KR100646305B1 - 코발라민 분석 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체액의 무세포 샘플을 고정 또는 고정 가능한 트랜스코발라민 (TC Ⅱ) 또는 코발라민 결합 TC Ⅱ (홀로 TC Ⅱ)에 대한 특이성 결합 리간드와 접촉시키고, 리간드 결합 분획을 리간드 비결합 분획으로부터 분리하고 그 안의 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 코발라민 함량을 측정하는 것을 포함하는 체 샘플 중의 트랜스코발라민 Ⅱ 결합 코발라민의 측정을 위한 분석 방법을 제공한다.
코발라민 분석, 트랜스 코발라민 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ(TC Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ), 합토코린 (HC), 홀로 (holo)-TC Ⅱ, 아포 (apo)-TC Ⅱ, 리간드
Description
도 1은 홀로-TC Ⅱ 에 대한 표준 곡선이고,
도 2는 총 혈청 코발라민과 홀로-TC Ⅱ 농도와의 관계를 나타내는 플롯이고,
도 3은 총 혈청 코발라민과 홀로-HC 농도와의 관계를 나타내는 플롯이다.
코발라민 또는 비타민 B12는 식품 중에서 발견되는 비타민 B 복합체의 일부를 형성하는 수용성 비타민이다. 핵심 분자는 필수 코발트 원자를 둘러싸는 네개의 피롤 단위의 코린 고리로 구성된다. 코발라민은 동물 또는 식물에 의해 합성될 수 없는 유일한 비타민이며 식품으로부터 소화관 중에서 흡수되어야 한다. 그러나 간에 저장될 수 있다. 이는 미생물, 특히 혐기성 세균 및 효모에 의해 합성된다.
코발라민은 생체내에서 보효소 및 코발라민 효소로서 세 가지 유형의 반응; (ⅰ)분자내 전위, 예를 들면 L-메틸말로닐 CoA로부터 숙시닐 CoA의 형성, (ⅱ)메틸화, 예를 들면 호모시스테인의 메틸화에 의한 메티오닌의 형성 및 (ⅲ)특정 미생물에 있어서 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매 작용하는 기능을 한다. 포유류에 있어서는, 단지 두 가지의 효소 반응, 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 에 구체적으로 언급한 반응들이 코발라민을 보효소로서 필요로 한다.
소화 과정 중에, 하기에 HC로 언급되는 합토코린 (또한 당업계에서 R-결합제 또는 트랜스코발라민Ⅰ및 Ⅲ로 집합적으로 지칭됨)이라 불리는 타액 단백질은 상부 위장 관에서 코발라민을 결합하여 위를 통과하는 복합체를 형성한다. 췌장 효소가 회장에서 코발라민-합토코린 (홀로(holo)-HC) 복합체를 소화시켜서 코발라민이 분리되고, 이는 다시 위 점막에서 분비되는 내인자라 불리는 단백질에 결합되어 또 다른 복합체를 형성한다. 코발라민-내인자 복합체는 말단 회장의 내층에서 특정 수용체에 결합하고, 그 후에 방출 인자에 의해 해리되고 코발라민은 회장의 막을 가로질러 혈류내로 능동수송된다.
코발라민은 체내를 유리 형태로는 감지할 수 있을 정도의 양으로 순환하지 않는다. 아마도 99% 정도의 코발라민은 트랜스코발라민 단백질 (TC Ⅰ-Ⅲ) 또는 알부민 중의 하나에 의해 결합된다.
코발라민을 표적 조직으로 수송하는 역할을 하는 것으로 믿어지는 단백질은 임계 미량 단백질인 트랜스코발라민 Ⅱ (TC Ⅱ)이며, 이것이 없으면 코발라민은 세포막을 통과할 수 없다. 이러한 중요한 대사 기능에도 불구하고, 단지 약 6-25%의 혈청 중 코발라민만이 TC Ⅱ에 결합하고 대부분은 HC에 의해 수송된다. TC Ⅱ는 주로 혈청, 정액 및 뇌척수액 중에서 발견되는 45 kDa의 단일 사슬 폴리펩티드이다. 코발라민 결합 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ는 세포막의 특정 수용체에 결합되고 한번 결합되면 홀로-TC Ⅱ 복합체는 세포흡수작용에 의해 세포 내로 흡수된다.
TC Ⅱ는 간, 혈관 내피, 장세포, 대식세포 및 섬유아세포에 의해 합성되며 주로 아포 (apo)-TC Ⅱ (즉, 코발라민이 결합되지 않음)로서 순환한다. 대략 90분의 짧은 반감기를 갖는다.
전체 혈장 코발라민의 4분의 1미만이 TC Ⅱ와 결합된다. 나머지는 상기한 기타 트랜스코발라민 또는 알부민에 결합된다.
코발라민은 식품으로부터 섭취해야 하기 때문에, 위 기능을 약화시키는 임의의 질환, 예를 들면 위장염 또는 위의 위축을 야기하는 질환, 또는 기능적인 합토코린, 내인자, 방출인자, TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 수용체의 생산 불능은 코발라민의 흡수를 약화시켜서 결핍을 결과한다.
특정 개체군 소집단, 예를 들면 노인, 임산부, 만성 또는 급성 위장병 환자, 특정 자기면역 질환을 앓고 있는 이들, 악성 빈혈 가족력을 갖고 있는 이들 및 AIDS 환자가 특히 코발라민 결핍에 걸리기 쉽다.
코발라민 결핍의 임상적 발현은 다양하고 여러 가지이나 주로 빈혈, 거대적아구 조혈 및 신경계의 기능적 및 구조적 이상을 포함한다. 코발라민 결핍으로 진단된 개인들의 약 60%가 빈혈이나, 대부분이 신경학적 증상만이 유일하게 관찰되는 임상적 징후이다. 대략 10%의 환자가 정신의학적 증상을 나타내고 약 40%가 신경학적 및 정신의학적 증상을 둘 다 나타낸다.
특정의 코발라민 결핍의 발현은, 특히 신경정신의학적 작용은 조기에 발견하여 코발라민 치료에 의해 완화시키지 않으면 돌이킬 수 없기 때문에, 코발라민 결핍의 조기 진단은 환자의 양호한 예후를 보장하기 위하여 중요하다.
그러므로 개인이 코발라민 결핍에 걸릴 수 있느냐 그렇지 않느냐를 확립하기 위하여, 개인의 코발라민 수치를 편리하고 효율적인 방법으로 정확하게 분석하는 것이 요망된다.
총 혈장 코발라민, 즉 트랜스코발라민 (TC) 단백질 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 중 어느 하나에 결합된 코발라민 (코발라민 유사 물질)의 측정이 코발라민 결핍을 분석하기 위해 사용되어 왔다. 이 기술은 정상으로 사료되는 개체군 범위 안의 넓은 기초 농도 분포를 결과하므로 넓은 표준 범위를 산출한다. 그러나 개인들 중에서, 개인에 대하여 정상이라고 사료되는 유효한 코발라민의 범위는 매우 좁다. 비록 개개인의 대사 활성 코발라민 농도가 그들 자신의 표준 범위 밖으로 넘어갈지라도, 총 혈장 코발라민의 함량이 개체군에게는 정상으로 사료되는 범위내인 것이 관찰되었다. 이러한 상황하에서, 코발라민 결핍이 검출되지 않고 지나칠 수 있다. 이러한 신뢰할 수 없는 방법은 명백하게 바람직하지 않고 상기 혈청 또는 혈장 코발라민 측정은 낮은 진단 감도 및 특이성을 갖는 것으로 인정된다.
성장을 위하여 코발라민 의존성인 미생물을 포함하는 미생물 분석이 개발되었고 혈장 코발라민 농도를 측정하는데 사용되어 왔으나, 적절한 표준 범위를 추정하기가 어렵다는 것이 추가하여, 이들 방법은 시간이 많이 소요되고 귀찮으며, 신속한 실험실 스크리닝에 전적으로 부적합한 코발라민의 추출 및 전환을 필요로 한다.
코발라민 결핍을 분석하기 위한 대안적인 방법은 전환에 코발라민을 필요로 하는 혈장내 대사산물의 축적을 측정하는 것을 포함한다. 혈장 메틸말로네이트 및 혈장 호모시스테인 수치는 코발라민 결핍 개인에서 증가하고 [샤나린(Chanarin), 거대적아구성 빈혈 (The megaloblastic anaemia);런던, 블랙웰 사이언티픽 퍼블리케이션 (Blackwell Scientific Publications), 1991] 비타민 B12 결핍과의 상관을 위한 양호한 후보 분자를 제공한다. 그러나 호모시스테인 분석을 기초로 하는 방법은 복잡하고 비실용적이며 빈약한 특이성 및 감도를 나타낸다. 반면에 메틸말로네이트 측정을 기초로 하는 방법은 정확하고 신뢰할 수 있으나, 성가시고 복합된 가스-크로마토그래피/질량 분석법에 의한 분석이 필요해서 비용이 높고 상용의 임상 스크리닝에 다시 부적절하다 [넥소 등 (Nexo et al.) (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:61-76].
