ES2234299T3 - Ensayo para la determinacion de cobalamina. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo para la determinación de cobalamina unida a transcobalamina II (TC II) en una muestra corporal, consistente en poner en contacto una muestra libre de células de un fluido corporal con una cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las apo-formas de TC II y haptocorrina y en poner en contacto a continuación dicha muestra con un ligando específico inmovilizado o inmovilizable para la TC II o la TC II unida a cobalamina (holo TC II), separar una fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando y medir el contenido en holo- TC II o cobalamina unida a TC II en la misma.

Description

Ensayo para la determinación de cobalamina.

La presente invención se relaciona con métodos de ensayo para la determinación de cobalamina o vitamina B_{12} en un fluido orgánico y, en particular, con métodos de ensayo para el pool metabólicamente activo de la cobalamina.

La cobalamina o vitamina B_{12} es una vitamina hidrosoluble que forma parte del complejo de la vitamina B que se encuentra en los alimentos. La molécula central consiste en un anillo de corrina de cuatro unidades de pirrol que rodean al átomo de cobalto esencial. La cobalamina es la única vitamina que no puede ser sintetizada por los animales o las plantas y debe ser absorbida del alimento en el intestino. Puede, sin embargo, almacenarse en el hígado. Es sintetizada por microorganismos, en particular por bacterianas anaerobias y levaduras.

La cobalamina funciona in vivo como coenzima y las enzimas de cobalamina catalizan tres tipos de reacciones: (i) reorganizaciones intramoleculares, por ejemplo, la formación de succinil-CoA a partir de L-metilma-lonil-CoA; (ii) metilaciones, por ejemplo, la formación de metionina por metilación de homocisteína, y (iii) reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. En mamíferos, sólo se conocen dos reacciones enzimáticas, las específicamente mencionadas en (i) y (ii) anteriormente, que requieran cobalamina como coenzima.

En el proceso de la digestión, una proteína salival llamada haptocorrina, a la que en adelante se hará aquí referencia como HC (y a la que también se hace referencia en la técnica como ligante R o transcobalaminas I y III de manera colectiva), se une a la cobalamina en el tracto gastrointestinal superior para formar un complejo que pasa a través del estómago. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo cobalamina-haptocorrina (holo-HC) en el íleon, liberando cobalamina, que se une entonces a una proteína llamada factor intrínseco, que es segregada por la mucosa gástrica, para formar otro complejo. El complejo cobalamina-factor intrínseco se une a un receptor específico en el revestimiento del íleon terminal, después de lo cual se disocia por un factor de liberación y la cobalamina es transportada activamente a través de la membrana del íleon hacia el torrente sanguíneo.

La cobalamina no circula en el organismo en forma libre en una cantidad apreciable. Probablemente, un 99% aproximadamente de la cobalamina se une a una de las proteínas transcobalamina (TC I-III) o a la albúmina.

La proteína que se cree responsable del transporte de la cobalamina a los tejidos interesados es la transcobalamina II (TC II), una proteína traza crítica sin la cual la cobalamina no puede cruzar las membranas celulares. A pesar de su importante función metabólica, sólo aproximadamente un 6-25% de la cobalamina del suero se une a la TC II y la mayor parte es transportada por la HC. La TC II es un polipéptido de cadena única de 45 kDa que se encuentra primariamente en el suero, en el fluido seminal y en el fluido cerebroespinal. La TC II unida a la cobalamina o la holo-TC II se unen a receptores específicos sobre las membranas celulares y, una vez unidos, el complejo holo-TC II es captado por las células por pinocitosis.

La TC II es sintetizada por el hígado, el endotelio vascular, los enterocitos, los macrófagos y los fibroblastos y circula predominantemente como apo-TC II, es decir, que carece de cobalamina unida. Tiene una corta vida media de aproximadamente 90 minutos.

Menos de un cuarto de la cobalamina plasmática total se asocia con la TC II. El resto se une a otras transcobalaminas o a albúmina, como se ha mencionado antes.

Como la cobalamina debe absorberse a partir del alimento, cualesquiera condiciones que den lugar a una función gástrica alterada, por ejemplo, gastroenteritis o condiciones que den lugar a atrofia gástrica, o a una incapacidad para producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de liberación, TC II o receptores de TC II, pueden dar lugar a una captación alterada de cobalamina y a una deficiencia resultante.

Determinados subgrupos poblacionales, por ejemplo, las personas de edad, las mujeres gestantes, los pacientes con enfermedad gastrointestinal crónica o aguda, quienes sufren de determinadas enfermedades autoinmunes, quienes tienen una historia familiar de anemia perniciosa y quienes sufren de SIDA, son particularmente proclives a la deficiencia de cobalamina.

Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de cobalamina son variadas y numerosas, pero incluyen anemia, hematopoyesis megaloblástica y trastornos funcionales y estructurales del sistema nervioso. Alrededor de un 60% de los individuos diagnosticados como deficientes en cobalamina son anémicos, pero en muchos los síntomas neurológicos son los únicos signos clínicos observados. Alrededor de un 10% de los pacientes exhiben síntomas psiquiátricos y alrededor de un 40% exhiben tanto síntomas neurológicos como psiquiátricos.

El diagnóstico precoz de la deficiencia de cobalamina es crucial para asegurar un buen pronóstico para los pacientes, ya que algunas de las manifestaciones de la deficiencia de cobalamina, particularmente los efectos neuropsiquiátricos, son irreversibles si no se detectan y alivian terapia con cobalamina rápidamente.

Es deseable, por lo tanto, valorar con precisión el nivel de cobalamina de un individuo de una forma conveniente y eficaz, en vistas a establecer si el individuo puede estar sufriendo o no deficiencia de cobalamina.

La medición de la cobalamina plasmática total, es decir, de la cobalamina (y substancias de tipo cobalamina) unida a cualquiera de las proteínas transcobalaminas (TC) I, II y III, ha sido usada en intentos de valoración de la deficiencia de cobalamina. Esta técnica da lugar a una distribución de concentración de base amplia en una población que se considera normal y, por ello, produce un amplio margen de referencia. En los individuos, sin embargo, el margen de cobalamina disponible considerado normal para ese individuo es muy estrecho. Se ha observado que, aunque la concentración de cobalamina metabólicamente activa del individuo se haya salido de su propio margen de referencia, su contenido en cobalamina plasmática total permanece dentro del margen considerado normal para la población. En tales circunstancias, la deficiencia en cobalamina puede pasar sin detectar. Tal método no fiable es claramente indeseable y se reconoce que dichas mediciones de cobalamina en suero o plasma tienen una baja sensibilidad y especificidad diagnóstica.

Se han desarrollado ensayos microbianos que implican a microorganismos dependientes de la cobalamina para su crecimiento y se les ha usado en la medición de la concentración de cobalamina en plasma, pero, además de la dificultad de estimación del margen de referencia apropiado, estos métodos requieren extracción y conversión de las cobalaminas, lo cual requiere mucho tiempo y es problemático y totalmente inadecuado para el estudio rápido de laboratorio.

Los métodos alternativos para valorar la deficiencia de cobalamina conllevan la medición de la acumulación de metabolitos en el plasma que requieren cobalamina para su conversión. Los niveles de metilmalonato en plasma y de homocisteína en plasma aumentan en individuos deficientes en cobalamina (Chanarin, The megaloblastic anaemia, London, Blackwell Scientific Publications, 1991) y constituyen buenas moléculas candidatas para la correlación con la deficiencia de vitamina B_{12}. Los métodos basados en la determinación de la homocisteína han mostrado, sin embargo, ser complicados y poco prácticos y muestran pobre especificidad y sensibilidad. Mientras que los métodos basados en la medición del metilmalonato son precisos y fiables, son incómodos y requieren análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas combinadas y son, por lo tanto, caros y de nuevo inadecuados para el estudio clínico de rutina (Nex\phi y col. (1994), Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61-76).

