ES2287607T3 - Ensayo de cobalamina. - Google Patents
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Abstract
Un método de ensayo para la determinación de la holo-transcobalamina II en una muestra libre de células de un fluido corporal, comprendiendo la puesta en contacto de dicha muestra con un ligando de unión específica para la Transcobalamina II o la holo-Transcobalamina II, mostrando una reactividad cruzada con la Haptocorrina inferior al 1%, inmovilizada sobre partículas magnetizables, separando una fracción unida al ligando de una fracción no unida al ligando por medio de la aplicación de un campo magnético y midiendo el contenido de holo-Transcobalamina II en dicha fracción unida al ligando, en donde la separación de dicha fracción unida al ligando de dicha fracción no unida a ligando proporciona un incremento en la concentración de holo-Transcobalamina II de, al menos, 3 veces y, en donde dicho ligando de unión específica posee una constante de afinidad de, al menos, 109M-1 en el caso de un ligando de unión específica para la Transcobalamina II, y de al menos 1010M-1 en el caso de un ligando de unión específica para la holo-Transcobalamina II.
Description
Ensayo de cobalamina.
La presente invención está relacionada con
métodos de ensayo para la determinación de la presencia de
cobalamina o vitamina B_{12} en un fluido corporal y, en
particular, con métodos de ensayo para determinar el pool
metabólicamente activo de la cobalamina.
La cobalamina, o vitamina B_{12}, es una
vitamina soluble en agua, la cual forma parte del complejo
vitamínico B que se encuentra en los alimentos. La parte central de
la molécula consiste en un anillo de corrina de cuatro unidades
pirrólicas que rodean al átomo esencial de cobalto. La cobalamina es
la única vitamina que no puede ser sintetizada por los animales o
las plantas, y debe ser absorbida de la comida en el intestino. Sin
embargo, puede ser almacenada en el hígado. Es sintetizada por
microorganismos, en particular por bacterias anaeróbicas y
levaduras.
La cobalamina funciona in vivo como una
coenzima y las enzimas de cobalamina catalizan tres tipos de
reacción; (1) recolocaciones intramoleculares, por ejemplo, la
formación de succinil-CoA partiendo del
L-metilmalonil CoA, (ii) metilaciones, por ejemplo,
la formación de metionina por medio de la metilación de la
homocisteína y (iii) reducción de ribonucleótidos en
desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. En los mamíferos
únicamente se sabe de dos reacciones enzimáticas -las antes
mencionadas específicamente en (i) y (ii)- que precisan de la
cobalamina como una coenzima.
En el proceso de la digestión una proteína
salivaria, llamada haptocorrina -de aquí en adelante referida como
HC (la cual es denominada también en este campo
Ligando-R o transcobalaminas I y III
colectivamente)-, se une a la cobalamina en el tracto superior
gastrointestinal, formando un complejo que pasa a través del
estómago. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo de
cobalamina-haptocorrina (holo-HC) en
el íleon, liberando cobalamina, la cual se une entonces a una
proteína denominada factor intrínseco, que es secretada por la
mucosa gástrica, con el fin de formar un nuevo complejo. El complejo
de cobalamina-factor intrínseco se une a un
receptor específico en el revestimiento del íleon terminal, en donde
es disociado por medio de un factor liberador y la cobalamina
transportada cruza activamente la membrana del íleon hasta llegar al
torrente sanguíneo.
La cobalamina no circula por el cuerpo en forma
libre en una cantidad apreciable. Probablemente aproximadamente el
99% de la cobalamina se encuentra unida por medio de una de las
proteínas de la transcobalamina (TC I-III) o de la
albúmina.
Se cree que la proteína responsable del
transporte de la cobalamina hasta los tejidos diana es la
transcobalamina II (TC II), una proteína localizadora esencial,
sin la cual la cobalamina no puede cruzar las membranas celulares.
A pesar de esta importante función metabólica, únicamente alrededor
del 6 al 25% de la cobalamina en el suero se encuentra unida a la
TCII, y la mayor parte es transportada por la HC. La TC II es un
polipéptido de cadena sencilla de 45 kDa que se encuentra
principalmente en el suero, fluido seminal y fluido cerebroespinal.
La cobalamina unida a la TC II, u holo-TC II, se
une a receptores específicos situados en las membranas celulares y,
una vez unida, el complejo holo-TC II es
transportado al interior de las células por medio de
pinocitosis.
La TC II es sintetizada por el hígado, el
endotelio vascular, los enterocitos, los macrófagos y los
fibroblastos, y circula predominantemente como
apo-TC II, i.e., sin cobalamina unida a la misma.
Tiene una vida media corta, de aproximadamente 90 minutos.
Menos de un cuarto de la cobalamina plasmática
total se encuentra asociada a la TC II. El resto está unido a las
otras transcobalaminas o a la albúmina, conforme es mencionado con
anterioridad.
Debido a que la cobalamina debe ser absorbida de
la comida, cualquiera de las dolencias que dan como resultado un
deterioro de la función gástrica, por ejemplo la gastroenteritis, o
dolencias que produzcan atrofia gástrica, o una incapacidad de
producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor
liberador, TC II o receptores TC II, puede dar como resultado un
deterioro en la captación de cobalamina y la deficiencia
resultante.
Ciertos subgrupos de población, por ejemplo los
ancianos, las mujeres embarazadas, los pacientes con enfermedad
gastrointestinal crónica o aguda, aquéllos que sufren de ciertas
enfermedades autoinmunes, aquéllos con un historial familiar de
anemia perniciosa y los que sufren de SIDA, son particularmente
proclives a deficiencia de cobalamina.
Las manifestaciones clínicas de la deficiencia
de cobalamina son variadas y numerosas, pero principalmente
incluyen la anemia, la hematopoyesis megaloblástica, y los
desórdenes funcionales y estructurales del sistema nervioso.
Alrededor del 60% de los individuos que son diagnosticados como
deficientes en cobalamina son anémicos, pero en muchos de ellos los
síntomas neurológicos son los únicos signos clínicos observados.
Alrededor del 10% de los pacientes muestran síntomas psiquiátricos
y alrededor del 40% exhiben tanto síntomas neurológicos como
psiquiátricos.
Es crucial un diagnóstico temprano de la
deficiencia de cobalamina para asegurar una buena prognosis para
los pacientes, ya que algunas de las manifestaciones de la
deficiencia de cobalamina, particularmente los efectos
neuropsiquiátricos, son irreversibles si no son detectados y
tratados rápidamente con terapia de cobalamina.
Por lo tanto, es deseable el determinar con
seguridad el nivel de cobalamina de un individuo de una manera
rápida y eficiente, con vistas a establecer si el individuo puede
estar sufriendo o no de deficiencia de cobalamina.
La medición de la cobalamina plasmática total,
i.e. la cobalamina (y sustancias similares a la cobalamina) unida a
cualquiera de las proteínas de la transcobalamina (TC) I, II y III,
ha sido utilizada en intentos para determinar la deficiencia de
cobalamina. Esta técnica da como resultado una distribución de
concentración con una amplia base en el seno de una población que
es considerada normal y, de ahí, que produzca un amplio rango de
referencia. Sin embargo, entre los individuos, el rango de
cobalamina disponible que se considera normal para un individuo en
particular es muy estrecho. Ha sido observado que, aunque una
concentración de cobalamina metabólicamente activa en los
individuos se haya desplazado fuera de su propio rango de
referencia, su contenido de cobalamina plasmática total permanece
dentro del rango considerado como normal para la población. Bajo
tales circunstancias la deficiencia de cobalamina puede pasar
desapercibida. Un método tan poco fiable es claramente indeseable y
es de sobra reconocido que tales mediciones de cobalamina sérica o
plasmática presentan una baja sensibilidad diagnóstica y
especificidad.
Han sido desarrollados y utilizados ensayos
microbiales, que incluyen microorganismos que dependen para su
crecimiento de la cobalamina, para la medición de la concentración
de la cobalamina plasmática pero, además de la dificultad de
estimar el rango de referencia adecuado, estos métodos precisan de
la extracción y conversión de las cobalaminas, lo cual lleva mucho
tiempo, es problemático y totalmente inadecuado para un rápido
escrutinio en laboratorio.
Los métodos alternativos para la determinación
de la deficiencia de cobalamina implican la medición de la
acumulación de metabolitos en el plasma que precisan de la
cobalamina para su conversión. Los niveles en plasma de
metilmalonato y de homocisteína se ven incrementados en los
pacientes con insuficiencia de cobalamina (Chanarin, The
megaloblastic anaemia; London, Blackwell Scientific Publications,
1991) y les convierten en buenos candidatos como moléculas que
correlacionan la deficiencia de vitamina B_{12}. Sin embargo, los
métodos basados en la determinación de homocisteína han demostrado
ser complicados, poco prácticos y presentan una pobre especificidad
y sensibilidad. Aunque los métodos basados en la medición del
metilmalonato son precisos y fiables, son incómodos y precisan de
análisis combinado de cromatografía de gases y espectrometría de
masas y, por lo tanto, son caros y también inadecuados para un
escrutinio rutinario clínico (Nexø et al. (1994) Scand. J.