총 혈장 코발라민에 대립하는 TC Ⅱ 결합 코발라민의 측정이 코발라민 결핍 가능성의 신뢰할 수 있는 임상 지표를 제공할 수 있다는 것이 또한 제안되었다 [허버트 등 (herbert et al.) (1990) Am. J. Hematol. 34:132-139;위크라마싱헤 & 피다 (Wickramasinghe & Fida) (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539; 미국 특허 제 4680273 호]. 그러나, 홀로-TC Ⅱ 농도를 측정하기 위한 이러한 노력은 현재까지 대부분이 간접적인 것으로, 홀로-TC Ⅱ의 농도를 총 혈장 코발라민 및 TC Ⅱ 소모 혈장의 코발라민 농도와의 차이로 추정하는 것이다.
상기 TC Ⅱ 소모는 황산암모늄 [카멜 (Carmel) (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62:367-372], 마이크로실리카 [헤르쯔리히 & 후버트 (Herzlich & Hubert) (1988) Lab. Invest. 58:332-337;위크라마싱헤 & 피다 (1993) J. Clin. Pathol. 46:537- 539], 마이크로파인 유리 [부 등 (Vu et al.) (1993) Am. J. Hematol. 42:202-211] 또는 고정 항-TC Ⅱ 다클론성 항체 [린드만스 등 (Lindemans et al.) (1983) Clin. Chim. Acta 132:53-61]에로의 흡착에 의해 수행될 수 있다. 총 혈장 및 소모된 분획 중의 코발라민의 농축은 방사선 또는 효소 혈청항체분석 기술과 같은 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 수행된다. 이들 방법은 복잡하고 시간이 많이 소요되기 때문에 그리고 사용된 흡착 물질의 낮은 특이성이 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-HC의 불충분한 분리를 결과하여 홀로-TC Ⅱ의 과다 추정을 야기하기 때문에 자동화된 또는 비자동화된 상용의 스크리닝에 부적절하다. 흡착 물질의 로트-투-로트 (lot-to-lot) 변동은 보다 더 큰 오차를 유도하고 가장 중요하게는 하나의 큰 부피에서 또 하나의 큰 부피를 빼는 것은 받아들일 수 없는 부정확성 및 비신뢰성을 결과한다.
TC Ⅱ를 분석하기 위한 또 다른 시도는 TC Ⅱ를 TC Ⅰ및 TC Ⅲ를 포함하는 다른 혈청 성분으로부터 친유성을 이용하여 분리하는 것을 포함한다. 그리하여 카펠 등 [Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172:297-310], 벤헤이욘 등 [Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89:195-199] 및 토프트 등 [Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62]는 각각 헤파린 세파로스, 실리카겔 또는 셀룰로오즈를 사용하여 기타 트랜스코발라민으로부터 TC Ⅱ를 분리하는 방법을 공개한다. 그러나 이들 방법은 간접 방법과 동일한 흡착 물질에 의존하기 때문에 동일한 단점을 갖는다. 또한 홀로-TC Ⅱ의 낮은 혈장 농도는 이들 방법이 현존하는 코발라민 정량법과 조합되는 것을 부적절하게 한다. 홀로-TC Ⅱ의 정상 범위는 35-160 pM이며 35 pM미만의 값은 일반적으로 코발라민 결핍의 지표로서 여긴다. 혈장 코발라민에 대한 대부분의 상용 방법의 보고된 분석 감도는 약 40 pM이나 실제로는 종종 훨씬 높아서, 전형적으로는 90 pM정도이다. 그러므로, 홀로-TC Ⅱ의 정상 혈장 수치가 코발라민 정량을 위한 상용 방법의 감도 한계보다 낮거나 그 부근이다.
아마도 현재로서 가장 정확하다고 인정되는 TC Ⅱ 결합 코발라민을 측정하기 위한 방법은 TC Ⅱ를 실리카에 흡착시킨 다음 결합된 분획을 코발라민 함량에 대하여 예를 들면 쿠에멀르 등 [Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10:2073-2077]에 의해 기술된 혈청항체분석법 또는 미생물학적 분석법 (후자의 방법이 명백하게 최상의 결과를 낸다)에 의해 분석하는 것을 포함한다. 이 방법은 단지 20 개의 분석을 수행하기 위해 하루 전체가 필요하다. 이는 매우 고가이며 비실용적이어서 상용의 임상 진단 실험실 연구에는 부적절하다.
그러므로, 코발라민 수치와 코발라민 결핍의 가능성을 상관시키기 위하여, 상용의 임상 진단 적용에 적절한, 체액 중의 대사 활성 코발라민의 수치를 분석하기 위한 개선된 방법이 절실히 요구된다.
본 발명은 체액 중의 코발라민 또는 비타민 B12를 측정하기 위한 분석 방법 및 특히 코발라민의 대사 활성 풀 (pool)에 대한 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 첫번째 국면에 따르면, 본 발명은 체액의 무세포 샘플을 고정 또 는 고정 가능한 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 대한 특이성 결합 리간드와 접촉시키고, 리간드 결합 분획을 리간드 비결합 분획으로부터 분리하고 그 중의 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 코발라민 함량을 측정하는 것을 포함하는, 체 샘플 중의 트랜스코발라민 Ⅱ 결합 코발라민의 측정을 위한 분석 방법을 제공한다.
특이성 결합 리간드는 단순하게 체액 샘플의 많은 성분에 대하여 공통일 수 있는 전반적인 물리-화학적 성질 (예컨대 친유성)에 의해서가 아니라 특정의 화학 구조 또는 형태에 의하여 TC Ⅱ (즉 아포-TC Ⅱ 및 홀로-TC Ⅱ) 또는 홀로 TC Ⅱ에 결합하는 것을 의미한다. 본 방법에 사용하기 적절한 리간드의 결합 친화성 및 특이성은 바람직하게는 3-배, 보다 바람직하게는 5-배 및 보다 더 바람직하게는 10-배 및 가장 바람직하게는 10-배 이상의 샘플 중 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ의 농축을 가능하게 하므로 상기 방법은 홀로-TC Ⅱ의 보다 낮은 정상 범위 및 또한 준-정상 범위에서 홀로-TC Ⅱ에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 값을 줄 수 있다. 표적 분자의 분리 및 농축은 HC 또는 홀로-HC로부터 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ를 효율적으로 분리하는 것이 불가능한 현존하는 방법으로는 가능하지 않다. TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ를 적어도 3배로 농축시킬 수 있어야 분석 실행시 자동화된 분석 장치의 사용이 허용된다. 그러한 농축 단계 없이는, 샘플 중에 존재하는 분석물의 양이 검출 하한보다 낮을 수 있다. 상기 자동화된 분석장치는 그의 작동을 위해서는 전형적으로 150 μl 이상의 총 부피 중 전형적으로 40 내지 100 μl의 샘플을 필요로 한다. 그러므로, 저농도 분석물이 심지어 분석을 위하여 희석된다. 본 발명의 분석 방법을 사용함으로써, 분석물이 적어도 3-배 농축된다. 상기 자동화 분석 장치를 사용 하면 감도 하한 약 40 pM의, 그러나 실제적으로는 하한 약 90 pM으로 100-700 pM의 대조용 범위를 전형적으로 포함하기 때문에, 5-배 농축은 18 pM으로 낮은 홀로-TC Ⅱ의 측정을 가능하게 하고 10-배 농축은 9 pM으로 낮은 홀로-TC Ⅱ의 측정을 가능하게 한다. 본 발명은 10-배 이상의 농축도 가능하기 때문에 당업계 숙련인 에게 감도가 증진되는 정도가 매우 효과적인 기술을 만든다는 것이 잘 이해될 것이다.
분석물을 농축시켜서 상기 자동화된 방법에 의한 분석에 적합하게 할 수 있다는 것이 본 분석 방법의 중요한 이점이다.
바람직하게는 체액의 출발 샘플 600 μl로부터, 150 μl이하의, 보다 바람직하게는 100 μl이하의, 가장 바람직하게는 60 μl미만의 부피를 생성시킨 다음, 이를 임의로 자동화된 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
임의의 TC Ⅱ 특이성 결합 리간드가 본 발명의 방법에서 포획, 농축 및 분리 리간드 또는 검출 리간드로서 사용될 수 있으며, 본 발명의 특정 실시태양에 따라서, 아포 및 홀로 형 둘 다의 TC Ⅱ에 결합할 수 있거나 홀로-형에 특이적으로 또는 우세하게 결합할 수 있다. TC Ⅱ 결합 리간드는 바람직하게는 TC Ⅱ에 대하여 고도의 선택성 및 특이성을 나타낼 것이며 아포 또는 홀로 형의 기타 TC 단백질, 즉 TC Ⅰ 또는 Ⅲ 또는 임의의 기타 코발라민-결합 단백질에 대하여는 낮은 친화성을, 보다 바람직하게는 친화성이 본질적으로 없는 것을 나타낼 것이다. TC Ⅱ 결합 리간드가 홀로-TC Ⅱ 특이성 결합 리간드라면, 아포-TC Ⅱ에 대하여도 낮은 친화성을, 바람직하게는 친화성이 본질적으로 없는 추가의 요구조건과 함께 동일한 성질을 나타낸다.
TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드는 일반적으로 항체, 항체 단편 또는 세포 표면 수용체, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 작은 유기 화학물질 등과 같은 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 각각에 대한 친화성을 갖는 화합물 중 하나일 것이다. 기타 결합 리간드는 결합 화학 또는 파아지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)로부터 선택된 특이성 결합제 또는 DNA 또는 RNA의 특이성 결합 서열일 수 있다.
