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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
für diagnostische
Assays verwendbare Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von
Analyten, welche Krankheitszustände
kennzeichnen wie z. B. Herzfunktionsstörungen oder mikrobielle Infektionen.
Insbesondere ist sie zur Identifizierung von Analyten in Vollblutproben
nützlich, obwohl
sie nicht darauf beschränkt
ist.
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TECHNISCHER
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In jüngerer Zeit wurde eine Anzahl
von Immunoassayverfahren entwickelt, welche von Reaktionen Gebrauch
machen, die auf einer porösen
bzw. cellulären
Membran stattfinden, wobei diese Reaktionen entweder visuell oder
mit Hilfe eines Instrumentes wie z. B. eines Reflektometers detektierbar
sind. Allgemein involvieren diese Verfahren, ohne jedoch darauf
beschränkt
zu sein, Antigen/Antikörper-Reaktionen,
in welchen ein Mitglied des reaktiven Paars mit einem detektierbaren
Label markiert ist. Üblicherweise
ist das Label ein Enzymlabel oder ein Sol-Label wie z. B. Gold. Auf dem vorliegenden
technischen Gebiet ist man über
viele nützliche Label
sowie Verfahren zu deren Handhabung gut unterrichtet. Daher besteht
hier kein Bedarf an einer weiteren Diskussion von Labeln.
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Typische immunochromatographische
Vorrichtungen dieser Art werden in mehreren Patenten in den Vereinigten
Staaten und im Ausland beschrieben. So beschreibt beispielsweise
das US-Patent 4,861,711 eine Vorrichtung, in welcher ein Analyt
mittels Antigen/Antikörper-Reaktionen
detektiert wird, welche in einer Se rie von coplanaren Membranen
stattfinden, deren Kanten miteinander in Berührung stehen.
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Die US-Patente 4,477,575 und 4,816,224
beschreiben laminare Vorrichtungen, welche eine Glasfaserschicht
zur Durchführung ähnlicher
Reaktionen beinhalten.
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Andere laminierte Vorrichtungen werden
in den US-Patenten:
| 4,774,192 | 5,079,142 |
| 4,753,776 | 5,096,809 |
| 4,933,092 | 5,110,724 |
| 4,987,065 | 5,144,890 |
| 5,075,078 | 5,290,678 |
| 5,135,716 | 5,591,645 |
beschrieben.
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US-Patent Nr. 5,135,716 verwendet
ein Agglutinationsmittel zur Unterstützung der Abtrennung von roten
Blutkörperchen.
Alle genannten Patente beschreiben laminierte Vorrichtungen.
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Soweit den Anmeldern bekannt ist,
wurde bislang noch keine nicht-laminierte immunochromatographische
Vorrichtung bekannt bzw. beschrieben, welche mit Vollblut betrieben
werden kann.
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Vorrichtungen, wie sie in den oben
angegebenen Patenten beschrieben werden, sind oft schwer herzustellen,
da sie aus vielen Schichten bestehen und mehreren Schichten von
porösen
Streifen und Filtrationsstreifen zur Gewährleistung genauer Ergebnisse
benötigen.
Es ist für
die Detektion von Analyten in Vollblut erforderlich, die roten Blutkörperchen
zu entfernen, so dass sie nicht bei der Visualisierung des gefärbten Produktes
stören,
welches gewöhnlich
als Konsequenz der Immunoassay-Reaktionen entsteht. Es wurden Glasfaservliese
zur Filtration verwendet, aber dies fügt lediglich eine weitere Schicht
zur Vorrichtung hinzu. Die Schwierigkeiten ergeben sich aufgrund
der Probleme, mehrere Schichten dünner flexibler Streifen genau
in einer geeigneten untereinander deckungsgleichen Anordnung zu
platzieren, wobei gleichzeitig die Probenaufgabezonen, Reaktionszonen
und weitere Bereiche der Streifen in einer geeigneten relativen
Anordnung gehalten werden. Zu einer weiteren Verkomplizierung der
Probleme kommt es aufgrund der Schwierigkeiten, die fertige Vorrichtung
in bzw. auf einer geeigneten Plattform anzuordnen, welche oft ein
hohles Gehäuse
mit voneinander trennbarem Ober- und Unterteil einschließlich feststehender
Pfeiler und Vertiefungen ist, um eine Bewegung der Vorrichtung zu
verhindern und definierte Bereiche der Vorrichtung in einer geeigneten
Anordnung relativ zu Sichtfenstern und anderen Öffnungen im Gehäuse zu halten.
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Wenn Immunoassay-Instrumente wie
z. B. die vorstehend genannten zur Detektion von Analyten in Vollblut
verwendet werden, werden Label an den gegen die Analyten gerichteten
Antikörpern
verwendet, welche zu einem detektierbaren Produkt führen. Im üblichen
Falle reagiert ein markierter Detektor-Antikörper mit einem Epitop des Analyten,
während
ein Einfang-Antikörper
mit einem anderen Epitop des Analyten reagiert. Typischerweise ist
das Produkt, da es gefärbt
ist, visuell detektierbar. In einigen Anordnungen ist die Farbe
mit dem bloßen
Auge erkennbar. In anspruchsvolleren Vorrichtungen kann die Konzentration
des Analyten mittels Messung der Intensität der Produktfarbe mit einem
geeigneten Instrument bestimmt werden. In beiden Fällen stört die Anwesenheit
von roten Blutkörperchen
im Farbentwicklungsbereich eine geeignete Visualisierung der Farbe
aufgrund der intensiven Färbung
dieser Zellen.
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Zur Verhinderung dieser Störung wurden
bereits große
Anstrengungen unternommen. Als Ergebnis dieser Anstrengungen beinhalten
alle Vorrichtungen, welche zur Analyse von Vollblutproben vorgeschlagen wurden,
irgendeinen Filtertyp zur Entfernung der roten Blutkörperchen
zur Erzeugung von Serum oder Plasma, welches der Sichtbarkeit der
erzeugten Farbe nicht schadet. In der Vorrichtung gemäß US-Patent
4,477,575 ist ein Glasfaservlies zur Filtration der roten Blutkörperchen
vorgesehen. Andere Patente beschreiben die Verwendung von Papier-
oder Plastikfiltern.
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JP-A-60 94 718 offenbart ein Assay,
in welchem eine Vollblutprobe auf eine Vorrichtung aufgebracht wird.
Die Membran besteht aus mit Silicagel beschichteten Glasfasern.
Als Detektorkomplex wird ein mit Goldkolloid beschichteter Antikörper verwendet.
Die Entwicklungsgeschwindigkeiten des Flüssiganteils und des Zellanteils
sind voneinander verschieden und das Testergebnis kann daher mit
dem bloßen
Auge beobachtet werden.
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EP-A-505 636 offenbart eine z. B.
aus Nitrocellulose hergestellte Immunoassay-Vorrichtung. Der Streifen
der Vorrichtung enthält
eine Verengung, welche als Einrichtung zur Strömungskontrolle bzw. Strömungsbeeinflussung
fungiert, sowie eine Probenaufgabezone, eine Detektorzone mit einem
mobilen markierten Antikörper
und eine Einfangzone.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß wird ein Assay zur Verfügung gestellt,
in welchem alle Reaktionen, die zur Bestimmung der Anwesenheit eines
Analyten in einer Vollblutprobe notwendig sind, ohne dass es zu
einer Störung durch
rote Blutkörperchen
kommt, auf einer oder höchstens
zwei Membran-Vorrichtungen stattfinden, welche mittels einfacher
Herstellungsmethoden zusammengesetzt sind. Die für das Assay verwendete Vorrichtung kann
in einem sehr einfachen Gehäuse
enthalten sein.
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Obwohl die vorliegende Erfindung
nicht auf ein derartiges Gebiet beschränkt ist, wird sie zweckmäßigerweise
zur Verwendung für
die Bestimmung von herzspezifischen Analyten in Vollblutproben beschrieben. Sie
kann darüber
hinaus auch zur Bestimmung und/oder Messung einer großen Vielzahl
von Analyten in Blutproben eingesetzt werden, wie z. B.: Drogen
einschließlich
therapeutischer Medikamente und missbräuchlich verwendeter Drogen,
Hormonen, Vitaminen, Proteinen einschließlich aller Klassen von Antikörpern, Peptiden; Steroiden;
Bakterien; Pilzen; Viren; Parasiten; Komponenten oder Produkten
von Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten; Allergenen aller Typen;
Produkten oder Komponenten von normalen oder bösartigen Zellen; etc. Als Beispiele
können
insbesondere erwähnt
werden: Digoxin; hCG; Insulin; Theophyllin; luteinisierendes Hormon; Thyroidstimulierendes
Hormon; Organismen, welche verschiedene Krankheitszustände bewirken
bzw. damit assoziiert sind wie z. B. Streptococcus pyrogens (Gruppe
A), Herpes Simplex I und II, Cytomegalovirus, Chlamydien, Antikörper gegen
Röteln,
etc.
