PT1443328E - Doseamento de cobalamina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DOSEAMENTO DE COBALAMINA" A presente invenção refere-se a métodos de doseamento para a determinação de cobalamina ou vitamina B12 num fluido corporal e, em especial, a métodos de doseamento da reserva metabolicamente activa de cobalamina. A cobalamina ou vitamina B12 é uma vitamina solúvel em água que forma parte do complexo da vitamina B encontrado nos alimentos. A molécula nuclear consiste num anel de corrina com quatro unidades de pirrole que rodeiam o átomo de cobalto essencial. A cobalamina é a única vitamina que não pode ser sintetizada por animais ou plantas e tem de ser absorvida a partir dos alimentos no intestino. Pode, contudo, ser armazenada no figado. É sintetizada por microrganismos, em especial por bactérias anaeróbias e leveduras. A cobalamina funciona in vivo como uma coenzima e as enzimas cobalamina catalisam três tipos de reacção: (i) rearranjos intramoleculares, por exemplo, a formação de succinil CoA a partir de L-metilmalonil CoA, (ii) metilações, por exemplo, a formação de metionina por metilação de homocisteina e (iii) redução de ribonucleotidos a desoxirribonucleotidos em alguns microrganismos. Em mamíferos, só se conhece duas reacções enzimáticas, as especificamente referidas em (i) e (ii) acima, que requerem cobalamina como uma coenzima.

No processo de digestão, uma proteína salivar chamada 1 haptocorrina, daqui em diante referida como HC (que também é referida na técnica como "ligante R" ou transcobalaminas I e III conjuntamente) liga-se à cobalamina no tracto gastrointestinal superior formando um complexo que passa através do estômago. As enzimas pancreáticas digerem o complexo de cobalamina-haptocorrina (holo-HC) no íleo, libertando cobalamina que é então ligada a uma proteína chamada factor intrínseco, que é segregada pela mucosa gástrica, para formar mais um complexo. 0 complexo de cobalamina-factor intrínseco liga-se a um receptor específico no revestimento do íleo terminal, com o que é dissociado por um factor de libertação e a cobalamina transportada activamente através da membrana do íleo para a corrente sanguínea. A cobalamina não circula no organismo em forma livre numa quantidade apreciável. Provavelmente, cerca de 99% da cobalamina está ligada por uma das proteínas da transcobalamina (TC I-III) ou albumina. A proteína que se crê ser responsável pelo transporte da cobalamina para tecidos alvo é a transcobalamina II (TC II), uma proteína vestigial crítica, sem a qual a cobalamina não pode atravessar as membranas celulares. Apesar desta importante função metabólica, só cerca de 6-25% da cobalamina no plasma está ligada a TC II e a maior parte está ligada à HC. A TC II é um polipéptido de cadeia simples de 45 kDa que se encontra sobretudo no plasma, fluido seminal e fluido cérebro-espinal. A cobalamina ligada a TC II ou holo-TC II, liga-se a receptores específicos nas membranas celulares, e uma vez ligada, o complexo de holo-TC II é absorvido pelas células por pinocitose. A TC II é sintetizada pelo fígado, endotélio vascular, enterócitos, macrófagos e fibroblastos e circula 2 predominantemente como apo-TC II, i. e. sem cobalamina ligada. Tem uma semi-vida curta de, aproximadamente, 90 minutos.

Menos de um quarto da cobalamina total do plasma está associada a TC II. O resto está ligado às outras transcobalaminas ou albumina como referido acima.

Uma vez que a cobalamina tem de ser absorvida a partir dos alimentos, quaisquer patologias que resultem em função gástrica prejudicada, por exemplo, gastroenterite ou patologias que resultem em atrofia gástrica, ou uma incapacidade de produzir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de libertação, receptores de TC II ou TC II, pode resultar numa absorção prejudicada de cobalamina e na deficiência resultante.

Certos subgrupos da população, por exemplo os idosos, mulheres grávidas, doentes com doença gastrointestinal crónica ou aguda, os que sofrem de certas doenças auto-imunes, os que têm uma história familiar de anemia perniciosa e os doentes de SIDA, têm especial susceptibilidade à deficiência de cobalamina.

As manifestações clínicas da deficiência de cobalamina são variadas e numerosas mas envolvem sobretudo anemia, hematopoiese megaloblástica e distúrbios funcionais e estruturais do sistema nervoso. Cerca de 60% dos indivíduos diagnosticados como sendo deficitários em cobalamina são anémicos, mas em muitos deles os sintomas neurológicos são os únicos sinais clínicos observados. Cerca de 10% dos doentes apresentam sintomas psiquiátricos e cerca de 40% apresentam sintomas neurológicos e psiquiátricos. O diagnóstico precoce de deficiência de cobalamina é crucial para assegurar um bom prognóstico para os doentes, uma 3 vez que algumas das manifestações da deficiência de cobalamina, especialmente os efeitos neuropsiquiátricos, são irreversíveis se não forem detectados e rapidamente aliviados por terapêutica com cobalamina. É, portanto, desejável avaliar com exactidão o nível de cobalamina num indivíduo de modo expedito e eficiente, com o objectivo de determinar se o indivíduo pode ou não estar a sofrer de deficiência de cobalamina. A determinação da cobalamina total no plasma i. e. cobalamina (e substâncias semelhantes a cobalamina) ligada a qualquer das proteínas transcobalaminas (TC) I, II e III, foi utilizada em tentativas de avaliar a deficiência de cobalamina. Esta técnica resulta de uma distribuição de concentrações numa base alargada no seio de uma população que é considerado como sendo normal e portanto produz uma gama de referência ampla. Nos indivíduos, contudo, a gama de cobalamina disponível considerada como sendo normal para esse indivíduo é muito estreita. Observou-se que embora em indivíduos a concentração de cobalamina metabolicamente activa se tenha deslocado para fora da sua própria gama de referência, o seu teor total de cobalamina no plasma permanece dentro da gama considerada normal para a população. Nessas circunstâncias, a deficiência de cobalamina pode ficar por detectar. Um método de tal modo não fiável é claramente indesejável e é reconhecido que essas determinações de cobalamina no soro ou plasma têm baixa sensibilidade e especificidade para diagnóstico.

Foram desenvolvidos doseamentos microbianos envolvendo microrganismos dependentes de cobalamina para o crescimento e foram utilizados na medição da concentração de cobalamina no plasma, mas além da dificuldade de estimativa da gama de referência apropriada, estes métodos requerem extracção e 4 conversão das cobalaminas o que é muito moroso, incómodo e completamente desadequado para um rastreio laboratorial rápido. Métodos alternativos para avaliação da deficiência de cobalamina envolvem a medição da acumulação no plasma de metabolitos que requerem cobalamina para a sua conversão. Os níveis de metilmalonato no plasma e de homocisteína no plasma aumentam nos indivíduos deficientes em cobalamina (Chanarin, The megaloblastic anaemia; Londres, Blackwell Scientific Publications, 1991) e são moléculas boas candidatas para correlação com deficiência de vitamina B±2. Demonstrou-se, contudo, que os métodos baseados na avaliação de homocisteína são complicados, não práticos e apresentam fraca especificidade e sensibilidade. Embora os métodos baseados na determinação de metilmalonato sejam exactos e fiáveis, são incómodos e requerem análise por cromatografia gasosa associada a espectrometria de massa e, são por isso, dispendiosos e mais uma vez desadequados para o rastreio clínico em rotina (Nex et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:61-76).

Também foi sugerido que a medição de cobalamina ligada a TC II em vez da cobalamina total no plasma pode proporcionar um indicador clínico fiável da probabilidade de deficiência de cobalamina (Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34:132—139; Wickramasinghe e Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537—539; Patente US 4680273) . Contudo, esses esforços para determinar a concentração de holo-TC II até à data foram sobretudo indirectos, estimando-se a concentração de holo-TC II como a diferença entre a cobalamina total no plasma e a concentração de cobalamina de plasma empobrecido em TC II.