Clin. Lab. Invest. 54:61-76).
Ha sido sugerido también que la medición de la
cobalamina unida a la TC II comparándola con la cobalamina
plasmática total puede proporcionar un indicador clínico fiable de
la probabilidad de deficiencia de cobalamina (Herbert et al.
(1990) Am. J. Hematol. 34:132-139;
Wickramasinghe and Fida (1993) J. Clin. Pathol.
46:537-539; Patente US 4680273). Sin
embargo, tales esfuerzos para determinar la concentración de
holo-TC II han sido hasta el día de hoy mayormente
indirectos, estimando la concentración de holo-TC II
como la diferencia entre la cobalamina plasmática total y la
concentración de cobalamina en el plasma al que se le ha eliminado
la TC II.
Tal eliminación de la TC II puede ser llevada a
cabo por medio de la adsorción de sulfato de amonio (Carmel (1974)
Am. J. Clin. Pathol. 62:367-372), microsílice
(Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest.
58:332-337); Wickramasinghe & Fida (1993) J.
Clin. Pathol. 46:537-539), vidrio microfino (Vu
et al. (1993) Am. J. Hematol. 42:202-211) o
anticuerpos policlonales anti-TC II inmovilizados
(Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta
132:53-61). La concentración de cobalamina en el
plasma total y la fracción eliminada son realizadas por medio de
métodos de sobra conocidos en este campo, tales como técnicas de
radio inmunoensayo o inmunoensayo enzimático. Estos métodos son
inadecuados para un escrutinio rutinario, automatizado o no, debido
a que son complejos y llevan mucho tiempo, y porque el bajo grado
de especificidad de los materiales adsorbentes utilizados da como
resultado una separación insuficiente entre la
holo-TC II y la holo-HC, lo cual
lleva a una sobreestimación de la holo-TC II. La
variación lote a lote del material adsorbente introduce errores
adicionales y, lo más importante, la sustracción de un gran volumen
de otro gran volumen da como resultado imprecisiones inaceptables y
poca fiabilidad.
Los otros intentos para determinar la TC II han
comprendido la separación de la TC II de otros componentes séricos,
incluyendo la TC I y la TC III, utilizando su lipofilicidad. De esta
forma, Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta
172:297-310, Benhayoun et al. (1993)
Acta Haematol. 89:195-199 y Toft et al.
(1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62 revelan métodos
para separar la TC II de otras transcobalaminas, utilizando
heparina-sefarosa, gel de sílice o celulosa,
respectivamente. Sin embargo, estos métodos presentan las mismas
desventajas que los métodos indirectos, ya que se basan en los
mismos materiales adsorbentes. Del mismo modo, la baja
concentración plasmática de la holo-TC II hace que
estos métodos sean inadecuados para combinar con los métodos
existentes de cuantificación de cobalamina. El rango normal de la
holo-TCII es de 36-160 pM y los
valores por debajo de 35 pM serán considerados por lo general como
indicativos de deficiencia de cobalamina. La sensibilidad analítica
reportada por la mayoría de los métodos rutinarios para determinar
la cobalamina plasmática es de alrededor de 40 pM pero, en la
práctica, a menudo es mucho mayor, usualmente alrededor de 90 pM.
Por lo tanto, los niveles plasmáticos normales de la
holo-TC II se encuentran por
debajo del límite de sensibilidad, o cerca del mismo, de los métodos rutinarios para la cuantificación de la cobalamina.
debajo del límite de sensibilidad, o cerca del mismo, de los métodos rutinarios para la cuantificación de la cobalamina.
Posiblemente, el método más preciso reconocido
en la actualidad para la determinación de la cobalamina unida a la
TC II comprende la adsorción de la TC II por el sílice y, a
continuación, analizando la fracción unida para determinar el
contenido de cobalamina, utilizando un inmunoensayo como el
descrito, por ejemplo, por Kuemmerle et al.(1992) Clin.
Chem. 38/10: 2073-2077, o un ensayo microbiológico,
produciendo este último, aparentemente, los mejores resultados.
Este método precisa de un día entero de trabajo para realizar
únicamente veinte ensayos. Es muy caro y poco práctico, y no se
adecua a las investigaciones diagnósticas clínicas rutinarias en
laboratorio.
De esta forma, existe una gran necesidad de
encontrar métodos mejorados para determinar el nivel de cobalamina
metabólicamente activa en un fluido corporal, con vistas a
correlacionar el nivel de cobalamina con la probabilidad de una
deficiendia de cobalamina, que sean favorables para la aplicación
diagnóstica clínica rutinaria.
De esta manera, conforme a un primer aspecto, la
presente invención proporciona un método de ensayo para la
determinación de la cobalamina unida a la transcobalamina II en una
muestra corporal, comprendiendo la puesta en contacto de una
muestra libre de células de un fluido corporal con un ligando de
unión específica, inmovilizado o inmovilizable, para la TC II o la
holo-TC II; la separación de una fracción unida al
ligando de una fracción no unida al ligando; y la medición del
contenido en la misma de la holo-TC II, o
cobalamina unida a TC II.
Por un ligando de unión específica se quiere
decir uno que se una a la TC II (i.e., la apo-TC II
y la holo-TC II) o a la holo-TCII,
en virtud de su estructura química específica o conformación, y no
simplemente en virtud de una propiedad general
físico-química (como la lipofilicidad), la cual
puede ser común a muchos componentes de una muestra de fluido
corporal. La afinidad de unión y especificidad de los ligandos
adecuados para su utilización en el método permiten preferiblemente
una concentración triple, más preferiblemente una quíntuple y, aún
más preferiblemente, una concentración de 10 veces y, más
preferiblemente aún, una concentración superior a 10 veces de la TC
II o de la holo-TC II en la muestra y, por lo tanto,
un método de este tipo es capaz de proporcionar valores precisos y
fidedignos de la holo-TC II en el rango normal
inferior de la holo-TC II, y también en el rango
por debajo de lo normal. Tal separación y concentración de moléculas
diana no es posible con los métodos actualmente existentes, los
cuales son incapaces de separar eficientemente la TC II o la
holo-TC II de la HC o de la
holo-HC. La capacidad de concentrar la TC II o la
holo-TC II al menos tres veces, permite la
utilización de equipo analítico automatizado en el ensayo de
realización. Sin una fase de concentración tal, la cantidad de
analito presente en una muestra va a ser probablemente inferior al
límite inferior de detección. Un equipo analítico automatizado de
este tipo precisa, usualmente, de entre 40 y 100 \mul de muestra
en un volumen total de, usualmente, 150 \mul o mayor, para su
funcionamiento. De esta forma, una baja concentración de analito es
diluida incluso más para el análisis. Sin embargo, utilizando el
método de ensayo de la invención, el analito es concentrado, al
menos, 3 veces. Debido a que la utilización de un equipo analítico
automatizado de este tipo implica usualmente un rango de control de
100-700 pM, con un límite inferior de sensibilidad
de alrededor de 40 pM, pero con un límite inferior práctico de
alrededor de 90 pM, una concentración quíntuple facilita la
medición de la holo-TC II hasta los 18 pM, y una
concentración de 10 veces facilita la medición hasta los 9 pM de
holo-TC II. Debido a que la presente invención
facilita una concentración mayor de 10 veces, será fácilmente
entendido por un experto en este campo hasta que punto es mejorada
la sensibilidad, convirtiéndola realmente en una técnica muy
poderosa.
La capacidad para concentrar el analito de tal
modo que sea favorable para el análisis por medio de tales
procedimientos automatizados es una ventaja importante del presente
método de ensayo.
De una muestra inicial de 600 \mul de fluido
corporal, será generado preferiblemente un volumen de hasta 150
\mul, más preferiblemente de hasta 100 \mul y, más
preferiblemente, inferior a 60 \mul, que puede ser analizado a
continuación utilizando opcionalmente procedimientos
automatizados.
Puede ser utilizado cualquier ligando de unión
específica para la TC II en el método de la invención, como un
ligando de captura, de concentración o separación, o un ligando de
detección y, dependiendo de la realización específica de la
invención, puede unirse a la TC II tanto en la forma apo como en la
holo, o puede unirse específicamente, o preferentemente, a la forma
holo. El ligando de unión a la TC II exhibirá preferiblemente un
alto grado de selectividad y especificidad hacia la TC II, y
mostrará una baja afinidad o, más preferiblemente, esencialmente no
mostrará afinidad hacia otras proteínas TC, i.e., la TC I o la III
-tanto en forma apo como en forma holo-, o hacia cualquier otra
proteína de unión a la cobalamina. Si el ligando de unión a TC II es
un ligando de unión específica para la holo-TC II
son exhibidas las mismas propiedades, con el requisito adicional de
que es mostrada una baja afinidad o, preferiblemente, ninguna
afinidad hacia la apo-TC II.