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Eine wichtige Eigenschaft der vorliegenden
Erfindung ist die Geometrie der Vorrichtung, welche in dem Assay
verwendet wird, das zur Bereitstellung eines Stroms konstruiert
ist, von welchem im Wesentlichen alle roten Blutkörperchen
abgetrennt wurden. Als Ergebnis der geometrischen Konstruktion der
Vorrichtung steht ein festgelegtes Plasmavolumen mit einem im Voraus
festgelegten Bereich der Vorrichtung über einen längeren Zeitraum in Berührung, wodurch
eine für
das Stattfinden der Bindungsreaktionen ausreichende Kontaktzeit
ermöglicht
wird. Dieses festgelegte Volumen wird durch die volumetrische Kapazität der Membran
bestimmt.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Zum besseren Verständnis der
vorliegenden Erfindung wird auf die nachfolgende Beschreibung in
Verbindung mit den Zeichnungen als Teil der vorliegenden Patentschrift
Bezug genommen, wobei:
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1 eine
Aufsicht auf eine einschichtige Vorrichtung zeigt, welche im erfindungsgemäßen Assay
verwendet wird;
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2 eine
Aufsicht auf eine Vorrichtung zeigt, in welcher eine obere langgestreckte
Membran entfaltet und gegenüber
einer anderen, kürzeren
Membran, der sie überlagert
ist und mit der sie im Flüssigkeitskontakt steht,
um 180° rotiert
ist;
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3 eine
Aufsicht auf ein Erzeugnis zeigt, welches vier Vorrichtungen in
derselben Struktureinheit aufweist;
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4 eine
Explosionsdarstellung eines alternativen Erzeugnisses zeigt, welches
eine zweischichtige Vorrichtung auf einer Plattform mit einem Oberteil
und einem Unterteil aufweist;
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5a die
Darstellung eines Querschnitts durch ein Gehäuse einer der vorliegenden 4 entsprechenden Vorrichtung
zeigt;
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5b eine
Aufsicht auf die obere Membran zur Verwendung in 5a zeigt;
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5c eine
Aufsicht auf die untere Membran zur Verwendung in 5a zeigt;
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6a die
Darstellung eines Querschnitts durch das Gehäuse einer Vorrichtung zeigt,
in welcher die Verwendung eines Lochs in der in 4 gezeigten oberen Membran vermieden
wird;
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6b eine
Aufsicht auf die obere Membran zur Verwendung in 6a zeigt;
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6c eine
Aufsicht auf die untere Membran zur Verwendung in 6a zeigt;
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7 die
in Beispiel 2 verwendete Vorrichtung mit einer Einzelmembran
zeigt; die Teile sind zum besseren Verständnis mit ihren Namen bezeichnet;
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8 die
in Beispiel 3 verwendete Vorrichtung zeigt; die Teile sind
auf ähnliche
Art und Weise bezeichnet;
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9 die
in Beispiel 4 verwendete, auf ähnliche Art und Weise beschriftete
Vorrichtung zeigt:
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei der in der vorliegenden Beschreibung
der Erfindung beschriebenen Vorrichtung handelt es sich um die Membran-Struktur, die eingesetzt
wird, um den Fluss der roten Blutkörperchen in Blut, welches auf
eine auf der Membran befindliche Aufgabezone aufgegeben wird, chromatographisch
zu verzögern,
um das Vollblut dadurch in einen Strom mit einer Plasmafront, gefolgt
von einer sich langsamer bewegenden roten Blutkörperchenfront zu transformieren.
Diese Vorrichtung ist insbesondere zur Aufnahme und für die diagnostische
Verarbeitung kleiner Quantitäten
einer Fluidprobe wie z. B. Vollbluttröpfchen, welche in einem Finger-Prick-Verfahren
gewonnen wurden, ausgelegt und hierfür in hohem Maße geeignet.
Die Membran-Struktur dient auch als Substrat für die diagnostischen Reaktionen.
Bei dem Gehäuse
handelt es sich um einen Träger,
eine Halterung oder eine Plattform für die Vorrichtung.
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Ein hauptsächlicher Faktor, welcher zu
der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung beiträgt, beruht
auf der Entdeckung, dass celluläre
Membranen, welche vorzugsweise aus Nitrocellulose konstruiert sind,
den Fluss der roten Blutkörperchen,
welche sich entlang der Membran bewegen, vorzugsweise verzögern oder
hemmen, wodurch ein Strom mit einer roten Blutkörperchenfront und stromabwärts davon
einer Plasmafront gebildet wird. Genauer gesagt, werden die roten
Blutkörperchen
nicht aus dem Vollblut herausgefiltert, sondern werden vom Plasma
chromatographisch abgetrennt, welches in der ausgewählten Membran-Struktur
schneller fließt
als die roten Blutkörperchen.
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Ein weiteres Merkmal der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass das Plasmasegment bzw. die Sektion
des Stroms, welches bzw. welche im Wesentlichen frei von roten Blutkörperchen
ist, so manipuliert wird, dass dieses bzw. diese langsam durch ein
Gebiet fließt,
in welchem bestimmte der diagnostisch nützlichen Reaktionen stattfinden.
Dieses Merkmal wird im Folgenden ausführlicher erläutert werden.
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Vorrichtungen zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung sind mit einer Probenaufgabezone, auf welche
die Blutprobe aufgebracht wird, sowie stromabwärts von der Probenaufgabezone
mit einer Strömungszone
wie z. B. einer langgestreckten Reaktionszone ausgestattet, welche
eine Detektorzone stromaufwärts von
einer Einfangzone umfasst. In dieser Hinsicht ist eine in der vorliegenden
Erfindung verwendete Vorrichtung nicht unähnlich zu den bisher bekannten
Vorrichtungen, wie sie z. B. in den oben angegebenen Patenten beschrieben
werden. Die kritischen Merkmale aller derartiger Vorrichtungen bestehen
darin, dass ein im Blut enthaltener Analyt wie z. B. Myoglobin oder
Leichtketten-Myosin in der Reaktionszone mit einem gefärbten mobilen
markierten, gegen den Analyten gerichteten Antikörper unter Bildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes
reagiert. Dieser Komplex ist in der Trägerflüssigkeit löslich oder darin suspendiert
und bewegt sich entlang der Membran stromabwärts, um mit einem Einfang-Antikörper unter
Bildung eines sichtbaren Antikörper/Antigen/Antikörper-Reaktionsproduktes
zu reagieren, wobei das Antigen der Analyt ist. In allen derartigen
Vorrichtungen wird, wenn diese zur durch die Bildung eines gefärbten Produktes
gekennzeichneten Diagnose mit Vollblut betrieben werden, irgend
ein Filtertyp eingesetzt, um den Fluss der roten Blutkörperchen
zu stoppen und diese von Gebieten fernzuhalten, in welchen die nützlichen
diagnostischen Reaktionen stattfinden, um eine Wechselwirkung mit
der Farbbildung sowie deren Interpretation zu verhindern. Typischerweise
ist das Filter ein Glasfaserfilter, ein Plastikfilter oder ein Cellulosepapierfilter,
welches die roten Blutkörperchen
entfernt, während
sich das Blut longitudinal vom Aufgabepunkt zum Reaktionsgebiet
bewegt.
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Im Gegensatz zu solchen vorbekannten
Vorrichtungen wird in der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung eine
chromatographische Abtrennung erreicht, wobei die roten Blutkörperchen
nach wie vor fließen, allerdings
mit einer geringeren Geschwindigkeit als das Plasma oder Serum.
Somit werden die roten Blutkörperchen
chromatographisch und nicht mittels Filtration vom Plasma abgetrennt.