결합 리간드가 항체라면 이는 다클론성일 수 있으나 바람직하게는 단클론성이다. 단클론성 항체는 다클론성 항체에 비하여 현저히 높은 특이성 및 균일성을 산출할 수 있고 체액 중의 다른 성분, 특히 기타 트랜스코발라민 및 적절하다면, 표적 분석물의 다른 형태 즉 아포형과의 교차반응성을 감소시킨다. 단클론성 항체에 의해 제공되는 균일성 및 재현성은 다클론성 항체에 비하여 분석물이 상기한 바와 같이 저농도인 분석에서 필수적인 보다 높은 정확도를 보장한다. 대안적으로, 이는 항체 단편 예를 들면, F(ab), F(ab')2 또는 F(v) 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 일가 또는 이가일 수 있으며 하이브리도마 (hybridoma)기술에 의해 생산될 수 있거나 합성된 것일 수 있으며, 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의해 생산될 수도 있다. 예를 들면 단일 사슬 항체 또는 기타 항체 유도체 또는 유사체가 사용될 수도 있다. 항체는 적절하게 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 단백질의 임의의 에피토프 (epitope), 성분 또는 구조에 대하여 배향되거나 융기될 수 있다.
본 발명에서 결합 리간드로서 사용하기에 적절한 항체가 예를 들면 콰드로스 등 [Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:149-154] 및 맥린 등 [McLean et al. (1997) Blood 89(1);235-242]에 의해 공개된다.
TC Ⅱ의 아포 및 홀로 형을 결합할 수 있는 또는 우세하게 또는 특이적으로 홀로-TC Ⅱ 형을 결합할 수 있는 수용체 분자가 유사하게 사용될 수 있다. 적절한 수용체는 세표 표면 또는 막 결합 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 수용체이며 종간 반응성 성질은 인간 또는 소로부터 유래한 상기 수용체가 바람직하나 임의의 포유류 종으로부터의 상기 수용체 분자를 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 수용체 분자를 비교적 정제된 형태로 분리하는 것이 바람직하나, 수용체를 포함하는 세포막 또는 혼합된 막 분획을 바람직하게는 농축된 형태로 사용하는 것이 또한 시도된다. 상기 수용체 또는 수용체 함유 막 또는 막 분획은 이롭게는 신장, 태반 또는 종양 세포로부터 분리될 수 있다. 침착 세포는 일반적으로 상기한 수용체의 공급원으로 사용될 수 없다. 그러나 침착 세포는 합토코린 수용체의 공급원으로 사용될 수 있다.
TC Ⅱ 수용체가 풍부한 막 분획을 셀리그만 등 [Seligman et al., J. Biol. Chem 253:1766-1772 (1978)] 및 넥소 등 [Nexo et al., Biochem Biophys Act 628:190-200 (1980)]에 의해 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 근본적으로, 조직, 예를 들면 인간 태반 또는 토끼 간을 작은 조각으로 절단하고 0.15M NaCl 및 10 mM EDTA를 함유하는 트리스 완충액, pH 7.4 중에서 균질화시킨 후에 25,000xg에서 30 분간 원심분리시킨다. 잔류 혈액을 제거하기 위하여 균질화/원심분리를 적어도 1회 이상 반복한다. 이 막 분획을 세정제, 예를 들면 Ammonyx-LO, Triton X-100 또는 Chapso로 추출하고 4 ℃에서 100,000 x g로 30 분간 원심분리하여 청징 화시킨다. 이 상징액을 TC Ⅱ 수용체의 공급원으로서 사용한다.
홀로-TC Ⅱ 복합체에 우세하게 결합하는 적절한 수용체 분자의 예는 무공유결합 호모다이머로서 존재하는 62 Kda 단일 사슬 당단백질이며 모든 조직의 세포 표면에서 발견된다 [로덴버그 & 콰드로스 (Rothenberg & Quadros) (1996) Balliere's Clinical Haematology 8(3) 499-514;WO 제 96/085150 호]. 본 발명의 분석 방법에 사용하기에 적절한 또 다른 단백질은 모에스트럽 등 [Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science 93:8612-8617]에 의해 공개되고 기술된 바와 같이 흡수성 상피 세포, 예를 들면 신장 인접 세관에서 발현되는 gp300, 600 kDa 세포흡수작용 조정 막 단백질이다. 이 수용체는 LDL 수용체이고 TC Ⅱ의 아포 및 홀로 형 모두를 결합한다.
세포 표면 수용체가 사용된다면, 접합에 의해 예를 들면 비이드 또는 시이트의 표면에 고정될 수 있고, 또는 대안적으로 수용체를 함유하는 세포막 분획이 수용체를 밖으로 드러내는 소낭 또는 시이트로 성형될 수 있다.
리간드가 고정될 때, 예를 들면 필터 필름 또는 시이트와 같은 고체의 표면 또는 관의 관강상일 것이나, 입자, 예를 들면 다이노 인더스트리어 ASA (Dyno Industrier ASA, 노르웨이)에 의해 생산되는 것들과 같은 마이크로스피어상으로의 고정이 특히 바람직하다. 상기 입자는 다공성 또는 비다공성일 수 있으며 원한다면, 상기 입자를 집합시키는 수단을, 예를 들면 초상자기성 산화철 결정과 같은 자기 반응성 물질을 입자에 포함시킴으로써 제공할 수도 있다. 상기 자기 반응성 마이크로비이드는 다이노 인더스트리어 ASA 및 다이날 AS (Dynal AS, 노르웨이), 뱅 파티클즈 (Bang Particles, 미국) 및 프롤라보 (Prolabo, 프랑스)로부터 구입할 수 있다. 리간드가 고정되는 것과는 대조적으로 고정 가능하다면, 이는 리간드를 특이성 결합 쌍 (예를 들면 비오틴/스트렙트아비딘)의 한 구성원에 커플링하고, 임의로 기질에 결합된, 결합 쌍의 다른 구성원을 사용하여 응집시켜서, 그렇지 않으면 본 발명의 수행시 비결합 분획으로부터 리간드 결합 분획을 분리하기에 앞서 리간드 또는 리간드:TC Ⅱ 또는 리간드:홀로-TC Ⅱ 복합체를 고정시킴으로써 달성될 수 있다.
친화성 분자, 예를 들면 항체 및 항체 단편을 분리 목적을 위하여, 예를 들면 리간드를, 임의로 링커에 의해, 결합 또는 커플링 시켜, 분리 또는 컬럼상의 고정을 위하여 현재 널리 사용되고 제안되는 임의의 공지된 고체 지지체 또는 매트릭스로 고정시키는 것은 당업계에 공지되어 있으며 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 상기 고체 상은 입자, 시이트, 겔, 필터, 막, 섬유 또는 모세관 또는 마이크로티터 스트립 (microtitre strip), 관 또는 웰의 플레이트 등의 형태를 취할 수 있으며 편리하게는 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합체 물질로 만들어질 수 있다. 리간드를 고체 지지체에 결합하는 기술 또한 잘 공지되어 있으며 문헌에 광범위하게 기술되어 있다.
리간드를 기질에 또는 특이성 결합 쌍의 한 구성원에 커플링 하는 것은 통상적인 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
분석이 경쟁 결합 분석으로 수행된다면, 본 발명의 방법은 일반적으로 리간드와 결합하기 위해 경쟁하는 표지 화합물을 샘플에 첨가하는 것을 포함할 것이다. 일반적으로, 이러한 점에서 표지 홀로-TC Ⅱ를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 사용되는 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 임의의 표지, 예를 들면 발색단 (이 용어는 형광단을 포함하는 것으로 사용됨), 방사선 표지 (일반적으로 공유 결합된 또는 킬레이트 결합된), 효소 또는 효소 기질, 자기 표지등을 사용할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 고정 또는 고정 가능한 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드를 조사하는 샘플과 접촉시키고;
리간드-결합 분획을 리간드-비결합 분획으로부터 분리하고;
결합 분획 중의 홀로-TC Ⅱ 분자로부터 결합 코발라민을 해리하고 방출된 코발라민의 농도를 측정하는 것을 포함하며, 바람직하게는 해리에 의해 방출된 코발라민의 농도가 최초 샘플 중의 홀로-TC Ⅱ의 농도에 비하여 적어도 3배, 바람직하게는 5배, 보다 더 바람직하게는 10 배이상이도록 영향을 받는다.
본 발명의 이러한 국면의 핵심은 코발라민 측정의 표준 방법이 본 방법에서 유용하게 사용되도록 허용하는 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ의 분리 및 농축이다. 상기한 바와 같이, 상기한 농축 단계가 빠진다면 당업계의 방법은 코발라민이 너무 저농도로 존재하기 때문에 코발라민 측정에 부적절하다. 홀로-TC Ⅱ로부터 코발라민을 방출하기 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있으나 편리하게는 이에 대해서는 가열 또는 주위 매질의 pH를 변화시키는 것이 사용될 수 있다. 상이한 코발라민 형태는 KCN으로 처리하여 보다 덜 감광성인 시아노코발라민으로 전환될 수 있다. 유리 코발라민 측정을 위한 임의의 적절한 방법, 예를 들면 고정 코발라민에 대한 결합 파트너를 샘플의 해리된 코발라민과 고정 결합 파트너에 결합하기 위해 분리 코발라민과 경쟁하는 표지 리간드 존재하에 접촉시킴으로써 수행되는 경쟁 분석이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 쿠에머크 등 [Kuemmerk et al. (1992) Clin. Chem 38:2073-2077]에 의해 기술된 방법이 예를 들면 적절할 것이다. 유리 코발라민을 측정하기 위한 대안의 방법은 미국 특허 제 5451508 호에 기술되어 있으며 혈청항체 분석법 기술을 포함한다.