El ligando de unión para la TC II o para la
holo-TC II será, por lo general, un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo o un compuesto con una afinidad por la TC
II o por la holo-TC II, respectivamente, como un
receptor de superficie celular, un polipéptido, un oligopéptido,
una sustancia química orgánica pequeña, etc. Otros ligandos de
unión pueden ser un enlace específico seleccionado de entre una
librería de colección de fagos o de química combinatoria, o una
secuencia de unión específica de ADN o ARN.
Si el ligando de unión es un anticuerpo, éste
puede ser policlonal pero, preferiblemente, será monoclonal. Los
anticuerpos monoclonales pueden ser generados con una especificidad
y uniformidad mucho mayores que los anticuerpos policlonales, y
esto reduce la reactividad cruzada con otros componentes del fluido
corporal, en particular con otras transcobalaminas, y donde fuera
apropiado, con la conformación alternativa, i.e., la forma apo del
analito diana. La uniformidad y reproducibilidad que ofrecen los
anticuerpos monoclonales en comparación con los anticuerpos
policlonales asegura una mayor precisión, la cual es vital para un
ensayo en donde el analito se encuentra en una concentración tan
baja. Alternativamente, puede ser un fragmento de anticuerpo, por
ejemplo el fragmento F(ab), el F(ab')_{2}, o el
F(v). Los anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpo,
pueden ser monovalentes o divalentes, y pueden ser producidos por
medio de tecnología de hibridomas o pueden ser de origen sintético,
y pueden ser generados por medio de tecnología de ADN recombinante o
síntesis química. Podrían ser utilizados, por ejemplo, anticuerpos
de cadena sencilla u otros derivados de anticuerpos, o miméticos.
Si fuera preciso, el anticuerpo puede ser dirigido, o producido,
contra cualquier epítope, componente o estructura de la proteína TC
II u holo-TC II.
Anticuerpos adecuados para su utilización como
ligandos de unión en la presente invención son revelados, por
ejemplo, por Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 222:149-154; McLean et al. (1997)
Blood 89(1):235-242.
De forma similar, pueden ser utilizadas
moléculas receptoras capaces de unirse a las formas apo y holo de
la TC II, o de unirse preferentemente o específicamente a la forma
holo-TC II. Los receptores adecuados son receptores
de la TC II o de la holo-TC II unidos a la
superficie celular o a la membrana, y las propiedades de
reactividad cruzada entre especies quieren decir que pueden ser
utilizadas tales moléculas receptoras procedentes de cualquier
especie mamífera, aunque preferiblemente el origen de tales
receptores es humano o bovino. Aunque las moléculas receptoras son
aisladas preferiblemente en una forma relativamente purificada, se
contempla también la utilización de membranas celulares o de
fracciones de membrana mezcladas comprendiendo los receptores,
preferiblemente en forma concentrada. Tales receptores o membranas,
o fracciones de membrana, conteniendo los receptores, pueden ser
aislados de forma ventajosa del riñón, placenta o células tumorales.
Por lo general, no deberían ser utilizadas células depósito como
fuente de tales receptores. Sin embargo, las células depósito pueden
ser utilizadas como una fuente de receptores de haptocorrina.
Una fracción de membrana enriquecida con
receptores de la TC II puede ser obtenida conforme es descrito por
Seligman et al., J. Biol Chem
253:1766-1772 (1978) y Nexø et al.,
Biochem Biophys Act 628: 190-200 (1980).
Esencialmente, el tejido -e.g. placenta humana o hígado de conejo-
es cortado en trozos pequeños y homogeneizado en tampón tris, pH
7.4, conteniendo 0,15 M de NaCl y 10 mM de EDTA, seguido de
centrifugación a 25.000 xg durante 30 minutos. Para eliminar la
sangre residual es repetida la homogenización/centrifugado al menos
una vez. Esta fracción de membrana es extraída adicionalmente con
detergente -e.g. Ammonyx-LO, Triton
X-100 o Chapso- y clarificada por medio de
centrifugado a 100.000 xg durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante
es utilizado como fuente de receptores para la TC II.
Un ejemplo de molécula receptora adecuada que se
une preferentemente al complejo holo-TC II es la
glicoproteína de cadena sencilla de 62 kDa, la cual existe como un
homodímero no covalente y se encuentra en la superficie celular de
todos los tejidos (Rothenberg & Quadros (1996) Balliere's
Clinical Haematology 8(3) 499-514; WO
96/085150). Una proteína adicional adecuada para su utilización en
el método de ensayo de la invención es la gp300, una proteína de
membrana mediadora de endocitosis de 600 kDa, la cual es expresada
en las células epiteliales de absorción, por ejemplo, las células
del túbulo proximal renal, conforme es revelado y descrito por
Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science
93: 8612-8617). Este receptor es un receptor LDL y
se une a ambas formas, apo y holo, de la TC II.
Donde es utilizado un receptor de superficie
celular, éste puede ser inmovilizado conjugándolo con una
superficie, e.g. de una perla o lámina o, alternativamente, una
fracción de membrana celular conteniendo los receptores puede ser
conformada en vesículas o láminas que exhiben los receptores.
Donde el ligando es inmovilizado, éste puede
encontrarse, por ejemplo, sobre la superficie de un sólido, e.g.
una película o lámina de filtro, o el lumen de un tubo, sin embargo
es preferida especialmente la inmovilización sobre partículas, e.g.
microesferas, como las producidas por Dyno Industrier ASA, Noruega.
Tales partículas pueden ser porosas o no porosas y, si así se
desea, pueden ser proporcionadas con medios que las permitan ser
recolectadas, e.g. por medio de la inclusión junto con las
partículas de material que responde al magnetismo, por ejemplo,
cristales de óxido de hierro superparamagnéticos. Tales microperlas
que responden al magnetismo se encuentran disponibles en Dyno
Industrier ASA, así como en Dynal AS, Noruega, Bang Particles, USA y
Prolabo, Francia. Donde el ligando va a ser inmovilizable, en
comparación con el inmovilizado, esto puede ser conseguido
acoplando el ligando a un miembro de un par de unión específica
(e.g., biotina-estreptavidina) y utilizando al otro
miembro del par de unión -opcionalmente unido a un sustrato- para
aglomerar o inmovilizar al ligando, o a los complejos de ligando:TC
II o ligando:holo-TC II, con anterioridad a la
separación de la fracción unida al ligando de la fracción no unida
al ligando en la realización del método de la invención.
Es de sobra conocida en este campo la
inmovilización de moléculas de afinidad -e.g., anticuerpos y
fragmentos de anticuerpos- a efectos de separación, por ejemplo,
uniendo o acoplando los ligandos -opcionalmente por medio de un
ligando- a cualquiera de los soportes o matrices sólidas de sobra
conocidos, hoy en día ampliamente utilizados, o propuestos, para la
separación o inmovilización en columnas, y puede ser utilizado
cualquier método conocido en este campo. Tales fases sólidas pueden
tomar la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas,
fibras o capilares, o tiras de microtítulo, tubos o placas de
pocillos, etc. y pueden estar realizados convenientemente en
vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Las técnicas para
unir al ligando con el soporte sólido son también de sobra
conocidas y ampliamente descritas en la literatura existente.
El acoplamiento del ligando a un sustrato o a un
miembro de un par de unión específica puede ser conseguido
utilizando técnicas convencionales.
El método de la invención, si el ensayo es
realizado como un ensayo de unión competitivo, incluirá, por lo
general, la adición a la muestra de un compuesto marcado, el cual
compite por la unión con el ligando. Generalmente, se preferirá en
este sentido la utilización de holo-TC II marcada.
El marcador utilizado puede ser cualquier marcador que pueda ser
determinado directa o indirectamente, e.g., un cromóforo (cuyo
término es usado para incluir fluoróforos), un radiomarcador (por
lo general unido de forma covalente o por quelación), una enzima o
sustrato enzimático, un marcador magnético, etc.
En una realización preferida, el método de la
presente invención comprende la puesta en contacto de un ligando de
unión TC II u holo-TC II inmovilizado o
inmovilizable con la muestra bajo investigación;
la separación de una fracción unida al ligando
de una fracción no unida al ligando;
la disociación de la cobalamina unida de las
moléculas de holo-TC II en la fracción unida y la
determinación de la concentración de cobalamina liberada,
preferiblemente siendo efectuada la disociación de tal forma que la
concentración de cobalamina liberada sea, al menos, 3 veces,
preferiblemente 5 veces, e incluso más preferiblemente 10 veces
mayor que la concentración de holo-TC II en la
muestra inicial.
