DE4243375C2 - Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents
Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen FlüssigkeitenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein immunologisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung
von Autoantikörpern, deren Nachweis die Diagnose einer Autoimmu
nerkrankung ermöglicht.
Immunologische Bestimmungsverfahren spielen in zahlreichen Varianten eine sehr wesentliche Rolle in der
medizinischen Diagnostik. Neben derartigen Bestimmungsverfahren, die auf die qualitative und/oder quantitati
ve Bestimmung von Antigenen oder Haptenen, z. B. Hormonen, abzielen, gibt es auch zahlreiche derartige
Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere humanen
Seren.
Antikörper sind Eiweißkörper, die als Immunglobuline (Ig) bezeichnet werden und die vom Körper als
Reaktion auf ein Antigen gebildet werden. Da Antigene normalerweise zahlreiche antigene Determinanten
aufweisen, sind Antikörper polyklonaler Natur, stellen also eine Population von Eiweißkörpern mit unterschied
lichen Bindungseigenschaften gegenüber dem Antigen, gegen das sie gerichtet sind, dar. Sie werden normaler
weise gegen körperfremde Antigene gebildet, um den Körper gegen Substanzen zu schützen, die entsprechende
antigene Determinanten aufweisen. Erkennt das Immunsystem des Körpers fälschlich bestimmte körpereigene
Zellen oder Zellstrukturen als fremd, können aber auch Antikörper gegen Antigendeterminanten körpereigener
Elemente gebildet werden. Derartige körpereigene Elemente werden dann als Autoantigene bezeichnet, und die
gegen sie gebildeten Antikörper als Autoantikörper.
Bekannte Bestimmungsverfahren für Antikörper verwirklichen in der einen oder anderen Form verschiedene
Grundprinzipien, von denen zwei beispielsweise in der US-PS B1 3 654 090 in Spalte 3, oben, schematisch
dargestellt sind. Gemäß einer Variante, die dem klassischen Radioimmunoassay (RIA) entspricht, wird ein
Unterschuß eines immobilisierten Antigens verwendet, und der zu untersuchenden Probe wird eine markierte
Form des zu bestimmenden Antikörpers in einer bekannten Menge zugesetzt. Aus dem Grad der Bindung des
markierten Antikörpers an das immobilisierte Antigen kann auf die Anwesenheit bzw. Konzentration des
gesuchten Antikörpers zurückgeschlossen werden. Für diesen nach dem Konkurrenzprinzip arbeitenden Test
wird das Antigen in hochreiner Form benötigt.
Gemäß einem zweiten Verfahrensprinzip (vgl. US-PS B1 36 54 090 a. a. O. oder Arbeitsbeschreibungen DY-
NOtest® anti-TPO oder LUMItest® anti-TPO der Anmelderin) wird so vorgegangen, daß eine bekannte Menge
des zu bestimmenden Antikörpers oder eines geeigneten Derivats davon an einem festen Träger immobilisiert
wird, und man läßt dann den in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Antikörper und den immobilisierten
Antikörper um ein dem Reaktionssystem zugesetztes markiertes Antigen konkurrieren. Die Anwesenheit bzw.
Menge des zu bestimmenden Antikörpers ergibt sich aus der Verminderung der Bindung des markierten
Antigens an den immobilisierten Antikörper und damit an die feste Phase.
Bei der zuletzt genannten Art der Bestimmung wird eine markierte Form des zugehörigen hochreinen
Antigens benötigt, und der zu bestimmende Antikörper und der immobilisierte Antikörper müssen in solchen
Mengen vorliegen, daß es, gegebenenfalls unter Berücksichtigung nicht völlig identischer Affinitäten zu dem
markierten Antigen, zu einer wirksamen Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem
Antikörper in der zu untersuchenden Probe kommen kann.
Gemäß einem weiteren Verfahrensprinzip (vgl. DE-OS 37 25 504 A1) wird in analoger Vorgehensweise zu
dem für die Antigenbestimmung gut bekannten Sandwich-Test zur Antikörperbestimmung zuerst ein Über
schuß eines Antigens, üblicherweise in immobilisierter Form, vorgelegt, durch das die Gesamtmenge des zu
bestimmenden Antikörpers gebunden wird, und durch eine nachfolgende zweite immunologische Umsetzung
mit einem zweiten markierten Binder gegen den im ersten Schritt gebundenen Antikörper wird dieser unter
Ausbildung eines sandwichartigen Immunkomplexes markiert Der zweite Binder ist dabei häufig ein anti-Anti
körper (Doppelantikörperverfahren), oder es werden zur Markierung markierte unspezifische Binder wie die
sogenannten Proteine A oder G eingesetzt, die aus Bakterien gewonnene Proteine darstellen, die unspezifisch an
zahlreiche IgG-Antikörper binden. Die Selektivität des Verfahrens in dieser Variante wird durch die Selektivität
der Bindung zwischen dem immobilisierten Antigen und dem zu bestimmenden Antikörper gegen dieses Anti
gen gewährleistet, während die Markierungsreaktion ziemlich unspezifisch ist.
