ES2262627T3 - Analisis biologico que sirve para detectar una enfermedad cardiovascular. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo para la detección de al menos una enfermedad del conjunto de enfermedad cardiovascular y enfermedad cardiovascular potencial, en un sujeto humano o animal no humano, comprendiendo dicho método evaluar la concentración tanto de holo-transcobalamina II (holo-TCII) como de folato en una muestra de dicho sujeto, que contenga cobalamina.

Description

Análisis biológico que sirve para detectar una enfermedad cardiovascular.

Ensayo de CVD.

La presente invención se refiere a un método de ensayo para detectar enfermedad cardiovascular (CVD) potencial en un sujeto vascularizado, por ejemplo, un ser humano o animal no humano, especialmente un mamífero, y en particular a un método de ensayo que puede usarse para detectar enfermedad cardiovascular potencial antes de la aparición de síntomas de CVD perceptibles por el sujeto.

La enfermedad cardiovascular es una fuente principal de mala salud entre la población humana aunque el tratamiento prematuro o preventivo, por ejemplo, con cambio de dieta, reducción o cese del consumo de tabaco, aumento de ejercicio regular, prescripción de fármacos reductores del nivel de lípidos, etc. tiene una alta tasa de éxito.

Flynn et al. en J. Am. Coll. Nutrition 16 258-267 (1997) estudiaron diversos parámetros incluyendo folato y holo-TCII pero no concluyeron que la holo-TCII fuera un marcador adecuado para CVD. Wickramasinghe et al. en J. Clin. Pathol. 49 755-758 (1996) estudiaron varios parámetros incluyendo holoTCII y folato en macrocitosis.

Se necesitan, en consecuencia, métodos que se puedan usar para detectar CVD o el potencial para o propensión a CVD antes de que la enfermedad haya progresado más allá de la fase en la que el tratamiento tiene éxito rutinariamente o se puede usar para prevenir mayor progresión de la enfermedad, y en particular para detectar CVD en las fases tempranas cuando los síntomas no son evidentes para el paciente o su médico.

Tales métodos pueden usarse para explorar a la población general, o a grupos de riesgo dentro de la población, por ejemplo, hombres de más de 40 años, trabajadores en puestos con alto nivel de estrés, pacientes con dietas insanas, fumadores, etc. en los que se diagnostica CVD potencial o propensión a CVD, se puede dar tratamiento preventivo y/o se puede estimular al paciente para hacer ajustes en su estilo de vida y hábitos. Asimismo, cuando se detecta CVD potencial o propensión a CVD, se puede someter al paciente a más pruebas, por ejemplo, usando técnicas más caras o que requieren más tiempo, tales como ECG, con y sin actividad física, formación de imágenes con radioisótopos de perfusión miocárdica, rayos X (por ejemplo, CT), angiografía miocárdica, angiografía miocárdica MR o formación de imágenes con perfusión, etc. para confirmar la presencia y el estado de la CVD. Mediante el uso de tales métodos de ensayo como una técnica de selección de "filtro grueso" se puede evitar el uso innecesario de tales pruebas caras y que requieren tiempo mientras se sigue aumentando la probabilidad de descubrir y tratar CVD aún no descubierta antes de que el daño a la salud se llegue a ser irreversible.

La presente invención se basa en la comprensión de que el complejo proteico holo-transcobalamina II (holo TCII), un complejo de la proteína vehículo transcobalamina II (TCII) y la Vitamina B_{12} (cobalamina) y/o folato son marcadores eficaces para enfermedad cardiovascular, y en particular, que niveles anormalmente bajos de holo-TCII y/o folato en los fluidos corporales tales como sangre es indicativo de CVD o susceptibilidad a CVD.

Para evitar dudas, el término "cobalamina" se usa en este documento de forma sinónima a "vitamina B_{12}", e incluye todas las formas de vitamina B_{12} (por ejemplo, cianocobalamina; 5-6-dimetil-bencimidazolil cianocobamida; metilcobalamina; 5'-desoxiadenosilcobalamina) como pueden encontrarse y pueden ser metabólicamente activas (cuando se presentan apropiadamente) en el cuerpo.

La vitamina B_{12} (cobalamina) es una vitamina soluble en agua que forma parte del complejo de vitaminas B que se encuentra en los alimentos. La molécula central consta de un anillo corrínico de cuatro unidades pirrol que rodean el átomo de cobalto esencial. La cobalamina es la única vitamina que no pueden sintetizar animales o plantas y tiene que absorberse a partir de los alimentos en el intestino. Se puede almacenar, sin embargo, en el hígado. La sintetizan microorganismos, en particular, bacterias anaeróbicas y levaduras.