Esse empobrecimento em TC II pode ser realizado por adsorção a sulfato de amónio (Carmel (1974) Am. J. Clin. 5

Pathol. 62:367-372), microssílica (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58:332-337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539), vidro microfino (Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42:202-211) ou anticorpos policlonais anti-TC II imobilizados (Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132:53-61). A concentração de cobalamina no plasma total e na fracção empobrecida é realizada por métodos bem conhecidos na técnica tais como técnicas de imunoensaio radiológico ou enzimático. Estes métodos são desadequados para rastreio em rotina, automatizado ou não automatizado, porque são complexos e morosos, e porque o baixo grau de especificidade dos materiais adsorventes utilizados resulta em separação insuficiente de holo-TC II e holo-HC resultando em sobre-estimativa de holo-TC II. A variação lote para lote do material adsorvente introduz erros adicionais e o que é mais importante, a subtracção de um grande volume de outro grande volume resulta em inexactidões inaceitáveis e falta de fiabilidade.

As outras tentativas para avaliar TC II envolveram a separação de TC II de outros componentes do plasma, incluindo a TC I e a TC III, utilizando a sua lipofilia. Assim Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172:297-310, Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89:195-199 e Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62 descrevem métodos para a separação de TC II de outras transcobalaminas utilizando respectivamente heparina-sefarose, gel de silica ou celulose. Estes métodos sofrem contudo das mesmas desvantagens que os métodos indirectos uma vez que se baseiam nos mesmos materiais adsorventes. Além disso, a baixa concentração de holo-TC II no plasma torna estes métodos desadequados para combinação com métodos existentes de quantificação de cobalamina. A gama normal de holo-TC II é 35-160 pM e valores abaixo de 35 pM 6 seriam geralmente considerados como indicadores de deficiência de cobalamina. A sensibilidade analítica descrita da maioria dos métodos de rotina para cobalamina no plasma é cerca de 40 pM mas na prática é frequentemente muito mais elevada, tipicamente cerca de 90 pM. Assim, os níveis normais no plasma de holo-TC II estão abaixo ou próximos do limite de sensibilidade dos métodos de rotina para quantificação de cobalamina.

Possivelmente o método mais exacto actualmente aceite para determinação da cobalamina ligada a TC II envolve a adsorção de TC II a sílica e, depois, quantificação do teor de cobalamina na fracção ligada utilizando um imunoensaio, tal como descrito por exemplo por Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10:2073-2077, ou um doseamento microbiológico, aparentemente produzindo, este último, os melhores resultados. Este método requer um dia inteiro de trabalho para a realização de apenas vinte doseamentos. É muito caro e pouco prático e muito pouco adequado para investigações laboratoriais para diagnóstico clínico em rotina.

Assim, há uma grande necessidade de métodos melhorados para avaliação do nível de cobalamina metabolicamente activa num fluido corporal, com o objectivo de correlacionar o nível de cobalamina com a probabilidade de deficiência de cobalamina, que sejam susceptíveis de aplicação em diagnóstico clínico em rotina.

Assim, de acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método de doseamento para a determinação de cobalamina ligada a transcobalamina II numa amostra corporal, compreendendo fazer contactar uma amostra isenta de células de um fluido corporal com um ligando de ligação específica imobilizável para TC II ou holo TC II, 7 separação de uma fracção ligada ao ligando de uma fracção não ligada ao ligando e determinação aí do teor de cobalamina ligada a holo-TC II ou TC-II.

Por um ligando de ligação específica significa-se um que se liga a TC II (i. e. apo-TC II e holo-TC II) ou holo TC II devido à sua estrutura química específica ou conformação e não simplesmente devido a uma propriedade físico-química global (tal como lipofilia) que pode ser comum a muitos componentes de uma amostra de fluido corporal. A afinidade e especificidade de ligação dos ligandos adequados para utilização no método de um modo preferido permite uma concentração 3 vezes, mais de um modo preferido 5 vezes e de um modo ainda mais preferido 10 vezes ou mais da TC II ou holo-TC II na amostra e daí esse método ser capaz de dar valores exactos e fiáveis para holo-TC II na gama normal mais baixa de holo-TC II e, também, na gama subnormal. Essa separação e concentração das moléculas alvo não é possível com métodos existentes actualmente que não são capazes de separar eficientemente TC II ou holo-TC II de HC ou holo-HC. A aptidão para concentrar a TC II ou holo-TC II, pelo menos, 3 vezes permite a utilização de equipamento analítico automatizado na realização do doseamento. Sem esse passo de concentração, a quantidade de analito presente numa amostra que está provavelmente abaixo do limite de detecção. Para funcionar esse equipamento analítico automatizado, tipicamente, requer entre 40 e 100 pL de amostra num volume total, tipicamente, de 150 μL ou maior. Assim, para análise um analito em baixa concentração é ainda mais diluído. Por utilização do método de doseamento da invenção, contudo, o analito é concentrado, pelo menos, 3 vezes. Uma vez que a utilização desse equipamento analítico automatizado envolve uma gama de controlo de 100-700 pM com um limite de sensibilidade mais baixo de cerca de 40 pM mas um limite inferior prático de cerca de 90 pM, uma concentração de 5 vezes facilita a medição de holo-TC II a níveis tão baixos como 18 pM e uma concentração de 10 vezes facilita a medição a níveis tão baixos como 9 pM de holo-TC II. Uma vez que a presente invenção facilita a concentração mais de 10 vezes será facilmente compreendido por um especialista na matéria a medida em que a sensibilidade é melhorada tornando-a numa técnica de facto muito poderosa. A aptidão para concentrar o analito de modo a que seja susceptível de análise por esses processos automatizados é uma importante vantagem do presente método de doseamento. de um modo preferido a partir de uma amostra inicial de fluido corporal com 600 pL será produzido um volume até 150 pL, de um modo mais preferido até 100 pL e de um modo ainda mais preferido inferior a 60 pL, que pode então ser analisado, opcionalmente utilizando processos automatizados.

Qualquer ligando que se liga especificamente a TC II pode ser utilizado no método da invenção como um ligando de captura, concentração e separação ou como um ligando de detecção, e dependendo da forma de realização específica da invenção pode ligar-se a TC II na forma apo e holo ou pode ligar-se especificamente ou, de um modo preferido, à forma holo. O ligando de ligação a TC II apresentará, de um modo preferido, um elevado grau de selectividade e especificada para TC II e apresentará afinidade baixa ou mais, de um modo preferido, essencialmente nenhuma afinidade para outras proteínas TC, í. e. TC I ou III, na forma apo ou holo, ou para qualquer outra proteína que se liga a cobalamina. Se o ligando de ligação a TC II for um ligando de ligação específica a holo-TC II, são apresentadas as mesmas propriedades com o requisito adicional de que é apresentada baixa afinidade ou de, um modo preferido, nenhuma afinidade em relação a apo-TC II. 9 0 ligando de ligação a TC II ou holo-TC II será geralmente um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um composto com uma afinidade para TC II ou holo-TC II, respectivamente, tais como um receptor da superfície celular, um polipéptido, um oligopéptido, um produto quimico orgânico pequeno, etc. Outros ligandos de ligação podem ser um ligante especifico, seleccionado de uma biblioteca de química combinatória ou biblioteca de fagos, ou uma sequência de ADN ou ARN que se liga especificamente.

Se o ligando de ligação for um anticorpo, pode ser policlonal mas, de um modo preferido, será monoclonal. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos com muito maior especificidade e uniformidade do que os anticorpos policlonais e isto reduz a reactividade cruzada com outros componentes do fluido corporal, em particular outras transcobalaminas e onde apropriado, com a conformação alternativa i. e. na forma apo do analito alvo. A uniformidade e reprodutibilidade oferecidas pelos anticorpos monoclonais em relação aos anticorpos policlonais asseguram uma maior exactidão que é vital para um doseamento em que o analito está numa concentração tão baixa. Alternativamente, pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, o fragmento F(ab), F(ab')2 ou F(v). Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser monovalentes ou divalentes e podem ser produzidos por tecnologia de hibridomas ou ser de origem sintética, e produzidos por tecnologia de ADN recombinante ou síntese química. Poderiam, por exemplo, ser utilizados anticorpos de cadeia simples ou outros derivados ou mímicos de anticorpos. 0 anticorpo pode ser dirigido ou criado contra qualquer epitopo, componente ou estrutura da proteína TC II ou holo-TC II, consoante apropriado.

