DE4339795C2 - Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von geringen Mengen von Biomolekülen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Anwendungsgebiete sind die medizinische Diagnostik und die molekularbiologische Forschung.

Trägergebundene Biomoleküle werden in einer Vielzahl unterschiedlichster Assaytypen nachgewiesen.

Die wichtigsten davon sind Mikrotiterplattenassays Teststreifenassays und Nachweisverfahren unter Verwendung von Blots. Bei Mikrotiterassays (EP 029 6544) wird das Biomolekül zum Beispiel an die Oberfläche von Mikrotiterplattengefäßen gebunden und dort durch unterschiedlichste Nachweisreaktionen nachgewiesen. Der Hauptnachteil aller dieser Verfahren ist, daß meist die gesamte innere Oberfläche der Mikrotiterplattengefäße in das Nachweisverfahren einbezogen wird und damit die unspezifische Bindung von Sondenmolekülen, die das Biomolekül spezifisch erkennen und binden können und damit eine Nachweisstrategie ermöglichen sollen, sehr hoch ist. Die damit verbundenen hohen Backgroundwerte werden noch dadurch erhöht, daß das Gesamtverfahren innerhalb eines Mikrotiterplattengefäßes ohne Kammerwechsel durchgeführt werden muß.

Im Falle von Teststreifenassays (DD 2 26 084) wird zumeist auf eine sehr schnelle optische Detektion von Biomolekülen mit einer Auswertungsmöglichkeit mittels des Auges orientiert.

Damit muß auf eine extreme Reduktion der Nachweisfläche und damit des Backgroundes der Nachweisreaktion verzichtet werden.

Der Nachweis der Biomoleküle erfolgt auf der Oberfläche des Teststreifens und muß deshalb auf eine Signalakkumulationsmöglichkeit in Lösung verzichten.

Sämtliche Nachweisassays unter Nutzung von Blottingtechniken (USA Pat.-Nr. 4, 716, 101) agieren auf großflächigen Blottingmatrices und unterliegen deshalb den beschränkten Möglichkeiten der Backgroundreduktion dieser Verfahren. Die schwer zu unterdrückende unspezifische Bindung der Sondenmoleküle bestimmt hierbei unmittelbar das Signal/Background-Verhältnis und damit die Empfindlichkeit des Nachweises. Der Nachweis erfolgt auf der Oberfläche der Blots, die insgesamt durch das Nachweisverfahren bewegt werden.

Auf eine parallele Differenzmessung verschiedener Kontrollproben, z. B. ohne Einsatz von Sondenmolekülen, muß deshalb verzichtet werden.

Zum Nachweis von Biomolekülen, speziell zum Nachweis von Proteinen, werden bevorzugt Enzyme, wie z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase eingesetzt. Eines der empfindlichsten Nachweissysteme verwendet als Enzym eine Aminoglucosidphosphotransferase, vorzugsweise Neomycinphosphotransferase als Nachweissystem (EP 0 304 934).

Aus DE 41 20 139 ist ein heterogenes Festphasen- Enzymimmunoassay-Verfahren und ein Testset dazu für die Routinediagnostik bekannt. Es werden Biomoleküle an einen Träger gebunden und diese dann nacheinander durch mit Nachweissonden enthaltender Pufferlösung und in einem Waschschritt mit Pufferlösung gefüllte Kammern bewegt. Das Biomolekül wird anschließend durch eine Reaktion nachgewiesen.

Weiterhin sind aus DE 38 14 892, DE 37 36 632, DE 42 15 932, DE 37 22 273 und DE 39 23 342 verschiedene Vorrichtungen für Festphasen-Enzymimmuno-Verfahren bekannt. Ihre Flächen für den die Biomoleküle bindenden Teil des Trägers sind jedoch relativ groß (mm²). Was den Nachteil hat, daß die Volumina der eingesetzten Lösungen, die z. T. kostenspielig und auch aufwendig gewonnen werden müssen, relativ groß sein müssen.