También se ha sugerido que la medición de la cobalamina unida a TC II, frente a la cobalamina plasmática total, puede aportar un indicador clínico fiable de la probabilidad de deficiencia de cobalamina (Herbert y col. (1990), Am. J. Hematol. 34: 132-139; Wickramasinghe y Fida (1993), J. Clin. Pathol. 46: 537-539; Patente EE.UU. 4680273). Sin embargo, dichos esfuerzos por determinar la concentración de holo-TC II han sido hasta la fecha mayormente indirectos, calculando la concentración de holo-TC II como la diferencia entre la cobalamina plasmática total y la concentración de cobalamina del plasma empobrecido en TC II.

Tal depleción de plasma puede ser conseguida por adsorción en sulfato de amonio (Carmel (1974), Am. J. Clin. Pathol. 62: 367-372), microsílice (Herzlich y Hubert (1988), Lab. Invest. 58: 332-337; Wickramasinghe y Fida (1993), J. Clin. Pathol. 46: 537-539), vidrio microfino (Vu y col. (1993), Am. J. Hematol. 42: 202-211) o anticuerpos policlonales anti-TC II inmovilizados (Lindemans y col. (1983), Clin. Chim. Acta 132: 53-61). Se determina la concentración de cobalamina en el plasma total y la fracción empobrecida por métodos bien conocidos en este campo, tales como las técnicas de radio- o enzimoinmunoensayo. Estos métodos resultan inadecuados para el estudio de rutina automatizado o no automatizado, ya que son complejos y llevan tiempo y ya que el bajo grado de especificidad de los materiales adsorbentes utilizados da como resultado una separación insuficiente de la holo-TC II y la holo-HC, que da lugar a una sobreestimación de la holo-TC II. La variación entre lotes del material adsorbente introduce más errores y, lo que es más importante, la substracción de un gran volumen de otro gran volumen da lugar a imprecisiones inaceptables y a falta de fiabilidad.

Los otros intentos de valorar la TC II han conllevado la separación de la TC II con respecto a otros componentes del suero, incluyendo la TC I y la TC III, usando su lipofilicidad. Así, Kapel y col. (1988), Clin. Chim. Acta 172: 297-310, Benhayoun y col. (1993), Acta Haematol. 89: 195-199, y Toft y col. (1994), Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 describen métodos para separar la TC II de otras transcobalaminas usando heparina sefarosa, gel de sílice o celulosa, respectivamente. Estos métodos, sin embargo, sufren de los mismos inconvenientes que los métodos indirectos, ya que se basan en los mismos materiales adsorbentes. Además, la baja concentración plasmática de holo-TC II hace que estos métodos sean inadecuados para su combinación con los métodos existentes de cuantificación de la cobalamina. El rango normal de holo-TC II es de 35-160 pM y valores por debajo de 35 pM serían generalmente considerados como indicativos de deficiencia de cobalamina. La sensibilidad analítica descrita de la mayoría de los métodos rutinarios para la cobalamina plasmática es de aproximadamente 40 pM, pero, en la práctica, es frecuentemente mucho mayor, típicamente de alrededor de 90 pM. Por ello, los niveles plasmáticos normales de holo-TC II están por debajo o próximos al límite de sensibilidad de los métodos rutinarios para la cuantificación de cobalamina.

Posiblemente, el método más preciso actualmente reconocido para la determinación de la cobalamina unida a TC II conlleva la adsorción de TC II en sílice y la determinación luego de la fracción unida para el contenido en cobalamina usando un inmunoensayo como el descrito, por ejemplo, por Kuemmerle y col. (1992), Clin. Chem. 38/10: 2073-2077, o un ensayo microbiológico, produciendo este último aparentemente los mejores resultados. Este método requiere un día de trabajo completo para realizar sólo veinte ensayos. Es muy caro y no es práctico y tiene una pobre adecuación a las investigaciones rutinarias de laboratorio diagnóstico clínico.

Existe, por lo tanto, una gran necesidad de métodos mejorados de valoración del nivel de cobalamina metabólicamente activa en un fluido corporal con vistas a correlacionar el nivel de cobalamina con la probabilidad de deficiencia de cobalamina que puedan ser llevados a aplicación diagnóstica clínica rutinaria.

Así, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de ensayo para la determinación de cobalamina unida a transcobalamina II (TC II) en una muestra orgánica, consistente en poner en contacto una muestra libre de células de un fluido orgánico con una cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las apo-formas de TC II y a haptocorrina y en poner en contacto a continuación dicha muestra con un ligando de unión especifica inmovilizado o inmovilizable para la TC II o la TC II unida a cobalamina (holo-TC II), separar una fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando y medir en ella el contenido en holo-TC II o cobalamina unida a TC II.

Por ligando de unión específica, se entiende uno que se una a TC II (es decir, apo-TC II y holo-TC II) u holo-TC II en virtud de su estructura química o conformación específica y no simplemente en virtud de una propiedad fisicoquímica global (tal como la lipofilicidad), que puede ser común a muchos componentes de una muestra de fluido orgánico. La afinidad y la especificidad de unión de los ligandos adecuados para uso en el método preferiblemente permiten una concentración de 3 veces, más preferiblemente de 5 veces e incluso más preferiblemente de 10 veces, y lo más preferible de más de 10 veces, de la TC II u holo-TC II en la muestra y, por ello, dicho método es capaz de dar valores precisos y fiables para la holo-TC II en el rango normal inferior de la holo-TC II y también en el rango subnormal. Tal separación y concentración de las moléculas diana no es posible con los métodos actualmente existentes, que son incapaces de separar eficazmente la TC II o la holo-TC II de la HC o la holo-HC. La capacidad para concentrar la TC II o la holo-TC II al menos 3 veces permite el uso de un equipo analítico automatizado en el ensayo de rendimiento. Sin dicha etapa de concentración, la cantidad de analito presente en una muestra es probable que esté por debajo del límite inferior de detección. Dicho equipo analítico automatizado requiere típicamente entre 40 y 100 \mul de muestra en un volumen total típicamente de 150 \mul o superior para su operación. Así, se diluye un analito de baja concentración incluso más para su análisis. Usando el método de ensayo de la invención, sin embargo, se concentra el analito al menos 3 veces. Dado que la utilización de tal equipo analítico automatizado conlleva típicamente un rango de control de 100-700 pM con un límite inferior de sensibilidad de aproximadamente 40 pM, pero un límite inferior práctico de alrededor de 90 pM, una concentración de 5 veces facilita la medición de la holo-TC II hasta a 18 pM y una concentración de 10 veces facilita la medición hasta a 9 pM de holo-TC II. Como la presente invención facilita la concentración en más de 10 veces, el experto entenderá fácilmente el grado en el cual se aumenta la sensibilidad, haciendo que sea una técnica muy potente, ciertamente.

La capacidad para concentrar el analito de forma que pueda ser sometido a análisis mediante dichos procedimientos automatizados es una ventaja importante del presente método de ensayo.

Preferiblemente, a partir de una muestra de partida de 600 \mul de fluido orgánico, se generará un volumen de hasta 150 \mul, más preferiblemente de hasta 100 \mul y más preferiblemente de menos de 60 \mul, el cual puede ser entonces analizado, eventualmente usando procedimientos automatizados.

Se puede usar cualquier ligando de unión específica a TC II en el método de la invención, ya sea como un ligando de captura, concentración y separación o como un ligando de detección, y, dependiendo de la realización específica de la invención, puede unirse a TC II tanto en la forma apo como en la holo, o puede unirse específica o preferencialmente a la holo-forma. El ligando de unión a TC II exhibirá preferiblemente un alto grado de selectividad y de especificidad hacia TC II y exhibirá una baja, o más preferiblemente esencialmente nula, afinidad hacia otras proteínas TC, es decir, TC I o III, en la forma apo o en la holo, o hacia cualquier otra proteína de unión a cobalamina. Si el ligando de unión a TC II es un ligando de unión específica a holo-TC II, se exhiben las mismas propiedades, con el requerimiento adicional de que se muestra una baja, o preferiblemente nula, afinidad hacia la apo-TC II.

El ligando de unión a TC II u holo-TC II será generalmente un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un compuesto con una afinidad por la TC II o la holo-TC II, respectivamente, tal como un receptor de la superficie celular, un polipéptido, un oligopéptido, un pequeño compuesto químico orgánico, etc. Otros ligandos de unión pueden ser un ligando específico seleccionado a partir de una librería de química combinatoria o de exhibición de fagos o una secuencia de ADN o ARN de unión específica.