본 발명의 이런 실시태양에서 TC Ⅱ에 대한 결합 리간드는 고정되고 홀로 및 아포-TC Ⅱ 모두에 결합하는 것이 바람직하다.
대안의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 분석 방법은 그 위에 고정된 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드를 갖는 고체 지지체를 조사 샘플 및 또한 비고정 리간드와 접촉시키고;
여기에서 상기 고정 리간드는 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 및 상기 비고정 리간드의 복합체에 결합할 수 있고, 상기 비고정 리간드는 상기 고정 리간드, TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 및 상기 고정 리간드 및 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 복합체중 적어도 하나에 결합할 수 있으며;
여기에서 상기 분석 방법이 샌드위치 분석이라면, 상기 리간드 중 적어도 하나는 홀로-TC Ⅱ에 대하여 특이성이며 상기 분석이 경쟁 분석이라면 고정 리간드가 홀로-TC Ⅱ 및 이의 경쟁자에 대하여 특이성이고;
이에 의해 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 의해, 상기 비고정 리간드에 의해, 또는 상기 비고정 리간드 및 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ의 복합체에 의해 결합된 상기 고정 리간드의 비율은 상기 샘플 중에 존재하는 홀로-TC Ⅱ의 양에 의존하고;
상기 비고정 리간드는 결합된 경우 또는 비결합된 경우 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있으며;
결합 분획을 비결합 분획으로부터 분리하고;
고정 리간드에 결합된 (결합 분획) 또는 비결합이고 용액 중의 (비결합 분획) 비고정 리간드를 직접적으로 간접적으로 측정하고;
샘플 및 상기 비고정 리간드와 고체 지지체를 접촉시키는 것은 별개로, 동시에 또는 차례로 수행될 수 있으며 별개로 또는 차례로 수행시 이들은 어떤 순서로도 접촉될 수 있는 것을 포함한다.
그러므로, 본질적으로 본 발명 방법의 대안의 바람직한 실시태양은 고정 리간드에 직접적 또는 간접적으로 결합되거나 대안적으로 직접적 또는 간접적으로 결합하는데 실패한 비고정 리간드를 측정하는 것을 포함한다. 비고정 리간드가 고정 리간드에 결합하기 위하여 홀로-TC Ⅱ와 경쟁한다면, 비결합 비고정 리간드의 높은 수치는 샘플 중 홀로-TC Ⅱ의 농도가 높다는 것을 나타내는 지표이고, 비결합 비고정 리간드의 낮은 수치는 샘플 중 홀로-TC Ⅱ의 농도가 낮다는 것을 나타내는 지표이다. 비고정 리간드가 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 결합하고, 이것이 고정 리간드에 그후에 결합된다면 결합 비고정 리간드의 높은 수치는 샘플 중 홀로-TC Ⅱ의 농도가 높다는 것을 나타내는 지표이고 결합 비고정 리간드의 낮은 수치는 샘플 중 홀로-TC Ⅱ의 농도가 낮다는 것을 나타내는 지표이다.
그러므로 본 발명의 방법에 있어서, 코발라민의 대사 활성 풀은 아포 및 홀 로-TC Ⅱ 및 아포 및 홀로-HC (합토코린 또는 TC Ⅰ 및 TC Ⅲ)의 혼합물을 함유하는 체 샘플 중에 존재하는, 홀로-TC Ⅱ 복합체를 측정하거나 TC Ⅱ 분자에 결합된 코발라민을 측정함으로써 측정된다.
전 분리 단계가 TC Ⅱ 및 합토코린 (HC) 둘 다의 아포-형에 선택적으로 결합하는 고정 코발라민 또는 이의 유사체 또는 단편을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 전 분리 단계에서, TC Ⅱ 및 HC 단백질의 아포형은 고정 코발라민, 이의 유사체 또는 단편에 의해 결합되고 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-HC 복합체로부터 분리된다.
이 경우에, 분리된 TC Ⅱ의 홀로-형을 분석하는 것은 상기한 바와 같은 본 발명의 임의의 실시태양에 따라서 수행되나 복합체를 해리하고 이어서 방출된 코발라민을 측정하는 것보다 홀로-TC Ⅱ 복합체를 측정하는 것이 명백하게 가장 유용하다. 상기 전 처리 단계가 상기 대안의 바람직한 실시태양에 선행한다면, TC Ⅱ의 아포-형이 포획되어 더이상 유효하지 않기 때문에, 샌드위치 분석에서는 TC Ⅱ에 반하는 홀로-TC Ⅱ에 특이성인 적어도 하나의 리간드가 필요하고 경쟁 분석에서는 TC Ⅱ에 반하는 홀로-TC Ⅱ 및 이의 경쟁자에 특이성인 고정 리간드가 필요하다는 것이 더이상 적절하지 않다는 것이 숙련인에게 명백할 것이다. 그러므로, 고정 또는 비고정 리간드는 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 또는 이의 경쟁자에게 특이성일 수 있다.
고정 코발라민은 아포-TC Ⅱ에의 결합 및 이의 홀로-TC Ⅱ로의 전환을 결과 할 수 있기 때문에 그의 지지체로부터 해리되는 어떠한 유의한 경향을 나타내지 않아야 한다. 비오티닐화 코발라민은 아비딘/스트렙트아비딘이 결합된 고체 표면에 매우 안정한 방식으로 결합하고, 이러한 방식으로 지지체에 코발라민을 묶어두는 것이 이 단계의 수행을 위해 편리하다. 사실상, 비오티닐화 코발라민을 사용한다면, TC Ⅱ 및 HC의 아포-형에 결합하는 비고정 형태로 분석 샘플에 첨가할 수 있다. 이 샘플을 그 위에 고정된 비오틴에 대한 결합 파트너, 예를 들면 아비딘을 갖는 고체 표면과 접촉시킬 수 있다. 아비딘-비오티닐화 코발라민-TC Ⅱ의 복합체가 형성되고 이는 샘플로부터 용이하게 분리될 수 있다.
상기 전 분리 단계가 수행되는 본 발명의 한 실시태양에서, 샘플을 홀로-TC Ⅱ 복합체를 포획하여 합토코린을 용액 중에 남겨두는 고정 TC Ⅱ 리간드와 접촉시킨 다음 고정 홀로-TC Ⅱ를 표지 되어 검출 가능한 두 번째 TC Ⅱ 리간드와 접촉시킴으로써 홀로-TC Ⅱ 풀이 연속적으로 측정된다. 적절한 TC Ⅱ 결합 리간드의 예는 비오버랩핑 (non-overlapping) 단클론성 항체일 것이나, 사실은 TC Ⅱ에 대하여 특이성인 다클론성 항체가 TC Ⅱ 분자상의 상이한 에피토프가 인식되기 때문에 본 실시태양에서 포획 및 검출 모두 다에 적절할 것이다.
이 전 분리 단계가 수행되는 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 홀로-TC Ⅱ 분자는 표지 비고정 리간드와 이에 대한 고정 리간드에 결합하기 위하여 경쟁하므로 홀로-TC Ⅱ의 양은 고정 리간드에 결합되거나 결합되지 않은 표지 비고정 리간드의 양에 관련하여 계산된다.
바람직한 실시태양에서, 전 분리 단계 중에, 아포 TC Ⅱ 및 아포 HC의 코발라민, 이의 유사체 또는 단편으로의 결합은 한 부위에서 수행되거나 고정 코발라민 결합 TC Ⅱ의 비고정 리간드 또는 TC Ⅱ에 대한 결합파트너에 의한 차후의 인식 및 결합을 저해하는 방식으로 수행된다. 본 실시태양에서, 본 발명의 분석을 수행하기에 앞서 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-HC를 결합 아포형으로부터 분리할 필요가 없다. 본 실시태양에서, 비고정 결합 파트너 또는 리간드가 배향하는 부위가 매우 중요하며 아포 TC Ⅱ 및 아포-HC가 코발라민, 이의 유사체 또는 단편에 고정될 때 은폐 또는 차폐되거나 그렇지 않으면 결합에 유효하지 않게 되는 TC Ⅱ상의 에피토프이어야 한다.
최초의 분리 단계가 TC Ⅱ에 대한 결합 리간드를 사용하는 것을 포함하거나 또는 고정 코발라민, 이의 유사체 또는 단편을 사용하는 전 단계가 선행되든지 간에, 총 분리, 즉 샘플로부터의 모든 아포 및 홀로 TC Ⅱ 단백질의 분리는 본 방법의 필요조건이 아니며 샘플로부터 원하는 '단백질의 TC Ⅱ 부분집합'의 적어도 일부를 포함하는 분획을 분리하는 것으로 충분하다.