Alle bisher beschriebenen Nachweissysteme werden außerdem in ihrer Empfindlichkeit vor allem durch mangelnde Möglichkeiten zur Reduktion des Backgroundes beschränkt.

Ziel der Erfindung ist es, den Background von Nachweisreaktionen für Biomoleküle dramatisch zu senken und damit eine Empfindlichkeitssteigerung zu ermöglichen.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 und 2 realisiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die in zu untersuchenden Proben vorhandenen Biomoleküle trägergebunden und durch verschiedenste Lösungen, die sich in unterschiedlichen Kammern befinden, bewegt werden. Damit wird keinerlei Background der einzelnen Stufen der Nachweisreaktion oder von der Gefäßwand resultierend, mit in die nächste Nachweisstufe übernommen.

Schließlich findet die Nachweisreaktion in einer gesonderten Reaktionskammer, die für die entsprechende Reaktion optimiert ist, statt. Dadurch, daß parallel unterschiedliche Kontrollen, z. B. unbehandelte Trägermaterialien, die das Biomolekül nicht binden können, und Doppelwerte mitgeführt werden können, wird ein Subtraktionsverfahren der im letzten Schritt erhaltenen Reaktionswerte ermöglicht. Dies gestattet die statistisch sichere Auswertung kleinster Unterschiede der Meßwerte.

Die nacheinander durchzuführenden Verfahrensschritte sind:
Inkubationsschritte, in denen Nachweissonden, wie z. B. Antikörper, Hybridisationssonden oder auch andere Moleküle mit spezifischer Affinität zum Biomolekül, mit dem nachzuweisenden Biomolekül reagieren können;
Waschschritte, in denen nicht gebundene Sondenmoleküle vom Träger abgewaschen werden;
Blockierungsschritte, in denen mit Hilfe von Blockierungsmitteln (proteinfreier bzw. Proteinblock) die Oberfläche des Trägers gegen unspezifische Sondenbindungen blockiert wird und schließlich
der Reaktionsschritt, in dem das Biomolekül nachgewiesen wird. In den bevorzugten Varianten werden z. B. Proteine mittels eines Antikörpers oder auch Fab-Fragmenten in einer Inkubationskammer an den Träger gebunden. Dabei kann mit relativ großen Volumina gearbeitet werden (300-2000 µl), da die unspezifische Bindung an die Gefäßwand nicht in die Nachweisreaktion einfließt, da die Kammer anschließend häufig gewechselt wird.

In anschließenden Waschschritten mit entsprechenden Pufferlösungen wie PBS werden nacheinander bevorzugt 2-3 Kammern durchlaufen. Der Blockierungsschritt (z. B. mit 5% Magermilchpulver in PBS) erfolgt ebenfalls in einer neuen Kammer. Waschschritte werden vorzugsweise immer von mehreren Kammerwechseln begleitet, für Blockierungsschritte und Inkubationsschritte genügt der Aufenthalt des Trägers in einer Kammer. Für die Nachweisreaktion ist eine für diese Reaktion optimal gestaltete Reaktionskammer vorgesehen.

Zum Nachweis können übliche Enzyme, wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase eingesetzt werden, als Substrate sowohl chromogene, fluorogene als auch Lumineszenz- einschließlich Chemilumineszenz- Substrate verwendet werden.

Besonderen Vorzug für das Verfahren hat die Verwendung der Enzymklasse der Aminoglucosidphosphotransferasen, wie z. B. der Neomycinphosphotransferase II. Dieses Enzym phosphoryliert Aminoglucosid-Antibiotika, wie z. B. Kanamycin, und kann aufgrund seiner außergewöhnlichen Stabilität unter den verschiedensten Reaktionsbedingungen sehr gut zur Langzeitakkumulation von Signalen verwendet werden.