Si el ligando de unión es un anticuerpo, puede ser policlonal, pero será preferiblemente monoclonal. Se pueden generar anticuerpos monoclonales con mucha mayor especificidad y uniformidad que los anticuerpos policlonales y esto reduce la reactividad cruzada con otros componentes del fluido orgánico, en particular otras transcobalaminas y, donde resulte apropiado, la conformación alternativa, es decir, la forma apo del analito diana. La uniformidad y reproductibilidad ofrecida por los anticuerpos monoclonales en relación a los anticuerpos policlonales asegura una mayor precisión, que es vital para un ensayo en el que el analito está en una concentración tan baja. Alternativamente, puede tratarse de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento F(ab), F(ab')_{2} o F(v). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden ser monovalentes o divalentes y pueden ser producidos por tecnología de hibridomas o ser de origen sintético y ser generados por tecnología de ADN recombinante o por síntesis química. Se podrían usar, por ejemplo, anticuerpos de una sola cadena u otros derivados o simulacros de anticuerpos. El anticuerpo puede ser dirigido o producido contra cualquier epitopo, componente o estructura de la proteína TC II u holo-TC II, según sea apropiado.

Se describen anticuerpos adecuados para uso como ligandos de unión en la presente invención, por ejemplo, en Quadros y col. (1996), Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149-154, y M^{c}Lean y col. (1997), Blood 89(1): 235-242.

De forma similar, se pueden usar moléculas receptoras capaces de unirse a las formas apo y holo de la TC II o de unirse preferible o específicamente a la forma holo-TC II. Los receptores adecuados son receptores de TC II u holo-TC II unidos a la superficie o membrana celular y las propiedades de reactividad con especies cruzadas significan que se pueden usar dichas moléculas receptoras de cualquier especie de mamífero, aunque preferiblemente el origen de dichos receptores es humano o bovino. Aunque las moléculas receptoras son preferiblemente aisladas en forma relativamente purificada, también se contempla el uso de membranas celulares o de fracciones de membranas mixtas que contienen los receptores preferiblemente en forma concentrada. Dichos receptores o membranas o fracciones de membranas que contienen receptores pueden ser ventajosamente aislados de células de riñón, de placenta o tumorales. Las células en depósito no deben ser empleadas, en general, como fuente de tales receptores. Las células en depósito pueden ser, sin embargo, usadas como fuente de receptores de haptocorrina.

Se puede obtener una fracción de membrana enriquecida en receptor de TC-II según describen Seligman y col., J. Biol. Chem. 253: 1766-1772 (1978), y Nex\phi y col., Biochem. Biophys. Acta 628: 190-200 (1980). Esencialmente, se corta el tejido, por ejemplo, placenta humana o hígado de conejo, en pequeñas piezas y se homogeneiza en tampón tris, pH 7,4, que contiene NaCl 0,15 M y EDTA 10 mM, seguido de centrifugación a 25.000 x g durante 30 minutos. Para eliminar la sangre residual, se repite la homogeneización/centrifugación al menos una vez. Se extrae además esta fracción de membrana con detergente, por ejemplo, Ammonyx-LO, Triton X-100 o Chapso, y se clarifica por centrifugación a 100.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. Se usa el sobrenadante como fuente para el receptor de TC-II.

Un ejemplo de una molécula receptora adecuada que se une preferencialmente al complejo holo-TC II es la glicoproteína de cadena única de 62 kDa que existe como homodímero no covalente y se encuentra en la superficie celular de todos los tejidos (Rothenberg y Quadros (1996), Balliere's Clinical Haematology 8(3): 499-514; WO 96/085150). Otra proteína adecuada para uso en el método de ensayo de la invención es gp300, una proteína de membrana mediadora de la endocitosis de 600 kDa que se expresa en células epiteliales absorbentes, por ejemplo, células del túbulo proximal renal, según revelan y describen Moestrup y col. (1996), Proceedings National Academy Science 93: 8612-8617). Este receptor es un receptor de LDL y se une tanto a la forma apo como a la holo de TC II.

Cuando se usa un receptor de la superficie celular, éste puede ser inmovilizado por conjugación a una superficie, por ejemplo, de una perla o lámina, o alternativamente se puede dar forma a una fracción de membranas celulares que contenga los receptores de vesículas o láminas que exhiben los receptores.

Cuando el ligando está inmovilizado, éste puede estar, por ejemplo, sobre la superficie de un sólido, por ejemplo, una película o lámina de filtro o la luz de un tubo; sin embargo, se prefiere especialmente la inmovilización sobre partículas, por ejemplo, microesferas tales como las producidas por Dyno Industries ASA, Noruega. Dichas partículas pueden ser porosas o no porosas y, si se desea, pueden ser provistas de medios que les permitan ser recogidas, por ejemplo, por inclusión con las partículas de un material que responde magnéticamente, por ejemplo, cristales de óxido de hierro superparamagnético. Dichas microperlas que responden magnéticamente pueden ser adquiridas de Dyno Industries ASA, así como de Dynal AS, Noruega, Bang Particles, EE.UU., y Prolabo, Francia. Cuando el ligando ha de ser inmovilizable, en lugar de inmovilizado, esto se puede conseguir copulando el ligando a un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, biotina/estreptavidina) y usando el otro miembro del par de unión, eventualmente unido a un substrato, para aglomerar o inmovilizar de algún otro modo el ligando o los complejos ligando:TC II o ligando:holo-TC II antes de la separación de la fracción unida a ligando de la fracción no unida en la realización del método de la invención.

Es bien sabido en la técnica cómo inmovilizar moléculas de afinidad, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, con fines de separación, por ejemplo, uniendo o copulando los ligandos, eventualmente por medio de un conector, a cualquiera de los bien conocidos soportes sólidos o matrices ampliamente usados en la actualidad o propuestos para la separación o inmovilización sobre columnas y se podría usar cualquier método conocido en la técnica. Dichas fases sólidas pueden adoptar la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, fibras o capilares o tiras de microtitulación, tubos o placas de pocillos, etc., y pueden estar convenientemente hechas de vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Las técnicas para unir el ligando al soporte sólido son también extremadamente bien conocidas y están ampliamente descritas en la literatura.

La copulación del ligando a un substrato o a un miembro de un par de unión específica puede ser conseguida usando técnicas convencionales.

El método de la invención, si se realiza el ensayo como ensayo de unión competitiva, conllevará generalmente la adición a la muestra de un compuesto marcado que compita por la unión al ligando. En general, se preferirá usar holo-TC II marcada en este contexto. El marcaje usado puede ser cualquier marcaje que pueda ser determinado directa o indirectamente, por ejemplo, un cromóforo (cuyo término es usado para incluir los fluoróforos), un radiomarcaje (generalmente unido covalentemente o unido a quelato), una enzima o substrato enzimático, un marcaje magnético, etc.

En una realización preferida, el método de la presente invención conlleva el contacto de un ligando de unión a TC II u holo-TC II inmovilizado o inmovilizable con la muestra que se está investigando;

la separación de una fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando, y

la disociación de la cobalamina unida de las moléculas de holo-TC II en la fracción unida y la determinación de la concentración de cobalamina liberada, preferiblemente efectuando la disociación de tal forma que la concentración de la cobalamina liberada sea al menos 3 veces, preferiblemente 5 veces e incluso más preferiblemente 10 veces mayor que las concentraciones de holo-TC II en la muestra inicial.

La esencia de este aspecto de la invención es la separación y concentración de TC II u holo-TC II, lo que permite emplear con utilidad métodos estándar de la determinación de cobalamina en el método. Como se ha indicado anteriormente, en ausencia de dicha etapa de concentración, los métodos del estado de la técnica no resultan adecuados para la determinación de cobalamina, ya que existe a una concentración tan baja. Se puede emplear cualquier medio apropiado para liberar cobalamina de la holo-TC II, pero se pueden emplear convenientemente en este sentido el calor o el cambio del pH del medio circundante. Las diferentes formas de cobalamina pueden convertirse en la menos sensible a la luz cianocobalamina por tratamiento con KCN. Se puede emplear cualquier medio apropiado para la determinación de cobalamina libre en el método de la invención, por ejemplo, un ensayo competitivo realizado por contacto de un compañero de unión inmovilizado para la cobalamina con la cobalamina disociada de la muestra en presencia de ligando marcado, que compite con la cobalamina aislada por la unión a los compañeros de unión inmovilizados. Sería apropiado, por ejemplo, un método como el descrito por Kuemmerk y col. (1992), Clin. Chem. 38: 2073-2077. Un medio alternativo para determinar la cobalamina libre está descrito en la Patente EE.UU. Nº 5451508 y conlleva una técnica de inmunoensayo.