La cobalamina funciona in vivo como una coenzima y las enzimas cobalamina catalizan tres tipos de reacción: (i) redisposiciones intramoleculares; (ii) metilaciones; y (iii) reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. En mamíferos, sólo se conocen dos reacciones enzimáticas, concretamente las anteriores (i) y (ii), que requieren cobalamina como coenzima.

En el proceso de la digestión, una proteína salivar llamada haptocorrina (que también se menciona en la técnica como agente de unión R o transcobalaminas I y III colectivamente) se une a cobalamina en la parte superior del tracto gastrointestinal formando un complejo que pasa a través del estómago. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo cobalamina-haptocorrina en el íleo, liberando cobalamina que se une entonces a una proteína llamada factor intrínseco, que secreta la mucosa gástrica, para formar otro complejo. El complejo cobalamina-factor intrínseco se une a un receptor específico en el revestimiento del íleo terminal, en el que se disocia mediante un factor de liberación y la cobalamina se transporta activamente a través de la membrana del íleo hacia el torrente sanguíneo.

La cobalamina no circula en el cuerpo en forma libre en cantidades apreciables. Probablemente, aproximadamente el 99% de la cobalamina está unida por una de las proteínas transcobalamina (TC I, II y III) o albúmina.

La proteína que se cree que es la única responsable de transportar cobalamina a los tejidos diana es la transcobalamina II (TC II), una proteína crítica en cantidades traza sin la que la cobalamina no podría atravesar membranas celulares. A pesar de esta importante función metabólica, sólo aproximadamente el 6-25% de la cobalamina en el suero está unida a TCII - la haptocorrina transporta la mayoría. La TCII comprende un polipéptido de cadena única de aproximadamente 40 kDa que se encuentra principalmente en el suero, fluido seminal y fluido cefalorraquídeo. La TCII unida a cobalamina (es decir, holo-TCII) se une a receptores específicos de las membranas celulares y, una vez unida, la holo-TCII se introduce en las células por pinocitosis. La holo-TCII constituye el conjunto metabólicamente activo de cobalamina, dado que ninguna otra proteína de unión de cobalamina, incluyendo las transcobalaminas I y III, es capaz de facilitar la entrada de la vitamina a las células.

La TCII se sintetiza en el hígado, endotelio vascular, enterocitos, macrófagos y fibroblastos y circula predominantemente como apo-TCII, es decir, que carece de cobalamina unida. Tiene una vida media corta de aproximadamente 90 minutos.

Menos de aproximadamente una cuarta parte de la cobalamina plasmática total está asociada con TCII. El resto está unido a las otras transcobalaminas o albúmina como se ha mencionado anteriormente. La función o papel de las transcobalaminas no TCII no está clara, pero dado que se unen a tanto a cobalamina como a sustancias tipo cobalamina, pueden desempeñar un papel en asegurar que análogos de cobalamina potencialmente dañinos no puedan competir con la cobalamina debido a que no pueden entrar en las células si están unidos a TC I o III. Pueden desempeñar un papel en eliminar análogos de cobalamina de la circulación o pueden servir como almacén de cobalaminas. Como alternativa, pueden asegurar que la cobalamina libre y análogos de la misma no estén disponibles para su utilización por parte de microorganismos.

El folato (ácido fólico en su forma aniónica) es una vitamina que pertenece al complejo de vitaminas B, y es necesario como cosustrato en la formación de metionina a partir de homocisteína. Su forma reducida, tetrahidrofolato, es esencial en el proceso de biosíntesis de ADN.

Desde este punto de vista, la invención proporciona un método de ensayo para la detección de enfermedad cardiovascular (CVD), enfermedad cardiovascular potencial, o propensión a enfermedad cardiovascular en un sujeto humano o animal no humano, comprendiendo dicho método evaluar la concentración de holo-transcobalamina II (holo TCII) en una muestra de dicho sujeto que contiene cobalamina, por ejemplo, una muestra de sangre, plasma, suero, fluido seminal, fluido amniótico o fluido cefalorraquídeo, preferiblemente una muestra de sangre, plasma o suero, en particular una muestra de suero, y opcionalmente evaluar además la concentración de folato en dicha muestra.