Die phosphorylierten Reaktionsprodukte eignen sich hervorragend zur leichten Auswertung mittels entsprechender Assays.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beinhaltet 3 Hauptkomponenten:

Der Träger a) dient zum Transport der Biomoleküle durch die unterschiedlichen Inkubations-, Wasch- und Blockierungskammern in die Reaktionskammer. Wesentliches Merkmal des Trägers ist, daß er aus einem größeren Teil, einem Schaft aus inertem Material besteht, der zum Transport dient, und einem kleinen, das Biomolekül bindenden Teil. Die Verkleinerung der Oberfläche des das Biomolekül bindenden Teils führt im Verfahren zur Senkung des unspezifischen Untergrundes. Bevorzugt wird der Träger in Stabform ausgebildet. Der Schaft, der aus den Kammern herausragt, besteht aus inertem Material, wie z. B. Teflon, und ist gut zum Transport der Träger geeignet. Der kleine das Biomolekül bindende Teil sitzt an der Spitze des Stabes und ermöglicht gleichzeitig sehr niedrige Füllhöhen der einzelnen Inkubationslösungen in den Kammern, einschließlich minimalster Volumina in der Reaktionskammer.

Der das Biomolekül bindende Teil des Trägers weist eine Fläche aus dem mikroskopisch kleinen Bereich auf.

Dies kann durch verschiedenste Herstellungsvarianten des Trägers erreicht werden. Z.B. kann ein aus Biomolekül bindendem Material bestehender Schaft zunächst mit einer inerten Schicht überzogen werden, die definiert in bestimmten mikroskopischen Bereichen von dieser Schutzschicht befreit wird (Photolackprinzip), bzw. auf einen inerten Schaft werden mikroskopisch kleine Bereiche eines Biomoleküle bindenden Materials aufgebracht bzw. mikroskopisch kleine Partikel verankert.

Der die Biomoleküle bindende Teil des Trägers kann aus allen geeigneten Materialien, wie z. B. ionisch bindenden, hydrophob bindenden oder kovalent bindenden Materialien bestehen (z. B. DEAE- Cellulose, Nitrocellulose, PVDF, Polystyrol, Nylon, DBM- oder CCA-Papier, chemisch aktivierte Gläser). Der zum Transport der Biomoleküle vorgesehene Teil des Trägers kann aus allen geeigneten inerten Materialien, wie z. B. synthetischen und natürlichen Polymeren, Keramik, Metallen oder Metallegierungen oder Glas bestehen.

Besonders vorteilhaft ist eine Ausführung des Trägers in pipettenspitzenähnlicher Form, da diese eine Entnahme von Aliquots aus der Reaktionslösung gestattet. Der hohle Schaft aus inertem Material kann auf eine Ansaugautomatik aufgesteckt sein. Die Biomoleküle werden auf einer kleinen Fläche biomolekülbindenden Materials, die sich an der Spitze des Trägers befindet, fixiert.

Der Block b) mikrotiterplattenähnlich angeordneter Kammern dient zur optimalen Realisierung des Gesamtverfahrens.

Durch die gewählte Anordnung wird die parallele Führung mehrerer Träger durch die verschiedenen Kammern gewährleistet.

Die Grundvariante beinhaltet einen Block aus 4 nebeneinander angeordneten Reihen von 8-20 Kammern. Der Block kann aber wesentlich mehr nebeneinander angeordnete Reihen (bis 20) beinhalten, die parallel viele Meßwerte, einschließlich vieler Kontrollwerte gestatten.

Dabei können die einzelnen Reihen mit völlig unterschiedlichen Kammern (Form, Volumina) ausgestattet sein, die dem entsprechenden Verfahrensschritt angepaßt sind. Durch den Wechsel der Kammern für die verschiedenen Verfahrensschritte wird der Background des Gesamtverfahrens drastisch gesenkt.

Zur Unterstützung der Effektivität von Einzelschritten z. B. Wasch- und Inkubationsschritten, kann der Block mit einer, die Bewegung der Kammer verursachenden, Technik verbunden sein.

Die Bewegung kann dabei sowohl kreisend als auch schüttelnd sein. Der zeitliche Verlauf der Bewegung kann dem Ablauf der einzelnen Arbeitsschritte durch eine Automatik angepaßt sein.

