DE60119289T2

DE60119289T2 - Diagnose von kardiovaskulären Krankheiten durch Messung von Folat und Holo-TCII

Info

Publication number: DE60119289T2
Application number: DE60119289T
Authority: DE
Inventors: Erling Axis-Shield Asa Sundrehagen; Lars Axis-Shield ASA ORNING
Original assignee: Axis Shield ASA
Current assignee: Axis Shield ASA
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2021-02-22
Also published as: WO2001063298A3; WO2001063298A2; ES2262627T3; EP1257831B1; EP1257831A2; ATE325345T1; DK1257831T3; GB0004040D0; DE60119289D1; US20040253745A1; PT1257831E; CY1105520T1; JP2003524186A; AU2001233928A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Prüfverfahren zum Erkennen einer potentiellen kardiovaskulären Krankheit (CVD) in einem vaskularisierten Subjekt, beispielsweise einem menschlichen oder einem nicht menschlichen Tier, insbesondere einem Säugetier, und insbesondere ein Prüfverfahren, das zum Erkennen einer potentiellen kardiovaskulären Krankheit vor dem Einsetzen von CVD-Symptomen, die von dem Subjekt bemerkbar sind, verwendet werden kann.
Die kardiovaskuläre Krankheit ist eine Hauptquelle einer schlechten Gesundheit unter der menschlichen Bevölkerung, wobei jedoch eine frühe oder vorbeugende Behandlung, beispielsweise mit einer Diätänderung, einer Verringerung oder einer Aufgabe des Rauchens, einer Zunahme regelmäßiger körperlicher Aktivitäten, einer Verschreibung Lipid verringernder Arzneimittel usw., eine hohe Erfolgsrate hat.
Flynn u.a. haben in J. Am. Coll. Nutrition 16, 258–267 (1997) verschiedene Parameter, einschließlich Folat und Holo-TCII, untersucht, jedoch nicht geschlossen, dass Holo-TCII ein geeigneter Marker für CVD war. Wickramasinghe u.a. haben in J. Clin. Pathol. 49, 755–758 (1996) eine Anzahl von Parametern unter Einschluss von Holo-TCII und Folat bei der Makrozytose untersucht.
Es gibt dementsprechend einen Bedarf an Verfahren, die zum Erkennen einer CVD oder des Potentials für eine CVD oder der Anfälligkeit für eine CVD verwendet werden können, bevor die Krankheit über das Stadium fortgeschritten ist, an dem eine Behandlung routinemäßig erfolgreich ist, oder die verwendet werden können, um ein weiteres Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, und insbesondere zur Erkennung einer CVD in frühen Stadien, wenn die Symptome für den Patienten oder seinen Arzt nicht offensichtlich sind.
Solche Verfahren können verwendet werden, um die allgemeine Bevölkerung oder Risikogruppen innerhalb der Bevölkerung, beispielsweise Männer über 40, Arbeiter in Berufen mit hohen Stressniveaus, Patienten mit ungesunden Ernährungsgewohnheiten, Raucher usw., zu durchmustern, und es kann, wenn eine potentielle CVD oder eine Anfälligkeit für eine CVD diagnostiziert wird, eine vorbeugende Behandlung ausgeführt werden, und/oder der Patient kann ermutigt werden, seinen Lebensstil und seine Gewohnheiten zu ändern. Ebenso kann der Patient, wenn eine CVD, eine potentielle CVD oder eine Anfälligkeit für eine CVD erkannt wird, weiteren Tests unterzogen werden, wobei beispielsweise kostspieligere oder zeitaufwendigere Techniken, wie EKG, mit und ohne körperliche Aktivität, eine Radioisotopenabbildung der Herzmuskelperfusion, Röntgen-(beispielsweise CT)-Herzmuskelangiographie, MR-Herzmuskelangiographie oder eine Perfusionsabbildung usw. verwendet wird, um das Vorhandensein und den Status der CVD zu bestätigen. Durch die Verwendung solcher Prüfverfahren als eine "Grobfilter"-Durchmusterungstechnik kann eine unnötige Verwendung solcher kostspieliger und zeitaufwendiger Tests vermieden werden, während noch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass eine bisher nicht entdeckte CVD gefunden und behandelt wird, bevor Gesundheitsschäden irreversibel werden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass der Proteinkomplex Holo-Transcobalamin II (Holo-TCII), ein Komplex des Trägerproteins Transcobalamin II (TCII) und Vitamin B₁₂ (Cobalamin) und/oder Folat wirksame Marker für eine kardiovaskuläre Krankheit sind, und insbesondere darauf, dass ungewöhnlich niedrige Holo-TCII- und/oder Folatniveaus in Körperflüssigkeiten, wie Blut, auf eine CVD oder eine Anfälligkeit für eine CVD hindeuten.
