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Gebiet der Erfindung
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Ausführungsformen
der Erfindung betreffen Techniken zur Bestimmung von Bindungsaffinitäten von Molekülen zu einem
molekularen Bindungspartner. Spezifischer betreffen Ausführungsformen
der Erfindung Verfahren zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität von Antikörpern zu
einem Zielantigen durch Inkontaktbringen jedes Antikörpers mit
begrenzten Verdünnungen
des Antigens.
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Hintergrund der Erfindung
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Während einer
Immunantwort werden B-Zellen zur Erzeugung von Antikörpern stimuliert,
die spezifisch an Moleküle
binden, die das Immunsystem aktivieren. Die genetischen Rekombinationsereignisse,
die bei der Synthese von Antikörpern
stattfinden, ermöglichen
es Tieren, eine immense Vielzahl von Antikörper zu erzeugen, jeder mit
seinen eigenen Merkmalen wie Bindungsspezifität und Bindungsaffinität. Antikörper werden
gegenwärtig
für diverse
diagnostische, bildgebende oder therapeutische Anwendungen verwendet.
Antikörper,
die erfolgreich für
diagnostische, bildgebende oder therapeutische Anwendungen verwendet
werden können,
erfordern oft spezielle Merkmale. Insbesondere diktieren oft die
kinetischen Eigenschaften ihre Verwendbarkeit. Im Allgemeinen zeigt
die Effektivität
oder Eignung eines Antikörpers
eine starke positive Korrelation mit der Affinität des Antikörpers zu seinem Ziel. Da Antikörper mit
höherer
Affinität
in der Lage sind, ihr Ziel schneller zu binden und länger an
das Ziel gebunden zu bleiben, sind sie im Allgemeinen bei niedrigeren Konzentrationen
wirksam. Monoclonale Antikörper
können
mittels einer Vielzahl von Techniken erzeugt werden, einschließlich der
Hybridomtechnik, welche die Fusion von Antikörper produzierenden B-Zellen
mit Myelomkrebszellen involviert. (Köhler & Milstein (1975) Nature 256: 52–53). Die
resultierende Hybridomzelle ist eine "immortalisierte" Zelle, die einen Antikörper einer
einzigen Spezifität
sezerniert (monoclonaler Antikörper). Ein
alternatives Verfahren für
die Erzeugung von monoclonalen Antikörpern wird als Selektierte
Lymphocyten-Antikörper-Verfahren
(SLAM) bezeichnet, beschrieben Im
U.S.-Patent
Nr. 5,627,052 mit dem Titel "Methods for the production of proteins
with a desired function" und
in "A novel strategy
for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes
producing antibodies of defined specificities" Babcook et al. (1996) Proc Natl Acad
Sci USA. 93: 7843–8.
Dieses Verfahren erlaubt einem zunächst die Identifizierung von B-Zellen,
die Antikörper
mit erwünschten
Merkmalen machen, wie Bindungsspezifität, Funktion und optimale Kinetik.
Die selektierten B-Zellen
werden dann isoliert und dann werden durch molekulare Techniken
wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Gene für die variable
Domäne
des Antikörpers
gewonnen, die den bindenden Teil des Antikörpers codieren, und in Expressionsvektoren
cloniert, die eine Domäne
der konstanten Region des Antikörpers
haben. Die Expressionsvektoren werden dann in Zellen wie CHO- oder
NS0-Zellen transfiziert, um sezernierte Antikörpermoleküle zu produzieren. Dieses Verfahren
erlaubt die praktisch ungebremste Produktion des gewünschten
Antikörpers.
Andere Methoden wie das Phagen-Display oder die virale Immortilisation
(einschließlich
Epstein Barr-Virus (EBV)) von B-Zellen wurden ebenfalls erfolgreich
bei der Erzeugung von monoclonalen Antikörpern verwendet.
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Während des
SLAM-Verfahrens werden Millionen von B-Zellen auf die Spezifizität, Funktion
und kinetischen Charakteristika der Antikörper durchmustert, die sie
produzieren. Für
ein selektiertes Ziel können
Tausende von zielspezifischen B-Zellen
identifiziert werden. Beispiele von bekannten Verfahren für das Screenen umfassen
das Screenen auf Antikörper,
die (1) an nativ exprimiertes Antigen auf der Zelloberfläche binden,
(2) an Zelllinien binden und Apoptose induzieren, (3) an Zellen
binden und entweder Proliferation induzieren oder Proliferation
blockieren und (4) an den Liganden binden und die Bindung des Liganden
an den Rezeptor blockieren, und umgekehrt. Die Durchführung von
formalen Affinitätsmessungen
von großen
Panels von Antikörpern
ist ein zeitraubendes, teures und ineffizientes Verfahren für die Identifizierung
von optimalen Antikörpern. Demgemäß besteht
ein Bedarf an einem einfachen, schnellen und genauen Mechanismus
für das
Screenen von Antikörpern
zur Bestimmung ihrer relativen Bindungsmerkmale.
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Watkins
et al. haben die Bestimmung der relativen Affinitäten von
Antikörperfragmenten,
die in Escherichia coli exprimiert wurden, mittels eines enzymgebundenen
Immunadsorptionstests (ELISA) beschrieben. (Watkins et al. (1997)
Anal Biochem 253: 37–45).
Das
U.S.-Patent Nr. 5,800,815 betrifft
Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung der Entzündung und
von anderen pathologischen Zuständen
unter Verwendung neuer blockierender P-Selectin-Antikörper.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren für die kinetische Reihung von
jedem Antikörper
in einem Satz von Antikörpern,
indem man einen Satz von verdünnten
Antigenpräparationen
herstellt und danach die Bindung von jedem Antikörper in dem Satz von Antikörpern an
die verdünnten
Antigenpräparationen
misst. Während
des Bindungstests werden Antikörper
und Antigen kombiniert, die Bindungsreaktion wird bis zum Gleichgewicht
gehen gelassen und nachdem das Gleichgewicht erreicht ist, wird
jeder Antikörper
vorzugsweise mit einer nachweisbaren Markierung versehen und die
Stärke
des Markierungssignals von jedem Antikörper steht in Relation zu der
Bindungsaffinität
des Antikörpers
für eine
verdünnte
Antigenpräparation.
Es kann somit ein Vergleich der relativen Affinität von jedem
Antikörper
zu jeder speziellen Antigenpräparation
durchgeführt werden.
Antikörper,
die an die verdünnteren
Antigenpräparationen
binden, haben eine höhere
relative Affinität zu
dem Antigen, während
Antikörper,
die nur an konzentriertere Antigenpräparationen binden, eine relativ
niedrigere Affinität
zu dem Antigen haben.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung der relativen
Bindungsaffinitäten
von Antikörpern
zu einem Antigen. Diese Ausführungsform
umfasst: Bestimmung der begrenzenden Konzentration eines Antigens,
um den Nachweisbereich von Antikörperaffinitäten für das besagte
Antigen zu maximieren; Bereitstellung eines Satzes an Antikörperlösungen,
wobei die Konzentration an Antikörpern
in jeder Antikörperlösung bekannt
ist; Inkubation der begrenzenden Konzentration eines Antigens mit
jedem Mitglied des Satzes an Antikörperlösungen; Messung des relativen
Maßes,
mit dem der Antikörper
in jedem Mitglied des Satzes an Antikörperlösungen an die begrenzenden
Konzentration des Antigens bindet; und Reihung der Antikörper in
jedem Mitglied des besagten Satzes an Antikörperlösungen auf der Basis ihrer
Bindungsaffinität
zu besagten unterschiedlichen Lösungen,
um die relativen Bindungsaffinitäten
von jedem der besagten verschiedenen Antikörper zu dem besagten Antigen
zu bestimmen.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung der relativen
Bindungsaffinitäten
eines Satzes von Antikörpern
zu einem Antigen, welches umfasst: Bereitstellung einer Antigenlösung, welche
eine erste Verdünnung
des Antigens umfasst, wobei das besagte Antigen mit einer ersten Markierung
markiert ist, und eine zweite Verdünnung des Antigens, wobei das
besagte Antigen mit einer zweiten Markierung markiert ist; die Bereitstellung
eines Satzes von Antikörperlösungen,
wobei jede Antikörperlösung im
Wesentlichen die selbe relative Konzentration des besagten Antikörpers hat;
die Messung der Bindung des Antikörpers an die erste Verdünnung des
besagten Antigens; die Messung der Bindung des Antikörpers an
die zweite Verdünnung
des Antigens; und die Reihung der Antikörper in dem Satz an Antikörperlösungen, die
an eine relativ verdünntere
Antigenpräparation
binden, da sie eine höhere
relative Affinität
haben, und der Antikörper,
die im Wesentlichen nur an eine relativ konzentriertere Antigenpräparation
binden, da sie eine relativ niedrigere Bindungsaffinität zu dem
Antigen haben.
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Noch
eine andere Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinitäten eines
Satzes an Molekülen
an ein Bindungspartnermolekül.
Dieses Verfahren umfasst: die Bestimmung der begrenzenden Konzentration
eines Bindungspartnermoleküls,
die den Nachweisbereich an Molekülaffinitäten für das besagte
Bindungspartnermolekül
maximiert; die Bereitstellung eines Satzes an Moleküllösungen,
wobei die Konzentration an Molekülen
in jeder Moleküllösung bekannt
ist; die Inkubation der begrenzenden Konzentration des Bindungspartnermoleküls mit jedem
Mitglied des Satzes an Moleküllösungen;
Messung des relativen Maßes,
mit dem die Moleküle
in jedem Mitglied des Satzes an Moleküllösungen mit der begrenzenden Konzentration
des Bindungspartnermoleküls
binden; und die Reihung der Moleküle in jedem Mitglied des Satzes
an Moleküllösungen auf
der Basis ihrer Bindungsaffinitäten
zu den besagten verschiedenen Lösungen,
um die relativen Bindungsaffinitäten
von jedem der besagten verschiedenen Moleküle zu dem besagten Bindungspartnermolekül zu bestimmen.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die
Ausführungsformen
der Erfindung betreffen Verfahren für die schnelle Bestimmung der
differentiellen Bindungseigenschaften innerhalb eines Satzes an
Antikörpern.
Entsprechend kann die schnelle Identifikation von optimalen Antikörpern für die Bindung
an ein Ziel bestimmt werden. Jeder Satz an Antikörpern, der gegen ein spezielles
Zielantigen erzeugt wurde, kann an eine Vielzahl von Epitopen auf
dem Antigen binden. Zusätzlich
können
die Antikörper
mit verschiedenen Affinitäten
an ein spezielles Epitop binden. Ausführungsformen der Erfindung
stellen Verfahren für
die Bestimmung bereit, wie stark oder wie schwach ein Antikörper an
ein spezielles Epitop im Verhältnis
zu anderen Antikörpern
bindet, die gegen das Antigen erzeugt wurden.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung wird durch die Herstellung eines Satzes von verdünnten Antigenpräparationen
und danach die Messung der Bindung von jedem Antikörper in
einem Satz von Antikörpern
an die verdünnten
Antigenpräparationen
bereit gestellt. Ein Vergleich der relativen Affinität von jedem
Antikörper zu
einer speziellen Konzentration an Antigen kann somit durchgeführt werden.
