JP2000506610A

JP2000506610A - 免疫測定装置

Info

Publication number: JP2000506610A
Application number: JP9532398A
Authority: JP
Inventors: バンス，ロジャー，アブラハム; イー．フライターク，ヘルムート
Original assignee: スペクトラルダイアグノスティックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 2000-05-30
Also published as: AU730911B2; WO1997034148A1; AU1936697A; DE69719737D1; ATE234467T1; EP0888547B1; EP0888547A1; DE69719737T2; CA2248709A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、膜上で縦方向の全血の流れが赤血球の先端と先導する血漿の先端とにクロマトグラフ的に分離され、全血中の分析体の存在を決定するために必要な全ての反応が、赤血球による妨害なしに、１つあるいは多くとも２つの膜上で起こる診断装置を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫測定装置発明の分野本発明は、たとえば心機能不全あるいは微生物感染のような病的状態を特徴づける分析体の存在を決定するための臨床的測定に有用な装置および方法に関する。発明の背景有孔質または多孔質膜上で生じる反応を利用したり、可視的または反射計のような測定器を利用した多くの免疫測定手段が近年開発されている。それ程限られたことではないが、これらの方法は一般的に反応の対の１つのメンバーが検出され得る標識で標識されている抗原／抗体反応を含んでいる。典型的には、標識は酵素標識または金のようなゾル標識である。多くの有益な標識やそれらの操作方法の技術がよく知られている。それゆえ、ここではさらに標識について考察する必要はない。この種の典型的な免疫クロマトグラフ装置はいくつかの米国特許および外国特許に記載されている。例えば、米国特許第４，８６１，７１１号は、分析体が、端と端が接触した一連の同一平面上で起こる抗原／抗体反応により検出される装置を記載している。米国特許第４，４７７，５７５号および第４，８１６，２２４号は同様の反応を行うためにガラス繊維を含む薄層からなる装置を記載している。他の薄層からなる装置は以下の米国特許に記載されている。４，７７４，１９２５，０７９，１４２４，７５３，７７６５，０９６，８０９４，９３３，０９２５，１１０，７２４４，９８７，０６５５，１４４，８９０５，０７５，０７８５，２９０，６７８５，１３５，７１６５，５９１，６４５米国特許第５，１３５，７１６号は赤血球の分離を助けるために凝集剤を使用している。これら全ての特許は薄層からなる装置を記載している。本出願人が知る限り、全血で操作される非薄層の免疫クロマトグラフ装置は以前から知られておらず、また記載されてもいない。上記に示した特許において記載されているような装置は、多層であり、正確な結果を保証するために多孔性で濾過性の片のいくつかの層を必要とするので、しばしば製造するのに困難を伴う。全血中の分析体を検出するために、赤血球を除去する必要がある、それによって通常免疫測定反応の結果である着色産物の可視化を妨害することがなくなる。ガラス繊維フリース（glass fiber fleeces）は濾過に使用されていたが、しかしこれは単に装置に別の層を加えるだけである。薄い可撓性ストリップのいくつかの層を適当な定められた位置に正確に位置せしめ、同時に試料配置領域、反応領域およびストリップ上のその他の領域に互いに適切な関係を保持しながら正確に位置せしめるという問題の故に困難が生じる。装置を動揺から保護するため、およびケーシング中の観察ウィンドウおよびその他の開口について適当な位置に装置の定められた領域を保持するための固定された支柱および溝を含む分離し得る上および下の部材（member）からなる、しばしば中空のケーシングである適当な台中または台上に完成した装置を配置する困難さによって問題が更に複雑になる。全血中の分析体を検出するために、前記したような免疫測定装置を使用するとき、検出され得る産物を与える分析体に対する抗体上の標識を利用する。通常の場合、標識された検出抗体は分析体の一つのエピトープと反応し、そして捕捉抗体は分析体上のたの他の一つのエピトープと反応する。典型的には、産物は着色しているから可視的に検出され得る。ある種の構成においては、色彩は肉眼に明らかである。より精巧な装置では、分析体の濃度は生じた色彩の強度を適当な装置で測定することによって決定する事ができる。両方の例において、発色領域における赤血球の存在は、赤血球細胞の強い色合いの故に適切な明視化を妨害する。多くの努力がそのような妨害を防止するために費やされた。その結果、全血分析のために提案された全ての装置は、生じる色の可視化を損なわない血清あるいは血漿をとるために赤血球を除去するためのある種のフィルターを含んでいる。米国特許第４，４７７，５７５号の装置においては、ガラス繊維フリースが赤血球を濾過するために使用されている。その他の特許には紙または樹脂のフィルターの使用が記載されている。発明の要旨本発明は、全血中の分析体の存在を決定するために必要な全ての反応が赤血球による妨害なしに、容易に製造され得る技術により組み立てられた１あるいは多くとも２つの膜装置上で起こる装置を提供するものである。装置は非常に簡単なケーシング内に含まれている。本発明はそれ程限定されてはいないが、簡便には、全血中の心臓の分析体の検出に利用されるように記載されている。