Um Zweifel zu vermeiden, wird der Begriff "Cobalamin" hier synonym mit "Vitamin B₁₂" verwendet und schließt alle Formen von Vitamin B₁₂ (beispielsweise Cyanocobalamin, 5–6-Dimethyl-benzimidazolylcyanocobamid, Methylcobalamin und 5'-Desoxyadenosylcobalamin) ein, welche im Körper auftreten können und metabolisch aktiv sein können (wenn sie geeignet präsentiert werden).
Vitamin B₁₂ (Cobalamin) ist ein wasserlösliches Vitamin, das ein Teil des in Nahrungsmitteln vorgefundenen Vitamin-B-Komplexes ist. Das Kernmolekül besteht aus einem Corrin-Ring aus vier Pyroleinheiten, welche das essenzielle Kobaltatom umgeben. Cobalamin ist das einzige Vitamin, das nicht von Tieren oder Pflanzen synthetisiert werden kann und von Nahrungsmitteln im Darm absorbiert werden muss. Es kann jedoch in der Leber gespeichert werden. Es wird von Mikroorganismen, insbesondere von anaeroben Bakterien und Hefe, synthetisiert.
Cobalamin funktioniert in vivo als ein Coenzym, und Cobalaminenzyme katalysieren drei Reaktionstypen, nämlich:
(i) intramolekulare Neuanordnungen, (ii) Methylierungen und (iii) die Reduktion von Ribonucleotiden zu Desoxy ribonucleotiden in manchen Mikroorganismen. Bei Säugetieren ist nur von zwei enzymatischen Reaktionen, nämlich den zuvor erwähnten Reaktionen (i) und (ii), bekannt, dass sie Cobalamin als ein Coenzym benötigen.
Beim Verdauungsprozess bindet ein als Haptocorrin bezeichnetes Speichelprotein (welches auf dem Fachgebiet auch als R-Bindemittel oder kollektiv Transcobalamine I und III bezeichnet wird) Cobalamin im oberen Gastrointestinaltrakt und bildet einen Komplex, der den Magen passiert. Pankreasenzyme verdauen den Cobalamin-Haptocorrin-Komplex im Ileum, wodurch Cobalamin freigesetzt wird, das dann an ein als Intrinsic-Faktor bezeichnetes Protein gebunden wird, das von der Magenschleimhaut abgesondert wird, wodurch ein weiterer Komplex gebildet wird. Der Cobalamin-Intrinsic-Faktor-Komplex bindet an einen spezifischen Rezeptor in der Wand des End-Ileums, woraufhin er durch einen Trennfaktor gelöst wird und das Cobalamin aktiv durch die Membran des Ileums in den Blutstrom transportiert wird.
Cobalamin zirkuliert nicht in einer erheblichen Menge in freier Form im Körper. Wahrscheinlich sind etwa 99% des Cobalamins von einem der Transcobalaminproteine (TC I, II und III) oder Albumin gebunden.
