ES2284616T3 - Ensayo para medir holo-transcobalamina y folato. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo que comprende la detección de holo-transcobalamina II (holo-TC II) y folato en una muestra que contiene cobalamina de un sujeto en el que dicha detección de holo-TC II comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra con un ligando de unión específica para un analito elegido entre el conjunto de TC II y holo-TC II y separar la fracción unida a ligando de la fracción no unida a ligando para concentrar de este modo dicho analito en al menos 3 veces para dar una muestra concentrada, seguido por la determinación del nivel de holo-TC II.

Description

Ensayo para medir holo-transcobalamina y folato.

La presente invención se refiere a métodos de ensayo para la determinación de cobalamina o vitamina B_{12} y/o folato en un fluido corporal y en particular a métodos de ensayo para la combinación metabólicamente activa de cobalamina.

La cobalamina o vitamina B_{12} es una vitamina soluble en agua que forma parte del complejo vitamina B encontrado en los alimentos. La molécula central consta de un anillo corrínico de cuatro unidades pirrol que rodean el átomo de cobalto esencial. La cobalamina es la única vitamina que no puede sintetizarse por los animales o plantas y debe absorberse a través de los alimentos en el intestino. Sin embargo, puede almacenarse en el hígado. Se sintetiza por los microorganismos, en particular por bacterias anaeróbicas y levaduras.

El folato (Ácido Fólico en su forma aniónica) es una vitamina que pertenece al complejo vitamina B, y es necesaria como cosustrato en la formación de metionina a partir de homocisteína. Su forma reducida, tetrahidrofolato, es esencial en el proceso de biosíntesis del ADN.

La cobalamina funciona in vivo como co-enzima y las enzimas cobalamina catalizan tres tipos de reacciones; (i) reordenamientos intramoleculares, por ejemplo, la formación de succinil CoA a partir de L-metilmalonil CoA, (ii) metilaciones, por ejemplo, la formación de metionina por metilación de homocisteína y (iii) reducción de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. En mamíferos, sólo se conocen dos reacciones enzimáticas que requieren cobalamina como co-enzima, las mencionadas específicamente en (i) y (ii) anteriormente.

En el proceso de digestión, una proteína de la saliva llamada haptocorrina, a partir de ahora mencionada como HC (que también se conoce en la técnica como aglutinante R o transcobalaminas I y III colectivamente) se une a la cobalamina en el tracto gastrointestinal superior formando un complejo que pasa a través del estómago. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo cobalamina-haptocorrina (holo-HC) en el íleon, liberando la cobalamina que después se une a una proteína llamada factor intrínseco, que se secreta por la mucosa gástrica, para formar un complejo adicional. El complejo de cobalamina-factor intrínseco se une a un receptor específico en el revestimiento del íleon terminal, por lo que se disocia por un factor de liberación y la cobalamina se transporta activamente a través de la membrana del íleon en el torrente sanguíneo.

La cobalamina no circula en el cuerpo de una forma libre en una cantidad apreciable. Probablemente el 99% o más de la cobalamina está unida por una de las proteínas transcobalamina (TC I-III) o albúmina.

Se cree que la proteína responsable del transporte de cobalamina a tejidos diana es la transcobalamina II (TC II), una proteína traza crítica sin la que la cobalamina no puede cruzar las membranas celulares. A pesar de esta importante función metabólica sólo aproximadamente el 6-25% de la cobalamina en el suero está unida a TC II y la mayoría se transporta por HC. TC II es un polipéptido de una única cadena de 45 kDa encontrada principalmente en el suero, fluido seminal y fluidos céfalo-raquídeo. La cobalamina unida a TC u holo-TC II, se une a receptores específicos en las membranas celulares y una vez unida, el complejo holo-TC II se capta en las células por pinocitosis.

TC II se sintetiza por el hígado, el endotelio vascular, enterocitos, macrófagos y fibroblastos y circula predominantemente como apo-TC II, es decir, que carece de cobalamina unida. Tiene una corta vida media de aproximadamente 90 minutos.

Menos de una cuarta parte de la cobalamina plasmática total está asociada con TC II. El resto está unido a las otras transcobalaminas o albúmina como se ha mencionado anteriormente.

Como la cobalamina debe absorberse del alimento, cualquier afección que provoque una función gástrica alterada, por ejemplo, gastroenteritis o afecciones que provoquen atrofia gástrica, o una incapacidad de producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de liberación, TC II o receptores de TC II, puede provocar una captación alterada de la cobalamina y su deficiencia resultante.

Ciertos subgrupos de la población, por ejemplo los ancianos, mujeres embarazadas, pacientes con enfermedad gastrointestinal crónica o aguda, los que padecen de ciertas enfermedades autoinmunes, aquellos con una historia familia de anemia perniciosa y enfermos de SIDA, son particularmente propensos a deficiencia de cobalamina y/o folato.

Las manifestaciones clínicas de deficiencia de cobalamina y/o folato son variadas y numerosas pero principalmente implican anemia, hiperhomocisteinemia por hematopoyesis megaloblástica y trastornos funcionales y estructurales del sistema nervioso. Aproximadamente el 60% de los individuos diagnosticados como deficientes en cobalamina son anémicos, pero en muchos, los síntomas neurológicos son los únicos signos clínicos observados. Aproximadamente el 10% de los pacientes muestra síntomas psiquiátricos y aproximadamente el 40% muestra síntomas tanto neurológicos como psiquiátricos.

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El diagnóstico temprano de la deficiencia de cobalamina y/o folato es crucial para asegurar un buen pronóstico para los pacientes, ya que algunas de las manifestaciones de la deficiencia de cobalamina y/o folato, particularmente los efectos neuropsiquiátricos, son irreversibles si no se detectan y alivian por una terapia de cobalamina y/o folato rápidamente.

Por lo tanto, es deseable evaluar de forma precisa los niveles de cobalamina y/o folato de un individuo de un modo oportuno y eficaz, con el propósito de establecer si un individuo puede o no estar padeciendo de deficiencia de cobalamina y/o folato.

La medida de la cobalamina plasmática total, es decir, cobalamina (y sustancias de tipo cobalamina) unida a una cualquiera de las proteínas transcobalamina (TC) I, II y III, se ha usado en intentos de evaluar la deficiencia de cobalamina. Esta técnica produce una distribución de concentración básica amplia en una población que se considera normal y por tanto produce un amplio intervalo de referencia. En individuos, sin embargo, el intervalo de cobalamina disponible considerado como normal para este individuo, es muy estrecho. Se ha observado que aunque una concentración de cobalamina metabólicamente activa del individuo se ha movido fuera de su propio intervalo de referencia, su contenido de cobalamina plasmática total permanece en el intervalo considerado como normal para la población. En dichas circunstancias, la deficiencia de cobalamina puede permanecer sin detectar. Dicho método no fiable es claramente indeseable y está bien reconocido que dichas medidas de cobalamina en suero o plasma tienen una baja sensibilidad y especificidad de diagnóstico.

Se han desarrollado y usado ensayos microbiológicos que implican microorganismos dependientes de cobalamina para el crecimiento, para medir la concentración de cobalamina plasmática, pero además de la dificultad de estimar el intervalo de referencia apropiado, estos métodos requieren extracción y conversión de las cobalaminas que consume mucho tiempo, es problemático y completamente inadecuado para una exploración rápida de laboratorio.

Métodos alternativos para evaluar la deficiencia de cobalamina implican medir la acumulación de metabolitos en el plasma que requiere cobalamina para su conversión. Los niveles de metilmalonato plasmático y homocisteína plasmática aumentan en individuos deficientes en cobalamina (Chanarin, The megaloblastic anaemia; London, Blackwell Scientific Publications, 1991) y son buenas moléculas candidatas para la correlación con la deficiencia de vitamina B_{12}. Los métodos basados en la evaluación de homocisteína han demostrado, sin embargo, ser complicados, poco factibles y muestran mala especificidad y sensibilidad. Aunque los métodos basados en la medida de metilmalonato son precisos y fiables, son incómodos y requieren análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas combinadas y por tanto son caros y de nuevo inadecuados para una exploración clínica rutinaria (Nexo et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61-76).

También se ha sugerido que la medida de cobalamina unida a TC II en oposición a la cobalamina plasmática total puede proporcionar un indicador clínico fiable de la probabilidad de deficiencia de cobalamina (Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34: 132-139; Wickramasinghe and Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537-539; Patente de Estados Unidos 4680273). Sin embargo, dichos esfuerzos para determinar la concentración de holo-TC II hasta la fecha han sido principalmente indirectos, estimando la concentración de holo-TC II como la diferencia entre la cobalamina plasmática total y la concentración de cobalamina de plasma al que se ha eliminado TC II.