그러므로, 특정 실시태양에서, 결합 파트너 또는 리간드 및 결합 조건은 실질적으로 모든 선택된 "부분집합"의 분리가 달성되도록 선택될 수 있다. 이 경우에 비결합 분획은 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 단백질이 실질적으로 없는 것으로 간주할 수 있는데, 즉 어떤 성분이 분획화의 기준으로서 선택되느냐에 의존하여 적어도 80%, 90% 또는 95%의 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ 단백질이 없다.
대안의 실시태양에서, 결합 파트너 및 조건은 샘플 중 단지 일부의 TC Ⅱ 단백질만이 분획 내로 분리되도록 선택될 수 있다. 이러한 경우에, 분석용 표준 검정 곡선을 구축시 부분 분리가 고려되어야 한다. 이에 관하여, 검출된 홀로-TC Ⅱ의 농도를 측정할 수 있는 표준 검정 곡선의 산출은 당 업계에 공지된 표준 기술을 사용한다.
그러므로, 분획화 단계 중에, TC Ⅱ 결합 리간드가 사용된다면, 적어도 일부의 TC Ⅱ 결합 코발라민이 결합 분획 중에 위치할 것이고, TC Ⅱ이외의 분자, 예를 들면 HC 또는 알부민에 결합된 샘플중의 임의의 코발라민이 비결합 (즉, 비분리 분획 또는 분획들)일 것이다. 결합 분획중의 TC Ⅱ는 아포 및 홀로 형일 수 있으며 코발라민뿐만 아니라 코발라민 유사 물질 또는 유사체에 의해 복합될 수 있다.
원한다면, 본 발명의 방법은 샘플을 합토코린 (아포 및 홀로형 또는 홀로형만의)에 대한 고정 또는 고정 가능한 특이성 결합 리간드와 접촉시키는 또 다른 전분리 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법으로 홀로-HC로부터 유래하는 TC Ⅱ-결합 코발라민 측정에 있어서의 오차에 대한 임의의 인자를 감소시킬 수 있고 합토코린에 대하여 특정의 결합 친화성을 갖는 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 대한 특이성 결합 리간드를 사용할 수 있다.
그렇지 않으면, 상기한 바와 같이, 아포 및 홀로형 둘 다의 TC Ⅱ의 혈청 농도가 매우 낮기 때문에, 특히 높은 특이성 및 친화성을 갖는 리간드 또는 결합 파트너가 본 발명의 조작시 필수적이다. 또한 본 발명의 리간드의 요구되는 친화성 상수는 TC Ⅱ의 혈청 농도는 약 0.5-1 nM이나 홀로-TC Ⅱ의 농도는 단지 35-160 pM이기 때문에, 리간드가 TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 특이성인지 또는 그의 용도가 포획 또는 검출 리간드인지에 의존한다. 그러므로, TC Ⅱ 포획 리간드에 대하여, 적어도 109M-1, 바람직하게는 2x109M-1이상 및 보다 바람직하게는 1010M-1의 친화성 상수 가 요망된다. 홀로-TC Ⅱ 포획 리간드에 대하여, 친화성 상수는 적어도 1010M-1이 요망되고, 바람직하게는 2x1010M-1이상이고, 보다 바람직하게는 2x1010M
-1이상이고, 가장 바람직하게는 1011M-1이상이다. 명백하게 검출 결합제의 요구되는 친화성 상수는 분석의 농축 효과 때문에 포획 리간드의 것보다 낮을 수 있다.
홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 리간드의 HC와의 교차 반응성 정도는, 바람직하게는 1%미만, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 1%, 가장 바람직하게는 0.1% 미만이다. 유사하게 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드는 바람직하게는 1%를 초과하는 아포-TC Ⅱ와의 교차 반응성 정도를 나타내서는 안되며, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 1% 및 가장 바람직하게는 교차 반응성은 0.1%미만이어야 한다.
상기한 높은 친화성의 리간드를 사용함으로써 그들의 기능은 단순히 포획 및/또는 검출 리간드인 것을 넘어서 확장되어 분석 샘플로부터 TC Ⅱ 단백질을 분리하고 농축하는데 필수적인 역할을 한다. TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 대한 결합 리간드는 바람직하게는 리간드를 적어도 3-배, 보다 바람직하게는 적어도 5-배, 보다 더 바람직하게는 적어도 10-배 농축해야 한다.
경쟁 분석보다 치환 분석에 보다 유사한 분석 기술의 또 다른 실시태양에 있어서, 홀로-TC Ⅱ 복합체를 포함하는 샘플은 홀로-TC Ⅱ와 동일한 고정 리간드 상의 결합 부위를 인식하는 표지 리간드가 결합된 고체 상과 접촉시킨다. 샘플 중의 홀로-TC Ⅱ는 결합 표지 리간드와 부위에 대하여, 시스템의 평형화 후에, 지지체로부터 치환되어 용액 중에서 검출 가능한 표지 리간드의 양과 원 샘플 중에 존재하 는 리간드의 양이 직접 비례 관계이도록 경쟁한다. 표지 리간드는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있으며 적절하게 고체 지지체에 결합된 또는 결합되지 않은 표지 리간드의 양으로 측정할 수 있다. 결과적으로, 본 실시태양에서는, 상기 언급된 비고정 리간드가 샘플을 적용시키기 전에 고정 리간드에 결합하나 그러한 결합은 리간드가 어떠한 경우라도 고정된다라는 것을 의미하는 것으로 이해해서는 안 된다.
또 다른 바람직한 실시태양은 홀로-TC Ⅱ 함유 샘플을 그 위에 홀로-TC Ⅱ가 고정된 고체 지지체 및 표지 비고정 홀로-TC Ⅱ 특이성 결합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 샘플 중의 유리 홀로-TC Ⅱ 및 고정 홀로-TC Ⅱ는 표지 비고정 리간드와 결합하기 위하여 경쟁하고 고체 상에 결합된 또는 용액에 잔류하는 표지 리간드를 측정하면 홀로-TC Ⅱ 농도가 계산된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서 표지 비고정 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드는 항체이다.
또 다른 실시태양에서, 분석 대상물을 포함하는 샘플을 표지 홀로-TC Ⅱ 및 고정 리간드와 접촉시킨다. 표지 및 비표지 홀로-TC Ⅱ는 고정 리간드에 결합하기 위하여 경쟁하며 평형에 다다른 후에, 고정 리간드에 결합된 표지 홀로-TC Ⅱ의 양은 대상 샘플 중의 표지 홀로-TC Ⅱ의 양에 간접적으로 비례한다. 다시, 표지 홀로-TC Ⅱ는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있고 적절하게 고체 지지체에 결합된 또는 결합되지 않은 표지 홀로-TC Ⅱ의 양으로 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 홀로-TC Ⅱ 복합체에 대하여 특이성인 비고정이나 고정 가능한 리간드 (예를 들면 비오틴 또는 특이성 결합 쌍의 또 다른 구성원에 접합된)를 샘플과 접촉시켜서 홀로-TC Ⅱ/비고정 리간드 복합체를 형성한다. 그 다음 리간드/홀로-TC Ⅱ 복합체는 공지된 방법을 사용하여 용액으로부터 침전되고 분석을 위하여 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 임의로 TC Ⅱ 및 HC의 아포형의 샘플을 소모시키는 것과 같은 전 단계 후에, 두개의 표지 결합 파트너를 샘플에 첨가한다. 이 경우에 결합 파트너는 표지 홀로-TC Ⅱ 또는 이의 유사체 또는 단편과 이에 대한 표지 결합 파트너, 예를 들면 표지 항체이다. 본 실시태양에서 검출가능한 시그날은 표지들이 서로 상당히 근접한 때에만, 즉 두개의 표지 결합 파트너들이 서로 결합될 때에만 생성된다. 샘플에 첨가시, 홀로-TC Ⅱ에 대한 표지 결합 파트너는 샘플 중에 존재하는 비표지 홀로-TC Ⅱ에 결합할 수 있고 이 경우에는 검출 가능한 시그날이 생성되지 않으며, 또는 표지 TC Ⅱ 결합 파트너를 결합하는 표지 홀로-TC Ⅱ, 이의 유사체, 단편 또는 변이체에 결합할 수 있고, 이 경우에는 검출 가능한 시그날이 생성된다. 미국 특허 제 4568649 호에 기술된 아머샴 신틸레이션 근접 분석 (Amersham scintillation proximity assays)의 것들과 같은 표지 시약이 상기 실시태양에 통합하기에 적절하며 이러한 절차의 고감도는 분석물이 저농도로 존재하는 분석에 잘 적용된다. 그러므로 예를 들면, 결합 쌍 중의 한 구성원이 I125 또는 H3 과 같은 β-선 방사 핵종으로 표지될 수 있고 다른 구성원은 적절한 신틸레이션 분자로 표지될 수 있다. 방사된 β입자는 신틸레이션이 1.5 μm이내이지 않으면 그의 수성 환경에서 에너지를 잃어서 검출 가능한 시그날을 위하여 서로 결 합되는 표지 파트너 두개 모두 다를 요구한다. 서로 결합하는 두개 표지 파트너의 확률은 샘플 중의 홀로-TC Ⅱ의 농도가 낮을 수록 보다 큰 시그날이 생성되는 양상으로 샘플 중에 존재하는 홀로-TC Ⅱ의 농도에 의해 측정된다.