En esta realización de la invención, se prefiere que los ligandos de unión para TC II estén inmovilizados y se unan tanto a la holo como a la apo-TC II.

En una realización preferida alternativa, el método de ensayo de la presente invención consiste en poner en contacto un soporte sólido que tenga inmovilizado sobre el mismo un ligando de unión a TC II u holo-TC II con la muestra investigada y también con un ligando no inmovilizado,

donde dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse a TC II u holo-TC II, a dicho ligando no inmovilizado o a complejos de dicha TC II u holo-TC II y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse a al menos uno de dichos ligando inmovilizado, TC II u holo-TC II y complejos de dicho ligando inmovilizado y TC II u holo-TC II;

donde, si dicho método de ensayo es un ensayo en emparedado, al menos uno de dichos ligandos es específico para la holo-TC II y, si dicho ensayo es un ensayo competitivo, dicho ligando inmovilizado es específico para holo-TC II y competidores de la misma;

mediante lo cual la proporción de dicho ligando inmovilizado unido a TC II u holo-TC II, a dicho ligando no inmovilizado o a complejos de dicho ligando no inmovilizado y TC II u holo-TC II es dependiente de la cantidad de holo-TC presente en dicha muestra, y

dicho ligando no inmovilizado es capaz de generar una señal directa o indirectamente detectable cuando está unido o cuando no está unido;

separar una fracción unida de una fracción no unida, y

determinar directa o indirectamente el ligando no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (la fracción unida) o no unido y en solución (la fracción no unida);

donde el contacto de la muestra y dicho ligando no inmovilizado con el soporte sólido puede ser realizado por separado, simultánea o secuencialmente y, si se realiza por separado o secuencialmente, pueden contactar en cualquier orden.

En esencia, por lo tanto, la realización preferida alternativa del método de la invención conlleva la determinación del ligando no inmovilizado, que se ha unido directa o indirectamente o que alternativamente no ha podido unirse directa o indirectamente al ligando inmovilizado. Cuando el ligando no inmovilizado compite por la unión al ligando inmovilizado con la holo-TC II, un alto nivel de ligando no inmovilizado no unido es indicativo de una alta concentración de holo-TC II en la muestra y un bajo nivel de ligando no inmovilizado no unido es indicativo de una baja concentración de holo-TC II en la muestra. Cuando el ligando no inmovilizado se une a la TC II u holo-TC II, que se une a su vez al ligando inmovilizado, entonces un alto nivel de ligando no inmovilizado unido es indicativo de una alta concentración de holo-TC II en la muestra y un bajo nivel de ligando no inmovilizado unido es indicativo de una baja concentración de holo-TC II en la muestra.

En el método de la presente invención, por lo tanto, se determina el pool metabólicamente activo de cobalamina midiendo el complejo holo-TC II o midiendo la cantidad de cobalamina unida a moléculas de TC II presentes en una muestra orgánica que contiene una mezcla de apo y holo-TC II y de apo y holo-HC (haptocorrina o TC I y III).

Se lleva a cabo una etapa de separación preliminar usando cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las formas apo tanto de la TC II como de la haptocorrina (HC). En dicha etapa preliminar, las formas apo de la TC II y de las proteínas HC se unen a la cobalamina inmovilizada, al análogo o al fragmento de la misma y se separan de los complejos holo-TC II y holo-HC. ___________ El análisis de las formas holo de TC II separadas __________ tiene lugar según cualquier realización ___________ descrita anteriormente, pero claramente es más útil cuando la determinación del complejo holo-TC II tiene lugar de un modo distinto a la disociación del complejo y a la posterior determinación de la cobalamina liberada. Será evidente para el experto que, cuando la etapa preliminar precede a la realización preferida alternativa antes mencionada, el requerimiento de que al menos un ligando en un ensayo en emparedado sea específico para la holo-TC II, frente a la TC II, y el requerimiento de que el ligando inmovilizado en un ensayo competitivo sea específico para la holo-TC II y sus competidores frente a la TC II ya no son relevantes, ya que la forma apo de la TC II ha sido capturada y ya no está disponible. Así, los ligandos inmovilizados o no inmovilizados pueden ser específicos para holo-TC II o TC II o sus competidores.

La cobalamina inmovilizada no debe exhibir ninguna tendencia significativa a disociarse de su soporte, ya que esto podría dar lugar a la unión a apo-TC II y a su transformación en holo-TC II. La cobalamina biotinilada se une de una forma muy estable a una superficie sólida con avidina/estreptavidina unida a la misma y ligar cobalamina a un soporte de este modo es conveniente para la realización de esta etapa. En efecto, cuando se usa cobalamina biotinilada, se puede añadir a la muestra analizada en una forma no inmovilizada, donde se une a las apo-formas de TC II y HC. La muestra puede contactar entonces con una superficie sólida que tenga un compañero de unión para la biotina, por ejemplo, avidina, inmovilizado sobre la misma. Se forma entonces un complejo de avidina-cobalamina biotinilada-TC II, que puede ser fácilmente aislado de la muestra.

En una realización de la invención, donde ha tenido lugar la etapa de separación preliminar, el pool de holo-TC II es posteriormente determinado por contacto de la muestra con un ligando de TC II inmovilizado que captura el complejo holo-TC II, dejando la haptocorrina en solución, y poniendo luego en contacto la holo-TC II inmovilizada con un segundo ligando para TC II que está marcado y que, por lo tanto, es detectable. Serían ejemplos de ligandos de unión a TC II adecuados anticuerpos monoclonales no solapantes o, ciertamente, un anticuerpo policlonal específico para TC II sería adecuado en esta realización tanto para la captura como la detección, ya que se reconocen diferentes epitopos sobre las moléculas de TC II.

En otra realización de la invención, donde ha tenido lugar la etapa de separación preliminar, las moléculas de holo-TC II compiten con el ligando no inmovilizado marcado por la unión al ligando para las mismas inmovilizado y se calcula la cantidad de holo-TC II en relación a la cantidad de ligando no inmovilizado marcado unido o no unido al ligando inmovilizado.

En una realización preferida, en la etapa de separación preliminar la unión de apo TC II y apo HC a cobalamina, análogos o fragmentos de la misma tiene lugar en un sitio o de tal forma que se inhibe el posterior reconocimiento y unión de la cobalamina inmovilizada unida a TC II por el ligando no inmovilizado o el compañero de unión para TC II. En esta realización, no hay necesidad de aislar la holo-TC II y la holo-HC de las apo-formas unidas antes de realizar el ensayo de la invención. En esta realización, el sitio contra el cual se dirige el compañero de unión o ligando no inmovilizado es muy importante y debe ser un epitopo sobre TC II que quede enmascarado o protegido o de algún otro modo no disponible para la unión cuando la apo TC II y la apo-HC quedan inmovilizadas sobre la cobalamina, el análogo o el fragmento de la misma.

La separación total, es decir, la separación de todas las proteínas apo y holo TC II, de la muestra no es un requerimiento del método y basta con que se separe una fracción de la muestra que contenga al menos una porción del "subgrupo TC II de proteínas" deseado.

Así, en determinadas realizaciones, los compañeros de unión o ligandos y las condiciones de unión pueden ser seleccionadas para conseguir la separación de substancialmente todo el "subgrupo" seleccionado. En este caso, se puede considerar la fracción no unida como substancialmente libre de proteínas TC II u holo-TC II, es decir, como al menos un 80%, 90% o 95% libre de TC II o de holo-TC II dependiendo de qué componente se seleccione como base de fraccionación.