Das Protein, das als ausschließlich für den Transport von Cobalamin zu Zielgeweben verantwortlich angesehen wird, ist Transcobalamin II (TCII), ein kritisches Spurenprotein, ohne das Cobalamin Zellmembranen nicht durchqueren kann. Trotz dieser wichtigen Stoffwechselfunktion sind nur etwa 6–25% des Cobalamins im Serum an TCII gebunden, und der größte Teil wird von Haptocorrin getragen. TCII umfasst ein Einzelketten-Polypeptid mit etwa 40 kDa, das in erster Linie im Serum, in der Samenflüssigkeit und in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit angetroffen wird. An Cobalamin gebundenes TCII (d.h. Holo-TCII) haftet an spezifischen Rezeptoren an Zellmembranen, und das Holo-TCII wird durch Pinozytose in Zellen aufgenommen, sobald die Bindung aufgetreten ist. Das Holo-TCII bildet den metabolisch aktiven Cobalamin-Pool, weil keines der anderen Cobalamin bindenden Proteine, einschließlich Transcobalamin I und III, in der Lage ist, das Eindringen des Vitamins in Zellen zu erleichtern.
TCII wird von der Leber, von der Gefäßinnenhaut, von Enterozyten, von Makrophagen und von Fibroblasten synthetisiert und zirkuliert vorwiegend als Apo-TCII, so dass es ihm an gebundenem Cobalamin mangelt. Es hat eine kurze Halbwertszeit von etwa 90 Minuten.
Weniger als etwa ein Viertel des Gesamt-Plasma-Cobalamins ist TCII zugeordnet. Der Rest ist an die anderen Transcobalamine oder Albumin gebunden, wie zuvor erwähnt wurde. Die Funktion oder die Rolle der Nicht-TCII-Transcobalamine ist unklar, weil sie jedoch sowohl Cobalamin als auch cobalaminartige Substanzen binden, können sie eine Rolle bei der Gewährleistung spielen, dass möglicherweise schädliche Analoga von Cobalamin nicht mit Cobalamin konkurrieren können, weil sie nicht in der Lage sind, in Zellen einzudringen, wenn eine Bindung an TC I oder III vorliegt. Sie können eine Rolle beim Entfernen von Cobalamin-Analoga aus dem Kreislauf spielen oder als ein Speicher von Cobalaminen dienen. Alternativ können sie gewährleisten, dass freies Cobalamin und Analoga davon nicht zur Verwendung durch Mikroorganismen verfügbar sind.
Folat (Folsäure in ihrer anionischen Form) ist ein Vitamin, das zum Vitamin-B-Komplex gehört, und es ist als ein Cosubstrat bei der Bildung von Methionin aus Homocystein erforderlich. Seine reduzierte Form, Tetrahydrofolat, ist beim Prozess der DNA-Biosynthese wesentlich.
Demgemäß sieht die Erfindung gemäß einem Aspekt ein Prüfverfahren für die Erkennung einer kardiovaskulären Krankheit (CVD), einer potentiellen kardiovaskulären Krankheit oder einer Anfälligkeit für eine kardiovaskuläre Krankheit in einem menschlichen oder nicht menschlichen tierischen Subjekt vor, wobei das Verfahren das Überprüfen der Konzentration von Holo-Transcobalamin II (Holo-TCII) in einer Cobalamin enthaltenden Probe von dem Subjekt, beispielsweise einer Probe von Blut, Plasma, Serum, Samenflüssigkeit, Fruchtwasser oder Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit, vorzugsweise einer Probe von Blut, Plasma oder Serum, insbesondere einer Probe von Serum, und wahlweise weiter das Überprüfen der Konzentration von Folat in der Probe aufweist.
Mit Überprüfen ist gemeint, dass ein quantitativer oder semi-quantitativer Wert für die Konzentrationen von Holo-TCII und/oder Folat bestimmt wird. Dies kann ein Wert für die Konzentration der getesteten Probe sein, beispielsweise nach einer Behandlung zum Entfernen von Zellen oder anderen Probenkomponenten, die nicht überprüft wurden, oder zum Konzentrieren oder Verdünnen der Probe oder zum Übertragen des Holo-TCII in ein getrenntes Medium, beispielsweise ein festes Substrat.