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Es wurde überraschend gefunden, dass
Vollblut, während
es sich entlang einer Membran wie z. B. einer Nitrocellulosemembran
bewegt, chromatographisch in einen sich relativ schnell bewegenden
Plasmastrom und einen sich relativ langsam bewegenden Strom aus
roten Blutkörperchen
getrennt wird. Im Endergebnis werden die roten Blutkörperchen
vom Plasma abgetrennt. Bei einem erfindungsgemäßen Assay können die anfänglichen
immunologischen Reaktionen sogar schon stattfinden, bevor sich die
Plasmafront des Stroms gebildet hat, welche im Wesentlichen frei
von roten Blutkörperchen
ist. Die Reaktion setzt sich im abgetrennten Plasma fort, wobei
diagnostisch nützliche
Information zur Verfügung
gestellt wird.
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Während
eines ischämischen
Ereignisses wie z. B. einer stabilen oder instabilen Angina oder
eines Myokard-Infarktes wird eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen
vom Herzgewebe freigesetzt, die für dieses Ereignis charakteristisch
sind. Diese Proteine, welche hier als Analyten bezeichnet werden,
können
zur Diagnose eingesetzt werden, wie dies in den US-Patenten Nr.
5,290,678 und Nr. 5,604,105 beschrieben wird, deren Inhalt hier
mittels Bezugnahme inkorporiert wird. Typische Beispiele solcher
Analyten sind Myoglobin, Kreatinin-Kinase-MB (CK-MB), Leichtketten-Myosin,
Troponin I und Troponin T. Wie in diesen Patenten beschrieben wird,
wird die Anwesenheit dieser Analyten im Vollblut mittels Antigen/Antikörper-Reaktionen
bestimmt, welche in einer laminierten Struktur stattfinden, in welcher
der Analyt zuerst mir einem markierten Detektor-Antikörper im
Kontakt kommt, welcher mit einem ersten Epitop auf dem Analyten
unter Bildung eines markierten Antikörper/Analyten-Komplexes reagiert.
Dieser Komplex kommt anschließend
mit einem Einfang-Antikörper in
Kontakt, welcher mit einem anderen Epitop des Analyten unter Bildung
eines sichtbaren, markierten Antikörper/ Analyten/Detektor-Antikörper-Reaktionsproduktes
reagiert. Wie in den besagten Patenten beschrieben wird, erlaubt
eine Bestimmung der Anwesenheit von zumindest drei Analyten in gegenüber den
Normalwerten erhöhten
Mengen dem Arzt, das kardiale Ereignis genau als eine stabile oder
instabile Angina oder einen Myokard-Infarkt zu kennzeichnen. Es
gibt noch viele andere herzspezifische Analyten, welche gleichermaßen eingesetzt
werden können.
Es sind auch Vorrichtungen mit nur einem oder zwei Analyten verfügbar, welche
indessen nicht in der Lage sind, so viele Informationen bereitzustellen
wie Vorrichtungen, die für
drei oder mehr Analyten ausgelegt sind.
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Zum Erleichterung eines klaren Verständnisse
der vorliegenden Erfindung wird auf die Darstellung einiger spezifischer
Ausführungsformen
verwiesen. Im Anschluss an die Beschreibung folgt eine Diskussion
einiger der bei der Konstruktion von Produkten involvierten allgemeinen Überlegungen.
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1 zeigt
eine typische Vorrichtung, welche eine Membran 10 umfasst,
die wie dargestellt konfiguriert ist.
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Die Membran umfasst eine Probenaufgabezone 12,
welcher ein Tropfen oder mehrere Tropfen Vollblut zugeführt werden
kann bzw. können.
Wie bereits weiter oben erwähnt
wurde, besteht ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung
darin, dass Vollblut direkt analysiert werden kann und dass lediglich
kleine Blutmengen wie z. B. 8 bis 20 μl oder sogar noch weniger erforderlich
sind. Diese Blutmenge kann direkt aus einem Finger-Prick-Verfahren
erhalten und zugeführt
werden, oder aus einer Tropfpipette oder einer Pipette, nachdem
sie vom Patienten abgenommen worden ist.
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Das Blut bewegt sich von der Aufgabezone 12 stromabwärts zu einer
Reaktionszone, welche eine Detektorzone 14 beinhaltet,
die einen markierten Detektor-Antikörper enthält, welcher mit einem Epitop
auf dem Analyten unter Bildung eines markierten Antikörper/Analyten-Komplexes
reagieren kann. Diese Reaktion ist wohl bekannt und braucht nicht
weiter im Detail beschrieben zu werden.
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Es kann irgend ein Label einer Vielzahl
von Labeln, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, eingesetzt werden.
Metall- und Enzymlabel werden bevorzugt. Besonders bevorzugt werden
die Metall-Label aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit.
Von den Metall-Labeln wird Gold am meisten bevorzugt, vor allem,
da es für
diesen Reaktionstyp verbreitet eingesetzt wird und seine Eigenschaften
so gut verstanden werden. Darüber
hinaus kann ein Gold-Signal durch die Verwendung eines löslichen
Silbersalzes und eines Reduktionsmittels gemäß bekannten Verfahren verstärkt werden,
um dann leicht sichtbar zu sein. Das Gold-Label wirkt als en Katalysator
zur Reduktion des Silbersalzes zu metallischem Silber, welches sich
als sichtbares Produkt ablagert. Ein typisches Reaktionspaar ist
Silberlactat, welches als Quelle- für reduzierbare Silberionen dient,
und Hydrochinon als Reduktionsmittel. Das metallische Silber bildet
eine leicht erkennbare Ablagerung um alle Goldpartikel.
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Es kann eine Präinkubationszone vorgesehen
sein, welche in der Aufgabezone beginnt und sich bis in die Detektorzone
fortsetzt, obwohl dies nicht notwendiger Weise ein Merkmal der vorliegenden
Erfindung darstellt. Die Präinkubationszone
wird eingesetzt, um Produkte zu entfernen, welche im Blut vorhanden
sind und welche die gewünschten
Reaktionen stören
oder deren Detektion erschweren können. Eine typische störende Substanz
ist eine Isoform der Kreatinin-Kinase, nämlich das CK-MM. Die gegen
die Isoform CK-MB gerichteten Antikörper können eine Kreuzreaktion mit
CK-MM eingehen und falsche Messwerte ergeben. Dies kann vermieden
werden, indem eine hinreichende Menge an CK-MM immobilisierendem
Antikörper
in einer Präinkubationszone
bereitgestellt wird, so dass die Gesamtmenge an CK-MM entfernt wird,
bevor die Probe die Detektorzone erreicht.
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In der in 1 dargestellten Vorrichtung kann ein
Detektor-Antikörper oder
können
eine Vielzahl von Detektor-Antikörpern
verwendet werden. Falls mehrere Detektor-Antikörper eingesetzt werden, muss
sorgfältig
darauf geachtet werden, dass störende Reaktionen
vermieden werden. Es ist oft am Besten, dass die Antikörper in
einer oder in mehreren Detektorzonen angeordnet werden, um mit ihren
spezifischen Analyten zu reagieren.
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Der markierte Detektor-Antikörper ist
mobil, d.h. er ist beweglich an die Membran 10 in der Detektorzone 14 gebunden,
so dass sich der einmal gebildete Antikörper/Analyten-Komplex ungehindert
stromabwärts bewegen
kann. Natürlich
kann es sich bei den in dieser Reaktion eingesetzten Antikörpern bzw,
bei in nachfolgend zu beschreibenden Reaktionen eingesetzten Antikörpern entweder
um monoklonale oder um polyklonale Antikörper handeln. Eine Vielzahl
solcher Antikörper
ist wohl bekannt und leicht erhältlich
oder kann mit Standardverfahren hergestellt werden.
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Wenn sich das Blut stromabwärts von
der Aufgabezone 12 weg bewegt, bewegen sich die roten Blutkörperchen
langsamer als das Plasma und bilden die Front 16. Ein Teil
der Plasmakomponente der ursprünglichen
Blutprobe bewegt sich weiterhin stromabwärts als Plasmasegment, dessen
Front in 1 mit dem Bezugszeichen 18 bezeichnet
wird. Letztendlich werden, wie oben gesagt wurde, im Wesentlichen
alle roten Blutkörperchen
in einem Gebiet eingeschlossen sein, welches die Aufgabezone 12 bis
zur Front 16 der roten Blutkörperchen umfasst. Falls sich
ein markierter Antikörper/Analyten-Komplex
gebildet hat, wird dieser im Plasma gelöst und in Richtung der Einfangzone 20 bewegt
werden. In der Einfangzone wird dieser Komplex mit einem Einfang-Antikörper in
Kontakt treten, welcher mit dem Komplex unter Bildung eines detektierbaren
markierten Antikörper/Analyt/Antikörper-Reaktionsproduktes
reagieren wird.