それに加え、血液中の広範な種々の分析体、例えば、治療用薬物および濫用薬物を含む薬物；ホルモン、ビタミン、全てのクラスを含むタンパク質、ペプチド；ステロイド；バクテリア；カビ；ウィルス；寄生虫：バクテリア、カビ、ウイルス、あるいは寄生虫の成分あるいは産物、全てのタイプのアレルゲン：正常または悪性細胞の産物または成分;等を検出および／または測定するために使用され得る。特定の例としては、ジゴキシン、ｈＣＧ；インスリン；テオフィリン；黄体形成ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；種々の病的状態の原因または関連生体、例えばストレプトコッカス・パイロジェン（Ａ型）、単純ヘルペスＩ型およびII型、サイトメガロウィルス、クラミジア、風疹抗体、等があげられる。本発明の重要な特徴は、全血の分析に使用されるとき、実質的に全ての赤血球が分離されるような流れがおこるように設計された装置の幾何学的配置である。装置の幾何学的設計の結果として、血漿の一定量が長時間かけて、装置の前以て選択された領域で接触し、かくして結合反応がおこるように充分な接触時間が与えられる。該一定容量は膜の容積能で決められる。図面の簡単な説明本発明は、図面と共に本明細書の部分をなす以下の記述と共に考慮するとき、最もよく理解されるであろう、即ち：第１図は本発明の単層装置の平面図。第２図は本発明の装置の平面図であって、上の長い膜は他の短い膜に関し広げられ１８０°回転されており短い膜の上に重ねられて液体と接触をする。第３図は同一の単層構造の発明の４つの装置を示す本発明の産物の平面図。第４図は上層および下層部材の台上に本発明の２層の装置を示す本発明の別の例の分解図。第５ａ図は第４図に相当する装置の入れ物を通した断面図。第５ｂ図は第５ａ図で用いられる上層膜の平面図。第５ｃ図は第５ａ図で用いられる下層膜の平面図。第６ａ図は第４図に示す上層膜の孔の使用を避けたハウジング装置の断面図。第６ｂ図は第６ａ図で用いられる上層膜の平面図。第６ｃ図は第６ａ図で用いられる下層膜の平面図。第７図は実施例２において使用される単−膜装置。部品は容易に理解できるように名前により明らかにされている。第８図は実施例３の装置である。部品は同様に何であるかを明らかにしている。第９図は同様に命名した実施例４で使用される装置を示す。発明の詳細な説明本発明のこの記載では、装置は、添加領域に添加した血液中の赤血球の流れをクロマトグラフ的に遅らせることにより、全血を血漿の先端とそれに続く遅れて移動する赤血球細胞の先端との流れに変換することからなる膜構造である。本装置は、特に、指穿刺処置で得られる数滴の全血のような少量の液体試料の受け入れおよび診断処置に適しており好都合である。膜構造は、また、診断反応のための基質としても使用される。ケーシングは装置のキャリヤー、ホルダー、あるいは台となる。本発明の物は装置とケーシングの組み合わせである。ここに記載され特許請求される発明に対し主要な貢献要因は、好ましくは、ニトロセルロースから構成されている多孔質膜は膜に沿って移動する赤血球の流れを選択的に遅延させるか阻害するので、その結果赤血球細胞の先端とその下流に血漿の先端を生じるような流れを形成することの発見である。より詳細には、赤血球細胞は全血から濾過されるのではなく、選択された膜物質中で血漿からクロマトグラフ的に分離されるのである。本発明の別の特徴は、実質的に赤血球が存在しない、流れの血漿部分または区域は、ある種の診断適に有用な反応が起こる領域を通してゆっくりと流れるように操作されることである。この特徴は以下に更に詳細に説明される。本発明の装置は、血液試料が添加される試料添加領域、および試料添加領域の下流に、例えば捕捉領域の上流の検出領域を含む延長された反応領域のような、流動領域でデザインされている。この点に関して、本発明の装置は前記に特定した特許に記載されているような公知の装置とは異なっている。全てのそのような装置の決定的な特徴は、分析体例えば血液中のミオグロビンまたはミオシンＬ鎖、は反応領域で抗原／抗体複合体を形成するように分析体に対し着色した移動し得る標識抗体と反応することである。この複合体は運搬液体中に溶解または懸濁され、膜の下流に移動し，捕捉抗体と反応し、可視抗体／抗原／抗体反応産物を形成する。ここにおいて抗原は分析体である。着色物質を産生することにより診断を達成するため全血を使用するとき、全てのそのような装置は赤血球の流れを止めるためにある種のフィルターを用い、着色物の生成および結果の解釈を妨害するのを避けて有用な診断反応が行われる領域から、それらを離している。典型的には、フィルターはガラス繊維、プラスチック、またはセルロースペーパーフィルターであり、それにより、血液を添加領域から反応領域に長方向に移動して、赤血球を分離している。そのような公知の診断の方法とは逆に、本発明の装置は、赤血球細胞が連続して流動するが、しかし、血漿または血清よりもより遅い速度でクロマトグラフ的に分離が達成される。それゆえ、赤血球は、濾過によるよりもむしろクロマトグラフ的に血漿から分離される。全血は、ニトロセルロース膜のような膜に沿って移動するので、比較的速く移動する血漿の流れと比較的遅く移動する赤血球の流れにクロマトグラフ的に分離されるという発見は驚くべきことであった。その結果、赤血球は血漿から分離される。本発明の装置において、最初の免疫反応は、実質的に赤血球のない流れの血漿の先端が生じる前におこる。反応は分離された血漿中で引き続き、診断的に有用な情報を提供する。安定または不安定狭心症または心筋梗塞のような虚血発作中に、発作に特徴的な種々のタンパクが心組織から遊離される。これらのタンパクは、ここでは分析体と称するが、米国特許第５，２９０，６７８号および第５，６０４，１０５号に記載されているような診断的に使用され得る。