Lo principal de este aspecto de la invención es
la separación y concentración de la TC II o de la
holo-TC II, lo cual permite que en este método sean
utilizados provechosamente los métodos estándar para la
determinación de cobalamina. Conforme es indicado anteriormente, en
ausencia de tal fase de concentración los métodos convencionales
son inadecuados para la determinación de la cobalamina, ya que ésta
existe en una concentración tan baja. Puede ser utilizado cualquier
medio apropiado para liberar la cobalamina de la
holo-TC II, pero puede ser usado en este sentido un
calentamiento conveniente o un cambio del pH del medio circundante.
Las distintas formas de la cobalamina pueden ser transformadas en
cianocobalamina, con menor sensibilidad lumínica, por medio del
tratamiento con KCN. Puede ser utilizado en el método de la
invención cualquier medio adecuado para la determinación de
cobalamina libre, por ejemplo, un ensayo competitivo llevado a cabo
por medio de la puesta en contacto de un miembro de unión
inmovilizado para la cobalamina con la cobalamina disociada de la
muestra, en presencia del ligando marcado que compite con la
cobalamina aislada por la unión con los miembros de unión
inmovilizados. Por ejemplo, sería apropiado un método como el
descrito por Kuemmerk et al. (1992) Clin. Chem
38:2073-2077. Un medio alternativo para
determinar la cobalamina libre es descrito en la Patente US nº
5451508 y comprende una técnica de inmunoensayo.
En esta realización de la invención se prefiere
que los ligandos de unión para la TC II se encuentren inmovilizados
y unidos a ambas TC II, la holo-TC II y la
apo-TC II.
En una realización alternativa preferida, el
método de ensayo de la presente invención comprende la puesta en
contacto de un soporte sólido, que posee inmovilizado en el mismo un
ligando de unión TC II u holo-TC II, con la muestra
bajo investigación, y también con un ligando no inmovilizado,
en donde dicho ligando inmovilizado es capaz de
unirse a la TC II o a la holo-TC II, a dicho ligando
no inmovilizado o a complejos de dicha TC II u
holo-TC II y dicho ligando no inmovilizado; y dicho
ligando no inmovilizado es capaz de unirse, al menos, a uno de
dichos ligandos inmovilizados, a la TC II o a la
holo-TC II y a complejos de dicho ligando
inmovilizado y TC II u holo-TC II;
en donde si dicho método de ensayo en un ensayo
de tipo sándwich, al menos uno de dichos ligandos es específico
para la holo-TC II, y si dicho ensayo en un ensayo
competitivo, dicho ligando inmovilizado es específico para la
holo-TC II y para competidores de la misma;
por lo que la proporción de dicho ligando
inmovilizado unido por la TC II o la holo-TC II, por
dicho ligando no inmovilizado o por complejos de dicho ligando no
inmovilizado y TC II u holo-TC II, depende de la
cantidad de holo-TC II presente en dicha muestra
y,
dicho ligando no inmovilizado es capaz de
generar una señal detectable directa o indirectamente cuando se
encuentra unido o cuando no lo está;
comprende la separación de una fracción unida de
una fracción no unida; y
la determinación directa o indirecta del ligando
no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (la fracción unida) o
no unido y en la solución (la fracción no unida);
donde la puesta en contacto de la muestra y
dicho ligando no inmovilizado con el soporte sólido puede ser
realizada de forma independiente, simultáneamente o secuencialmente
y, si es realizada por separado o secuencialmente, pueden ser
puestos en contacto en cualquier orden.
Esencialmente, por lo tanto, la realización
alternativa preferida del método de la invención comprende la
determinación del ligando no inmovilizado, el cual se ha unido
directa o indirectamente, o alternativamente no ha podido unirse
directa o indirectamente, al ligando inmovilizado. Donde el ligando
no inmovilizado compite con la holo-TC II por la
unión con el ligando inmovilizado, un alto nivel de ligando no
inmovilizado no unido es indicativo de una alta concentración de
holo-TC II en la muestra, y un bajo nivel de ligando
no inmovilizado no unido es indicativo de una baja concentración de
holo-TC II en la muestra. Donde el ligando no
inmovilizado se une con la TC II o con la holo-TC
II que, a su vez, se encuentra unida al ligando inmovilizado,
entonces un alto nivel de ligando no inmovilizado unido es
indicativo de una alta concentración de holo-TC II
en la muestra, y un bajo nivel de ligando no inmovilizado unido es
indicativo de una baja concentración de holo-TC II
en la muestra.
Por lo tanto, en el método de la presente
invención el pool metabólicamente activo de cobalamina es
determinado midiendo el complejo de holo-TC II, o
midiendo la cantidad de cobalamina unida a las moléculas de TC II,
presente en una muestra corporal que contenga una mezcla tanto de
apo-TC II como de holo-TC II y de
apo-HC y holo-HC (haptocorrina o TC
I y III).
Puede ser llevada a cabo una fase preliminar de
separación, utilizando cobalamina inmovilizada, o un análogo o
fragmento de la misma, que selectivamente se una a las formas apo
tanto de la TC II como de la haptocorrina (HC). En tal fase
preliminar, las formas apo de las proteínas de TC II y de HC son
unidas por medio de la cobalamina inmovilizada, el análogo o el
fragmento de la misma, y son separadas de los complejos
holo-TC II y
holo-HC.
holo-HC.
En este caso, el análisis de las formas holo
separadas de la TC II tiene lugar entonces conforme a cualquier
realización de la invención, según es descrito anteriormente, pero
claramente es más útil donde la determinación del complejo de
holo-TC II tiene lugar por un método distinto del de
disociación del complejo y posterior determinación de la cobalamina
liberada. Será evidente para un experto en este campo que si tal
fase preliminar precede a la realización alternativa preferida
anteriormente indicada, el requisito de que al menos un ligando en
un ensayo de tipo sándwich sea específico para la
holo-TC II y no para la TC II, y el requisito de que
el ligando inmovilizado en un ensayo competitivo sea específico
para la holo-TC II y competidores de la misma y no
para la TC II ya no son relevantes, ya que la forma apo de la TC II
ha sido capturada y ya no se encuentra disponible. De esta forma,
los ligandos inmovilizados o no inmovilizados pueden ser específicos
para la holo-TC II o la TC II, o para competidores
de las mismas.
La cobalamina inmovilizada no debería exhibir
ninguna tendencia significativa a ser disociada de su soporte, ya
que esto podría dar como resultado la unión a la
apo-TC II y la transformación de la misma en
holo-TC II. La cobalamina biotinilada se une de una
manera muy estable a una superficie sólida con
avidina-estreptavidina unida a la misma, siendo
conveniente para la realización de esta fase el trabar de esta forma
la cobalamina a un soporte. De hecho, cuando es utilizada la
cobalamina biotinilada, ésta puede ser añadida a la muestra bajo
análisis en una forma no inmovilizada, donde se une a las formas apo
de la TCII y de la HC. A continuación, la muestra puede ser puesta
en contacto con una superficie sólida poseyendo un compañero ligando
para la biotina, por ejemplo, la avidina, inmovilizada sobre la
misma. Entonces se forma un complejo de
avidina-cobalamina biotinilada-TC
II, el cual puede ser aislado fácilmente de la muestra.
En una realización de la invención en donde ha
tenido lugar esta fase preliminar de separación, el pool de
holo-TC II es determinado seguidamente por medio de
la puesta en contacto de la muestra con un ligando TC II
inmovilizado, el cual captura el complejo de holo-TC
II dejando a la haptocorrina en la solución y, a continuación,
poniendo en contacto a la holo-TC II inmovilizada
con un segundo ligando TC II, el cual se encuentra marcado y, de
esta forma, es detectable. Ejemplos de ligandos de unión TC II
adecuados serían anticuerpos monoclonales sin superposición, o
incluso un anticuerpo policlonal específico para la TC II sería
adecuado en esta realización, tanto para la captura como para la
detección, ya que son reconocidos diferentes epítopes en las
moléculas de TC II.
En otra realización de la invención en donde ha
tenido lugar esta fase preliminar de separación, las moléculas de
holo-TC II compiten por consiguiente con el ligando
no inmovilizado marcado por la unión con el ligando inmovilizado, y
la cantidad de holo-TC II es calculada en relación
con la cantidad de ligando no inmovilizado marcado unido o no unido
al ligando inmovilizado.
En una realización preferida, en la fase de
separación preliminar, la unión de la apo TC II y de la apo HC a la
cobalamina, a análogos o a fragmentos de la misma tiene lugar en un
sitio, o de una manera tal, que inhibe el reconocimiento y la unión
ulteriores de la TC II unida a la cobalamina inmovilizada por medio
del ligando no inmovilizado, o la unión al compañero para la TC II.
En esta realización no hay necesidad de aislar con anterioridad a
la realización del ensayo de la invención la holo-TC
II y la holo-HC de las formas apo unidas. En esta
realización es muy importante el sitio contra el que es dirigido el
compañero o ligando de unión no inmovilizado, y debería ser un
epítope de TC II, el cual se encuentra enmascarado o protegido, o es
inasequible para la unión cuando la apo TC II y la
apo-HC se inmovilizan sobre la cobalamina, el
análogo o el fragmento de la misma.