Dem entsprechend unterscheidet dieses Verfahren, welche Antikörper an
die verdünnteren
Konzentrationen an Antigen binden, oder die konzentrierten Antigenpräparationen,
als Teil eines Vergleichtests für
die relative Affinität
von jedem Antikörper
in einem Satz.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung wird durch die Herstellung eines Satzes an verdünnten Antikörperpräparationen
und danach die Messung der Bindung eines Antigens an jede der verdünnten Antikörperpräparationen
bereit gestellt. Ein Vergleich der relativen Affinität von jedem
Antikörper
zu einem speziellen Antigen kann somit durchgeführt werden. Dem entsprechend
unterscheidet dieses Verfahren, ob eine spezielle Konzentration
eines Antigens an die verdünntere
Konzentration der Antikörperpräparationen
bindet, oder die konzentrierten Antikörperpräparationen, als Teil eines
Vergleichtests für
die relative Affinität
von jedem Antikörper
in einem Satz.
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Obwohl
ein Verfahren offenbart wird, bei dem die relative Affinität eines
Antikörpers
bestimmt werden kann, kann ein ähnliches
Protokoll für
die Identifikation von Antikörperfragmenten
hoher Affinität,
von Proteinliganden, von kleinen Molekülen oder jedem anderen Molekül mit Affinität zu einem
anderen vorgesehen werden. Somit ist die Erfindung nicht nur auf
die Analyse der Bindung von Antikörpern an Antigene beschränkt.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Verfahren für die Analyse der kinetischen
Eigenschaften von Antikörpern
bereit, um die Reihung und Selektion von Antikörpern mit den gewünschten
kinetischen Eigenschaften zuzulassen. Affinität, wie hier definiert, reflektiert
die Beziehung zwischen der Rate, mit der ein Molekül an ein
anderes Molekül
bindet (Assoziationskonstante Kon), und
der Rate, mit der die Dissoziation des Komplexes eintritt (Dissoziationskonstante
Koff). Wenn ein Antikörper und ein Ziel unter geeigneten
Bedingungen kombiniert werden, wird der Antikörper mit dem Zielantigen assoziieren.
An einem gewissen Punkt erreicht das Verhältnis der Menge des Antikörpers, der
bindet, und der von der Zielstruktur freigesetzt wird, ein Gleichgewicht.
Dieses Gleichgewicht wird als die "Affinitätskonstante" oder nur "Affinität" bezeichnet.
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Wenn
Bindungsreaktionen verglichen werden, die identische Konzentrationen
an Antikörper
und Zielmolekül
haben, werden Reaktionen, die Antikörper mit höherer Affinität enthalten,
im Gleichgewicht mehr Antikörper
an das Ziel gebunden haben als Reaktionen, die Antikörper mit
niedrigerer Affinität
enthalten.
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Bei
Tests, bei denen die Bindung von einem Molekül mit einem anderen durch die
Bildung von Komplexen gemessen wird, die ein Signal erzeugen, ist
die Menge an Signal proportional zu der Konzentration der Moleküle ebenso
wie zur Affinität
der Wechselwirkung. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Tests verwendet, um
die Bildung von Komplexen zwischen Antikörpern und ihren Zielen (auf
Antigenen) zu messen, wobei die in solchen Tests gemessenen Signale
proportional zu der Konzentration des Antikörpers oder der Antikörper sein
kann, zur Konzentration des Zielantigens und zur Affinität der Wechselwirkung.
Geeignete Testverfahren für
die Messung der Bildung von Antikörper-Ziel-Komplexen umfassen
enzymgekoppelte Immunadsorptionstests (ELISA), fluoreszenzgekoppelte
Immunadsorptionstests (einschließlich der Luminex-Systems),
fluorometrische Mikrovolumen-Testtechnologie (FMAT), die Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung ((FACS)-Systeme), den Radioisotopentest (RIA), ebenso
wie andere, die vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt werden
können.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Verfahren für die kinetische
Reihung von Antikörpern
hinsichtlich der Affinität
auf der Basis der Signalstärke
eines Test, wie einer der vorstehend aufgelisteten Tests, wenn das
Ziel oder das Antigen mit begrenzender Konzentrationen bereit gestellt
wird. Der Antikörper
und das Antigen werden kombiniert, die Bindungsreaktion wird in
das Gleichgewicht gehen gelassen, und nachdem das Gleichgewicht
erreicht ist, wird ein Test durchgeführt, um die Menge an Antikörper zu
bestimmen, die an die Zielstruktur oder das Antigen gebunden ist.
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Menge an gebundenem Antikörper, die
mit dem Test nachgewiesen wird, direkt proportional der Affinität des Antikörpers zu
dem Zielantigen. Bei sehr niedrigen Konzentrationen an Antigen werden
einige Antikörper
mit niedriger Affinität
wegen nicht ausreichender Menge an gebundenem Antikörper kein
nachweisbares Signal erzeugen. Bei denselben sehr niedrigen Konzentrationen
an Antigen werden Antikörper
mit mäßiger Affinität niedrige
Signale erzeugen und Antikörper
mit hoher Affinität
werden starke Signale erzeugen.
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Während eines
Standardtests unter Verwendung von mäßigen bis hohen Konzentrationen
des Ziels kann eine Sammlung von verschiedenen Antikörpern, die
verschiedene Affinitäten
für dasselbe
Zielantigen haben, Signale gleicher oder ähnlicher Intensität erzeugen.
Wenn jedoch die Menge des Antigens verdünnt wird, wird es möglich, Unterschiede
bei der Affinität
bei den Antikörpern
zu erkennen. Unter Verwendung von begrenzenden Konzentrationen an
Zielantigen in dem Test gemäß den Lehren
der vorliegenden Offenbarung ist es möglich, eine kinetische Reihung
einer Sammlung von Antikörpern
gegen dasselbe Zielantigen zu etablieren.
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Unter
den Bedingungen von begrenzenden Mengen an Antigen wird eine Sammlung
von Antikörpern gegen
dasselbe Antigen eine Reihe an Signalen von hohem bis niedrigem
oder keinem Signal ergeben, obwohl beim ursprünglichen Test unter Verwendung
von hohen bis mäßigen Spiegeln
an Antigen einige dieser Antikörper
Signale von offensichtlich ähnlicher
Stärke
produziert haben können.
Antikörper
können
somit in einem begrenzenden Antigentest gemäß den Lehren der vorliegenden
Offenbarung mittels ihrer Signalintensität hinsichtlich ihrer Affinität gereiht
werden.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung von Antikörpern mit
höheren Affinitäten als
gegenwärtig
bekannte und charakterisierte Antikörper. Diese Verfahren umfasst
die Verwendung von charakterisierten Antikörpern als kinetische Standards.
Eine Vielzahl von Testantikörpern
wird dann gegen die kinetischen Standardantikörper gemessen, um diejenigen
Antikörper
zu bestimmen, die an verdünntere Antigenpräparationen
binden als die Standardantikörper.
Eine Vielzahl von Testantikörpern
wird dann gegen den kinetischen Standardantikörper gemessen, um diejenigen
Antikörper
zu bestimmen, die mehr Antikörper an
eine vorgegebene verdünnte
Antigenpräparation
gebunden haben. Dies erlaubt die rasche Entdeckung von Antikörpern, die
eine höhere
Affinität
zu einem Antigen haben im Vergleich mit kinetischen Standardantikörpern.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird bei einem begrenzenden Antigentest gemäß der vorliegenden Offenbarung
ein ELISA verwendet.
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Es
wurde empirisch bestimmt, dass Überstände von
gezüchteten
B-Zellen im Allgemeinen Antikörper in
einem Konzentrationsbereich von 20 ng/ml bis 800 ng/ml sezernieren.
Da es bei diesen Kulturen oft eine limitierte Menge an Überstand
gibt, werden B-Zell-Kulturüberstände für die meisten
Test typischerweise 10-fach verdünnt,
was eine Arbeitskonzentration von 2 ng/ml–80 ng/ml für die Verwendung bei Tests
zu Affinitätsbestimmung
ergibt. Bei einem Aspekt der Erfindung wurde die geeignete Konzentration
an Zielantigen, die zur Beschichtung von ELISA-Platten verwendet
wurde, unter Verwendung einer Referenzlösung von einem monoclonalen
Antikörper
mit einer Konzentration von 100 ng/ml bestimmt. Diese Zahl konnte
sich in Abhängigkeit
vom Konzentrationsbereich des Testantikörpers und der Affinität des Referenzantikörpers verändern, so
dass die Konzentration des Zielantigens, die bei einer Messung der
Antikörper/Antigen-Bindung
auf ELISA-Basis für
ein halbmaximales Signal erforderlich ist, empirisch bestimmt werden
kann. Diese Bestimmung ist nachstehend detaillierter diskutiert.
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Es
wurde Antigen mit einer empirisch bestimmten optimalen Beschichtungskonzentration
bei Affinitätsmessungstests
verwendet, um die von verschiedenen B-Zell-Kulturen produzierten
Antikörper
zu unterscheiden, die einen höheren
ELISA-Wert ergaben als ein Referenzantikörper. Gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung ist der einzige Weg, um ein höheres Signal als das zu erhalten,
das unter Verwendung des Referenzantikörpers erhalten wird, wenn (1)
der Antikörper
von höherer
Affinität
ist als der Referenzantikörper
oder (2) der Antikörper
dieselbe Affinität
hat, aber mit einer höheren
Konzentration als der Referenzantikörper anwesend ist. Wie vorstehend
offenbart, liegen Antikörper
in B-Zell-Kulturüberständen üblicherweise in
Konzentrationen von zwischen 20–800
ng/ml vor und werden zu Arbeitskonzentrationen von zwischen 2–80 ng/ml
verdünnt.
Bei einer Ausführungsform
werden Testantikörper
bei einer Konzentration von zwischen 2 –80 ng/ml in Tests verwendet,
die eine Referenzantikörperkonzentration
von 100ng/ml haben. Das Signal, das von den Testantikörpern erhalten
wurde, wird verglichen mit dem des Referenzantikörpers mit 100 ng/ml. Wenn bei Antikörpern innerhalb
der Testgruppe gefunden wird, dass sie ein höheres Signal haben, dann wird
von dem Antikörper
angenommen, dass er eine höhere
Affinität
als der Referenzantikörper
hat.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
werden Antikörper,
die von Hybridomen erzeugt wurden, unter Verwendung eines begrenzenden
kinetischen Antigen-Tests in einem Protokoll auf der Basis ELISA
gereiht. Die Bindungsaffinitäten
für diese
Antikörper
wurden durch Quantifizierung und kinetische Reihung dieser Antikörper unter
Verwendung eines Biacore-Systems bestätigt. Wie bekannt ist, gibt
das Biacore-System formale kinetische Werte für den Bindungskoeffizient zwischen
jedem Antikörper
und dem Antigen. Es wurde bestimmt, dass sie kinetische Reihung
von Antikörpern
unter Verwendung des begrenzenden Antigen-Tests, wie er durch die
vorliegende Offenbarung gelehrt wird, eng korrelierte mit den formalen
kinetischen Werten für
diese Antikörper,
wie sie mit dem Biacore-Verfahren bestimmt wurden, wie gezeigt in
Tabelle 5 (Beispiel 5).