これらの開示は、ここでは引例としてとり入れられる。分析体の典型的な例はミオグロビン、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオシンＬ鎖、トロポニンＩ、およびトロポニンＴである。これらの特許に記載されているように、全血中のこれら分析体の存在は、積層構造中で抗原／抗体反応により決定される。そこにおいて、分析体はまず標識検出抗体と接触し、それは第１のエピトープと分析体上で反応し、標識抗体／分析体複合体を形成する。複合体は、次いで、捕捉抗体に接触し、分析体上の別のエピトープと反応して、可視標識抗体／分析体／検出抗体反応生成物を形成する。特許に記載されているように、通常以上の量の少なくとも最後の３つの分析体の存在の検出は、医師が心臓発作を安定、または不安定狭心症、あるいは心筋梗塞として正確に特徴づけることが可能になる。他に多くの同様に取り扱うことができる心臓の分析体がある。ほんの１つまたは２つの分析体の装置も同様に得ることができるが、しかし一般的には３つあるいはそれ以上の分析体に適応される装置よりは多くの情報を与える能力はない。本発明の明確な理解は、いくつかの特定の実施態様の記載により、容易になるであろう。その記載は次いで、本発明の設計産物に関する一般的な考慮をいくつか考察することになる。第１図に図示したような膜１０からなる本発明の典型的な装置を示す。膜は試料添加領域１２を含み、それに全血の１あるいはそれ以上の滴数が添加される。前に述べたように、本発明の特別の進歩性は全血が直接分析できること、およびほんの少量の血清、即ち約８から２０μｌあるいはそれ以下しか必要としないことである。この血液量は指穿刺からあるいは点滴注入器あるいはピペットで患者から採取した後に得られ、添加することができる。血液は添加領域１２の下流に、分析体上のエピトープと反応して標識抗体／分析体複合体を産生する標識抗体を含有する検出領域１４を含む反応領域に移動する。この反応はよく知られており、詳細に記述する必要はない。当業者に利用され得るいかなる種々の標識も利用可能である。金属および酵素標識が好ましい。金属標識はその顕著な感受性の故に特に好ましい。金属の中でも、原理的に金がもっとも好ましい、なぜならこの種の反応に広く利用されており、その性質が大変よく解っているからである。更に、金の信号は、公知の方法に従って可溶性銀塩および還元剤の使用により直ぐに視えるように増強することができる。金標識は銀塩を金属銀に還元するように触媒として作用し、可視産物として沈殿する。典型的な反応性の組み合わせは、還元性銀イオンの供給源として働く、乳酸銀と還元剤としてのハイドロキノンである。金属銀は金の粒子の周囲に容易に識別し得る黒い沈殿を形成する。本発明の必須の特徴ではないが、添加領域に始まりそして検出領域へと続く前処置（preincubation）領域をおくことができる。神殿領域は、望ましい反応を妨害しあるいは検出を困難にする産物を除去するのに使用される。典型的な妨害物質はクレアチンキナーゼのイソ型、ＣＫ−ＭＭである。イソ型ＣＫ−ＭＢに対する抗体はＣＫ−ＭＭと交叉反応し、偽の読みを与える。これは、前処置領域にＣＫ−ＭＭに対する充分な量の不溶化抗体をおくことによりＣＫ−ＭＭの全てが、移動試料が検出領域に達する前に除去され、避けることができる。第１図の装置は１または複数の標識抗体を利用することができる。数種の標識検出体を使用するときは、妨害反応を避けるために注意を払わなければならない。抗体を、それらと特異的な分析体と反応する１またはそれ以上の検出領域中に、配置することが、しばしば最善である。標識検出抗体は移動する、即ち検出領域１４中の膜１０に移動時に結合し、それにより標識抗体／分析体複合体は、一度生成すると、下流に自由に移動する。もちろん、本反応、あるいは引続いて記載される反応において使用される抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。そのような抗体の多くは公知であり、容易に入手され、あるいは標準的な操作で作成することができる。血液は添加領域１２から離れて下流に移動するので、赤血球細胞は血漿よりゆっくりと移動し、先端１６を形成する。元の血液試料の血漿成分の部分は血漿区分として下流へと続き、その先端は第１図において１８で示されている。最終的に、そして上に示したように、実質的に全ての赤血球細胞は添加領域１２および赤血球細胞先端１６で取り囲まれた領域に限られている。もし標識抗体／分析体複合体が形成したら、血漿中に溶解しそして捕捉領域２０に向かって運ばれる。捕捉領域では、複合体は捕捉抗体に接触し、それは複合体と反応して検出し得る標識抗体／分析体／抗体反応産物を形成する。標識抗体と分析体の最初の反応は赤血球細胞の存在下で全血の流れの中で行われることが注目される。血液試料中の分析体の適切な分析のために、この点において検出抗体が反応体と反応していることを知る必要はない。赤血球細胞は妨害物ではない。しかし、もし必要なら、複合体は標識抗体の適当な配置によって赤血球細胞先端１６の下流に生じさせることもできるが、しかし、装置の長さを増やすこと必要はない。もし、標識が金のようなゾルであれば、可視的な線が形成するであろうし、それは、上に示したように、金の産物あるいは還元された銀である。もし標識が、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であれば、反応は、標準的な方法に従って、過酸化水素および、オルトフェニレンジアミンのような色素により、検出され得る。第１図の装置は対照領域２２を含む。これは、血流中および血漿中に通常存在するいかなる物質とも反応して可視的産物を産生する産物を含む対照の反応を使用することは所望によるが、しかしそれは望ましいことである、それによって、操作をする者は、添加領域に充分な血液が添加されたこと、および診断反応が行われる機会があったことを、知ることになる。