여기에서 사용되는, 용어 "측정" 또는 "분석"은 샘플 중의 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 코발라민의 양 또는 농도의 절대값을 얻기 위한 의미의 정량, 및 또한 세미-정량 및 정성 분석 또는 측정을 둘 다 포함한다. 예를 들면, 총 코발라민에 대한, TC Ⅱ 결합 코발라민의 수치 또는 양의 지수, 비율, 백분율 또는 유사한 지시를 얻을 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 사용되는 체 샘플은 임의의 코발라민 함유 샘플, 예를 들면 체액 또는 조직 샘플, 또는 현탁액 등일 수 있다.
그러나, 바람직하게는 샘플은 체액, 예를 들면 정액, 뇌척수액 또는 양수일 것이나, 일반적으로는 혈액 유도 샘플일 것이다. 분석에 사용되는 샘플이 바람직하게 무세포인 경우에 혈청 또는 혈장이 사용될 수 있다. 샘플은 본 발명의 분석 방법에 사용되기 앞서 처리될 수 있는데, 예를 들면 완충액 또는 기타 수성 매질을 첨가함으로써 희석될 수 있고 분석 전까지 예를 들면, 냉장 또는 동결에 의해 저장 또는 보존될 수 있다.
본 발명의 실행시, 결합 분획을 비결합 분획으로부터 분리하는데, 이는 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 침전, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 방법 등에 의해 수행될 수 있다.
의심의 여지를 없게 하기 위하여, 여기에서 사용되는 용어 "코발라민"은 "비 타민 B12"와 동의어이며 체내에서 발생할 수 있고 대사 활성 (적절하게 발현될 때)인 모든 형태의 비타민 B12 (시아노코발라민; 5-6-디메틸벤즈이미다졸일 시아노코바마이드; 메틸코발라민; 5'-데옥시아데노실코발라민)를 포함함을 명시한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에서, TC Ⅱ-결합 코발라민의 측정은 분리된 홀로-TC Ⅱ에 결합된 리간드를 검출함으로써, 또는 홀로-TC Ⅱ에 대한 표지 경쟁자를 사용하여, 이에 의해 홀로-TC Ⅱ가 표지 경쟁자와 이에 대한 결합 리간드에 결합하기 위해 경쟁하는 경쟁 분석을 수행함으로써, 또는 분리된 홀로-TC로부터 방출된 코발라민을 검출함으로써 수행될 것이다.
검출 가능한 리간드는 편리하게 임의의 통상적인 방법에 의해, 예를 들면 루미네센스 (luminescence), 화학 루미네센스 (chemiluminescence), 비색 평가, 형광, 방사능 또는 효소 활성에 의해 측정될 수 있는 시그날 형성 표지로 표지될 수 있다. 결과적으로, 당업계에 공지된 임의의 시그날 형성 표지를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
단지 예를 들기 위한, 본 발명에서 결합 리간드를 검출 가능하게 표지하는데 사용될 수 있는 착색 또는 형광 화합물의 특정의 적절한 예는 안트라퀴논, 아조 염료, 아진 염료, 예컨대 옥사진 및 티아진, 트리아진, 천연 색소, 예컨대 포르피린, 피코에리틴 및 피코콰닌을 포함하는 피코빌린단백질, 클로로필 및 그의 유사체 및 유도체, 카로테노이드, 아크리딘, 플루오레스세인 및 로다민을 포함하는 크산텐, 인디고염료, 티오크산텐, 쿠마린, 디 및 트리 아릴메틴을 포함하는 폴리메틴 및 프 탈로시아닌 및 금속 프탈로시아닌의 유도체이다.
유사하게, 광범위한 방사성 화합물을 본 발명에서 사용되는 시약의 시그날 형성 표지 부분으로서 사용할 수 있으며, 그 중에서 예를 들면 요오드-125-표지 화합물이다.
대안적으로, 결합 리간드는 공지된 방법 [콜미어, M.J. 등 (Cormier M.J. et al.); Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, 뉴욕 1973]으로 분석될 수 있는 화학 루미네센스 시그날을 생성할 수 있는 천연 또는 합성 화합물에 접합될 수 있다. 적절한 화학 루미네센스 화합물은 루시페린, 옥살산 에스테르, 1, 2-디옥스에탄, 루미놀 또는 이의 유도체를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 적절하다면, 과산화수소, 효소, 예를 들면 루시페린 효소, 또는 기타 화학물질을 사용하여 사용된 시그날 생성 분자로부터 화학 루미네센스 시그날을 생성할 수 있다.
강-음이온성 시그날 형성 분자는 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하지 않을 수 있는데, 샘플 중에 존재할 수 있는 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 혈청 단백질에 결합하는 경향을 갖기 때문이다. 사용될 수 있는 특히 적절한 예는 플루오레스세인 이소티오시아네이트, 로다민 B 또는 N-(레조르핀-4-카르보닐)피페리딘-4-카르복실산-N-(히드록시숙신이미드-에스테르) 또는 레소스이다.
본 발명 방법의 한 실시태양에 따르면, 체액을 TC Ⅱ에 대하여 특이성인 결합 리간드와 반응시킨 다음 TC Ⅱ 결합 분획을 샘플의 나머지로부터 분리하고, 이에 의해 그 안의 표적 분석물을 분리하고 농축함으로써, 적어도 일부의 TC Ⅱ를 포 함하는 분획을 체액 샘플로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서는, 홀로-TC Ⅱ에 대하여 배향되는 검출 가능한 결합 리간드를 사용하여 분리된 결합 분획 중에 존재하는 TC Ⅱ-코발라민 복합체를 측정할 수 있다. 홀로-TC Ⅱ 결합 리간드는 조사 샘플과, TC Ⅱ 결합 리간드와의 접촉 전에, 동시에 또는 후에 그리고 TC Ⅱ 결합 분획을 샘플의 나머지로부터 분리하기 전에 또는 후에, 접촉될 수 있다.
유사하게, 코발라민 함유 분획 (예를 들면 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-HC 포함)은 샘플의 나머지로부터, 조사 체액을 아포-TC Ⅱ 및 아포-HC를 결합하는 고정되거나 묶여진 코발라민 또는 이의 유사체 또는 단편과 반응시키고 결합 분획을 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-HC를 포함하는 샘플의 나머지로부터 분리시킴으로써 분리될 수 있다. 그 다음에 검출 가능한 TC Ⅱ 결합 리간드를 분리된 분획에 존재하는 TC Ⅱ-코발라민 복합체를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 검출 가능한 TC Ⅱ 결합 리간드는 조사 샘플과, 결합 코발라민과의 접촉 전에, 동시에 또는 그후에 그리고 결합 분획의 샘플의 나머지로부터의 분리 전 또는 후에 접촉될 수 있다.
특정의 구현에에서는, 아포 및/또는 홀로 TC Ⅱ/HC 복합체의 한 성분 또는 다른 성분들에 대한 고정 리간드는 컬럼내에서 배열될 수 있다. TC Ⅱ 코발라민 복합체를 함유하는 체액을 컬럼에 적용하고 결합 리간드(들)와 접촉시킬 수 있다.
컬럼은 수세되거나 세척될 수 있고 사용되는 용출제는 필요하다면, 컬럼으로부터 결합 분획을 방출되도록 하여 이의 수집을 용이하게 한다. 비결합 분획의 내용물이 기타 성분에 대하여 분석되거나 또한 분석된다면, 정확한 알고있는 부피를 투여하고 누적시키는 것을 보장하는 눈금이 정해진 미량 피펫을 사용하여 투여되는 완충액 또는 매질로 컬럼을 세척해야만 한다. 투여되는 부피는 바람직하게는 3 %이내의 의도된 (즉, 측정된)부피, 보다 바람직하게는 1 또는 2%이내이다. 유사하게, 분석되는 분획이 검출에 앞서 컬럼으로부터 방출된다면, 복합체를 방출하기 위해 사용되는 용출제는 눈금이 정해진 미량 피펫을 사용하여 투여되어야 한다.
대안의 실시태양에서는, 샘플의 분획을 분리하기 위해 사용되는 결합 리간드는 입자상 고체상 지지체, 예를 들면 라텍스 또는 중합체 비이드 상에 고정될 수 있다. 조작 및 분리를 돕기 위하여, 자기 비이드를 사용할 수 있는데 이것이 본 발명의 매우 바람직한 실시태양이다. 여기에서 사용되는 용어 "자기"는 자기장에 놓여지면 지지체가 그에 부여된 자기 모멘트를 가질 수 있는 것을 의미한다. 즉, 자기 입자를 포함하는 지지체는 자기 응집에 의해 잘 제거될 수 있으므로, 빠르고, 단순하고 효율적인 방식의 리간드 결합 후의 분획의 분리를 제공한다.
그러므로, 본 발명의 방법을 사용함으로써, TC Ⅱ-코발라민 복합체가 부착된 자기 입자는 자기장의 적용, 예를 들면 영구 자석을 사용함으로써 적절한 표면상으로 제거될 수 있다. 자석을 샘플을 함유하는 반응기의 측면에 적용하여 입자들을 반응기의 벽에 집합시키는 것으로 통상적으로 충분하며 그 후의 분석을 위하여 분리한다.