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Kurz
gesagt verwendet die Biacore-Technologie die Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR), um
die Ablösung
von Antikörper
von Antigen bei verschiedenen Konzentrationen von Antigen und einer
bekannten Konzentration von Antikörper zu messen. Zum Beispiel
werden Chips mit Antikörper
beladen, gewaschen und der Chip wird einer Antigenlösung ausgesetzt,
um die Antikörper
mit Antigen zu beladen. Der Chip wird dann kontinuierlich mit einer
Lösung
ohne Antigen gewaschen. Ein anfängliches
Anwachsen bei der SPR wird gesehen, wenn sich der Antikörper- und
Antigen-Komplex bildet, gefolgt von einem Abfallen, wenn der Antigen-Antikörper-Komplex dissoziiert.
Das Abfallen beim Signal ist direkt proportional zur Antikörperaffinität. In ähnlicher
Weise könnte
diese Verfahren auf den umgekehrten Test angewendet werden, mit
begrenzten Konzentrationen an Antikörperbeschichtetem Chip.
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Unter
Verwendung der Luminex (MiraiBio, Inc., Alameda, CA)-Technologie
werden Antikörper
darauf getestet, wie sie eine Vielzahl an mit verschiedenen Antigenen
beschichteten Beads banden. Bei diesem Test wird jeder Satz von
Beads vorzugsweise mit einer verschiedenen Konzentration an Antigen
beschichtet. Da das Luminex-Lesegerät die Fähigkeit hat, alle Sätze an Beads
zu vervielfachen, werden die Bead-Sätze kombiniert und die Antikörperbindung
an jeden der verschiedenen Bead-Sätze bestimmt. Das Verhalten
der Antikörper
auf den verschieden beschichteten Beads kann dann verfolgt werden.
Nachdem man einmal auf die Antikörperkonzentration
normalisiert hat, korrelieren dann die Antikörper, die ein hohes Maß an Bindung
behalten, wenn man sich von nicht begrenzten Antigenkonzentrationen
zu begrenzten Antigenkonzentrationen bewegt, gut mit hoher Affinität. Vorteilhafterweise
können
diese unterschiedlichen Verschiebungen für die relative Reihung der
Antikörperaffinitäten verwendet
werden. Zum Beispiel entsprechen Proben mit kleineren Verschiebungen
Antikörpern
mit höherer
Affinität
und Antikörper
mit größeren Verschiebungen
entsprechen Antikörpern
mit niedrigerer Affinität. Tabelle 1 Vergleich der Affinitätsreihung zwischen den Biacore-
und den Luminex-Verfahren
| Bia Core
Affinitätsmessungen | Luminex-Reihung |
| ka
(M –1
s –1) | kd
(s –1) | Biacore
Med-res KD (nM) | Reihung |
| 9.9 × 10 5 | 9.3 × 10 –3 | 9.4 | 1 | 1 |
| 2.7 × 10 5 | 4.2 × 10 –3 | 16 | 2 | 14 |
| 3.1 × 10 5 | 5.6 × 10 –3 | 18 | 3 | 57 |
| 8.2 × 10 5 | 2.7 × 10 –2 | 33 | 4 | 83 |
| 1.4 × 10 6 | 6.2 × 10 –2 | 42 | 5 | 116 |
| 2.9 × 10 5 | 1.6 × 10 –2 | 54 | 6 | 123 |
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine Serie von begrenzten Konzentrationen des
zu testenden Antikörpers
verglichen mit einer Standardlösung
von Antikörper.
Ein solches Verfahren unter Verwendung von begrenzenden Konzentrationen
an Antikörper
würde als "Umkehrung" des Verfahrens unter Verwendung
von begrenzenden Antigenkonzentrationen erscheinen, aber es stellt
einen ähnlichen
Mechanismus für
das schnelle Screenen eines Satzes an Antikörpern bereit, um die relative
Affinität
jedes Antikörpers zum
Zielantigen zu bestimmen. Andere Platten, die chemisch modifiziert
sind oder werden können,
um kovalente oder passive Beschichtung zu erlauben, können auch
verwendet werden. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet kann
sich weitere Modifikationen des hier dargelegten Verfahrens ausdenken,
um einen Test unter Verwendung von begrenzenden Antikörperverdünnung für das Screenen
und die kinetische Reihung von Testantikörpern durchzuführen.
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Bestimmung der optimalen Konzentration
von gebundenem Antigen
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Ausführungsformen
des Testverfahrens mit begrenzendem Antigen werden unter Verwendung
eines Verfahrens durchgeführt,
bei dem Antigen vor der anschließenden Handhabung an eine stationäre Phase
gebunden oder angeheftet wird. Die Oberfläche ist vorzugsweise Teil eines
Gefäßes, in
dem die anschließende Handhabung
stattfinden kann; mehr bevorzugt ist die Oberfläche in einem Kolben oder Teströhrchen,
noch mehr bevorzugt ist die Oberfläche in der Vertiefung einer
Mikrotiterplatte wie einer Platte mit 96 Vertiefungen, einer Platte
mit 384 Vertiefungen oder einer Platte mit 864 Vertiefungen. Alternativ
kann die Oberfläche,
an die Antigen gebunden wird, Teil einer Oberfläche wie eines Trägers oder
Beads sein, wobei die Oberfläche
mit gebundenem Antigen in anschließenden Antikörperbindungs-
und Nachweisschritten manipuliert werden kann. Vorzugsweise interferiert
das Verfahren, mit dem das Antigen an die Oberfläche gebunden oder angeheftet wird,
nicht mit der Fähigkeit
von Antikörpern
zur Erkennung und Bindung an das Zielantigen.
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Bei
einer Ausführungsform
wird die Oberfläche
mit Streptavidin beschichtet und das Antigen wird biotinyliert.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Platte eine
Mikrotiterplatte, vorzugsweise eine Platte mit 96 Vertiefungen,
die auf mindestens einer Oberfläche
in jeder Vertiefung eine Streptavidin-Beschichtung hat, und das
Antigen ist biotinyliert. Am meisten bevorzugt ist die Platte eine
Sigma SA-Platte mit 96 Vertiefungen und das Antigen ist biotinyliert
mit Pierce EZ-Link-Sulpho-NHS-Biotin
(Sigma-Aldrich Canada, Oakville Ontario, CANADA). Es können auch
andere Verfahren der Biotinylierung verwendet werden, die die Biotinmoleküle an andere
Gruppen anheften.
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In
dem unwahrscheinlichen Fall, dass ein Antigen nicht biotinyliert
werden kann, können
alternative Oberflächen
substituiert werden, an die Antigen gebunden werden kann. Zum Beispiel
die Costar® Universal-BINDTM-Oberfläche,
bei der die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen mittels
eines durch UV-Bestrahlung entfernbaren Wasserstoffs vorgesehen
ist, was in einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung resultiert. (Corning Life Sciences,
Corning, NY). Es können
Platten, zum Beispiel Costar® Universal-BINDTM-Platten mit 96 Vertiefungen verwendet
werden. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet kann die anschleißenden Manipulationen
in dem Fall modifizieren, dass die Verwendung von alternativen Oberflächen wie
Costar® Universal-BINDTM die Zeit für den Test erhöht und/oder
die Verwendung von mehr Antigen erfordert.
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Bei
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Test entworfen, entworfen, um
die optimale Konzentration an gebundenem Antigen zu finden. Ein
Beispiel ist nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. Die folgende Beschreibung
umfasst eine Offenbarung der Schritte zur Bestimmung der optimalen
Beschichtungskonzentration von biotinyliertem Antigen unter Verwendung
von Platten mit 96 Vertiefungen, die mit Streptavidin beschichtet
sind. Diese Offenbarung ist nur als Illustration eines Weges zur
Ausführung
verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung gedacht. Der Schutzbereich
der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die Verfahren des Tests
beschränkt,
der vorstehend und nachstehend beschrieben ist, da ein Durchschnittsfachmann auf
dem Fachgebiet die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
einer großen
Vielzahl von Materialien und Manipulationen ausführen kann. Die Verfahren umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf; die Expression von Antigen auf Zellen (transient oder stabil),
die Verwendung von Phagen, die verschiedene Kopienzahlen von Antigen
pro Phage exprimieren.
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Antigenverdünnung und Verteilung
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Es
wird ein zu testendes Antigen ausgewählt. Ein solches Antigen kann
zum Beispiel jedes Antigen sein, das für Antikörper ein therapeutisches Ziel
bereitstellen könnte.
Zum Beispiel sind Tumormarker, Zelloberflächenmoleküle, Lymphokine, Chemokine,
mit Pathogen assoziierte Proteine und Immunmodulatoren nicht beschränkende Beispiele
für solche
Antigene.
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Eine
Lösung
von Antigen mit einer anfänglichen
Konzentration, vorzugsweise etwa 1 μg/ml, wird in einer Serie von
schrittweisen Verdünnungen
verdünnt.
Die verdünnten
Proben werden dann auf Oberflächen platziert,
wie in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, und Replikate von
jeder Probe werden ebenfalls auf Oberflächen verteilt. Wenn erwünscht, können die
Antigenlösungen
blockierende Mittel enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden serielle Verdünnungen
von Antigen über
die Spalten einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Spezifisch
wird in jede Spalte eine unterschiedliche Antigenlösung platziert,
was die Proben in jeder Reihe der. Spalte repliziert. Bei einer
Platte mit 96 Vertiefungen werden Replikate jeder Verdünnung in
den Reihen A-H unter jeder Spalte platziert. Obwohl die Standardverdünnungen
von Antigen zu Antigen variieren, startet die typische Verdünnungsserie
bei 1 μg/ml
und wird seriell 1:2 bis zu einer Endkonzentration von etwa 900
pg/ml verdünnt.
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Bei
einer Ausführungsform
wird biotinyliertes Antigen horizontal über eine Platte mit 96 Vertiefungen von
einer Konzentration von 1 μg/ml
bis zu 900 pg/ml verdünnt.
Während
ein bevorzugter blockierender Puffer eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)/Milch-Lösung ist,
können
andere Puffer wie Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt mit PBS, substituiert werden.
Bei einer anderen Ausführungsform
wird biotinyliertes Antigen in 1%-iger Magermilch/1 × PBS, pH
7,4, von einer Konzentration von 1 μg/ml bis zu 900 pg/ml verdünnt und
in die Vertiefungen der Spalten 1–11 einer Sigma SA (Streptavidin)-Mikrotiterplatte
pipettiert, wobei 8 Replikate von jeder Verdünnung in die Reihen A-H von
jeder Spalte platziert werden. Die Spalte 12 wird leer gelassen und
dient als "nur Antikörper"-Kontrolle. Das Endvolumen
in jeder Vertiefung ist 50 μl.
Das Antigen wird für
einen geeigneten Zeitraum auf der Oberfläche inkubiert (d. h. in den
Vertiefungen der Platte), damit das Antigen an der Oberfläche anhaftet;
die Inkubationszeit, die Temperatur und die anderen Bedingungen
können
gemäß den Vorschriften
des Herstellers und/oder Standardprotokollen für die verwendete Oberfläche bestimmt
werden. Nach der Inkubation wird die überschüssige Antigenlösung entfernt.
Wenn nötig,
werden die Platten dann mit einer geeigneten Blockierungslösung blockiert,
die z. B. Magermilch, Milchpulver, BSA, Gelatine, Detergens oder
andere geeignete Blockierungsmittel enthält, um während der folgenden Schritte
unspezifische Bindung zu verhindern.