Eine andere Variante der Antikörper-Bestimmung nach dem Sandwich-Prinzip (vgl. z B. K. Beever et al.,
Clinical Chemistry, Vol. 35, No. 9, 1989, S. 1949-1954), die insbesondere für die Bestimmung von Autoantikör
pern angewandt wird und die den nächsten Stand der Technik bildet, von dem in der vorliegenden Anmeldung
ausgegangen wird unterscheidet sich von der eben geschilderten dadurch, daß zur quantitativen Bindung
(Extraktion aus der Probenlösung) des zu bestimmenden Antikörpers anstelle eines selektiven Antigens ein eher
unspezifischer Binder für Antikörper verwendet wird und daß die Selektivität des Bestimmungsverfahrens
dadurch gewährleistet wird, daß als Marker für die "richtigen" gebundenen Antikörper ein hochreines markier
tes Antigen gegen letztere verwendet wird. Wie bei der weiter oben geschilderten "kompetitiven" Verfahrensva
riante konnte dieses Verfahrensprinzip bisher nur dann verwirklicht werden, wenn das fragliche Antigen in
reiner Form verfügbar war.
In der US-A-4 292 403 wird ein Verfahren zum Nachweis von
Immunglobulinen (Antikörpern), insbesondere solchen der Klas
sen IgM, IgA, IgD und IgE, beschrieben, bei dem ein Testmedium
nacheinander umgesetzt wird mit
- a) einem unlöslich gemachten Antikörper oder Antikörperfrag ment gegen Antikörper derjenigen Antikörperklasse IgX, der der zu bestimmende spezifische Antikörper angehört,
- b) einem Antigen (Ag) zu den zu bestimmenden spezifischen Antikörpern (Ak) in Form einer Präparation eines körper fremden Erregers, und
- c) markierten Antikörperfragmenten, insbesonder als Enzym konjugate vorliegenden F(ab')2 -Fragmenten, von spezifi schen Antikörpern gegen das relevante Antigen,
und bei dem man im letzten Schritt die feste oder ungelöste
Phase von der flüssigen Phase trennt und die Anwesenheit oder
Menge der zu bestimmenden Antikörper (Ak) in dem Testmedium
anhand der an die feste Phase gebundenen Menge des markierten
Antikörperfragments festellt.
Die bei dem beschriebenen Verfahren zur Markierung verwendeten
IgG-Fragmente werden in allen Fällen aus den Seren immunisier
ter Tiere bzw. positiver Patienten erhalten, sind also poly
klonal. Damit wird bei einem Verfahren gemäß US-A-4 292 403
jedoch eine komplexe Überlagerung von Konkurrenzreaktionen und
Bindungsreaktionen erhalten, ohne daß der in der Summe erhal
tene Effekt in irgendeiner Weise generell voraussagbar wäre.
Außerdem ist das beschriebene Verfahren mehrstufig und sieht
eine Vielzahl von zwischengeschalteten Waschschritten vor.
Bei der Bestimmung von Antikörpern gegen körperfremde Antigene lassen sich die Funktionsvoraussetzun
gen für die verschiedenen Tests häufig ohne größere Schwierigkeiten erfüllen. Die Antikörperkonzentrationen
gegen körperfremde Antigene sind im Normalfalle relativ niedrig, und die zugehörigen Antigene oder auch
Haptene können häufig in ausreichenden Mengen auf chemischem oder biotechnologischem Wege synthetisiert
oder aus natürlichem Material isoliert und angereichert werden.
Beabsichtigt man jedoch, nach einem der geschilderten Verfahrensprinzipien Autoantikörper zu bestimmen,
so stößt man auf eine Reihe von teilweise erheblichen Schwierigkeiten, und zwar sowohl aufgrund der auftreten
den Autoantikörperkonzentrationen als auch aufgrund der Natur der Autoantigene.