Anticorpos adequados para utilização como ligandos de 10 ligação na presente invenção estão descritos por exemplo por Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:149-154; McLean et al. (1997) Blood 89(1):235-242.

Analogamente, podem ser utilizadas moléculas receptoras capazes de ligação às formas apo e holo de TC II ou de ligação, de um modo preferido, ou especificamente. à forma holo-TC II. Os receptores adequados são receptores de TC II ou holo-TC II ligados à superfície ou membrana celular e propriedades de reactividade cruzada inter-espécies significa que podem ser utilizadas essas moléculas receptoras de qualquer espécie de mamíferos, embora, de um modo preferido, a origem desses receptores seja humana ou bovina. Embora as moléculas receptoras sejam, de um modo preferido, isoladas numa forma relativamente purificada, também está contemplada a utilização de membranas celulares ou fracções de membranas mistas compreendendo os receptores, de um modo preferido, em forma concentrada. Esses receptores ou membranas ou fracções de membranas contendo receptores podem, com vantagem, ser isolados do rim, placenta ou células tumorais. As células depositadas não devem, geralmente, ser utilizadas como fonte desses receptores. Contudo, as células depositadas podem ser utilizadas como uma fonte de receptores de haptocorrina.

Uma fracção de membranas enriquecida em receptor de TC-II pode ser obtida como descrito por Seligman et al., J. Biol Chem. 253:1766-1772 (1978) e Nex et al., Biochem Biophys Act 628:190-200 (1980). Essencialmente, tecido, e. g. placenta humana ou fígado de coelho, é cortado em pequenos pedaços e homogeneizado em tampão tris, pH 7,4 contendo NaCl a 0,15 M e EDTA a 10 mM, seguido por centrifugação a 25.000 x g durante 30 minutos. Para retirar sangue residual é repetida a homogeneização/centrifugação, pelo menos uma vez. Esta fracção 11 de membranas é adicionalmente extraída com detergente, e. g. Ammonyx-LO, Triton X-100 ou Chapso, e clarificada por centrifugação a 100.000 x g durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante é utilizado como a fonte de receptor de TC-II.

Um exemplo de uma molécula receptora adequada que, de um modo preferido, se liga ao complexo holo-TC II é uma glicoproteína de cadeia simples de 62 kDa que existe como um homodímero não covalente e se encontra na superfície celular de todos os tecidos (Rothenberg & Quadros (1996) Balliere's Clinicai Haematology 8(3) 499-514; documento WO 96/085150). Uma outraproteína adequada para utilização no método de doseamento da invenção é gp300, uma proteína membranar mediadora de endocitose com 600 kDa que é expressa em células epiteliais absorvíveis por exemplo, células do túbulo renal proximal, como descrito por Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science 93: 8612-8617). Este receptor é um receptor de LDL e liga-se às formas apo e holo de TC II.

Quando se utiliza um receptor da superfície celular, este pode ser imobilizado por conjugação a uma superfície, e. g. de uma pérola ou folha, ou, alternativamente, uma fracção da membrana celular contendo os receptores pode ser formada em vesículas ou folhas exibindo os receptores.

Quando o ligando é imobilizado, isto pode, por exemplo, ser na superfície de um sólido, e. g. uma película de filtro ou folha ou o lúmen de um tubo, contudo a imobilização em partículas, e. g. microesferas tais como as produzidas por Dyno Industrier ASA, Noruega, é especialmente preferida. Essas partículas podem ser porosas ou não porosas e se desejado podem ser dotadas de meios que lhes permitem ser recolhidas, e. g. por inclusão com as partículas de material que responde 12 magneticamente, por exemplo cristais de óxido de ferro superparamagnético. Essas micropérolas de resposta magnética estão disponíveis de Dyno Industrier ASA bem como de Dynal AS, Noruega, Bang Particles, EUA e Prolabo, França. Quando o ligando se destina a ser imobilizável em vez de imobilizado, isto pode ser feito por acoplamento do ligando a um membro de um par de ligação especifica (e. g. biotina/estreptavidina) e utilizando o outro membro do par de ligação, opcionalmente ligado a um substrato, para aglomerar ou de outro modo imobilizar o ligando ou os complexos ligando:TC II ou ligando:holo-TC II, antes da separação da fracção ligada ao ligando da fracção não ligada na execução do método da invenção. É bem conhecida na técnica a imobilização de moléculas com afinidade e. g. anticorpos e fragmentos de anticorpos para efeitos de separação, por exemplo por ligação ou acoplamento de ligandos, opcionalmente por meio de um ligante, a qualquer dos suportes ou matrizes sólidos bem conhecidos que são actualmente amplamente utilizados ou propostos para separação ou imobilização em colunas e pode ser utilizado qualquer método conhecido na técnica. Essas fases sólidas podem ter a forma de partículas, folhas, geles, filtros, membranas, fibras ou capilares ou tiras de microtitulação, tubos ou placas com poços etc. e convenientemente podem ser feitas de vidro, sílica, látex ou de um material polimérico. As técnicas para ligação do ligando ao suporte sólido também são extremamente bem conhecidas e estão amplamente descritas na literatura. 0 acoplamento do ligando a um substrato ou a um membro de um par de ligação específica pode ser feita utilizando técnicas convencionais. 0 método da invenção, se o ensaio for realizado como um 13 ensaio de ligação competitiva, geralmente vai envolver a adição da amostra a um composto marcado que compete pela ligação ao ligando. Geralmente, a este respeito será preferido utilizar holo-TC II marcado. 0 marcador utilizado pode ser qualquer marcador que pode ser determinado directamente ou indirectamente, e. g. um cromóforo (termo este que é utilizado para incluir fluoróforos) , um radiomarcador (geralmente ligado covalentemente ou ligado a um quelato), uma enzima ou substrato de enzima, um marcador magnético, etc.

Numa forma de realização preferida, o método da presente invenção envolve fazer contactar um ligando de ligação a TC II ou holo-TC II imobilizado ou imobilizável com a amostra em investigação; separação de uma fracção ligada ao ligando de uma fracção não ligada ao ligando; dissociação da cobalamina ligada das moléculas de holo-TC II na fracção ligada e determinação da concentração de cobalamina libertada,, de um modo preferido, com a dissociação efectuada de tal modo que a concentração da cobalamina libertada é pelo menos 3 vezes, de um modo preferido, 5 vezes e ainda mais, de um modo preferido, 10 vezes maior do que as concentrações de holo-TC II na amostra inicial. A essência deste aspecto da invenção é a separação e concentração de TC II ou holo-TC II que permite que métodos correntes de determinação de cobalamina sejam utilizados de forma útil no método. Como indicado acima, na ausência desse passo de concentração, os métodos do estado da técnica não são adequados para a determinação de cobalamina uma vez que existe numa concentração tão baixa. Podem ser utilizados quaisquer

meios apropriados para a libertação de cobalamina de holo-TC II 14 mas com vantagem a este respeito pode utilizar-se aquecimento ou variação do pH do meio circundante. As diferentes formas de cobalimina podem ser convertidas na cianocobalamina menos sensível à luz por tratamento com KCN. Pode utilizar-se no método da invenção quaisquer meios adequados para a determinação de cobalamina livre, por exemplo, um ensaio de competição realizado fazendo contactar um parceiro de ligação a cobalamina imobilizado com a cobalamina dissociada da amostra na presença de ligando marcado que compete com a cobalamina isolada pela ligação aos parceiros de ligação imobilizados. Um método como descrito por Kuemmerk et al. (1992) Clin. Chem. 38:2073-2077, por exemplo, seria apropriado. Um modo alternativo de determinação de cobalamina livre está descrito na Patente US N° 5451508 e envolve uma técnica de imunoensaio.