Dicha eliminación de TC II puede conseguirse por adsorción en sulfato amónico (Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367-372), microsílice (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332-337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537-539), vidrio microfino (Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42: 202-211) o anticuerpos policlonales anti-TC II inmovilizados (Lindemans et al. (1993) Clin. Chim. Acta 132: 53-61). La concentración de cobalamina en plasma total y la fracción eliminada se realizan por métodos bien conocidos en la técnica tales como técnicas de radioinmunoensayo o inmunoensayo enzimático. Estos métodos son inadecuados para la exploración rutinaria automatizada o no automatizada porque son complejos y consumen mucho tiempo y porque el bajo grado de especificidad de los materiales de adsorción usados provoca una separación insuficiente de holo-TC II y holo-HC provocando una sobreestimación de holo-TC II. La variación lote a lote del material de adsorción introduce errores adicionales y más importante, la resta de un gran volumen de otro gran volumen provoca inexactitudes inaceptables y falta de fiabilidad.

Los otros intentos de evaluar TC II han implicado separar TC II de otros componentes séricos, incluyendo la TC II y TC III, usando su lipofilicidad. Por tanto Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172: 297-310, Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195-199 y Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 describen métodos para separar TC II de otras transcobalaminas usando heparina sepharose, gel de sílice o celulosa respectivamente. Estos métodos sin embargo tienen las mismas desventajas que los métodos indirectos ya que dependen de los mismos materiales de adsorción. Además, la baja concentración plasmática de holo-TC II vuelve a estos métodos inadecuados para la combinación con métodos existentes de cuantificación de cobalamina. El intervalo normal de holo-TC II es 35-160 pM y valores por debajo de 35 pM generalmente se considerarían como indicativos de deficiencia de cobalamina. La sensibilidad analítica presentada de la mayoría de los métodos rutinarios para la cobalamina plasmática es aproximadamente 40 pM pero en la práctica a menudo es mucho mayor, típicamente aproximadamente 90 pM. Por tanto, los niveles plasmáticos normales de holo-TC II están por debajo o cerca del límite de sensibilidad de los métodos rutinarios para la cuantificación de cobalamina.

Posiblemente el método más exacto actualmente reconocido para determinar cobalamina unida a TC II implica la adsorción de TC II a sílice y después el ensayo de la fracción unida para el contenido de cobalamina usando un inmunoensayo descrito por ejemplo por Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073-2077, o un ensayo microbiológico, produciendo aparentemente este último los mejores resultados. Este método requiere un día de trabajo completo para realizar solamente veinte ensayos. Es muy caro e impracticable y poco adecuado para investigaciones de laboratorio de diagnóstico clínico rutinarias.

Por tanto, existe una gran necesidad de métodos mejorados para evaluar el nivel de cobalamina metabólicamente activa en un fluido corporal, con el propósito de correlacionar el nivel de cobalamina con la probabilidad de deficiencia de cobalamina, que sean susceptibles a una aplicación de diagnóstico clínico rutinaria.

Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de ensayo doble que mide tanto el folato total como la homo-TC III en una muestra de acuerdo con el método descrito en las reivindicaciones adjuntas.

La medida del folato puede, por ejemplo, realizarse añadiendo primero un agente de liberación o desnaturalizante (tal como uno que contenga hidróxido sódico, cianuro potásico y ditiotreitol). Puede añadirse un marcador doble que contenga cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato marcado con I125, seguido por una cantidad limitada de aglutinante doble que contenga factor intrínseco inmovilizado y aglutinante de folato.

La medida de holo-TC II puede, por ejemplo, realizarse poniendo en contacto la muestra con un ligando específico y movilizado para holo-TC II, preferiblemente unido a una partícula magnetizable, separando la fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando, por ejemplo, por el uso de un imán fuerte, y midiendo el contenido de holo-TC II en el mismo.

Preferiblemente, la detección del contenido de holo-TC II se realiza usando el aglutinante doble y el marcador doble como se ha descrito previamente.

Por un ligando de unión específica se entiende uno que se une a TC II (es decir, apo-TC II y holo-TC II) u holo TC II debido a su estructura química específica o conformación y no simplemente debido a una propiedad físico-química global (tal como lipofilicidad) que puede ser común para muchos componentes de una muestra de fluido corporal. La afinidad y la especificidad de unión de los ligandos adecuados para su uso en el método permiten una concentración 3 veces, más preferiblemente 5 veces e incluso más preferiblemente 10 veces y mucho más preferiblemente mayor de 10 veces la de TC II u holo-TC II en la muestra y por tanto dicho método es capaz de dar valores exactos y fiables para holo-TC II en el intervalo normal inferior de holo-TC II y también en el intervalo por debajo del normal. Dicha separación y concentración de las moléculas diana no son posibles con los métodos actualmente existentes que son incapaces de separar de forma eficaz TC II u holo-TC II de HC u holo-HC. La capacidad de concentrar la TC II u holo-TC II al menos 3 veces permite el uso de un equipo analítico automatizado en el ensayo de realización. Sin dicha etapa de concentración, la cantidad de analito presente en una muestra probablemente estará por debajo del límite de detección inferior. Dicho equipo analítico automatizado típicamente requiere entre 40 y 100 \mul de muestra en un volumen total de típicamente 150 \mul o mayor para su funcionamiento. Por tanto, un analito de baja concentración se diluye incluso adicionalmente para el análisis. Usando el método de ensayo de la invención, sin embargo, el analito se concentra al menos 3 veces. Como usar dicho equipo analítico automatizado típicamente implica un intervalo de control de 100-700 pM con un límite de sensibilidad inferior de aproximadamente 40 pM pero un límite inferior práctico de aproximadamente 90 pM, una concentración de 5 veces facilita la medida de holo-TC II por debajo de 18 pM y una concentración de 10 veces facilita la medida por debajo de holo-TC II 9 pM. Como la presente invención facilita la concentración a más de 10 veces, los especialistas en la técnica entenderán fácilmente que el grado al que se potencia la sensibilidad la hace de hecho una técnica muy potente.

La capacidad de concentrar el analito de modo que sea susceptible al análisis por dichos procedimientos automatizados es una ventaja importante del presente método de ensayo.

Preferiblemente, se generará a partir de una muestra de partida de 600 \mul de fluido corporal, un volumen de hasta 150 \mul, más preferiblemente hasta 100 \mul y mucho más preferiblemente menos de 60 \mul que después puede analizarse, opcionalmente usando procedimientos automatizados.

Puede usarse cualquier ligando de unión específica de TC II en el método de la invención como ligando de captura, concentración y separación o un ligando de detección, y dependiendo de la realización específica de la invención puede unirse a TC II tanto en forma apo como en forma holo o puede unirse específicamente o preferentemente a la forma holo. El ligando de unión a TC II preferiblemente mostrará un elevado grado de selectividad y especificidad hacia TC II y mostrará baja o más preferiblemente, esencialmente ninguna afinidad hacia otras proteínas TC, es decir, TC I o III, en forma apo u holo, o cualquier otra proteína de unión a cobalamina. Si el ligando de unión a TC II es un ligando de unión específica para holo-TC II, se muestran las mismas propiedades con el requisito adicional de que se muestra baja afinidad o preferiblemente ninguna afinidad hacia apo-TC II.

El ligando de unión a TC II u holo-TC II generalmente será un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un compuesto con una afinidad por TC II u holo-TC II respectivamente tal como un receptor de superficie celular, un polipéptido, un oligopéptido, un pequeño compuesto químico orgánico, etc. Otros ligandos de unión pueden ser un aglutinante específico seleccionado entre una biblioteca química combinatoria o de presentación de fagos o una secuencia de ADN o ARN de unión específica.

Si el ligando de unión es un anticuerpo puede ser policlonal pero preferiblemente será monoclonal.

Los anticuerpos monoclonales pueden generarse con especificidad y uniformidad mucho mayores que los anticuerpos policlonales y esto reduce la reactividad cruzada con otros componentes del fluido corporal, en particular otras transcobalaminas y cuando sea apropiado, la conformación alternativa, es decir, la forma apo del analito diana. La uniformidad y reproducibilidad ofrecidas por los anticuerpos monoclonales con relación a los anticuerpos policlonales asegura una mayor exactitud que es vital para un ensayo donde el analito está en dicha baja concentración. Como alternativa, puede ser un fragmento de anticuerpo por ejemplo F(ab), F(ab')_{2} o F(v). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser monovalentes o divalentes y pueden producirse por tecnología de hibridoma o pueden ser de origen sintético, y generarse por tecnología de ADN recombinante o síntesis química.