Die Bestimmung von Autoantikörpern ist für den Nachweis des Vorliegens einer Autoimmunerkrankung sehr
wichtig, insbesondere um die beobachteten Krankheitserscheinungen richtig zu interpretieren und evtl. schädli
che Falschbehandlungen zu vermeiden. Bekannte Autoimmunerkrankungen, die teilweise außerordentlich
schwerer Natur sind, sind beispielsweise die rheumatoide Arthritis, der Diabetes mellitus Typ 1, die Myasthenia
gravis sowie einige mit der Schilddrüse assoziierte Autoimmunerkrankungen, wie die Basedow-Hyperthyreose
(auch Graves-Krankheit genannt), die Myxödemanämie und die Hashimoto Thyreoiditis. Als Autoantigene
wirken im Falle der Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen je nach Art der Krankheit das Thyreoglobulin, der
TSH-Rezeptor und/oder die Schilddrüsenperoxidase (TPO), wobei letztere nach jüngeren Erkenntnissen mit
dem sogenannten mikrosomalen Antigen identisch ist. Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend insbesonde
re im Hinblick auf die Bestimmung von Schilddrüsenautoantikörpern, insbesondere von Antikörpern gegen
hTPO, beschrieben. Das der Erfindung zugrundeliegende neue Verfahrensprinzip ist jedoch nicht auf diese
speziellen Bestimmungen beschränkt, sondern kann nutzbringend auch zur Bestimmung anderer Autoantikör
per angewandt werden.
Zusammenfassungen des derzeitigen Erkenntnisstandes auf dem Gebiet der Schilddrüsen-Autoimmunerkran
kungen finden sich in der wissenschaftlichen Literatur beispielsweise in dem Artikel von Marian Ludgate und
Gilbert Vassart in: Autoimmunity, 1990, Band 7, Seiten 201-211; ferner in dem Review von Jadwiga Furmaniak
und Bernard Rees Smith in: Autoimmunity, 1990, Band 7, Seiten 63-80; sowie in dem Artikel von P. M.
Schumm-Draeger, H. J. C. Wenisch in: Akt. Endokr. Stoffw. 10 (1989), Seiten 9-102 (Sonderheft), wo ein Über
blick über die Methoden zum Nachweis von Schilddrüsenautoantikörpern gegeben wird.
Die immundiagnostische Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern bzw. Autoantikörpern generell un
ter sinngemäßer Anwendung eines der eingangs genannten Bestimmungstypen stößt auf die grundsätzliche
Schwierigkeit, daß die Autoantikörper sehr häufig gegen Autoantigene gerichtet sind, die in der Zellmembran
verankert sind und in der für die übliche Verfahrensdurchführung erforderlichen hohen Reinheit und Menge nur
schwer erhältlich sind. Im Falle der menschlichen Schilddrüsenperoxidase (hTPO), eines Enzyms, das als Autoan
tigen für die Hashimoto Thyreoiditis verantwortlich ist, handelt es sich beispielsweise um ein glycosyliertes
Hämoprotein, das an die Schilddrüsenmembranen gebunden ist. Seine antigenen Eigenschaften, einschließlich
der vorhandenen Typen von Epitepen auf seiner Oberfläche, sind beschrieben in dem Artikel von J. Ruf et. al. in:
Endocrinology, Vol. 125, No. 3, S. 1211 bis 1218. Um für die immundiagnostischen Bestimmungsverfahren nach
den bekannten Verfahrensprinzipien diese Schilddrüsenperoxidase in ausreichender Reinheit und Menge als
Antigen zur Verfügung zu haben, muß die Schilddrüsenperoxidase auf proteolytischem Wege oder mit Hilfe von
Detergenzien aus der Membran herausgelöst und über Immunadsorbenzien oder mittels konventioneller Chro
matographiemethoden an unterschiedlichen Trennphasen gereinigt werden, z. B. mittels Gelfiltration, Ionenaus
tauschchromatographie, Chromatographie über hydrophobe Interaktionen, Chromatographie über aromatische
Interaktionen, Adsorptionschromatographie und Chromatographie über Concanavalin A. Diese Verfahren sind
aufwendig und mit dem Risiko ungewollter Veränderungen des zu isolierenden Enzyms sowie starkem Material
verlust verbunden. Hochgereinigte native Schilddrüsenperoxidase (TPO) ist daher nur in geringen Mengen und
zu hohen Preisen verfügbar. Diese Tatsache wirkt sich direkt auf alle obigen Verfahrensvarianten aus, bei denen
das Antigen in reiner Form entweder zur selektiven Bindung der zu bestimmenden Antikörper oder als
selektiver Marker verwendet werden muß. Als Alternative zur Isolierung der Schilddrüsenperoxidase aus
Schilddrüsen wurden daher auch schon Versuche unternommen bzw. Verfahren entwickelt, nach denen TPO auf
gentechnologischem Wege erzeugbar ist. Auch die so gewonnene TPO ist jedoch nur in begrenzten Mengen und
zu hohen Preisen verfügbar, und die Identität des gentechnologisch gewonnenen Materials mit der natürlichen
Schilddrüsenperoxidase, insbesondere was die antigenen Eigenschaften angeht, ist nicht in jedem Falle gewähr
leistet.