특히 바람직하게는 반응도중 입자의 자기 응집 및 군집을 피할 수 있기 때문에, 초상자기성 입자이며 예를 들면 신테프 (Sintef)에 의해 제 EP-A-106873 호에 기술된 것들이다. 뱅 파티클즈 (미국)에 의해 제조된 공지된 자기 비이드가 본 발 명에 사용하기에 특히 적합할 수 있다.
일반적으로, 평가 샘플 외에, 알려진 홀로-TC Ⅱ 복합체 함량을 갖는 검정 샘플도 본 발명의 분석 방법 수행시에 또한 분석될 것이다. 상기 측정은 검정 곡선을 그리는데 사용될 수 있으며, 이로부터 조사하는 샘플의 결합 코발라민 함량을 측정할 수 있다. 검정 샘플의 성질 및 홀로-TC Ⅱ 복합체의 측정에 사용되는 환산계수 및 조정계수는, 예를 들면 분석의 결합 및 분리 단계에 사용된 특정 리간드 및 샘플의 결합 및 분리에 영향을 미치는 방법의 다른 측면, 예를 들면 완충액 조성, 분석 조건 등에 의존하여 변화될 수 있다. 전형적으로, 0 내지 300 pmol/l의 홀로-TC Ⅱ 함량을 갖는 검정 샘플이 사용될 것이다. TC Ⅱ 결합 코발라민의 값이 일반적으로 발견될 표준 범위는 30 내지 160 pmol/l이다.
홀로-TC Ⅱ 검정 표준은 전형적으로 인간, 천연 또는 재조합 홀로-TC Ⅱ일 것이다. 홀로-TC Ⅱ 분석에서 칼리브레이터 (calibrator)로서의 홀로-TC Ⅱ의 용도는 신규한 것이며 본 발명의 또 다른 국면을 형성한다.
또 다른 국면의 견지에서, 본 발명은 본 발명에 따른 진단 분석용 키트를 제공하며, 상기 키트는:
TC Ⅱ 또는 홀로-TC Ⅱ에 대한 고정 또는 고정 가능한 특이성 결합 리간드;
바람직하게는 공지된 농도의 홀로-TC Ⅱ 용액 및 보다 바람직하게는 홀로-TC Ⅱ 복합체 농도의 범위를 갖는 상기 용액의 셋트;
임의로, 홀로-TC Ⅱ로부터 코발라민을 방출시키는 방출제; 및
임의로, 표지 리간드를 포함한다.
본 발명의 분석 방법은 홀로-TC Ⅱ 복합체를 측정하거나 또는 홀로-TC Ⅱ 복합체를 분리한 다음 그와 결합된 코발라민을 측정함으로써 코발라민의 대사 활성 풀을 측정하므로 코발라민 결핍의 임상적 발현의 개시 이전 또는 이후에 코발라민의 결핍을 측정하는 편리한 방법을 제공한다. 이 분석 방법은 음성 코발라민 발란스의 정확한 예견 값을 갖기 때문에 증상의 개시 전에 이롭게 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예 및 상술된 첨부 도면에 의해 기술될 것이다:
실시예 1
TC Ⅱ에 특이성인 항체 (예를 들면 단클론성 또는 다클론성 항체)를 자기화 가능한 입자상에 고정했다. 같은 부피의 PBS와 혼합된 혈청의 부분 표본 (100-500 μl)을 15 분간 과량의 고정 항체 및 과량의 I125로 방사성 표지된 비오버랩핑 항-홀로-TC Ⅱ 항체 (예를 들면 단클론성 항체)와 반응시켰다. 자기화 가능한 입자는 강한 자석을 사용하여 침강시키고, 상징액을 제거하고, 입자를 PBS로 세척했다.
방사능을 측정하고 샘플의 홀로-TC Ⅱ 농도를 표준곡선에서의 보간법에 의해 측정했다.
실시예 2
TC Ⅱ에 특이성인 항체 (예를 들면 단클론성 또는 다클론성 항체)를 자기화 가능한 입자상에 고정했다. 같은 부피의 PBS와 혼합된 혈청의 부분 표본 (600 μl)을 항체와 30 분간 반응시켰다. 자기화 가능한 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시키고, 상징액을 제거했다. 입자를 PBS로 한번 세척한 후에 이어서 100 μl의 총 부피로 시안화칼륨 (100 μM), 디티오트레이톨 (15 mM) 및 고정된 양의 I125 또는 Co57로 방사성 표지된 시아노코발라민을 함유하는 수산화나트륨 (0.3M)으로 15 분간 처리하여 고정 홀로-TC Ⅱ에 결합된 코발라민을 방출시키고 동시에 모든 형태의 코발라민을 시아노코발라민으로 전환시키고 고정된 양의 표지 시아노코발라민과 혼합시켰다. 100 μl의 붕산염 완충액 중의 제한된 양의 내인자를 첨가하고 10 분간 반응시켰다. 자기화 가능한 입자를 강한 자석으로 침강시키고 방사능 측정을 위하여 150 μl의 상징액을 제거했다. 혈청 샘플 중의 TC Ⅱ-결합 코발라민의 농도는 표준곡선으로부터 측정했다.
대안적으로 방출된 코발라민을 아보트의 IMx 방법 (Abbot's IMx method) 또는 유사한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
실시예 3
홀로-TC Ⅱ에 특이성인 항체 (예를 들면 단클론성 또는 다클론성 항체)를 자기화 가능한 입자상에 고정했다. 같은 부피의 PBS와 혼합된 혈청의 부분 표본 (100-500 μl)에 고정된 양의 I125표지 홀로-TC Ⅱ 및 제한된 양의 고정 항-홀로-TC Ⅱ 항체를 첨가했다. 15 분간 배양 후에 자기화 가능한 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시켰다. 입자를 PBS로 세척하고, 방사능을 측정했다. 홀로-TC Ⅱ의 농도는 표준곡선으로부터 측정된다.
실시예 4
재조합 홀로-TC Ⅱ를 자기화 가능한 입자상에 고정했다. 같은 부피의 PBS와 혼합된 혈청의 부분 표본 (100-500 μL)에 고정된 양의 고정 홀로-TC Ⅱ 및 홀로-TC Ⅱ에 특이성이며 I125로 방사성 표지된 과량의 항체 (예를 들면 단클론성 또는 다클론성 항체)를 첨가했다. 15 분간 배양 후에 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시켰다. 입자를 PBS로 세척하고 방사능을 측정했다. 홀로-TC Ⅱ의 농도를 표준곡선으로부터 측정했다.
실시예 5
혈청의 부분 표본 (100-500 μL)에 모든 아포-TC Ⅱ 및 아포-HC를 결합하도록 과량의 비오티닐화 코발라민을 첨가했다. 10 분간의 배양 후에, 혈청 샘플을 아비딘 코팅된 자기 입자로 10 분간 처리했다. 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시켰다. 상징액을 회수하고 하나는 I125 로 방사성 표지되고 다른 하나는 비오틴과 접합된 두개의 비오버랩핑 단클론성 항-TC Ⅱ 항체와 혼합했다. 10 분 후에 아비딘-코팅된 자기화 가능한 입자를 첨가하고 10 분간 비오티닐화 부가물을 결합시켰다. 이어서, 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시키고 PBS로 세척했다. 방사능을 측정하고 홀로-TC Ⅱ 농도를 표준곡선상에서의 보간법에 의해 측정했다.
실시예 6
아포-TC Ⅱ가 소모된 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 혈청을 고정된 양의 I125 표지 홀로-TC Ⅱ 및 제한된 양의 자기화 가능한 입자상에 고정된 항-TC Ⅱ 항체와 혼합했다. 15 분간의 배양 후에 입자를 강한 자석을 사용하여 침강시켰다.
입자를 PBS로 세척하고 방사능을 측정한다.
실시예 7
코발라민을 공유 커플링에 의해 또는 비오틴-(스트렙트)아비딘 커플링을 사용함으로써 자기화 가능한 마이크로스피어 상으로 고정했다. 전형적으로, 스트렙트아비딘 코팅 자기화 가능한 마이크로스피어를 1 μM의 비오티닐화 코발라민과 30 분간 실온 및 어두운 상태로 배양했다. 비이드를 자석을 사용하여 침강시키고 PBS로 두 번 세척하고 PBS + 5 mg/mL HSA 중에 1%로 재현탁시켰다. 혈청의 부분 표본 (100-500 μL)에 같은 부피의 PBS 및 1/10 부피의 코발라민 코팅 자기화 가능한 마이크로스피어를 첨가했다. 혼합물을 30 분간 실온 및 어둠 속에서 30 분간 반응시켜서 모든 아포TC Ⅱ 및 아포HC를 결합하도록 했다. 입자를 자석을 사용하여 침강시키고 상징액을 회수하고 하나는 I125로 방사능 표지되고 다른 하나는 비오틴과 접합된 두개의 비오버랩핑 단클론성 항-인간 TC Ⅱ 항체와 혼합했다. 10 분 후에 (스트렙트)아비딘-코팅 자기화 가능한 마이크로스피어를 첨가하고 10 분간 비오티틸화 부가물을 결합하도록 했다. 이어서, 입자를 자석으로 침강시키고 PBS로 세척했다. 방사능을 측정하고 홀로-TC Ⅱ 농도를 표준 곡선상에서의 보간법에 의해 측정했다.