Nesta forma de realização da invenção é preferido que os ligandos de ligação a TC II estejam imobilizados e se liguem tanto a holo como a apo-TC II.

Numa forma de realização preferida alternativa, o método de doseamento da presente invenção compreende fazer contactar um suporte sólido com um ligando de ligação a TC II ou holo-TC II nele imobilizado, com a amostra em investigação e também com um ligando não imobilizado, em que o referido ligando imobilizado é capaz de se ligar a TC II ou holo-TC II, ao referido ligando não imobilizado ou a complexos da referida TC II ou holo-TC II e referido ligando não imobilizado, e o referido ligando não imobilizado é capaz de se ligar a, pelo menos, um do referido ligando imobilizado, TC II ou holo-TC II e complexos do referido ligando imobilizado e TC II ou holo-TC II; em que o referido método de doseamento é um ensaio do tipo 15 sanduíche, pelo menos, um dos referidos ligandos é específico para holo-TC II e se o referido ensaio for um ensaio de competição o referido ligando imobilizado é específico para holo-TC II e os seus competidores; com o que a proporção do referido ligando imobilizado ligado por TC II ou holo-TC II, pelo ligando não imobilizado ou pelos complexos do referido ligando não imobilizado e TC II ou holo-TC II está dependente da quantidade de holo-TC II presente na referida amostras, e o referido ligando não imobilizado é capaz de produzir um sinal detectável directamente ou indirectamente quando ligado ou quando não ligado; separação de uma fracção ligada de uma fracção não ligada; e determinação directamente ou indirectamente do ligando não imobilizado ligado ao ligando imobilizado (a fracção ligada) ou não ligado e em solução (a fracção não ligada); em que o contacto da amostra e do referido ligando não imobilizado com o suporte sólido pode ser realizado separadamente, simultaneamente ou sequencialmente, e se for realizado separadamente ou sequencialmente, podem entrar em contacto por qualquer ordem.

Na sua essência, portanto, a forma de realização preferida alternativa do método da invenção envolve a determinação do ligando não imobilizado que se ligou directamente ou indirectamente ou alternativamente não se ligou directamente ou indirectamente ao ligando imobilizado. Quando o ligando não imobilizado compete por ligação ao ligando imobilizado com a holo-TC II, um nível elevado de ligando não 16 imobilizado não ligado é indicador de uma concentração alta de holo-TC II na amostra e um nivel baixo de ligando não imobilizado não ligado é indicador de uma concentração baixa de holo-TC II na amostra. Quando o ligando não imobilizado se liga a TC II ou holo-TC II que está ligada por sua vez ao ligando imobilizado, então um nivel alto de ligando não imobilizado ligado é indicador de uma concentração alta de holo-TC II na amostra e um nivel baixo de ligando não imobilizado ligado é indicador de uma concentração baixa de holo-TC II na amostra.

No método da presente invenção portanto, a reserva de cobalamina metabolicamente activa é determinada por medição do complexo de holo-TC II ou medição da quantidade de cobalamina ligada a moléculas de TC II, presente numa amostra corporal que contém uma mistura de apo e holo-TC II e apo e holo-HC (haptocorrina ou TC I e III) .

Pode ser realizado um passo de separação preliminar utilizando cobalamina imobilizada ou um seu análogo ou fragmento que se liga selectivamente às formas apo tanto de TC II como de haptocorrina (HC) . Nesse passo preliminar, as formas apo das proteínas TC II e HC são ligadas pela cobalamina imobilizada, seu análogo ou fragmento e separadas dos complexos de holo-TC II e holo-HC.

Neste caso, a análise das formas holo de TC II separadas tem então lugar de acordo com qualquer forma de realização da invenção como descrito acima mas, claramente, é mais útil quando a determinação do complexo de holo-TC II tem lugar por outro que não a dissociação do complexo e subsequente determinação da cobalamina libertada. Será evidente para o especialista na matéria que se esse passo preliminar anteceder a forma de realização preferida alternativa acima referida, o requisito de, pelo menos, um ligando num ensaio do tipo 17 sanduíche ser específico para holo-TC II em vez de para TC II e o requisito do ligando imobilizado num ensaio de competição ser específico para holo-TC II e os seus competidores em vez de para TC II já não é relevante uma vez que a forma apo de TC II foi capturada e já não está disponível. Assim, os ligandos imobilizados ou não imobilizados podem ser específicos para holo-TC II ou TC II ou os seus competidores. A cobalamina imobilizada não deve apresentar qualquer tendência significativa para ficar dissociada do seu suporte uma vez que isto podia resultar em ligação a apo-TC II e à sua transformação em holo-TC II. A cobalamina biotinilada liga-se de uma maneira muito estável a uma superfície sólida com avadina/estreptavidina a ela ligada, e agarrar cobalamina a um suporte desta maneira é conveniente para a realização deste passo. De facto, quando se utiliza cobalamina biotinilada, pode ser adicionada à amostra em análise numa forma não imobilizada onde ser liga às formas apo de TC II e HC. Pode então fazer-se contactar a amostra com uma superfície sólida tendo um parceiro de ligação para o exemplo de biotina, avidina, nele imobilizado. Forma-se então um complexo de avadina-cobalamina biotinilada-TC II que pode ser facilmente isolado da amostra.

Numa forma de realização da invenção em que teve lugar este passo de separação preliminar, o reservatório de holo-TC II é subsequentemente determinado fazendo contactar a amostra com um ligando de TC II imobilizado que captura o complexo de holo-TC II deixando a haptocorrina em solução e em seguida fazendo contactar o holo-TC II imobilizado com um segundo ligando de TC II que está marcado e por isso detectável. Exemplos de ligandos de ligação a TC II adequados seriam anticorpos monoclonais não sobreponíveis ou de facto um anticorpo policlonal específico para TC II seria adequado nesta forma de realização tanto para a captura como para a detecção 18 uma vez que são reconhecidos diferentes epitopos nas moléculas de TC II.

Noutra forma de realização da invenção em que teve lugar este passo de separação preliminar, as moléculas de holo-TC II competem com o ligando não imobilizado marcado para ligação ao seu ligando imobilizado e a quantidade de holo-TC II é calculada em relação à quantidade de ligando não imobilizado marcado ligado ou não ligado ao ligando imobilizado.

Numa forma de realização preferida, no passo de separação preliminar, a ligação de apo TC II e apo HC a cobalamina, seus análogos ou fragmentos tem lugar num sítio ou de tal modo que inibe o reconhecimento subsequente e a ligação da TC II ligada a cobalamina imobilizada pelo ligando não imobilizado ou parceiro de ligação para TC II. Nesta forma de realização não há necessidade de isolar a holo-TC II e a holo-HC das formas apo ligadas antes da realização do ensaio da invenção. Nesta forma de realização, o sítio contra o qual é dirigido o parceiro de ligação ou ligando não imobilizado é muito importante e deve ser um epitopo no TC II que fica mascarado ou protegido ou de outra forma indisponível para ligação quando apo TC II e apo-HC ficarem imobilizadas na cobalamina, seu análogo ou fragmento.

Quer o passo de separação envolva a utilização de um ligando de ligação para TC II quer seja antecedido por um passo preliminar utilizando cobalamina imobilizada, os seus análogos ou fragmentos, a separação total, i. e. separação de todas as proteínas TC II apo e holo da amostra, não é um requisito do método e basta que a fracção seja separada da amostra que compreende, pelo menos, uma porção do "subconjunto de proteínas TC" desejado. 19

Assim, em certas formas de realização, os parceiros de ligação ou ligandos e condições de ligação podem ser seleccionados de modo a conseguir a separação de substancialmente todo o "subconjunto" seleccionado. Neste caso a fracção não ligada pode ser considerada como estando substancialmente isenta de proteínas TC II ou holo-TC II, i. e. estando pelo menos 80%, 90% ou 95% isenta de TC II ou holo-TC II dependendo de qual o componente que é seleccionado como a base do fraccionamento.