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Es fällt auf, dass die erste Reaktion
des markierten Antikörpers
mit dem Analyten in Vollblutstrom in Anwesenheit der roten Blutkörperchen
stattfinden kann. Für
eine ordnungsgemäße Analyse
der Analyten in der Blutprobe ist es nicht erforderlich, bereits
hier zu wissen, dass der Detektor-Antikörper mit einem Analyten reagiert
hat. Die roten Blutkörperchen
stören
nicht. Der Komplex kann indessen, falls erwünscht, durch eine geeignete
Anordnung des markierten Antikörpers
stromabwärts
von der Front 16 der roten Blutkörperchen gebildet werden, aber
dies kann die Länge
der Vorrichtung unnötig
erhöhen.
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Falls das Label ein Sol wie z. B.
Gold ist, bildet sich eine sichtbare Linie aus, welche, wie oben
vorgeschlagen, aus dem Goldprodukt selbst oder aus reduziertem Silber
bestehen kann. Falls das Label ein Enzym wie z. B. Meerrettich-Peroxidase
ist, kann durch Zugabe von Wasserstoffperoxid und eines Farbstoffs
wie z. B. ortho-Phenylendiamin gemäß Standardverfahren eine Reaktion
festgestellt werden.
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In der in 1 dargestellten Vorrichtung ist eine
Kontrollzone 22 umfasst, welche ein Produkt enthalten kann,
das mit irgendeiner Substanz, die normalerweise im Blut vorhanden
ist, unter Bildung eines sichtbaren Produktes reagiert. Die Verwendung
einer Kontrollreaktion ist optional; sie wird aber bevorzugt, damit
der Operator weiß,
dass eine hinreichende Blutmenge auf die Aufgabezone 12 aufgebracht
worden ist und die diagnostischen Reaktionen stattfinden konnten.
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Der Fachmann erkennt, dass die beschriebenen
Reaktionen jeweils charakteristische Reaktionskinetiken aufweisen
und jeweils eine bestimmte Zeit für die Vervollständigung
der Reaktion benötigen.
Um sicher zu stellen, dass eine hinreichende Zeit für die Vervollständigung
der Reaktion mit dem Einfang-Antikörper und die Bildung einer
hinreichenden Menge eines sichtbaren Produktes zur Verfügung steht,
wird die Vorrichtung so konfiguriert, dass die Fließgeschwindigkeit
des Plasmastroms verzögert
wird und mehr Zeit für
die Reaktion des markierten Antikörper/Analyten-Komplexes mit
dem Einfang-Antikörper
zur Verfügung
steht.
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Im Allgemeinen kann die Modulation
der Strömung
der Fluidprobe und deren Komponenten bzw. die Strömungskontrolle
mit verschiedenen Maßnahmen
erfolgen. So kann beispielsweise die Membran so konfiguriert sein,
dass die Strömung
des Fluids (d. h. die Plasmaströmung)
langgestreckt ist und sich bis zum Ende der Membran hin erstreckt.
Eine andere Methode zur Kontrolle bzw. Beeinflussung der Strömung besteht
in einer Verengung der Kanäle,
durch welche diese Strömung
stattfinden kann, und zwar entweder hinsichtlich der Abmessung oder
hinsichtlich der Anzahl dieser Kanäle. Eine dritte Methode zur
Kontrolle bzw. Beeinflussung der Strömung besteht in der Aufbringung
eines im Voraus festgelegten Probenvolumens auf die Membran, so
dass die Menge dieser Probe nur dem Volumen entspricht, welches
die für
diese Fluidströmung
auf der Membran zur Verfügung
stehenden Kanäle
füllt.
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Dementsprechend kann die Vorrichtung
Einrichtungen zur Modulation der Strömung bzw. Strömungskontrolle
beinhalten, die mit der Membran bzw. den Streifen assoziiert sind
und die beispielsweise eine oder mehrere Verengungen der Membranbreite
oder die Anordnung einer oder mehrerer Blenden oder ähnlicher Strömungsbarrieren
umfassen können,
um der Strom des Plasmas zu hemmen. Derartige Blenden können durch
Kompressionen in der Membran gebildet werden, welche die Porosität eliminieren
und folglich einen Durchfluss verhindern.
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Eine Modulation der Strömung bzw.
Verengung kann auch erreicht werden, indem der Plasmastrom verlängert wird,
so dass der Abstand ansteigt, den ein festes Plasmavolumen zurücklegen
muss, bevor es den Einfang-Antikörper
erreicht. Das Ergebnis besteht letztendlich darin, dass das gesamte
Plasmavolumen eine längere
Zeit in der Einfangzone 20 verbleibt. Der Volumeninhalt
des Streifens zwischen der Einfangzone 20 und dem Ende
des Streifens 10a bestimmt das Plasmavolumen, welches durch
das Einfanggebiet 20 fließt. Das heißt, die Strömung kommt zum Erliegen, sobald
der Streifen vollständig
gesättigt
ist. Darüber
hinaus wird auch ein weiterer Fluss der roten Blutkörperchen
verhindert, und diese werden daran gehindert, das Einfanggebiet
zu verschleiern.
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Eine weitere Funktion dieser Verlängerung
besteht darin, eine größere Trennung
der Front der roten Blutkörperchen
von der Plasmafront 18 für ein minimales Plasmavolumen
zu bewirken. Dies ist wichtig, um die Möglichkeit zu verringern, dass
die roten Blutkörperchen
in die Einfangzone 20 wandern und die Messergebnisse durcheinander
bringen. Es existieren verschiedene Maßnahmen, um die Verlängerung
des Weges zu erreichen, den das Plasmasegment zurücklegen
muss. Eine derartige Maßnahme
wird in der 1 dargestellt,
welche eine Einbuchtung der Membranseiten unter Ausbildung einer
Verjüngung 24 zeigt.
Diese Verjüngung
kann gebildet werden, indem die Flanken der Membran abgeschnitten
werden. Dieses Abschneiden sollte indessen z. B. mit einer Laser-Vorrichtung
erfolgen, da herkömmliche
Mittel den Kapillarraum, d.h. die Poren, an den Flanken der Kanäle auf der
Membran komprimieren könnten,
und so die Strömung
des Fluids behindern könnten.
Diese Verjüngung
kann ebenso mittels Kompression der Membran unter Ausbildung eines komprimierten
Bereichs einer gewünschten
Form gebildet werden, durch welchen das Plasma nicht fließen kann.
Dasselbe Ergebnis kann erreicht werden, indem die Membran mit einem
Wachs oder einer anderen inerten Substanz imprägniert wird, um ebenfalls eine
gewünschte
Konfiguration auszubilden, durch welche kein Plasma fließt.
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Weitere Alternativen umfassen die
Kompression einer Reihe von runden, quadratischen oder langgestreckten
Mustern auf der Membran in einem in der 1 als Verjüngung 24 dargestellten
Gebiet. Falls diese Alternative gewählt wird, liegt keine Einbuchtung
der Membran vor, sondern die komprimierten Segmente behindern den
Strom des Plasmas auf eine Art und Wiese, die der Behinderung des
Wasserstroms in einem Fluss durch Felsen ähnelt.
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2 illustriert
eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, in welcher die Aufgabezone 12 und die
Detektorzone 14 in einer unteren Membranschicht 26 unter
dem stromaufwärts
gelegenen Ende einer oberen Membranschicht 29 angeordnet
sind. Der Vorteil dieser Anordnung besteht darin, dass sowohl die
Länge der
Vorrichtung als auch die Fließzeit
durch die Vorrichtung verringert sind. Dies wird erreicht, während gleichzeitig
die erforderliche Strömung
der Probe durch die Vorrichtung ohne einen Verlust des chromatographischen
Effektes beibehalten wird. Somit kann ein größeres Blutvolumen in einer
kürzeren
Zeit analysiert werden. Eine alternative Struktur würde in einer
lokalen Erhöhung
der Membranbreite bestehen. Dies wird indessen nicht bevorzugt,
da sich die Fließeigenschaften ändern würden und
Stagnationsbereiche gebildet würden, in
denen sich das Plasma zwar ansammelt aber nicht fließt.