Eine weitere Schwierigkeit ergibt sich ferner daraus, daß die antigenen Eigenschaften der TPO sehr stark
durch chemische Einwirkungen beeinträchtigt werden können, insbesondere wenn dadurch die dreidimensionale
Struktur verändert wird und/oder die Disulfidbrücken geöffnet werden (vgl. den genannten Artikel von J. Ruf).
Um TPO jedoch als markiertes Antigen in dem klassischen Verfahren zur Antikörperbestimmung einsetzen zu
können, muß an das TPO ein Markierungsanteil chemisch gebunden werden. Zusätzlich zu der Schwierigkeit der
Gewinnung von reinem TPO besteht auf dieser Stufe das Risiko, daß durch die mit der Markierung verbundenen
Umsetzungen die antigenen Eigenschaften der TPO so beeinflußt werden, daß sie nicht mehr der nativen TPO
entspricht und daher auch als Antigen zum Nachweis von Autoantikörpern nur noch bedingt geeignet ist.
Beispielsweise können die durch die Isolierung und/oder Markierung der TPO bewirkten Veränderungen dazu
führen, daß nur noch ein Teil der polyklonalen TPO-Autoantikörper mit einer derartigen markierten TPO
reagiert.
Um die mit der Isolierung und Markierung von TPO verbundenen Probleme wenigstens teilweise zu umge
hen, wurde als Abwandlung der eingangs geschilderten Sandwich-Tests zur Antikörperbestimmung auch schon
ein Test entwickelt, bei dem als immobilisiertes Antigen ein nicht hochgereinigt, sondern roh eingesetztes TPO
(humanes mikrosomales Antigen) verwendet wird (Arbeitsbeschreibung PROMAK-Assay® der Anmelderin).
Bei diesem Test besteht jedoch die Gefahr, daß in dem immobilisierten rohen TPO noch andere Substanzen mit
antigenen Eigenschaften vorhanden sind, die zu einer Immobilisierung anderer als der gesuchten Antikörper
führen, und daß diese dann bei der nachfolgenden, relativ unspezifischen Markierung nach einem Doppelanti
körperverfahren oder durch markiertes Protein A markiert werden und falsche positive Ergebnisse vortäuschen.
Angesichts der geschilderten Schwierigkeiten einer Bestimmung von Autoantikörpern nach den bekannten
immundiagnostischen Bestimmungsverfahren besteht daher ein dringender Bedarf nach einem verbesserten
Verfahren zur immundiagnostischen Bestimmung von Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten, das eine
sichere qualitative Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten ermöglicht, das durch geeignete
Eichung und Optimierung der Verfahrensparameter auch zur zuverlässigen quantitativen Bestimmung von
Antikörpern geeignet ist und bei dem es nicht nötig ist, hochgereinigte Antigene zu den zu bestimmenden
Antikörpern in nennenswerten Mengen einzusetzen. Das in dem nicht vorveröffentlichen Patent
DE 41 20 412 C1 beschriebene Verfahren der Anmelderin löst diese und andere Aufgaben für den Fall von
Antikörper-Assays, insbesondere Autoantikörper-Assays, bei denen sich die Anwesenheit der gesuchten Auto
antikörper als Störung der Bindung eines markierten Antikörpers an die feste Phase äußert und bei dem man das
Autoantigen, insbesondere TPO, nicht in hochgereinigter Form benötigt sondern in Form eines rohen, nativen
(cruden) Organextrakts einsetzen kann.
Da bei der nach dem Sandwichverfahren arbeitenden Verfahrensvariante, bei der die zu bestimmenden
Antikörper, insbesondere Autoantikörper, durch eine relativ unspezifische Bindung mit einem "Binder" extra
hiert werden, die Selektivität des Verfahrens von der Selektivität des Markers für die gesuchten Antikörper
abhängt, erschien bisher bei dieser Verfahrensvariante die Verwendung eines hochgereinigten markierten
Antigens und damit die Inkaufnahme aller geschilderten Nachteile als unumgänglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Antikörperbestimmung, bei dem
diese durch Bindung an einen unspezifischen Binder aus der Reaktionslösung extrahiert und dann spezifisch
markiert werden, zu entwickeln, bei dem die mit der Verwendung hochgereinigter markierter Antigene verbun
denen Probleme gelöst werden können.
Diese Aufgabe wird durch ein immunologisches Bestimmungsverfahren gelöst, wie es im Patentanspruch 1
dargestellt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen enthalten.
Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung von Autoantikörpern wie huma
nen Autoantikörpern gegen Schilddrüsenperoxidase (hTPO), so vorgegangen, daß die zu bestimmenden Anti
körper unter Verwendung unspezifischer Binder auf herkömmliche Weise an eine feste oder ungelöste Phase
gebunden werden und dann anschließend durch Umsetzung mit einer cruden Antigenpräparation und einem
weiteren, markierten Antikörper oder Antikörperfragment, die für das Antigen spezifisch sind, jedoch von dem
Binder nicht oder nicht nennenswert gebunden werden, für eine nachfolgende Messung selektiv markiert
werden. Die Anwesenheit der zu bestimmenden Antikörper äußert sich in Form eines an die feste bzw. ungelöste
Phase gebundenen Markierungsanteils, dessen Menge der Menge der zu bestimmenden Antikörper in der Probe
proportional ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird kein gereinigtes Antigen, z. B. hTPO benötigt, und dieses Antigen
muß auch nicht direkt markiert werden. Die Selektivität des Verfahrens wird dadurch gewährleistet, daß aus
durch eine Folge relativ unspezifischer Umsetzungen gebildeten Immunkomplexen oder Sandwichs aus Binder/
(gebundenen Antikörpern, die auch die zu bestimmenden Antikörper umfassen) sowie gegebenenfalls crudem
Antigen und Begleitsubstanzen durch eine Markierung mit einem nur für das Antigen spezifischen markierten
Antikörper oder Antikörperfragment die "richtigen" Sandwiches für die Bestimmung ausgewählt werden. Weder
bei der Extraktion der Antikörper mittels des Binders, noch bei der Umsetzung des erhaltenen Immunkomplexes
mit dem cruden Antigen kann man davon ausgehen, daß dabei mit einer für eine Messung ausreichenden
Selektivität die "richtigen" Sandwiches aus Binder/zu bestimmendem Antikörper/Antigen gebildet werden.
Indem man jedoch bei der Markierung so arbeitet, daß für die nachfolgende Bestimmung selektiv nur gebundene
Antigene erfaßt werden, wird ein insgesamt sehr spezifisches Bestimmungsverfahren erhalten.
Aus praktischen Gründen, und zwar zur Verminderung der Zahl der dem Endverbraucher in die Hand
gegebenen Reagenzien, ist es zwar vorzuziehen, die Umsetzung zwischen cruder Antigenpräparation und dem
für das Antigen spezifischen Tracer separat durchzuführen, so daß in die Bestimmung eine crude Antigenpräpa
ration eingesetzt wird, in der nur die eigentlichen Antigene eine Markierung tragen, das Verfahren kann aber
grundsätzlich ohne weiteres auch so durchgeführt werden, daß man erst die Umsetzung Binder/Probenflüssig
keit/-crude Antigenpräparation durchführt und anschließend in einem getrennten Schritt markiert oder daß man
alle genannten Reagenzien gleichzeitig inkubiert.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "Antigen" in einem engen Sinne verwendet,
nämlich nur für solche Substanzen, die nicht gleichzeitig Antikörper darstellen und Immunglobulincharakter
aufweisen, obwohl gut bekannt ist, daß auch Antikörper als Antigene wirken können und die Bildung von
anti-Antikörpern veranlassen können. Insbesondere sind Antigene im Sinne der vorliegenden Beschreibung
solche körpereigenen Substanzen, die auch wie eingangs beschrieben als Autoantigene wirken und die Bildung
von Autoantikörpern bewirken können.
Als Tracer werden zur Vermeidung einer Kreuzreaktion mit dem zur Extraktion der zu bestimmenden
Antikörper verwendeten Binder vorzugsweise markierte Fragmente von monoklonalen Antikörpern F(Ak)*
verwendet, z. B. Fragmente der mit F(ab)2 oder F(ab) bezeichneten Art oder auch andere Fragmente, die auf eine
Region des Antigens gerichtet sind, die von Autoantikörpern nicht erkannt wird. Antikörperfragmente ohne den
Fe-Teil sind bevorzugt. Der Grund der bevorzugten Verwendung derartiger Antikörperfragmente ist der, daß
die unspezifischen Binder wie Protein A oder Protein G Antikörper über das Fc-Fragment erkennen und binden,
das für verschiedene Antikörper im wesentlichen identisch ist. Wird dafür gesorgt, daß die zur selektiven
Markierung verwendeten Antikörper gegen das Antigen dieses Fc-Fragment nicht aufweisen, kann eine Verfäl
schung der Meßergebnisse aufgrund einer direkten Bindung des Tracers an den Binder verhindert werden. Es
liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, auch andere Antikörperfragmente, auch von polyklonalen
Antikörpern, und intakte Antikörper als Tracer zu verwenden, vorausgesetzt, diese sind selektiv für das Antigen
und werden durch den Binder nicht in einem die Messung verfälschenden Ausmaße gebunden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels noch näher erläutert.