Por evaluar se entiende que se determina un valor cuantitativo o semicuantitativo para las concentraciones de holo-TCII y/o folato. Este puede ser un valor para la concentración de la muestra tal como se ensaya, por ejemplo, después del tratamiento para retirar células u otros componentes de la muestra a los que no está destinado el ensayo, o para concentrar o diluir la muestra o para transferir la holo-TCII a un medio diferente, por ejemplo, un sustrato sólido.

Como alternativa, la evaluación puede ser simplemente cualitativa, es decir, para indicar si las concentraciones de holo-TCII y/o folato están por encima o por debajo de uno o más valores umbral preseleccionados, por ejemplo, valores indicativos de la ausencia de CVD detectables por el ensayo, de la presencia de CVD (o CVD potencial, o propensión a CVD) detectables por el ensayo, o incertidumbre en cuanto a presencia o ausencia de CVD, etc. Los valores concretos para dichos valores umbral u otros valores de referencia para la concentración de holo-TCII y/o folato pueden depender de la naturaleza de la muestra, la edad, peso, sexo, y especie del sujeto y se pueden determinar de forma rutinaria ensayando sujetos equivalentes sin CVD o con CVD en diversas fases de desarrollo.

Un valor indicativo de la concentración de holo-TCII determinado (o "evaluado") de acuerdo con el método de la invención puede ser una concentración absoluta de holo-TCII o puede ser como alternativa un índice, proporción, porcentaje o indicación similar de la concentración de holo-TCII y de la de algún otro analito, por ejemplo, otra transcobalamina u homocisteína. Una proporción preferida es aquella entre la concentración de holo-TCII y la concentración total de cobalamina. Los ensayos de cobalamina total se conocen de la bibliografía como también se conocen ensayos para otros analitos tales como homocisteína, que se ha mencionado anteriormente.

La muestra corporal usada en el método de ensayo de la invención puede ser cualquier muestra que contenga cobalamina, por ejemplo, un fluido corporal o muestra tisular, o una suspensión, etc. Generalmente la muestra no será orina o una muestra tomada del tracto gastrointestinal. Preferiblemente, la muestra será un fluido corporal, por ejemplo, fluido seminal, fluido cefalorraquídeo o fluido amniótico, o más particularmente sangre o una muestra derivada de sangre. Cuando este es el caso, la muestra usada para el análisis estará preferiblemente libre de células y por tanto se puede usar suero o plasma. La muestra se puede tratar antes de usarse en el método de ensayo de la invención, por ejemplo, se puede diluir añadiendo un tampón u otro medio acuoso.

Aunque se conocen y se pueden usar ensayos para holo-TCII en el método de la invención, no se ha sugerido previamente que la holo-TCII sea un marcador para CVD o propensión a CVD.

Se describen o se citan ejemplos de ensayos de holo-TCII, por ejemplo, en: Herzlich et al., Lab. Invest. 58: 332-337 (1988); Markle, Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 33: 247-356 (1996); Herbert, Am. J. Clin. Nutrition 59 (5 Supl.): 1213S-1222S (1994); Das et al., J. Nutr. Biochem. 2: 455-464 (1991); van Kapel et al., Clin. Chim. Acta 172: 297-310 (1988); Lindemans et al., Clin. Chim. Acta 132: 53-61 (1983); Nex\diameter et al., Scand. J. Lab. Invest 37: 723-728 (1997); Morelli et al., J. Lab. Clin. Med. 89: 645-652 (1977); Carmel, Am. J. Clin. Pathol. 62: 367-372 (1974); Wickramasinghe et al., J. Clin. Pathol. 46: 537-539 (1993); Vu et al., Am. J. Hematol. 42: 202-211 (1993); Benhayoun et al., Acta Haematol. 89: 195-199 (1993); Rothenberg et al., Methods in Enzymology 281: 261-268 (1997); y en Frater-Schröder et al., páginas 877-880 en "Vitamin B_{12}", Zagalak et al (Ed), W. De Gruyter, Berlín, 1979.