当業者は、記載された反応が夫々特徴的な反応動態を有すること、および夫々が反応が完了するための時間を必要とすることを認識している。捕捉抗体との反応の完了、および充分な可視的産物の生産に充分な時間があることを保証するために、本発明の装置は、血漿の流動速度が遅延するよう、および標識抗体／分析体複合体と捕捉抗体の反応により時間があるように、配列されている。一般的に、液体試料およびその成分の流れの調節または制御は異なった手段で達成される。例えば、膜は、液体の流れ（即ち、血漿の流れ）が膜の終点に拡大して延長するように配列される。流れを制御する別の方法は、流路を、大きさまたは数のいずれかにおいて、制限することにより、適当な流れが生じるように、制御することができる。流れを制御する第３の方法は、前以て定められた容量の試料を膜に添加することであり、それによって、そのような試料の量が、そのような液体の流れに対し膜中において得られる流路を満たすだけの容量に相当することになる。従って、装置は膜またはストリップに属する流れの調節あるいは制御手段を含む。それは、例えば、膜の巾を１またはそれ以上制限すること、あるいは血漿の流れを阻害するために１またはそれ以上の隔壁あるいはそのような流れの障壁を設置することからなっている。そのような隔壁は膜を圧縮し、多孔性を除き、従って、それを通しての流れを阻害または防止することによって、形成される。流れの調節または制限は、また、血漿の流れを延長することによって達成することもできる、それによって、一定量の血漿が捕捉抗体に到達する前に流れねばならない距離が増加する。究極の結果は、血漿の総容量が捕捉領域２０に長時間残留することである。捕捉領域２０とストリップ１０ａの端の間のストリップの容量は捕捉領域２０を通して流れる血漿の容積を決定する。それはストリップが全体的に飽和するとき流れが停止することである。更に、これは、赤血球細胞の余計な流れを防止し、そして捕捉領域の不明確さから赤血球を予防する。当然、装置のデザイン、構造、形および大きさの変形は本発明の範囲内に予想されている。延長の別の機能は、最小の血漿量について、赤血球細胞の先端と血漿先端１８の間を最大に分離することを提供するにある。このことは、捕捉領域２０に赤血球細胞が移動する可能性を最小にし、結果を混乱させないために重要である。血漿区域が従わなければならない流路の延長を達成するにはいくつかの手段がある。そのような一つの手段は、ネック２４を形成する膜の両サイドのくぼみを示す第１図に示される。ネックは膜の端をカットすることにより形成される。しかし、そのようなカットは、例えば、レーザー装置により、達成されねばならない。なぜなら通常の方法は毛管部分、即ち孔、を膜の通路に端に沿って圧縮し、そして液体の流れを結果として妨害するからである。膜を圧縮することによって、所望の形の圧縮区分を形成し、それを通して血漿が不安定に流れるように形成することができる。同様の結果は、膜をワックスあるいは他の不溶性物質で含侵することによって、所望の形を形成させ、それを通して血漿が流れないように、達成することができる。更に別の変形は、第１図でネック２４として示した領域において、膜を横断して、円形、四角形または延長されたデザインの連続に圧縮することを含む。もし、この変形を選択するならば、膜のくぼみはないが、しかし、ちようど岩が川の水の流れを妨げるのと同様の方法で、圧縮された区分は血漿の流れを妨げる。第２図は本発明の実施態様を示す、ここにおいて添加領域１２および検出領域１４は、上層膜層２９の上流端の下にある下層膜層２６中にある。この設計の利点は装置の長さおよび装置を通しての流動時間の両方共減少することである。これは装置を通して試料の必須の流れを保ちながら、そしてクロマトグラフ的効果の損失なしに達成される。それゆえ、より多くの血液量がより短い時間で分析することができる。別の変形構造は局所的に膜の巾を増加させたものである。しかし、これは、血漿が集められ、しかし流動しない沈滞領域を形成することによる流動性質が変わるので、好ましくない。第２図の装置において、添加領域１２は通過孔２７の下にある下層２６の部分であり、孔２７を通して血液は、下層２６中を下流へ検出領域１４を通りそして上層２９へと流動する前に、添加される。上層２９の添加領域１２内にある通過孔２７の周辺領域は、例えば圧縮またはワックスにより形成したブロックされた領域２８である。このブロッキングの目的は、血液が上層２９中を下層に流れることを防ぐことおよび下層２６の検出領域に流動する血液のための通路を形成することである。全血は検出領域１４を通して流動し、そこて、分析体は、もし存在すれば、標識された検出抗体と接触し反応し、そして上層部材２９へと流入する。第２図の装置の操作はその後については第１図の装置と同じである。赤血球細胞先端１６、先端１８の血漿流、対照領域２２およびネック２４がある。第２図の装置において、下層部材２６の下流端３０は上層部材２９のブロック領域２８と重複しており、血液の流路をしていることが注目される。ブロック領域２８は液の流れを制限するワックスまたは他の水溶液不浸透性被覆から構成されている。第２図において示した配列の最終的な効果は、血液を添加領域１２から検出領域１４を通り捕捉領域２０の方向に流すための流路を形成することである。流れは、なお、膜に沿っていてクロマトグラフ効果が維持されることは必須である。第２図に示す層の位置は逆にすることもできる。そのような例においては、通過孔２７は不要である。なお流れの方向は実質的に膜に沿っている。重複した膜構成の効果は血液の量を最大にすることである。それで装置は、なお必須的に長方向の流れを保持しながら過剰のテスト期間なしに、利用することができる。