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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Untersuchungsverfahren für die Ermittlung
von Kobalamin oder Vitamin B12 und/oder
Folgt in einer Körperflüssigkeit
und insbesondere auf Untersuchungsverfahren für das metabolisch aktive Reservoir
von Kobalamin.
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Kobalamin
oder Vitamin B12 ist ein wasserlösliches
Vitamin, das einen Teil des Vitamin B-Komplexes bildet, der in Nahrungsmitteln
vorkommt. Das Kernmolekül
besteht aus einem Corrinring aus vier Pyrroleinheiten, die das essentielle
Kobaltatom umgeben. Kobalamin ist das einzige Vitamin, das nicht von
Tieren oder Pflanzen synthetisiert werden kann und im Darm aus der
Nahrung aufgenommen werden muss. Es kann jedoch in der Leber gespeichert
werden. Es wird durch Mikroorganismen synthetisiert, insbesondere
durch anaerobe Bakterien und Hefen.
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Folgt
(Folsäure
in ihrer anionischen Form) ist ein Vitamin, das zum Vitamin B-Komplex
gehört
und als Cosubstrat für
die Bildung von Methionin aus Homocystein benötigt wird. Seine reduzierte
Form, Tetrahydrofolat, ist wesentlich für den Prozess der DNS-Biosynthese.
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Kobalamin
wirkt in vivo als ein Coenzym und Kobalaminenzyme katalysieren drei
Arten von Reaktionen; (i) intramolekulare Umlagerungen, zum Beispiel
die Bildung von Succinyl-CoA aus L-Methylmalonyl-CoA, (ii) Methylierungen,
zum Beispiel, die Bildung von Methionin durch Methylierung von Homocystein
und (iii) die Reduktion von Ribonucleotiden zu Desoxyribonucleotiden
in einigen Mikroorganismen. Bei Säugetieren sind nur zwei enzymatische
Reaktionen bekannt, nämlich
die spezifisch in (i) und in (ii) oben erwähnten, die Kobalamin als Coenzym
benötigen.
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Beim
Verdauungsprozess bindet ein Haptocorrin genanntes Speichelprotein,
das im Folgenden als HC bezeichnet wird (und das in der Fachliteratur auch
als R-Binder bezeichnet wird oder als Kollektiv der Transkobalamine
I und III beschrieben wird), Kobalamin im oberen Gastrointestinaltrakt
und bildet einen Komplex, der den Magen passiert. Enzyme der Bauchspeicheldrüse verdauen
den Kobalamin-Haptocorrin (holo-HC) Komplex im Ileum und setzen
Kobalamin frei, das dann an ein Protein gebunden wird, das Intrinsic
Factor genannt wird und von der Magenschleimhaut abgesondert wird,
wodurch ein weiterer Komplex gebildet wird. Der Komplex aus Kobalamin und
Intrinsic Factor bindet an einen spezifischen Rezeptor in der Wand
des terminalen Ileums, worauf er durch einen Freisetzungsfaktor
dissoziiert wird und das Kobalamin aktiv durch die Membran des Ileums in
den Blutstrom transportiert wird.
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Kobalamin
zirkuliert nicht in einer nennenswerten Menge in freier Form im
Körper.
Vermutlich sind ungefähr
99% des Kobalamins durch eines der Transkobalaminproteine (TC I–III) oder
Albumin gebunden.
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Das
Protein, von dem angenommen wird, dass es für den Transport des Kobalamins
zu den Zielgeweben verantwortlich ist, ist Transkobalamin II (TC
II), ein kritisches Spurenprotein, ohne das Kobalamin Zellmembranen
nicht durchdringen kann. Trotz dieser wichtigen metabolischen Funktion
sind nur etwa 6–25%
des Kobalamins im Serum an TC II gebunden und der größte Teil
wird durch HC transportiert. TC II ist ein einkettiges Polypeptid
von 45 kDa, das hauptsächlich
im Serum, in der Samenflüssigkeit und
in der zerebrospinalen Flüssigkeit
gefunden wird. An Kobalamin gebundenes TC II oder holo-TC II bindet
an spezifische Rezeptoren auf Zellmembranen und sobald der holo-TC
II Komplex ge bunden wurde, wird er durch Pinozytose in die Zellen
transportiert.
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TC
II wird durch die Leber, das Gefäßendothel,
Enterozyten, Makrophagen und Fibroblasten synthetisiert und zirkuliert überwiegend
als apo-TC II, d. h. ohne gebundenes Kobalamin. Es hat eine kurze Halbwertszeit
von ungefähr
90 Minuten.
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Weniger
als ein Viertel des gesamten Kobalamins im Plasma ist an TC II gebunden.
Der Rest ist an die anderen Transkobalamine oder an Albumin gebunden,
wie oben erwähnt.
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Da
Kobalamin aus der Nahrung aufgenommen werden muss, können alle
möglichen
Zustände, die
eine eingeschränkte
Magenfunktion zur Folge haben, zum Beispiel Gastroenteritis oder
Zustände
mit der Folge einer Magenatrophie oder der Unfähigkeit, funktionsfähiges Haptocorrin,
Intrinsic Factor, Freisetzungsfaktor, TC II oder TC II-Rezeptoren
zu produzieren, zu eingeschränkter
Aufnahme von Kobalamin und einem daraus resultierenden Mangel führen.
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Bestimmte
Teilgruppen der Bevölkerung, zum
Beispiel Senioren, schwangere Frauen, Patienten mit chronischen
oder akuten Magen-Darm-Krankheiten, diejenigen, die unter bestimmten
Autoimmunkrankheiten leiden, diejenigen mit einer Familienkrankengeschichte
von perniziöser Anämie, und
an AIDS Leidende sind besonders anfällig für Kobalamin- und/oder Folatmangel.
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Die
klinischen Manifestationen von Kobalamin- und/oder Folatmangel sind
unterschiedlich und zahlreich, aber sie umfassen hauptsächlich Anämie, megaloblastische
Hämatopoese,
Hyperhomocysteinämie
und funktionelle und strukturelle Störungen des Nervensystems. Etwa
60% der Individuen, bei denen ein Kobalaminmangel diagnostiziert
wird, sind anämisch,
aber bei vielen sind neurologische Symptome die einzigen beobachteten
klinischen Anzeichen. Etwa 10% der Patienten zeigen Symptome psychischer
Störungen
und etwa 40% zeigen sowohl neurologische Symptome wie auch Symptome
psychischer Störungen.
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Eine
frühe Diagnose
des Kobalamin- und/oder Folatmangels ist entscheidend, um eine gute
Prognose für
die Patienten sicherzustellen, da einige der Manifestationen von
Kobalamin- und/oder Folatmangel, besonders die neuropsychiatrischen Effekte,
irreversibel sind, wenn sie nicht schnell entdeckt und durch Kobalamin-
und/oder Folattherapie gelindert werden.
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Es
ist daher wünschenswert,
die Kobalamin- und/oder die Folatniveaus eines Individuums genau zu
bestimmen, in einer praktischen und effizienten Weise, mit dem Blick
darauf, herauszufinden, ob das Individuum unter Kobalamin- und/oder
Folatmangel leiden könnte
oder nicht.
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Die
Messung des Gesamtgehalts an Kobalamin im Plasma, d. h. des Kobalamins
(und Kobalamin ähnlicher
Substanzen), das gebunden ist (bzw. die gebunden sind) an eines
der Transkobalamin (TC) Proteine I, II und III, ist in Versuchen
zur Bestimmung von Kobalaminmangel verwendet worden. Diese Technik
ergibt eine allgemeine Verteilung der als normal betrachteten Konzentrationen
innerhalb der Gesamtbevölkerung,
und erzeugt dadurch einen breiten Bezugsbereich. Bei Individuen
jedoch ist der Bereich für
die Menge von verfügbarem
Kobalamin, der für das
jeweilige Individuum als normal zu betrachten ist, sehr schmal.
Es ist beobachtet worden, dass, obgleich die metabolisch aktive
Konzentration von Kobalamin bei einem Individuum sich außerhalb
seines eigenen Bezugsbereichs befindet, der Gesamtgehalt von Kobalamin
in seinem Plasma innerhalb des Bereiches bleibt, der für die Gesamtbevölkerung
als normal angesehen wird. Unter solchen Umständen kann ein Kobalaminmangel
unentdeckt bleiben. Solch eine unzuverlässige Methode ist offensichtlich nicht
wünschenswert
und es ist allgemein anerkannt, dass solche Messungen von Kobalamin
im Serum oder Plasma eine niedrige Diagnoseempfindlichkeit und -spezifität aufweisen.
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Es
sind mikrobielle Assays mit Mikroorganismen, die für ihr Wachstum
Kobalamin benötigen,
entwickelt und zur Bestimmung der Konzentration von Kobalamin im
Plasma verwendet worden, aber abgesehen von der Schwierigkeit der
Abschätzung
des adäquaten
Bezugsbereichs erfordern diese Methoden auch Extraktion und Umwandlung
des Kobalamins, was sehr zeitraubend, schwierig und völlig ungeeignet
für schnelle
Reihenuntersuchungen im Labor ist.
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Alternative
Methoden zur Feststellung von Kobalaminmangel schließen die
Messung der Akkumulation von Stoffwechselprodukten, die Kobalamin für ihre Umwandlung
erfordern, im Plasma ein. Die Niveaus von Methylmalonat und Homocystein
im Plasma erhöhen
sich bei Individuen mit Kobalaminmangel (Chanarin, The megaloblastic
anaemia (Megaloblastische Anämie);
London, Blackwell Scientific Publications, 1991) und daher stellen
diese gute Kandidatenmoleküle
für eine
Korrelation mit Vitamin B12-Mangel dar.
Es ist jedoch gezeigt worden, dass die Methoden, die auf der Bestimmung
von Homocystein basieren, kompliziert und unpraktisch sind und geringe
Spezifität
und Empfindlichkeit zeigen. Während
die Methoden, die auf der Bestimmung von Methylmalonat basieren,
genau und zuverlässig
sind, sind sie umständlich
und erfordern Analyse durch kombinierte Gaschromatographie/Massenspektrometrie
und sind folglich teuer und wiederum ungeeignet für routinemäßige klinische
Reihenuntersuchungen (Nexø et
al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61–76).
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Es
ist auch vorgeschlagen worden, dass die Messung von an TC II gebundenem
Kobalamin im Gegensatz zum gesamten Kobalamin im Plasma einen zuverlässigen klinischen
Indikator der Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen eines Kobalaminmangels
liefern könnte
(Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34: 132–139; Wickramasinghe und Fida (1993)
J. Clin. Pathol. 46: 537–539;
US Patent Nr. 4 680 273 ).