Alternativ kann die Überprüfung einfach qualitativ erfolgen, d.h. um anzugeben, ob die Holo-TCII- und/oder die Folatkonzentrationen oberhalb oder unterhalb von einem oder mehreren vorgewählten Schwellenwerten liegen, beispielsweise Werten, die das Nichtvorhandensein einer durch die Überprüfung erkennbaren CVD, das Vorhandensein einer CVD (oder einer potentiellen CVD oder einer Anfälligkeit für eine CVD), wie durch die Überprüfung erkennbar ist, oder eine Unsicherheit in Bezug auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer CVD usw. angeben. Die genauen Werte für diese Schwellenwerte oder andere Referenzwerte für die Holo-TCII- und/oder die Folatkonzentration können von der Natur der Probe, dem Alter, dem Gewicht, dem Geschlecht und der Gattung des Subjekts abhängen und routinemäßig durch Testen entsprechender Subjekte ohne CVD oder mit CVD in verschiedenen Entwicklungsstadien bestimmt werden.
Ein durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmter (oder "überprüfter") Wert, der die Holo-TCII-Konzentration angibt, kann eine absolute Konzentration von Holo-TCII sein oder alternativ ein Index, ein Verhältnis, ein Prozentsatz oder eine andere Angabe der Konzentration von Holo-TCII und eines anderen Analyten, beispielsweise eines anderen Transcobalamins oder Homocysteins, sein. Ein bevorzugtes Verhältnis ist dasjenige zwischen der Konzentration von Holo-TCII und der Gesamtcobalaminkonzentration. Gesamtcobalaminanalysen sind ebenso wie Analysen für andere Analyten, wie Homocystein, das vorstehend erwähnt wurde, aus der Literatur bekannt.
Die in dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren verwendete Körperprobe kann eine beliebige cobalaminhaltige Probe, beispielsweise eine Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe oder eine Suspension usw. sein. Im Allgemeinen ist die Probe nicht Urin oder eine aus dem Gastrointestinaltrakt entnommene Probe. Vorzugsweise ist die Probe eine Körperflüssigkeit, beispielsweise Samenflüssigkeit, Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit oder Fruchtwasser oder insbesondere Blut oder eine von Blut abgeleitete Probe. Wenn dies der Fall ist, ist die zur Analyse verwendete Probe vorzugsweise zellenfrei, und es kann daher entweder Serum oder Plasma verwendet werden. Die Probe kann behandelt werden, bevor sie in dem Prüfverfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, wobei sie beispielsweise durch Hinzufügen eines Puffers oder eines anderen wässrigen Mediums verdünnt werden kann.
Wenngleich Überprüfungen auf Holo-TCII bekannt sind und in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, wurde bisher nicht vorgeschlagen, dass Holo-TCII ein Marker für eine CVD oder eine Anfälligkeit für eine CVD ist.
Beispiele von Holo-TCII-Analysen sind beispielsweise in Herzlich u.a., Lab. Invest. 58: 332–337 (1998), Markle, Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 33: 247–356 (1996), Herbert, Am. J. Clin. Nutrition 59 (5 Suppl.): 1213S–1222S (1994), Das u.a., J. Nutr. Biochem. 2: 455–464 (1991), van Kapel u.a., Clin. Chim. Acta 172: 297–310 (1988), Lindemans u.a., Clin. Chim. Acta 132: 53–61 (1983), Nexo u.a., Scand. J. Lab. Invest 37: 723–728 (1997), Morelli u.a., J. Lab. Clin. Med. 89: 645–652 (1977), Carmel, Am. J. Clin. Pathol. 62: 367–372 (1974), Wickramasinghe u.a., J. Clin. Pathol. 46: 537–539 (1993), Vu u.a., Am. J. Hematol. 42: 202–211 (1993), Benhayoun u.a., Acta Haematol. 89: 195–199 (1993), Rothenberg u.a., Methods in Enzymology 281: 261–268 (1997) und Frater-Schröder u.a., S. 877–880 in "Vitamin B₁₂", Zagalak u.a. (Herausgeber), W. De Gruyter, Berlin, 1979, beschrieben und erwähnt.