Podrían usarse, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla u otros derivados de anticuerpo o miméticos. El anticuerpo puede estar dirigido o provocado contra cualquier epítopo, componente o estructura de la proteína TC II u holo-TC II según sea apropiado.

Los anticuerpos adecuados para su uso como ligandos de unión en la presente invención se describen por ejemplo por Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149-154; M^{c}Lean et al. (1997) Blood 89 (1): 235-242.

Las moléculas receptoras capaces de unirse a las formas apo y holo de TC II o preferentemente o específicamente unirse a la forma holo-TC II pueden usarse de forma similar. Los receptores adecuados son receptores de TC II u holo-TC II de superficie celular o unidos a membrana y las propiedades de reactividad de especie cruzada significa que pueden usarse dichas moléculas receptoras de cualquier especie de mamífero, aunque preferiblemente el origen de dichos receptores es humano o bovino. Aunque las moléculas receptoras están preferiblemente aisladas en una forma relativamente purificada, también se contempla el uso de membranas celulares o fracciones de membrana mixtas que comprenden los receptores preferiblemente en forma concentrada. Dichos receptores o membranas o fracciones de membrana que contienen receptor pueden aislarse ventajosamente de riñón, placenta o células tumorales. Generalmente no deben usarse depósitos de células como fuente de dichos receptores. Los depósitos de células pueden, sin embargo, usarse como fuente de receptores de haptocorrina.

Un fracción de membrana enriquecida en receptor de TC II puede obtenerse como se describe por Seligman et al., J. Biol Chem 253: 1766-1772 (1978) y Nexo et al., Biochem Biophys Act 628: 190-200 (1980). Esencialmente, se corta tejido, por ejemplo placenta humana o hígado de conejo, en pequeños trozos y se homogeneizan en tampón tris, pH 7,4 que contiene NaCl 0,15 M y EDTA 10 mM, seguido por centrifugación a 25.000 x g durante 30 minutos. Para retirar la sangre residual se repite la homogeneización/centrifugación al menos una vez. Esta fracción de membrana se extrae adicionalmente con detergente, por ejemplo, Ammonyx-LO, Triton X-100 o Chapso, y se aclara por centrifugación a 100.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se usa como fuente para el receptor de TC-II.

Un ejemplo de una molécula receptora adecuada que se une preferentemente al complejo holo-TC II es la glicoproteína de cadena sencilla de 62 kDa que existe como homodímero no covalente y se encuentra en la superficie celular de todos los tejidos (Rothenberg & Quadros (1996) Balliere's Clinical Haematology 8 (3) 499-514; documento WO 96/085150). Una proteína adicional adecuada para su uso en el método de ensayo de la invención es gp300, una proteína de membrana que media la endocitosis de 600 kDa que se expresa en células de epitelio de absorción por ejemplo, células del túbulo proximal renal como se describe por Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science 93: 8612-8617). Este receptor es un receptor LDL y se une a las formas tanto apo como holo de TC II.

Cuando se usa un receptor de superficie celular, puede inmovilizarse por conjugación con una superficie, por ejemplo, de una perla o lámina, o como alternativa una fracción de membrana celular que contiene los receptores puede formarse en vesículas o láminas que presentan los receptores.

Cuando se inmoviliza el ligando, esto puede ser por ejemplo en la superficie de un sólido, por ejemplo una película o lámina de filtro o la luz de un tubo, sin embargo, la inmovilización en partículas, por ejemplo, microesferas tales como las producidas por Dyno Industrier ASA, Noruega, es especialmente preferida. Dichas partículas pueden ser porosas o no porosas y si se desea pueden estar provistas de un medio que posibilite que se recojan, por ejemplo, por inclusión con las partículas de material magnéticamente sensible, por ejemplo cristales de óxido de hierro supermagnéticos. Dichas microperlas magnéticamente sensibles están disponibles en Dyno Industrier ASA así como de Dynal AS, Noruega, Bang Particles, USA y Prolabo, Francia. Cuando el ligando tiene que ser inmovilizable en oposición a inmovilizado, esto puede conseguirse acoplando el ligando a un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, biotina/estreptavidina) y usando el otro miembro del par de unión, opcionalmente unido a un sustrato, para aglomerar o inmovilizar de otro modo el ligando o los complejos ligando:TC II o ligando:holo-TC II, antes de la separación de la fracción unida a ligando de la fracción no unida en la realización del método de la invención.

En la técnica se sabe bien inmovilizar moléculas de afinidad por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo para propósitos de separación, por ejemplo uniendo o acoplando los ligandos, opcionalmente mediante un enlazador, a cualquiera de los soportes sólidos o matrices bien conocidos que actualmente están ampliamente usados o propuestos para la separación o inmovilización en columnas y podría usarse cualquier método conocido en la técnica. Dichas fases sólidas pueden tener la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, fibras o capilares o tiras de microtitulación, tubos o placas de pocillos etc. y convenientemente pueden estar fabricados de vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Las técnicas para unir el ligando al soporte sólido también son extremadamente bien conocidas y están ampliamente descritas en la bibliografía.

Acoplar el ligando a un sustrato o a un miembro de un par de unión específica puede conseguirse usando técnicas convencionales.

El método de la invención, si el ensayo se realiza como un ensayo de unión competitiva, generalmente implicará la adición a la muestra de un compuesto marcado que compite por la unión al ligando. Generalmente, se preferirá usar holo-TC II marcada en este aspecto. El marcador usado puede ser cualquier marcador que pueda determinarse directa o indirectamente, por ejemplo, un cromóforo (usando dicho término para incluir fluoróforos), un radiomarcador (generalmente unido covalentemente o unido a un quelato), una enzima o sustrato enzimático, un marcador magnético, etc.

En una realización preferida, el método de la presente invención implica poner en contacto un ligando de unión a TC II u holo-TC II inmovilizado o inmovilizable con la muestra en investigación; separar una fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando; disociar la cobalamina unida de las moléculas de holo-TC II en la fracción unida y determinar la concentración de cobalamina liberada, estando la disociación afectada de modo que la concentración de cobalamina liberada es al menos 3 veces, preferiblemente 5 veces e incluso más preferiblemente 10 veces mayor que las concentraciones de holo-TC II en la muestra inicial, y opcionalmente, evaluar adicionalmente el contenido de folato de dicha muestra.

La esencia de este aspecto de la invención es la separación y concentración de TC II u holo-TC II que permite que se empleen de forma útil métodos convencionales de determinación de cobalamina en el método. Como se ha indicado anteriormente, en ausencia de dicha etapa de concentración, los métodos del estado de la técnica no son adecuados para la determinación de cobalamina ya que existe a dicha concentración baja. Puede usarse cualquier medio apropiado para liberar la cobalamina de holo-TC II pero puede usarse convenientemente calor o un cambio del pH del medio circundante en este aspecto. Las diferentes formas de cobalamina pueden convertirse en una cianocobalamina menos sensible a la luz por tratamiento con KCN. Puede emplearse cualquier medio adecuado para la determinación de cobalamina en el método de la invención, por ejemplo, un ensayo de competición realizado poniendo en contacto un compañero de unión inmovilizado para la cobalamina con la cobalamina disociada de la muestra en presencia de ligando marcado que compite con la cobalamina aislada por la unión a los compañeros de unión inmovilizados. Sería apropiado, por ejemplo, un método descrito por Kuemmerk et al. (1992) Clin. Chem 38: 2073-2077. Un medio alternativo para determinar la cobalamina libre se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5451508 e implica una técnica de inmunoensayo.

En esta realización de la invención se prefiere que los ligandos de unión se inmovilicen y se unan tanto a holo como apo-TC II.