Die Reaktionskammern können vom Block der anderen Kammern abgetrennt sein, um eine optimale Gestaltung der Nachweisreaktion zu erlauben. Im Falle radioaktiver Verfahren erhöht diese Abtrennung die Sicherheit der Gesamtmethode.

Zweckmäßigerweise sollten die Reaktionskammern sehr kleine Reaktionsvolumina erlauben und zentrifugierbar sein, um die Auswertung der Reaktionslösung zu erleichtern.

Die Nachweisreaktion erfolgt zunächst in Lösung. Ausgewertet werden kann über vielfältigste Verfahren, wie z. B. optische, densitometrische, colorimetrische, autoradiographische oder radiometrische Verfahren.

Ausgewertet werden kann durch Messung der Lösung aus den Reaktionskammern direkt nach der Nachweisreaktion, z. B. optische Messung, bzw. nach Aufarbeitung der Reaktionslösung, z. B. Abtrennung eines umgesetzten Substrates vom nicht umgesetzten Substrat, und anschließende Auswertung (z. B. autoradiographische Messung). Die Nachweisreaktion kann zeitlich verfolgt werden, indem aus den Reaktionskammern zu unterschiedlichsten Zeiten Proben zur Analyse entnommen werden.

Parallel zu den Meßwerten werden die Kontrollwerte analysiert.

Aus dem Vergleich der beiden Kinetiken werden Rückschlüsse auf das Vorhandensein kleinster Mengen der Biomoleküle in der zu testenden Probe gezogen.

Die Automatik c) dient zum Transport der Träger von Kammer zu Kammer.

Optimalerweise ist sie kammartig gestaltet, indem die stabförmigen Träger an ihren Schäften in einem mit dem Abstand der Kammern im Block abgestimmten Abstand in einer Halterung befestigt sind.

Diese Halterung führt die Reihe der Träger zeitlich gesteuert nacheinander durch die entsprechende Reihe der Kammern und taucht sie in die verschiedenen Lösungen.

Die Automatik kann eine für die Bewegung der Träger in den Kammern verantwortliche Technik enthalten, die zeitlich abgestimmt mit den Verfahrensschritten die Effektivität von Wasch- und Inkubationsschritten erhöht.

Besonders in Kombination mit pipettenspitzenähnlichen Trägern erweist sich eine Automatik, die eine Technik zur Entnahme von Aliquots aus der Reaktionslösung und zum Transport dieser Aliquots in ein Detektionssystem aufweist, als sehr günstig.

Mittels dieser Technik können Aliquots zu verschiedenen Reaktionszeiten entnommen werden und diese Meßwerte zur Erstellung einer Reaktionskinetik umgesetzt werden.

Besonders günstig ist diese Verfahrensweise bei Auswerteverfahren mittels eines Festphasenassays, wie z. B. im Falle der Benutzung von NPTII als Nachweisenzym und Phosphocellulose-Papier als Auswertungsmatrix. Die Reaktionslösung wird hierbei auf die Matrix aufgetüpfelt. Hierbei wird das Produkt der Enzymreaktion an die Matrix gebunden, dabei punktförmig konzentriert und kann dort sehr leicht und empfindlichst nachgewiesen werden. Die Automatik kann sowohl Pipettierungen zu verschiedenen Zeiten durchführen, als auch variable Volumina (z. B. 1-20 µl) pipettieren.

Mit der Erfindung wird erreicht, daß die Nachweisempfindlichkeit für Biomoleküle um mindestens 2 Größenordnungen höher ist als bei herkömmlichen Verfahren. Das ist von besonderer Bedeutung zum Nachweis von Proteinen.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Dystrophinbestimmung aus Muskellysaten

Verwendet werden stäbchenförmige Träger (Schaftmaterial 2 cm Teflon, Spitze 1 mm Polystyrol).

An der Spitze von 2 stäbchenförmigen Trägern wurde ein monoklonaler Antikörper gegen Dystrophin (Dys1) fixiert.

Zur Inkubation werden Mikrotiterplatten verwendet.