Tanto si la fase de separación inicial implica
la utilización de un ligando de unión para la TC II, como si es
precedida por una fase preliminar utilizando cobalamina
inmovilizada, análogos o fragmentos de la misma, la separación
total, i.e., la separación de la muestra de todas las proteínas apo
y holo TC II no es un requisito del método, y es suficiente con que
sea separada de la muestra una fracción que comprenda, al menos, una
parte deseada del "subconjunto TC II de proteínas".
De esta forma, en ciertas realizaciones los
compañeros de unión o ligandos y las condiciones de unión pueden
ser seleccionados de tal forma que consigan la separación de
sustancialmente todo el "subconjunto" seleccionado. En este
caso la fracción no unida puede ser considerada como sustancialmente
libre de proteínas TC II u holo-TC II, i.e.,
estando libre al menos un 80%, un 90% o un 95% de TC II o de
holo-TC II, dependiendo de qué componente sea
seleccionado como la base del fraccionamiento.
En realizaciones alternativas, el compañero y
las condiciones de unión pueden ser seleccionados de tal modo que
únicamente una parte de las proteínas TC II en la muestra es
separada en una fracción. En este caso, debe tenerse en cuenta la
separación parcial a la hora de construir una curva de calibración
estándar para el ensayo. En este sentido, la generación de una
curva de calibración estándar contra la que pueda ser determinada la
concentración de holo-TC II detectada utiliza
técnicas estándar de sobra conocidas en este campo.
De esta forma, si en una fase de fraccionamiento
es utilizado un ligando de unión TC II, al menos una parte de la
cobalamina unida a TC II será localizada en la fracción unida y
cualquier cobalamina en la muestra unida a moléculas distintas de
la TC II, por ejemplo, HC o albúmina, se encontrará en la fracción
no unida (i.e., fracción o fracciones no separadas). La TC II en la
fracción unida puede encontrarse tanto en forma apo como en forma
holo, y puede encontrarse formando un complejo con sustancias
similares a la cobalamina o análogos, además de la cobalamina.
Si así se desea, el método de la invención puede
incluir una fase de separación preliminar adicional, en la cual la
muestra es puesta en contacto con un ligando de unión específica,
inmovilizado o inmovilizable, para la haptocorrina (en formas apo y
holo, o únicamente en forma holo). De esta manera, puede verse
reducida cualquier contribución a error en la determinación de la
cobalamina unida a TC II que derive de la holo-HC, y
pueden ser utilizados ligandos de unión específica para la TC II o
para la holo-TC II, los cuales presentan cierta
afinidad de unión por las haptocorrinas.
Por otra parte, conforme es indicado con
anterioridad, debido a que la concentración en suero de la TC II,
tanto en forma apo como en forma holo, es muy baja, para llevar a
cabo la invención son necesarios ligandos o compañeros de unión con
una especificidad y afinidad particularmente altas. Asimismo, las
constantes de afinidad requeridas a los ligandos de la presente
invención dependen de si el ligando es específico para la TC II o
para la holo-TC II, y también de su utilización,
bien como un ligando de captura o de detección, ya que la
concentración en suero de la TC II es de alrededor de
0,5-1 nM, pero la concentración de la
holo-TC II es únicamente de 35-160
pM. De esta manera, para un ligando de captura de TC II es deseable
una constante de afinidad de, al menos, 10^{9}M^{-1},
preferiblemente superior a 2x10^{9}M^{-1} y, más
preferiblemente, 10^{10}M^{-1}. Para un ligando de captura de
holo-TC II es deseable una constante de afinidad de,
al menos, 10^{10}M^{-1}, preferiblemente de
2x10^{10}M^{-1}, más preferiblemente superior a
2x10^{10}M^{-1} y, más preferiblemente, superior a
10^{11}M^{-1}. Es claro que la constante de afinidad requerida
para un ligando de detección puede ser inferior que la requerida
para un ligando de captura, debido al efecto de concentración del
ensayo.
El grado de reactividad cruzada de un ligando de
unión holo-TC II o TC II con la HC debería ser,
preferiblemente, inferior al 1%, más preferiblemente entre el 0,1%
y el 1% y, más preferiblemente, inferior al 0,1%. De forma similar,
un ligando de unión holo-TC II no debería exhibir
preferiblemente un grado de reactividad cruzada con la
apo-TC II superior al 1%, más preferiblemente entre
el 0,1% y el 1% y, más preferiblemente, la reactividad cruzada
debería ser inferior al 0,1%.
Al utilizar tales ligandos de alta afinidad su
función se extiende más allá de la de ser simplemente ligandos de
captura y/o detección, y juegan un papel vital a la hora de ser
capaces de separar y concentrar la proteína TC II de la muestra
para análisis. Los ligandos de unión para TC II u
holo-TC II deberían preferiblemente concentrar el
ligando al menos 3 veces, más preferiblemente 5 veces e, incluso más
preferiblemente, al menos 10 veces.
En una realización adicional de la técnica de
ensayo, más afín a un ensayo de desplazamiento que a un ensayo
competitivo, la muestra comprendiendo el complejo
holo-TC II es puesta con contacto con una fase
sólida, a la cual se encuentra unido un ligando marcado
reconociendo los mismos sitios de unión sobre los ligandos
inmovilizados que la holo-TC II. La
holo-TC II en la muestra compite con el ligando
marcado unido por los sitios, de tal forma que, después del
equilibrado del sistema, existe una relación directamente
proporcional entre la cantidad de ligando marcado desplazado del
soporte sólido y detectable en la solución, y la cantidad de
holo-TC II presente en la muestra original. El
ligando marcado puede ser detectado directa o indirectamente, y
puede ser determinado como la cantidad de ligando marcado unido o
no unido al soporte sólido, conforme sea adecuado. En efecto, en
esta realización el ligando no inmovilizado, referido anteriormente,
se encuentra unido al ligando inmovilizado antes de la aplicación
de la muestra, pero
el significado de tal unión no debe ser interpretado como que el ligando se encuentra de alguna forma inmovilizado.
el significado de tal unión no debe ser interpretado como que el ligando se encuentra de alguna forma inmovilizado.
Otra realización preferida adicional comprende
la puesta en contacto de una muestra conteniendo
holo-TC II con un soporte sólido poseyendo
holo-TC II inmovilizada sobre el mismo y un ligando
específico de holo-TC II no inmovilizado marcado.
La holo-TC II libre en la muestra y la
holo-TC II inmovilizada compiten por la unión con
el ligando no inmovilizado marcado, y la determinación del ligando
marcado unido a la fase sólida, o que permanece en la solución,
permite el cálculo de la concentración de holo-TC
II. En una realización especialmente preferida de la presente
invención, el ligando de unión holo-TC II no
inmovilizado marcado es un anticuerpo.
En otra realización más, la muestra
comprendiendo el analito de interés es puesta en contacto con la
holo-TC II marcada y con el ligando inmovilizado.
La holo-TC II marcada y sin marcar compiten por la
unión con el ligando inmovilizado y, después de que es alcanzado el
equilibrio, la cantidad de holo-TC II marcada unida
al ligando inmovilizado es indirectamente proporcional a la cantidad
de holo-TC II en la muestra de interés. De nuevo,
la holo-TC II marcada puede ser detectada directa o
indirectamente, y puede ser determinada como la cantidad de
holo-TC II marcada unida o no unida al soporte
sólido, conforme sea adecuado.
En una realización adicional de la presente
invención, un ligando no inmovilizado, pero inmovilizable,
específico para el complejo holo-TC II (e.g., un
ligando conjugado con biotina u otro miembro de un par de unión
específica) es puesto en contacto con la muestra para formar un
complejo de holo-TC II/ ligando no inmovilizado.
Entonces, el complejo de ligando/holo-TC II puede
ser precipitado de la solución utilizando métodos conocidos, y
puede ser aislado para análisis.