第３図は、４つの装置が同じ基板６０上にある本発明の実施態様を示している。全ての装置は添加領域１２を共有している。添加領域１２に加えられた血液は、それぞれの装置を通じて流動し、前記したのと同じように反応する。複数の装置の例は、膜シート上に、各装置に適当な流路を形成するようにワックスあるいは他の物質と共に、圧縮または加熱により、あるいは線を印刷することにより、各装置を決定する線を形成することにより、１つの膜物質のシート上に印刷されているものである。代わりとして、複数の装置は膜からそれを切断し、流動する血液または血漿に対し毛管吸引現象がない、例えばプラスチックシートのような不活性基板を接着することによって、別別に形成することができる。事実、ポリエステルの裏張りを有するニトロセルロース膜は市販されており、本発明の種々の装置をつくるのに、目下の所、好ましいものである。他の複数の装置の実施態様の配置については当業者に自明である。例えば、装置は第４図に示すように並列して設置することができる。第４図は、本発明の実施態様を示す。ここで２つの近接した装置はカバー部材３６を有するケーシング３０および支持部材３４中に支持されている。図示するように、本発明の産物は２つの装置を支持している、それぞれ検出領域１４を有している。第４図において、これらの番号は、他の図における番号と同じであり、同じ意味を有する。図は、２つの結合した装置を示す分解図であり、夫々１０と支持されており、ケーシング中、ポリエステルシート３２で裏打ちされており、支持部材３４および支持部材３４につながるカバー部材３６で装置１０を同封していることからなる。カバー部材３６は、全血を添加するための添加領域１２と記載された通過孔３８を含む。また、装置１０の夫々に存在する捕捉領域２０および、もし存在するなら、対照領域２２と記載された、視認ウィンドウ４０を含み、操作者が結果を見ることができるようになっている。カバー部材３６は充分な試料指示孔４２を含んでいてもよい。それにより操作者が、試験が完成するに充分な血液が加えられたかどうかを決定することができる。装置には試験終了信号を示す孔４４を含むこともできる、それにより操作をする者に、早期に読み取りを行うことによる偽陰性の危険なしに結果を読むことができるように充分な時間が経過したことを知らせる。同様の安全性の必要性はストップウオッチやその他の時計装置でまかなうことができる。もし試験終了信号が必要ならば、そしてもし１つだけ使用する場合なら装置の終端に、あるいはもし複数の装置が使われるなら装置の１つの終端に、色素スポットを置くことができる。いずれにせよ、染料は視認孔４０の上流にある。染料は流れているプラスマに溶解して、視認ウィンドウ４４に運ばれ、操作者に試験を読む時間であることを知らせる。更に詳細には、装置１０（第４図）の領域４６は、視認ウィンドウ４４の下まで延長されているタイミング装置の配置を示す。色素は対照領域２２とウィンドウ４４の下に位置する延長領域４６の間に置かれる。ウィンドウ４４の下に色素の出現は、操作をする者に結果を読む時であるというシグナルを与える。部材４８はケーシング３０中の装置を支持するものである。第５図Ａは単純化したカバー部材５１および単純化した下層支持部材５２を示す。開口５３は上層膜２９および、従って下層膜２６上における、孔２７を通して添加される血液へのアクセスを提供するものである。２つの部材の暗い部分はポリエステル背部に、点を付した部分はニトロセルロールに相当する。上層部分の斜線領域２８は、血液が直接上層膜に運ばれるのを防ぐためのワックスバリアーである。下層部材１２の斜線領域５４ａおよび５４ｂは、単に隅における血液のよどみを防止するためのものである。ワックス線５５は血液の下層および上層膜への流出速度を制限するために働く。隙間領域５６、開口５３の周囲、は上層ハウジングと上層膜のポリエステル表面の間に別に生じる可能性のある毛細管通路に沿って血液が運ばれるのを防止する。捕捉領域５７の巾は狭部に対して比較的拡大されており、分析結果がよりよく見えることになる。第６図Ａは上記に類似しているが、上層における孔を作る必要がないものである。上層膜１０はより短くつくられており、それで開口６３は、下層膜２６の添加領域１２に、血液添加が直接接続している。その他の特徴は上記したとおりであり、そして番号は同じ意味を有している。本発明の試験装置の操作性は、全血から赤血球細胞を最終的に分離して、捕捉領域２０に達する標識抗体／分析体複合体を含む実質的に澄明な血漿を得るようにすること、それで色の変化が赤血球細胞の強い色調からの妨害なしに検出し得ることにかかっている。これまでは、そのような結果は、赤血球細胞を濾過により分離し、それで膜の厚さを通して流れがあるような、分離用垂直の膜を使用することなしには実現され得なかったのである。ほんの少しの観察でも、赤血球細胞先端と澄明な血漿が、限定された寸法と孔の大きさの多孔性膜上に現れることを決定するのに充分である。一度それが判ると、当業者は、試験する分析体、使用される抗体の分析体に対する親和性、および反応の動態をしることで、どこに抗体および捕捉抗体、をおくか、装置の長さはどうかを知るであろう。たとえこのような要素が知られていなくても、抗体についての至適位置および至適信号を与える血漿流の長さ、を経験的に決めることができる。この全ては当業者に容易である。全血より赤血球および血小板をクロマトグラフィーにより分離しうるものであればいずれの膜も本発明に使用できることは、当業者であれば理解しうるものである。しかしながら、手頃な値段で容易に入手しうることから、ニトロセルロースが最も好ましい。ニトロセルロースは、クロマトグラフィーおよび関連分野で長年にわたって使用されてきたので、研究者および技術者は、その特性を熟知している。市販のニトロセルロースは、どのような長さおよび幅の薄片にも加工できる。