In 4 Mikrotiterplattengefäße (Inkubationskammern) (1. Reihe) wurde je 200 µl Muskelzellysat (1 : 50 Verdünnung) gegeben.

In 2 Inkubationskammern wurden je ein unbehandelter Träger (Doppelwerte, Kontrolle), in 2 Inkubationskammern je ein Träger mit Dys1 (Doppelwerte, Meßwert) fixierter Spitze gestellt.

Die gesamte Mikrotiterplatte einschließlich der Träger wurde 2 h bei Zimmertemperatur geschüttelt.

Dabei wird das im Muskelzellysat enthaltene Dystrophin an den Antikörper Dys1 gebunden. Die beiden unbehandelten Träger dienen als Kontrolle.

Danach werden 12 weitere Inkubationskammern (4 × 2.+3.+4. Reihe der Mikrotiterplatte) mit je 300 µl TBS gefüllt.

Die 4 Träger werden nacheinander je 2 Minuten unter Schütteln in die Inkubationskammern der 2., 3. und 4. Reihe umgesetzt (Waschschritt). 4 weitere Inkubationskammern (5. Reihe der Mikrotiterplatte) werden mit einer Lösung von 5% Magermilchpulver in TBS gefüllt (je 300 µl) und die 4 Träger in diesen Inkubationskammern 10 Minuten geschüttelt (Blockschritt).

4 Inkubationskammern (6. Reihe der Mikrotiterplatte) werden mit je 100 µl 5% Magermilchpulver in TBS + 10 µl Antidystrophinantiserum (Kaninchen, 2. Antikörper) gefüllt und die 4 Träger 2 h bei Zimmertemperatur unter Schütteln inkubiert.

Dabei bindet der 2. Antidystrophinantikörper an das über den 1. Antikörper an den Träger gebundene Dystrophin.

Je 4 Inkubationskammern der (7., 8. und 9. Reihe) werden mit TBS gefüllt und der Waschschritt wiederholt.

Anschließend wird der Blockschritt in Reihe 10 wiederholt.

In Reihe 11 werden je 200 µl 5% Magermilchpulver in TBS + 10 µl eines ein Fusionsprotein aus Protein A und Neomycinphosphotransferase II enthaltenes E. coli Lysates in 4 Mikrotiterplattengefäße gefüllt und die Träger darin 10 Minuten inkubiert. Dabei bindet das Fusionsprotein an den Fc-Teil des 2. Antikörpers.

Auf einer neuen Mikrotiterplatte wird in Reihe 1-4 der Waschschritt wiederholt.

Anschließend wird in einer einzelnen Reihe Mikrotiterplattengefäße die Enzymreaktion zum Nachweis der Biomoleküle (Dystrophin) durchgeführt, dazu werden kleinere Mikrotiterplattengefäße verwendet und mit 50 µl Enzympuffer gefüllt. Nach 1 h Inkubationszeit werden aus den 4 Gefäßen jeweils 5 µl Enzympuffer entnommen und auf Phosphorcellulose aufgetüpfelt.

Diese wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Auswertung erfolgt zunächst mittels Autoradiographie. Die quantitative Auswertung erfolgt mittels Phosphorimager.

Beispiel 2

Höchstempfindlicher Biomolekülnachweis unter Verwendung pipettenspitzenähnlicher Träger und einer Transport- und Pipettierautomatik.

Der Träger ist pipettenspitzenähnlich geformt. Der inerte Schaft besteht aus Polypropylen. Am unteren Ring der "Pipettenspitze" befindet sich eine ca. 0,5 mm² große Fläche Polystyrol, die zur Bindung der Biomoleküle vorgesehen ist. 2 der Träger werden mit dem Fab- Fragment eines monoklonalen Antikörpers gegen Desmin beschichtet, 2 Träger bleiben unbehandelt. Die 4 Spitzen werden auf eine kammartige Vorrichtung aufgesteckt, die sowohl zum Transport der Spitzen, zur kreisförmigen Bewegung der Spitzen und zur Pipettierung von Aliquots in der Lage ist.