Por tanto, por ejemplo van Kapel et al. (supra) describen un método para separar específicamente TCII de otras transcobalaminas usando heparin sepharose, facilitando de esta forma la cuantificación de holo-TCII por ensayo de dilución de radioisótopos y la concentración de TCII no portadora de cobalamina midiendo la capacidad de unión de cobalamina insaturada de la TCII unida con cobalamina radiactiva. Se han usado métodos similares usando sílice microfina tal como QUSO^{TM} para unir TCII y permitir su purificación (en forma apo u holo) de TCI y III (véase Das et al. (supra)). Se piensa, sin embargo, que la heparin sepharose es un agente de unión más específico de la TCII y algunos investigadores han informado de que TCI y II se unen a la sílice en cantidades apreciables (véase Benhayoun et al. Acta Haematol. 89: 195-199 (1993)). Toft et al .Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 (1994)) han propuesto recientemente un método por el que se adsorbe transcobalamina II a celulosa y la cobalamina asociada con la TCII unida se puede cuantificar por métodos convencionales.

Un inmunoensayo para holo-TCII en el que se usa sepharose anti-TCII como se describe en Lindemans (supra) usa una técnica descrita por Lindemans et al. en Clin. Chim. Acta 95: 29-33 (1979).

El método usado actualmente en la práctica clínica para determinar holo-TCII implica adsorber TCII en sílice y después ensayar la fracción unida para el contenido en cobalamina usando un inmunoensayo (como se describe, por ejemplo, por Kuemmerle et al. Clin. Chem. 38/10: 2073-2077 (1992)) o un ensayo microbiológico, produciendo este último aparentemente los mejores resultados. Este método es preciso y fiable.

En general, además de la muestra en evaluación, se evaluarán también muestras de calibrado con contenido conocido de holo-TCII y/o folato en la realización del método de ensayo. Tales determinaciones se pueden usar para representar una curva de calibrado a partir de la cual se puede determinar el contenido de holo-TCII y/o folato de la muestra en investigación. La naturaleza de las muestras de calibrado y la selección de factores de conversión o ajuste usados en la determinación de la holo-TCII y/o folato pueden variar dependiendo, por ejemplo, de la manera en la que se detecta la TCII y/o folato en la técnica de ensayo realmente usada y de otros aspectos del método que afectan a los resultados del ensayo, por ejemplo, composición del tampón, condiciones de ensayo etc. Típicamente, se usarán muestras de calibrado que tienen contenidos de holo-TCII de 0 a 300 pmol/l. El intervalo de referencia dentro del que generalmente se encontrará el valor para holo-TCII es 0 a 160 pmol/l. Una concentración de holo-TCII en suero por debajo de 35 pmol/l será generalmente fuertemente indicativa de deficiencia.

Se puede usar un conjunto de patrones de cobalamina, preferiblemente con un intervalo de concentraciones prolongado de 80 a 800 pmol/l o más amplio, por ejemplo, 0 a 1500 pmol/l, para determinar el contenido total de cobalamina de la muestra, y no sólo el contenido de holo-TCII, si se requiere tal medida.

Típicamente, se usarán patrones de calibrado que tienen contenidos de folato de 0-45 nM. Una concentración de folato por debajo de 3,4 nM se considera baja, ya que el intervalo en una población normal está entre 3,4 y 38 nM.

Además de obtener una determinación del contenido de holo-TCII y/o folato para la muestra en investigación, puede ser frecuentemente deseable determinar el contenido total de cobalamina en la muestra y/o el contenido de apo-TCII en la muestra. Muchas de las publicaciones anteriormente mencionadas describen cómo se puede hacer esto.

Se puede desear la medida del contenido total de cobalamina de una muestra, particularmente una muestra de suero, para dar una indicación de cualquier desequilibrio de cobalamina en el periodo que precede al momento del muestreo. Tal medida se puede realizar en combinación con evaluación de los niveles de holo-TCII y/o folato y forma un aspecto más de la invención. La medida del contenido total de cobalamina en una muestra se realiza preferiblemente en combinación con evaluación de niveles tanto de holo-TCII como de folato y se puede conseguir por cualquiera de los métodos descritos en las publicaciones mencionadas anteriormente.

En general, el contenido total de cobalamina en suero para seres humanos estará en el intervalo 200-600 pmol/l y el contenido de holo-TCII representará normalmente del 6 al 20% de ésta, es decir, 30-160 pmol/l. Un valor umbral bajo el cual el ensayo puede considerarse como predictivo de CVD o propensión a CVD puede ser generalmente aproximadamente 35 pmol/l, más preferiblemente aproximadamente 30 pmol/l, especialmente aproximadamente 20 pmol/l.