Em formas de realização alternativas, o parceiro de ligação e as condições podem ser seleccionados para que só uma parte das proteínas TC II na amostra seja separada numa fracção. Neste caso, deve tomar-se em conta a separação parcial na construção de uma curva de calibração normalizada para o ensaio. A este respeito, a produção de uma curva de calibração normalizada em relação à qual pode ser determinada a concentração de holo-TC II detectada utiliza técnicas correntes bem conhecidas na técnica.

Assim, num passo de fraccionamento, é utilizado um ligando de ligação a TC II, pelo menos, uma porção da cobalamina ligada a TC II estará localizada na fracção ligada e qualquer cobalamina na amostra ligada a moléculas que não TC II, por exemplo, HC ou albumina estará na fracção não ligada (i. e. fracção ou fracções não separadas). A TC II na fracção ligada pode estar em forma apo e holo e pode estar complexada por substâncias semelhantes a cobalamina ou análogos para além de cobalamina.

Se desejado, o método da invenção pode envolver um passo de separação preliminar adicional em que se faz contactar a amostra com ligando de ligação específica para haptocorrina imobilizado ou imobilizável (em formas apo e holo ou só em 20 forma holo) . Desta forma qualquer contribuição para erros na determinação da cobalamina ligada a TC II que derivam de holo-HC podem ser reduzidos e podem ser utilizados ligandos de ligação específica para TC II ou holo-TC II que têm alguma afinidade para haptocorrinas.

De resto, como indicado acima, uma vez que a concentração no plasma de TC tanto na forma apo como holo é muito baixa, são necessários ligandos ou parceiros de ligação com especificidade e afinidade especialmente elevadas para funcionamento da invenção. Além disso, as constantes de afinidade requeridas dos ligandos da presente invenção dependem de ser o ligando é específico para TC II ou holo-TC II e também da sua utilização como ligando de captura ou de detecção, uma vez que a concentração no plasma de TC II é cerca de 0,5-1 nM mas a concentração de holo-TC II é só de 35-160 pM. Assim, para um ligando de captura de TC II é desejável uma constante de afinidade de pelo menos 10^ M“l, de um modo preferido, superior a 2 x 10^ M“1 e mais, de um modo preferido, 10-*-^ M”l. Para um ligando de captura de holo-TC II, é desejável uma constante de afinidade de pelo menos 10-*-^ M“l, de um modo preferido, 2 x IqIO m- 1, mais, de um modo preferido, superior a 2 x 10^*-* M-l e, de um modo ainda mais preferido, superior a 10 M”l. Claramente a constante de afinidade requerida de um ligante de detecção pode ser inferior à de um ligando de captura devido ao efeito de concentração do ensaio. O grau de reactividade cruzada de um ligando de ligação a holo-TC II ou TC II com HC deve, de um modo preferido, ser inferior a 1%, mais, de um modo preferido, entre 0,1% e 1% e mais, de um modo preferido, ainda inferior a 0,1%. Analogamente, um ligando de ligação a holo-TC II, de um modo preferido, não deve apresentar um grau de reactividade cruzada 21 com apo-TC II superior a 1%, mais, de um modo preferido, entre 0,1% e 1% e, de um modo ainda mais preferido, a reactividade cruzada deve ser inferior a 0,1%.

Por utilização desses ligandos de alta afinidade a sua função é prolongada para além da de serem simples ligandos de captura e/ou detecção e desempenham um papel vital por serem capazes de separar e concentrar proteina TC II a partir da amostra para análise. Os ligandos de ligação para TC II ou holo-TC II devem, de um modo preferido, concentrar o ligando pelo menos 3 vezes, de um mais modo preferido, 5 vezes e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos 10 vezes.

Numa forma de realização adicional da técnica de doseamento mais semelhante a um ensaio de deslocação do que um ensaio de competição, faz-se contactar a amostra compreendendo complexo de holo-TC II com uma fase sólida à qual está ligado um ligando marcado que reconhece os mesmos sítios de ligação nos ligandos imobilizados que holo-TC II. A holo-TC II da amostra compete com o ligando marcado ligado pelos sítios de tal modo que após a equilibraçâo do sistema, há uma relação directamente proporcional entre a quantidade de ligando marcado deslocado do suporte sólido e detectável em solução e a quantidade de holo-TC II presente na amostra original, o ligando marcado pode ser detectado directamente ou indirectamente e pode ser determinado como a quantidade de ligando marcado ligado ou não ligado ao suporte sólido consoante apropriado. De facto, nesta forma de realização, o ligando não imobilizado a que se fez referência anteriormente está ligado ao ligando imobilizado antes da aplicação da amostra mas essa ligação não deve ser considerada como significando que o ligando está de imobilizado por qualquer forma. 22

Uma forma de realização preferida adicional envolve fazer contactar uma amostra contendo holo-TC II com um suporte sólido com holo-TC II nele imobilizada e um ligante específico de holo-TC II marcado não imobilizado. A holo-TC II livre na amostra e a holo-TC II imobilizada competem para ligação ao ligando marcado não imobilizado e a determinação do ligando marcado ligado à fase sólida ou que permanece em solução permite calcular a concentração de holo-TC II. Numa forma de realização especialmente preferida da presente invenção, o ligando de ligação a holo-TC II marcado não imobilizado é um anticorpo.

Ainda noutra forma de realização, faz-se contactar a amostra compreendendo o analito de interesse com holo-TC II marcada e ligando imobilizado. A holo-TC II marcada e não marcada competem para ligação ao ligando imobilizado e depois de ser atingido o equilíbrio, a quantidade de holo-TC II marcada ligada ao ligando imobilizado é indirectamente proporcional à quantidade de holo-TC II na amostra de interesse. Novamente, a holo-TC II marcada pode ser detectada directamente ou indirectamente e pode ser determinada como a quantidade de holo-TC II marcada ligada ou não ligada ao suporte sólido consoante apropriado.

Numa forma de realização adicional da presente invenção, faz-se contactar um ligando não imobilizado mas imobilizável específico de complexo de holo-TC II, (e. g. um ligando conjugado com biotina ou outro membro de um par de ligação específica) com a amostra para formar um complexo de holo-TC II/ligando não imobilizado. 0 complexo de ligando/holo-TC II pode, então, ser precipitado da solução utilizando meios conhecidos e isolado para análise.

Ainda noutra forma de realização da invenção, dois 23 parceiros de ligação marcados são adicionados à amostra, opcionalmente após um passo preliminar, tal como esgotamento da amostra das formas apo de TC II e HC. Os parceiros de ligação neste caso são holo-TC II marcado ou um seu análogo ou fragmento e um seu parceiro de ligação marcado, por exemplo um anticorpo marcado. Nesta forma de realização só é produzido um sinal detectável a partir dos marcadores quando estão em grande proximidade um em relação ao outro, i. e. quando os dois parceiros de ligação marcados ficam ligados um ao outro. Assim, por adição à amostra, o parceiro de ligação marcado para holo-TC II pode ligar-se a holo-TC II não marcado presente na amostra caso em que não é produzido um sinal detectável ou a holo-TC II marcado ou um seu análogo, fragmento ou variante que se liga ao parceiro de ligação da TC II marcada, caso em que é produzido um sinal detectável. Os agentes de marcação como os dos ensaios de proximidade de cintilação da Amersham, tal como descritos na Patente US N° 4568649 são adequados para incorporação nessa forma de realização e a alta sensibilidade deste procedimento é muito adequada para um ensaio em que o analito está numa concentração tão baixa. Assim por exemplo, um membro de par de ligação podia ser marcado com um nuclido emissor β, tal como 125j Qu e o outro membro marcado com uma molécula cintilante adequada. A partícula β emitida perde a sua energia para o seu meio circundante aquoso salvo se o cintilador estiver dentro de 1,5 ym e por isso requer que ambos os parceiros marcados estejam ligados um ao outro para formar um sinal que seja detectável. A probabilidade de dois parceiros marcados se ligarem um ao outro é determinada pela concentração de holo-TC II presente na amostra de tal modo que quanto maior o sinal produzido, menor a concentração de holo-TC II na amostra.