Die Automatik taucht zunächst die 4 Spitzen in 4 mit je 300 µl Puffer, der 5% Magermilchpulver enthält, gefüllte Kammern (Reihe 1) ein und verweilt dort ca. 5 Minuten (Blockierungsschritt). Die 4 Kammern gehören zu einem mikrotiterplattenähnlichen Block von 18 Reihen mit je 4 Kammern.

Danach bewegt die Automatik die 4 Spitzen nacheinander in 3 mit Puffer gefüllte Kammern (Reihe 2, 3, 4) und bewegt sie dort je 1 Minute kreisförmig (Waschschritt).

Danach bewegt die Automatik die 4 Spitzen in 4 Kammern, in denen sich je 200 µl Muskellysat befinden (Reihe 5) und verweilt dort unter leichten Kreisbewegungen ca. 15 Minuten (Inkubationsschritt).

Nach Wiederholung des Waschschrittes in Reihe 6-8 und des Blockschrittes in Reihe 9 wird in Reihe 10 mit einem polyklonalen Antiserum gegen Desmin (Kaninchen) inkubiert (10 Min.). In Reihe 11- 13 wird wieder gewaschen, Reihe 14, geblockt, Reihe 15 mit 200 µl PBS, 5% Magermilchpulver, der Fusionsproteine zwischen Protein A und Neomycinphosphotransferase inkubiert (10 Min. unter Kreisbewegung). Anschließend wird in Reihe 16-18 mit PBS gewaschen. Danach bewegt die Automatik die Spitzen in 4 Reaktionskammern, die je 50 µl Enzympuffer enthalten.

Nach 5 Minuten Reaktionszeit zieht die Automatik über die Spitzen je 2 µl Enzympuffer ein und transportiert diese zu einem Blatt Phosphocellulose-Papier (2 cm × 10 cm), tropft die 2 µl auf und transportiert die Spitze zurück in die Reaktionskammern.

Alle 10 Minuten wird wieder ein Aliquot entnommen und in ein Raster auf das Phospocellulose-Papier aufgetropft. Nach 2 Stunden wird die Phosphocellulose mit H₂O gewaschen und die Signale auf der Phosphocellulose mittels Phosphorimager ausgewertet.

Der zeitliche Verlauf der Meßwerte wird graphisch dargestellt und die Kontroll-Kurven (ohne Antikörperfixierung am Träger) mit den Kurven mit Antikörper verglichen.

Dadurch können kleinste Mengen des Desmins (Femtogrammbereich) des Proteins in den Lysaten detektiert werden.

Claims (2)

1. Verfahren zum Nachweis von an Trägern gebundenen Biomolekülen gekennzeichnet durch

• - Bindung der Biomoleküle über einen Antikörper in einer 1. Kammer des Trägers,
• - Waschung in weiteren Kammern mit Pufferlösungen, wobei nicht gebundene Antikörper abgewaschen werden bzw. unter Zusatz von einem Blockierungsmittel geblockt wird,
• - Bindung an einen zweiten Antikörper in einer weiteren Kammer,
• - erneute Waschung und dann
• - Verbindung mit einem Fusionsprotein in einer nächsten Kammer,
• - wiederholte Waschung und
• - anschließende Nachweisreaktion in einer gesonderten Kammer, gegebenenfalls nach Abtrennung vom Träger, wobei parallel ein unbehandelter Träger durch die gleichen Kammern bewegt und die Differenz der im letzten Schritt (Reaktionsschritt) erhaltenen Reaktionswerte gebildet wird.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von Biomolekülen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

• - Träger, die aus einem mikroskopisch kleinen, im Bereich von 5 × 10⁵ bis 10² µm² liegenden, die Biomoleküle bindenden Teil und einem inerten, zum Transport durch die Kammern benötigten Teil bestehen,
• - einen Block mikrotiterplattenähnlich angeordneter Kammern, gegebenenfalls nachgeordneten Reaktionskammern und gegebenenfalls
• - eine Automatik zum Transport der Träger von Kammer zu Kammer.