En una realización alternativa preferida, el método de ensayo de la presente invención comprende poner en contacto un soporte sólido que tenga inmovilizado en el mismo un ligando de unión a TC II u holo-TC II, con la muestra en investigación y también con un ligando no inmovilizado, en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse a TC II u holo-TC II, a dicho ligando no inmovilizado o a complejos de dicha TC II u holo-TC II y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse a al menos uno de dicho ligando inmovilizado, TC II u holo-TC II y complejos de dicho ligando inmovilizado y TC II u holo-TCII; en el que si dicho método de ensayo es un ensayo tipo sándwich, al menos uno de dichos ligandos es específico para holo-TC II y si dicho ensayo es un ensayo de competición dicho ligando inmovilizado es específico para holo-TC II y competidores de la misma; por el que la proporción de dicho ligando inmovilizado unido por TC II u holo TC II, por dicho ligando no inmovilizado o por complejos de dicho ligando no inmovilizado y TC II u holo-TC II es dependiente de la cantidad de holo-TC II presente en dicha muestra, y, dicho ligando no inmovilizado es capaz de generar una señal detectable directa o indirectamente cuando está unido o cuando no está unido; separar una fracción unida de una fracción no unida; y determinar directa o indirectamente el ligando no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (la fracción unida) o no unido y en solución (la fracción no unida); donde poner en contacto la muestra y dicho ligando no inmovilizado con el soporte sólido puede realizarse por separado, simultáneamente o secuencialmente, y si se realiza por separado o secuencialmente, pueden ponerse en contacto en cualquier orden.

Por lo tanto, en esencia, la realización preferida alternativa del método de la invención implica determinar el ligando no inmovilizado que se ha unido directamente o indirectamente o como alternativa no ha logrado unirse directa o indirectamente al ligando inmovilizado. Cuando el ligando no inmovilizado compite por la unión al ligando inmovilizado con la holo-TC II, un elevado nivel de ligando no inmovilizado no unido es indicativo de una elevada concentración de holo-TC II en la muestra y un bajo nivel de ligando no inmovilizado no unido es indicativo de una baja concentración de holo-TC II en la muestra. Cuando el ligando no inmovilizado se une a la TC II u holo-TC II que está unida a su vez al ligando inmovilizado, entonces un elevado nivel de ligando no inmovilizado unido es indicativo de una elevada concentración de holo-TC II en la muestra y un bajo nivel de ligando no inmovilizado unido es indicativo de una baja concentración de holo-TC II en la muestra.

En el método de la presente invención, por lo tanto, la combinación metabólicamente activa de cobalamina se determina midiendo el complejo holo-TC II o midiendo la cantidad de cobalamina unida a moléculas TC II, presentes en una muestra corporal que contiene una mezcla de apo y holo-TC II y apo y holo-HC (haptocorrina o TC I y III). La determinación del contenido de folato de la muestra puede realizarse simultánea o secuencialmente.

Puede realizarse una etapa de separación preliminar usando cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las formas apo tanto de TC II como haptocorrina (HC). En dicha etapa preliminar, las formas apo de las proteínas TC II y HC se unen por la cobalamina inmovilizada, análogo o fragmento de la misma y se separan de los complejos holo-TC II y holo-HC.

En este caso, el análisis de las formas holo separadas de TC II después tiene lugar de acuerdo con cualquier realización de la invención como se ha descrito anteriormente pero claramente es más útil cuando la determinación del complejo holo-TC II tiene lugar por algo diferente a disociación del complejo y posterior determinación de la cobalamina liberada. Será evidente para los especialistas en la técnica que si dicha etapa preliminar precede a la realización precedida alternativa mencionada anteriormente, el requisito de al menos un ligando en un ensayo tipo sándwich para que sea específico para holo-TC II en oposición a TC II y el requisito del ligando inmovilizado en un ensayo de competición para que sea específico para holo-TC II y competidores de la misma en oposición a TC II ya no es relevante ya que la forma apo de TC II se ha capturado y ya no está disponible. Por tanto, los ligandos inmovilizados o no inmovilizados pueden ser específicos para holo-TC II o TC II o competidores de las mismas.

La cobalamina inmovilizada no debe mostrar ninguna tendencia significativa a llegar a disociarse de su soporte ya que esto podría provocar la unión a apo-TC II y la transformación de la misma en holo-TC II. La cobalamina biotinilada se une de un modo muy estable a una superficie sólida con avidina/estreptavidina unida al mismo, y la unión de cobalamina a un soporte de este modo es conveniente para la realización de esta etapa. De hecho, cuando se usa cobalamina biotinilada, puede añadirse a la muestra en análisis de una forma no inmovilizada cuando se une a las formas apo de TC II y HC. La muestra puede después ponerse en contacto con una superficie sólida que tenga un compañero de unión para la biotina, por ejemplo, avidina, inmovilizada en la misma. Después se forma un complejo de avidina-cobalamina biotinilada-TC II que puede aislarse fácilmente de la muestra.

En una realización de la invención en la que esta etapa de separación preliminar ha tenido lugar, la combinación de holo-TC II se determina posteriormente poniendo en contacto la muestra con un ligando de TC II inmovilizado que captura el complejo de holo-TC II que deja la haptocorrina en solución y después poniendo en contacto la holo-TC II inmovilizada con un segundo ligando de TC II que está marcado y por tanto es detectable. Los ejemplos de ligandos de unión a TC II adecuados serían anticuerpos monoclonales no solapantes o de hecho un anticuerpo policlonal específico para TC II sería adecuado en esta realización tanto para la captura como la detección ya que se reconocen diferentes epítopos en las moléculas TC II.

En otra realización de la invención en la que esta etapa de separación preliminar ha tenido lugar, las moléculas holo-TC II compiten con el ligando no inmovilizado marcado por la unión al ligando inmovilizado para el mismo y se calcula la cantidad de holo-TC II en relación con la cantidad de ligando no inmovilizado marcado unido o no unido al ligando inmovilizado.

En una realización preferida, en la etapa de separación preliminar, la unión de apo-TC II y apo HC a cobalamina, análogos o fragmentos de la misma tiene lugar en un sitio o de un modo tal que inhibe el reconocimiento posterior y unión a la TC II unida a cobalamina inmovilizada por el ligando no inmovilizado o compañero de unión para TC II. En esta realización no hay necesidad de aislar la holo-TC II y holo-HC de las formas apo unidas antes de realizar el ensayo de la invención. En esta realización, el sitio frente al que se dirige el compañero o ligando de unión no inmovilizado es muy importante y debe ser un epítopo en TC II que llegue a enmascararse o cubrirse o quedar no disponible de otro modo para la unión cuando la apo-TC II y apo-HC llega a inmovilizarse en la cobalamina, análogo o fragmento de la misma.

Si la etapa de separación inicial implica usar un ligando de unión para TC II o está precedida por una etapa preliminar que usa cobalamina inmovilizada, análogos o fragmentos de la misma, la separación total, es decir, la separación de todas las proteínas apo y holo-TC II, de la muestra, no es un requisito del método y es suficiente que se separe una fracción de la muestra que comprenda al menos una parte del "subconjunto TC II de proteínas" deseado.

Por tanto, en ciertas realizaciones, los compañeros de unión o ligandos y las condiciones de unión pueden seleccionarse para conseguir la separación de sustancialmente todo el "subconjunto" seleccionado. En este caso, la fracción no unida puede considerarse como sustancialmente libre de proteínas TC II u holo-TC II, es decir, como al menos el 80%, 90% o 95% libre de TC II u holo-TC II dependiendo de qué componente se seleccione como base de fraccionamiento.

En realizaciones alternativas, el compañero de unión y las condiciones pueden seleccionarse de modo que solamente una parte de las proteínas TC II en la muestra se separen en una fracción. En este caso, debe tenerse en cuenta la separación parcial para construir una curva de calibrado convencional para el ensayo. En este aspecto, la generación de una curva de calibrado convencional frente a la que pueda determinarse la concentración de la holo-TC II detectada usa técnicas convencionales bien conocidas en la técnica.

Por tanto, si en una etapa de fraccionamiento, se usa un ligando de unión a TC II, al menos una parte de la cobalamina unida a TC II se localizará en la fracción unida y cualquier cobalamina en la muestra unida a moléculas diferentes a TC II, por ejemplo, HC o albúmina estará en la no unida (es decir, fracción o fracciones no separadas). La TC II en la fracción unida puede estar en forma apo y holo y puede estar complejada por sustancias de tipo cobalamina o análogos además de cobalamina.

Si se desea, el método de la invención puede implicar una etapa de separación preliminar adicional en la que se ponga en contacto la muestra con un ligando de unión específica inmovilizado o inmovilizable para haptocorrina (en formas apo y holo o solamente en forma holo). De este modo puede reducirse cualquiera contribución a los errores en la determinación de cobalamina unida a TC II que derive de holo-HC y pueden usarse ligandos de unión específica para TC II u holo-TC II que tienen alguna afinidad de unión por haptocorrinas.