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In der Vorrichtung gemäß 2 ist die Aufgabezone 12 der
unteren Schicht 26 unter dem Durchgangsloch 27 angeordnet,
durch welches das Blut zugegeben wird, bevor es in der unteren Schicht 26 stromabwärts durch
die Detektorzone 14 in die obere Schicht 29 fließt. Der
Bereich um das Durchgangsloch 27 in der Aufgabezone 12 ist
in der oberen Schicht 29 ein blockierter Bereich 28,
welches beispielsweise mittels Kompression oder mit Wachs gebildet
worden ist. Der Zweck dieses Blockierens besteht darin, dass das
Blut daran gehindert wird, in der oberen Schicht 29 stromabwärts zu fließen, und
so einen Kanal für
den Blutfluss in die Detektorzone 14 der unteren Schicht 26 gebildet
wird.
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Das Vollblut fließt durch die Detektorzone 14,
in welcher der gegebenenfalls vorhandene Analyt mit einem markierten
Detektor-Antikörper in
Kontakt tritt und mit diesem reagiert, und fließt anschließend in den oberen Teil 29.
Die Funktionsweise der Vorrichtung gemäß 2 entspricht anschließend der Funktionsweise der
Vorrichtung gemäß 1. Es existiert eine Front 16 der
roten Blutkörperchen,
ein Plasmastrom mit einer Front 18, eine Kontrollzone 22 und
eine Verjüngung 24.
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Es ist anzumerken, dass bei der Vorrichtung
gemäß 2 das stromabwärts gelegene
Ende der unteren Membran 26 mit dem blockierten Bereich 28 der
oberen Membran 29 überlappt,
so dass ein Weg für
den Blutfluss gebildet wird. Der blockierte Bereich 28 kann
aus Wachs oder einer anderen, für
eine wässrige
Flüssigkeit
undurchlässige
Beschichtung zur Kontrolle der Flüssigkeitsströmung bestehen.
Im Endeffekt besteht die Wirkung der in 2 gezeigten Anordnung darin, dass ein
Kanal für
die Strömung
gebildet wird, durch welchen der Blutfluss von der Aufgabezone 12 weg
durch die Detektorzone 14 in Richtung der Einfangzone 20 geleitet
wird. Die Strömung
erfolgt im Wesentlichen immer noch entlang der Membranen, wodurch
der chromatographische Effekt beibehalten wird.
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Die Anordnung der in 2 abgebildeten Schichten kann invertiert
werden; in diesem Falle ist das Durchgangsloch 27 nicht
erforderlich. Die Richtung der Strömung erfolgt dann immer noch
im Wesentlichen entlang den Membranen.
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Die Wirkung der überlappenden Membrananordnung
besteht darin, die Blutmenge zu maximieren, welche in der Vorrichtung
verwendet werden kann, ohne dass die Dauer der Untersuchung übermäßig lang wird,
wobei immer noch eine im Wesentlichen longitudinale Strömung beibehalten
wird.
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3 illustriert
eine Ausführungsform,
in welchen vier Vorrichtungen auf demselben Substrat 60 angeordnet
sind. Alle diese Vorrichtungen teilen sich die Aufgabezone 12.
Das Blut, welches zur Aufgabezone 12 zugegeben wird, fließt auf dieselbe
Art und Weise durch die jeweilige Vorrichtung und reagiert auf dieselbe Art
und Weise, wie weiter oben beschrieben wurde.
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Die Ausführungsform mit der Mehrfachvorrichtung
kann auf ein Blatt aus Membranmaterial aufgedruckt werden, indem
die Linien, welche die jeweilige Vorrichtung definieren, mittels
Kompression oder Hitze gebildet werden oder mit Wachs oder einem
anderen Material, welches in jeder Vorrichtung geeignete Strömungskanäle bildet,
auf das Membranblatt aufgedruckt werden. Alternativ kann die Mehrfachvorrichtung
separat gebildet werden, indem sie aus einem Membranblatt ausgeschnitten
wird und an ein inertes Substrat wie z. B. ein Plastikblatt geheftet
wird, welches keine Kapillarwirkung auf fließendes Blut oder Plasma ausübt. Tatsächlich sind
Nitrocellulosemembranen mit Polyesterrücken kommerziell erhältlich und
werden gegenwärtig zur
Herstellung der verschiedenen Vorrichtungen bevorzugt.
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Andere Konfigurationen dieser Ausführungsform
mit der Mehrfachvorrichtung erschließen sich dem Fachmann. So können diese
Vorrichtungen beispielsweise nebeneinander angeordnet sein, wie
dies in 4 dargestellt
ist.
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4 illustriert
eine Ausführungsform,
in welcher zwei aneinander grenzende Vorrichtungen von einem Gehäuse 30 getragen werden,
welches ein Abdeckungsteil 36 und ein Trägerteil 34 aufweist.
Wie dargestellt ist, trägt
das Produkt zwei Vorrichtungen, welche jeweils eine Detektorzone 14 aufweisen.
In 4 haben die Bezugszeichen,
welche mit Bezugszeichen in anderen Figuren identisch sind, dieselben
Bedeutungen.
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4 ist
eine Explosionsdarstellung, welche zwei miteinander verbundene Vorrichtungen
darstellt, die jeweils mit 10 bezeichnet werden, als Rücken ein
Polyesterblatt 32 tragen und in einem Gehäuse vorliegen, welches
ein Trägerteil 34 sowie
ein Abdeckungsteil 36 zur Verbindung mit dem Abdeckungsteil 36 zur
Aufnahme der Vorrichtungen 10 aufweist.
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Das Abdeckungsteil 36 umfasst
ein Durchgangsloch 38, welches mit der Aufgabezone 12 zur
Aufhabe des Vollbluts deckungsgleich angeordnet ist. Es umfasst
ebenso ein Sichtfenster 40, welches mit den Einfangzonen 20,
die auf jeder der Vorrichtungen 10 vorliegen, sowie, falls
vorhanden, mit den Kontrollzonen 22 deckungsgleich angeordnet
ist, um so eine Betrachtung der Messergebnisse durch den Operator
zu ermöglichen.
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Das Abdeckungsteil 36 kann
zusätzlich
ein Indikatorloch 42 zur Anzeige, dass eine ausreichende
Probenmenge vorliegt, enthalten, welches es dem Operator ermöglicht,
festzustellen, dass eine für
eine vollständige
Untersuchung ausreichende Blutmenge zugegeben wurde. Es kann zusätzlich ein
Loch 44 zur Beobachtung eines Untersuchungsendsignals enthalten,
welches den Operator darüber
informiert, dass eine ausreichende Zeit vergangen ist, so dass die
Messergebnisse abgelesen werden können, ohne dass die Gefahr
eines falschen negativen Ergebnisses aufgrund einer zu frühen Ablesung
besteht. Dieselbe Sicherheitsanforderung kann mit Hilfe einer Stoppuhr
oder eines anderen Zeitmessers erfüllt werden.
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Falls ein Untersuchungsendsignal
gewünscht
wird, kann ein Farbstofffleck am Ende der Vorrichtung, falls nur
eine Vorrichtung verwendet wird, oder am Ende einer der Vorrichtungen,
falls Mehrfachvorrichtungen eingesetzt werden, angeordnet werden.
In jedem Falle wird der Farbstoff stromaufwärts vom Beobachtungsloch 40 angeordnet.
Er wird im fließenden
Plasma aufgelöst
und zum Beobachtungsloch 44 weiterbefördert, um dem Operator zu signalisieren,
dass die Zeit zur Ablesung des Testergebnisses gekommen ist.
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Genauer gesagt zeigt der Bereich '46 der Vorrichtung 10 (4) die Konfiguration eines
Zeitmessers, welcher sich unter das Beobachtungsfenster 44 erstreckt.
Ein Farbstoff wird zwischen der Kontrollzone 22 und der
Sektion der Verlängerung 46,
welche sich unter dem Fenster 44 befindet, angeordnet.
Das Aufrauchen des Farbstoffs unter dem Fenster 44, wird
dem Operator signalisieren, dass die Zeit zur Ablesung der Testergebnisse
gekommen ist.
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Das Teil 48 trägt die Vorrichtung
im Gehäuse 30.