Demgemäß wurde beispielsweise von van Kapel u.a. (oben erwähnt) ein Verfahren zum spezifischen Trennen von TCII von anderen Transcobalaminen unter Verwendung von Heparinsepharose offenbart, wodurch die Quantisierung von Holo-TCII durch Radioisotopenverdünnungsanalyse und das Bestimmen der Konzentration von kein Cobalamin tragendem TCII durch Messen der Fähigkeit zum Binden ungesättigten Cobalamins durch das gebundene TCII mit radioaktivem Cobalamin erleichtert werden. Ähnliche Verfahren unter Verwendung von mikrofeinem Silika, wie QUSO^TM, wurden verwendet, um TCII zu binden und seine Reinigung (entweder in Apo- oder in Holo-Form) von TC I und III zu ermöglichen (siehe Das u.a. (oben erwähnt)). Es wird jedoch angenommen, dass Heparinsepharose ein spezifischeres Bindemittel für TCII ist, und einige Forscher haben darüber berichtet, dass TC I und III in erheblichen Mengen an Silika binden (siehe Benhayoun u.a. Acta Haematol. 89: 195–199 (1993)). Toft u.a. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 (1994) haben vor kurzem ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem Transcobalamin II an Zellulose adsorbiert wird und das dem gebundenen TCII zugeordnete Cobalamin durch Standardverfahren quantifiziert werden kann.
Eine Immunprobe für Holo-TCII, wobei Sepharose-Anti-TCII verwendet wird, wurde in Lindemans (oben erwähnt) verwendet, wobei eine Technik verwendet wird, die von Lindemans u.a. in Clin. Chim. Acta 95: 29–33 (1979) beschrieben ist.
Das Verfahren, das gegenwärtig in der klinischen Praxis verwendet wird, um Holo-TCII zu bestimmen, umfasst das Adsorbieren von TCII an Silika und das anschließende Überprüfen des gebundenen Anteils auf den Cobalamingehalt entweder unter Verwendung einer Immunprobe (wie beispielsweise von Kuemmerle u.a. Clin. Chem. 38/10: 2073–2077 (1992)) beschrieben wurde, oder einer mikrobiologischen Probe, wobei die letztgenannte anscheinend die besten Ergebnisse erzeugt. Dieses Verfahren ist genau und zuverlässig.
Im Allgemeinen werden abgesehen von der beurteilten Probe Kalibrierungsproben mit einem bekannten Holo-TCII- und/oder einem bekannten Folatgehalt auch bei der Ausführung des Prüfverfahrens ausgewertet. Diese Bestimmungen können verwendet werden, um eine Kalibrierungskurve aufzutragen, anhand derer der Holo-TCII- und/oder der Folatgehalt der untersuchten Probe bestimmt werden kann. Die Natur der Kalibrierungsproben und die Auswahl der Konvertierungs- und Einstellungsfaktoren, die beim Bestimmen von Holo-TCII und/oder Folat verwendet werden, können beispielsweise von der Art abhängen, in der Holo-TCII oder Folat bei der tatsächlich verwendeten Prüftechnik erfasst wird, und von anderen Aspekten des Verfahrens abhängen, welche das Prüfergebnis beeinflussen, beispielsweise von der Pufferzusammensetzung, den Prüfbedingungen usw. Typischerweise werden Kalibrierungsproben mit Holo-TCII-Gehalten von 0 bis 300 pmol/l verwendet. Der Referenzbereich, innerhalb dessen der Wert für Holo-TCII im Allgemeinen gefunden wird, beträgt 0 bis 160 pmol/l. Eine Holo-TCII-Konzentration im Serum unterhalb von 35 pmol/l weist im Allgemeinen stark auf einen Mangel hin.
Eine Gruppe von Cobalaminnormen, vorzugsweise mit einem erweiterten Konzentrationsbereich von 80 bis 800 pmol/l oder breiter, beispielsweise 0 bis 1500 pmol/l, kann verwendet werden, um den Gesamtcobalamingehalt der Probe und nicht nur den Holo-TCII-Gehalt zu bestimmen, falls eine solche Messung erforderlich ist.
Typischerweise werden Kalibrierungsnormen mit Folatgehalten von 0–45 nM verwendet. Eine Folatkonzentration unterhalb von 3,4 nM wird als niedrig angesehen, weil der Bereich in einer normalen Population zwischen 3,4 und 38 nM liegt.