De otro modo, como se ha indicado anteriormente, como la concentración sérica de TC II en forma tanto apo como holo es muy baja, los ligandos o compañeros de unión de especificidad y afinidad particularmente elevadas son necesarios para el funcionamiento de la invención. Además, las constantes de afinidad necesarias de los ligandos de la presente invención dependen de si el ligando es específico para TC II u holo-TC II y también su utilización como un ligando de captura o detección, ya que la concentración sérica de TC II es aproximadamente 0,5-1 nM pero la concentración de holo-TC II es solamente 35-160 pM. Por tanto, para un ligando de captura de TC II es deseable una constante de afinidad de al menos 10^{9} M^{-1}, preferiblemente mayor de 2 x 10^{9} M^{-1} y más preferiblemente 10^{10} M^{-1}. Para un ligando de captura de holo-TC II, es deseable una constante de afinidad de al menos 10^{10} M^{-1}, preferiblemente 2 x 10^{10} M^{-1}, más preferiblemente mayor que 2 x 10^{10} M^{-1} y mucho más preferiblemente mayor que 10^{11} M^{-1}. Claramente, la constante de afinidad necesaria de un aglutinante de detección puede ser menor que la del ligando de captura debido al efecto de concentración del ensayo.

El grado de reactividad cruzada de un ligando de unión a holo-TC II o TC II con HC debe ser preferiblemente menor del 1%, más preferiblemente entre el 0,1 y el 1% y mucho más preferiblemente menor del 0,1%. De forma similar, un ligando de unión a holo-TC II debe preferiblemente no mostrar un grado de reactividad cruzada con apo-TC II en exceso del 1%, más preferiblemente entre el 0,1% y el 1% y mucho más preferiblemente la reactividad cruzada debe ser menor del 0,1%.

Usando dichos ligandos de elevada afinidad su función se prolonga más allá de ser simplemente ligandos de captura y/o detección y juegan un papel vital para ser capaces de separar y concentrar la proteína TC II de la muestra para el análisis. Los ligandos de unión para TC II u holo TC II deben preferiblemente concentrar el ligando en al menos 3 veces, más preferiblemente 5 veces, e incluso más preferiblemente en al menos 10 veces.

En una realización adicional de la técnica de ensayo más semejante a un ensayo de desplazamiento que un ensayo de competición, la muestra que comprende el complejo holo-TC II se pone en contacto con una fase sólida a la que se une un ligando marcado que reconoce los mismos sitios de unión en los ligandos inmovilizados que holo-TC II. La holo-TC II en la muestra compite con el ligando marcado unido por los sitios de modo que después del equilibrado del sistema, existe una relación directamente proporcional entre la cantidad del ligando marcado desplazado del soporte sólido y detectable en solución y la cantidad de holo-TC II presente en la muestra original. El ligando marcado puede detectarse directa o indirectamente y puede determinarse como la cantidad de ligando marcado unido o no unido al soporte sólido según sea apropiado. En efecto, en esta realización, el ligando no inmovilizado mencionado anteriormente se une al ligando inmovilizado antes de la aplicación de la muestra pero dicha unión no debe interpretarse como si significara que el ligando está inmovilizado de cualquier modo.

Una realización preferida adicional implica poner en contacto una muestra que contiene holo-TC II con un soporte sólido que tiene holo-TC II inmovilizada en el mismo y un aglutinante específico de holo-TC II no inmovilizado, marcado. La holo-TC II libre en la muestra y la holo-TC II inmovilizada compiten por la unión con el ligando no inmovilizado marcado y la determinación del ligando marcado unido a la fase sólida o que permanece en solución permite el cálculo de la concentración de holo-TC II. En una realización particularmente preferida de la presente invención el ligando de unión a holo-TC II no inmovilizado, marcado es un anticuerpo.

En otra realización más, la muestra que comprende el analito de interés se pone en contacto con holo-TC II marcada y ligando inmovilizado. La holo-TC II marcada y no marcada compite por la unión al ligando inmovilizado y después de que se alcance el equilibrio, la cantidad de holo-TC II marcada unida al ligando inmovilizado es indirectamente proporcional a la cantidad de holo-TC II en la muestra de interés. De nuevo, la holo-TC II marcada puede detectarse directa o indirectamente y puede determinarse como la cantidad de holo-TC II marcada unida o no unida en soporte sólido según sea apropiado.

En una realización adicional de la presente invención, se pone en contacto un ligando no inmovilizado pero inmovilizable específico para el complejo holo-TC II (por ejemplo, un ligando conjugado a biotina u otro miembro de un par de unión específica) con la muestra para formar un complejo de holo-TC II/ligando no inmovilizado. El complejo de ligando/holo-TC II después puede precipitarse de la solución usando un medio conocido y puede aislarse para el análisis.

En otra realización más de la invención, se añaden dos compañeros de unión marcados a la muestra, opcionalmente después de una etapa preliminar tal como eliminación de la muestra de las formas apo de TC II y HC. Los compañeros de unión en este caso son holo-TC II marcada o un análogo o fragmento de la misma y un compañero de unión marcado para la misma, por ejemplo un anticuerpo marcado. En esta realización se genera una señal detectable solamente de los marcadores cuando están en cercana proximidad entre sí, es decir, cuando los dos compañeros de unión marcados llegan a unirse entre sí. Por tanto, además de la muestra, el compañero de unión marcado para holo-TC II puede unirse a holo-TC II no marcada presente en la muestra en cuyo caso no se genera señal detectable o a holo-TC II marcada o un análogo, fragmento o variante de la misma que se une a compañero de unión a TC II marcado, en cuyo caso se genera una señal detectable.

Los agentes de marcaje tales como los de ensayos de proximidad de centelleo Amersham como se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4568649 son adecuados para la incorporación en dicha realización y la elevada sensibilidad de este procedimiento es muy adecuada para un ensayo en el que existe analito en dicha baja concentración. Por tanto, por ejemplo, un miembro del par de unión podría marcarse con un núclido de emisión \beta tal como I^{125} o H^{3} y el otro miembro se marca con una molécula de centelleo adecuada. La partícula de emisión \beta pierde su energía en su entorno acuoso a menos que el agente de centelleo esté en 1,5 \mum y por tanto requiere que ambos compañeros marcados estén unidos entre sí para que una señal sea detectable. La probabilidad de que dos compañeros marcados se unan entre sí se determina por la concentración de holo-TC II presente en la muestra de modo que cuanto mayor sea la señal generada, menor será la concentración de holo-TC II en la muestra.

Para todas las realizaciones de la invención, el contenido de folato de la muestra puede medirse simultánea o secuencialmente a la determinación del contenido de holo-TC II. El método preferido para ensayar el folato es como se ha descrito anteriormente en este documento.

Como se usa en este documento, las expresiones "determinación" o "evaluación" incluyen la cuantificación en el sentido de obtener un valor absoluto para la cantidad o concentración de holo-TC II o cobalamina unida a TC II o folato en la muestra, y también evaluaciones o determinaciones semi-cuantitativas y cualitativas. Puede obtenerse un índice, proporción, porcentaje o indicación similar del nivel o cantidad de cobalamina unida a TC II, por ejemplo con relación a la cobalamina total.

La muestra corporal usada en el método de ensayo de la invención puede ser cualquier muestra que contenga cobalamina y/o folato, por ejemplo, un fluido corporal o muestra tisular, o una suspensión, etc. Preferiblemente, sin embargo, la muestra será un fluido corporal, por ejemplo, fluido seminal, fluido céfalo-raquídeo o fluido amniótico, pero generalmente será una muestra obtenida de sangre. Cuando éste es el caso, como la muestra usada para el análisis está preferiblemente libre de células, puede usarse suero o plasma. La muestra puede tratarse antes de usarse en el método de ensayo de la invención, por ejemplo puede diluirse añadiendo un tampón u otro medio acuoso y puede almacenarse o conservarse por ejemplo por enfriamiento o congelación antes del análisis.

En la práctica de la invención, cuando se separa una fracción unida de una fracción no unida esto puede realizarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, precipitación, centrifugación, filtración, uso de partículas magnetizables, métodos cromatográficos, etc.

Para evitar toda duda, el término "cobalamina" se usa en este documento como sinónimo de "vitamina B_{12}" e incluye todas las formas de vitamina B_{12} (cianocobalamina; 5-6-dimetil-bencimidazolil cianocobamida; metilcobalamina; 5'-desoxiadenosilcobalamina) que puedan existir y estar metabólicamente activas (cuando se presentan apropiadamente) en el cuerpo.