En realizaciones alternativas, el compañero de unión y las condiciones pueden ser seleccionados de tal forma que sólo una parte de las proteínas TC II de la muestra se separe en una fracción. En este caso, se debe considerar la separación parcial al construir una curva de calibración estándar para el ensayo. En este sentido, la generación de una curva de calibración estándar frente a la que se pueda determinar la concentración de la holo-TC II detectada emplea técnicas estándar bien conocidas en este campo.

Así, si en una etapa de fraccionación se usa un ligando de unión a TC II, al menos una porción de la cobalamina unida a TC II se localizará en la fracción unida y cualquier cobalamina de la muestra unida a moléculas distintas de TC II, por ejemplo HC o albúmina, estará en la no unida (es decir, fracción o fracciones no separadas). La TC II de la fracción unida estará en la forma apo o en la holo y puede acomplejarse con substancias de tipo cobalamina o con análogos además de la cobalamina.

Si se desea, el método de la invención puede conllevar otra etapa de separación preliminar en la que la muestra contacta con un ligando de unión específica inmovilizado o inmovilizable para la haptocorrina (en las formas apo y holo o sólo en la forma holo). De esta manera, se puede reducir cualquier contribución a errores en la determinación de la cobalamina unida a TC II derivados de la holo-HC y se pueden usar ligandos de unión específica para TC II u holo-TC II que tengan alguna afinidad de unión por las haptocorrinas.

Por el contrario, como se ha indicado anteriormente, como la concentración sérica de TC II tanto en la forma apo como en la holo es muy baja, son necesarios ligandos o compañeros de unión de especificidad y afinidad particularmente altas para la operación de la invención. Además, las constantes de afinidad requeridas de los ligandos de la presente invención dependen de si el ligando es específico para TC II u holo-TC II y también de su utilización como ligando de captura o de detección, ya que la concentración en suero de TC II es de aproximadamente 0,5-1 nM, pero la concentración de holo-TC II es sólo de 35-160 pM. Por lo tanto, para un ligando de captura de TC II, es deseable una constante de afinidad de al menos 10^{9}M^{-1}, preferiblemente mayor de 2x10^{9}M^{-1} y más preferiblemente de 10^{10}M^{-1}. Para un ligando de captura de holo-TC II, es deseable una constante de afinidad de al menos 10^{10}M^{-1}, preferiblemente de 2x10^{10}M^{-1}, más preferiblemente mayor de 2x10^{10}M^{-1} y más preferiblemente mayor de 10^{11}M^{-1}. Claramente, la constante de afinidad requerida de un ligante de detección puede ser menor que la de un ligando de captura debido al efecto de concentración del ensayo.

El grado de reactividad cruzada de un ligando de unión a holo-TC II o a TC II con HC debe ser preferiblemente menor del 1%, más preferiblemente de entre el 0,1% y el 1% y más preferiblemente menor del 0,1%. De forma similar, un ligando de unión a holo-TC II preferiblemente no debe exhibir un grado de reactividad cruzada con la apo-TC II por encima del 1%, más preferiblemente de entre el 0,1% y el 1% y, más preferiblemente, la reactividad cruzada debe ser menor del 0,1%.

Utilizando dichos ligandos de alta afinidad, su función se prolonga más allá de la de los simples ligandos de captura y/o detección y tienen un papel vital en poder separar y concentrar la proteína TC II a partir de la muestra para análisis. Los ligandos de unión para TC II u holo-TC II deben concentrar preferiblemente el ligando al menos 3 veces, más preferiblemente al menos 5 veces e incluso más preferiblemente al menos 10 veces.

En otra realización de la técnica de ensayo, más relacionada con un ensayo de desplazamiento que con un ensayo competitivo, la muestra que contiene el complejo holo-TC II contacta con una fase sólida a la que se une un ligando marcado que reconoce los mismos sitios de unión sobre los ligandos inmovilizados como holo-TC II. La holo-TC II de la muestra compite con el ligando marcado unido por los sitios, de tal forma que, tras la equilibración del sistema, existe una relación directamente proporcional entre la cantidad de ligando marcado desplazado del soporte sólido y detectable en solución y la cantidad de holo-TC II presente en la muestra original. El ligando marcado puede ser detectado directa o indirectamente y puede ser determinado como la cantidad de ligando marcado unido o no unido al soporte sólido según sea apropiado. En efecto, en esta realización, el ligando no inmovilizado al que se hizo antes referencia se une al ligando inmovilizado antes de la aplicación de la muestra, pero dicha unión no ha de ser considerada como que signifique que el ligando está en modo alguno inmovilizado.

Otra realización preferida conlleva el contacto de una muestra que contiene holo-TC II con un soporte sólido que tiene holo-TC II inmovilizada sobre el mismo y un ligante específico para holo-TC II no inmovilizado marcado. La holo-TC II libre de la muestra y la holo-TC II inmovilizada compiten por la unión con el ligando no inmovilizado marcado y la determinación del ligando marcado unido a la fase sólida o que permanece en solución permite el cálculo de la concentración de holo-TC II. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el ligando de unión a holo-TC II no inmovilizado marcado es un anticuerpo.

En aún otra realización, la muestra que contiene el analito de interés contacta con holo-TC II marcada y ligando inmovilizado. La holo-TC II marcada y no marcada compite por la unión al ligando inmovilizado y, después de alcanzar el equilibrio, la cantidad de holo-TC II marcada unida al ligando inmovilizado es indirectamente proporcional a la cantidad de holo-TC II en la muestra de interés. De nuevo, la holo-TC II marcada puede ser detectada directa o indirectamente y puede ser determinada como la cantidad de holo-TC II marcada unida o no unida al soporte sólido, según sea apropiado.

En otra realización de la presente invención, un ligando no inmovilizado, pero inmovilizable, específico para el complejo holo-TC II (por ejemplo, un ligando conjugado a biotina u otro miembro de un par de unión específica) contacta con la muestra para formar un complejo holo-TC II/ligando no inmovilizado. El complejo ligando/holo-TC II puede entonces precipitar de la solución usando medios conocidos y ser aislado para análisis.

En aún otra realización de la invención, se añaden dos compañeros de unión marcados a la muestra, ___________ tras la etapa preliminar de depleción de la muestra de las formas apo de TC II y HC. Los compañeros de unión en este caso son holo-TC II marcada o un análogo o fragmento de la misma y un compañero de unión marcado para los mismos, por ejemplo, un anticuerpo marcado. En esta realización, sólo se genera una señal detectable por los marcajes cuando están en estrecha proximidad entre sí, es decir, cuando los dos compañeros de unión marcados se unen entre sí. De este modo, tras su adición a la muestra, el compañero de unión marcado para la holo-TC II puede unirse a la holo-TC II no marcada presente en la muestra, en cuyo caso no se genera ninguna señal detectable, o a la holo-TC II marcada o un análogo, fragmento o variante de la misma que se une al compañero de unión a TC II marcado, en cuyo caso se genera una señal detectable. Agentes de marcaje tales como los de los ensayos de proximidad de centelleo de Amersham descritos en la Patente EE.UU. Nº 4568649 son adecuados para incorporación en dicha realización y la alta sensibilidad de este procedimiento es muy adecuada para un ensayo en el que existe un analito a tal baja concentración. Así, por ejemplo, un miembro del par de unión podría ser marcado con un núclido \beta-emisor, tal como I^{125} o H^{3}, y el otro miembro es marcado con una molécula de centelleo adecuada. La partícula \beta emitida pierde su energía en su ambiente acuoso, a menos que el centelleante esté dentro de los 1,5 \mum, y, por lo tanto, requiere que ambos compañeros marcados se unan entre sí para que sea detectable una señal. La probabilidad de que dos compañeros marcados se unan entre sí viene determinada por la concentración de holo-TC II presente en la muestra, de tal forma que, cuanto mayor sea la señal generada, menor será la concentración de holo-TC II en la muestra.

Tal como se usan aquí, los términos "determinar" o "valorar" incluyen tanto la cuantificación, en el sentido de obtención de un valor absoluto para la cantidad o concentración de cobalamina unida a holo-TC II o TC II en la muestra, como las valoraciones o determinaciones semicuantitativas o cualitativas. Se puede obtener un índice, razón, porcentaje o indicación similar del nivel o cantidad de cobalamina unida a TC II, por ejemplo, en relación a la cobalamina total.