In den Figuren zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Grundbestandteile des
Verfahrens zur leichteren Identifizierung mit den auch in den Ansprüchen verwendeten Symbolen bezeichnet
werden, ohne daß diese Symbole als solche die jeweiligen Assaybestandteile substanzmäßig in irgendeiner
Weise einschränkend definieren sollen.
Fig. 2 eine typische Standardkurve des in dem Beispiel beschriebenen Verfahrens.
Fig. 3 eine graphische Darstellung mit einer Gegenüberstellung von erfindungsgemäßem Verfahren und dem
als IMMUtest anti-TPO der Anmelderin im Handel befindlichen Grundverfahren.
Fig. 4 eine graphische Darstellung mit einer Gegenüberstellung von erfindungsgemäßem Verfahren und dem
als DYNOtest® anti-TPO der Anmelderin im Handel befindlichen Bestimmungsverfahren.
Das nachfolgende Beispiel zeigt die Durchführung und die praktischen Vorteile eines Assays, in dem das
erfindungsgemäße Verfahren verwirklicht wird, anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels, das den Nach
weis von humanen Autoantikörpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) betrifft.
Es stellt eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Grundverfahrens zur Bestimmung von Autoantikör
pern gegen hTPO dar, das grundsätzlich beschrieben ist im Artikel von Beever et al., Clinical Chemistry 35. 1989,
1949-1954 und in dem im Handel befindlichen IMMUtest anti-TPO der Anmelderin praktisch verwirklicht
wird. Bei diesem Grundverfahren werden die Autoantikörper enthaltende Probe, unlösliches Protein A zu deren
Bindung (vorzugsweise als direkte Staphylococcus aureus Suspension, wie sie von der Fa. Calbiochem unter der
Bezeichnung Pansorbin® vertrieben wird) und direkt markierte gereinigte TPO als Tracer miteinander kontak
tiert. Protein A liegt in einem hinreichenden Überschuß vor, um sämtliche in der Probe vorhandenen Antikörper
zu binden. Bei Anwesenheit von Autoantikörpern gegen hTPO erfolgt die Bildung eines Sandwich und damit
eine Bindung des Tracers an die ungelöste Phase. Gebundener TPO-Tracer wird dann durch Zentrifugation von
gelöster TPO abgetrennt, und das Sediment wird vermessen. Bei diesem Grundverfahren wurde bisher gerei
nigte, direkt markierte TPO benötigt.
Gefrorene humane Schilddrüsen (60 g) wurden zerkleinert, mit Puffer (200 ml phosphatgepufferter Salzlö
sung, PBS) versetzt und anschließend mittels eines Homogenisators (Ultraturrax der Firma IKA Werke) homo
genisiert. Nach einer einstündigen Zentrifugation bei 100 000 g wurde der Überstand entfernt, und das erhaltene
Pellet wurde auf die gleiche Weise wie die zerkleinerten Schilddrüsen rehomogenisiert. Daran schloß sich eine
weitere Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Stunde an. Das nunmehr erhaltene Pellet wurde wieder in PBS
(200 ml) rehomogenisiert, das zusätzlich als Detergens 0,5% Triton X 100 der Firma PIERCE (Katalog-Nr.
28314) enthielt, und es wurde 1 Stunde bei 4°C gerührt. Zuletzt wurde das erhaltene Homogenisat bei 100 000 g
für 2 Stunden zentrifugiert. Der resultierende Überstand stellt den hTPO-Extrakt dar, der als rohes natives
Antigen (Ag) in das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO eingesetzt
wird.
Es wurde ein monoklonaler Antikörper (MAK) gewählt, der an hTPO bindet, wobei seine Bindungsstelle
jedoch nicht der Region entspricht, die von humanen anti-hTPO-Antikörpern erkannt wird. Dieser Antikörper
wurde gemäß der Veröffentlichung von J. Ruf et al. (Endocrinology, 1989, 125, S. 1211-1218) hergestellt und
gereinigt.
Zur Vermeidung einer Bindung dieses Antikörpers an das als Binder für die zu bestimmenden Autoantikörper
verwendete Protein A wurde der Fc-Anteil von dem MAK entfernt. Dazu wurde auf an sich bekannte Weise der
gereinigte MAK (1 mg in 1 ml 20 mM Phosphatpuffer) mit immobilisiertem Pepsin (Sigma, Katalognummer P
3286) in die Fc und F(ab)2 Fragmente gespalten. Je 1 mg Antikörper wurde mit 1000 Units Pepsin für 20 h bei 24°
inkubiert. Die erhaltenen Fragmente wurden mittels Gelchromatographie (im Pharmacia System) über eine
Superose-12 Säule auf einer FPLC-Anlage getrennt. Anschließend wurden die gereinigten F(ab)2 Fragmente
nach der Chloramin T Methode mit 125I markiert. Dazu wurden 100 µg des F(ab)2 Fragments in 280 µl 20 mM
Phosphatpuffer mit 67 MBq Na125I (Amersham, Nr. IMS. 30) und 10 µg Chloramin T (Merck, Katalog-Nr. 2426)
für eine Minute gemischt. Der Markierungsansatz wurde dann über HPLC gereinigt, um freies 125I von dem an
F(ab)2 Fragmente gebundenen zu trennen. Die Trennung erfolgte über eine HPLC-Anlage mit einer Zorbax
GF250/9 Säule.