Jedoch waren solche Versuche, die Konzentration von holo-TC II zu
bestimmen, bislang meist indirekt, indem die Konzentration von holo-TC II
als Differenz zwischen dem Gesamtgehalt von Kobalamin im Plasma
und der Konzentration von Kobalamin in Plasma, dem TC II entzogen
wurde, abgeschätzt
wurde.
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Solch
ein TC II-Entzug kann durch Adsorption an Ammoniumsulfat (Carmel
(1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367–372), feinteiliges Kieselgel
(Herzlich & Hubert
(1988) Lab. Invest. 58: 332–337;
Wickramasinghe & Fida
(1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539), mikrofeines
Glas (Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42: 202–211) oder immobilisierte polyklonale
anti-TC II Antikörper
(Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 53–61) erreicht
werden. Die Konzentration von Kobalamin im Gesamtplasma und in der
Fraktion, der TC II entzogen wurde, wird mit Methoden durchgeführt, die
der Fachwelt wohlbekannt sind, wie Radio- oder Enzymimmunoassay-Techniken.
Diese Methoden sind für
automatisierte oder nicht automatisierte routinemäßige Reihenuntersuchungen
ungeeignet, weil sie kompliziert und zeitraubend sind und weil der
niedrige Grad der Spezifität
der verwendeten Adsorptionsmittel zu unzureichender Trennung von holo-TC
II und holo-HC führt,
mit dem Ergebnis, dass der Gehalt von holo-TC II zu hoch abgeschätzt wird. Schwankungen
der Qualität
des Adsorptionsmittels von Los zu Los führen zu weiteren Fehlern und,
was am wichtigsten ist, die Subtraktion eines großen Volumens
von einem anderen großen
Volumen führt
zu unannehmbarer Ungenauigkeit und Unzuverlässigkeit.
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Die
anderen Versuche, TC II zu bestimmen, umfassten die abtrennung von
TC II von anderen Serumbestandteilen, einschließlich TC I und TC III, über seine
Liphophilie. So offenbaren Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta
172: 297–310,
Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195–199 und Toft et al. (1994)
Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 Methoden für die Abtrennung von TC II
von anderen Transkobalaminen mit Heparinsepharose, Silikagel beziehungsweise Zellulose.
Diese Methoden leiden jedoch unter den gleichen Nachteilen wie die
indirekten Methoden, da sie sich auf die gleichen Adsorptionsmittel stützen. Auch
macht die niedrige Konzentration von holo-TC II im Plasma diese
Methoden ungeeignet für die
Kombination mit vorhandenen Methoden zur Quantifizierung von Kobalamin.
Der Normalbereich für
die Konzentration von holo-TC II beträgt 35–160 pM und Werte unter 35
pM würden
im Allgemeinen als Anzeichen für
Kobalaminmangel betrachtet werden. Die berichtete analytische Empfindlichkeit
der meisten Routinemethoden zur Bestimmung von Kobalamin im Plasma
beträgt
ungefähr
40 pM, aber in der Praxis ist sie häufig viel höher, gewöhnlich in der Größenordnung
von 90 pM. Folglich liegen normale Konzentrationen von holo-TC II
im Plasma unterhalb oder in der Nähe der Nachweisgrenze der Routinemethoden
für die
Quantifizierung von Kobalamin.
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Die
vielleicht genaueste derzeit anerkannte Methode für die Bestimmung
von an TC II gebundenem Kobalamin umfasst Adsorption von TC II an
Silikagel und anschließende
Untersuchung der gebundenen Fraktion auf ihren Gehalt an Kobalamin,
entweder mit einem Immunoassay, wie zum Beispiel von Kuemmerle et
al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073–2077 beschrieben, oder einem
mikrobiologischen Assay, wobei das letztere anscheinend die besten
Resultate produziert. Diese Methode erfordert einen gesamten Arbeitstag,
um nur zwanzig Assays durchzuführen.
Es ist sehr kostspielig und unpraktisch und schlecht geeignet für routinemäßige klinische
Laboruntersuchungen für
Diagnosezwecke.
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Daher
besteht ein großes
Bedürfnis
nach verbesserten Methoden zur Bestimmung des Gehalts an metabolisch
aktivem Kobalamin in einer Körperflüssigkeit
mit Blick auf die Korrelation des Gehalts an Kobalamin mit der Wahrscheinlichkeit
eines Kobalaminmangels, die für
routinemäßige klinische Diagnoseanwendungen
zugänglich
sind.
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Daher
bezieht sich ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein
Doppeluntersuchungssystem, das den Gesamtgehalt sowohl von Folat
als auch von holo-TC II in einer Probe gemäß dem in den anhängenden
Ansprüchen
beschriebenen Verfahren misst.
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Die
Messung des Folats kann zum Beispiel erfolgen, indem zuerst ein
freisetzendes oder denaturierendes Mittel zugegeben wird (wie beispielsweise
eines, das Natriumhydroxid, Kaliumcyanid und Dithiothreitol enthält). Ein
Doppeltracer, der Cyanokobalamin enthält, das mit 57Co
(Co57) radioaktiv markiert wurde, und Folat, das mit 125I
(I125) markiert wurde, kann hinzugefügt werden, gefolgt von einer begrenzten
Menge eines Doppelbinders, der sowohl immobilisierten Intrinsic
Factor als auch Folatbinder enthält.
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Die
Messung von holo-TC II kann zum Beispiel durch in Kontakt bringen
der Probe mit einem immobilisierten spezifischen Liganden für holo-TC
II erfolgen, der vorzugsweise an einem magnetisierbaren Teilchen
angebracht ist, Abtrennung der an den Liganden gebundenen Fraktion
von einer nicht an den Liganden gebundenen Fraktion, zum Beispiel mittels
eines starken Magneten, und Messung des Gehalts an holo-TC II darin.
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Vorzugsweise
erfolgt der Nachweis des Gehalts an holo-TC II mit dem Doppelbinder
und dem Doppeltracer wie vorstehend beschrieben.
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Mit
einem spezifisch bindenden Liganden ist ein Ligand gemeint, der
aufgrund seiner spezifischen chemischen Struktur oder Konformation
an TC II bindet (d. h. apo-TC II und holo-TC II) oder holo-TC II und
nicht einfach aufgrund einer allgemeinen physikalisch-chemischen
Eigenschaft (wie Lipophilie), die vielen Bestandteilen einer Probe
einer Körperflüssigkeit
gemeinsam sein kann. Die Bindungsaffinität und die Spezifität der Liganden,
die für
eine Verwendung in dem Verfahren geeignet sind, lassen eine 3fache, vorzugsweise eine
5fache, besonders bevorzugt eine 10fache und am besten eine mehr
als 10fache Konzentration des TC II oder des holo-TC II in der Probe zu
und folglich ist solch ein Verfahren in der Lage, genaue und zuverlässige Werte
für holo-TC II im unteren
Normalbereich für
holo-TC II und auch im Bereich unterhalb des Normalbereichs zu liefern.
Solch eine Abtrennung und Konzentration der Zielmoleküle ist mit
derzeit existierenden Methoden nicht möglich, die nicht imstande sind,
TC II oder holo-TC II von HC oder holo-HC effizient zu trennen.
Die Fähigkeit,
TC II oder holo-TC II mindestens 3fach zu konzentrieren, erlaubt
den Einsatz automatisierter Analysengeräte in Untersuchungen mit hohem
Durchsatz. Ohne solch einen konzentrierenden Schritt ist die Menge des
in einer Probe vorhandenen Analyten wahrscheinlich kleiner als die
untere Nachweisgrenze. Solche automatisierten Analysengeräte erfordern
für ihren
Betrieb gewöhnlich
ein Probenvolumen zwischen 40 und 100 μl in einem Gesamtvolumen von gewöhnlich 150 μl oder mehr.
So wird ein Analyt mit niedriger Konzentration für die Analyse sogar noch weiter
verdünnt.
Durch das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren
wird der Analyt jedoch mindestens 3fach konzentriert. Da die Verwendung
solcher automatisierter Analysengeräte gewöhnlich einen Regelbereich von
100–700
pM mit einer unteren Nachweisgrenze von ungefähr 40 pM, aber einer praktischen
Untergrenze von etwa 90 pM, ermöglicht eine
5fache Konzentrierung bzw. Konzentration die Messung von holo-TC
II bis hinab zu 18 pM, und 10fache Konzentrierung ermöglicht die
Messung bis hinab zu 9 pM holo-TC II. Da die vorliegende Erfindung
mehr als 10fache Konzentrierung ermöglicht, wird der Fachmann leicht
erkennen, in welchem Ausmaß die
Empfindlichkeit verbessert wird, was das erfindungsgemäße Verfahren
in der Tat zu einer sehr leistungsfähigen Technik macht.
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Die
Möglichkeit,
den Analyten zu konzentrieren, damit er einer Analyse durch solche
automatisierten Verfahren zugänglich
ist, ist ein wichtiger Vorteil des vorliegenden Untersuchungsverfahrens.
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Vorzugsweise
wird aus einer Ausgangsprobe von 600 μl Körperflüssigkeit ein Volumen von bis zu
150 μl,
vorzugsweise bis zu 100 μl
und am besten kleiner als 60 μl
erzeugt, das dann analysiert werden kann, gegebenenfalls unter Verwendung
von automatisierten Verfahren.
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Jeder
spezifisch an TC II bindende Ligand kann im erfindungsgemäßen Verfahren
entweder als Ligand zum Einfangen, Konzentrieren und Abtrennen oder
als Ligand zum Nachweis benutzt werden, und kann, abhängig von
der spezifischen Ausführungsform
der Erfindung, an TC II sowohl in der apowie auch in der holo-Form
binden oder er kann spezifisch oder vorzugsweise an die holo-Form
binden. Der an TC II bindende Ligand wird vorzugsweise einen hohen
Grad von Selektivität
und Spezifität
für TC
II zeigen und niedrige, vorzugsweise im Wesentlichen keine Affinität zu anderen
TC Proteinen, z. B. TC I oder III, entweder in der apo- oder in
der holo-Form, oder irgendeinem anderen an Kobalamin bindendem Protein.
Wenn der an TC II bindende Ligand ein spezifisch an holo-TC II bindender
Ligand ist, zeigt er die gleichen Eigenschaften, mit der zusätzlichen
Anforderung, dass er niedrige oder vorzugsweise keine Affinität zu apo-TC II zeigt.
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Der
an TC II oder holo-TC II bindende Ligand wird im Allgemeinen entweder
ein Antikörper,
ein Antikörperfragment
oder eine Verbindung mit einer Affinität zu TC II beziehungsweise
holo-TC II, wie beispielsweise ein Rezeptor an einer Zelloberfläche, ein Polypeptid,
ein Oligopeptid, eine kleines organisches Molekül etc. sein. Andere bindende
Liganden können ein
spezifischer Binder sein, der aus einer durch kombinatorische Chemie
erzeugten Bibliothek oder einer Phagendisplay-Bibliothek ausgewählt ist,
oder eine spezifisch bindende Sequenz aus DNS oder RNS.