Tal como aqui utilizado, o termo "determinação" ou "avaliação" incluem ambos quantificação no sentido da obtenção 24 de um valor absoluto da quantidade ou concentração de holo-TC II ou cobalamina ligada a TC-II na amostra, e também avaliações ou determinações semiquantitativas e qualitativas. Pode obter-se um índice, proporção, percentagem ou indicação semelhante do nível ou quantidade de cobalamina ligada a TC II, por exemplo relativa à cobalamina total. A amostra corporal utilizada no método de ensaio da invenção pode ser qualquer amostra contendo cobalamina e. g. um fluido corporal ou amostra de tecido, ou uma suspensão etc. De um modo preferido, contudo, a amostra será um fluido corporal por exemplo, fluido seminal, fluido cérebro-espinal ou líquido amniótico, mas geralmente será uma amostra derivada do sangue. Quando é este o caso, como a amostra utilizada para análise está, de um modo preferido, isenta de células, pode utilizar-se soro ou plasma. A amostra pode ser tratada antes de ser utilizada no método de ensaio da invenção, por exemplo pode ser diluída por adição de um tampão ou outro meio aquoso e pode ser armazenada ou conservada por exemplo por arrefecimento ou congelação antes da análise.

Na prática da invenção, quando uma fracção ligada é separada de uma fracção não ligada isto pode ser realizado por qualquer meio adequado, por exemplo, precipitação, centrifugação, filtração, métodos cromatográficos, etc.

Para evitar dúvidas, o termo "cobalamina" é aqui utilizado como sinónimo de "vitamina B12" e inclui todas as formas da vitamina B12 (cianocobalamina; 5,6-dimetilbenzimidazolil cianocobamida; metilcobalamina; 5'-desoxiadenosilcobalamina) que podem ocorrer e ser activas metabolicamente (quando apresentadas apropriadamente) no organismo. 25

Como indicado acima, no método da invenção, a determinação da cobalamina ligada a TC pode ser realizada por detecção de um ligando ligado à holo-TC II separada, ou por realização de um ensaio de competição utilizando um competidor marcado para holo-TC II com o que a holo-TC II compete com o competidor marcado para ligação a um seu ligando de ligação, ou por detecção de cobalamina libertada de holo-TC II separada. 0 ligando detectável pode com vantagem ser marcado por qualquer meio convencional, por exemplo com um marcador que forme um sinal que pode ser determinado por e. g. luminescência, quimioluminescência, avaliação colorimétrica, fluorescência, radioactividade ou por actividade enzimática. De facto, qualquer marcador que forme um sinal conhecido na técnica pode ser utilizado no método da invenção.

Apenas a titulo exemplificativo, alguns exemplos adequados de compostos corados ou fluorescentes que podem ser utilizados para marcar um ligando de ligação de forma detectável na presente invenção são antraquinonas, corantes azóicos, corantes azinas, tais como oxazinas e tiazinas, triazinas, pigmentos de ocorrência natural tais como porfirinas, ficobiliproteinas, incluindo ficoeritinas e ficoquaninas, clorofilas e os seus análogos e derivados, carotenóides, acridinas, xantenos incluindo fluoresceinas e rodaminas, corantes indigóides, tioxantenos, cumarinas, polimetinos incluindo di e tri arilmetinos e os seus derivados de ftalocianinas e ftalocianinas de metais.

Analogamente, pode utilizar-se uma ampla gama de compostos radioactivos como a parte do marcador que forma um sinal do reagente utilizado nesta invenção, entre eles compostos marcados com Iodo-125. 26

Alternativamente, os ligandos de ligação podem ser conjugados a compostos naturais ou sintéticos para produzir um sinal quimioluminescente que pode ser determinado de modo conhecido (Cormier, M. J. et al.} Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, Nova Iorque 1973) . Compostos quimioluminescentes adequados incluem luciferina, ésteres oxálicos, 1,2-dioxetano, luminol ou os seus derivados, mas não estão limitados a estes. Se apropriado, pode utilizar-se peróxido de hidrogénio, enzimas e. g. luciferase, ou outros produtos químicos para produzir o sinal quimioluminescente a partir das moléculas produtoras de sinais utilizadas.

As moléculas formadoras de sinais fortemente aniónicos podem não ser preferidas para utilização no método da invenção, uma vez que têm tendência para se ligar a proteínas do soro tais como albumina de soro humano (HSA) que pode estar presente na amostra. Exemplos especialmente adequados que podem ser utilizados são isotiocianato de fluoresceína, Rodamina B ou ácido N-(resorufin-4-carbonil)piperidino-4-carboxílico-éster de N-hidroxissuccinimida) ou resos.

De acordo com uma forma de realização do método da invenção, uma fracção compreendendo, pelo menos, uma porção da TC II pode ser separada de uma amostra de fluido corporal por reacção do fluido corporal com um ligando de ligação específica para TC II e depois separação da fracção ligada a TC II do resto da amostra, isolando e concentrando assim o analito alvo nela presente. Numa forma de realização da invenção, um ligando de ligação detectável dirigido contra holo-TC II pode ser utilizado para determinar o complexo de TC II-cobalamina presente na fracção ligada separada. Pode fazer-se contactar o ligando de ligação a holo-TC II com a amostra em investigação antes de, simultaneamente com ou depois do contacto com o 27 ligando de ligação a TC II e antes ou depois da separação da fracção ligada a TC II do resto da amostra.

Correspondentemente, uma fracção contendo cobalamina (e. g. compreendendo holo-TC II e holo-HC) pode ser separada do resto da amostra por reacção do fluido corporal em investigação com uma cobalamina imobilizada ou agarrada ou um seu análogo ou fragmento que se liga a apo-TC II e apo-HC e separação da fracção ligada do resto da amostra que compreende holo-TC II e holo-HC. Um ligando de ligação a TC II detectável, pode, então ser utilizado para detectar o complexo de TC II-cobalamina presente na fracção separada. Pode fazer-se contactar o ligando de ligação a TC II detectável com a amostra em estudo antes de, simultaneamente com ou depois do contacto com a cobalamina ligada e antes ou depois da separação da fracção ligada do resto da amostra.

Em algumas formas de realização, podem ser dispostos numa coluna ligandos imobilizados para um ou os outros componentes dos complexos de apo e/ou holo TC II/HC. 0 fluido corporal contendo o complexo de cobalamina de TC II pode ser aplicado na coluna e entrar em contacto com o(s) ligando(s) de ligação. A coluna pode ser purgada ou lavada e utilizado um eluente para permitir, se necessário, a libertação de uma fracção ligada da coluna e facilitar a sua recolha. Se o conteúdo da fracção não ligada for ou se destinar também a ser analisado quanto a outros constituintes, a coluna deve ser lavada com um tampão ou meio administrado utilizando uma micropipeta calibrada para assegurar que um volume exacto é administrado e recolhido. 0 volume administrado está, de um modo preferido, dentro de 3% do volume desejado (i. e. de calibração), de um modo mais preferido, dentro de 1 ou 2%.

Analogamente, se a fracção a ser analisada for para ser 28 libertada da coluna antes da detecção, o eluente utilizado para libertar o complexo deve ser administrado utilizando uma micropipeta calibrada.

Numa forma de realização alternativa, os ligandos de ligação utilizados para separar uma fracção de uma amostra podem estar imobilizados num suporte em fase sólida em partículas, por exemplo, pérolas de látex ou de polímero. Para auxiliar na manipulação e separação, pode utilizar-se pérolas magnéticas e de facto esta é uma forma de realização preferida da presente invenção. 0 termo "magnético", tal como aqui utilizado significa que o suporte é capaz de ter um momento magnético a si conferido quando colocado num campo magnético. Por outras palavras, um suporte compreendendo partículas magnéticas pode ser prontamente removido por agregação magnética, que proporciona uma forma rápida, simples e eficiente de separar as fracções depois da ligação do ligando.