Abgesehen vom Erhalten einer Bestimmung des Holo-TCII- und/oder des Folatgehalts für die untersuchte Probe kann es häufig wünschenswert sein, den Gesamtcobalamingehalt in der Probe und/oder den Apo-TCII-Gehalt in der Probe zu bestimmen. Viele der vorstehend erwähnten Veröffentlichungen beschreiben, wie dies vorgenommen werden kann.
Die Messung des Gesamtcobalamingehalts einer Probe, insbesondere einer Serumprobe, kann erwünscht sein, um eine Angabe eines Cobalaminungleichgewichts über den Zeitraum bis zur Probenentnahmezeit zu erhalten. Eine solche Messung kann in Kombination mit der Beurteilung von Holo-TCII-Niveaus und/oder Folatniveaus vorgenommen werden und bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Die Messung des Gesamtcobalamingehalts in einer Probe wird vorzugsweise in Kombination mit der Beurteilung sowohl der Holo-TCII-Niveaus als auch der Folatniveaus ausgeführt und kann durch beliebige der in den vorstehend erwähnten Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren erreicht werden.
Im Allgemeinen liegt der Gesamtcobalamingehalt im Serum bei Menschen im Bereich von 200–600 pmol/l, und der Holo-TCII-Gehalt stellt normalerweise etwa 6 bis 20% hiervon, d.h. 30–160 pmol/l, dar. Ein Schwellenwert, unterhalb dessen die Überprüfung als eine CVD oder eine Anfälligkeit für eine CVD vorhersagend angesehen werden kann, kann im Allgemeinen etwa 35 pmol/l, bevorzugter etwa 30 pmol/l und insbesondere etwa 20 pmol/l betragen.
Die Schwellenwerte werden jedoch besser anhand Holo-TCII-Bestimmungen unter Verwendung derselben Prüftechnik für denselben Körperprobentyp aus einem Bereich von Patienten ähnlichen Typs (Alter, Geschlecht, Gewicht, Gattung usw.) von gesunden Proben bis zu CVD in einem Frühstadium bis zu einer ernsten CVD berechnet. Noch bevorzugter sind die Schwellenwerte für denselben Patienten in einem früheren gesunden Stadium bestimmte Werte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Doppelprüfsystem, wobei sowohl der Gesamtfolatanteil als auch Holo-TCII in einer Probe, vorzugsweise einer Serumprobe und bevorzugt gleichzeitig oder nacheinander gemessen werden. Die Messung des Folats kann ausgeführt werden, indem zuerst ein Löse- oder Denaturierungsmittel (beispielsweise eines, das Natriumhydroxid, Kaliumcyanid und Dithiotreitol enthält) zugegeben wird. Ein Doppelindikator, der mit Co57 radioaktiv markiertes Cyanocobalamin und mit I125 radioaktiv markiertes Folat enthält, kann hinzugegeben werden, und es wird anschließend ein begrenzter Anteil eines immobilisierten Intrinsic-Faktor und Folatbindemittel enthaltenden Doppelbindemittels hinzugegeben. Die gleichen Doppelindikatoren und -bindemittel können verwendet werden, um das Holo-TCII-Niveau zu quantifizieren. Die Konzentration von an TCII gebundenem Cobalamin in einem Serum wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung von Holo-TCII-Kalibratoren eingerichtet ist, und die Konzentra tion von Folat wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung bekannter Folatmengen eingerichtet ist.
In einer weiteren Hinsicht sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Prüfausstattung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 vor, wobei die Ausstattung Reagenzien nach Anspruch 7 und wahlweise Anweisungen zum Ausführen des Prüfverfahrens und zur Interpretation der Ergebnisse und wahlweise Holo-TCII und/oder Folat enthaltende Referenzproben sowie wahlweise einen Detektor aufweist.
Die Anweisungen in der Ausstattung können beispielsweise in Form eines Etiketts, eines Handbuchs oder eines Anweisungsblatts vorliegen, sie können jedoch stattdessen auch die Form eines Computerprogramms oder eines Datenträgers, beispielsweise einer Computerplatte, annehmen.
Der Detektor, wenn vorhanden, ist im Allgemeinen ein Detektor, der in der Lage ist, eine Reporterspezies zu erfassen, beispielsweise ein Spektrometer, ein Kernstrahlungsdetektor, ein Streulichtdetektor usw.