La muestra corporal usada en el método de ensayo de la invención puede ser cualquier muestra que contenga cobalamina, por ejemplo, una muestra de fluido o tejido corporal o una suspensión, etc. Preferiblemente, sin embargo, la muestra será un fluido corporal, por ejemplo, fluido seminal, fluido cerebroespinal o fluido amniótico, pero generalmente será una muestra derivada de sangre. Cuando éste sea el caso, como la muestra usada para análisis está preferiblemente libre de células, se pueden usar bien suero o bien plasma. La muestra puede ser tratada antes de ser usada en el método de ensayo de la invención; por ejemplo, puede ser diluida añadiendo un tampón u otro medio acuoso y puede ser guardada o conservada, por ejemplo, enfriando o congelando antes de su análisis.

En la práctica de la invención, cuando se separa una fracción unida de una fracción no unida, esto puede ser realizado por cualquier medio adecuado, por ejemplo, precipitación, centrifugación, filtración, métodos cromatográficos, etc.

Para evitar dudas, el término "cobalamina" es usado aquí de forma sinónima a "vitamina B_{12}" e incluye todas las formas de la vitamina B_{12} (cianocobalamina, 5,6-dimetilbenzimidazolilcianocobamida, metilcobalamina, 5'-desoxiadenosilcobalamina) que pueden aparecer y ser metabólicamente activas (cuando se presenten apropiadamente) en el organismo.

Como se ha indicado antes, en el método de la invención la determinación de la cobalamina unida a TC puede ser realizada detectando un ligando unido a la holo-TC II separada, o realizando un ensayo competitivo usando un competidor marcado para la holo-TC II, mediante lo cual la holo-TC II compite con el competidor marcado por la unión a un ligando de unión a la misma, o detectando la cobalamina liberada de la holo-TC II separada.

El ligando detectable puede ser convenientemente marcado por cualquier medio convencional, por ejemplo, con un marcaje formador de señal, que puede ser determinado, por ejemplo, por luminiscencia, quimioluminiscencia, determinación colorimétrica, fluorescencia, radiactividad o actividad enzimática. En efecto, cualquier marcaje formador de señal conocido en la técnica puede ser usado en el método de la invención.

Sólo a modo de ejemplo, algunos ejemplos adecuados de compuestos coloreados o fluorescentes que pueden ser usados para marcar un ligando de unión detectablemente en la presente invención son antraquinonas; tintes azo; tintes de azinas; tales como oxazinas y tiazinas; triazinas; pigmentos naturales, tales como las porfirinas; ficobiliproteínas, incluyendo ficoeritrinas y ficocuaninas; clorofilas y sus análogos y derivados; carotenoides; acrinidinas; xantenos, incluyendo fluoresceínas y rodaminas; tintes índigo; tioxantenos; cumarinas; polimetinos, incluyendo di- y triarilmetinos, y derivados de ftalocianinas y ftalocianinas metálicas.

De forma similar, se puede usar una amplia variedad de compuestos radiactivos como la parte de marcaje formador de señal del reactivo usado en esta invención, entre ellos los compuestos marcados con Yodo 125.

Alternativamente, los ligandos de unión pueden conjugarse con compuestos naturales o sintéticos, que pueden producir una señal quimioluminiscente que puede ser estudiada de forma conocida (Cormier, M.J. y col., Chemiluminiscence and Bioluminiscence, Plenum Press, New York 1973). Como compuestos quimioluminiscentes adecuados, se incluyen luciferina, ésteres oxálicos, 1,2-dioxetano, luminol o sus derivados, pero no se limitan a éstos. Si resulta apropiado, se pueden usar peróxido de hidrógeno, enzimas, por ejemplo luciferasa, u otros agentes químicos para producir la señal quimioluminiscente a partir de las moléculas productoras de señal utilizadas.

Las moléculas formadoras de señal fuertemente aniónicas pueden no ser preferidas para uso en el método de la invención, ya que tienen tendencia a unirse a las proteínas del suero, tales como la seroalbúmina humana (HSA), que puedan estar presentes en la muestra. Son ejemplos particularmente adecuados que pueden ser usados el isotiocianato de fluoresceína, la Rodamina B o el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido N-(resorrufin-4-carbonil)piperidina-4-carboxílico o resos.

Se puede separar una fracción que contenga cobalamina (por ejemplo, que contenga holo-TC II y holo-HC) del resto de la muestra por reacción del fluido orgánico investigado con una cobalamina inmovilizada o ligada o un análogo o fragmento de la misma que se une a apo-TC II y a apo-HC y por separación de la fracción unida del resto de la muestra, que contiene holo-TC II y holo-HC. Se puede usar entonces un ligando de unión a TC II detectable para detectar el complejo TC II-cobalamina presente en la fracción separada. El ligando de unión a TC II detectable puede contactar con la muestra en estudio antes del, simultáneamente al, o después del contacto con la cobalamina unida y antes o después de la separación de la fracción unida del resto de la muestra.

En algunas realizaciones, se pueden organizar ligandos inmovilizados para uno o para los otros componentes de los complejos apo y/o holo TC II/HC en una columna. Se puede aplicar el fluido orgánico que contiene el complejo TC II-cobalamina a la columna y ponerlo en contacto con el/los ligando(s) de unión.

La columna puede ser limpiada a chorro o lavada y se puede usar un eluyente para permitir, si es necesario, la liberación de una fracción unida de la columna y facilitar su recogida. Si los componentes de la fracción no unida son o han de ser también analizados con respecto a otros constituyentes, la columna debe ser lavada con un tampón o medio administrado usando una micropipeta calibrada para asegurar que se administra y recoge un volumen conocido preciso. El volumen administrado está preferiblemente dentro de un 3% del volumen deseado (es decir, de calibración), más preferiblemente dentro de un 1 ó 2%. De igual modo, si la fracción que se ha de analizar debe liberarse de la columna antes de la detección, el eluyente usado para liberar el complejo debe ser administrado usando una micropipeta calibrada.

En una realización alternativa, los ligandos de unión usados para separar una fracción de una muestra pueden estar inmovilizados sobre un soporte de fase sólida particulado, por ejemplo, perlas de látex o poliméricas. Para ayudar a la manipulación y separación, se pueden usar perlas magnéticas y ciertamente ésta es una realización preferida de la presente invención. El término "magnético", tal como se usa aquí, significa que el soporte es capaz de tener un momento magnético impartido al mismo cuando se pone en un campo magnético. En otras palabras, un soporte que contenga partículas magnéticas puede ser fácilmente retirado por agregación magnética, que proporciona una forma rápida, simple y eficiente de separación de las fracciones después de la unión del ligando.

Así, usando el método de la invención, las partículas magnéticas con el complejo TC II-cobalamina unido pueden ser retiradas sobre una superficie adecuada por aplicación de un campo magnético, por ejemplo, usando un imán permanente. Es normalmente suficiente aplicar un imán al lado del recipiente que contiene la mezcla de muestra para hacer que las partículas se congreguen en la pared del recipiente y aislarlas para posterior análisis.

Son especialmente preferidas las partículas superparamagnéticas, por ejemplo, las descritas por Sintef en EP-A-106873, ya que se puede evitar la agregación y agrupación de las partículas durante la reacción. Las conocidas perlas magnéticas fabricadas por Bang Particles (EE.UU.) pueden ser particularmente adecuadas para uso en la presente invención.

En general, además de la muestra en evaluación, también se valorarán muestras de calibración con un contenido conocido en complejo holo-TC II en el desarrollo del método de ensayo de la invención. Dichas determinaciones pueden ser usadas para trazar una curva de calibración a partir de la cual se pueda determinar el contenido en cobalamina unida a TC II de la muestra investigada. La naturaleza de las muestras de calibración y la selección de factores de conversión o de ajuste usados en la determinación del complejo holo-TC II pueden variar dependiendo, por ejemplo, de los ligandos particulares usados en las etapas de unión y separación del ensayo y de otros aspectos del método que afectan a la unión y separación de la muestra, por ejemplo, la composición del tampón, las condiciones de ensayo, etc. Típicamente, se usarán muestras de calibración que tengan contenidos en holo-TC II de 0 a 300 pmol/l. El rango de referencia dentro del cual se encontrará, en general, el valor para la cobalamina unida a TC II es de 30 a 160 pmol/l.