-
Die
Platten mit dem biotinylierten Antigen werden dann für einen
geeigneten Zeitraum inkubiert, um das Antigen an die Oberflächen zu
binden oder anzuheften. Biotinyliertes Antigen in einer Sigma SA-Platte wird
bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Überschüssige biotinylierte Antigenlösung wird
dann von der Platte entfernt. Bei dieser Ausführungsform ist Blockieren nicht
notwendig, weil Sigma SA-Platten vorblockiert sind.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
unter Verwendung von Costar® Universal-BIND-Platten wird
das Antigen übernacht
bei 4°C
in 1 × PBS
pH 7,4, 0,05% Azid, passiv adsorbiert. Wenn Costar® Universal-BINDTM-Platten verwendet werden, ist die anfängliche
Konzentration an Antigen im Allgemeinen eine etwas höhere Konzentration,
vorzugsweise 2–4 μg/ml. Am
nächsten
Morgen wird die überschüssige Antigenlösung von
der/den Costar® Universal-BINDTM-Platte oder -Platten entfernt, vorzugsweise
durch "Flicking", und jede Platte
wird vier (4) Minuten UV-Licht von 365 nm ausgesetzt. Jede Platte
wird dann mit 1%-iger Magermilch/1 × PBS pH 7,4 mit 100 μl Blockierungslösung pro
Vertiefung 30 Minuten blockiert.
-
Nach
der Inkubation mit Antigen und der Entfernung von überschüssiger Antigenlösung und,
fall nötig, Blockieren
werden die Platten viermal (4×)
mit Leitungswasser gewaschen. Die Platten können mit der Hand gewaschen
werden oder es kann eine Mikroplattenwaschmaschine oder eine andere
geeignete Waschvorrichtung verwendet werden.
-
Verdünnung
und Verteilung von Referenzantikörper
-
Es
wird dann ein Referenzantikörper
zugegeben, der das Antigen erkennt und daran bindet. Der Referenzantikörper ist
vorzugsweise ein monoclonaler Antikörper, kann aber alternativ
polyclonale Antikörper sein,
natürliche
Liganden oder lösliche
Rezeptoren, Antikörperfragmente
oder kleine Moleküle.
-
Eine
Lösung
von Referenzantikörper,
auch bekannt als Anti-Antigen-Antikörper, mit
einer anfänglichen Konzentration,
vorzugsweise etwa 1 μg/ml,
wird in einer Serie von schrittweisen Verdünnungen verdünnt. Die verdünnten Proben
werden dann auf Oberflächen
platziert, wie in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, und Replikate
von jeder Probe werden ebenfalls auf Oberflächen verteilt. Die seriellen
Verdünnungen
von Referenzantikörper
werden über
die Reihen einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Spezifisch
wird jede Referenzantikörperverdünnung in
einer Reihe platziert. Bei einer Platte mit 96 Vertiefungen wird
eine verschiedene Verdünnung
von Referenzantikörper
in jeder Reihe platziert, wobei Replikatproben in jeder Spalte über jede
Reihe platziert werden, beginnend mit einer anfänglichen Konzentration von
etwa 1 μg/ml
progressiv und einer siebenfachen 1:2 Verdünnung über eine Serie von sieben Vertiefungen.
Eine Endkonzentration von etwa 30 ng/ml wird als die Standardlösungsserie
verwendet. Die Lösungen
von Referenzantikörper
werden unter geeigneten Bedingungen, die von den verwendeten Materialien
und Reagentien bestimmt werden, mit dem gebundenen Antigen inkubiert,
vorzugsweise etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur. Der Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet kann feststellen, ob eine Inkubation für einen
längeren
oder kürzeren
Zeitraum oder bei höheren oder
niedrigeren Temperaturen für
eine spezielle Ausführungsform
geeignet wäre.
-
Optionaler Schritt: Inkubation unter Schütteln
-
Wenn
gewünscht,
kann die Platte dicht eingepackt werden und die Inkubation des Referenzantikörpers mit
dem gebundenen Antigen kann unter Schütteln durchgeführt werden,
um das Mischen und die effizientere Bindung zu fördern. Platten, die Referenzantikörper und
gebundenes Antigen enthalten, können übernacht
unter Schütteln
inkubiert werden, wie zum Beispiel bereitgestellt von einem Lab
Line Microplate Shaker bei der Einstellung 3.
-
Zugabe des Nachweisantikörpers
-
Die
Platten werden gewaschen, um nicht gebundenen Referenzantikörper zu
entfernen, vorzugsweise fünfmal
(5×) mit
Wasser. Als nächstes
wird ein markierter Nachweisantikörper zugegeben, der den Referenzantikörper erkennt
und bindet, und die Lösung
wird inkubiert, um die Bindung des Nachweisantikörpers an den Referenzantikörper zuzulassen.
Der Nachweisantikörper
kann polyclonal oder monoclonal sein. Der Nachweisantikörper kann
auf eine Weise markiert sein, die den Nachweis des an den Referenzantikörper gebundenen
Antikörpers
zulässt.
Die Markierung kann eine enzymatische Markierung sein wie alkalische
Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase (HRP), oder eine nicht enzymatische
Markierung wie Biotin oder Digoxygenin, oder sie kann eine radioaktive
Markierung sein wie 32P, 3H
oder 14C, oder sie kann jede andere Markierung
sein, die für
den Test geeignet ist, basierend auf verfügbaren Reagentien, Materialien
und Nachweisverfahren.
-
Nach
der Markierung werden 50 μl
polyclonaler Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper (Pierce Chemical Co, Rockford
IL, Katalog Nummer 31416) mit einer Konzentration von 0,5 μg/ml in 1%-iger
Magermilch, 1 × PBS
pH 7,4 zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte zugegeben. Die
Platte wird dann 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Überschüssige Lösung, die
Nachweisantikörper
enthält,
wird entfernt und die Platten werden wiederholt mit Wasser gewaschen,
vorzugsweise mindestens fünfmal,
um allen ungebundenen Nachweisantikörper zu entfernen.
-
Messung von gebundenem Nachweisantikörper
-
Die
Menge an Nachweisantikörper,
die an Referenzantikörper
gebunden ist, wird unter Verwendung des geeigneten Verfahrens für die Messung
und Quantifizierung der Menge an vorhandener Markierung bestimmt.
In Abhängigkeit
von der gewählten
Markierung können
Verfahren für
die Messung die Messung der enzymatischen Aktivität gegen
zugegebenes Substrat umfassen, die Messung der Bindung an einen
nachweisbaren Bindungspartner (z. B. Biotin), die Szintillationszählung zur
Messung der Radioaktivität,
oder jedes andere geeignete Verfahren, das vom Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet bestimmt werden kann.
-
Bei
der vorstehend beschriebenen Ausführungsform unter Verwendung
von polyclonalem Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper als
Nachweisantikörper
werden 50 μl
des chromogenen HRP-Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) zu jeder
Vertiefung zugegeben. Die Substratlösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Reaktion HRP/TMB wird durch Zugabe von 50 μl 1 M Phosphorsäure zu jeder
Vertiefung gestoppt.
-
Quantifizierung.
-
Die
Menge an gebundener Markierung wird dann mit dem geeigneten Verfahren
quantifiziert, wie der spektrophotometrischen Messung der Bildung
von Reaktionsprodukten oder Bindungskomplexen, oder der Berechnung
der Menge an nachgewiesener radioaktiver Markierung. Unter den hier
offenbarten Bedingungen ist die Menge an gemessener Markierung in
diesem Schritt ein Maß für die Menge
an markiertem Nachweisantikörper,
der an den Referenzantikörper
gebunden ist.
-
Bei
der vorstehend beschriebenen Ausführungsform unter Verwendung
von polyclonalem Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper und
TMB-Substrat wird die Menge an Nachweisantikörper, der an Referenzantikörper gebunden
ist, durch Messung der Absorption (optische Dichte oder "OD") bei 450 nm in jeder
Vertiefung der Platte quantifiziert.
-
Datenanalyse zur Bestimmung der optimalen
Antigenkonzentration.
-
Es
wird eine bekannte Referenzantikörperkonzentration
gewählt
und es werden die Resultate von Vertiefungen untersucht, die die
gewählte
Antikörperkonzentration
haben und verschiedene Mengen an Antigen. Die Antigenkonzentration,
die die gewünschte
Signalstärke
produziert, oder das Standardsignal, wird als die optimale Antigenkonzentration
für die
anschließenden
Experimente gewählt.
Das Standardsignal kann empirisch gemäß den Bedingungen und Materialien
bestimmt werden, die bei einer speziellen Ausführungsform verwendet werden,
weil das Standardsignal als Referenzpunkt für den Vergleich mit Signalen
von anderen Reaktionen dienen wird. Für ein Nachweisverfahren, das
ein chromogenes Produkt produziert, ist ein wünschenswertes Standardsignal
eines, das in den dynamischsten Bereich des ELISA-Lesegeräts oder
eines anderen Detektors fällt
und kann eine optische Dichte (OD) von zwischen etwa 0,4 und 1,6
OD-Einheiten sein und für dieses
System vorzugsweise etwa 1.0 OD-Einheiten, obwohl es möglich ist,
Signale zu erhalten, die von 0,2 bis zu mehr als 3,0 OD-Einheiten
reichen. Jeder OD-Wert kann als Standardsignal gewählt werden,
obwohl ein OD-Wert von etwa 1,0 OD-Einheiten eine genaue Messung
eines Bereichs von Testsignalen oberhalb und unterhalb von 1,0 OD-Einheiten
zulässt
und weiterhin einen leichten Vergleich mit anderen Testsignalen
und Referenzsignalen zulässt.
Die Konzentration an identifiziertem Antigen als die Konzentration,
die das Standardsignal produziert, wird bei den folgenden Experimenten
verwendet, um Antikörper
zu durchmustern und kinetisch zu reihen.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
unter Verwendung einer Platte mit 96 Vertiefungen wird eine Referenzantikörperkonzentration
von 100 ng/ml gewählt.
Es ist möglich,
in Abhängigkeit
von der Empfindlichkeit und den Konzentrationen des in dem System
verwendeten Antikörpers,
andere Referenzantikörperkonzentrationen
zu verwenden. Die Signale von der Nachweisantikörperreaktion in den Vertiefungen
in allen Spalten der Reihe, die 100 ng/ml Antikörper enthält, werden dann untersucht,
um die Antigenkonzentration zu finden, die einen OD-Wert von etwa
1,0 produziert.
-
Bei
der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung
von polyclonalem Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper und
TMB-Substrat werden die Vertiefungen in der Reihe, die 100 ng/ml
Antikörper
enthält,
untersucht, um zu bestimmen, welche Antigenkonzentration eine Reaktion
produziert, die, wenn die Absorption bei 450 nm gemessen wird, einen
OD-Wert von etwa 1,0 hat. Die Konzentration von dem Antigen wird
dann für
die folgenden Experimente verwendet, um Antikörper zu durchmustern und kinetisch
zu reihen. Ein ähnlicher
Weg wurde für
die Identifikation von optimalen Antigendichten mit dem System auf
der Basis von Luminex-Beads verwendet.