Die Reagenzien sind zur Bestimmung von Holo-TCII geeignete Reagenzien, beispielsweise Reagenzien, die in der hier zitierten Literatur spezifiziert sind, welche sich auf die Holo-TCII-Bestimmung bezieht.
Die Erfindung wird nun in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen beschrieben:
BEISPIEL 1
Klinische Untersuchung von Holo-TCII und kardiovaskulären Störungen
Niveaus von Holo-TC II und Homocystein wurden in Serumproben gemessen, die von (i) 25 gesunden Freiwilligen, (ii) 90 PTCA-(perkutane transluminale Koronarangioplastik)-Patienten vor einer Prozedur und (iii) 80 Herzinfarktpatienten sechs Tage nach dem Infarkt und für 37 von diesen auch sechs Wochen nach dem Infarkt entnommen wurden.
Holo-TC II wurde unter Verwendung des nicht spezifischen Verfahrens zur Adsorption von TC II an Silika (Toft u.a. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62–63) gemessen, und Homocystein wurde nach dem von Axis entwickelten IMx-Verfahren (Shipchandler & Moore (1995) Clin. Chem. 41: 991–994) gemessen.
35 pM wurde als die Abschneidegrenze für Holo-TC II definiert, und Werte unterhalb von 35 pM wurden als mangelhaft angesehen. Für Homocystein wurden 14,6 pM als die Abschneidegrenze definiert und Werte unterhalb von 14,6 pM als innerhalb des Normalbereichs liegend angesehen.
Als eine Risikoschätzung wurden Wahrscheinlichkeitsverhältnisse folgendermaßen berechnet: Fälle mit "unnormalen" Werten/Gesamtfälle der Störung, dividiert durch dasselbe Verhältnis für die Kontrollgruppe.
Ein Wert größer als eins (1) gibt an, dass ein Risiko existieren kann.
Das Wahrscheinlichkeitsverhältnis für Homocystein entspricht zahlreichen anderen Untersuchungen, welche zeigen, dass Homocysteinwerte größer als etwa 15 μM mit einem größeren Risiko einer kardiovaskulären Krankheit einhergehen.
Das Wahrscheinlichkeitsverhältnis für Holo-TC II gibt an, dass ein solches Risiko, wenngleich es niedriger ist, auch Holo-TC II zugeordnet ist. Die Werte werden wahrscheinlich wegen des verwendeten nicht spezifischen Verfahrens, nämlich der Adsorption von TC an Silika, unterschätzt. Das für MI am Tag 6 beobachtete Wahrscheinlichkeitsverhältnis, das kleiner als eins ist, ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass TC II ein Protein einer akuten Phase ist, und demgemäß erwartet werden kann, dass seine Konzentration nach einem Trauma in der Art eines Herzinfarkts ansteigt. Die erhöhte Konzentration von TC II ruft eine vorübergehende Neuverteilung von Cobalamin aus Haptocorrin zu TC II hervor, wodurch jede zugrunde liegende chronische Verringerung in Holo-TC II maskiert wird.
Beispiel 2
Zur Messung von Holo-TCII werden Serumanteile 30 Minuten lang mit einem gleichen Volumen von PBS und magnetisierbaren Teilchen, die mit für TCII spezifischen Antikörpern beschichtet sind, gemischt. Die magnetisierbaren Teilchen werden unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert, und die darüberstehenden Anteile werden entfernt. Die Teilchen werden einmal gewaschen und anschließend mit einem lösenden/denaturierenden Reagens, das Natriumhydroxid (0,3 M), Kaliumcyanid (100 μM) und Dithiotreitol (15 mM) enthält, behandelt. Zur Folatmessung werden Serumproben direkt mit dem lösenden/denaturierenden Reagens behandelt. Hierdurch wird im Wesentlichen das gesamte gebundene Cobalamin und Folat gelöst, das gesamte Cobalamin in die stabilere Cyanocobalaminform umgewandelt und das endogene Folat in reduzierter Form bewahrt. Zu allen Proben wird dann ein Doppelindikator hinzugefügt, der mit Co57 radioaktiv markiertes Cyanocobalamin und mit I125 radioaktiv markiertes Folat enthält. Ein begrenzter Anteil eines Doppelbindemittels, das immobilisierten Intrinsic-Faktor und Folatbindemittel enthält, wird zu jedem Röhrchen hinzugegeben und 10 bis 60 Minuten lang inkubiert. Das Bindemittel wird durch Zentrifugation oder unter Verwendung eines starken Magneten, abhängig vom Immobilisierungsmodus, sedimentiert. Die Konzentration von an TCII gebundenem Cobalamin in einer Serumprobe wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung von Holo-TCII-Kalibratoren eingerichtet ist, und die Konzentration von Folat wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung bekannter Folatmengen eingerichtet ist.