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Wenn
der bindende Ligand ein Antikörper
ist, kann er polyklonal sein, ist aber vorzugsweise monoklonal.
Monoklo nale Antikörper
können
mit viel größerer Spezifität und Gleichförmigkeit
erzeugt werden als polyklonale Antikörper und dies verringert Kreuzreaktivität mit anderen
Bestandteilen der Körperflüssigkeit,
insbesondere anderen Transkobalaminen und, wo dies von Bedeutung
ist, der alternativen Konformation, d. h. der apo-Form des Zielanalyten.
Die Gleichförmigkeit
und Reproduzierbarkeit, die monoklonale Antikörper im Vergleich zu polyklonalen
Antikörpern
bieten, stellt eine größere Genauigkeit
sicher, die entscheidend ist für
ein Assay, in dem der Analyt in solch niedriger Konzentration enthalten
ist. Alternativ kann der Ligand ein Antikörperfragment sein, zum Beispiel
ein F(ab)-, F(ab')2- oder
F(v)-Fragment. Die Antikörper
oder die Antikörperfragmente können einwertig
oder zweiwertig sein und können durch
Hybridomtechnologie produziert werden oder synthetischen Ursprungs
sein, und durch rekombinante DNS verwendende Technologie oder chemische
Synthese erzeugt werden. Beispielsweise könnten Einkettenantikörper oder
andere Antikörperderivate
oder -mimetika verwendet werden. Der Antikörper kann, je nachdem, wie
es jeweils zweckmäßig ist,
gegen jedes mögliche
Epitop, jeden Bestandteil oder jede Struktur des TC II oder holo-TC
II Proteins gerichtet sein oder gezüchtet werden.
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Für die Verwendung
in der vorliegenden Erfindung als bindende Liganden geeignete Antikörper sind
zum Beispiel offenbart von Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 222: 149–154; McLean
et al. (1997) Blood 89: 235–242.
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Rezeptormoleküle, die
in der Lage sind, die apo- und die holo-Form von TC II zu binden,
oder bevorzugt oder spezifisch die holo-Form von TC II, können ebenfalls
verwendet werden. Geeignete Rezeptoren sind an Zelloberflächen oder
an Membranen gebundene TC II- oder holo-TC II-Rezeptoren und Spezies-übergreifende
Reaktivitätseigenschaften bedeutet,
dass Rezeptormoleküle
von irgendeiner Säugetierspezies
benutzt werden können,
obgleich derartige Rezeptoren vor zugsweise menschlichen Ursprungs
sind oder vom Rind stammen. Obgleich die Rezeptormoleküle vorzugsweise
in einer verhältnismäßig gereinigten
Form isoliert werden, wird der Gebrauch von Zellmembranen oder gemischten Membranfraktionen,
welche die Rezeptoren vorzugsweise in konzentrierter Form enthalten,
ebenfalls erwogen. Solche Rezeptoren oder Membranen oder Membranfraktionen,
die Rezeptoren enthalten, können
vorteilhaft aus Nieren-, Plazenta- oder Tumorzellen isoliert werden.
Depotzellen sollten im Allgemeinen nicht als Quelle solcher Rezeptoren
benutzt werden. Depotzellen können
jedoch als eine Quelle für Haptocorrin-Rezeptoren
benutzt werden.
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Eine
mit TC-II-Rezeptor angereicherte Membranfraktion kann erhalten werden
wie beschrieben von Seligman et al., J. Biol. Chem 253: 1766–1772 (1978)
und Nexø et
al., Biochem. Biophys. Act. 628: 190–200 (1980). Im Wesentlichen
wird Gewebe, z. B. menschliche Plazenta oder Kaninchenleber, in
kleine Stücke
geschnitten und homogenisiert in Tris-Puffer, pH 7,4, der 0,15 M
NaCl und 10 mM EDTA enthält, gefolgt
von 30 Minuten dauernder Zentrifugation bei 25.000 × g. Um
Restblut zu entfernen, wird die Homogenisation/Zentrifugation mindestens
einmal wiederholt. Diese Membranfraktion wird weiter extrahiert mit
Detergens, z. B. Ammonyx-LO, Triton X-100 oder Chapso und durch
30 Minuten dauernde Zentrifugation bei 100000 × g bei 4°C geklärt. Der Überstand wird als Quelle für TC-II-Rezeptor
verwendet.
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Ein
Beispiel eines geeigneten Rezeptormoleküls, das vorzugsweise den holo-TC
II-Komplex bindet, ist das einkettige 62 kDa Glycoprotein, das als nicht
kovalent gebundenes Homodimer existiert und auf der Zelloberfläche aller
Gewebe gefunden wird (Rothenberg u. Quadros (1996) Balliere's Clinical Haematology
8 (3) 499–514;
WO 96/085150 ). Ein weiteres
Protein, das für
den Einsatz im erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren
verwendbar ist, ist gp300, ein 600 kDa Endozytose vermittelndes
Membranprotein, das in absorptiven Epithelzellen exprimiert wird,
zum Beispiel Zellen des pro ximalen Nierentubulus, wie offenbart
und beschrieben von Moestrup et al., (1996) Proceedings National
Academy Science 93: 8612–8617).
Dieser Rezeptor ist ein LDL Rezeptor und bindet sowohl die apo-
wie auch die holo-Form von TC II.
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Wenn
ein Rezeptor auf einer Zelloberfläche verwendet wird, kann er
durch Bindung an eine Oberfläche
immobilisiert werden, z. B. eines Kügelchens oder einer Schicht
oder alternativ kann eine Zellmembranfraktion, die die Rezeptoren
enthält,
zu Vesikeln oder Schichten geformt werden, die an ihrer Oberfläche die
Rezeptoren aufweisen.
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Wenn
der Ligand immobilisiert wird, kann dies zum Beispiel auf der Oberfläche eines
Körpers, z.
B. einem Filterfilm oder einem Blatt oder dem Lumen eines Schlauches
sein, jedoch ist insbesondere die Immobilisierung auf Partikeln,
z. B. Mikrokügelchen
wie denen, die von Dyno Industrier ASA, Norwegen produziert werden,
bevorzugt. Solche Partikel können
porös oder
porenfrei sein und wenn es gewünscht
ist, können
sie mit Mitteln versehen werden, die es ermöglichen, sie zu sammeln, z.
B. durch Einbau von auf Magnetfelder ansprechendem Material, zum
Beispiel superparamagnetischen Eisenoxidkristallen, in die Partikel.
Solche auf Magnetfelder ansprechende Mikrokügelchen sind erhältlich von
Dyno Industrier ASA sowie von Dynal AS, Norwegen, Bang Particles,
USA und Prolabo, Frankreich. Wenn der Ligand nicht immobilisiert
sondern immobilisierbar sein soll, kann dies erreicht werden, indem
man den Liganden an einen Partner eines spezifischen bindenden Paares
bindet (z. B. Biotin/Streptavidin) und den anderen Partner des bindenden
Paares, der gegebenenfalls an ein Substrat gebunden ist, zur Agglomerierung
oder anderweitigen Immobilisierung des Liganden oder des Komplexes
des Liganden mit TC II oder des Komplexes des Liganden mit holo-TC
II benutzt, bevor bei der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
die Abtrennung der an den Liganden gebundenen Fraktion von der nicht
gebundenen Fraktion erfolgt.
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Es
ist dem Fachmann wohlbekannt, Affinitätsmoleküle, z. B. Antikörper und
Antikörperfragmente
zu Trennzwecken zu immobilisieren, zum Beispiel indem man die Liganden,
gegebenenfalls unter Verwendung eines Linkers, an irgendeinen der
wohlbekannten festen Träger
oder Matrices bindet oder koppelt, die derzeit weithin benutzt werden
oder für die
Trennung oder die Immobilisierung auf Säulen vorgeschlagen wurden,
und jede dem Fachmann bekannte Methode könnte benutzt werden. Solche Festphasen
können
die Gestalt von Partikeln, Schichten, Gelen, Filtern, Membranen,
Fasern oder von Kapillaren oder Mikrotiterstreifen, Schläuchen oder
Mikrotiterplatten etc. haben und können zweckmäßigerweise aus Glas, Siliziumdioxid,
Latex oder einem polymeren Material bestehen. Techniken, mit denen
der Ligand an den festen Träger
gebunden werden kann, sind ebenfalls besonders gut bekannt und in
der Literatur breit beschrieben.
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Die
Koppelung des Liganden an ein Substrat oder an einen Partner eines
spezifisch bindenden Paares kann mit herkömmlichen Techniken erreicht werden.
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Wenn
die Untersuchung als kompetitiver Bindungstest durchgeführt wird,
wird im erfindungsgemäßen Verfahren
im Allgemeinen eine markierte Verbindung zur Probe hinzugegeben,
die darum konkurriert, an den Liganden zu binden. Im Allgemeinen wird
es bevorzugt sein, markiertes holo-TC II für diesen Zweck zu verwenden.
Der benutzte Marker kann jeder Marker sein, der direkt oder indirekt
bestimmt werden kann, z. B. ein Chromophor (wobei diese Bezeichnung
so verwendet wird, dass sie auch Fluorophore einschließt), ein
radioaktiver Marker (im Allgemeinen kovalent oder als Chelat gebunden),
ein Enzym oder Enzymsubstrat, ein magnetischer Marker, etc.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
das in Kontakt bringen eines immobi lisierten oder immobilisierbaren,
an TC II oder holo-TC II bindenden Liganden mit der zu untersuchenden
Probe;
das Abtrennen einer gebundenen Liganden enthaltenen
Fraktion von einer nicht gebundenen Liganden enthaltenden Fraktion;
das
Abspalten des gebundenen Kobalamins aus den holo-TC II Molekülen in der
Fraktion mit gebundenen Liganden und die Bestimmung der Konzentration
des freigesetzten Kobalamins, wobei die Abspaltung so beeinflusst
wird, dass die Konzentration des freigesetzten Kobalamins mindestens
3mal, bevorzugt 5mal und besonders bevorzugt 10mal größer ist
als die Konzentration von holo-TC II in der Ausgangsprobe, und gegebenenfalls
außerdem
die Bestimmung des Folatgehalts der besagten Probe.
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Das
Wesentliche dieses Aspekts der Erfindung ist die Abtrennung und
Konzentrierung von TC II oder von holo-TC II, die es erlaubt, Standardmethoden
der Bestimmung von Kobalamin erfolgreich in dem Verfahren einzusetzen.