-
Screenen von Antikörpern unter Verwendung von
begrenzenden Antigenkonzentrationen
-
Beschichtung von Oberflächen bei
optimierter Antigenkonzentration
-
Die
Oberfläche
oder Oberflächen,
die verwendet wurden, um das Screenen von Antikörpern durchzuführen, werden
mit Antigen mit der optimalen Konzentration beschichtet, wie vorstehend
bestimmt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oberflächen Vertiefungen
einer Streptavidinplatte mit 96 Vertiefungen, wie einer Sigma SA-Platte,
und zu den Vertiefungen wird biotinyliertes Antigen mit optimaler
Konzentration zugegeben. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform
werden 50 μl
Antigen in einer Lösung
von 1%-iger Magermilch, 1 × PBS
pH 7,4, und Platten 30 Minuten inkubiert. Bei einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
wird unmodifiziertes Antigen zu Costar® Universal-BINDTM-Platten zugegeben und die Inkubation und
die von UV-Licht vermittelte Antigenbindung werden gemäß den Vorschriften
des Herstellers und/oder Standardprotokollen durchgeführt, wie
vorstehend beschrieben.
-
Nach
der Inkubation mit der Antigenlösung
für einen
geeigneten Zeitraum werden die Platten gewaschen, um ungebundenes
Antigen zu entfernen, vorzugsweise mindestens viermal (4×).
-
Zugabe der zu durchmusternden und zu reihenden
Testantikörper
-
Antikörper, die
mit dem begrenzenden Antigentest durchmustert und gereiht werden
sollen, werden Testantikörper
genannt. Testantikörper
können
aus der Lösung
gewonnen werden, die Antikörper
produzierende Zellen umgibt. Vorzugsweise werden Testantikörper aus
den Medien von Antikörper
produzierenden B-Zell-Kulturen, Hybridomüberständen, Antikörper oder Antikörperfragmente,
die von jeder Art von Zelle exprimiert werden, mehr bevorzugt aus
dem Überstände von Antikörper produzierende
B-Zell-Kulturen gewonnen. Lösungen,
die Testantikörper
enthalten, zum Beispiel Überstände von
B-Zell-Kulturen, erfordern im Allgemeinen keine zusätzliche
Verarbeitung; zusätzliche
Schritte zur Konzentrierung, Isolierung oder Reinigung der Testantikörper wären jedoch
auch kompatibel mit den offenbarten Verfahren.
-
Jede
Lösung,
die Testantikörper
enthält,
wird verdünnt,
um die Konzentration in einen gewünschten Bereich zu bringen
und zu einer Oberfläche,
die Antigen angeheftet hat, werden Proben zugegeben. Typischerweise
hat ein wünschenswerter
Konzentrationsbereich für
Testantikörper
eine Höchstkonzentration,
die niedriger ist als die Konzentration des Referenzantikörpers, der
verwendet wurde, um wie vorstehend beschrieben die optimale Antigenkonzentration
zu selektieren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt bereit,
dass ein Testantikörper
bei derselben Antigenkonzentration ein höheres Signal produzieren würde als
das des Referenzantikörpers,
wenn der Testantikörper
(a) eine höhere
Affinität
zum Antigen hat, oder (b) eine ähnliche
Affinität
hat, aber in höherer
Konzentration vorliegt als das Referenzantigen. Wenn somit Testantikörper bei
niedrigeren Konzentrationen verwendet werden als die Konzentration
des Referenzantikörpers,
der verwendet wurde, um die Antigenkonzentration zu selektieren,
die bei dem Screeningtest verwendet wird, würde nur ein Testantikörper, der
eine höhere
Affinität
zu dem Antigen hat, ein höheres
Signal produzieren als das Referenzantikörpersignal.
-
Bei
einer Ausführungsform,
bei der eine Referenzantikörperkonzentration
von 100 ng/ml verwendet wird, um die optimale Antigenkonzentration
zu selektieren (wie vorstehend beschrieben), werden Überstände von
B-Zell-Kulturen, die einen empirisch bestimmten Testantikörperkonzentrationsbereich
von zwischen 20 ng/ml bis 800 ng/ml haben, typischerweise zehnfach
verdünnt,
um eine beim Test wirksame Testantikörperkonzentration von zwischen
2 ng/ml bis 80 ng/ml zu produzieren. Vorzugsweise werden mindestens
zwei doppelte Proben von jedem verdünnten Überstand der B-Zell-Kultur
getestet. Vorzugsweise werden die verdünnten Überstände von B-Zell-Kulturen zu
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zugegeben, wobei die Vertiefungen
mit Antigen mit einer optimalen Konzentration beschichtet sind,
die zuvor unter Verwendung von Antigen und einem Referenzantikörper bestimmt
wurde.
-
Eine
positive Kontrolle sollte als ein Teil des Screenens eingeschlossen
sein, wobei der Referenzantikörper,
der verwendet wurde, um den Test durch Bestimmung der optimalen
Antigenkonzentration zu optimieren, verdünnt und mit dem Antigen zur
Reaktion gebracht wird. Die positive Kontrolle stellt einen Satz
an Messungen bereit, die sowohl als interne Kontrolle von Nutzen
sind als auch zum Vergleich mit vorherigen Optimierungsresultaten,
um zu bestätigen,
sicher zu stellen und zu zeigen, dass Ergebnisse von einem Screening von
Testantikörpern
vergleichbar sind mit den erwarteten Resultaten der positiven Kontrolle
und konsistent sind mit vorherigen Optimierungsresultaten.
-
Bei
einer Ausführungsform
wird jeder zu testende Überstand
einer B-Zell-Kultur
mit 1%-iger Magermilch/1 × PBS
pH 7,4/.05% Azid 1:10 verdünnt
und 50 μl
werden zu jeder von zwei mit Antigen beschichteten Vertiefung einer
Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben, so dass 48 verschiedene Proben
auf jeder Platte mit 96 Vertiefungen vorhanden sind. Eine positive
Kontrolle, die eine Verdünnungsserie
des Referenzantikörpers umfasst,
wird vorzugsweise zu den Vertiefungen von etwa einer halben Platte
mit 96 Vertiefungen zugegeben, um eine Bestätigung zu erhalten und um zu
zeigen, dass die Resultate des Screenings von Testantikörpern in Überständen von
B-Zell-Kulturen, die parallel mit der positiven Kontrolle laufen,
intern konsistent und auch konsistent mit vorherigen Optimierungsresultaten
sind.
-
Die
Testantikörper
werden unter geeigneten Bedingungen mit Antigen inkubiert. Referenzantikörper und
positive Kontrollen werden parallel unter denselben Bedingungen
inkubiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Platten
dicht eingepackt, zum Beispiel mit einer Plastikhülle oder
Paraffinfolie, und 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.
-
Zugabe von Nachweisantikörper zu
Testantikörpern
-
Die
Platten werden gewaschen, um ungebundenen Testantikörper zu
entfernen, vorzugsweise fünfmal (5×) mit Wasser.
Als nächstes
wird ein markierter Nachweisantikörper zugegeben, der den Testantikörper erkennt
und bindet, und die Lösung
wird inkubiert, um die Bindung des Nachweisantikörpers an den Testantikörper zu
erlauben. Der Nachweisantikörper
wird auch zu der positiven Kontrolle zugegeben, um die Wechselwirkung
zwischen dem Referenzantikörper
und dem Nachweisantikörpers
zu bestätigen.
Der Nachweisantikörper kann
polyclonal oder monoclonal sein. Der Nachweisantikörper kann
auf eine Weise markiert sein, die den Nachweis des an den Referenzantikörper gebundenen
Antikörpers
erlaubt. Die Markierung kann eine enzymatische Markierung sein wie
alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase (HRP), oder eine
nicht enzymatische Markierung wie Biotin oder Digoxygenin, oder
eine radioaktive Markierung wie 32P, 3H oder 14C, oder
Fluoreszenz, oder sie kann jede andere Markierung sein, die für den Test
geeignet ist, basierend auf verfügbaren
Reagentien, Materialien und Nachweisverfahren.
-
Bei
einer Ausführungsform
unter Verwendung von humanen Testantikörpern werden 50 μl polyclonaler Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper (Pierce
Chemical Co, Rockford IL, Katalog Nummer 31416) mit einer Konzentration
von 0,5 μg/ml
in 1%-iger Magermilch, 1 × PBS
pH 7,4 zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte zugegeben, die
Testantikörper
und Referenzantikörper
enthält
(als positive Kontrolle). Die Platte wird dann 1 Std. bei Raumtemperatur
inkubiert.
-
Überschüssige Lösung, die
den Nachweisantikörper
enthält,
wird entfernt und die Platten werden wiederholt mit Wasser gewaschen,
vorzugsweise mindestens fünfmal,
um allen ungebundenen Nachweisantikörper zu entfernen.
-
Messung von gebundenem Nachweisantikörper.
-
Die
Menge von an den Testantikörper
gebundenem Nachweisantikörper
(und gebunden an den Referenzantikörper der Kontrolle) wird unter
Verwendung des geeigneten Verfahrens für die Messung und Quantifizierung
der vorhandenen Menge an Markierung bestimmt. In Abhängigkeit
von der gewählten
Markierung können
Verfahren für
die Messung die Messung der enzymatischen Aktivität gegen
zugegebenes Substrat umfassen, die Messung der Bindung an einen
nachweisbaren Bindungspartner (z. B. Biotin), die Szintillationszählung zur
Messung der Radioaktivität,
oder jedes andere geeignete Verfahren, das vom Durchschnittsfachmann auf
dem Fachgebiet bestimmt werden kann.
-
Bei
dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von polyclonalem
Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper als Nachweisantikörper werden
zu jeder Vertiefung 50 μl
des chromogenen HRP-Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben.
Die Antikörper-Substrat-Lösung wird
etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die HRP/TMB-Reaktion
wird durch Zugabe von 50 μl
1 M Phosphorsäure
zu jeder Vertiefung gestoppt.
-
Quantifizierung
-
Die
Menge an gebundener Markierung wird dann mit einem geeigneten Verfahren
bestimmt, wie der spektrophotometrischen Messung der Bildung von
Reaktionsprodukten oder Bindungskomplexen, oder der Berechnung der
Menge an nachgewiesener radioaktiver Markierung. Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Menge an Markierung
ein Maß für die Menge
des markierten Nachweisantikörpers
bereit, der an den Testantikörper
gebunden ist (oder, bei der positiven Kontrolle, an den Referenzantikörper gebunden ist).
Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Menge an Markierung
ein Maß für die Menge
des an das Antigen gebundenen markierten Antikörpers bereit. Somit stellen
der Nachweis und die Quantifizierung der Menge an Markierung ein
Mittel für
die Messung der Bindung eines Testantikörpers an das Testantigen bereit.
Durch den Vergleich des Standardsignals mit dem Signal, das die
Menge des an das Antigen gebundenen Testantikörpers quantifiziert, ist es
möglich,
Testantikörper
mit höheren
Affinitäten
zu identifizieren, indem man nach Testantikörpern sucht, die ein höheres Signal
als die Referenz geben.
-
Bei
der vorstehend beschriebenen Ausführungsform unter Verwendung
von polyclonalem Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper und
TMB-Substrat wird die Menge an Nachweisantikörper, der an Testantikörper gebunden
ist (und Referenzantikörper
bei der positiven Kontrolle), durch Messung der Absorption (optische
Dichte, OD) bei 450 nm in jeder Vertiefung der Platte quantifiziert.
-
Datenanalyse zur Identifikation und Reihung
von Antikörpern
von Interesse.