本発明のニトロセルロース膜は、互いにつながった様々な大きさおよび方向の複数の微細孔よりなるスポンジ状の形態が特徴である。これにより、調べようとする液体が試料投入口より移動しうる事を示している。本発明において実際に赤血球と血小板を分離するに当たり，目的の反応が予め決められた部位で起こるように、膜の材質、形、寸法について適当なものを選択する。この部位は、赤血球の流れと血小板の流れの先端の相対的な速度によって選ばれる。目的反応の動態、抗体の相応する抗原決定基との親和性，反応物質の大きさおよびその他の因子は既知であるかまたは、一般的に用いられる試験方法で決められる。ニトロセルロース膜の種類は、種々の細胞の大きさによって選べるが、好ましい膜は、もしフィルターとして用いるのであれば、膜の垂直面に縦に流れる液体の流れのフィルターであり、３μｍ以上１２μｍの粒子の通過を妨げる。本発明の実施については、ポアサイズ５から１２μｍ、好ましくは、３から８μｍが望ましい。多少の変動は可能である。しかし、ポアザイズが減少すると膜内での液体の移動が減少し、それにより診断に要する時間が増加する。もし孔が大きすぎると、通過時間が短縮され，その結果として、反応物質が分析反応ための充分な時間互いに接触することがなく、または、そのような限られた範囲で起こるため、望ましい結果をもたらさない。ポリエステルまたは他のフィルムで補強したニトロセルロース膜は市販されており入手できる。補強されていない膜は非常に弱く、破れやすいので、本発明では、補強してあるものを使用するのが好ましい。さらにフィルムは，実質縦の流れのチャンネルが膜の正しい設置によって作られるように流れる液体を通さない。そのような膜は、様々なポアサイズのものがGerbermembrane of Gerbershause n，独より入手可能である。本発明に用いられるラベルした抗体の作成方法は、当業者には良く知られており、詳細を記載する必要はない。望ましいラベルは、金属ラベルであり、特に金ラベルが好ましい。可視度と感度は公知の方法で銀を使用することにより増強する。本発明に用いられる金ラベル抗体の好ましい大きさは３５から６０ｎｍであるが、分析物の濃度や反応物質の親和性のような良く知られている要因によってはかなりの変動が認めうる。本発明に用いられる抗体は標準的な方法で調製する。例えば、Faifre,Howe,Mi lstein et al.,Nature Vol.266,7,550-552,April 1977を見るとよい。モノクロナール抗体の調製についての未開示部分については、参考文献よりここに取り入れられている。ニトロセルロースのような基質に抗体を固定する方法は公知であり、本発明の器具作成に利用できる。ニトロセルロースは、蛋白質と良く結合する。そこで固定化検定抗体は、予め決められた部位内の捕獲部位に用いるだけでよい。ラベルした反応抗体は最初に仔ウシ血清アルブミンなどで反応部１４を満たして動きながら膜に結合する。本発明は、分析物に適した親和性を有する抗体が入手可能な時、抗体が例えば金属や酵素ラベルで有効にラベルされ得る時、反応動態が良好な時、様々な反応物が膜を通過する時に最適な実施方法が可能であるが、その際以下の簡単な４段階で行われる。１）少量の血液を血液試料滴下部に滴下する。２）血液を反応部へ移動させる。もしその時反応物が存在すれば、反応物に対する遊離しているラベルされた抗体とラベル化抗体／反応物を形成し，血液と一緒に流れる。３）複合体を含む血液が膜を通過して赤血球先端１６まで流れ、そこから別れて血小板先端１８が形成されるようにする。血小板にはラベル化抗体／反応物が溶解しており、膜を通過して捕捉領域２０まで運ばれる。４）血小板の流れが赤血球から分離され、検出可能なラベル化抗体／反応物／捕獲抗体反応生成物が形成されるのに充分な時間捕捉領域２０で検定抗体と接触する。しかし、もし上記の条件のうち１つまたはそれ以上が存在しない場合には、最適な条件も変化する。例えば、時々起こることであるが、ラベル化抗体／反応物複合体は，極めてたやすく形成されるにも拘わらず、充分な検定抗体と結合せず容易に検出可能なシグナルが生成されないことがある。これは、充分な複合体が検定抗体と反応しないかまたは，反応生成物を形成するのに適さない配列の検定抗体と反応してしまうと起こるのである。他に考え得る問題としては、反応時間の不足や抗体の低親和性がある。このような問題点は、当業者には良く知られているように、アビジン／ストレプトアビジン反応またはそのアナローグの反応を利用することで回避できる。ビオチン／アビジン法（例；ビオチン／ストレプトアビジン）の利用は、この発明の多様性を示している。ビオチンに対しては高い親和性を持つストレプトアビジンを使用する。さらに，ビオチンの捕獲される物質としての使用およびストレプトアビジンの捕獲する物質としての使用は、これらの試料のより早く、より効果的な相互作用を起こすという利点がある。この過程の一例として、２つの抗体を反応部に固定し、ストレプトアビジンを検定部に固定する。反応抗体は好ましくは金のような金属でラベルされ、同一域の他の抗体はビオチンでラベルされる。抗体反応物が血小板中に存在するならば、ラベル化反応抗体／反応物／ビオチンラベルされた反応抗体を含む複合体が反応部で形成される。複合体は膜を通って血小板中を検定部へ移動する。ストレプトアビジンは検定部に固定されている。複合体がストレプトアビジンに到達すると、ストレプトアビジンがビオチンと結合し，小さな部位に複合体が集まる。その結果シグナルが検出可能となる。このビオチン反応の好ましい変化としては、ビオチンラベル化抗体／反応物／ラベル化反応抗体複合体が検定部でのビオチンとストレプトアビジンの反応によって、検出可能となる。この反応式は、例えばミオシンＬ鎖の検出に用いられる。具体的には、器具は、検出部で，２種類のＭＬＣ抗体を用いる。