Wie oben ausgeführt, sind
ohne einen solchen Konzentrierungsschritt Methoden des Standes der
Technik nicht zur Bestimmung von Kobalamin einsetzbar, da dieses
in solch niedriger Konzentration vorliegt. Es können alle geeigneten Mittel
für die
Freisetzung des Kobalamins aus holo-TC II eingesetzt werden, aber
es ist am bequemsten, hierfür
Hitze einzusetzen oder den pH-Wert des umgebenden Mediums zu verändern. Die
unterschiedlichen Formen von Kobalamin können durch Behandlung mit KCN
in das weniger lichtempfindliche Cyanokobalamin umgewandelt werden. Alle
zur Bestimmung von freiem Kobalamin geeigneten Mittel können in
dem erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden, zum Beispiel ein kompetitiver Test, der durchgeführt wird,
indem man einen immobilisierten Bindungspartner für Kobalamin
mit dem freigesetzten Kobalamin in der Probe in Kontakt bringt,
in Anwesenheit eines markierten Liganden, der mit dem ungebundenen
Kobalamin darum konkurriert, an die immobilisierten Bindungspartner
zu binden. Zum Beispiel wäre
eine Methode geeignet, wie sie von Kuemmerk et al. (1992) Clin.
Chem 38: 2073–2077
be schrieben wurde. Ein anderer Weg zur Bestimmung des freien Kobalamins
wird in
US Patent Nr. 5 451 508 beschrieben
und umfasst die Anwendung einer Immunoassay-Technik.
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In
dieser Ausführungsform
der Erfindung ist es bevorzugt, dass die an TC II bindenden Liganden immobilisiert
werden und sowohl an hold- wie auch an apo-TC II binden.
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In
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Untersuchungsverfahren
der vorliegenden Erfindung das in Kontakt bringen eines festen Trägers, auf
dem ein an TC II oder holo-TC II bindender Ligand immobilisiert
ist, mit der zu untersuchenden Probe und auch mit einem nicht immobilisierten
Liganden, worin besagter immobilisierter Ligand fähig ist
zur Bindung an TC II oder holo-TC II, an besagten nicht immobilisierten
Liganden oder an Komplexe aus besagtem TC II oder holo-TC II und dem
besagten nicht immobilisierten Liganden, und besagter nicht immobilisierter
Ligand fähig
ist zur Bindung an mindestes einen Vertreter der Gruppe aus besagtem
immobilisiertem Ligand, TC II oder holo-TC II und Komplexen des
besagten immobilisierten Liganden mit TC II oder holo-TC II; worin,
wenn besagtes Untersuchungsverfahren ein Sandwich-Test ist, mindestens
einer der besagten Liganden für
holo-TC II spezifisch ist, und wenn besagte Untersuchungsmethode
ein kompetitiver Test ist, besagter immobilisierter Ligand für holo-TC
II und Konkurrenten davon spezifisch ist; wobei der an TC II oder
holo-TC II, an besagten nicht immobilisierten Liganden oder an Komplexe
des besagten nicht immobilisierten Liganden mit TC II oder holo-TC
II gebundene Anteil von besagtem immobilisiertem Liganden von der
Menge des in besagter Probe enthaltenen holo-TC II abhängig ist,
und besagter nicht immobilisierter Ligand fähig ist, ein direkt oder indirekt
nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn er gebunden oder nicht gebunden
ist; Abtrennung einer gebundenen Fraktion von einer nicht gebundenen
Fraktion; und direkte oder indirekte Bestimmung des an den immobilisierten
Liganden gebundenen nicht immobilisierten Liganden (der gebundenen
Frak tion) oder des nicht gebundenen und in gelöster Form vorliegenden nicht
immobilisierten Liganden (der nicht gebundenen Fraktion); wobei
das in Kontakt bringen der Probe und des besagten nicht immobilisierten
Liganden mit dem festen Träger
separat, gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden kann, und wenn es
separat oder nacheinander durchgeführt wird, sie in beliebiger
Reihenfolge in Kontakt gebracht werden können.
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Folglich
umfasst die alternative bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
im Wesentlichen die Bestimmung des nicht immobilisierten Liganden,
der entweder direkt oder indirekt an den immobilisierten Liganden
gebunden hat oder im anderen Falle nicht direkt oder indirekt an den
immobilisierten Liganden gebunden hat. Wenn der nicht immobilisierte
Ligand mit dem holo-TC II darum konkurriert, an den immobilisierten
Liganden zu binden, zeigt eine hohe Konzentration des nicht gebundenen
nicht immobilisierten Liganden eine hohe Konzentration von holo-TC
II in der Probe an und eine niedrige Konzentration des nicht gebundenen nicht
immobilisierten Liganden zeigt eine niedrige Konzentration von holo-TC
II in der Probe an. Wenn der nicht immobilisierte Ligand an das
TC II oder holo-TC II bindet, das wiederum an den immobilisierten Liganden
gebunden wird, dann zeigt eine hohe Konzentration des gebundenen
nicht immobilisierten Liganden eine hohe Konzentration von holo-TC
II in der Probe an und eine niedrige Konzentration des gebundenen
nicht immobilisierten Liganden zeigt eine niedrige Konzentration
von holo-TC II in der Probe an.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird folglich das metabolisch
aktive Reservoir an Kobalamin bestimmt, indem man den holo-TC II
Komplex misst oder die Menge des an TC II-Moleküle gebundenen Kobalamins misst,
die in einer Körperprobe
vorhanden ist, die eine Mischung von sowohl apo- und holo-TC II
wie auch apo- und holo-HC (Haptocorrin oder TC I und III) enthält. Die
Bestimmung des Folatgehalts der Probe kann gleichzeitig oder davor oder
danach durchgeführt
werden.
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Ein
vorbereitender Trennungsschritt kann mit immobilisiertem Kobalamin
oder einem Analogon davon oder einem Fragment davon durchgeführt werden,
die selektiv an die apo-Formen von TC II und Haptocorrin (HC) bindet.
In solch einem vorbereitendem Schritt werden die apo-Formen der
TC II- und HC-Proteine durch das immobilisierte Kobalamin, Analogon
oder Fragment davon gebunden und von den holo-TC II und holo-HC
Komplexen abgetrennt.
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In
diesem Fall findet dann eine Analyse der abgetrennten holo-Formen
von TC II statt, die gemäß irgendeiner
Ausführungsform
der Erfindung, wie sie oben beschrieben sind, erfolgen kann; es
ist jedoch offensichtlich, dass es am nützlichsten ist, wenn die Bestimmung
des holo-TC II Komplexes durch eine andere Methode als die Dissoziation
des Komplexes und anschließende
Bestimmung des freigesetzten Kobalamins erfolgt. Es ist für den Fachmann
offensichtlich, dass, wenn solch ein vorbereitender Schritt der
obenerwähnten
alternativen Ausführungsform vorangeht,
die Anforderung, dass mindestens ein Ligand in einem Sandwich-Test
für holo-TC
II spezifisch sein muss und nicht an TC II binden darf, und die
Anforderung, dass der immobilisierte Ligand in einem kompetitiven
Test für
holo-TC II und Konkurrenten davon spezifisch sein muss und nicht
an TC II binden darf, nicht mehr relevant sind, da die apo-Form
von TC II eingefangen worden ist und nicht mehr vorhanden ist. Daher
können
die immobilisierten oder nicht immobilisierten Liganden für holo-TC
II oder TC II oder Konkurrenten davon spezifisch sein.
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Das
immobilisierte Kobalamin sollte keine merkliche Tendenz zur Ablösung von
seinem Träger zeigen,
da dies zu einer Bindung an apo-TC II und dessen Umwandlung zu holo-TC
II führen
könnte.
Biotinyliertes Kobalamin bindet in sehr beständiger Weise an eine feste
Oberfläche,
an die Avadin/ Streptavidin gebunden ist, und für die Durchführung dieses Schrittes
ist es günstig,
Kobalamin in dieser Weise an einen Träger zu fixieren. Tatsächlich kann
bei Verwendung von biotinyliertem Kobalamin dieses der zu analysierenden
Probe in einer nicht immobilisierten Form hinzugefügt werden
und bindet dort an die apo-Formen von TC II und HC. Die Probe kann
mit einer festen Oberfläche
in Kontakt gebracht werden, auf der ein Bindungspartner für das Biotin,
zum Beispiel Avidin, immobilisiert worden ist. Es wird dann ein
Komplex aus Avidin, biotinyliertem Kobalamin und TC II gebildet,
der in einfacher Weise aus der Probe isoliert werden kann.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung, in der dieser vorbereitende Trennungsschritt stattgefunden
hat, wird anschließend
das Reservoir an holo-TC II bestimmt, indem man die Probe mit einem
immobilisierten Liganden für
TC II in Kontakt bringt, das den holo-TC II Komplex einfängt und
das Haptocorrin in Lösung
lässt,
und dann das immobilisierte holo-TC II mit einem zweiten Liganden
für TC
II, der markiert und daher nachweisbar ist, in Kontakt bringt. Beispiele
geeigneter Liganden, die an TC II binden, wären nicht überlappende monoklonale Antikörper, oder
es wäre
in der Tat ein für
TC II spezifischer polyklonaler Antikörper in dieser Ausführungsform
sowohl für
das Einfangen wie auch den Nachweis geeignet, da verschiedene Epitope
auf den TC II Molekülen
erkannt werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, in der dieser vorbereitende Trennungsschritt stattgefunden
hat, konkurrieren die holo-TC II-Moleküle mit dem markierten nicht
immobilisierten Liganden darum, an den immobilisierten Liganden
dafür zu binden,
und die Menge von holo-TC II wird im Verhältnis zu der Menge des markierten
nicht immobilisierten Liganden berechnet, der an den immobilisierten
Liganden gebunden ist oder nicht gebunden ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
findet im vorbereitenden Trennungsschritt, die Bindung von apo-TC
II und apo-HC an Kobalamin, Analoga oder Fragmenten davon an einer
Stelle oder in solch einer Weise statt, dass die folgende Erkennung
und Bindung des immobilisierten an Kobalamin gebundenen TC II durch
den nicht immobilisierten Liganden oder Bindungspartner für TC II
verhindert wird. In dieser Ausführungsform
gibt es keine Notwendigkeit, das holo-TC II und holo-HC aus den
gebundenen apo-Formen zu isolieren, bevor man das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren
durchführt.
In dieser Ausführungsform
ist die Stelle, gegen die der nicht immobilisierte Bindungspartner
oder Ligand gerichtet ist, sehr wichtig und sollte ein Epitop auf
TC II sein, das maskiert oder abgeschirmt wird oder in anderer Weise
für eine
Bindung nicht mehr zur Verfügung
steht, wenn apo-TC II und apo-HC auf dem Kobalamin, Analogon oder
Fragment davon immobilisiert werden.