En otra realización más de la invención son
añadidos a la muestra dos compañeros de unión marcados,
opcionalmente después de una fase preliminar como la de eliminación
en la muestra de formas apo de la TC II y de la HC. Por
consiguiente, los compañeros de unión en este caso son la
holo-TC II marcada, o un análogo o fragmento de la
misma, y un compañero de unión marcado, por ejemplo un anticuerpo
marcado. En esta realización una señal detectable es generada
únicamente por los marcadores cuando se encuentran cercanos entre
sí, i.e., cuando los dos compañeros de unión marcados se unen entre
sí. De esta manera, al añadirlo a la muestra, el compañero de unión
marcado para la holo-TC II puede unirse tanto a la
holo-TC II no marcada presente en la muestra -en
cuyo caso no es generada una señal detectable-, como a una
holo-TC II marcada, o análogo, fragmento o variante
de la misma que se una al compañero de unión de la TC II marcada, en
cuyo caso es generada una señal detectable. Los agentes marcadores,
tales como los de los ensayos de escintilación por proximidad de
Amersham, conforme es descrito en la Patente US nº 4568649, son
adecuados para su incorporación en una realización de este tipo, y
la alta sensibilidad de este procedimiento es muy adecuada para un
ensayo en donde el analito existe en una concentración tan baja. De
este modo, por ejemplo, un miembro del par de unión podría ser
marcado con un núclido emisor \beta, como el I^{125} o el
H^{3}, y el otro miembro es marcado con una molécula escintilar
adecuada. La partícula \beta emitida pierde su energía en su
entorno acuoso, a menos que el escintileo se encuentre dentro de
los 1,5 \mum y, de esta forma, precisa que ambos compañeros
marcados se encuentren unidos entre sí para que una señal sea
detectable. La probabilidad de que dos compañeros marcados se unan
entre sí es determinada por la concentración de
holo-TC II presente en la muestra, de tal modo que
cuanto mayor sea la señal generada, menor es la concentración de
holo-TC II en la muestra.
Conforme es utilizado aquí, el término
"determinando" o "evaluando" incluye tanto la
cuantificación en el sentido de obtención de un valor absoluto para
la cantidad o concentración de cobalamina unida a
holo-TC II o a TC II en la muestra, como también
valoraciones o determinaciones semicuantitativas y cualitativas.
Puede ser obtenido un índice, proporción, porcentaje o indicación
similar del nivel o cantidad de cobalamina unida a TC II en
relación, por ejemplo, con la cobalamina total.
La muestra corporal utilizada en el método de
ensayo de la invención puede ser cualquier muestra que contenga
cobalamina, e.g., una muestra de fluido o tejido corporal, o una
suspensión, etc. Sin embargo, la muestra será preferiblemente un
fluido corporal, por ejemplo, fluido seminal, fluido cerebroespinal
o fluido amniótico, pero por lo general será una muestra procedente
de la sangre. Cuando es este el caso, como la muestra utilizada
para análisis se encuentra preferiblemente libre de células, pueden
ser utilizados tanto el suero como el plasma. La muestra puede ser
tratada con anterioridad a su utilización en el método de ensayo de
la invención, por ejemplo, puede ser diluida añadiendo un tampón u
otro medio acuoso, y puede ser almacenada o preservada -por
ejemplo, enfriándola o congelándola- previamente al análisis.
En la práctica de la invención, donde una
fracción unida es separada de una fracción no unida, esto puede ser
llevado a cabo por medio de cualquier método adecuado, por ejemplo,
métodos de precipitación, centrifugado, filtrado, cromatográficos,
etc.
Para evitar dudas, el término "cobalamina"
es utilizado aquí como sinónimo de "vitamina B_{12}" e
incluye todas las formas de la vitamina B_{12} (cianocobalamina;
5-6-dimetil-benzimidazolil
cianocobamida; metilcobalamina;
5'-desoxiadenosilcobalamina) que puedan tener lugar
y que sean metabólicamente activas (cuando se encuentran presentes
adecuadamente) en el cuerpo.
Conforme es indicado con anterioridad, en el
método de la invención la determinación de la cobalamina unida a TC
puede ser llevada a cabo por medio de la detección de un ligando
unido a la holo-TC II separada, o realizando un
ensayo competitivo utilizando un competidor marcado para la
holo-TC II, por medio del cual la
holo-TC II compite con el competidor marcado por la
unión a un ligando de unión, o detectando la cobalamina liberada de
la holo-TC II separada.
El ligando detectable puede ser marcado
convenientemente por medio de cualquier método convencional, por
ejemplo, con un marcador formador de señal, el cual puede ser
determinado, e.g., por medio de luminiscencia, quimioluminiscencia,
ensayo colorimétrico, fluorescencia, radioactividad o por actividad
enzimática. En efecto, puede ser utilizado en el método de la
invención cualquier marcador formador de señal conocido en este
campo.
Únicamente a modo de ejemplo, algunos ejemplos
adecuados de compuestos coloreados o fluorescentes que pueden ser
utilizados para marcar un ligando de unión detectablemente en la
presente invención son las antraquinonas, los tintes azo, los
tintes de azina -tales como las oxacinas y tiazinas-, las triazinas,
los pigmentos naturales -tales como las porfirinas-, las
ficobiliproteínas -incluyendo las ficoeritrinas y las ficocianinas-,
las clorofilas y sus análogos y derivados, los carotenoides, las
acrinidinas, los xantenos -incluyendo las fluoresceínas y
las rodaminas-, los tintes índigo, los tioxantenos, las coumarinas,
los polimetinos, incluyendo los di- y
tri-arilmetinos y derivados de los mismos de
ftalocianinas y ftalocianinas metálicas.
De forma similar, puede ser utilizada una amplia
gama de compuestos radioactivos como la parte marcadora formadora
de señal del reactivo utilizado en esta invención, entre ellos los
compuestos marcados con Iodina-125.
Alternativamente, los ligandos de unión pueden
ser conjugados con compuestos naturales o sintéticos, los cuales
pueden producir una señal quimioluminiscente que puede ser sometida
a ensayo de manera conocida (Cormier, M.J. et al.;
Chemiluminiscence and Bioluminiscence, Plenum Press, New York 1973).
Compuestos quimioluminiscentes adecuados incluyen la luciferina,
los ésteres oxálicos, el 1,2-dioxetano, el luminol o
derivados del mismo, aunque no están limitados a estos compuestos.
Si es apropiado, pueden ser utilizados el peróxido de hidrógeno,
enzimas (e.g. la luciferasa) u otras sustancias químicas con el fin
de producir la señal quimioluminiscente en las moléculas productoras
de señal utilizadas.
Las moléculas formadoras de señal fuertemente
aniónicas no son preferidas para su utilización en el método de la
invención, debido a que poseen una tendencia a unirse con proteínas
séricas, tales como la albúmina sérica humana (HSA), la cual puede
encontrarse presente en la muestra. Ejemplos particularmente
adecuados que pueden ser utilizados son el isotiocianato de
fluoresceína, la Rodamina B o el
N-(resorufin-4-carbonil)piperidina-4-ácido
carboxílico-N-hidroxisuccinimida-éster)
o resos.
Conforme a una realización del método de la
invención una fracción comprendiendo, al menos, una parte de la TC
II puede ser separada de una muestra de fluido corporal al hacer
reaccionar el fluido corporal con un ligando de unión específica
para la TC II y, a continuación, separando la fracción unida a TC II
del resto de la muestra, aislando y concentrando de esta forma el
analito diana en la misma. En una realización de la invención puede
ser utilizado un ligando de unión detectable dirigido contra la
holo-TC II, con el fin de determinar el complejo de
TC II-cobalamina presente en la fracción unida
separada. El ligando de unión de la holo-TC II puede
ser puesto en contacto con la muestra bajo investigación con
anterioridad, simultáneamente o después de ponerlo en contacto con
el ligando de unión TC II, y antes o después de la separación de la
fracción unida a TC II del resto de la muestra.
Igualmente, una fracción conteniendo cobalamina
(e.g., comprendiendo holo-TC II y
holo-HC) puede ser separada del resto de la muestra
al hacer reaccionar el fluido corporal objeto de la investigación
con una cobalamina inmovilizada o sujeta, o con un análogo o
fragmento de la misma que se una a la apo-TC II y la
apo-HC, y separando de la fracción unida el resto
de la muestra, la cual comprende holo-TC II y
holo-HC. Entonces puede ser utilizado un ligando de
unión TC II detectable con el fin de detectar el complejo de TC
II-cobalamina presente en la fracción separada. El
ligando de unión TC II detectable puede ser puesto en contacto con
la muestra bajo estudio con anterioridad, simultáneamente o después
de la puesta en contacto con la cobalamina unida, y antes o después
de la separación de la fracción unida del resto de la muestra.
En algunas realizaciones los ligandos
inmovilizados para uno u otro componente de los complejos apo y/u
holo TC II/HC pueden ser colocados en una columna. El fluido
corporal conteniendo el complejo de cobalamina TC II puede ser
aplicado a la columna y puesto en contacto con el(los)
ligando(s) de unión.
Puede ser pasado un chorro de agua por la
columna o puede ser lavada, y puede ser utilizado un eluyente para
permitir, si fuera necesario, la liberación de la columna de una
fracción unida y facilitar su recogida. Si los contenidos de la
fracción no unida son analizados, o han de serlo también, en
relación con otros constituyentes, la columna debe ser lavada con
un tampón o medio administrado utilizando una micropipeta calibrada,
con el fin de asegurar que es administrado y recogido un volumen
conocido preciso. El volumen administrado es preferiblemente un 3%
del volumen deseado (i.e., calibración), más preferiblemente un 1 o
2%. Asimismo, si la fracción a ser analizada va a ser liberada de
la columna con anterioridad a la detección, el eluyente utilizado
para liberar el complejo debe ser administrado utilizando una
micropipeta calibrada.