一方は金でラベルし、もう一つは、ビオチンでラベルする。もし試験血液中にＭＬＣが存在すると、作られる複合体は、金でラベルされた抗体、ＭＬＣ、ビオチンラベルされた抗体を含む。本複合体は検定部まで移動し、固定化されたストレプトアビジンと反応し、可視可能なシグナル物質を生成する。本発明は、主として心疾患に関する分析物の検出について述べてきた。例えば、ＣＫＭＢ、ＭＬＣ、ミオグロビン、グリコーゲンフォスフォリナーゼ、トロポニンＴ、トロポニンＩなどである。本発明の製品は、当業者にとって明らかに可能と思われるその他の全血中の物質、例えばピロリ菌、抗体、ＨＣＧ、ｈＬＨなどについても利用できる。様々な観点からここに記載され、クレームされているのは、簡単であるが、様々に利用できるものである。本発明の製品は、容易に製造可能で、注入した溶液の廃棄方法やフィルターを何層か重ねることなどの先行技術を不要とする。発明の第一の特色は、ごく少量の血液ですむことである。さらに洗浄液を必要としないことである。以下にあげる例は、一例としてあげるもので、これに限られるものではない。実施例１赤血球の分離ニトロセルロース膜（ポリエステル補強，３μｍおよび８μｍポアサイズ，Ge rbermembrane GmbH社製,Gerbershansen,独）の、水平クロマトグラフィー時における全血中の赤血球の流れを遅延させる能力を調べた。膜は、長さ４５mm，幅６mmに切断する。一方の端の滴下部（７mm×６mm）に、１５μｌの全血を滴下する。クロマトグラフィーによる分離の終了後，血小板先端部と赤血球先端部の始点からの距離を測定し下記の様な結果を得た。実施例２全血中のミオグロビンの検出２０mm×１０mmのシート状膜（ニトロセルロース、８μｍポアサイズ、Gerber membrane社製）上に、図７に示された輪郭をワックスプリンティング法（Labora tory News January 1996に記載）で作成した。抗ミオグロビン−金ゾル共役体は、British Biocell,Inc．（BBI）,Cardiff,英より入手した。４０mm金ゾルは、１．５μ９／ml，光学濃度５２０ｎｍの２Ｍｂ−２９５抗体（Spectral Diagnos tics,Torontoより入手）でロードした。この溶液１０mlに、４００mgの仔ウシＩｇＧ（Sigma-Aldrich GmbH社製，Deisenhofen, 独）および５mgのオクチル―Ｄ―グルコピラノシド（Fluka Chemie AG社製，Buc hs,スイス）を添加し、この混合液０．８μｌを反応部に使用した。検定線は、ポリクロナールウサギ抗ミオグロビン抗体（Spectral Diagnostics社製（ロット番号ＡＰＭＯ７５Ｃ））溶液（濃度３mg／mlリン酸緩衝生理食塩水に溶解、ｐＨ７．３）で検定部を作成して、調製した。血液試料滴下部に、ミオグロビン濃度で下記のようになるように４μｌの全血を滴下し、３−３．５分後の結果は、下記のようになった。ミオグロビン濃度検定線５０ｎｇ／ml 弱２００ｎｇ／ml 鮮明５００ｎｇ／ml 強実施例３全血中のＣＫ―ＭＢおよびミオグロビンの同時検出図８に図示された様なシート状膜上の輪郭は、２６mm×２０mm（上部膜）および1０mm×２０mm（下部膜）上に、‘edding 780’ペン（Edding AG社製Ahrensbu rg,独）を用いて指定された線を引いて作成する。インクが乾燥すると，実施例２のワックスプリンティング法と同様に水相に対し障壁を作る。上部膜相（ポリエステル補強ニトロセルロース膜、８μｍポアサイズ，Gerberme mbrane GmbH社製）の検定部は、ストレプトアビジン(Sigma-Aldrich GmbH社製、 Deisenhofen,独)水溶液（３０mg／ml）を注入した第一線を含む。第二線に注入する溶液は、ウサギ抗ミオグロビン抗体（Spectral Diagnostics社製，ロット番号９５ＡＰＭ０７５Ｃ）３mg／mlリン酸緩衝生理食塩水溶液を使用した。膜の湿り気の復元を増加させるために，その部分に０．０５％（重量／重量）オクチル −Ｄ−グルコピラノシドの穏やかな洗剤水溶液（Fluka AG社製、スイス）を注入した。下部膜相（ポリエステル補強ニトロセルロース膜、３μｍポアサイズ（Gerber membrane GmbH社製）の検出部に以下に記載の溶液を注入した。ａ）３μｌ金ゾル共役溶液この溶液は、以下の様に調製する。（抗ＣＫ−ＭＢ−，および抗ミオグロビン−金ゾル共役は、BBI，Cardiff，英より入手）９００μｌの抗ＣＫＭＢ−金 −ゾル共役（４０ｎｍ金−ゾルは、２２μｇ／ml（ＯＤ１０）の５ＣＫＭＢ−６抗体（Spectral Diagnostics社製）でロード）に、１００μｌの抗ミオグロビン金ゾル共役体（１５μｇ／ml（ＯＤ１０）でロードした４０ｎｍ金−ゾルを添加した。更に，オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（Fluka AG社製,Buchs,スイス）１０mgを加え、混合した。ｂ）２μｌビオチン化抗体溶液２μの９．５mg／ml,ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Sigma-Aldrich GmbH社製）溶液をアセトニトリル−水（１：１，体積／体積）１mlに加えたものを２mg／ml ｒＣＫＭＢ―２８抗体（Spectral Diaagnostics社製，７５ｍＭ，ｐＨ８.５リン酸カリウムに溶解）を含有する溶液１mlに加えて混合し、２時間インキュベートし、さらに２０μｌの５００ｍＭＤＬ−リジン−１−ハイドロクロライド（Fluka AG社製）、および１００ｍＭリン酸カリウム（最終ｐＨ８．５）を加え０．５時間インキュベートした。溶液はｐＨ７で５ｍＭリン酸カリウムおよび１０ｍＭ塩化ナトリウムで一晩透析した。