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Ob
der anfängliche
Trennungsschritt die Verwendung eines an TC II bindenden Liganden
mit einbezieht, oder ob ihm ein vorbereitender Schritt vorangeht,
der immobilisiertes Kobalamin, Analoga oder Fragmente davon verwendet,
eine vollständige
Abtrennung, d. h. Abtrennung aller apo- und holo-TC II Proteine aus der Probe, ist kein
Erfordernis des Verfahrens und es reicht aus, dass eine Fraktion
aus der Probe abgetrennt wird, die mindestens einen Teil der gewünschten „TC II
Proteinteilmenge" enthält.
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So
können
in bestimmten Ausführungsformen
die Bindungspartner oder die Liganden und die Bindungsbedingungen
so gewählt
werden, dass eine im Wesentlichen vollständige Abtrennung der ausgewählten „Teilmenge" erreicht wird. In
diesem Fall kann die nicht gebundene Fraktion kann als im Wesentlichen
frei von TC II- oder holo-TC II Proteinen angesehen werden, d. h.
zu mindestens 80%, 90% oder 95% frei entweder von TC II oder von
holo-TC II, abhängig
davon, welcher Bestandteil als Grundlage der Fraktionierung ausgewählt wird.
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In
alternativen Ausführungsformen
können der
Bindungspartner und die Bedingungen so ausgewählt werden, dass nur ein Teil
der TC II Proteine in der Probe in eine Fraktion abgetrennt wird.
In diesem Fall sollte man die teilweise Trennung bei der Konstruktion
einer Standardkalibrierungskurve für die Probe berücksichtigen.
In dieser Hinsicht verwendet die Erzeugung einer Standardkalibrierungskurve,
gegen die die gemessene Konzentration des holo-TC II bestimmt werden
kann, Standardtechniken, die in der Fachwelt weithin bekannt sind.
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Wenn
daher in einem Fraktionierungschritt ein an TC II bindender Ligand
benutzt wird, wird mindestens ein Teil des an TC II gebundenen Kobalamins
in der gebundenen Fraktion enthalten sein und jegliches Kobalamin
in der Probe, das an andere Moleküle als TC II gebunden ist,
zum Beispiel HC oder Albumin, in der nicht gebundenen (d. h. der
nicht abgetrennten Fraktion oder den nicht abgetrennten Fraktionen).
TC II in der gebundenen Fraktion kann sowohl in der apo- wie auch
der holo-Form vorliegen und kann außer an Kobolamin auch an Kobalamin-ähnliche
Substanzen oder Analoga gebunden sein.
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Wenn
es gewünscht
wird, kann das erfindungsgemäße Verfahren
einen weiteren vorbereitenden Trennungsschritt umfassen, in dem
die Probe mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren spezifisch
an Haptocorrin bindenden Liganden (in der apo- und holo-Form oder
allein in der holo-Form) in Kontakt gebracht wird. Auf diese Art
kann jeder möglicher Fehlerbeitrag
bei der Bestimmung des an TC II gebundenen Kobalamins, der auf holo-HC
zurückgeht, verringert
werden und es können
spezifisch an TC II oder holo-TC II bindende Liganden eingesetzt
werden, die eine gewisse Bindungsaffinität für Haptocorrine haben.
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Andernfalls
sind, wie oben ausgeführt,
Liganden oder Bindungspartner mit besonders hoher Spezifität und Affinität für die Ausführung der
Erfindung erforderlich, da die Konzentration von TC II sowohl in
der apo- wie in der holo-Form
im Serum sehr niedrig ist. Auch hängen die Affinitätskonstanten,
die die Liganden der vorliegenden Erfindung aufweisen müssen, davon
ab, ob der Ligand für
TC II oder holo-TC II spezifisch ist, und auch von seiner Anwendung
entweder als einfangender oder nachweisender Ligand, da die Konzentration
von TC II im Serum ungefähr
0,5–1
nM ist, aber die Konzentration von holo-TC II nur 35–160 pM
beträgt.
Daher ist für
einen TC II einfangenden Liganden eine Affinitätskonstante von mindestens
109M–1, bevorzugt größer als
2 × 109M–1 und besonders bevorzugt
1010M–1 wünschenswert. Für einen
holo-TC II einfangenden Liganden ist eine Affinitätskonstante
von mindestens 1010M–1 wünschenswert,
bevorzugt 2 × 1010M–1, besonders bevorzugt
größer als
2 × 1010M–1 und ganz besonders
bevorzugt größer als
1011M–1. Es ist offensichtlich,
dass die für
einen nachweisenden Liganden erforderliche Affinitätskonstante
wegen des Konzentrationseffekts des Tests kleiner sein kann als
die eines einfangenden Liganden.
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Das
Ausmaß der
Kreuzreaktivität
eines an holo-TC II oder TC II bindenden Liganden mit HC sollte
kleiner sein als 1%, bevorzugt zwischen 0,1% und 1%, und besonders
bevorzugt kleiner als 0,1%. Genauso sollte ein an holo-TC II bindender
Ligand bevorzugt ein Ausmaß an
Kreuzreaktivität
mit apo-TC II aufweisen, das nicht größer ist als 1%, besonders bevorzugt
zwischen 0,1% und 1%, und ganz besonders bevorzugt kleiner als 0,1%.
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Durch
die Verwendung solcher Liganden mit hoher Affinität wird deren
Funktion über
die einfacher einfangender oder nachweisender Liganden hinaus erweitert
und sie spielen eine entscheidende Rolle dabei, TC II Protein für die Analyse
aus der Probe abzutrennen und zu konzentrieren. Die bindenden Liganden
für TC
II oder holo-TC II sollten den Liganden mindestens 3fach, bevorzugt
5fach und besonders bevorzugt mindestens 10fach konzentrieren.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Untersuchungsverfahrens die mehr einem Verdrängungstest als einem kompetitiven
Test entspricht, wird die Probe, die den holo-TC II Komplex enthält, mit
einer festen Phase in Kontakt gebracht, an die ein markierter Ligand
gebunden ist, der die gleichen Bindungsstellen auf den immobilisierten
Liganden erkennt wie holo-TC II. Das holo-TC II in der Probe konkurriert
mit dem gebundenen markierten Ligand um die Bindungsstellen, so
dass, nachdem sich im System ein Gleichgewicht eingestellt hat,
ein direkt proportionaler Zusammenhang besteht zwischen der Menge
des markierten Liganden, der aus dem festen Träger verdrängt wurde und in der Lösung nachgewiesen
werden kann und der in der ursprünglichen Probe
enthaltenen Menge holo-TC II. Der markierte Ligand kann direkt oder
indirekt nachgewiesen werden und kann bestimmt werden als die an
den festen Träger
gebundene Menge des markierten Liganden oder als die nicht an den
festen Träger
gebundene Menge, wie jeweils erforderlich. Tatsächlich wird in dieser Ausführungsform
der vorerwähnte
nicht immobilisierte Ligand an den immobilisierten Liganden gebunden,
bevor die Probe aufgegeben wird, aber diese Bindung sollte nicht
so verstanden werden, dass dies bedeutet, dass der Ligand in irgendeiner
Weise immobilisiert ist.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst
das in Kontakt bringen einer holo-TC II enthaltenden Probe mit einem
festen Träger,
auf dem holo-TC II immobilisiert ist, und einem nicht immobilisierten
markierten Binder, der für
holo-TC II spezifisch ist. Das freie holo-TC II in der Probe und
das immobilisierte holo-TC II konkurrieren darum, an den nicht immobilisierten
markierten Liganden zu binden, und die Bestimmung des an die feste
Phase gebundenen oder des in der Lösung verbliebenen markierten
Liganden erlaubt die Berechnung der Konzentration von holo-TC II.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist der nicht immobilisierte, markierte, an holo-TC II
bindende Ligand ein Antikörper.
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In
wieder einer anderen Ausführungsform wird
die Probe, die den interessierenden Analyten enthält, mit
markiertem holo-TC
II und immobilisiertem Liganden in Kontakt gebracht. Markiertes
und unmarkiertes holo-TC II konkurrieren darum, an den immobilisierten
Liganden zu binden, und nachdem sich ein Gleichgewicht eingestellt
hat, ist die Menge des markierten holo-TC II, das an den immobilisierten Liganden
gebunden ist, indirekt proportional zur Menge von holo-TC II in
der interessierenden Probe. Wieder kann das markierte holo-TC II
direkt oder indirekt ermittelt werden und kann bestimmt werden als die
Menge des an den festen Träger
gebundenen markierten holo-TC II oder die Menge des nicht an den
festen Träger
gebundenen markierten holo TC II, wie jeweils erforderlich.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein nicht immobilisierter aber immobilisierbarer
Ligand, der für
den holo-TC II Komplex spezifisch ist (z. B. ein Ligand, der an
Biotin oder einen anderen Partner eines spezifisch bindenden Paares
gebunden ist), mit der Probe in Kontakt gebracht, um einen Komplex
aus holo-TC II und nicht immobilisiertem Liganden zu bilden. Der
Komplex aus Ligand und holo-TC II kann dann mit bekannten Mitteln
aus der Lösung
ausgefällt
und für
die Analyse isoliert werden.
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In
wieder einer anderen Ausführungsform der
Erfindung werden zwei markierte Bindungspartner der Probe zugesetzt,
gegebenenfalls nach einem vorbereitenden Schritt wie beispielsweise
dem Entfernen der apo-Formen von TC II und HC aus der Probe. Die
Bindungspartner sind in diesem Fall markiertes holo-TC II oder ein
Analogon oder ein Fragment davon und ein markierter Bindungspartner
dafür,
zum Beispiel ein markierter Antikörper. In dieser Ausführungsform
wird von den Markern nur dann ein nachweisbares Signal erzeugt,
wenn sie in unmittelbarer Nähe
zueinander sind, d. h. wenn die beiden markierten Bindungspartner
aneinander binden. So kann nach Zugabe zu der Probe der markierte
Bindungspartner für
holo-TC II entweder an unmarkiertes holo-TC II binden, das in der
Probe anwesend ist, wobei in diesem Fall kein nachweisbares Signal
erzeugt wird, oder an markiertes holo-TC II oder ein Analogon, ein Fragment
oder eine Variante davon, die den markierten Bindungspartner für TC II
bindet, wobei in diesem Fall ein nachweisbares Signal erzeugt wird.
Markierungsmittel wie die Amersham Szintillations-Annäherungstests
(Amersham scintillation proximity assays), die in
US Patent Nr. 4 568 649 beschrieben
sind, sind geeignet für
die Verwendung in einer solchen Ausführungsform und die hohe Empfindlichkeit
dieses Verfahrens ist gut geeignet für eine Untersuchungsmethode,
bei der der Analyt in solch einer niedrigen Konzentration vorliegt.