En una realización alternativa los ligandos de
unión utilizados para separar una fracción de una muestra pueden
ser inmovilizados sobre un soporte de fase sólida particulado, por
ejemplo látex o perlas poliméricas. Con el fin de ayudar en la
manipulación y separación, pueden ser utilizadas perlas magnéticas
y, en efecto, ésta es una realización preferida de la presente
invención. El término "magnético", conforme es utilizado aquí,
significa que el soporte es capaz de exhibir un momento magnético
impartido cuando es colocado en un campo magnético. En otras
palabras, un soporte comprendiendo partículas magnéticas puede ser
retirado fácilmente por medio de agregación magnética, lo cual
proporciona una forma rápida, simple y eficiente de separar las
fracciones después de la unión a ligando.
De esta manera, utilizando el método de la
invención, las partículas magnéticas con el complejo de TC
II-cobalamina unido a las mismas pueden ser
retiradas a una superficie adecuada por medio de la aplicación de un
campo magnético, por ejemplo, utilizando un magneto permanente.
Usualmente es suficiente con aplicar un magneto al lateral del
recipiente conteniendo la mezcla de la muestra para hacer que las
partículas se agrupen en la pared del recipiente y, de esta forma,
aislarlas para un análisis adicional.
Son especialmente preferidas las partículas
superparamagnéticas, por ejemplo las descritas por Sintef en
EP-A-106873, ya que pueden ser
evitados la agregación magnética y el agrupamiento de las partículas
durante la reacción. Pueden ser especialmente adecuadas para su
utilización en la presente invención las conocidas perlas magnéticas
fabricadas por Bang Particles (US).
En general, además de la muestra bajo
evaluación, a la hora de realizar el método de ensayo de la
invención serán evaluadas también muestras de calibración con
contenido conocido de complejo holo-TC II. Tales
determinaciones pueden ser utilizadas para construir una curva de
calibración, de la cual puede ser determinado el contenido de
cobalamina unida a TC II de la muestra objeto de la investigación.
Pueden variar la naturaleza de las muestras de calibración y la
selección de los factores de conversión o ajuste utilizados para la
determinación del complejo holo-TC II, dependiendo,
por ejemplo, de los ligandos en particular utilizados en las fases
de unión y separación del ensayo y de otros aspectos del método,
los cuales afectan la unión y separación de la muestra, por
ejemplo, la composición del tampón, las condiciones del ensayo, etc.
Usualmente, serán utilizadas muestras de calibración con contenidos
de holo-TC II de 0 a 300 pmol/l. El rango de
referencia dentro del cual se hallará por lo general el valor de la
cobalamina unida a TC II es de 30 a 160 pmol/l.
El estándar de calibración de
holo-TC II puede ser usualmente
holo-TC II humana, nativa o recombinante. Es nueva
la utilización de la holo-TC II como un calibrador
en los ensayos de holo-TC II, y forma un aspecto
adicional de la invención.
Visto desde un aspecto adicional, la invención
proporciona un kit para un ensayo diagnóstico conforme a la
invención, comprendiendo dicho kit:
un ligando de unión específica inmovilizado o
inmovilizable para la TC II o la holo-TC II;
preferiblemente una solución
holo-TC II con una concentración conocida y, más
preferiblemente, un grupo de tales soluciones poseyendo un rango de
concentraciones del complejo de holo-TC II;
opcionalmente, un agente liberador para liberar
la cobalamina de la holo-TC II; y
opcionalmente, un ligando marcado.
El método de ensayo de la invención determina el
pool metabólicamente activo de la cobalamina por medio de la
determinación del complejo holo-TC II o aislando el
complejo holo-TC II y, a continuación, determinando
la cobalamina asociada al mismo y, de esta forma, proporciona un
método conveniente para la determinación de la deficiencia de
cobalamina antes o después del comienzo de las manifestaciones
clínicas de la deficiendia de cobalamina. El método del ensayo
puede ser utilizado de forma ventajosa con anterioridad al comienzo
de los síntomas, ya que posee un valor predictivo seguro del
balance negativo de cobalamina.
La presente invención será ilustrada a
continuación por medio de los siguientes Ejemplos no limitadores y
los dibujos que los acompañan, en los cuales:
La Figura 1 es una curva estándar para la
holo-TC II;
La Figura 2 es un gráfico mostrando la relación
entre la cobalamina sérica total y la concentración de
holo-TC II; y
La Figura 3 es un gráfico mostrando la relación
entre la cobalamina sérica total y la concentración de
holo-HC.
Anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales o
policlonales) específicos para la TC II son inmovilizados sobre
partículas magnetizables. Se permite que reaccione durante 15
minutos una parte alícuota de suero (100-500
\mul) mezclada con un volumen igual de PBS, con un exceso de
anticuerpo inmovilizado y un exceso de anticuerpo
anti-holo-TC II sin solapamiento
(e.g., un anticuerpo monoclonal) radiomarcado con I^{125}. Las
partículas magnetizables son sedimentadas utilizando un magneto
fuerte, el sobrenadante es retirado y las partículas son lavadas con
PBS.
Es medida la radioactividad y es determinada la
concentración de holo-TC II en la muestra por medio
de interpolación en una curva estándar.
Son inmovilizados sobre partículas magnetizables
anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales o policlonales)
específicos para la TC II. Se permite que reaccione con el
anticuerpo durante 30 minutos una parte alícuota de suero (600
\mul) mezclada con un volumen igual de PBS. Las partículas
magnetizables son sedimentadas utilizando un magneto fuerte y el
sobrenadante es retirado. Las partículas son lavadas una vez con PBS
y, seguidamente, son tratadas con hidróxido de sodio (0,3 M)
conteniendo cianuro de potasio (100 \muM), ditiotreitol (15 mM) y
una cantidad fija de cianocobalamina radiomarcada con I^{125} o
Co^{57} en un volumen total de 100 \mul durante 15 minutos, con
el fin de liberar la cobalamina unida a la holo-TC
II inmovilizada y, al mismo tiempo, convertir todas las formas de
cobalamina en cianocobalamina, y mezclarlas con una cantidad fija
de cianocobalamina marcada. Es añadida una cantidad limitada de
Factor Intrínseco en 100 \mul de tampón de borato y se permite
que reaccione durante 10 minutos. Las partículas magnetizables son
sedimentadas por un magneto fuerte y son retiradas 150 \muL del
sobrenadante para medir la radioactividad. Es determinada la
concentración de cobalamina unida a TC II en la muestra de suero a
partir de una curva estándar.
Alternativamente, la cobalamina liberada puede
ser medida utilizando el método de Abbot IMx o métodos
similares.
Anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales o
policlonales) específicos para la holo-TC II son
inmovilizados sobre partículas magnetizables. A una parte alícuota
de suero (100-500 \mul) mezclada con un volumen
igual de PBS es añadida una cantidad fija de holo-TC
II marcada con I^{125} y una cantidad limitada del anticuerpo
anti-holo-TC II inmovilizado.
Después de su incubación durante 15 minutos, las partículas
magnetizables son sedimentadas utilizando un magneto fuerte. Las
partículas son lavadas con PBS y es medida la radioactividad. Es
determinada la concentración de holo-TC II por medio
de una curva estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Es inmovilizada sobre partículas magnetizables
holo-TC II recombinante. A una parte alícuota de
suero (100-500 \mul) mezclada con un volumen
igual de PBS es añadida una cantidad fija de holo-TC
II inmovilizada y un exceso de un anticuerpo (e.g., un anticuerpo
monoclonal o policlonal) específico para la holo-TC
II y radiomarcado con I^{125}. Después de su incubación durante
15 minutos, las partículas son sedimentadas utilizando un magneto
fuerte. Las partículas son lavadas con PBS y es medida la
radioactividad. Es determinada la concentración de
holo-TC II por medio de una curva estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
A una parte alícuota de suero
(100-500 \mul) es añadido un exceso de cobalamina
biotinilada, con el fin de unir toda la apo-TC II y
la apo-HC. Después de su incubación durante 10
minutos, la muestra de suero es tratada con partículas magnéticas
recubiertas de avidina durante 10 minutos. Las partículas son
sedimentadas utilizando un magneto fuerte. Es recuperado el
sobrenadante y mezclado con dos anticuerpos anti-TC
II monoclonales sin solapamiento, uno radiomarcado con I^{125} y
el otro con biotina conjugada. Después de 10 minutos son añadidas
las partículas magnetizables recubiertas con avidina y se permite
que se unan a los aductos biotinilados durante 10 minutos.
Seguidamente, las partículas son sedimentadas utilizando un magneto
fuerte y son lavadas con PBS. La radioactividad es medida y es
determinada la concentración de holo-TC II por medio
de interpolación en una curva estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo mismo que en el Ejemplo 5, pero el suero al
que se le ha eliminado la apo-TC II es mezclado con
una cantidad fija de holo-TC II marcada con
I^{125} y con una cantidad limitada de anticuerpo
anti-TC II inmovilizado sobre partículas
magnetizables. Después de su incubación durante 15 minutos, las
partículas son sedimentadas utilizando un magneto fuerte.