Como se ha indicado anteriormente, en el método de la invención, la determinación de la cobalamina unida a TC puede realizarse detectando un ligando unido a la holo-TC II separada, o realizando un ensayo de competición usando un competidor marcado para holo-TC II por lo que la holo-TC II compite con el competidor marcado por la unión a un ligando de unión para el mismo, o detectando la cobalamina liberada de la holo-TC II separada. El método de la invención comprende adicionalmente la determinación simultánea o secuencial del contenido de folato.

El ligando detectable puede marcarse convenientemente por cualquier medio convencional, por ejemplo con un marcador que forma señales que puede determinarse por ejemplo por luminiscencia, quimioluminiscencia, evaluación colorimétrica, fluorescencia, radiactividad o por actividad enzimática. De hecho, puede usarse cualquier marcador que forme señales conocido en la técnica en el método de la invención.

Solamente a modo de ejemplo, algunos ejemplos adecuados de compuestos coloreados o fluorescentes que pueden usarse para marcar un ligando de unión de forma detectable en la presente invención son antraquinonas, colorantes azo, colorantes azina, tales como oxazinas y tiazinas, triazinas, pigmentos de origen natural tales como porfirinas, ficobiliproteínas, incluyendo ficoeritinas y ficocuaninas, clorofilas y sus análogos y derivados, carotenoides, acrinidinas, xantenos incluyendo fluoresceínas y rodaminas, colorantes índigo, tioxantenos, cumarinas, polimetinas incluyendo di y triarilmetinas y derivados de las mismas de ftalocianinas y ftalocianinas metálicas.

De forma similar, puede usarse un amplio intervalo de compuestos radiactivos como parte marcadora que forma señales del reactivo usado en esta invención, entre ellos compuestos marcados con Yodo-125, y compuestos marcados con cobalto 57.

Como alternativa, los ligandos de unión pueden conjugarse con compuestos naturales o sintéticos que pueden producir una señal quimioluminiscente que puede ensayarse de un modo conocido (Cormier, M.J. et al.; Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973). Los compuestos quimioluminiscentes adecuados incluyen luciferina, ésteres oxálicos, 1,2-dioxetano, luminol o derivados del mismo, pero no se limitan a estos. Si es apropiado, puede usarse peróxido de hidrógeno, enzimas por ejemplo luciferasa, u otros compuestos químicos para producir la señal quimioluminiscente de las moléculas productoras de señales usadas.

Las moléculas que forman señales fuertemente aniónicas pueden no preferirse para su uso en el método de la invención, ya que tienen tendencia a unirse a proteínas séricas tales como albúmina sérica humana (HSA) que puede estar presente en la muestra. Los ejemplos particularmente adecuados que pueden usarse son isotiocianato de fluoresceína, Rodamina B o N-hidroxisuccinimida-éster del ácido N-(resorufin-4-carbonil)piperidina-4-carboxílico o resos.

De acuerdo con una realización del método de la invención, puede separarse una fracción que comprende al menos una parte de la TC II y/o folato de una muestra de fluido corporal haciendo reaccionar el fluido corporal con un ligando de unión específica para TC II y después separando la fracción unida a TC II del resto de la muestra, aislando de este modo y concentrando el analito diana en el mismo. En una realización de la invención, puede usarse un ligando de unión detectable dirigido contra holo-TC II para determinar el complejo TC II-cobalamina presente en la fracción unida separada. El ligando de unión a holo-TC II puede ponerse en contacto con la muestra en investigación antes de, simultáneamente con o después del contacto con el ligando de unión a TC II y antes o después de la separación de la fracción unida a TC II del resto de la muestra.

Por consiguiente, puede separarse una fracción que contiene cobalamina (por ejemplo, que comprende holo-TC II y holo-HC) del resto de la muestra haciendo reaccionar el fluido corporal en investigación con una cobalamina inmovilizada o unida o un análogo o fragmento de la misma que se una a apo-TC II y apo-HC y separando de la fracción unido el resto de la muestra que comprende holo-TC II y holo-HC. Después puede usarse un ligando de unión a TC II detectable para detectar el complejo TC II-cobalamina presente en la fracción separada. El ligando de unión a TC II detectable puede ponerse en contacto con la muestra en estudio antes de, simultáneamente con o después del contacto con la cobalamina unida y antes o después de la separación de la fracción unida del resto de la muestra.

En algunas realizaciones, pueden disponerse ligandos inmovilizados para uno o los otros componentes de los complejos apo y/u holo-TC II/HC en una columna. El fluido corporal que contiene el complejo de TC II y cobalamina puede aplicarse a la columna y ponerse en contacto con el ligando o ligandos de unión.

La columna puede lavarse abundantemente a su través o lavarse y usarse un eluyente para permitir, si fuera necesario, la liberación de una fracción unida de la columna y facilitar su recogida. Si los contenidos de la fracción no unida están o también tienen que analizarse con respecto a otros constituyentes, la columna debe lavarse con un tampón o medio administrado usando una micropipeta calibrada para asegurar que se administra y recoge un volumen conocido preciso. El volumen administrado es preferiblemente en el 3% del volumen deseado (es decir, calibración), más preferiblemente en el 1 ó 2%. Asimismo, si la fracción a analizar tiene que liberarse de la columna antes de la detección, el eluyente usado para liberar el complejo debe administrarse usando una micropipeta calibrada.

En una realización alternativa, los ligandos de unión usados para separar una fracción de una muestra pueden inmovilizarse en un soporte en fase sólida particulado, por ejemplo perlas de látex o polímero. Para ayudar a la manipulación y separación, pueden usarse perlas magnéticas y de hecho esta es una realización preferida de la presente invención. El término "magnético" como se usa en este documento significa que el soporte es capaz de tener un momento magnético ejercido al mismo cuando se coloca en un campo magnético. En otras palabras, puede retirarse fácilmente un soporte que comprende partículas magnéticas por agregación magnética, que proporciona un modo rápido, simple y eficaz de separar las fracciones después de la unión de ligando.

Por tanto, usando el método de la invención, las partículas magnéticas con el complejo de TC II-cobalamina unido pueden retirarse en una superficie adecuada por aplicación de un campo magnético, por ejemplo, usando un imán permanente. Habitualmente es suficiente aplicar un imán al lateral del recipiente que contiene la mezcla de muestra para causar que las partículas se congreguen en la pared del recipiente y aislarlas de este modo para el análisis adicional.

Se prefieren especialmente partículas superparamagnéticas por ejemplo las descritas por Sintef en el documento EP-A-106873, ya que puede evitarse la agregación magnética y el agrupamiento de las partículas durante la reacción. Las perlas magnéticas bien conocidas fabricadas por Bang Particles (US) pueden ser particularmente adecuadas para su uso en la presente invención.

En general, más allá de la muestra en evaluación, las muestras de calibrado con un contenido de complejo holo-TC II conocido y un contenido de folato conocido también se evaluará en la realización del método de ensayo de la invención. Dichas determinaciones pueden usarse para representar una curva de calibrado de la que puede determinarse el contenido de cobalamina unida a TC II y/o folato de la muestra en investigación. La naturaleza de las muestras de calibrado y la selección de los factores de conversión o ajuste usados en la determinación del complejo holo-TC II y/o folato pueden variar dependiendo, por ejemplo, de los ligandos particulares usados en las etapas de unión y separación del ensayo y otros aspectos del método que afectan a la unión y separación de la muestra, por ejemplo, composición de tampón, condiciones de ensayo, etc. Típicamente se usarán muestras de calibrado que tienen contenidos de holo-TC II de 0 a 300 pmol/l. El intervalo de referencia en el que generalmente se encontrará el valor para cobalamina unida a TC II es de 30 a 160 pmol/l.

Típicamente se usarán muestras de calibrado que tienen el intervalo de folato de 0 a 45 nM.

El patrón de calibrado de holo-TC II típicamente puede ser holo-TC II nativa o recombinante humana. El uso de holo-TC II como calibrador en ensayos de holo-TC II es nuevo y forma un aspecto adicional de la invención.

Aunque la evaluación de los niveles de holo-TC II da una medida precisa de cualquier desequilibrio de cobalamina en el cuerpo en el momento del muestreo, se ha descubierto adicionalmente que la medida de los niveles de cobalamina total, particularmente niveles de cobalamina sérica total en combinación con la evaluación de holo-TC II puede dar una indicación valiosa del desequilibrio de cobalamina en un período más largo. Dicha medida de los niveles de holo-TC II y de los niveles de cobalamina sérica total puede combinarse opcionalmente con la medida de los niveles de folato y preferiblemente se combina de este modo.