-
Die
Resultate von jedem Testantikörper
werden gemittelt und der Standardbereich wird bestimmt. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform,
bei der zwei Proben von jedem Testantikörper unter Verwendung eines mit
HRP markierten Nachweisantikörpers
getestet werden, werden die OD-Werte bei 450 nm gemittelt und die Standardabweichung
wird berechnet. Die mittleren OD-Werte der Testantikörper werden
mit den OD-Werten des Standardsignals verglichen. Die Werte von
den positiven Kontrolltests werden ebenfalls berechnet und auf die
Zuverlässigkeit
des Tests überprüft.
-
Die
Testantikörper
werden unter Berücksichtigung
der mittleren OD-Werte und des Bereichs von OD's zwischen den Replikaten kinetisch
gereiht. Der mittlere OD-Wert
stellt ein Maß für die Affinität des Testantikörpers zum
Antigen bereit, wobei die Affinität durch den Vergleich mit dem
Standardsignal bestimmt wird, oder dem OD-Wert des Referenzantikörpers in
der positiven Kontrolle. Der Bereich stellt ein Maß für die Zuverlässigkeit
des Tests bereit, wobei ein enger Bereich anzeigt, dass die OD-Werte wahrscheinlich
akkurate Messungen der Menge von an das Antigen gebundenem Testantikörper sind,
und ein weiter Bereich anzeigt, dass die OD-Werte keine akkuraten
Messungen der Bindung sein können.
Akzeptable Standardabweichungen sind typischerweise OD's von zwischen 5–15% Abweichung voneinander.
Testantikörper,
die die höchsten
OD-Werte ergeben und bei denen die Standardabweichung des Mittelwerts
niedrig ist, bekommen den höchsten
kinetischen Rang.
-
Bei
einer Ausführungsform,
bei der das Standardsignal 1,0 OD-Einheiten ist, wird jeder Testantikörper mit
einer mittleren OD von mehr als 1,0 OD-Einheiten und einer akzeptabel
niedrigen Standardabweichung so betrachtet, dass er eine höhere Affinität zum Antigen
hat als die Affinität
des Referenzantikörpers.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
wurden Tests auf der Basis von Luminex unter Verwendung von differentiell
mit Antigen beschichteten Beads verwendet. Bei diesem Test wurden
Antikörper
auf der Basis ihrer Bindung von Antigen bei höheren statt bei niedrigeren
Antigendichten gereiht.
-
Beispiel 1
-
Bestimmung der optimalen Antigenkonzentration
-
Antigengewinnung
-
Parathyroid-Hormon
(PTH) wurde unter Verwendung von Pierce EZ-Link-Sulpho-NHS-Biotin gemäß den Vorschriften
des Herstellers biotinyliert (Pierce EZ-Link-Sulpho-NHS-Biotin, (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL, Katalog-Nummer 21217). Wenn da Antigen nicht
biotinyliert werden konnte, wurden Costar-UV-Platten eingesetzt.
Die Verwendung von Costar-UV-Platten erhöhte die Zeit des Tests und
erforderte im Allgemeinen die Verwendung von beträchtlich
mehr Antigen.
-
Schachbrett-ELISA
-
Ein
Test, der in einem "Schachbrett"-Arrangement angelegt
war wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt, um die optimale Beschichtungskonzentration
des Antigens zu bestimmen. Der Test wurde unter Verwendung von mit
Streptavidin beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen (Sigma SA
Mikrotiterplatten, Sigma-Aldrich Chemicals, St Louis MO, Katalog-Nummer
M5432) wie folgt durchgeführt.
-
Das
Parathyroid-Hormon (PTH)-Antigen wurde unter Verwendung von Pierce
EZ-Link-Sulpho-NHS-Biotin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Katalog-Nummer
21217) gemäß den Vorschriften
des Herstellers biotinyliert. Das biotinylierte Antigen wurde mit
1%-iger Magermilch, 1 × PBS
pH 7,4, in einer Serie von schrittweisen Verdünnungen von einer Anfangskonzentration
von 500 ng/ml bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ng/ml verdünnt. Das
verdünnte
biotinylierte Antigen wurde horizontal über eine Sigma SA-Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen (Sigma-Aldrich Chemicals, Katalog M-5432) verteilt,
wobei 50 μl
von jeder Verdünnung
in die Vertiefungen jeder Spalte 1 bis 11 gegeben wurde, mit Replikaten
in jeder Vertiefung der Reihen A-H unter jeder Spalte. Zur Spalte
12 wurde kein Antigen zugegeben. Die Platte wurde 30 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Es wurde kein Blockierungsschritt durchgeführt, weil
Sigma SA-Platten vorblockiert sind.
-
Die
Platte wurde viermal mit Leitungswasser gewaschen, Die Platen wurden
mit der Hand gewaschen oder unter Verwendung eines Mikroplatten-Waschgeräts, wenn
verfügbar.
-
Ein
Anti-PTH-Antikörper
mit bekannter Affinität
wurde als Referenzantikörper
verwendet. Der Anti-PTH-Antikörper
15g2 wurde mit 1%-iger Magermilch/1 × PBS pH 7,4/0,05% zu einer
endgültigen
Anfangskonzentration von 1 μg/ml
verdünnt
und dann seriell 1:2 verdünnt,
7 Vertiefungen mit einer Endkonzentration von 15 ng/ml und 50 μl von jeder
Verdünnung
wurden in jede Vertiefung der Reihe A bis Reihe G verteilt, mit Replikaten
in jeder Vertiefung der Spalten 1–12. Zur Reihe H wurde kein
Antikörper
zugegeben. Platten, die das Antigen und den Referenzantikörper enthielten,
wurde etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
Platten wurden mit einer Plastikhülle oder Paraffinfolie dicht
eingepackt ("luftdicht") und dann übernacht
unter Schütteln
unter Verwendung eines Lab Line Titer Plate Shakers bei der Einstellung
3 inkubiert.
-
Die
Platten wurden fünfmal
(5×) mit
Wasser gewaschen, um ungebundenen Referenzantikörper zu entfernen. Gebundener
Referenzantikörper
wurde durch Zugabe von fünfzig
Mikrolitern (50 μl)
von 0,5 μg/ml polyclonalem
Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper (Pierce
Chemical Co, Rockford IL, Katalog Nummer 31416) in 1%-iger Magermilch,
1 × PBS
pH 7,4, zu jeder Vertiefung gegeben und 1 Std. Inkubation der Platte bei
Raumtemperatur. (Gt-anti-Human Fc HRP – Pierce Katalog-Nummer-31416).
-
Die
Platte wird mindestend fünfmal
(5×) mit
Waser gewaschen, um ungebundenen polyclonalen Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper zu
entfernen.
-
Fünfzig Mikroliter
(50 μl)
des HRP-Substrats TMB (Kirkegaard & Perry Laborstories, Inc, Gaithersberg, MD)
wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platte wurde für eine halbe
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die HRP-TMB-Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 1 M Phosphorsäure zu jeder
Mulde gestoppt. Die optische Dichte (Absorption) wurde für jede Vertiefung
der Platte gemessen.
-
Datenanalyse
-
Die
Tabelle 2 zeigt die Resultate von dem Referenztest unter Verwendung
von PTH als Antigen und 15g2 anti-PTH als Referenzantikörper. Die
OD-Messungen von der Reihe der Proben, die der Referenzantikörperkonzentration
von 100 ng/ml entsprechen, wurden untersucht, um die Antigenkonzentration
zu finden, die eine OD von etwa 1,0 ergibt. Diese Konzentration
wurde zu etwa 15 ng/ml PTH bestimmt. Diese Konzentration an Antigen
wurde als die optimal Antigenkonzentration betrachtet und wird bei
den folgenden Experimenten benutzt. Tabelle 2 Messungen der Optischen Dichte von Testantikörpern, die
an verschiedene Konzentrationen von PTH gebunden sind
| | PTH-Konzentration
(ng/mL) |
| 500.00 | 250.00 | 125.00 | 62.50 | 31.25 | 15.63 | 7.81 | 3.91 | 1.95 | 0.98 | 0.49 | 0.00 |
| Referenz-Antikörper-Konzentration (ng/mL) | 1000 | 3.218 | 3.273 | 3.075 | 3.103 | 2.521 | 1.910 | 1.269 | 0.885 | 0.438 | 0.329 | 0.256 | 0.086 |
| 500 | 3.199 | 3.133 | 3.144 | 3.068 | 2.608 | 1.928 | 1.283 | 0.708 | 0.424 | 0.293 | 0.224 | 0.062 |
| 250 | 3.130 | 3.274 | 3.208 | 2.945 | 2.393 | 1.634 | 3.182 | 0.543 | 0.295 | 0.201 | 0.156 | 0.055 |
| 125 | 3.190 | 3.194 | 3.177 | 2.733 | 2.116 | 1.251 | 0.863 | 0.444 | 0.489 | 0.178 | 0.147 | 8.067 |
| 62.5 | 3.187 | 3.262 | 2.952 | 2.137 | 1.678 | 0.946 | 0.515 | 0.295 | 0.179 | 0.126 | 0.103 | 0.055 |
| 31.3 | 3.148 | 3.001 | 2.628 | 1.767 | 1.168 | 0.604 | 0.336 | 0.199 | 0.131 | 0.098 | 0.127 | 0.063 |
| 15.6 | 2.998 | 2.792 | 2.099 | 1.245 | 0.736 | 0.371 | 0.189 | 0.127 | 0.093 | 0.073 | 0.070 | 0.056 |
| 0 | 0.114 | 0.121 | 0.089 | 0.038 | 0.069 | 0.068 | 0.054 | 0.052 | 0.054 | 0.057 | 0.058 | 0.063 |
-
Beispiel 2
-
Begrenzender Antigentest von Testantikörpern
-
SA-Mikrotiterplatten
wurden mit dem biotinylierten Antigen PTH bei der optimalen Konzentration
von 15 ng/ml beschichtet, wie in Beispiel 1 bestimmt. Fünfzig Mikroliter
(50 μl)
biotinyliertes Antigen bei einer Konzentration von 15 ng/ml in 1%-iger Magermilch,
1 × PBS
pH 7,4, wurden in einem Verteilungsmuster wie in Beispiel 1 beschrieben
zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde 30 Minuten inkubiert.
-
Die
Platten wurden viermal (4×)
mit Wasser gewaschen und Überstand
einer B-Zell-Kultur, die 1:10 verdünnten Testantikörper in
1%-iger Magermilch/1 × PBS
pH 7,4/.05% Azid enthielt, und 50 μl jeder Probe wurden zu jeder
von je zwei Vertiefungen zugegeben. Achtundvierzig (48) verschiedene
Proben wurden pro Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Auf einer
separaten Platte wurde der Referenzantikörper 15g2-anti-PTH bei der
Konzentration, die zur Bestimmung der optimalen Antigenkonzentration
verwendet wurde, mindestens eine halbe Platte ausverdünnt. Dies
stellt eine positive Kontrolle bereit, um sicher zu stellen, dass
die Resultate von Tests von Testantikörpern vergleichbar sind mit
den Optimierungsresultaten.