El patrón de calibración de holo-TC II puede ser típicamente holo-TC II humana, nativa o recombinante. El uso de holo-TC II como calibrador en los ensayos de holo-TC II es nuevo y forma otro aspecto de la invención.

Vista desde aún otro aspecto, la invención proporciona un kit para un ensayo diagnóstico según la invención, cuyo kit consiste en:

un ligando de unión específica inmovilizado o inmovilizable para TC II u holo-TC II;

preferiblemente, una solución de holo-TC II de concentración conocida y más preferiblemente un conjunto de dichas soluciones que tienen un rango de concentraciones de complejo holo-TC II;

eventualmente, un agente de liberación para liberar la cobalamina de la holo-TC II, y

eventualmente, un ligando marcado.

El método de ensayo de la invención determina el pool metabólicamente activo de cobalamina determinando el complejo holo-TC II o aislando el complejo holo-TC II y determinando luego la cobalamina asociada al mismo y proporciona de este modo un método conveniente para la determinación de la deficiencia de cobalamina antes o después de la aparición de manifestaciones clínicas de la deficiencia de cobalamina. El método de ensayo puede ser ventajosamente usado antes de la aparición de los síntomas, ya que tiene un valor predictivo preciso del equilibrio negativo de la cobalamina.

La presente invención será ahora ilustrada mediante los siguientes Ejemplos no limitativos y los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 es una curva patrón para holo-TC II;

La Figura 2 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración total en suero de cobalamina y de holo-TC II.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración total en suero de cobalamina y de holo-HC.

Ejemplo 1

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para TC II sobre partículas magnetizables. Se deja que una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclada con igual volumen de PBS reaccione durante 15 minutos con un exceso del anticuerpo inmovilizado y un exceso de un anticuerpo anti-holo-TC II no solapante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) radiomarcado con I^{125}. Se sedimentan las partículas magnetizables usando un imán fuerte, se elimina el sobrenadante y se lavan las partículas con PBS.

Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II de la muestra por interpolación en una curva patrón.

Ejemplo 2

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para TC II sobre partículas magnetizables. Se deja que una alícuota de suero (600 \mul) mezclada con igual volumen de PBS reaccione con el anticuerpo durante 30 minutos. Se sedimentan las partículas magnetizables usando un imán fuerte y se elimina el sobrenadante. Se lavan las partículas una vez con PBS y se tratan a continuación con hidróxido de sodio (0,3 M) que contiene cianuro de potasio (100 \muM), ditiotreitol (15 mM) y una cantidad fija de cianocobalamina radiomarcada con I^{125} o con Co^{57} en un volumen total de 100 \mul durante 15 minutos, para liberar la cobalamina unida a la holo-TC II inmovilizada y al mismo tiempo convertir todas las formas de cobalamina en cianocobalamina y mezclar con una cantidad fija de cianocobalamina marcada. Se añade una cantidad limitada de Factor Intrínseco en 100 \mul de tampón borato y se deja reaccionar durante 10 minutos. Se sedimentan las partículas magnetizables mediante un imán fuerte y se retiran 150 \mul del sobrenadante para medir la radiactividad. Se determina la concentración de cobalamina unida a TC II en la muestra de suero a partir de una curva patrón.

Alternativamente, se puede medir la cobalamina liberada usando el método IMx de Abbot o métodos similares.

Ejemplo 3

Se inmovilizan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) específicos para holo-TC II sobre partículas magnetizables. Se añaden a una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclada con igual volumen de PBS una cantidad fija de holo-TC II marcada con I^{125} y una cantidad limitada del anticuerpo anti-holo-TC II inmovilizado. Después de incubar durante 15 minutos, las partículas magnetizables son sedimentadas usando un imán fuerte. Se lavan las partículas con PBS y se mide la radiactividad. Se determina la concentración de holo-TC II a partir de una curva patrón.

Ejemplo 4

Se inmoviliza holo-TC II recombinante sobre partículas magnetizables. Se añaden a una alícuota de suero (100-500 \mul) mezclada con igual volumen de PBS una cantidad fija de holo-TC II inmovilizada y un exceso de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal) específico para holo-TC II y radiomarcado con I^{125}. Después de incubar durante 15 minutos, las partículas son sedimentadas usando un imán fuerte. Se lavan las partículas con PBS y se mide la radiactividad. Se determina la concentración de holo-TC II a partir de una curva patrón.

Ejemplo 5

A una alícuota de suero (100-500 \mul), se añade un exceso de cobalamina biotinilada para unir toda la apo-TC II y la apo-HC. Tras incubar durante 10 minutos, se trata la muestra de suero con partículas revestidas de avidina durante 10 minutos. Se sedimentan las partículas usando un imán fuerte. Se recupera el sobrenadante y se mezcla con dos anticuerpos anti-TC II monoclonales no solapantes, uno radiomarcado con I^{125} y el otro con biotina conjugada. Después de 10 minutos, se añaden partículas magnetizables revestidas de avidina y se deja que se unan a los aductos biotinilados durante 10 minutos. A continuación, se sedimentan las partículas con un imán fuerte y se lavan con PBS. Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II por interpolación en una curva patrón.

Ejemplo 6

Igual que el Ejemplo 5, pero se mezcla el suero desprovisto de apo-TC II con una cantidad fija de holo-TC II marcada con I^{125} y una cantidad limitada de anticuerpo anti-TC II inmovilizado sobre partículas magnetizables. Después de incubar durante 15 minutos, se sedimentan las partículas usando un imán fuerte.

Se lavan las partículas con PBS y se mide la radiactividad.

Ejemplo 7

Se inmoviliza cobalamina sobre microesferas magnetizables, por ejemplo, por copulación covalente o usando copulación con biotina-(estrept)avidina. Típicamente, se incuban microesferas magnetizables revestidas de estreptavidina con 1 \muM de cobalamina biotinilada durante 30 minutos a temperatura ambiente y en obscuridad. Se sedimentan las perlas usando un imán, se lavan dos veces con PBS y se resuspenden al 1% en PBS + 5 mg/ml de HSA. A una alícuota de suero (100-500 \mul), se añade el mismo volumen de PBS y un 1/10 de volumen de microesferas magnetizables revestidas de cobalamina. Se incuba la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente en obscuridad para unir toda la apo-TC II y la apo-HC. Se sedimentan las partículas mediante un imán y se recupera y mezcla el sobrenadante con dos anticuerpos anti-TC II humana monoclonales no solapantes, uno radiomarcado con I^{125} y el otro conjugado con biotina. Al cabo de 10 minutos, se añaden microesferas magnetizables revestidas de (estrept)avidina y se deja que se unan a los aductos biotinilados durante 10 minutos. A continuación, se sedimentan las partículas con un imán y se lavan con PBS. Se mide la radiactividad y se determina la concentración de holo-TC II por interpolación en una curva patrón.

Ejemplo 8

Igual que el Ejemplo 7, pero se añade un exceso de cobalamina biotinilada directamente a la muestra de suero + PBS para unir toda la apo-TC II y la apo-HC. Después de incubar durante 10 minutos, se trata la muestra de suero con microesferas magnetizables revestidas con (estrept)avidina durante 30 minutos a temperatura ambiente y en obscuridad.