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5a zeigt
ein vereinfachtes Abdeckteil 51 und ein vereinfachtes unteres
Trägerteil 52.
Die Öffnung 53 stellt
einen Zugang zur Aufbringung von Blut durch das Loch 27 in
der oberen Membran 29 und somit auf die untere Membran 26 dar.
Der dunkle Bereich der beiden Membranen entspricht dem Polyesterrücken und der
gepunktete Bereich der Nitrocellulose. Der schattierte Bereich 28 der
oberen Membran ist eine Barriere aus Wachs, um ein direktes Ansaugen
von Blut durch die obere Membran zu verhindern. Die schattierten
Bereiche 54a und 54b in der unteren Membran 12 verhindern
lediglich einen Blutverlust durch Stagnation in den Ecken. Die Wachs-Linie 55 dient
dazu, die Strömungsgeschwindigkeit
des Blutes in die untere und obere Membran zu begrenzen. Der freie
Bereich 56, welcher die Öffnung
53 umgibt,
hindert das Blut daran, in die kapillaren Kanäle, die sich ansonsten zwischen
dem oberen Gehäuse
und der Polyesteroberfläche
der oberen Membran bilden könnten,
hineingesaugt zu werden. Die Breite des Einfangbereichs 57 ist
gegenüber
der Verjüngung
erhöht,
um eine verbesserte Sichtbarkeit der Analysenergebnisse zu ermöglichen.
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6A ist
dem oben Gesagten ähnlich,
vermeidet aber die Notwendigkeit eines Lochs in der oberen Membran.
Die obere Membran 10 ist kürzer ausgeführt, so dass die Apertur 63 die
Blutaufgabe direkt mit der Aufgabezone 12 der unteren Membran 26 verbindet.
Die anderen Merkmale sind wie oben beschrieben und die Bezugszeichen
haben dieselben Bedeutungen.
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Die Betreibbarkeit der Testvorrichtungen
beruht letztendlich auf der Abtrennung der roten Blutkörperchen
vom Vollblut, so dass ein im Wesentlichen klares Plasma möglich wird,
welches den Antikörper/Analyten-Komplex
enthält
und die Einfangzone 20 erreicht, so dass die Farbänderung
ohne Störung
durch die starke Farbe der roten Blutkörperchen feststellbar ist.
Es wurde bisher nicht erkannt, dass ein derartiges Ergebnis ohne
die Verwendung separater vertikaler Membranen zur Entfernung der
roten Blutkörperchen
mittels Filtration, bei welcher die Strömung durch die Dicke der Membran
erfolgt, realisierbar ist.
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Es reichen einige einfache Beobachtungen
aus, um zu bestimmen, wo die Front der roten Blutkörperchen
und die klare Plasmafront auf einer cellulären Membran gegebener Dimensionen
und Porengrößen erscheinen
werden. Sobald dies bekannt ist, weiß der Fachmann, der den untersuchten
Analyten, die Affinität der
eingesetzten Antikörper
gegenüber
dem Analyten und die Reaktionskinetiken kennt, wo der Antikörper und der
Einfang-Antikörper anzuordnen
sind, und kennt auch die geeignete Länge der Vorrichtung. Selbst
wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, können die optimalen Positionen
der Antikörper
sowie die Länge
des Plasmastroms zur Erreichung eines optimalen Signals leicht empirisch
ermittelt werden. Dies alles liegt im Können des Fachmanns.
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Der Fachmann erkennt, dass für die vorliegende
Erfindung irgendeine celluläre
Membran eingesetzt werden kann, die die roten Blutkörperchen
vom Plasma des Vollbluts chromatographisch trennt. Indessen wird Nitrocellulose
bevorzugt, da sie bei vertretbaren Kosten leicht verfügbar ist.
Nitrocellulose wurde in der Chromatographie und verwandten Gebieten
nun schon so viele Jahre eingesetzt, dass die Wissenschaftler und Techniker
mit ihren Eigenschaften vertraut sind.
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Aus kommerziell erhältlicher
Nitrocellulose können
leicht Streifen irgendeiner gewählten
Länge und Breite
hergestellt werden.
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Die relevanten Nitrocellulosemembranen
können
als schwammartige Gebilde mit einer Vielzahl miteinander verbundener
Mikroporen verschiedener Größen und
Dimensionen, welche in der Membran Kapillarkräfte bewirken, bezeichnet werden.
Dies erlaubt es dem untersuchten biologischen Fluid, sich entlang
des Streifens von einer Probenaufgabezone weg zu bewegen.
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Für
die Trennung des Plasmas von den roten Blutkörperchen bei der Durchführung der
vorliegenden Erfindung werden das Membranmaterial, die Geometrie
und die Dimensionen so gewählt,
dass die gewünschten
Reaktionen in zuvor festgelegten Bereichen stattfinden. Diese Bereiche
werden auf der Grundlage der relativer Geschwindigkeiten der Fronten
des Stroms der roten Blutkörperchen
und des Plasmastroms festgelegt. Die Kinetiken der gewünschten
Reaktionen, die Affinität
der Antikörper
gegenüber
ihren jeweiligen Epitopen, die Größe der reagierenden Teilchen
sowie andere Faktoren sind entweder bekannt oder können leicht
mittels herkömmlicher
Untersuchungsverfahren bestimmt werden.
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Obwohl eine Vielzahl von Nitrocellulosemembranen
mit verschiedenen Zellengrößen verfügbar ist, werden
gegenwärtig
solche Membranen bevorzugt, die, falls sie als Filter eingesetzt
würden,
d. h. zur Filtration von Teilchen aus einem Flüssigkeitsstrom, welcher vertikal
zur rechtwinkligen Oberfläche
der Membran fließt, den
Durchtritt von Teilchen mit einer Größe von mehr als 3 bis 12 μm verhindern.
Bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung werden Membranen mit einer Porengröße von etwa
5 bis 12 μm,
vorzugsweise 3 bis 8 μm,
bevorzugt. Es ist eine gewisse Variation möglich. Indessen sinkt, wenn
sich die Porengröße verringert, die
Mobilität
des Fluids in der Membran, wodurch die für die Diagnose erforderliche
Zeit ansteigt. Falls die Poren zu groß sind, verringert sich die
Durchtrittszeit, mit dem Ergebnis, dass die Reaktanten nicht für eine für den Ablauf
der diagnostischen Reaktionen hinreichende Zeitdauer miteinander
in Berührung
stehen, oder dass diese nur in einem derart limitierten Umfang stattfinden,
dass sie nicht die gewünschten
Informationen liefern.
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Nitrocellulosemembranen mit Polyesterträgern oder
anderen Filmen sind kommerziell erhältlich. Diese werden zur Verwendung
in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da Membranen ohne Träger dazu
tendieren, recht brüchig,
d. h. bruchanfällig
zu sein. Darüber
hinaus sind die Filme für
fließende
Fluide undurchdringlich, so dass durch eine geeignete Anordnung
der Membranen im Gehäuse
im Wesentlichen longitudinale Fließkanäle ausgebildet werden können. Eine
derartige Membran ist in einer Vielzahl von Porengrößen von
Gerbermembrane, Gerbershausen, Deutschland erhältlich.
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Verfahren zur Herstellung markierter
Antikörper
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind dem Fachmann wohl
bekannt und brauchen hier nicht im Detail beschrieben zu werden.
Die gegenwärtig
bevorzugten Markierungen sind Metall-Label, insbesondere Goldlabel,
deren Sichtbarkeit und Empfindlichkeit nach bekannten Verfahren
unter Verwendung von Silber verbessert werden kann. Die bevorzugte
Teilchengröße der mit
Gold markierten, in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper beträgt etwa
35 bis 65 nm, obwohl eine merkliche Schwankung in Abhängigkeit
von wohl verstandenen Faktoren wie z. B. der Konzentration des Analyten
und der Affinität
der Reaktanten toleriert werden kann.
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Die in der vorliegenden Erfindung
eingesetzten Antikörper
werden mit Standardverfahren hergestellt. Siehe z. B. Falfre, Howe,
Milstein et al., Nature, Bd. 266, 550–552, April 1977.
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Verfahren zum Fixieren von Antikörpern an
Substrate wie z. B. Nitrocellulose sind bekannt und bei der Herstellung
der besagten Vorrichtungen einsetzbar. Nitrocellulose bindet Proteine
begierig. So braucht der immobile Einfang-Antikörper lediglich in einem in
Voraus festgelegten Gebiet auf die Einfangzone aufgebracht zu werden.