Zur Bestimmung von humanen Autoantikörpern gegen hTPO wurde im vorliegenden Falle zuerst ein Tracer-
Komplex bestehend aus Antigen (Ag aus der als hTPO-Extrakt unter 1. erhaltenen cruden Antigenpräparation)
und markierten F(ab)2 Fragmenten hergestellt. Dazu wurden beide Proteine im molaren Verhältnis von 1 : 1
gemischt und 20 h bei 24°C inkubiert. Innerhalb dieser Zeit bindet das F(ab)2 * an das Ag, der resultierende
Komplex wird auf eine Aktivität (125I) eingestellt und anschließend in das erfindungsgemäße Verfahren einge
setzt. Der Inkubations- und Verdünnungspuffer hatte folgende Zusammensetzung: 20 mM Tris, 150 mM NaCl,
0,1% Tween, 0,5% BSA (bovines Serumalbumin), 3 mM NaN3.
Zum Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen hTPO bzw. zur Eichung wurde jeweils wie folgt
vorgegangen:
- 1. Es wurden jeweils 50 µl der zu untersuchenden Probe bzw. des Standards oder Serums in Teströhrchen (Spitzbodenröhrchen 4,5 ml) pipettiert.
- 2. Anschließend wurden 50 µl einer Protein-A Suspension (Calbiochem: Katalog-Nr. 507858) pipettiert.
- 3. Als letztes wurden 50 µl des gemäß Punkt 3, beschriebenen Tracerkomplexes pipettiert, der das Antigen hTPO in Form des Extraktes aus humanen Schilddrüsen gemäß Punkt 1. und die daran gebundenen markierten F(ab)2 * Fragmente des monoklonalen anti-hTPO-Antikörpers enthält,
- 4. Die Reaktionsmischung wurde kurz geschüttelt und anschließend für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
- 5. Nach der Inkubation wurde in jedes Röhrchen 1 ml Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-De tergenz, 3 mM NaN3) pipettiert.
- 6. Anschließend wurden die Röhrchen 15 min bei 2000 g zentrifugiert, dekantiert, und das verbleibende Sediment wurde in einem Gamma-Counter gemessen.
Fig. 2 zeigt eine typische Standardkurve dieses Verfahrens.
In einer klinischen Untersuchung wurden die mit dem beschriebenen neuartigen Verfahren erhaltener Meß
ergebnisse mit denen verglichen, die unter Verwendung existierender immunologischer Bestimmungsverfahren
zur Autoantikörperbestimmung gegen hTPO für 200 Seren erhalten wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und den Fig. 3 und 4 zusammengefaßt.
In Tabelle 1 betreffen die Spalten a) und b) die Ergebnisse von Bestimmungsverfahren des Standes der
Technik die nachfolgend noch genauer erläutert werden. Dagegen werden die Werte, die nach dem neuen, wie
vorstehend beschrieben durchgeführten Verfahren erhalten wurden, unter c) aufgeführt. Die Meßergebnisse
sind in der Tabelle in Units/ml angegeben.
Die als Vergleichsverfahren dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenübergestellten Verfahren des Standes
der Technik waren im einzelnen:
- a) Ein Verfahren, bei dem ein anti-hTPO-Antikörper auf der Festphase verwendet wird. Radioaktiv mar kiertes und gereinigtes hTPO wird durch humane Autoantikörper in einer Konkurrenzreaktion von der Festphase verdrängt. Der verwendete Test ist ein kommerziell erhältlicher Test, der als DYNOtest® anti-TPO der Anmelderin im Handel ist.
- b) Bei diesem Test gemäß dem obigen Grundverfahren wird analog zum erfindungsgemäßen Verfahren Protein A auf der Festphase immobilisiert. Der Nachweis von Autoantikörpern in einer Probe erfolgt durch deren Bindung an die Festphase und ihren anschließenden Nachweis mit Hilfe von markierter gereinigter hTPO. Im konkreten Falle wird 125I markiertes hTPO gemäß dem IMMUtest anti-TPO der Anmelderin verwendet (vgl. auch Beever et al. Clin. Chem. 1989, 35: 1949-1954).