Ejemplo 9

Se inmovilizó anticuerpo de conejo específico para la TC II humana y con una constante de unión aparente >5x10^{9} M^{-1} sobre microesferas magnetizables de 1 \mum revestidas con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (Indica Diagnostics). Se mezclaron muestras de suero de 400 \mul cada una de 49 voluntarios sanos con igual volumen de PBS y 40 \mul del anticuerpo inmovilizado (1%). Se mantuvieron las mezclas a temperatura ambiente en obscuridad durante 1 hora y se sedimentaron luego las microesferas usando un imán. Se lavaron los precipitados una vez con tampón de lavado helado (PBS más un 0,02% de Tween 20) y se resuspendieron posteriormente en 50 \mul de ditiotreitol 50 mM, 0,001% de cianuro de potasio y una cantidad fija de 57Co-CN-cobalamina (Amersham) en tampón fosfato, pH 7,5. Se dejo reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se añadieron 25 \mul de hidróxido de sodio 0,5 M y 15 minutos después 300 \mul de Factor Intrínseco inmovilizado sobre Dextrano (suficiente para unir un 50% del trazador) en tampón fosfato, pH 8,6. Después de 1 hora a temperatura ambiente en obscuridad, se centrifugaron las muestras a 1000 g y 4ºC durante 10 minutos, se retiraron cuidadosamente los sobrenadantes y se contaron las pellas en un Riastar Packard. Se determinó la concentración de cobalamina unida a TC II a partir de una curva patrón construida con 8 calibradores (0-500 pM de holo-TC II) tratados de forma idéntica a las muestras. Se analizaron también 37 muestras de suero con respecto a la cobalamina sérica total usando el ensayo IMx B12 de Abbot.

En la Figura 1 se muestra la curva patrón para la holo-TC II y en la Figura 2 se ilustra la relación entre las concentraciones séricas totales de cobalamina y de holo-TC II en 37 voluntarios sanos. Es evidente que la correlación es baja, con r^{2} = 0,50. Por el contrario, la correlación entre la holo-HC y la cobalamina sérica total es alta, con r^{2} = 0,96 (Fig. 3). La concentración medida de holo-TC para los 49 voluntarios sanos era de 64 \pm 28 pM y el rango de referencia del 95% de 23-127 pM.

El ensayo tiene una CV del 10%, una sensibilidad analítica (0-calibrador - 3 s.d.) por debajo de 10 pM y no tiene reacción cruzada con la haptocorrina.

Claims (21)

1. Un método de ensayo para la determinación de cobalamina unida a transcobalamina II (TC II) en una muestra corporal, consistente en poner en contacto una muestra libre de células de un fluido corporal con una cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las apo-formas de TC II y haptocorrina y en poner en contacto a continuación dicha muestra con un ligando específico inmovilizado o inmovilizable para la TC II o la TC II unida a cobalamina (holo TC II), separar una fracción unida a ligando de una fracción no unida a ligando y medir el contenido en holo-TC II o cobalamina unida a TC II en la misma.

2. Un método de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1, donde dicho ligando de unión específica es seleccionado entre el grupo consistente en un anticuerpo policlonal o monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un polipéptido, un oligopéptido, un pequeño compuesto químico orgánico, un ligante seleccionado entre una librería de química combinatoria o de exhibición de fagos, una secuencia de unión específica a ADN o ARN o un receptor de la superficie celular.

3. Un método de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1 ó en la reivindicación 2, donde dicho ligando de unión específica exhibe un alto grado de selectividad y de especificidad hacia la TC II y exhibe baja afinidad hacia otras proteínas TC, ya sea en la forma apo como en la holo, o cualquier otra proteína de unión a cobalamina.

4. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha cobalamina se libera de las moléculas de holo-TC II cambiando la temperatura o el pH del medio circundante.

5. Un método de ensayo según se reivindica en la reivindicación 4, donde dicha cobalamina liberada es determinada por un ensayo competitivo realizado por contacto de un compañero de unión inmovilizado para la cobalamina con la cobalamina disociada de la muestra en presencia de ligando marcado, que compite con la cobalamina aislada por la unión a los compañeros de unión inmovilizados.

6. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho método consiste en poner en contacto un soporte sólido que tiene inmovilizado sobre el mismo un ligando de unión a TC II u holo-TC II con la muestra investigada y también con un ligando no inmovilizado,

donde dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse a TC II u holo-TC II, a dicho ligando no inmovilizado o a complejos de dicha TC II u holo-TC II y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse a al menos uno de dichos ligando inmovilizado, TC II u holo-TC II y complejos de dicho ligando inmovilizado y TC II u holo-TC II;

donde, si dicho método de ensayo es un ensayo en emparedado, al menos uno de dichos ligandos es específico para la holo-TC II y, si dicho ensayo es un ensayo competitivo, dicho ligando inmovilizado es específico para holo-TC II y competidores de la misma;

mediante lo cual la proporción de dicho ligando inmovilizado unido a TC II u holo-TC II, a dicho ligando no inmovilizado o a complejos de dicho ligando no inmovilizado y TC II u holo-TC II es dependiente de la cantidad de holo-TC presente en dicha muestra, y

dicho ligando no inmovilizado es capaz de generar una señal directa o indirectamente detectable cuando está unido o cuando no está unido;

separar una fracción unida de una fracción no unida, y

determinar directa o indirectamente el ligando no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (la fracción unida) o no unido y en solución (la fracción no unida);

donde el contacto de la muestra y dicho ligando no inmovilizado con el soporte sólido puede ser realizado por separado, simultánea o secuencialmente y, si se realiza por separado o secuencialmente, pueden contactar en cualquier orden.

7. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho ligando de unión a TC II posee una constante de afinidad de al menos 10^{9}M^{-1}.

8. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la constante de afinidad es mayor de 10^{11}M^{-1}.

9. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el grado de reactividad cruzada de un ligando de unión a holo-TC II o TC II con HC es de entre el 0,1% y el 1%.

10. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el grado de reactividad cruzada de un ligando de unión a holo-TC II o TC II con HC es menor del 0,1%.

11. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha muestra que contiene el complejo holo-TC II contacta con una fase sólida a la que se une un ligando marcado que reconoce los mismos sitios de unión sobre los ligandos inmovilizados que la holo-TC; la holo-TC II en dicha muestra compite con dicho ligando marcado unido por dichos sitios de unión, de tal forma que, después de equilibrar el sistema, existe una relación directamente proporcional entre la cantidad de ligando marcado desplazado de dicho soporte sólido y detectable en solución y la cantidad de holo-TC II presente en la muestra original; siendo detectado dicho ligando marcado directa o indirectamente como la cantidad de ligando marcado unido o no unido a dicho soporte sólido según sea apropiado.

12. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha muestra que contiene holo-TC II contacta con un soporte sólido que tiene holo-TC II inmovilizada sobre el mismo y un ligante específico para holo-TC II no inmovilizado marcado, donde la holo-TC II libre de la muestra y la holo-TC II inmovilizada compiten por la unión al ligando no inmovilizado marcado, y la determinación del ligando marcado unido a la fase sólida o que permanece en solución permite la determinación de la concentración de holo-TC II.

13. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha muestra que contiene holo-TC II contacta con holo-TC II marcada y con ligando inmovilizado para la misma, dichos complejos de holo-TC II marcados y no marcados compiten por la unión al ligando inmovilizado y, después de alcanzar el equilibrio, la cantidad de holo-TC II marcada unida al ligando inmovilizado es indirectamente proporcional a la cantidad de holo-TC II en la muestra.

14. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde dicha muestra corporal es seleccionada entre el grupo consistente en fluido seminal, fluido cerebroespinal, fluido amniótico o una muestra derivada de sangre.

15. Un método de ensayo según se reivindica en la reivindicación 14, donde dicha muestra derivada de sangre es suero o plasma.

16. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde dicha fracción unida es separada de dicha fracción no unida por precipitación, centrifugación, filtración o métodos cromatográficos.

17. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho ligando detectable está marcado con un marcaje formador de señal que puede ser determinado por luminiscencia, quimioluminiscencia, determinación colorimétrica, fluorescencia, radiactividad o actividad enzimática.

18. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde la calibración del ensayo es efectuada usando un patrón de holo-TC II.

19. Un método de ensayo según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde dicho patrón es holo-TC II humana, nativa o recombinante.

20. Un kit para uso en un ensayo diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, consistente en:

cobalamina inmovilizada o un análogo o fragmento de la misma que se une selectivamente a las apo-formas de TC II y haptocorrina;

un ligando de unión específica inmovilizado o inmovilizable para TC II u holo-TC II;

preferiblemente, una solución de holo-TC II de concentración conocida o un conjunto de dichas soluciones que tienen un rango de concentraciones de complejo holo-TC II;

eventualmente, un agente de liberación para liberar la cobalamina de la holo-TC II, y

eventualmente, un ligando marcado.

21. El uso de holo-TC II como calibrador en un ensayo para holo-TC II según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.