El método de ensayo de la invención determina la combinación metabólicamente activa de cobalamina determinando el complejo de holo-TC II o aislando el complejo de holo-TC II y después determinando la cobalamina asociada con la misma y por tanto proporciona un método adecuado para la determinación de deficiencia de cobalamina antes o después de la aparición de manifestaciones clínicas de deficiencia de cobalamina. El método de la invención incluye la medida simultánea o secuencial de niveles de folato. El método de ensayo puede usarse ventajosamente antes de la aparición de los síntomas ya que tiene un valor predictivo preciso del equilibrio negativo de cobalamina y/o folato. El método puede incluir opcionalmente la medida de los niveles de cobalamina total para evaluar el período sobre el que ha existido una deficiencia o desequilibrio de cobalamina.

La presente invención se ilustrará ahora por los siguientes Ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos en los que:

la Figura 1 es una curva patrón para holo-TC II;

la Figura 2 es una representación que muestra la relación entre la concentración de cobalamina sérica total y holo-TC II;

la Figura 3 es una representación que muestra la relación entre la concentración de cobalamina sérica total y holo-HC; y

la Figura 4 es una representación que muestra los niveles de apo-TC II, haptocorrina y cobalamina libre en suero humano antes y después del tratamiento con microesferas magnetizables recubiertas con cobalamina.

Ejemplo 1

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para TC II en partículas magnetizables. Se deja que una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclado con un volumen igual de PBS reaccione durante 15 minutos con un exceso del anticuerpo inmovilizado y un exceso de un anticuerpo anti-holo-TC II no solapante (por ejemplo un anticuerpo monoclonal) radiomarcado con I^{125}. Las partículas magnetizables se sedimentan usando un imán fuerte, se retira el sobrenadante, y se lavan las partículas con PBS.

Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II de la muestra por interpolación en una curva patrón.

Ejemplo 2

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para TC II en partículas magnetizables. Se deja que una alícuota de suero (600 \mul) mezclado con un volumen igual de PBS reaccione con el anticuerpo durante 30 minutos. Se sedimentan las partículas magnetizables usando un imán fuerte y se retira el sobrenadante. Se lavan las partículas una vez con PBS y posteriormente se tratan con hidróxido sódico (0,3 M) que contiene cianuro potásico (100 \muM), ditiotreitol (15 mM), y una cantidad fija de cianocobalamina radiomarcada con I^{125} o Co^{57} en un volumen total de 100 \mul durante 15 minutos, para liberar la cobalamina unida a la holo-TC II inmovilizada y al mismo tiempo convertir todas las formas de cobalamina en cianocobalamina y mezclarlas con una cantidad fija de cianocobalamina marcada. Se añade una cantidad limitada de Factor Intrínseco en 100 \mul de tampón borato y se deja reaccionar durante 10 minutos. Las partículas magnetizables se sedimentan por un imán fuerte y se retiran 150 \mul del sobrenadante para medir la radiactividad. Se determina la concentración de cobalamina unida a TC II en la muestra sérica a partir de una curva patrón.

Como alternativa, puede medirse la cobalamina liberada usando el método IMx de Abbot o métodos similares.

Ejemplo 3

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para holo-TC II en partículas magnetizables. A una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclado con un volumen igual de PBS se añade una cantidad fija de holo-TC II marcada con I^{125} y una cantidad limitada del anticuerpo anti-holo-TC II inmovilizado. Después de incubación durante 15 minutos se sedimentan las partículas magnetizables usando un imán fuerte. Las partículas se lavan con PBS, y se mide la radiactividad. Se determina la concentración de holo-TC II a partir de una curva patrón.

Ejemplo 4

Se inmoviliza holo-TC II recombinante en partículas magnetizables. A una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclado con un volumen igual de PBS se añade una cantidad fija de holo-TC II inmovilizada y un exceso de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal) específico para holo-TC II y radiomarcado con I^{125}. Después de 15 minutos de incubación se sedimentan las partículas usando un imán fuerte. Las partículas se lavan con PBS, y se mide la radiactividad. Se determina la concentración de holo-TC II a partir de una curva patrón.

Ejemplo 5

A una alícuota de suero (100-500 \mul) se añade un exceso de cobalamina biotinilada, para unir toda la apo-TC II y apo-HC. Después de incubación durante 10 minutos, se trata la muestra de suero con partículas magnéticas recubiertas con avidina durante 10 minutos. Las partículas se sedimentan usando un imán fuerte. El sobrenadante se recupera y se mezcla con dos anticuerpos anti-TC II monoclonales no solapantes, uno radiomarcado con I^{125} y el otro con biotina conjugada. Después de 10 minutos se añaden partículas magnetizables recubiertas con avidina y se dejan unir a los aductos biotinilados durante 10 minutos. Posteriormente, se sedimentan las partículas con un imán fuerte y se lavan con PBS. Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II por interpolación en una curva patrón.

Ejemplo 6

Igual que el Ejemplo 5, pero el suero sin apo-TC II se mezcla con una cantidad fija de holo-TC II marcada con I^{125} y una cantidad limitada de anticuerpo anti-TC II inmovilizado en partículas magnetizables. Después de incubación durante 15 minutos se sedimentan las partículas usando un imán fuerte.

Las partículas se lavan con PBS y se mide la radiactividad.

Ejemplo 7

Se inmoviliza cobalamina o análogos de cobalamina en microesferas magnetizables, por ejemplo, por acoplamiento covalente o usando acoplamiento de biotina-(Estrept)avidina (por ejemplo, Pathare et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 217-232). Típicamente, se incuban microesferas magnetizables recubiertas con Estreptavidina con cobalamina biotinilada 1 \muM durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Las perlas se sedimentan usando un imán, se lavan dos veces con PBS y se resuspenden al 1% en PBS + 5 mg/ml de HSA. A una alícuota de suero (10-100 \mul) se añade de uno a cinco volúmenes de PBS y 1/10 del volumen de microesferas magnetizables recubiertas con cobalamina. La mezcla se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad para unir toda la apo-TC II y apo-HC. Las partículas se sedimentan por imán y se recupera el sobrenadante. (La Figura 4 representa dos cromatogramas de suero humano antes y después de tratamiento con microesferas magnetizables recubiertas con cobalamina. Casi toda la apo-TC II se retira por el tratamiento). El sobrenadante se mezcla con dos anticuerpos anti-TC II humana, dos anticuerpos anti-TC II humana monoclonales no solapantes o con un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal o menos preferentemente dos anticuerpos policlonales, uno marcado (por ejemplo, ^{125}I) y el otro conjugado con biotina. Después de 10 minutos se añaden microesferas magnetizables recubiertas con (Estrept)avidina y se dejan unir los aductos biotinilados durante 10 minutos. Posteriormente, se sedimentan las partículas con un imán y se lavan con PBS enfriado en hielo. Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II por interpolación en una curva patrón, preparada añadiendo una cantidad conocida de TC II a tampón o suero.

Ejemplo 8

Igual que el Ejemplo 7 pero se añade exceso de cobalamina biotinilada directamente a la muestra sérica + PBS, para unir toda la apo-TC II y apo-HC. Después de incubación durante 10 minutos, se trata la muestra de suero con microesferas magnetizables recubiertas con (Estrept)avidina durante 30 minutos a temperatura ambiente, en oscuridad.

Ejemplo 9

Se inmovilizó anticuerpo de conejo específico para TC II humana y con una constante de unión aparente >5 x 10^{9} M^{-1} en microesferas magnetizables de 1 \mum recubiertas con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (Indica Diagnostics). Se mezclaron muestras de suero de 400 \mul cada una de 49 voluntarios sanos con un volumen igual de PBS y 40 \mul del anticuerpo movilizado (1%). Las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente en oscuridad durante 1 hora y después se sedimentaron las microesferas usando un imán. Los precipitados se lavaron una vez con tampón de lavado enfriado en hielo (PBS más Tween 20 al 0,02%) y posteriormente se resuspendieron en 50 \mul de ditiotreitol 50 mM, cianuro potásico al 0,001%, y una cantidad fija de 57Co-CN-Cobalamina (Amersham) en tampón fosfato, pH 7,5. Esto se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente después de lo que se añadieron 25 \mul de hidróxido sódico 0,5 M y 15 minutos después 300 \mul de Factor Intrínseco inmovilizado en Dextrano (suficiente para unir el 50% del marcador) en tampón borato, pH 8,6. Después de 1 hora a temperatura ambiente, en oscuridad, se centrifugaron las muestras a 1000 g y 4ºC durante 10 minutos, se retiraron cuidadosamente los sobrenadantes, y se contaron los sedimentos en un Packard Riastar. Se determinó la concentración de cobalamina unida a TC II a partir de una curva patrón construida con ocho calibradores (0-500 pM de holo-TC II) tratados de forma idéntica a las muestras. También se analizaron 37 muestras de suero con respecto a la cobalamina sérica total usando el ensayo IMx B12 de Abbot.