Sin embargo, los valores umbral se calculan mejor a partir de las determinaciones de holo-TCII usando la misma técnica de ensayo para el mismo tipo de muestra corporal de un intervalo de pacientes de tipo similar (edad, sexo, peso, especie, etc.) desde sanos pasando por CVD en fase temprana hasta CVD grave. Incluso más preferiblemente, los valores umbral serán valores determinados pare el mismo paciente en una fase sana más temprana.

La presente invención se refiere a un sistema de ensayo dual que mide tanto el folato total como la holo-TCII total en una muestra, preferiblemente una muestra de suero y preferiblemente simultánea o secuencialmente. La medida de folato se puede efectuar añadiendo primero agente de liberación o desnaturalizante (tal como uno que contenga hidróxido sódico, cianuro potásico y ditiotreitol). Se puede añadir un marcador dual que contenga cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato radiomarcado con I125, seguido de una cantidad limitada de agente de unión dual que contenga factor intrínseco inmovilizado y agente de unión de folato. Los mismos marcadores y agentes de unión duales se pueden usar para cuantificar el nivel de holo-TCII. La concentración de cobalamina unida a TCII en un suero se determina a partir de una curva patrón construida usando calibradores holo-TCII y la concentración de folato a partir de una curva patrón construida de cantidades conocidas de folato.

Visto desde otro punto de vista, la presente invención proporciona el uso de un kit de ensayo en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho kit reactivos como se especifica en la reivindicación 7 y opcionalmente instrucciones para la realización del método de ensayo y para la interpretación de los resultados, y, opcionalmente, muestras de referencia que contienen holo-TCII y/o folato, y, opcionalmente, un detector.

Las instrucciones en el kit pueden estar por ejemplo en forma de etiqueta, un manual o un folleto de instrucciones; sin embargo, en lugar de ello pueden tomar forma de un programa informático o un portador de datos, por ejemplo, un disco de ordenador.

El detector, cuando esté presente, será generalmente uno capaz de detectar una especie informadora, por ejemplo, un espectrómetro, un detector de radicación nuclear, un detector de luz dispersada, etc.

Los reactivos serán reactivos adecuados para la determinación de holo-TCII, por ejemplo, reactivos especificados en la bibliografía citada en este documento que se refiere a la determinación de holo-TCII.

La invención se describirá ahora en los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1

Estudio clínico sobre holo-TCII y trastornos cardiovasculares

Se midieron los niveles de holo-TCII y homocisteína en muestras de suero tomadas de (i) 25 voluntarios sanos, (ii) 90 pacientes con PTCA (Angioplastia Coronaria Transluminal Percutánea) antes del procedimiento, y (iii) 80 pacientes con infarto de miocardio seis días después del infarto y, para 37 de estos también seis semanas después del infarto.

Se midió holo-TCII usando el método no específico de adsorción de TCII sobre sílice (Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62-63) y homocisteína por el método IMx desarrollado por Axis (Schiphandler y Moore (1995) Clin. Chem. 41: 991-994).

Se definió 35 pM como el punto de corte para holo-TCII; considerándose valores por debajo de 35 pM como deficientes. Para homocisteína se definió 14,6 pM como punto de corte; se consideró que valores por debajo de 14,6 pM estaban dentro del intervalo normal.

Como una estimación de riesgo, se calcularon proporciones de probabilidad del siguiente modo: casos con valores "fuera de lo normal"/casos totales del trastorno dividido por la misma proporción para el grupo de control.

Un valor mayor que uno (1) indica que puede existir un riesgo.

Grupo	Total	Holo-TCII	Homocisteína
		Casos	Proporción de	Casos	Proporción de
			probabilidad		probabilidad
Control	25	1	-	1	-
PTCA	90	5	1,4	19	5,3
MI, día 6	80	2	0,6	30	9,4
MI, semana 6	37	4	2,7	15	10

Las proporciones de probabilidad para homocisteína están de acuerdo con numerosos estudios diferentes que muestran que valores de homocisteína mayores de aproximadamente 15 \muM están asociados con mayor riesgo de enfermedad cardiovascular.

Las proporciones de probabilidad para holo-TCII indican que tal riesgo, aunque más bajo, está relacionado también con holo-TCII. Los valores se han subestimado probablemente a causa del método no específico usado, adsorción de TC en sílice. Las proporciones de probabilidad menores que la unidad observadas para MI en el día 6 se debe más probablemente a que la TCII es una proteína de fase aguda y por tanto se puede esperar que aumente en concentración después de un traumatismo tal como un infarto de miocardio. La concentración aumentada de TCII causará una redistribución temporal de cobalamina de haptocorrina a TCII, enmascarando cualquier disminución crónica de holo-TCII subyacente.