-
Die
Platten wurden mit Plastikfolie oder Paraffinfilm dicht eingepackt
und unter Schütteln
24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Am
folgenden Tag wurden alle Platten fünfmal (5×) gewaschen und 50 μl polyclonaler
Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-HRP-Antikörper mit einer Konzentration
von 0,5 μg/ml
in 1%-iger Milch, 1 × PBS
pH 7,4, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden 1 Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
Platten wurden mindestens fünfmal
(5× mit
Leitungswasser) gewaschen. Fünfzig
Mikroliter (50 μl) des
HRP-Substrats TMB wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten
wurden 30 Minuten inkubiert. Die HRP-TMB-Reaktion wurde durch Zugabe
von 50 μl
1 M Phosphorsäure
zu jeder Vertiefung gestoppt. Die optische Dichte (Absorption) wurde
für jede
Vertiefung der Platte gemessen.
-
Datenanalyse
-
Die
OD-Werte der Testantikörper
wurden gemittelt und der Bereich wurde berechnet. Die Antikörper mit
dem höchsten
Signal und akzeptabel niedriger Standardabweichung wurden als die
Antikörper
selektiert, die eine höhere
Affinität
zu dem Antigen haben als der Referenzantikörper.
-
Tabelle
3 zeigt die Resultate des begrenzenden Antigenverdünnungstests
unter Verwendung von PTH als ein Ligand. Die Antikörper sind
gemäß ihrer
relativen Affinität
zu verschiedenen PTH-Antigenen gereiht und werden durch ihre Vertiefungsnummer
identifiziert. Tabelle 3 Affinitätsreihung von Testantikörpern bei
limitierter Verdünnung
von PTH
| Vertiefung | Limitierende
Ag OD | Limitierende Ag-Reinung | Primäre OD | Sekundäre OD | PTH(1-84) | PTH(7-84) | PTH(17-44) | Ratte PTH (1.84) |
| 292A10 | 2.747 | 1 | 0.992 | ND | 1.40 | 195 | 3.26 | 0.62 |
| 302A7 | 1.376 | 2 | 0.317 | ND | 0.35 | 0.36 | 2.66 | 0.19 |
| 253D10 | 1.009 | 3 | 0.954 | 0.511 | 0.79 | 1.10 | 2.10 | 1.18 |
| 263C8 | 0.693 | 5 | 0.372 | 0.286 | 1.75 | 1.98 | 3.29 | 1.34 |
| 245B10 | 0.644 | 6 | 0.622 | 0.580 | 0.84 | 0.32 | 0.12 | 0.19 |
| 238F8 | 0.566 | 7 | 0.667 | 0.541 | 1.05 | 1.34 | 2.79 | 1.19 |
| 228E3 | 0.504 | 8 | 0.560 | 0.259 | 0.48 | 0.80 | 3.12 | 1.40 |
| 262H1 | 0.419 | 9 | 0.461 | 0.274 | 0.86 | 1.20 | 2.45 | 0.36 |
| 161G7 | 0.411 | 10 | 0.409 | 0.212 | 0.49 | 0.90 | 1.68 | 0.84 |
| 331H6 | 0.322 | 11 | 0.312 | ND | 1152 | 0.45 | 2.40 | 0.24 |
| 287E7 | 0.261 | 12 | 0.682 | ND | 0.71 | 0.13 | 0.36 | 1.03 |
| 315D8 | 0.221 | 13 | 0.441 | ND | 0.14 | 0.17 | 0.29 | 0.31 |
| 279E6 | 0.213 | 14 | 0.379 | ND | 0.31 | 0.10 | 0.17 | 0.19 |
| 250G6 | 0.178 | 15 | 0.560 | 0.248 | 0.44 | 0.66 | 1.77 | 0.19 |
| 244H11 | 0.175 | 16 | 0.405 | 0.556 | 0.50 | 0.85 | 0.98 | 0.31 |
| 313D5 | 0.170 | 17 | 0.664 | ND | 0.12 | 0.29 | 0.43 | 0.30 |
| 339F5 | 0.120 | 18 | 0.319 | ND | 0.40 | 0.21 | 0.11 | 0.25 |
| 279D2 | 0.114 | 19 | 0.353 | ND | 0.31 | 0.11 | 0.27 | 0.18 |
| 307H1 | 0.084 | 20 | 0.401 | ND | 0.10 | 0.14 | 0.30 | 0.42 |
| 308A1 | 0.079 | 21 | 0.312 | ND | 0.19 | 0.22 | 0.30 | 0.45 |
| 322F2 | ND | 22 | 1.870 | ND | 1.01 | 0.15 | 0.34 | 1.41 |
-
Beispiel 3
-
Verdünnungen
von Antikörpern
gegen Interleukin-8 (IL-8)
-
Die
geeignete Beschichtungskonzentration für IL-8 wurde wie vorstehend
beschrieben bestimmt, um eine Konzentration von IL-8 zu bestimmen,
die in einer OD von etwa 1 resultierte. Die optimale Konzentration wurde
dann mit einer Vielzahl von Überständen von
Anti-IL-8-Antikörpern
inkubiert, die von XenoMouse-Tieren abgeleitet waren, die mit IL-8
immunisiert worden waren. Die Tabelle 4 illustriert typische Resultate
und die Reihung von Antikörpern,
die auf ihre Affinität
zu IL-8 durchmustert wurden. Die Spalten "primäre
OD" und "sekundäre OD" betreffen primäre und sekundäre Bindungsscreenings-OD's, die erhalten wurden,
wenn nicht begrenzte Mengen an IL-8 in dem Bindungs-ELISA verwendet
wurden. Die OD-
-
Werte,
die in dem Bereich begrenztes Antigen dargestellt sind, betreffen
im Mittel zwei Bindungs-ELISA's,
die mit begrenztem Antigen gemacht wurden. Wie in Tabelle 4 gezeigt,
sind die drei besten Antikörper
in der Lage, ihre Bindung an das Antigen selbst bei den begrenzten
Konzentrationen zu behalten. Andere Antikörper, die bei dem primären und
sekundären
nicht begrenzten Antigenbindungs-ELISA auch hohe OD's erreichten, waren
nicht in der Lage, das selbe Signal zu erreichen, wenn die Antigenkonzentrationen
begrenzend waren. Tabelle 4 Affinitätsreihung von Testantikörpern bei
limitierter Verdünnung
von IL-8
| Clon Nummer | | | Limitierte
Ag |
| Platte | Vertiefung | Primäre OD | Sekundäre OD | Durchschnitt | St
dev. | Limitierte
Ag Reihung |
| 36 | C6 | 1.95 | 3.023 | 1.32 | 4% | 1 |
| 6 | G11 | 2.021 | 1.403 | 0.90 | 9% | 2 |
| 50 | B1 | 1.818 | 2.398 | 0.82 | 14% | 3 |
| 41 | C11 | 1.83 | 3.218 | 0.81 | 19% | 4 |
| 53 | G5 | 1.128 | 2.521 | 0.80 | 1% | 5 |
| 44 | B8 | 2.09 | 2.707 | 0.78 | 2% | 6 |
| 51 | G10 | 1.408 | 1.652 | 0.78 | 2% | 7 |
| 53 | E1 | 1.992 | 3.035 | 0.72 | 12% | 8 |
| 38 | C1 | 2.571 | 2.945 | 0.71 | 3% | 9 |
| 32 | F3 | 2.339 | 3.322 | 0.66 | 13% | 10 |
| 13 | F10 | 1.505 | 1.833 | 0.66 | 5% | 11 |
| 41 | D2 | 2.997 | 2.944 | 0.66 | 5% | 12 |
| 53 | C2 | 1.56 | 1.869 | 0.64 | 22% | 13 |
| 14 | E2 | 1.255 | 1.875 | 0.57 | 25% | 14 |
| 54 | C3 | 2.131 | 2.486 | 0.51 | 12% | 15 |
| 50 | F3 | 0.572 | 1.635 | 0.51 | 26% | 16 |
| 55 | E8 | 1.031 | 1.917 | 0.50 | 10% | 17 |
| 42 | E5 | 3.07 | 3.147 | 0.49 | 4% | 18 |
| 6 | E7 | 0.637 | 1.545 | 0.49 | 22% | 19 |
| 7 | E10 | 1.794 | 1.953 | 0.48 | 18% | 20 |
| 8 | B2 | 1.725 | 1.777 | 0.48 | 5% | 21 |
| 48 | E6 | 2.103 | 3.004 | 0.48 | 25% | 22 |
| 33 | A1 | 2.623 | 2.351 | 0.47 | 17% | 23 |
| 51 | F5 | 2.062 | 2.838 | 0.45 | 15% | .24 |
| 51 | B1 | 1.778 | 2.631 | 0.45 | 0% | 25 |
| 44 | A5 | 2.473 | 2.55 | 0.44 | 5% | 26 |
| 6 | G4 | 2.117 | 1.505 | 0.41 | 7% | 27 |
| 43 | G4 | 0.991 | 1.943 | 0.41 | 2% | 28 |
| 47 | E3 | 1.049 | 2.222 | 0.40 | 16% | 29 |
| 46 | F11 | 1.641 | 1.843 | 0.39 | 9% | 30 |
| 43 | F4 | 0.744 | 1.449 | 0.39 | 7% | 31 |
| 54 | H1 | 1.465 | 1.584 | 0.38 | 25% | 32 |
| 44 | F4 | 2.05 | 2.573 | 0.38 | 13% | q33 |
| 49 | G11 | 1.334 | 2.019 | 0.37 | 6% | 34 |
| 11 | C10 | 1.169 | 1.498 | 0.37 | 3% | 35 |
| 41 | B12 | 1.107 | 1.347 | 0.37 | 3% | 36 |
| 46 | F2 | 0.865 | 1.15 | 0.37 | 11% | 37 |
| 52 | E11 | 0.961 | 2.034 | 0.37 | 5% | 38 |
| 7 | 86 | 2.039 | 1.802 | 0.33 | 6% | 39 |
| 39 | F6 | 1.434 | 1.196 | 0.33 | 6% | 40 |
| 10 | E5 | 0.886 | 1.262 | 0.33 | 6% | 41 |
| 36 | C12 | 1.078 | 1.991 | 0.33 | 10% | 42 |
| 44 | B9 | 1.469 | 1.683 | 0.32 | 4% | 43 |
| 8 | H1 | 1.338 | 1.316 | 0.31 | 2% | 44 |
| 52 | F3 | 1.289 | 1.204 | 0.28 | 16% | 45 |
| 45 | A4 | 1.136 | 1.302 | 0.28 | 13% | 46 |
| Clon Nummer | | | Limitierte |
| Platte | Vertiefung | Primäre OD | Sekundäre OD | Durchschnitt | St
dev. | Limitierte
Ag Reihung |
| 25 | A11 | 1.199 | 1.17 | 0.27 | 25% | 47 |
| 51 | C12 | 0.955 | 1.148 | 0.26 | 11% | 48 |
| 6 | E5 | 1.41 | 1.138 | 0.24 | 8% | 49 |
| 39 | H3 | 0.471 | 1.155 | 0.23 | 6% | 50 |
| 14 | E3 | 1.958 | 1.255 | 0.22 | 15% | 51 |
| 3 | D1 | 2.254 | 3.497 | 0.21 | 24% | 52 |
| 33 | F4 | 1.323 | 1.408 | 0.21 | 24% | 53 |
| 51 | A12 | 0.555 | 1.522 | 0.19 | 17% | 54 |
| 5 | G1 | 2.205 | 2.274 | 0.17 | 4% | 55 |
| 35 | C9 | 1.217 | 1.249 | 0.17 | 4% | 56 |
| 6 | B10 | 1.006 | 1.145 | 0.17 | 8% | 57 |
| 39 | B4 | 1.326 | 1.62 | 0.17 | 8% | 58 |
| 5 | G3 | 1.192 | 1.387 | 0.17 | 29% | 59 |
| 35 | F10 | 1.307 | 1.777 | 0.17 | 29% | 60 |
| 17 | E11 | 0.839 | 1.805 | 0.17 | 15% | 61 |
| 3 | D3 | 0.605 | 1.351 | 0.16 | 5% | 62 |
| 31 | A1 | 1.557 | 1.826 | 0.16 | 17% | 63 |
| 28 | C5 | 1.373 | 1.942 | 0.16 | 5% | 64 |
| 14 | F5 | 1.441 | 1.482 | 0.15 | 25% | 65 |
| 43 | D8 | 0.714 | 1.501 | 0.15 | 22% | 66 |
| 29 | D5 | 1.326 | 1.322 | 0.14 | 23% | 67 |
| 32 | F11 | 1.36 | 1.284 | 0.48 | 71% | 68 |
| 7 | D4 | 0.874 | 2.333 | 0.44 | 34% | 69 |
| 47 | G11 | 0.811 | 1.209 | 0.42 | 76% | 70 |
| 39 | G2 | 0.676 | 1.157 | 0.42 | 32% | 71 |
| 15 | G4 | 2.046 | 2.461 | 0.39 | 41% | 72 |
| 31 | G12 | 1.902 | 1.929 | 0.36 | 44% | 73 |
| 41 | C2 | 1.201 | 2.522 | 0.33 | 34% | 74 |
| 7 | E11 | 1.402 | 1.719 | 0.32 | 50% | 75 |
| 40 | A4 | 1.786 | 1.427 | 0.32 | 50% | 76 |
| 45 | E12 | 1.986 | 2.887 | 0.26 | 54% | 77 |
| 2 | B10 | 1.871 | 1.389 | 0.22 | 38% | 78 |
| 7 | H8 | 1.516 | 1.171 | 0.22 | 45% | 79 |
| 28 | C3 | 1.246 | 1.182 | 0.15 | 52% | 80 |
Tabelle 4A Affinitätsmessung
von Referenzantikörper
1
| Referenzantikörper 1 |
| Konz.