Las partículas son lavadas con PBS y es medida
la radioactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Es inmovilizada cobalamina sobre microesferas
magnetizables, e.g. por medio de acoplamiento covalente o utilizando
acoplamiento de biotin(estrept)avidina. Usualmente,
las microesferas magnetizables recubiertas con estreptavidina son
incubadas con 1 \muM de cobalamina biotinilada durante 30 minutos
a temperatura ambiente y en oscuridad. Las perlas son sedimentadas
utilizando un magneto, son lavadas dos veces con PBS y resuspendidas
en PBS al 1% + 5 mg/mL de HSA. A una parte alícuota de suero
(100-500 \mul) es añadido el mismo volumen de PBS
y 1/10 en volumen de microesferas magnetizables recubiertas de
cobalamina. La mezcla es incubada durante 30 minutos a temperatura
ambiente, en la oscuridad, con el fin de unir toda la
apo-TC II y la apo-HC. Las
partículas son sedimentadas por medio de un magneto y el
sobrenadante es recuperado y mezclado con dos anticuerpos
anti-TC II humana monoclonales sin solapamiento,
uno radiomarcado con I^{125} y el otro con conjugado con biotina.
Después de 10 minutos son añadidas las microesferas magnetizables
recubiertas con (estrept)avidina, y se permite que se unan a
los aductos biotinilados durante 10 minutos. Seguidamente, las
partículas son sedimentadas utilizando un magneto y lavadas con
PBS. Es medida la radioactividad y es determinada la concentración
de holo-TC II por medio de interpolación en una
curva
estándar.
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo mismo que en el Ejemplo 7, pero el exceso de
cobalamina biotinilada es añadido directamente a la muestra de
suero + PBS, de tal forma que se una toda la apo-TC
II y la apo-HC. Después de su incubación durante 10
minutos, la muestra de suero es tratada con microesferas
magnetizables recubiertas de (estrept)avidina durante 30
minutos, a temperatura ambiente, en oscuridad.
\newpage
Anticuerpo de conejo específico para la TC II
humana y con una constante de unión aparente >5x10^{9}
M^{-1} fue inmovilizado sobre microesferas magnetizables de 1
\mum recubiertas con anticuerpo de
cabra-anticonejo IgG (Indica Diagnostics). Fueron
mezcladas muestras de suero, cada una de ellas de 400 \muL,
procedentes de 49 voluntarios sanos con un volumen igual de PBS y
40 \muL del anticuerpo inmovilizado (1%). Las mezclas se
mantuvieron a temperatura ambiente, en oscuridad, durante 1 hora y,
a continuación, las microesferas fueron sedimentadas utilizando un
magneto. Los precipitados fueron lavados una vez con tampón de
lavado helado (PBS más 0,02% Tween 20) y, seguidamente,
resuspendidos en 50 \muL 50 mM de ditiotreitol, 0,001% de cianuro
de potasio y una cantidad fija de
57Co-CN-cobalamina (Amersham) en
tampón de fosfato, pH 7.5. Ser permitió que reposara durante 30
minutos a temperatura ambiente, después de lo cual fueron añadidas
25 \muL 0,5M de hidróxido de sodio y, 15 minutos más tarde, 300
\muL de Factor Intrínseco inmovilizado en Dextran (suficiente
para unir al 50% del trazador) en tampón de borato, pH 8.6. Después
de 1 hora a temperatura ambiente, en oscuridad, las muestras fueron
centrifugadas a 1000g y a 4ºC durante 10 minutos, los sobrenadantes
fueron retirados cuidadosamente, y los pelets fueron contados en un
Packard Riastar. Fue determinada la concentración de cobalamina
unida a TC II tomando una curva estándar construida con 8
calibradores (0-500 pM de holo-TC
II) tratados idénticamente que las muestras. 37 muestras de suero
fueron analizadas también para determinar la cobalamina sérica
total, utilizando el ensayo de Abbot IMx B12.
La curva estándar para la
holo-TC II es mostrada en la Figura 1 y la relación
entre las concentraciones de cobalamina sérica total y de
holo-TC II en 37 voluntarios sanos es ilustrada en
la Figura 2. Es evidente que la correlación es baja, con r^{2} =
0,50. En comparación, la correlación entre la
holo-HC y la cobalamina sérica total es alta,
r^{2} = 0,96 (Fig. 3). El promedio de concentración de
holo-TC para los 49 voluntarios sanos fue de
64\pm28 pM y el rango de referencia del 95% fue
23-127 pM.
El ensayo posee un CV del 10%, una sensibilidad
analítica (0-calibrador - 3 s.d.) por debajo de 10
pM y no presenta reactividad cruzada con la haptocorrina.
Claims (16)
1. Un método de ensayo para la determinación de
la holo-transcobalamina II en una muestra libre de
células de un fluido corporal, comprendiendo la puesta en contacto
de dicha muestra con un ligando de unión específica para la
Transcobalamina II o la holo-Transcobalamina II,
mostrando una reactividad cruzada con la Haptocorrina inferior al
1%, inmovilizada sobre partículas magnetizables, separando una
fracción unida al ligando de una fracción no unida al ligando por
medio de la aplicación de un campo magnético y midiendo el contenido
de holo-Transcobalamina II en dicha fracción unida
al ligando, en donde la separación de dicha fracción unida al
ligando de dicha fracción no unida a ligando proporciona un
incremento en la concentración de
holo-Transcobalamina II de, al menos, 3 veces y, en
donde dicho ligando de unión específica posee una constante de
afinidad de, al menos, 10^{9}M^{-1} en el caso de un ligando de
unión específica para la Transcobalamina II, y de al menos
10^{10}M^{-1} en el caso de un ligando de unión específica para
la holo-Transcobalamina II.
2. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en la reivindicación 1, en donde dicho ensayo es capaz de detectar
la holo-Transcobalamina II en una concentración tan
baja como 9 pM.
3. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en donde dicho
ligando de unión específica exhibe un alto grado de selectividad y
especificidad hacia la Transcobalamina II y muestra una baja
afinidad hacia otras proteínas de la Transcobalamina, tanto en forma
apo como en forma holo, o hacia cualquier otra proteína de unión a
la cobalamina.
4. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde dicho
ligando de unión específica es seleccionado de entre el grupo
consistente en un anticuerpo policlonal o monoclonal, un fragmento
de anticuerpo, un polipéptido, un oligopéptido, una sustancia
química orgánica pequeña, una secuencia de ADN o de ARN específica
de unión, o un receptor de la superficie celular.
5. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde dicho
ligando de unión específica es un anticuerpo monoclonal que se une a
la Transcobalamina II.
6. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde dicha
cobalamina es liberada de las moléculas de
holo-Transcobalamina II por medio de un cambio en la
temperatura o en el pH del medio circundante.
7. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en donde dicha
cobalamina liberada es determinada a través de un ensayo de unión
competitivo realizado por medio de la puesta en contacto de un
compañero de unión inmovilizado para la cobalamina con la cobalamina
disociada de la muestra, en presencia del ligando marcado, el cual
compite con la cobalamina aislada por la unión con el compañero de
unión inmovilizado.
8. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en la reivindicación 7, en donde dicho ligando marcado es marcado
con un marcador formador de señal, el cual puede ser determinado por
luminiscencia, quimioluminiscencia, medición colorimétrica,
fluorescencia, radioactividad o por medio de actividad
enzimática.
9. Un método de ensayo, conforme es reivindicado
en la reivindicación 7, en donde dicho ligando marcado es marcado
con un marcador formador de señal, el cual puede ser determinado por
medio de radioactividad.
10. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9,
en donde dicho ligando de unión específica es específico de la
Transcobalamina II y posee una constante de afinidad superior a
10^{11}M^{-1}.
11. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10,
en donde el grado de reactividad cruzada de una
holo-Transcobalamina II, o del ligando de unión de
la Transcobalamina II, con la Haptocorrina es inferior al 0,1%.
12. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11,
en donde dicha muestra libre de células de un fluido corporal es
seleccionada de entre el grupo comprendiendo fluido seminal, fluido
cerebroespinal, fluido amniótico o una muestra procedente de la
sangre.
13. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en la reivindicación 12, en donde dicha muestra
procedente de la sangre es suero o plasma.
14. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13,
en cuyo ensayo la calibración es realizada utilizando un estándar de
holo-Transcobalamina II.
15. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en la reivindicación 14, en donde dicho estándar es
holo-Transcobalamina II humana, nativa o
recombinante.
16. Un método de ensayo, conforme es
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4,
en donde dicho ligando de unión específica se une a la
holo-Transcobalamina II y posee una reactividad
cruzada para la apo-Transcobalamina II no superior
al 1%.
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