Ejemplo 2

Para la medida de holo-TCII, se mezclan alícuotas de suero durante 30 minutos con un volumen igual de PBS y partículas magnetizables recubiertas con anticuerpos específicos para TCII. Las partículas magnetizables se sedimentan usando un imán fuerte y el sobrenadante se retira. Las partículas se lavan una vez y se tratan posteriormente con un reactivo de liberación/desnaturalizante que contiene hidróxido sódico (0,3 M), cianuro potásico (100 \muM) y ditiotreitol (15 mM). Para la medida de folato, las muestras de suero se tratan directamente con el reactivo de liberación/desnaturalizante. Este liberará sustancialmente toda la cobalamina unida y el folato, convertirá toda la cobalamina en la forma más estable cianocobalamina, y mantendrá el folato endógeno en forma reducida. Se añade después a todas las muestras un marcador dual que contiene cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato radiomarcado con I125. Se añade a cada tubo una cantidad limitada de un agente de unión dual, que contiene Factor Intrínseco inmovilizado y agente de unión de folato, y se incuba durante 10-60 minutos. El agente de unión se sedimenta por centrifugación o usando un imán fuerte, dependiendo del modo de inmovilización. La concentración de cobalamina unida a TCII en una muestra de suero se determina a partir de una curva patrón construida usando calibradores holo-TCII y la concentración de folato a partir de una curva patrón construida de cantidades conocidas de folato.

Ejemplo 3

Para la medida de holo-TCII, se mezclan alícuotas de suero durante 30 minutos con un volumen igual de PBS y partículas magnetizables recubiertas con anticuerpos específicos para holo-TCII. Las partículas magnetizables se sedimentan usando un imán fuerte y el sobrenadante se retira. Las partículas se lavan una vez y se tratan posteriormente con un reactivo de liberación/desnaturalizante que contiene hidróxido sódico (0,3 M), cianuro potásico (100 \muM), y ditiotreitol (15 mM). Para la medida de cobalamina total y folato en suero, las muestras de suero se tratan directamente con el reactivo de liberación/desnaturalizante. Este liberará sustancialmente toda la cobalamina unida y el folato, convertirá toda la cobalamina en la forma más estable cianocobalamina, y mantendrá el folato endógeno en forma reducida. Se añade después a todas las muestras un marcador dual que contiene cianocobalamina radiomarcada con Co57 y folato radiomarcado con I125. Se añade a cada tubo una cantidad limitada de agente de unión, que contiene Factor Intrínseco inmovilizado y agente de unión de folato, y se incuba durante 10-60 minutos. El agente de unión se sedimenta por centrifugación o usando un imán fuerte, dependiendo del modo de inmovilización. La concentración de cobalamina unida a TCII en una muestra de suero se determina a partir de una curva patrón construida usando calibradores holo-TCII y la concentración total de cobalamina y folato en suero a partir de una curva patrón construida de cantidades conocidas de cobalamina y folato.

Claims (9)

1. Un método de ensayo para la detección de al menos una enfermedad del conjunto de enfermedad cardiovascular y enfermedad cardiovascular potencial, en un sujeto humano o animal no humano, comprendiendo dicho método evaluar la concentración tanto de holo-transcobalamina II (holo-TCII) como de folato en una muestra de dicho sujeto, que contenga cobalamina.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de fluido seleccionado entre el conjunto de sangre, plasma, suero, fluido seminal, fluido amniótico y fluido cefalorraquídeo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha muestra es una muestra de sangre.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra es una muestra de suero.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra se trata antes de usarla en el método de ensayo para separar la holo-TCII.

6. Un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente la medida del nivel de cobalamina total en dicha muestra.

7. Uso de un kit de ensayo en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho kit un agente desnaturalizante, un marcador dual que contiene cianocobalamina radiomarcada con Co^{57} y folato radiomarcado con I^{125}, y una cantidad limitada de agente de unión dual que contiene factor intrínseco inmovilizado y agente de unión de folato.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho kit comprende adicionalmente muestras de referencia que contienen holo-TCII.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en el que dicho kit comprende adicionalmente muestras de referencia que contienen folato.