DE68921650T2

DE68921650T2 - Immunoassays.

Info

Publication number: DE68921650T2
Application number: DE68921650T
Authority: DE
Inventors: Larry Chaney; Philip Mcmahon; Quentin Tonelli
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1988-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1995-10-26
Anticipated expiration: 2009-01-20
Also published as: EP0325449A3; DE68921650D1; CA1339723C; JPH01245157A; ATE120008T1; EP0325449B1; EP0325449A2; US5356785A

Description

Die Erfindung betrifft Immunanalyseverfahren zum Erfassen oder Messen von Substraten in flüssigen Proben, wie z.B. biologische Flüssigkeiten wie das gesamte Blut, Serum, Plasma und Urin.
Es wird üblicherweise eine große Bandbreite an Substanzen in biologischen Proben über Immunanalyseverfahren erfaßt oder gemessen; Beispiele dafür sind Hormone, Antikörper, Toxine und Drogen. Üblicherweise, obwohl nicht immer, werden entweder die Substanzen erfaßt, oder eine Substanz, die in ihrer Erfassunng verwendet wird, ist ein Antikörper, daher der Begriff "Immunanalyse". Der Antikörper ist ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars, und der andere Bestandteil des Bindungspaars wird einem Antigen oder Analyten zugeschrieben. Andere spezifische Bindungspaare neben den Antikörper-Antigen Paaren, die in Immunanalysen gemessen und verwendet werden, schließen Molekülpaare ein, die zueinander eine spezifische Bindungsaffinität haben, z.B. Hormon-Hormon Rezeptoren und Biotin-Avidin.
Immunanalysen werden im allgemeinen, zumindest teilweise auf festen Haltern, wie bspw. Glasfasermembranen durchgeführt. Die beiden meist verwendeten Formate für die Immunanalysen, die feste Halter benutzen, sind konkurrierende Formate und Sandwichformate. In einer typischen konkurrierenden Analyse ist die zu messende Substanz (der Analyt) eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, wie bspw. ein Drogenrest oder ein kleines Hormon mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100 bis ungefähr 2000; solche Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht eignen sich nicht gut für Sandwichanalysen, wie unten beschrieben wird. In der typischen konkurrierenden Analyse, wird ein Antikörper zu dem Analyten auf einem festen Halter unbeweglich gemacht, und die Probe, von der erwartet wird, daß sie den Analyten enthält, wird mit dem festen Halter in Kontakt gebracht. Zur gleichen oder zu einer späteren Zeit wird eine flüssige Lösung, die den bezeichneten Analyten enthält, in Kontakt mit dem Halter gebracht, so daß der bezeichnete und der in der Probe befindliche Analyt darum konkurrieren, sich an den unbeweglichen Antikörper zu binden. (Wenn die zu messende Substanz selbst ein Antikörper ist, kann der unbewegliche Analyt entweder ein Antikörper zu dem Antikörper oder ein Antigen sein, für das der Antikörper spezifisch ist.) Der feste Halter wird dann gewaschen und die Menge des Bezeichneten (Analyten) gemessen oder erfaßt, und zwar als inverse Messung des Analyten in der Probe. Typischerweise ist der bezeichnete Analyt eine chemolumineszente Substanz wie ein Radioisotop oder vorzugsweise ein Enzym, das im abschließenden Schritt mit einem farbenerzeugenden Substrat reagiert, das eine Farbintensität erzeugt, die invers zur betreffenden Menge des Analyten in der Probe ist. Ein typisches konkurrierendes Format ist bspw. in der US-PS- 4,540,659 von Litman et al. beschrieben. In der konkurrierenden Analyse von Litman et al. trägt der feste Halter zusätzlich zu der Tüpfelprobe etwas, was als "Kalibrierungsoberfläche" bezeichnet wird und vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise einen Antikörper zu der zu messenden Substanz beinhaltet, und was als "Standard für die Bestimmung des Signallevels von der Messungsoberfläche" dient (Spalte 3, Zeilen 14 bis 17). Die von Chandler et al. in Clinical Chemica Acta (1982) 121 225-230 beschriebene Vorrichtung enthält eine Vielzahl von verbundenen kapillaren Röhren, durch die eine Probe hindurchgeführt werden kann. Jedes Rohr testet auf ein anderes Schlangengift und es wird ein zusätzliches positives Kontrollrohr verwendet, um ein positives Resultat anzuzeigen. Auf ähnliche Weise kann die in der EP-217403 A offenbarte Einrichtung zur Festphasenanalyse vorzugsweise Kontrollen beinhalten, wie bspw. einen sichtbaren positiven Kontrollbereich, um ein negatives Resultat zur Erleichterung der Interpretation von den Testergebnissen anzuzeigen.