抗体溶液は．水で３５μｇ／mlの濃度になるように希釈し、この希釈溶液１mlに１０mgのクロテインＣおよび３mgのオクチル−Ｄ−グルコピラノシドを加え、ビオチン化抗体溶液を作成した。ｃ）３．５μｌ緩衝液（７５ｎＭ HEPES，ｐＨ６．８および０．０５％オクチル −Ｄ−グルコピラノシド２５μｌのミオグロビン（Spectral Diagnostics社製、ロット番号３−１０２３８），またはｒＣＫ−ＭＢ（Spectral Diagnostics社製、ロット番号３−２４３６３Ｇ）を含有するヘパリン化全血を指示された濃度で試料滴下部位に滴下した。結果は下記の通りである。（９分から１２分以内）実施例４全血中のトロポニンＩの検出図９には、ステットラールモカラー３１３ペン（Steadtler社製，Nuernberg, 独）を用いて、３０mm×３５mmのシート状膜（ニトロセルロース、３μｍポアサイズ、Gerbermembrane）上に図案を描いた。検定部において、１３mg／mlのストレプトアビジン（ポリ）（MicrocoatGmbH 社製Penzberg,独）を注入して、線を作成した。乾燥後、膜の反応部および試料滴下部に、０．５％クロテインＣ水溶液（Croda GmbH社製）を注入し、非特異的な結合を防止した。反応部には，更に以下の溶液を注入した。ａ）５μｌ金ゾル共役溶液９０μｌの抗ＴＮ−Ｉ金ゾル共役（６０ｎｍ金ゾル１０μｇ／ml（ＯＤ１０）の抗体２Ｉ−１４（Spectral Diagnostics社製）（ＯＤ３０）でロードし，２５０ｍＭサクシン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を１０μｌ加えて混合し，金／ゾル共役溶液を作成した。ｂ）２μｌビオチン化抗体溶液ビオチン化は、実施例３と同様に抗ＴＮ−Ｉ抗体８Ｉ−７（Spectral Dia gnostics社製）を用いて行う。このビオチン化抗体溶液（濃度６００μｇ／ml）５０μｌに、５０μｌの０６％オクチル−Ｄ−グルコノピラノシドおよび２００ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．５溶液を加えて混合し、ビオチン化抗体溶液を作成した。３５μｌのヘパリン化全血（指示された濃度のＴＮ−Ｉを含有）を試料滴下部に滴下し、得られた結果は下記の通りである（９から１２分）。本発明は、ここに記載し示した実例に限定されないことを理解されるべきである。それらは本発明を実施するに最良の態様の単なる実例であると考えられ、そして形式、サイズ、部品の配列および操作の詳細の変形を可能にするものである。本発明は、特許請求の範囲により定義された精神と範囲内にあるそのような修正の全てを包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの多孔質膜を有し、膜に沿って横方向に流動する全血試料中の分析体の存在を測定するに適した診断装置であって、該膜は全血試料が添加される試料添加領域を有し、試料添加領域の下流、延長された流動領域、には検出領域および捕捉領域を含み、検出領域は、下流方向に移動する可動性の抗原／分析体複合体を形成するように反応する、可動性の標識された検出抗体を含み、膜は血漿から赤血球細胞をクロマトグラフ的に分離して捕捉領域に向かって移動し、そして赤血球細胞の先端をその上流に有するように血漿の先端を形成するように作用し；いずれの複合体の主要部分も、実質的に赤血球細胞が存在しない、２つの先端の間の流動部分に溶解して存在し、捕捉領域は複合体と反応して検出し得る産物を生じる反応体を含み、ここにおいて赤血球細胞の先端は、捕捉領域を侵蝕しないか、あるいはそれを過ぎて流動しない、ことを含む診断装置。２．反応体が分析体に対する捕捉抗体である請求項１記載の装置。３．検出領域は、また、ビオチン標識抗体を含み、反応体がストレプトアビジンであり、そして複合体が標識抗体−分析体−ビオチン標識抗体複合体である請求項１記載の装置。４．標識抗体は分析体の１つのエピトープと反応し、反応体は、抗体上の他の１つのエピトープと反応する抗体である請求項１記載の装置。５．該多孔質膜が単一膜である請求項１記載の装置。６．該多孔質膜がニトロセルローズから調製される請求項１記載の装置。７．該多孔質膜は、血漿から赤血球細胞を分離するのに役立つ該試料添加領域の下流に位置する流動制御手段を含むことからなる請求項１記載の装置。８．該流動制御手段が多孔質膜の長方向部分に沿って巾が減少していることよりなる請求項７記載の装置。９．該多孔質膜がその部分を除くことにより巾が減少されていることよりなる請求項８記載の装置。１０．該流動制御手段が、多孔質膜の長方向部分に沿って該多孔質膜内に、少なくとも１つの液体不浸透性領域を配置していることよりなる請求項７記載の装置。１１．該多孔質膜の巾における減少は多孔質膜の長方向部分の側端に沿った液体不浸透性組成物の配置により規定されることよりなる請求項８記載の装置。１２．該多孔質膜の巾に沿って存在する複数の分離した液体不浸透性領域があることよりなる請求項１１記載の装置。１３．全血中の分析体の存在を検出する方法において、ａ．該全血の少量を装置に置き、該装置は多孔質よりなり、該膜は全血試料が添加される試料添加領域を有し、試料添加領域の下流、延長された流動領域、には検出領域および捕捉領域を含み、検出領域は、下流方向に移動する可動性の抗原／分析体複合体を形成するように反応する、可動性の標識された検出抗体を含み、膜は血漿から赤血球細胞をクロマトグラフ的に分離して捕捉領域に向かって移動し、そして赤血球細胞の先端をその上流に有するように血漿の先端を形成するように作用し；そしてｂ．該膜の捕捉領域を、検出されるべき分析体の存在の該反応信号によって、反応の存在のため試験する、ことよりなる全血中の分析体の存在を検出する方法。