So könnte zum
Beispiel ein Partner des bindenden Paares mit einem β-Teilchen
emittierenden Nuklid wie beispielsweise
125I
oder
3H markiert werden und der andere Partner
wird mit einem geeigneten szintillierenden Molekül markiert. Das ausgestrahlte β-Teilchen
verliert seine Energie in seiner wässrigen Umgebung, außer wenn
das szintillierende Molekül
weniger als 1,5 μm
entfernt ist, und es ist daher erforderlich, dass beide markierten
Partner aneinander gebunden sind, damit ein Signal nachweisbar ist.
Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei markierte Partner aneinander binden,
wird in der Weise durch die Konzentration von holo-TC II in der
Probe bestimmt, dass die Konzentration von holo-TC II in der Probe
umso geringer ist, je größer das
erzeugte Signal ist.
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In
allen Ausführungsformen
der Erfindung kann der Folatgehalt der Probe gleichzeitig mit der Bestimmung
des Gehalts an holo-TC II gemessen werden oder davor oder danach.
Die bevorzugte Methode der Untersuchung auf Folat ist die hierin
zuvor beschriebene.
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So
wie sie hierin verwendet werden, schließen die Begriffe „bestimmen" und „ermitteln" sowohl quantitative
Bestimmung im Sinne der Ermittlung eines Absolutwerts für die Menge
oder die Konzentration von an holo-TC II oder TC II gebun denem Kobalamin
oder Folat in der Probe ein, als auch semiquantitative und qualitative
Ermittlungen oder Bestimmungen. Es können ein Index, ein Verhältnis, ein
Prozentsatz oder eine ähnliche
Anzeige der Konzentration oder der Menge des an TC II gebundenen
Kobalamins, zum Beispiel im Verhältnis
zum Gesamtgehalt an Kobalamin, erhalten werden.
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Die
Körperprobe,
die im Untersuchungsverfahren der Erfindung benutzt wird, kann jede
Kobalamin und/oder Folat enthaltene Probe sein, z. B. eine Körperflüssigkeit
oder eine Gewebeprobe oder eine Suspension etc. Bevorzugt wird die
Probe eine Körperflüssigkeit
sein, zum Beispiel Samenflüssigkeit, zerebrospinale
Flüssigkeit
oder Fruchtwasser, aber im Allgemeinen wird es eine aus Blut gewonnene Probe
sein. Wenn dies der Fall ist, können
entweder Serum oder Plasma verwendet werden, da die Probe, die für die Analyse
benutzt wird, bevorzugt keine Zellen enthält. Die Probe kann bevor sie
im erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren
verwendet wird, behandelt werden, zum Beispiel kann sie durch Zugabe
eines Puffers oder eines anderen wässrigen Mediums verdünnt werden,
und sie kann aufbewahrt oder konserviert werden, zum Beispiel durch
Abkühlung
oder Einfrieren vor der Analyse.
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Wenn
bei der Ausführung
der Erfindung eine gebundene Fraktion von einer nicht gebundenen Fraktion
abgetrennt wird, so kann dies mit allen geeigneten Mitteln durchgeführt werden,
zum Beispiel Fällung,
Zentrifugation, Filtration, Verwendung magnetisierbarer Partikel,
chromatographische Methoden etc.
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Zur
Klarstellung sei gesagt, dass der Begriff „Kobalamin" hierin synonym mit „Vitamin B12" verwendet wird und
alle Formen des Vitamins B12 umfasst (Cyanokobalamin;
5-6-Dimethylbenzimidazolylcyanokobalamid; Methylkobalamin; 5'-Desoxyadenosylkobalamin) die im Körper auftreten
und metabolisch aktiv sein können
(wenn sie in geeigneter Weise präsentiert
werden).
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Wie
oben ausgeführt
kann im erfindungsgemäßen Verfahren
die Bestimmung des an TC gebundenen Kobalamins durchgeführt werden,
indem ein Ligand, der an das abgetrennte holo-TC II gebunden ist,
nachgewiesen wird, oder indem ein kompetitiver Test mit einem markierten
Konkurrenten zu holo-TC II durchgeführt wird, wobei das holo-TC
II mit dem markierten Konkurrenten darum konkurriert, an einen Bindungsliganden
dafür zu
binden, oder indem das Kobalamin ermittelt wird, das aus abgetrenntem
holo-TC II freigesetzt wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin,
entweder gleichzeitig oder davor oder danach, die Bestimmung des
Folatgehalts.
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Der
nachweisbare Ligand kann mit jedem gebräuchlichen Mittel in geeigneter
Weise markiert werden, zum Beispiel mit einem signalerzeugenden Marker,
der bestimmt werden kann z. B. durch Lumineszenz, Chemolumineszenz,
kolorimetrische Bestimmung, Fluoreszenz, Radioaktivität oder durch enzymatische
Aktivität.
Tatsächlich
kann jeder dem Fachmann bekannte signalerzeugende Marker im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
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Nur
um Beispiele zu nennen, einige geeignete Vertreter von farbigen
oder fluoreszierenden Verbindungen, die benutzt werden können, um
einen bindenden Liganden der vorliegenden Erfindung nachweisbar
zu markieren, sind Anthrachinone, Azofarbstoffe, Azinfarbstoffe
wie Oxazine und Thiazine, Triazine, natürlich vorkommende Pigmente
wie Porphyrine, Phycobiliproteine, einschließlich Phycoerythin und Phycocyanin,
Chlorophylle und ihre Analoga und Derivate, Carotinoide, Acrinidine,
Xanthene einschließlich
Fluoreszein und Rhodamin, Indigofarbstoffe, Thioxanthene, Cumarine,
Polymethine einschließlich
Di- und Triarylmethine und Derivate davon von Phthalocyaninen und
Metallphtalocyaninen.
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In ähnlicher
Weise kann eine Vielzahl radioaktiver Verbindungen als signalerzeugender
Markierungsteil des in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagenzes
verwendet werden, darunter sind mit Iod-125 markierte Verbindungen
und mit Kobalt-57 markierte Verbindungen.
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Alternativ
können
die bindenden Liganden an natürliche
oder synthetische Verbindungen gebunden werden, die ein chemolumineszentes
Signal erzeugen können,
das in bekannter Weise gemessen werden kann (Cormier, M. J. et al.;
Chemiluminescence and Bioluminescence (Chemolumineszenz und Biolumineszenz),
Plenum Presse, New York 1973). Geeignete chemolumineszente Verbindungen schließen Luciferin,
Oxalsäureester,
1,2-Dioxetan, Luminol oder Derivate davon mit ein, sind aber nicht auf
diese begrenzt. Wenn dies zweckdienlich ist, können Wasserstoffperoxid, Enzyme,
z. B. Luciferase, oder andere Chemikalien benutzt werden, um das chemolumineszente
Signal aus den verwendeten signalerzeugenden benutzten Molekülen hervorzurufen.
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Ausgeprägt anionische
signalerzeugende Moleküle
sind möglicherweise
nicht für
die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, da
sie eine Tendenz haben, an Serumproteine wie menschliches Serumalbumin
(HSA) zu binden, das in der Probe enthalten sein kann. Besonders
geeignete Beispiele, die verwendet werden können, sind Fluoreszeinisothiocyanat,
Rhodamin B oder N-(Resorufin-4-carbonyl)piperidin-4-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester)
oder resos.
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Gemäß einer
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann ein Fraktion, der mindestens einen Teil des TC II und/oder
des Folats enthält,
aus einer Probe einer Körperflüssigkeit
abgetrennt werden, indem man die Körperflüssigkeit mit einem spezifisch
an TC II bindenden Liganden reagieren lässt und dann die an TC II gebundene
Fraktion vom Rest der Probe abtrennt, wodurch der Zielanalyt darin
isoliert und konzentriert wird. In einer Ausführungsform der Erfindung kann
ein nachweisbarer bindender Ligand, der gegen holo-TC II gerichtet
ist, benutzt werden, um den Komplex aus TC II und Kobalamin nachzuweisen,
der in der ab getrennten gebundenen Fraktion vorhanden ist. Der an
Holo-TC II bindende
Ligand kann mit der zu untersuchenden Probe vor, gleichzeitig mit,
oder nach dem Kontakt mit dem an TC II bindenden Liganden und vor
oder nach Abtrennung der an TC II gebundenen Fraktion vom Rest der
Probe in Kontakt gebracht werden.
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Entsprechend
kann eine Kobalamin enthaltende Fraktion (die z. B. holo-TC II und
holo-HC enthält)
vom Rest der Probe abgetrennt werden, indem man die zu untersuchende
Körperflüssigkeit
mit einem immobilisierten oder fixierten Kobalamin oder einem Analogon
oder einem Fragment davon reagieren lässt, das apo-TC II und apo-HC
bindet, und von der gebundenen Fraktion den Rest der Probe abtrennt,
die holo-TC II und holo-HC enthält.
Ein nachweisbarer, an TC II bindender Ligand kann dann verwendet
werden, um den in der abgetrennten Fraktion vorhandenen Komplex
aus TC II und Kobalamin zu bestimmen. Der nachweisbare, an TC II
bindende Ligand kann mit der zu untersuchenden Probe vor, gleichzeitig
mit, oder nach dem Kontakt mit dem gebundenen Kobalamin und vor
oder nach der Abtrennung der gebundenen Fraktion vom Rest der Probe in
Kontakt gebracht werden.
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In
manchen Ausführungsformen
können
immobilisierte Liganden für
den einen oder anderen Bestandteil des Komplexes aus apo- und/oder
holo-TC II und HC in einer Säule
angeordnet werden. Die Körperflüssigkeit,
die den Komplex aus TC II und Kobalamin enthält, kann auf die Säule aufgegeben
werden und mit dem (bzw. den) bindenden Liganden in Kontakt gebracht
werden.
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Die
Säule kann
durchgespült
oder gewaschen werden und ein Eluent kann benutzt worden, um, wenn
notwendig, die Freisetzung einer gebundenen Fraktion aus der Säule zu erlauben
und es zu erleichtern, sie zu sammeln. Wenn die Inhaltsstoffe der nicht
gebundenen Fraktion in Bezug auf oder auch in Bezug auf andere Bestandteile
analysiert werden sollen, sollte die Säule mit einem Puffer oder einem Medium
gewa schen werden, der bzw. das mit einer kalibrierten Mikropipette
zugegeben wird, um sicherzustellen, dass ein exaktes bekanntes Volumen
aufgegeben und gesammelt wird. Das aufgegebene Volumen ist bevorzugt
innerhalb von 3% des gewünschten
(d. h. Kalibrierungs-)Volumens, bevorzugt innerhalb von 1 oder 2%.
Ebenso sollte, wenn die zu analysierende Fraktion vor dem Nachweis
aus der Säule freigesetzt
werden soll, das Elutionsmittel, das benutzt wird, um den Komplex
freizusetzen, mit einer kalibrierten Mikropipette aufgegeben werden.