ng/ml | Limitierte
Ag OD | St.
Dev. |
| 125.00 | 1.52 | 1% |
| 62.50 | 1.38 | 2% |
| 31.25 | 1.25 | 12% |
| 15.63 | 1.13 | 28% |
| 7.81 | 0.80 | 2% |
| 3.91 | 0.78 | 18% |
| 1.95 | 0.67 | 0% |
| 0.98 | 0.73 | 8% |
| 0.49 | 0.53 | 18% |
| 0.24 | 0.39 | 17% |
Tabelle
4B Tabelle 4B Affinitätsmessung von Referenzantikörper 2
| Referenzantikörper 2 |
| Konz.
ng/ml | Limitierte
Ag OD | St.
Dev. |
| 125.00 | 0.52 | 23% |
| 62.50 | 0.38 | 11% |
| 31.25 | 0.34 | 1% |
| 15.63 | 0.42 | 43% |
| 7.81 | 0.54 | 13% |
| 3.91 | 0.46 | 30% |
| 1.95 | 0.54 | 9% |
| 0.98 | 0.34 | 9% |
| 0.49 | 0.49 | 32% |
| 024 | 0.55 | 38% |
-
Beispiel 4
-
Affinitätsreihung
-
Herstellung von Antigenen
-
Um
den effektiven Durchsatz des Antikörper-Affinitätsreihungsverfahrens
zu erhöhen,
markierten wir verschiedene Konzentrationen eines Antigens mit verschieden
gefärbten
Beads. Bei diesem Beispiel wurden Beads von dem Luminex-System verwendet.
Wie bekannt ist, emittiert jedes Bead, wenn aktiviert, Licht einer variierenden
Wellenlänge.
Wenn es in ein Luminex-Lesegerät
gebracht wird, kann die Identität
von jedem Bead leicht bestätigt
werden.
-
Bei
diesem Beispiel wurde eine verschiedene Farbe eines Streptavidin-Luminex-Beads an
jeweils eine von vier Konzentrationen von biotinyliertem Antigen
(1 μg/ml,
100 ng/ml, 30 ng/ml und 10 ng/ml) gebunden. Somit wurde jede Konzentration
des Antigens durch ein verschieden gefärbtes Bead repräsentiert.
Die vier Konzentrationen wurden in einer einzigen Lösung gemischt,
die alle vier farbgebundenen Konzentrationen enthielt.
-
Alle
Antikörperproben
wurden dann unter Verwendung der Luminex-Quantifizierungsresultate oder einer
Ein-Punkt-Quantifizierung von Luminex auf dieselbe Konzentration
verdünnt
(~500 ng/ml). Dann wurde eine serielle Verdünnung (1:5) aller Proben durchgeführt, somit
wurden insgesamt vier Verdünnungspunkte
erhalten, wobei vorzugsweise genug Probe für zwei Platten verdünnt wurde:
eine Quantifizierungsplatte und die Reihungsplatte.
-
Reihung von Antikörpern
-
Um
die Antikörper
zu reihen, wurden ~2000 von jedem Gemisch von Luminex-Bead-Antigenproben
in jede Vertiefung der Luminex-Platte geladen und die Vertiefung
wurde dann abgesaugt. Dann wurden 50 μl von jeder Antikörperprobe
(24 Proben insgesamt) in jede Vertiefung geladen und übernacht
bei 4°C
geschüttelt. Die
Platten wurden dreimal (3×)
mit Waschpuffer gewaschen. Dann wurde 20 Min. bei Raumtemperatur
unter Schütteln
der Nachweis mit einem fluoreszierenden Anti-Mensch-Antikörper (hIgG-Phycoerythrin (PE)
(Verdünnung
1:500)) durchgeführt,
der 50 μl/Vertiefung
band. Die Platten wurden dann dreimal (3×) mit Waschpuffer gewaschen.
Die Platten wurden in 80 μl
Blockierungspuffer resuspendiert. Als nächstes wurden die Platten in
den Luminex geladen.
-
Datenanalyse
-
Weil
jede Vertiefung vier verschiedene Konzentrationen desselben Antigens
enthielt, die auf der Basis ihrer Farbe unterschieden werden konnten,
war es möglich,
die Bindungsaffinitäten
der verschiedenen Antikörper
rasch zu reihen. Zum Beispiel banden die Antikörper, die eine sehr starke
Bindungsaffinität
zu dem Antigen hatten, sogar an die schwächste Verdünnung von Antikörper. Dies
konnte durch die Analyse der Menge an fluoreszierendem Anti-Mensch-Antikörper gemessen
werden, die an das gefärbte
Bead gebunden waren, das mit der schwächsten Antigenkonzentration
verknüpft
war. Alternativ wurden Antikörper,
die nicht stark banden, nur nachgewiesen in Bindung mit den Antigenkonzentrationen
von 1 μg/ml
und 100 ng/ml, aber nicht bei Konzentrationen von 30 ng/ml oder
10 ng/ml.
-
Die
Datenanalyse wurde unter Verwendung von SoftMax Pro für die Quantifizierungsdaten
durchgeführt.
Das Luminex-Signal von Proben, die bei mehreren Konzentrationen
getestet wurden, wurde verglichen. Die Proben wurden dann entsprechend
gereiht.
-
Beispiel 5
-
Vergleich der Ergebnisse mit begrenzendem
Antigen im Vergleich mit absoluten Biacore KD-Messungen
-
Die
folgende kinetische Reihungstechnologie wurde mittels ELISA durchgeführt und
mit formalen BiaCore-Kinetiken verglichen. Nachstehend in Tabelle
5 ist ein Vergleich eines typischen Ergebnisses mit begrenztem Antigen
im Vergleich mit absoluten, mit Biacore abgeleiteten KD-Messungen.
Kurz gesagt wurden 68 Antikörper
unter Verwendung der Reihung mit begrenztem Antigen gereiht (relativ
zueinander). Von den 68 Antikörpern
wurden 17 in ausreichenden Mengen für formale Affinitätsmessungen
unter Verwendung der BiaCore-Technologie produziert. Tabelle 5 Vergleich von Affinitätsmessung auf der Basis von
begrenzten Verdünnungen
mit Biacore Affinitätsmessungen
| Probe
ID | Limitierte
Antigen Reihung | Biacore
Affinität
(nM) |
| A | 1 | 1.9 |
| B | 3 | 1.9 |
| C | 4 | 1.3 |
| D | 5 | 6.9 |
| E | 7 | 3.3 |
| F | 10 | 17.7 |
| G | 11 | 28.9 |
| H | 12 | 3.8 |
| I | 13 | 4.4 |
| J | 23 | 11.2 |
| K | 28 | 57.8 |
| L | 30 | 29.2 |
| M | 34 | 1667 |
| N | 46 | 115.2 |
| O | 47 | 305.1 |
| P | 51 | 1000 |
| Q | 60 | 33.1 |
-
Datenanalyse
-
Wie
insgesamt gesehen werden kann, gibt es ein hohes Maß an Korrelation
zwischen dem hohen Rang bei begrenztem Antigen und dem formalen
KD. Im Falle von Antikörpern, die nicht gut korrelieren,
gibt es eine Reihe von Gründen,
warum solche Diskrepanzen existieren könnten. Obwohl zum Beispiel
ELISA-Platten mit Antigen mit niedriger Dichte beschichtet werden,
können
Aviditätseffekte
nicht völlig
ausgeschlossen werden. Außerdem
ist es möglich,
dass bei Beschichtungstestmaterial für die Reihungstechnik mit begrenztem Antigen
gewisse Epitope maskiert oder verändert werden könnten. Wenn
bei der Biacore-Analyse das Antigen über einen mit Antikörper beschichteten
Chip fließen
gelassen wird, könnten
diese Epitope auf dem Antigen in einer verschiedenen Konformation
vorhanden sein und daher in einer verschiedenen relativen Konzentration gesehen
werden. Dies könnte
wiederum in einer unterschiedlichen kinetischen Reihung zwischen
den beiden Verfahren resultieren.
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Es
ist auch möglich,
dass ein Antikörper
mit niedrigeren, von Biacore abgeleiteten Affinitäten wegen der
Anwesenheit einer viel höheren
Konzentration an Antigen-spezifischen Antikörper als durchschnittlich in der
Testprobe einen hohen Rang bei begrenztem Antigen geben kann. Dies
könnte
wiederum zu einem künstlich
hohen Rang bei begrenztem Antigen führen.
-
Es
ist wichtig, dass das kinetische Verfahren mit begrenztem Antigen
eine rasche Bestimmung der relativen Affinität erlaubte und dass es die
Antikörper
mit der höchsten
formalen Affinität
der Testantikörper
in dieser Anordnung identifizierte. Da weiterhin das relative kinetische
Reihungsverfahren mit begrenztem Antigen leicht zu erweitern ist,
um Tausende von Antikörpern
bei frühen
Stadien der Erzeugung von Antikörpern zu
untersuchen, bietet es einen signifikanten Vorteil gegenüber anderen
Technologien, die nicht einen ähnlichen
Vorteil der Erweiterung bieten.