La curva patrón para holo-TC II se muestra en la Figura 1 y la relación entre las concentraciones de cobalamina sérica total y holo-TC II en 37 voluntarios sanos se ilustra en la Figura 2. Es evidente que la correlación es baja, con r^{2} = 0,50. En contraste, la correlación entre holo-HC y cobalamina sérica total es elevada, r^{2} = 0,96 (Figura 3). La concentración media de holo-TC para los 49 voluntarios sanos fue 64 \pm 28 pM y el intervalo de referencia al 95% 23 - 127 pM.

El ensayo tiene un CV del 10%, una sensibilidad analítica (0-calibrador - 3 s.d.) por debajo de 10 pM y no reacciona de forma cruzada con haptocorrina.

Ejemplo 10

Para medir holo-TC II, se mezclan alícuotas de suero durante 30 minutos con un volumen igual de PBS y partículas magnetizables recubiertas con anticuerpos específicos para TC II. Las partículas magnetizables se sedimentan usando un imán fuerte y se retira el sobrenadante. Las partículas se lavan una vez y se tratan posteriormente con un reactivo de liberación/desnaturalizante que contiene hidróxido sódico (0,3 M), cianuro potásico (100 \muM), y ditiotreitol (15 mM). Para la medida del folato, se tratan directamente muestras de suero con el reactivo de liberación/desnaturalizante. Esto liberará sustancialmente toda la cobalamina y folato unidos, convertirá toda la cobalamina en la forma cianocobalamina más estable, y conservará el folato endógeno en forma reducida. Después se añade a todas las muestras un marcador doble que contiene cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato radiomarcado con I^{125}. Se añade una cantidad limitada de un aglutinante doble, que contiene Factor Intrínseco inmovilizado y aglutinante de folato, a cada tubo y se incuba durante 10-60 minutos. El aglutinante se sedimenta por centrifugación o usando un imán fuerte, dependiendo del modo de inmovilización. La concentración de cobalamina unida a TC II en una muestra de suero se determina a partir de una curva patrón construida usando calibradores de holo-TC II y la concentración de folato a partir de una curva patrón construida de cantidades conocidas de folato.

Ejemplo 11

Para medir holo-TC II, se mezclan alícuotas de suero durante 30 minutos con un volumen igual de PBS y partículas magnetizables recubiertas con anticuerpos específicos para TC II. Las partículas magnetizables se sedimentan usando un imán fuerte y se retira el sobrenadante. Las partículas se lavan una vez y posteriormente se tratan con un reactivo de liberación/desnaturalizante que contiene hidróxido sódico (0,3 M), cianuro potásico (100 \muM), y ditiotreitol (15 mM). Para medir la cobalamina sérica total y el folato, las muestras de suero se tratan directamente con el reactivo de liberación/desnaturalizante. Esto liberará sustancialmente toda la cobalamina y folato unidos, convertirá toda la cobalamina en la forma cianocobalamina más estable, y conservará el folato endógeno en forma reducida. Después se añade a todas las muestras un marcador doble que contiene cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato radiomarcado con I125. Se añade una cantidad limitada de aglutinante doble, que contiene Factor Intrínseco inmovilizado y aglutinante de folato, a cada tubo y se incuba durante 10-60 minutos. El aglutinante se sedimenta por centrifugación o usando un imán fuerte, dependiendo del modo de inmovilización. La concentración de cobalamina unida a TC II en una muestra de suero se determina a partir de una curva patrón construida usando calibradores de holo-TC II y la concentración de cobalamina sérica total y folato a partir de una curva patrón construida de cantidades conocidas de cobalamina y folato.

Claims (24)

1. Un método de ensayo que comprende la detección de holo-transcobalamina II (holo-TC II) y folato en una muestra que contiene cobalamina de un sujeto en el que dicha detección de holo-TC II comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra con un ligando de unión específica para un analito elegido entre el conjunto de TC II y holo-TC II y separar la fracción unida a ligando de la fracción no unida a ligando para concentrar de este modo dicho analito en al menos 3 veces para dar una muestra concentrada, seguido por la determinación del nivel de holo-
TC II.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho ensayo es un ensayo automatizado.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que dicha determinación comprende la disociación de cobalamina unida de dicha muestra concentrada.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha disociación se realiza calentando y/o cambiando el pH de la muestra concentrada.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho ligando de unión específica tiene reactividad cruzada para haptocorrina de no más del 1%.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende poner en contacto una muestra que contiene holo-TC II con un ligando inmovilizado, y un ligando no inmovilizado, en el que al menos uno de dicho ligando inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es un ligando de unión específica para holo-TC II y en el que al menos uno de dicho ligando inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado está marcado.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho ligando de unión específica se elige entre el conjunto de un ligando inmovilizado y un ligando inmovilizable.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho ligando de unión específica se inmoviliza por unión a una fase sólida seleccionada entre el conjunto de películas de filtro, láminas de filtro, las luces de tubos, partículas, partículas magnetizables, láminas, geles, membranas, fibras, capilares, tiras de microtitulación, tubos de microtitulación y placas de microtitulación.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho ligando de unión específica se inmoviliza por unión a partículas magnetizables.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que un ligando de unión específica inmovilizado se pre-une a un ligando marcado y posteriormente se pone en contacto con una muestra que comprende holo-TC II, en el que dicha holo-TC II se une al mismo sitio en dicho ligando inmovilizado que se une por dicho ligando marcado y en el que se detecta el desplazamiento de dicho ligando marcado por holo-TC II.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que dicho ligando de unión específica se elige entre el conjunto de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un receptor, un polipéptido, un oligopéptido, un aglutinante específico de una biblioteca química combinatoria, un aglutinante específico de una biblioteca de presentación de fagos, una secuencia de ADN de unión específica y una secuencia de ARN de unión específica.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que dicho ligando de unión específica se elige entre el conjunto de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena sencilla y un derivado de anticuerpo.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 en el que dicho ligando de unión específica es un anticuerpo monoclonal.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que dicho ligando de unión específica es un ligando de unión específica para holo-TC II y en el que dicho ligando de unión específica tiene una constante de afinidad por holo-TC II de más de 10^{10} M^{-1}.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende adicionalmente una separación preliminar de apo-TC II y apo-haptocorrina de holo-TC II y holo-haptocorrina.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15 en el que dicha separación preliminar se realiza usando e inmovilizando un aglutinante seleccionado entre el conjunto de cobalamina inmovilizada, análogos de cobalamina inmovilizados y fragmentos de cobalamina inmovilizados.

17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16 en el que dicha separación preliminar comprende la retirada de apo-TC II y apo-haptocorrina unidas y la determinación de la holo-TC II comprende poner en contacto la muestra libre de apo-TC II y apo-haptocorrina con un ligando de TC II inmovilizado y después poner en contacto la holo-TC II inmovilizada con un ligando de TC II marcado.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16 que comprende adicionalmente la adición de un ligando no inmovilizado para TC II, en el que dicha separación preliminar implica la unión de apo-TC II y apo-haptocorrina de un modo que se inhiba la unión de dicho ligando no inmovilizado a TC II.

19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en el que dicho folato se detecta simultáneamente con la detección de dicha holo-TC II.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende separar holo-TC II de holo-haptocorrina, añadir un agente de liberación o desnaturalizante, cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato marcado con I125, y una cantidad limitada de un aglutinante doble que contiene factor intrínseco inmovilizado y aglutinante de folato a la muestra y detectar Co57 unido e I125 unido.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 en el que dicho ligando marcado es un ligando marcado de forma quimioluminiscente.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 que comprende adicionalmente medir el nivel de cobalamina total de dicha muestra.

23. El uso de holo-TC II como calibrador en un método de ensayo para holo-TC II de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. El uso de folato como calibrador en un método de ensayo para folato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.