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In
einer alternativen Ausführungsform
können
die bindenden Liganden, die benutzt werden, um eine Fraktion einer
Probe abzutrennen, immobilisiert werden auf einem partikelförmigen Festphasen-Träger, zum
Beispiel Latex oder Polymerkügelchen.
Um Handhabung und Abtrennung zu unterstützen, können magnetische Kügelchen
benutzt werden und in der Tat ist dies eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Der Begriff „magnetisch", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet, dass der Träger
fähig ist,
ein magnetisches Moment übertragen zu
bekommen, wenn er in ein Magnetfeld gebracht wird. Das heißt mit anderen
Worten, dass ein Träger, der
magnetische Teilchen enthält,
durch magnetische Aggregation einfach entfernt werden kann, was einen
schnellen, einfachen und leistungsfähigen Weg zur Trennung der
Fraktionen nach der Bindung an den Liganden darstellt.
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So
können
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
magnetische Teilchen, an die der Komplex aus TC II und Kobalamin
gebunden ist, durch Anwendung eines Magnetfelds, zum Beispiel mit
einem Dauermagneten, auf eine geeignete Oberfläche übertragen werden. Es ist normalerweise
ausreichend, einen Magneten an der Seite des Behälters, der die Probenmischung
enthält,
anzusetzen, um die Partikel zu veranlassen, sich an der Wand des
Behälters
zu sammeln und sie so für
die weitere Analyse zu isolieren.
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Besonders
bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, zum Beispiel die,
die von Sintef in
EP-A 106 873 beschrieben
wurden, da magnetische Aggregation und Verklumpen der Partikel während der
Reaktion vermieden werden können.
Die weithin bekannten magnetischen Kügelchen, die von Bang Particles
(US) hergestellt werden können
besonders geeignet sein, um in der vorliegenden Erfindung verwendet
zu werden.
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Im
Allgemeinen werden neben der zu untersuchenden Probe auch Kalibrierungsproben
mit bekanntem Gehalt an holo-TC II Komplex und bekanntem Folatgehalt
bei der Durchführung
des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens
ausgewertet. Solche Bestimmungen können verwendet werden, um eine
Kalibrierungskurve zu erzeugen, aus der der Gehalt von an TC II
gebundenem Kobalamin und/oder der Folatgehalt der untersuchten Probe
ermittelt werden können.
Die Art der Kalibrierungsproben und die Auswahl von Umrechnungs- oder
Korrekturfaktoren, die in der Bestimmung des holo-TC II Komplexes
und/oder des Folats verwendet werden, können variieren in Abhängigkeit
zum Beispiel von den jeweiligen Liganden, die in den Bindungs- und
Trennungsschritten der Untersuchung benutzt werden und von anderen
Aspekten des Verfahrens, die die Bindung und die Trennung der Probe beeinflussen,
zum Beispiel Pufferzusammensetzung, Untersuchungsbedingungen etc.
Normalerweise werden Kalibrierungsproben benutzt werden, die Gehalte
an holo-TC II von 0 bis 300 pmol/l aufweisen. Der Referenzbereich,
innerhalb dessen der Wert für an
TC II gebundenes Kobalamin im Allgemeinen gefunden werden wird,
ist 30 bis 160 pmol/l.
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Normalerweise
werden Kalibrierungsproben mit einem Folatgehalt im Bereich von
0 bis 45 nM benutzt werden.
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Der
Kalibrierungsstandard für
holo-TC II wird normalerweise menschliches, natives oder rekombinantes
holo-TC II sein. Die Verwendung von holo-TC II als Kalibrierungsstandard
in holo-TC II-Untersuchungen ist neuartig und bildet einen zusätzlichen Aspekt
der Erfindung.
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Während die
Bestimmung der Konzentrationen von holo-TC II eine genaue Messung
eines möglichen
Kobalamin-Ungleichgewichts im Körper
zur Zeit der Probennahme ermöglicht,
wurde außerdem gefunden,
dass die Messung der Gesamtkonzentration von Kobalamin, insbesondere
der Gesamtkonzentration von Kobalamin im Serum in Verbindung mit
der Bestimmung von holo-TC
II wertvolle Hinweise auf ein über
längere
Zeit bestehendes Kobalamin-Ungleichgewicht geben kann. Solche Messungen
der Gehalte an holo-TC II und der Gesamtkonzentrationen von Kobalamin
im Serum können
gegebenenfalls mit der Messung der Folatkonzentrationen kombiniert
werden, und werden bevorzugt in dieser Weise kombiniert.
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Das
erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren
ermittelt das metabolisch aktive Reservoir von Kobalamin durch Bestimmung
des holo-TC II Komplexes oder Isolierung des holo-TC II Komplexes
und anschließende
Bestimmung des damit verbundenen Kobalamins und stellt damit eine
geeignete Methode zur Feststellung von Kobalaminmangel vor oder
nach dem Einsetzen der klinischen Manifestationen von Kobalaminmangel
zur Verfügung.
Das erfindungsgemäße Verfahren
schließt
die simultane oder vor- oder nachgeschaltete Messung von Folatniveaus
ein. Das Untersuchungsverfahren kann vorteilhaft vor dem Einsetzen
von Symptomen eingesetzt werden, da es die präzisen Voraussage einer negativen
Kobalamin- und/oder Folatbalance erlaubt. Das Verfahren kann gegebenenfalls
die Messung der Gesamtkonzentrationen von Kobalamin einschließen, um
den Zeitraum zu ermitteln, über
den ein Kobalaminmangel oder ein Kobalamin-Ungleichgewicht bestanden
hat.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele und die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
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1 eine
Standardkurve für
holo-TC II ist;
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2 ein
Diagramm ist, das die Beziehung zwischen dem Gesamtgehalt an Kobalamin
im Serum und der Konzentration von holo-TC II zeigt;
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3 ein
Diagramm ist, das die Beziehung zwischen dem Gesamtgehalt an Kobalamin
im Serum und der Konzentration von holo-HC zeigt; und
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4 ein
Diagramm ist, das die Konzentrationen von apo-TC II, Haptocorrin
und freiem Kobalamin in menschlichem Serum vor und nach der Behandlung
mit magnetisierbaren Mikrokugeln zeigt, die mit Kobalamin beschichtet
sind.
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Beispiel 1
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Für TC II
spezifische Antikörper
(z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper) werden auf magnetisierbaren
Partikeln immobilisiert. Man lässt
ein Aliquot Serum (100–500 μl), das mit
einem gleichen Volumen PBS gemischt wird, 15 Minuten lang mit einem Überschuss
des immobilisierten Antikörpers und
einem Überschuss
eines nicht überlappenden Antikörpers gegen
holo-TC II (z. B. eines monoklonalen Antikörpers), der mit 125I
radioaktiv markiert wurde, reagieren. Die magnetisierbaren Partikel
werden unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert, der Überstand
wird entfernt, und die Partikel werden mit PBS gewaschen.
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Die
Radioaktivität
wird gemessen und die Konzentration von holo-TC II in der Probe
wird durch Interpolation auf einer Standardkurve ermittelt.
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Beispiel 2
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Für TC II
spezifische Antikörper
(z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper) werden auf magnetisierbaren
Partikeln immobilisiert. Man lässt
ein Aliquot Serum (600 μl),
das mit einem gleichen Volumen PBS gemischt wird, 30 Minuten lang
mit dem Antikörper
reagieren. Die magnetisierbaren Partikel werden unter Verwendung
eines starken Magneten sedimentiert und der Überstand wird entfernt. Die Partikel werden
einmal mit PBS gewaschen und anschließend 15 Min. lang mit Natriumhydroxid
(0,3 M) behandelt, das Kaliumcyanid (100 μM), Dithiothreitol (15 mM) und
eine festgelegte Menge mit 125I oder 57Co radioaktiv markiertem Cyanokobalamin
in einem Gesamtvolumen von 100 μl
enthält,
um Kobalamin freizusetzen, das an das immobilisierte holo-TC II
gebunden ist, und gleichzeitig alle Formen des Kobalamins in Cyanokobalamin
umzuwandeln und mit einer festgelegten Menge markiertem Cyanokobalamin
zu mischen. Eine begrenzte Menge des Intrinsic Factors in 100 μl Boratpuffer
wird zugegeben und man lässt 10
Min. lang reagieren. Die magnetisierbaren Partikel werden unter
Verwendung eines starken Magneten sedimentiert und 150 μl des Überstands
werden zur Messung der Radioaktivität entfernt. Die Konzentration
von an TC II gebundenem Kobalamin in der Serumprobe wird aus einer
Standardkurve ermittelt.
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Alternativ
kann das freigesetzte Kobalamin mit Abbots IMx Verfahren oder ähnlichen
Verfahren gemessen werden.
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Beispiel 3
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Für holo-TC
II spezifische Antikörper
(z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper) werden auf magnetisierbaren
Partikeln immobilisiert. Man gibt zu einem Aliquot Serum (100–500 μl), das mit
einem gleichen Volumen PBS gemischt wurde, eine festgesetzte Menge
von mit 125I markiertem holo-TC II und eine begrenzte
Menge des immobilisierten Antikörpers
gegen holo-TC II. Nach 15 Minuten dauernder Inkubation werden die
magnetisierbaren Partikel unter Verwendung eines starken Magneten
sedimentiert. Die Partikel werden mit PBS gewaschen und die Radioaktivität wird gemessen.
Die Konzentration von holo-TC II wird aus einer Standardkurve ermittelt.
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Beispiel 4
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Rekombinantes
holo-TC II wird auf magnetisierbaren Partikeln immobilisiert. Man
gibt zu einem Aliquot Serum (100–500 μl), das mit einem gleichen Volumen
PBS gemischt wurde, eine festgelegte Menge immobilisiertes holo-TC
II und einen Überschuss eines
Antikörpers
(z. B. eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers),
der spezifisch für
holo-TC II ist und mit 125I radioaktiv markiert
wurde. Nach 15 Min. dauernder Inkubation werden die Partikel unter Verwendung
eines starken Magneten sedimentiert. Die Partikel werden mit PBS
gewaschen und die Radioaktivität
wird gemessen. Die Konzentration von holo-TC II wird aus einer Standardkurve
ermittelt.
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Beispiel 5
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Zu
einem Aliquot Serum (100–500 μl) wird ein Überschuss
biotinyliertes Kobalamin gegeben, um das gesamte apo-TC II und apo-HC
zu binden. Nach 10 Min. dauernder Inkubation wird die Serumprobe
10 Min. lang mit magnetischen Partikeln behandelt, die mit Avidin
beschichtet sind. Die Partikel werden unter Verwendung eines starken
Magneten sedimentiert. Der Überstand
wird abgetrennt und mit zwei nicht überlappenden monoklonalen Antikörpern gegen
TC II gemischt, von denen der eine mit 125I
radioaktiv markiert ist und der andere mit konjugiertem Biotin.