Bei der Bewertung von Meßergebnissen von Autoimmunerkrankungen hat es sich als sinnvoll erwiesen,
zwischen dem eindeutig negativen und eindeutig positiven Bereich eine Übergangszone, den sogenannten
"Graubereich", zu definieren. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Vergleichsverfahren b) liegt
dieser Bereich zwischen 100 und 200 Units/ml, und bei dem Verfahren a) zwischen 70 und 130 Units/ml. Unter
Berücksichtigung der Graubereiche korrelieren die Ergebnisse der beiden Vergleichsverfahren sehr gut mit
denen des erfindungsgemäßen Verfahrens c). Vergleicht man das erfindungsgemäße Verfahren c) mit Verfahren
b), so wird lediglich eine von 200 Patientenproben diskrepant gefunden, nämlich schwach positiv im erfindungs
gemäßen Verfahren und negativ in b). Bei der Korrelation der Verfahren a) und c) werden vier von 200 Proben in
a) schwach positiv gefunden, die in c) eindeutig als negativ zu betrachten sind Eine Probe wird dagegen mit c) als
schwach positiv und mit Hilfe von a) als negativ erkannt.
Wie bereits eingangs erwähnt wurde, ist das neue Verfahrensprinzip nicht auf die Bestimmung von Autoanti
körpern gegen hTPO beschränkt Es läßt ähnliche Vorteile auch für die Bestimmung anderer Autoantikörper
erwarten, die gegen membranassoziierte und andere Autoantigene gebildet werden. Es kann in diesem Zusam
menhang die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Acetylcholinrezeptoren vom Nikotintyp erwähnt wer
den, deren Auftreten nach allgemeiner Ansicht für die schwere Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis
kennzeichnend ist.
Tabelle 1
Claims (8)
1. Immunologisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung
von Antikörpern (Ak) in biologischen Flüssigkeiten, bei dem
die biologische Flüssigkeit umgesetzt wird mit
- a) einem unspezifischen Binder für Antikörper von der Art der zu bestimmenden Antikörper, wobei der Binder in der Reaktionsmischung unlöslich ist oder an eine feste Phase oder Mikrofestphase gebunden ist,
- b) einem Antigen (Ag) zu den zu bestimmenden Antikörpern (Ak), und
- c) einem Antikörper oder einem Fragment eines Antikör pers (F(Ak)*), die einen detektierbaren Markierungs anteil aufweisen und ebenfalls spezifisch an das Antigen (Ag) binden,
2. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß man als rohe native Antigenpräparation einen
humanen oder tierischen Organextrakt einsetzt.
3. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß der unspezifische Binder ausgewählt ist
aus einer Gruppe, die besteht aus Protein A, Protein G und
anti-human-Antikörpern nicht-humanen Ursprungs.
4. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden Autoanti
körper Autoantikörper gegen Schilddrüsenperoxidase (thyroid
peroxidase - TPO) sind und als Antigen rohe native hTPO in
Form eines Extrakts aus zerkleinerten humanen Schilddrüsen
eingesetzt wird.
5. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß der an den markierten monoklo
nalen Antikörper oder an das markierte Fragment eines monoklo
nalen Antikörpers (F(Ak)*) gebundene detektierbare Markie
rungsanteil ein radioaktives Isotop, ein Enzym, ein Fluores
zenz- oder Chemilumineszenzlabel oder ein Substrat für eine
enzymatische Nachweisreaktion oder ein anderes bekanntes, bei
immunologischen Bestimmungsverfahren verwendetes Label ist.
6. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, daß man die rohe native Antigen
präparation in einer vorgeschalteten Stufe mit dem markierten
monoklonalen Antikörper oder markierten Fragment eines mono
klonalen Antikörpers (F(Ak)*) umsetzt und auf diese Weise den
Anteil des eigentlichen Antigens in der Antigenpräparation
(Ag) indirekt markiert, und daß man die markierte Antigen
präparation dann einer vorinkubierten Reaktionsmischung zu
setzt, die den zu bestimmenden Autoantikörper (Ak) über den
Binder an eine feste oder ungelöste Phase gebunden enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man alle Umsetzungspartner in der Reaktionsmischung ge
meinsam inkubiert und die Menge der Markierung bestimmt, die
nach der Abtrennung der flüssigen Phase an die feste Phase
gebundenen ist.
8. Verwendung von rohen nativen Autoantigenen (Ag) in
Form von Organextrakten zur Herstellung von Kits zur Bestim
mung von Autoantikörpern (Ak) in biologischen Flüssigkeiten
nach einem immunologischen Bestimmungsverfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 7.
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