실시예 8
과량의 비오티닐화 코발라민을 혈청 샘플 + PBS에 직접 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 하여, 모든 아포TC Ⅱ 및 아포HC를 결합하도록 했다. 10 분간의 배양 후에, 혈청 샘플을 (스트렙트)아비딘 코팅 자기화 가능한 마이크로스피어로 30 분간 실온 및 어둠 속에서 처리한다.
실시예 9
인간 TC Ⅱ에 대하여 특이성이고 겉보기 결합 상수 >5x109M-1의 토끼 항체를 염소 항-토끼IgG 항체 [인디카 다이아그노스틱스 (Indica Diagnostics)]로 코팅된 1 μm 자기화 가능한 마이크로스피어상에 고정했다. 49 명의 건강한 지원자로부터의 각각의 400 μL의 혈청 샘플을 같은 부피의 PBS 및 40 μL의 고정 항체 (1%)와 혼합했다. 혼합물을 실온 및 어둠 속에서 1 시간 유지한 다음 마이크로스피어를 자석을 사용하여 침강시켰다. 침전물을 빙냉 세척 완충액 (PBS + 0.02% Tween 20)으로 1 회 세척하고 연속적으로 인산염 완충액, pH 7.5 중의 50 μL 50 mM 디티오트레이톨, 0.001% 시안화칼륨, 및 고정된 양의 57Co-CN-코발라민 [아머샴 (Amersham)]에 재현탁시켰다. 이를 30 분간 실온에서 방치 후에 25 μL 0.5M 수산화나트륨을 첨가하고 15 분 후에 붕산염 완충액, pH 8.6 중의 Dextran상에 고정된 300 μL의 (50%의 트레이서를 결합하기에 충분한)내인자를 첨가한다. 실온 및 어둠 속에서 1 시간 후에, 샘플을 4 ℃에서 10 분간 1000g로 원심분리하고, 상징액을 조심스럽게 제거하고, Packard Riastar 중에서 결정 소구의 갯수를 세었다. TC Ⅱ-결합 코발라민의 농도를 샘플과 동일하게 처리된 8 개의 칼리브레이터 (0-500 pM의 홀로-TC Ⅱ)로 구축된 표준 곡선으로부터 측정했다. 37 개의 혈청 샘플을 또 한 아보트 IMx B12 분석을 사용하여 총 혈청 코발라민에 대하여 분석했다.
홀로 TC-Ⅱ에 대한 표준 곡선을 도 1에 나타내었고 37 명의 건강한 지원자의 총 혈청 코발라민과 홀로 TC-Ⅱ 농도의 관계를 도 2에 도시했다. 상관도가 r2=0.50으로 낮다는 것이 명백하다. 대조적으로, 홀로HC 및 총 혈청 코발라민 사이의 상관도는 r2=0.96으로 높다 (도 3). 49 명의 건강한 지원자에 대한 평균 홀로TC 농도는 64+28 pM이었고 95% 표준 범위는 23-127 pM 이었다.
분석은 10% 의 CV, 10 pM미만의 분석 감도 (0-칼리브레이터-3 s.d.)를 가지며 합토코린과 교차 반응하지 않는다.
본원 발명은 코발라민 수치와 코발라민 결핍의 가능성을 상관시키기 위하여, 상용의 임상 진단 적용에 적절한, 체액 중의 대사 활성 코발라민의 수치를 분석하기 위한 개선된 방법으로서, 체액의 무세포 샘플을 고정 또는 고정 가능한 트랜스코발라민 (TC Ⅱ) 또는 코발라민 결합 TC Ⅱ (홀로 TC Ⅱ)에 대한 특이성 결합 리간드와 접촉시키고, 리간드 결합 분획을 리간드 비결합 분획으로부터 분리하고 그 안의 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 코발라민 함량을 측정하는 것을 포함하는 체 샘플 중의 트랜스코발라민 Ⅱ 결합 코발라민의 측정을 위한 분석 방법을 제공한다.
Claims (19)
- 체액의 무세포 샘플을, 자기화 가능한 입자 상에 고정된 트랜스코발라민 II (TC Ⅱ) 또는 홀로 (holo)-TC II에 대한 특이성 결합 리간드와 접촉시키고, 자기장을 인가하여 리간드 결합 분획을 리간드 비결합 분획으로부터 분리하고 상기 리간드 결합 분획 중의 홀로-TC II 또는 TC II 결합 코발라민 함량을 측정하는 것을 포함하는, 신체 샘플 중의 홀로-TC Ⅱ의 측정을 위한 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 리간드 비결합 분획으로부터 리간드 결합 분획의 분리가 홀로-TC Ⅱ의 농도를 3-배 이상 증가시키도록 수행되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 9 pM 농도의 홀로-TC Ⅱ를 검출할 수 있는 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 특이성 결합 리간드가 TC Ⅱ에 대하여 고도의 선택성 및 특이성을 나타내며, 아포 (apo) 또는 홀로형의 기타 TC 단백질 또는 임의의 기타 코발라민-결합 단백질에 대하여는 낮은 친화성을 나타내는 것인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 특이성 결합 리간드가 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항체 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 작은 유기 화학물질, 결합 화학 (combinatorial chemistry) 또는 파아지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)로부터 선택된 특이성 결합제, DNA 또는 RNA의 특이성 결합 서열 또는 세포 표면 수용체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 특이적 결합 리간드가 TC II에 결합하는 모노클로날 항체인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코발라민을 홀로 TC Ⅱ 분자로부터 주위 매질의 온도 또는 pH를 변화시킴으로써 방출시키는 분석 방법.
- 제7항에 있어서, 코발라민에 대한 고정 결합 파트너를 고정 결합 파트너로의 결합에 대하여 방출된 코발라민과 경쟁하는 표지 리간드의 존재하에 샘플 중의 방출된 코발라민과 접촉시킴으로써 수행되는 경쟁 분석에 의해 상기 방출된 코발라민을 측정하는 분석 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 표지 리간드가 루미네센스 (luminescence), 화학 루미네센스 (chemiluminescence), 비색 평가, 형광, 방사능 또는 효소 활성에 의해 검출될 수 있는 시그날 형성 표지로 표지되는 것인 분석 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 표지 리간드가 화학 루미네센스에 의해 검출될 수 있는 시그날 형성 표지로 표지되는 것인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TC Ⅱ 결합 리간드가 109M-1 이상의 친화성 상수를 갖는 것인 분석 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 친화성 상수가 1011M-1 보다 큰 것인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 리간드와 HC의 교차 반응도가 0.1 내지 1%인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 홀로-TC Ⅱ 또는 TC Ⅱ 결합 리간드와 HC의 교차 반응도가 0.1 % 미만인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신체 샘플이 정액, 뇌척수액, 양수 또는 혈액 유래 샘플을 포함하는 군으로부터 선택되는 분석 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 혈액 유래 샘플이 혈청 또는 혈장인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 분석 검정을 홀로-TC Ⅱ 표준을 사용하여 수행하는 분석 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 홀로-TC II 표준이 인간, 천연 또는 재조합 홀로-TC Ⅱ인 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 혈청 또는 혈장 샘플을 자기화 가능한 입자 상에 고정된 TC II 모노클로날 항체와 접촉시키고, 자기장을 인가하여 리간드 결합 분획을 리간드 비결합 분획으로부터 분리하고, 주위 매질의 pH를 변화시킴으로써 홀로 TC II 분자로부터 상기 코발라민을 방출함으로써 상기 리간드 결합 분획 중의 TC II 결합 코발라민 함량을 측정하고, 코발라민에 대한 고정 결합 파트너를, 고정 결합 파트너로의 결합에 대하여 방출된 코발라민과 경쟁하는 표지 리간드 (여기서, 상기 표지 리간드는 화학 루미네센스에 의해 검출될 수 있는 시그날 형성 표지로 표지됨)의 존재하에 방출된 코발라민과 접촉시키는 것을 포함하는 분석 방법.
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| US5374560A (en) * | 1989-04-03 | 1994-12-20 | The University Of Colorado, Inc. | Method for screening and distinguishing between cobalamin and folic acid deficiency based on assay for cystathionine and 2-methylcitric acid |
| DE3900650A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vitamin-b12-bestimmung |
| US5506109A (en) | 1989-06-26 | 1996-04-09 | Bayer Corporation | Vitamin B12 assay |
| US5310656A (en) | 1989-06-26 | 1994-05-10 | Tritech Partners | Vitamin B12 assay |
| EP0479929B1 (en) * | 1989-06-26 | 1994-04-13 | Tritech Partners | Vitamin b12 assay |
| AU680822B2 (en) * | 1992-05-08 | 1997-08-14 | Receptagen Corporation | Anti-receptor agents to the vitamin B12/transcobalamin II receptor |
| US6274564B1 (en) * | 1996-09-18 | 2001-08-14 | William J. Sarill | Compositions of cobalamin and related corrinoids, and uses thereof |
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1998
- 1998-09-18 GB GBGB9820473.8A patent/GB9820473D0/en not_active Ceased
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