Nach 10 Min. werden magnetische Partikel zugegeben, die mit Avidin
beschichtet sind, und man lässt
sie 10 Min. lang die biotinylierten Addukte binden. Anschließend werden
die Partikel unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert
und mit PBS gewaschen. Die Radioaktivität wird gemessen und die Konzentration
von holo-TC II wird durch Interpolation auf einer Standardkurve
ermittelt.
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Beispiel 6
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Wie
Beispiel 5, aber das Serum, aus dem apo-TC II entfernt wurde, wird
mit einer festgelegten Menge holo-TC II, das mit 125I
markiert wurde, und einer begrenzten Menge Antikörper gegen TC II, der auf magnetisierbaren
Partikeln immobilisiert wurde, gemischt. Nach 15 Min. dauernder
Inkubation werden die Partikel unter Verwendung eines starken Magneten
sedimentiert.
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Die
Partikel werden mit PBS gewaschen und die Radioaktivität wird gemessen.
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Beispiel 7
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Kobalamin
oder Kobalamin-Analoga werden auf magnetisierbaren Mikrokugeln immobilisiert,
z. B. durch kovalente Kopplung oder durch Biotin-(Strept)Avidin-Kopplung
(z. B. Pathare et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 217–232). Normalerweise
werden mit Streptavidin beschichtete magnetisierbare Mikrokugeln
bei Zimmertemperatur und im Dunkeln 30 Minuten lang mit 1 μM biotinyliertem
Kobalamin inkubiert. Die Kügelchen
werden unter Verwendung eines Magneten sedimentiert, zweimal mit PBS
gewaschen und in einer Konzentration von 1% in PBS + 5 mg/ml HSA
resuspendiert. Zu einem Aliquot Serum (10–100 μl) werden ein bis fünf Volumina PBS
und 1/10 Volumen mit Kobalamin beschichtete magnetisierbare Mikrokugeln
hinzugefügt.
Die Mischung wird 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur im Dunklen
inkubiert, um alles apo-TC II und apo-HC zu binden. Die Partikel
werden unter Verwendung eines Magneten sedimentiert und der Überstand
wird abgetrennt. (4 stellt zwei Chromatogramme
eines menschlichen Serums vor und nach der Bahandlung mit magnetisierbaren
Mikrokugeln, die mit Kobalamin beschichtet sind, bildlich dar. Praktisch
das gesamte apo-TC II wird durch die Behandlung entfernt). Der Überstand
wird mit zwei Antikörpern
gegen menschliches TC II gemischt, entweder zwei nicht überlappenden
monoklonalen Antikörpern
gegen menschliches TC II, oder einem monoklonalen und einem polyklonalen
Antikörper,
oder, weniger bevorzugt, zwei polyklonalen Antikörpern, von denen einer markiert
(z. B. mit 125I) und der andere mit Biotin
konjugiert ist. Nach 10 Minuten werden mit (Strept)Avidin beschichtete
magnetisierbare Mikrokugeln hinzugefügt und man lässt sie
10 Minuten lang die biotinylierten Addukte binden. Anschließend werden
die Partikel unter Verwendung eines Magneten sedimentiert und mit
eiskaltem PBS gewaschen. Die Radioaktivität wird gemessen und die Konzentration
von holo-TC II wird durch Interpolation auf einer Standardkurve
ermittelt, die erzeugt wird, indem man eine bekannte Menge TC II
zu Puffer oder Serum hinzufügt.
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Beispiel 8
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Wie
Beispiel 7, aber überschüssiges biotinyliertes
Kobalamin wird direkt der Serumprobe + PBS hinzugefügt, um das
gesamte apo-TC II und apo-HC zu binden. Nach 10 Minuten dauernder
Inkubation wird die Serumprobe mit magnetisierbaren Mikrokugeln,
die mit (Strept)Avidin beschichtet sind, 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur
im Dunkeln behandelt.
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Beispiel 9
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Ein
für menschliches
TC II spezifischer Kaninchenantikörper mit einer scheinbaren
Bindungskonstante von > 5 × 109 M–1 wurde immobilisiert
auf 1 μm
großen
magnetisierbaren Mikrokugeln, die mit einem von Ziegen stammenden
Antikörper
gegen Kaninchen-IgG (Indica Diagnose) beschichtet waren. Serumproben
von jeweils 400 μL
von 49 gesunden Freiwilligen wurden mit einem gleichgroßen Volumen PBS
und 40 μL
des immobilisierten Antikörpers
(1%) gemischt. Die Mischungen wurden 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur
im Dunkeln gehalten und dann wurden die Mikrokugeln unter Verwendung
eines Magneten sedimentiert. Die Niederschläge wurden einmal mit eiskaltem
Waschpuffer gewaschen (PBS plus 0,02% Tween 20) und anschließend resuspendiert
in 50 μL
50 mM Dithiothreitol, 0,001% Kaliumcyanid und einer festgelegten
Menge 57Co-CN-Kobalamin (Amersham)
in Phosphatpuffer, pH 7,5. Dies ließ man 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur
stehen, dann wurden 25 μL
0,5 M Natriumhydroxid zugegeben und 15 Minuten später 300 μL auf Dextran
immobilisierter Intrinsic Factor (genug, um 50% des Tracers zu binden)
in Boratpuffer, pH 8,6. Nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur im Dunkeln
wurden die Proben bei 4°C
und 1000 g 10 Minuten lang zentrifugiert, Überstände sorgfältig entfernt, und die Radioaktivität der Pellets
in einem Packard Risstar gemessen. Die Konzentration von an TC II
gebundenem Kobalamin wurde aus einer Standardkurve ermittelt, die
mit Hilfe von acht Kalibrierungsproben konstruiert wurde (0–500 pM
holo-TC II), die genauso wie die Proben behandelt wurden. An 37
Serumproben wurde auch der Gesamtgehalt von Kobalamin im Serum analysiert
unter Verwendung des Abbot IMx B12 Immunoassay.
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Die
Standardkurve für
holo-TC II ist in 1 gezeigt und die Relation zwischen
den Gesamtgehalten von Kobalamin im Serum und den Konzentrationen
von holo-TC II bei 37 gesunden Freiwilligen ist in 2 veranschaulicht.
Es ist offensichtlich, dass die Korrelation niedrig ist, mit r2 = 0,50. Demgegenüber ist die Korrelation zwischen
holo-HC und dem
Gesamtgehalt an Kobalamin im Serum hoch, r2 =
0,96 (3). Die durchschnittliche Konzentration von holo-TC
bei den 49 gesunden Freiwilligen betrug 64 ± 28 pM und der 95% Referenzbereich
23–127
pM.
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Das
Untersuchungsverfahren hat einen Variationskoeffizienten (CV) von
10%, eine Nachweisempfindlichkeit (0 – Kalibrierungsprobe – 3σ (englisch: "3 s.d.")) kleiner 10 pM
und zeigt keine Kreuzreaktivität
mit Haptocorrin.
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Beispiel 10
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Zur
Messung von holo-TC II werden Aliquote von Serum 30 Min. lang mit
einem gleichgroßen
Volumen PBS und magnetisierbaren Partikeln, die mit für TCII spezifischen
Antikörpern
beschichtet sind, gemischt. Die magnetisierbaren Partikel werden
unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert, und der Überstand
wird entfernt. Die Partikel werden einmal gewaschen und anschließend mit
einem Freisetzungs-/Denaturierungs-Reagenz behandelt, das Natriumhydroxid
(0,3 M), Kaliumcyanid (100 μM),
und Dithiothreitol (15 mM) enthält.
Zur Messung von Folgt werden Serumproben direkt mit dem Freisetzungs-/Denaturierungs-Reagenz
behandelt. Dies wird im Wesentlichen das gesamte gebundene Kobalamin
und Folgt freisetzen, das gesamte Kobalamin in die stabilere Cyanokobalamin-Form
umwandeln und das endogene Folgt in reduzierter Form konservieren.
Allen Proben wird dann ein Doppeltracer hinzugefügt, der mit Co57 radioaktiv
markiertes Cyanokobalamin und mit I125 radioaktiv markier tes Folat enthält. Eine
begrenzte Menge eines Doppelbinders, der immobilisierten Intrinsic
Factor und Folatbinder enthält,
wird jedem Röhrchen
hinzugefügt
und 10–60 Min.
lang inkubiert. Der Binder wird durch Zentrifugation sedimentiert
oder unter Verwendung eines starken Magneten, abhängig von
der Art der Immobilisierung. Die Konzentration von an TC II gebundenem Kobalamin
in einer Serumprobe wird aus einer Standardkurve ermittelt, die
konstruiert wurde mit Hilfe von Kalibrierungsproben von holo-TC
II und der Konzentration von Folat aus einer Standardkurve, die
aus bekannten Mengen Folat konstruiert wurde.
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Beispiel 11
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Zur
Messung von holo-TC II werden Aliquote von Serum 30 Min. lang mit
einem gleichgroßen
Volumen PBS und magnetisierbaren Partikeln, die mit für TCII spezifischen
Antikörpern
beschichtet sind, gemischt. Die magnetisierbaren Partikel werden
unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert, und der Überstand
wird entfernt. Die Partikel werden einmal gewaschen und anschließend mit
einem Freisetzungs-/Denaturierungs-Reagenz behandelt, das Natriumhydroxid
(0,3 M), Kaliumcyanid (100 μM),
und Dithiothreitol (15 mM) enthält.
Zur Messung des Gesamtgehalts von Kobalamin und Folat im Serum werden
Serumproben direkt mit dem Freisetzungs-/Denaturierungs-Reagenz
behandelt. Dies wird im Wesentlichen das gesamte gebundene Kobalamin
und Folat freisetzen, das gesamte Kobalamin in die stabilere Cyanokobalamin-Form
umwandeln und das endogene Folat in reduzierter Form konservieren.
Allen Proben wird dann ein Doppeltracer hinzugefügt, der mit Co57 radioaktiv
markiertes Cyanokobalamin und mit I125 radioaktiv markiertes Folat enthält. Eine
begrenzte Menge eines Doppelbinders, der immobilisierten Intrinsic
Factor und Folatbinder enthält,
wird jedem Röhrchen
hinzugefügt
und 10–60 Min.
lang inkubiert. Der Binder wird durch Zentrifugation sedimentiert
oder unter Verwendung eines starken Magneten, abhängig von
der Art der Immobilisierung. Die Konzentration von an TC II gebundenem Kobalamin
in einer Serumprobe wird aus einer Standardkurve ermittelt, die
konstruiert wurde mit Hilfe von Kalibrierungsproben von holo-TC
II und der Gesamtkonzentration von Kobalamin und Folat im Serum
aus einer Standardkurve, die aus bekannten Mengen Kobalamin und
Folat konstruiert wurde.