Assim, utilizando o método da invenção, as partículas magnéticas com o complexo de TC Il-cobalamina ligado podem ser removidas para uma superfície adequada por aplicação de um campo magnético, por exemplo, utilizando um íman permanente. Normalmente é suficiente aplicar um íman no lado do recipiente contendo a mistura da amostra para fazer com que as partículas de congreguem na parede do recipiente e para as isolar para análise posterior. São especialmente preferidas as partículas superparamagnéticas por exemplo as descritas por Sintef no documento EP-A-106873, uma vez que pode ser evitada a agregação e junção magnéticas das partículas durante a reacção. As pérolas magnéticas bem conhecidas produzidas por Bang Particles (EUA) podem ser especialmente adequadas para utilização na presente invenção. 29

Em geral, para além da amostra em avaliação, amostras de calibração com teor conhecido de complexo de holo-TC II serão também avaliadas na realização do método de ensaio da invenção. Essas determinações podem ser utilizadas para traçar uma curva de calibração a partir da qual pode ser determinado o teor de cobalamina ligada a TC II da amostra em investigação. A natureza das amostras de calibração e selecção de factores de conversão ou ajustamento utilizados na determinação do complexo de holo-TC II pode variar dependendo, por exemplo, dos ligandos específicos utilizados nos passos de ligação e de separação do ensaio e outros aspectos do método que afectam a ligação e separação da amostra, por exemplo, composição do tampão, condições do ensaio, etc. Tipicamente, utilizar-se-á amostras de calibração com teor de holo-TC II de 0 a 300 pmol/L. A gama de referência dentro da qual o valor de cobalamina ligada a TC II vai geralmente ser encontrado é de 30 a 160 pmol/L. O padrão de calibração de holo-TC II pode, tipicamente, ser humano, nativo ou holo-TC II recombinante. A utilização de holo-TC II como um calibrador em doseamentos de holo-TC II é nova e constitui mais um aspecto da invenção.

Considerada ainda num outro aspecto, a invenção proporciona um kit para um ensaio de diagnóstico de acordo com a invenção, compreendendo o referido kit: de ligação específica para TC II ou holo-TC II imobilizado ou imobilizável; de um modo preferido uma solução de holo-TC II de concentração conhecida e mais, de um modo preferido, um conjunto dessas soluções com uma gama de concentrações de complexo de holo-TC II; 30 opcionalmente, um agente de libertação para libertar cobalamina de holo-TC II; e opcionalmente um ligando marcado. 0 método de ensaio da invenção determina a reserva metabolicamente activa de cobalamina por determinação do complexo de holo-TC II ou isolamento do complexo de holo-TC II e depois determinação da cobalamina a ele associada e proporciona assim um método conveniente para a determinação da deficiência de cobalamina antes ou depois da instalação de manifestações clinicas de deficiência de cobalamina. 0 método de ensaio pode, com vantagem, ser utilizado antes da instalação de sintomas uma vez que tem um valor exacto de previsão do balanço negativo de cobalamina. A presente invenção será agora ilustrada pelos seguintes Exemplos não limitativos e os desenhos anexos em que: a Figura 1 é uma curva padrão de holo-TC II; a Figura 2 é um gráfico que mostra a relação entre a cobalamina total no soro e a concentração de holo-TC II; e a Figura 3 é um gráfico que mostra a relação entre a cobalamina total no soro e a concentração de holo-HC. EXEMPLO 1

Anticorpos (e. g. anticorpos monoclonais ou policlonais) específicos para TC II são imobilizados em partículas 31 magnetizáveis. Deixa-se reagir uma aliquota de soro (100-500 pL) misturada com igual volume de PBS durante 15 min com um excesso de anticorpo imobilizado e um excesso de um anticorpo anti-holo-TC II não sobreponivel (e. g. um anticorpo monoclonal) radiomarcado com As partículas magnetizáveis são sedimentadas utilizando um íman forte, o sobrenadante é retirado e as partículas são lavadas com PBS. A radioactividade é medida e a concentração de holo-TC II da amostra é determinada por interpolação numa curva padrão. EXEMPLO 2

Anticorpos (e. g. anticorpos monoclonais ou policlonais) específicos para TC II são imobilizados em partículas magnetizáveis. Deixa-se reagir uma aliquota de soro (600 pL) misturada com igual volume de PBS durante 30 min com o anticorpo. As partículas magnetizáveis são sedimentadas utilizando um íman forte e o sobrenadante é retirado. As partículas são lavadas uma vez com PBS e são subsequentemente tratadas com hidróxido de sódio (0,3 M) contendo cianeto de potássio (100 pM) , ditiotreitol (15 mM) e uma quantidade fixa de cianocobalamina radiomarcada com 125j ou 57p0 num voiume total de 100 pL durante 15 min, para libertar a cobalamina ligada ao holo-TC II imobilizado e ao mesmo tempo converter todas as formas de cobalamina em cianocobalamina e misturar com uma quantidade fixa de cianocobalamina marcada. Uma quantidade limitada de Factor Intrínseco em 100 pL de tampão borato é adicionada e deixada reagir durante 10 min. As partículas magnetizáveis são sedimentadas utilizando um íman forte e retira-se 150 pL de sobrenadante para medição da radioactividade. A concentração de cobalamina ligada a TC II na 32 amostra de soro é determinada a partir de uma curva padrão.

Alternativamente, a cobalamina libertada pode ser medida utilizando o método IMX de Abbot ou métodos semelhantes. EXEMPLO 3

Anticorpos (e. g. anticorpos monoclonais ou policlonais) específicos para holo-TC II são imobilizados em partículas magnetizáveis. A uma alíquota de soro (100-500 pL) misturada com igual volume de PBS é adicionada uma quantidade fixa de holo-TC II marcada com 125j e uma quantidade limitada do anticorpo anti-holo-TC II imobilizado. Após incubação durante 15 min as partículas magnetizáveis são sedimentadas utilizando um íman forte. As partículas são lavadas com PBS e a radioactividade é medida. A concentração de holo-TC II é determinada a partir de uma curva padrão. EXEMPLO 4

Holo-TC II recombinante é imobilizada em partículas magnetizáveis. A uma alíquota de soro (100-500 pL) misturado com um volume igual de PBS adiciona-se uma quantidade fixa de holo-TC II imobilizado e um excesso de um anticorpo (e. g. um anticorpo monoclonal ou policlonal) específico para holo-TC II e radiomarcado com 125j_ Após 15 min de incubação as partículas são sedimentadas por utilização de um íman forte. As partículas são lavadas com PBS e a radioactividade é medida. A concentração de holo-TC II é determinada a partir de uma curva padrão. 33 EXEMPLO 5 A uma alíquota de soro (100-500 yL) adiciona-se um excesso de cobalamina biotinilada, de modo a ligar toda a apo-TC II e apo-HC. Após incubação durante 10 min, a amostra de soro é tratada com partículas magnéticas revestidas com avidina durante 10 min. As partículas são sedimentadas por utilização de um íman forte. O sobrenadante é recuperado e misturado com dois anticorpos monoclonais anti-TC II não sobreponíveis, um radiomarcado com 125j e o outro com biotina conjugada. Após 10 min adiciona-se partículas magnéticas revestidas com avidina e deixa-se ligar os adutos biotinilados durante 10 min. Subsequentemente, as partículas são sedimentadas utilizando um íman forte e lavadas com PBS. A radioactividade é medida e a concentração de holo-TC II é determinada por interpolação numa curva padrão. EXEMPLO 6 O mesmo que no Exemplo 5, mas o soro desprovido de apo-TC II é misturado com uma quantidade fixa de holo-TC II marcado 1251 e uma quantidade limitada de anticorpo anti-TC II imobilizado em partículas magnetizáveis. Após incubação durante 15 min as partículas são sedimentadas utilizando um íman forte.