Der markierte Detektor-Antikörper kann
beweglich auf der Membran fixiert werden, indem die Detektorzone 14 zuerst
mit einem anderen Protein wie z. B. Rinderserumalbumin gesättigt wird.
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Das optimale Verfahren zur Durchführung der
vorliegenden Erfindung, welches anwendbar ist, wenn Antikörper mit
einer geeigneten Affinität
zum Analyten verfügbar
sind wenn diese Antikörper
effektiv mit z. B. einem Metall- oder Enzym-Label markiert werden
können;
wenn die Reaktionskinetiken günstig
sind; und wenn sich die verschiedenen Reaktionsprodukte mit prakti kablen
Geschwindigkeiten durch die Membran bewegen; wird in vier einfachen
Schritten ausgeführt.
Diese sind:
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- 1) Zugeben einer kleinen Blutmenge zur Aufgabezone,
- 2) Zulassen, dass sich das Blut in die Detektorzone bewegt,
wo der Analyt, falls anwesend, mit einem gegen den Analyten gerichteten
mobilen markierten Antiköper
unter Bildung eines markierten Antikörper/Analyten-Komplexes komplexiert,
welcher mit dem Blut fließt,
- 3) Erlauben, dass sich das Blut, welches den Komplex enthält, durch
die Membran bewegt, bis sich eine eindeutige Front 16 mit
roten Blutkörperchen
und eine separate Plasmafront 18 gebildet haben. Das Plasma
enthält
den gelösten
markierten Antikörper/Analyten-Komplex,
welcher vom Plasma durch die Membran zur Einfangzone 20 transportiert
wird.
- 4) Zulassen, dass der Plasmastrom, welcher im Wesentlichen frei
von roten Blutkörperchen
ist, für
eine zur Bildung eines detektierbaren markierten Antikörper/Analyt/Einfang-Antikörper-Reaktionsproduktes
hinreichende Zeitdauer mit dem Einfang-Antikörper in der Einfangzone 20 in
Kontakt tritt.
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Es sind indessen Abwandlungen dieses
optimalen Verfahrens möglich,
falls eine oder mehrere der oben beschriebenen Bedingungen nicht
zutrifft bzw. nicht zutreffen. So geschieht es beispielsweise manchmal, dass
sich der markierte Antikörper/Analyten-Komplex
recht bereitwillig bildet, sich aber nicht mit einer zur Bildung
eines leicht detektierbaren Signals hinreichenden Menge an Einfang-Antikörper vereinigt.
Dies kann geschehen, falls keine hinreichende Anzahl an Komplexen
mit den Einfang-Antikörpern
in Kontakt tritt oder mit diesen in einer Konfiguration in Kontakt
tritt, die zur Bildung eines Reaktionsproduktes nicht optimal ist.
Andere mögliche
Probleme sind eine ungenügende
Inkubationszeit oder eine niedrige Antikörperaffinität. Diese Schwierigkeiten können vermieden
werden, indem von der vorteilhaften Avidin/Streptavidin-Reaktion
oder analogen Reaktionen Gebrauch gemacht wird, de dem Fachmann
wohl bekannt sind. Die Verwendung der Biotin/Avidin-Technik, von welcher
die Biotin/Streptavidin-Reaktion ein Beispiel ist, illustriert die
Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung. Diese verwendet in vorteilhafter
Wiese die hohe Affinität
des Streptavidins für
Biotin. Insbesondere die Verwendung von Biotin als dem eingefangenen
Material und Streptavidin als dem Einfangmaterial bringt den Vorteil
einer schnelleren und positiveren gegenseitigen Wechselwirkung dieser
Reagenzien.
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In einer Anwendung dieses Verfahrens
werden zwei Antikörper
ablösbar
in der Detektorzone und Streptavidin in der Einfangzone fixiert.
Der Detektor-Antikörper
ist markiert, vorzugsweise mit einem Metall wie z. B. Gold, und
ein weiterer Antikörper
in der Detektorzone ist mit Biotin markiert. Falls der Analyt für die Antikörper im
Plasma anwesend ist, bildet sich in der Detektorzone ein Komplex,
welcher einen markierten Detektor-Antikörper/Analyt/Biotin-markierten
Detektor-Antikörper
enthält.
Dieser Komplex bewegt sich mit dem Plasma durch die Membran in die
Einfangzone. In der Einfangzone liegt immobilisiertes Streptavidin
vor. Wenn der Komplex das Streptavidin erreicht, bindet letzteres
an das Biotin und konzentriert den Komplex auf einen kleinen Bereich.
Als Resultat wird ein Signal detektierbar. In dieser bevorzugten
Abwandlung der Biotin-Reaktion wird der mit Biotin markierte Antikörper/Analyt/markierte
Detektor-Antikörper-Komplex
durch Umsetzung des Biotins mit dem Streptavidin oder einem analogen
Reagenz in der Einfangzone detektierbar gemacht.
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Dieses Reaktionsschema kann eingesetzt
werden, um z. B. Leichtketten-Myosin (MLC) zu detektieren. In dieser
Ausführungsform
werden zwei gegen MLC gerichtete Antikörper in der Detektorzone angeordnet.
Ein Antikörper
ist mit Gold markiert, der andere mit Biotin. Falls MLC im untersuchten
Blut anwesend ist, enthält
der sich bildende Komplex einen mit Gold markierten Antikörper, MLC
und einen mit Biotin markierten Antikörper. Dieser Komplex bewegt
sich durch die Vorrichtung in die Einfangzone und reagiert mit dem
Streptavidin unter Erzeugung eines sichtbaren Signals.
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Die vorliegende Erfindung wurde prinzipiell
unter Hinweis auf die Detektion von herzspezifischen Analyten beschrieben.
Diese umfassen z. B. CKMB, MLC, Myoglobin, Glycogen-Phosphorylase,
Troponin I und Troponin T. Die Vorrichtungen und Produkte können ebenfalls,
wie sich dem Fachmann erschließt,
verwendet werden, um eine Anzahl anderer Substanzen im Vollblut
zu bestimmen. Diese umfassen z. B. H. pylori, Antikörper, HCG
und hLH.
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Die hier hinsichtlich ihrer verschiedenen
Aspekte beschriebene und beanspruchte Untersuchung ist einfach und
flexibel. Die Produkte sind einfach herzustellen und benötigen keine
zusätzlichen
Merkmale des Standes der Technik wie z. B. poröse Medien zur Aufnahme von
Abfall und Filterschichten. Ein primäres Merkmal der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass lediglich kleine Blutvolumina benötigt werden.
Auch wird keine Waschflüssigkeit
eingesetzt.
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Die nachfolgenden, nicht-limitierenden
Beispiele sollen die vorliegende Erfindung lediglich illustrieren.
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BEISPIEL 1
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ABTRENNUNG DER
ROTEN BLUTKÖRPERCHEN
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Cellulosenitrat-Membranen (mit Polyester-Träger und
einer nominalen Porengröße von 3 μm und 8 μm von Gerbermembrane
GmbH, Gerbershausen, Deutschland) wurden auf ihre Fähigkeit
hin untersucht, den Fluss der roten Blutkörperchen des einer horizontalen
Chromatographie unterzogenen Vollbluts zu verzögern.
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Die Membranen wurden auf eine Länge von
45 mm und eine Breite von 6 mm zurechtgeschnitten. Zu einer an einem
Ende gelegenen Aufgabezone (7 mm × 6 mm) wurden 15 μl Vollblut
zugegeben. Nach Beendigung der chromatographischen Trennung betrugen
die gemessenen Abstände
der Plasmafront und der Front der roten Blutkörperchen vom Ausgangspunkt:
-
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BEISPIEL 2
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BESTIMMUNG VON
MYOGLOBIN IM VOLLBLUT
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Auf einem 20 mm × 10 mm großen Membranblatt (Cellulosenitrat,
8 μm nominale
Porengröße, Gerbermembrane)
wurde die in 7 abgebildete
Struktur mittels eine Wachsdruckverfahrens (wie in Laboratory News
von Januar 1996 veröffentlicht)
hergestellt. Anti-Myoglobin-Goldsolkonjugate wurden von British
Biocell, Inc. (BBI), Cardiff, UK, hergestellt (40 nm Goldsol, beladen
mit dem Antikörper
2Mb-295 von Spectral Diagnostics, Toronto, mit einer Konzentration
von 1,5 μg/ml
und einer optischen Dichte (bei 520 nm) von 1) . Zu 10 ml dieser
Lösung
wurden 400 mg Rinder-IgG (von Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen, Deutschland)
und 5 mg Octyl-D-glucopyranosid (von Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz)
zugegeben und 0,8 μl
dieser Mischung wurde auf die Detektorzone aufgegeben. Die Einfanglinie
wurde mittels Imprägnierens
mit einer Lösung
von polyklonalen Kaninchen-anti-Myoglobin-Antikörpern von
Spectral Diagnostics (Charge 95 APMO75C) bei einer Konzentration
von 3 mg/ml in einer Phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von
7,3 zur Herstellung der Einfangzone hergestellt.