Beispiel 3
Zur Messung von Holo-TCII werden Serumanteile 30 Minuten lang mit einem gleichen Volumen von PBS und magnetisierbaren Teilchen, die mit für TCII spezifischen Antikörpern beschichtet sind, gemischt. Die magnetisierbaren Teilchen werden unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert, und die darüberstehenden Anteile werden entfernt. Die Teilchen werden einmal gewaschen und anschließend mit einem lösenden/denaturierenden Reagens, das Natriumhydroxid (0,3 M), Kaliumcyanid (100 μM) und Dithiotreitol (15 mM) enthält, behandelt. Zur Messung des gesamten Serumcobalamins und Folats werden Serumproben direkt mit dem lösenden/denaturierenden Reagens behandelt. Hierdurch wird im Wesentlichen das gesamte gebundene Cobalamin und Folat gelöst, das gesamte Cobalamin in die stabilere Cyanocobalaminform umgewandelt und das endogene Folat in reduzierter Form bewahrt. Zu allen Proben wird dann ein Doppelindikator hinzugefügt, der mit Co57 radioaktiv markiertes Cyanocobalamin und mit I125 radioaktiv markiertes Folat enthält. Ein begrenzter Anteil eines Doppelbindemittels, das immobilisierten Intrinsic-Faktor und Folatbindemittel enthält, wird zu jedem Röhrchen hinzugegeben und 10 bis 60 Minuten lang inkubiert. Das Bindemittel wird durch Zentrifugation oder unter Verwendung eines starken Magneten, abhängig vom Immobilisierungsmodus, sedimentiert. Die Konzentration von an TCII gebundenem Cobalamin in einer Serumprobe wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung von Holo-TCII-Kalibratoren eingerichtet ist, und die Konzentration des gesamten Serumcobalamins und -folats wird aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung bekannter Cobalamin- und Folatmengen eingerichtet ist.

Claims

Prüfverfahren zum Erkennen zumindest einer Krankheit aus der Gruppe von kardiovaskulären Krankheiten und potentiellen kardiovaskulären Krankheiten in einem menschlichen oder nichtmenschlichen tierischen Subjekt, wobei das Verfahren das Überprüfen der Konzentration von sowohl Holo-Transcobalamin II (Holo TCII) als auch von Folat in einer Cobalamin enthaltenden Probe von dem Subjekt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe eine Probe einer Flüssigkeit ist, die aus der Gruppe bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Samenflüssigkeit, Fruchtwasser und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine Blutprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Probe eine Serumprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Probe vor der Verwendung in dem Prüfverfahren behandelt wird, um das Holo-TCII zu separieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das zusätzlich das Messen des gesamten Cobalaminniveaus in der Probe umfasst.
Verwendung einer Prüfausstattung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ausstattung ein Denaturierungsmittel, einen Doppelindikator, der mit Co⁵⁷ radioaktiv markiertes Cyanocobalamin und mit I¹²⁵ radioaktiv markiertes Folat enthält und eine begrenzte Menge eines Doppelbindemittels, das einen immobilisierten Intrinsic-Factor und einen Folatbinder enthält.
Verwendung nach Anspruch 7, bei der die Ausstattung zusätzlich Holo-TCII enthaltende Referenzproben umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, bei der die Ausstattung zusätzlich Folat enthaltende Referenzproben umfasst.