As partículas são lavadas com PBS e a radioactividade é medida. 34

Exemplo 7

Cobalamina é imobilizada em microesferas magnetizáveis, e. g. por acoplamento covalente ou por utilização de acoplamento com biotina-(estrept)avidina. Tipicamente, microesferas magnetizáveis revestidas com estreptavidina são incubadas com 1 μΜ de cobalamina biotinilada durante 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro. As pérolas são sedimentadas por utilização de iman, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas a 1% em PBS + 5 mg/mL de HSA. A uma aliguota de soro (100-500 pL) adiciona-se o mesmo volume de PBS e 1/10 em volume de microesferas magnetizáveis revestidas com cobalamina. A mistura é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro de modo a ligar toda a apoTCII e apoHC. As partículas são sedimentadas por um iman e o sobrenadante é recuperado e misturado com dois anticorpos monoclonais anti-TC II humana não sobreponíveis, um radiomarcado com 125j e 0 outro conjugado com biotina. Após 10 minutos adiciona-se microesferas magnetizáveis revestidas com (estrept)avidina e deixa-se ligar os adutos biotinilados durante 10 minutos. Subseguentemente, as partículas são sedimentadas com um iman e lavadas com PBS. A radioactividade é medida e a concentração de holo-TC II é determinada por interpolação numa curva padrão. EXEMPLO 8 0 mesmo que no Exemplo 7 mas o excesso de cobalamina biotinilada é directamente adicionado à amostra de soro + PBS, de modo a ligar toda a apoTCII e apoHC. Após incubação durante 10 minutos, a amostra de soro é tratada com microsferas magnetizáveis revestidas com (estrept)avidina durante 30 minutos à temperatura ambiente, no escuro. 35 EXEMPLO 9

Anticorpo de coelho específico para TCII humana e com uma constante de ligação aparente > 5x10^ M_1 foi imobilizado em microesferas magnetizáveis de 1 pm revestidas com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho (Indica Diagnostics). Amostras de soro de 400 pL cada de 49 voluntários saudáveis foram misturadas com igual volume de PBS e 40 pL do anticorpo imobilizado (1%) . As misturas foram mantidas à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora e, depois, as microesferas foram sedimentadas por utilização de um íman. Os precipitados foram lavados uma vez com tampão de lavagem gelado (PBS mais Tween 20 a 0,02%) e subsequentemente, ressuspensos em 50 pL de ditiotreitol a 50 mM, cianeto de potássio a 0,001%, e uma quantidade fixa de 5^Co-CN-Cobalamina (Amersham) em tampão fosfato, pH 7,5. Esta foi deixada em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente após o que se adicionou 25 pL de hidróxido de sódio 0,5 M e 15 minutos mais tarde 300 pL de Factor Intrínseco imobilizado em Dextrano (suficiente para ligar 50% de marcador) em tampão borato, pH 8,6. Após 1 hora à temperatura ambiente, no escuro, as amostras foram centrifugadas a 1000 g e 4 °C durante 10 minutos, os sobrenadantes foram cuidadosamente retirados e os sedimentos contados num Packard Riastar. A concentração de cobalamina ligada a TCII foi determinada a partir de uma curva padrão construída com oito calibradores (0-500 pM de holoTC-II) tratados de modo idêntico às amostras. 37 amostras de plasma também foram analisadas quanto à cobalamina total no soro por utilização do ensaio IMx B12 da Abbot. A curva padrão para holo TC-II está apresentada na Figura 36 1 e a relação entre as concentrações de cobalamina total no soro e holo TC-II em 37 voluntários saudáveis está ilustrada na

Figura 2. É evidente que a correlação é baixa, com r^ = 0,50. Em contraste, a correlação entre holo HC e cobalamina total no soro é alta, r^ = 0,96 (Fig. 3). A concentração média de holo TC para os 49 voluntários saudáveis era 64+28 pM e a gama de referência a 95% 23-127 pM. O ensaio tem um CV de 10%, uma sensibilidade analítica (O-calibrador - 3 d.p.) abaixo de 10 pM e não há reacção cruzada com haptocorrina.

Lisboa, 25 de Maio de 2007 37

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de ensaio para a determinação de holo- transcobalamina II numa amostra isenta de células de um fluido corporal, compreendendo fazer contactar a referida amostra com um ligando de ligação especifico para Transcobalamina II ou holo-Transcobalamina II, tendo uma reactividade cruzada para Haptocorrina inferior a 1%, imobilizado em partículas magnetizáveis, separação de uma fracção ligada ao ligando de uma fracção não ligada ao ligando por aplicação de um campo magnético e determinação do teor de holo-Transcobalamina II na referida fracção ligada ao ligando, em que a separação da referida fracção ligada ao ligando da referida fracção não ligada ao ligando proporciona um aumento da concentração de holo-Transcobalamina II de, pelo menos, 3 vezes e em que o referido ligando de ligação especifico possui uma constante de afinidade de, pelo menos, 10^ M-l no caso de um ligando de ligação específico para Transcobalamina II, e, pelo menos, 10-*-^ M-1 no caso de um ligando de ligação específico para holo-Transcobalamina II .
2. 2. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 1 em que o referido ensaio é capaz de detectar holo-Transcobalamina II a uma concentração tão baixa como 9 pM.
3. 3. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o referido ligando de ligação específico apresenta um elevado grau de sensibilidade e especificidade para Transcobalamina II e apresenta baixa 1 afinidade para outras proteínas Transcobalaminas, quer na forma apo quer na forma holo, ou qualquer outra proteína que se liga a cobalamina. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3 em que o referido ligando de ligação específico é seleccionado do grupo compreendendo um anticorpo monoclonal e policlonal, um fragmento de anticorpo, um polipéptido, um oligopéptido, uma produto químico orgânico pequeno, uma sequência de ADN ou ARN de ligação específica, ou um receptor à superfície celular. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o referido ligando de ligação específico é um anticorpo monoclonal que se liga a Transcobalamina II. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5 em que a referida cobalamina é libertada das moléculas de holo Transcobalamina II por meio de uma alteração da temperatura ou do pH do meio circundante. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 6 em que a referida cobalamina libertada é determinada por um ensaio de ligação competitiva realizado fazendo contactar um parceiro de ligação imobilizado para cobalamina com a cobalamina dissociada da amostra na presença de ligando marcado que compete com a cobalamina isolada para ligação ao parceiro de ligação imobilizado. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 7 em que o referido ligando marcado está marcado com um 2 marcador que forma um sinal que pode ser determinado por luminescência, quimioluminescência, determinação colorimétrica, fluorescência, radioactividade ou actividade enzimática.
4. 9. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 7 em que o referido ligando marcado está marcado com um marcador que forma um sinal que pode ser determinado por radioactividade.
5. 10. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 9 em que o referido ligando de ligação especifico é especifico para Transcobalamina II e tem uma constante de afinidade superior a 10M--*-.
6. 11. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 10 em que o grau de reactividade cruzada de um ligando de ligação a holo-Transcobalamina II ou Transcobalamina II com Haptocorrina é inferior a 0,1%.
7. 12. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 11 em que a referida amostra isenta de células de um fluido corporal é seleccionada do grupo que compreende fluido seminal, fluido cérebro-espinal, liquido amniótico ou uma amostra derivada do sangue.
8. 13. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 12 em que a referida amostra derivada do sangue é soro ou plasma.
9. 14. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 13 em que a calibração do ensaio é 3 realizada utilizando um padrão de holo-Transcobalamina II.
10. 15. Método de ensaio como reivindicado na reivindicação 14 em que o referido padrão é holo-Transcobalamina II humana, nativa ou recombinante.
11. 16. Método de ensaio como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o referido ligando de ligação especifico se liga a holo-Transcobalamina II e tem uma reactividade cruzada para apo-Transcobalamina II não superior a 1%. Lisboa, 25 de Maio de 2007 4