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Zur Blutaufgabezone wurden 4 μl Vollblut
mit den unten angegebenen Myoglobin-Konzentrationen aufgebracht;
die Ergebnisse (nach 3 und 3,5 Minuten) waren wie folgt:
| Myoglobin-Konzentration | Signal
an der Einfanglinie |
| 50
ng/ml | schwaches
Signal |
| 200
ng/ml | deutliches
Signal |
| 500
ng/ml | starkes
Signal |
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BEISPIEL 3
-
GLEICHZEITIGE
BESTIMMUNG VON CK-MB UND MYOGLOBIN IM VOLLBLUT
-
Auf geeigneten Membranblättern wurde
die in 8 illustrierte
Konfiguration erhalten, indem auf einem 26 mm × 20 mm Blatt (obere Membran)
und einem 10 mm × 20
mm Blatt (untere Membran) die angegebenen Linien mit einem "edding 780"-Stift (von Edding
AG, Ahrensburg, Deutschland) gezeichnet wurden. Die getrocknete
Tinte bildet eine Barriere für
wässrige
Lösungen, ähnlich den
Wachsdruck-Verfahren gemäß Beispiel
2.
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Die Einfangzone der oberen Membran
(Cellulosenitrat-Membran mit Polyesterrücken, 8 μm nominale Porengröße, von
Gerbermembrane GmbH) enthält
eine erste Linie, welche mit einer Lösung aus Streptavidin (von
Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen, Deutschland) in Wasser bei einer
Konzentration von 30 mg/ml imprägniert
ist. Die Imprägnierungslösung für die zweite
Linie ist eine 3 mg/ml Lösung
von 3 mg/ml Kaninchen-anti-Myoglobin-Antikörpern von Spectral Diagnostics
(Charge 95 APMO75C) in einer Phosphatgepufferten Salzlösung. Zur
Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Membranbenetzung wurden
angegebene Bereiche mit einer Lösung
eines milden Tensids imprägniert,
nämlich
mit 0,05% (w/w) Octyl-D-glucopyranosid (von Fluka AG, Schweiz) in
Wasser.
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Die Detektorzone der unteren Membranschicht
(Cellulosenitrat-Membran
mit Polyesterrücken,
3 μm nominale
Porengröße, von
Gerbermembrane GmbH) wird mit den folgenden Lösungen imprägniert:
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a) 3 μl einer Goldsol-Konjugat-Lösung.
-
Diese Lösung wird wie folgt hergestellt
(Anti-CK-MB- und Anti-Myoglobin-Goldsolkonjugate wurden von BBI,
Cardiff, UK, hergestellt). Zu 900 μl Anti-CKMB-Goldsolkonjugat
(40 nm Goldsol, beladen mit 22 μg/ml (bei
einer OD von 10) des Antikörpers
SCKMB-6 von Spectral Diagnostics) wurden 100 μl Anti-Myoglobin-Goldsolkonjugat
zugegeben (40 nm Goldsol, beladen mit 15 μg/ml (bei einer OD von 10) des
Antikörpers 2MB-295
von Spectral Diagnostics). Weiterhin wurden 10 mg Octyl-D-glucopyranosid
(von Fluka AG, Schweiz) zugegeben und gemischt.
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b) 2 μl einer biotinylierten Antikörperlösung.
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Zwei μl einer Lösung von 9,5 mg/ml Biotinamidcaproat-Nhydroxysuccinimidester
(von Sigma-Aldrich GmbH) in 1 ml Acetonitril/Wasser (1 : 1, v/v)
wurden zu 1 ml einer Lösung,
enthaltend 2 mg/ml des Antikörpers rCKMB-28
(von Spectral Diagnostics) in 75 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert
von 8,5, zugegeben, gemischt und 2 Stunden lang inkubiert, gefolgt
von der Zugabe von 20 μl
einer Lösung
aus 500 mM DL-Lysinmonohydrochlorid (von Fluka AG) und 100 mM Kaliumphosphat
(End-pH-Wert von 8,5) und 0,5 Stunden lang inkubiert. Die Lösung wurde über Nacht
gegen 5 mM Kaliumphosphat und 10 mM Natriumchlorid bei einem pH-Wert
von 7 dialysiert. Die Antikörperlösung wurde
mit Wasser auf eine Konzentration von 35 μg/ml verdünnt, und zu 1 ml dieser verdünnten Lösung wurden
10 mg Crotein C und 3 mg Octyl-D-glucopyranosid zugegeben, um die
biotinylierte Antikörperlösung zu
erhalten.
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c) 3,5 μl einer Pufferlösung von
75 nM HEPES (pH-Wert 6,8) und 0,05% Octyl-D-glucopyranosid.
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25 μl heparinisiertes Vollblut,
welches Myoglobin (Spectral Diagnostics, Chargen-Nr. 3-10238) oder rCK-MB
(Spectral Diagnostics, Chargen-Nr. 3-24363G) der angegebenen Konzentrationen
enthielt, wurden zur Aufgabezone zugegeben und die Ergebnisse (innerhalb
von 9 bis 12 Min.) waren wie folgt:
-
-
BEISPIEL 4
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BESTIMMUNG VON Troponin
I IM VOLLBLUT
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In 9 wird
das Design illustriert, welches mit einem Staedtler Lumocolor 313-Stift
(von Staedtler, Nürnberg,
Deutschland) auf ein 30 mm × 35
mm Membranblatt gezeichnet wurde (Cellulosenitrat, 3 μm nominale
Porengröße, Gerbermembrane).
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In der Einfangzone wird eine Linie
mit einer Lösung
aus 13 mg/ml Streptavidin (Poly) von Microcoat GmbH, Penzberg, Deutschland
imprägniert.
Nach dem Trocknen wird die Membran mit einer 0,5%-igen wässrigen
Lösung
von Crotin C (von Croda GmbH) sowohl in der Detektor- als auch in
der Einfangzone imprägniert, um
unspezifische Bindung zu verhindern. Die Detektorzone wurde anschließend imprägniert mit:
-
a) 5 μl einer Goldsol-Konjugat-Lösung:
-
Zu 90 μl Anti-TN-I-Goldsolkonjugat
(60 nm Goldsol, beladen mit 10 μg/ml
(bei einer OD von 10) des Antikörpers
2I-14 von Spectral Diagnostics) einer OD von 30 werden 10 μl eines 250
mM Natriumsuccinatpuffers von einem pH-Wert von 5,5 zugegeben und
gemischt, um das Gold/Sol-Konjugat zu ergeben.
-
b) 2 μl einer biotinylierten Antikörperlösung:
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Die Biotinylierung erfolgt wie im
Beispiel 3, jedoch mit dem Anti-TN-I-Antikörper 8I-7
von Spectral Diagnostics. Zu 50 μl
dieser biotinylierten Antikörperlösung einer
Konzentration von 600 μg/ml
wurden 50 μl
einer Lösung
von 0,6%-igem Octyl-D-glucopyranosid und 200 mM MES bei einem pH-Wert
von 5,5 zugegeben und gemischt um die biotinylierte Antikörperlösung zu
erhalten.
-
35 μl heparinisiertes Vollblut,
welches TN-I der angegebenen Konzentrationen enthielt, wurden zur Aufgabezone
zugegeben und die Ergebnisse (innerhalb von 9 bis 12 Min.) waren
wie folgt:
| TNI
ng/ml | Signal
*) an der Einfanglinie |
| – | – |
| 0,5 | + |
| 1 | ++ |
| 2 | ++ |
| *0 "–-" kein sichtbares Signal "+++" starkes sichtbares
Signal | |