Sandwich-Immunanalysen (bspw. in der US-PS-4,376,110 von David et al. beschrieben) werden im allgemeinen verwendet, um zu messende Substanzen (Antigene, Analyten) mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 zu erfassen, z.B. Antikörper und andere Proteine. In einer typischen Sandwichanalyse wird ein erster zu analysierender Antikörper auf einem festen Halter unbeweglich gemacht, der dann mit einer flüssigen Probe in Kontakt gebracht wird, so daß sich ein in der Probe befindlicher Analyt an den Antikörper bindet. Ein zweiter, bezeichneter Antikörper für den Analyten wird dann hinzugegeben, der Halter wird gewaschen und die Menge an dem gebundenen Bezeichneten (Analyten) wird gemessen, wobei der gebundene Bezeichnete (Analyt) proportional zu Menge des Analyten in der Probe ist.
Der Sinn von einigen Immunanalysen ist ein Ergebnis gewesen, das nicht einfach positiv oder negativ ist, sondern das semi-quantitativ ist, das z.B. eine grobe, nicht ganz präzise Bewertung von der Menge eines in einer Probe befindlichen Analyten schafft. Bspw. beschreibt Chandler et al. in International Archives of Allergy and Applied Immunology 72. 267, 1983 eine semi-quantitative Immunanalyse für IgE in Plasma, die drei gläserne kapillare Röhren verwendet, die jeweils einen unbeweglich gemachten Antikörper, der spezifisch für IgE ist, beinhalten. Die EP-A-0165288 beschreibt eine kolorimetrische Immunanalyse, bei der die Testfarbe mit Vergleichsfarben verglichen wird, um ein semi-quantitatives Resultat zu erzielen. Litman et al. führt oben aus, daß "man die beobachteten Resultate quantifizieren kann in Beziehung zu den Verhältnissen, die man aus den bekannten Mengen des Analyten und der graphischen Darstellung der Veränderungen im Verhältnis des Signallevels über der Veränderung in der Konzentration erzielt".
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Arbeitsgerät für die semi-quantitative Messung von einem Analyten in einer flüssigen Probe mittels Immunanalyse. Das Arbeitsgerät hat einen festen Halter, der einen ersten Testbereich trägt, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine erste Menge von mindestens einem Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der erste Testbereich geeignet ist, um ein erstes Signal in der Immunanalyse zu produzieren, das reagierend zum Analyten in der Probe ist; und einen Referenzbereich (c), der ein Referenzsignal schafft, das unabhängig von der Menge des Analyten in der Probe ist, wobei der Referenzbereich einen bezeichneten Reaktanten umfaßt, der geeignet ist, um zur Schaffung des Referenzsignals mit einer in der Iinmunanalyse verwendeten Komponente zu reagieren. Erfindungsgemäß hat das Arbeitsgerät einen zweiten Testbereich, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine zweite Menge von mindestens einem Bestandteil des spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der zweite Testbereich geeignet ist, um ein zweites Signal in der Immunanalyse zu produzieren, das reagierend zur Menge des Analyten in der Probe ist, wobei das zweite Signal eine Intensität hat, die für eine gegebene Menge des Analyten in der Probe unterschiedlich zur Intensität des ersten Signals ist; und daß der bezeichnete Reaktant in einer Menge vorhanden ist, um eine vorbestimmte nachweisbare Referenzsignal-Intensität zu schaffen, die quantitativ auf die Intensitäten von denjenigen Signalen bezogen ist, die in Anwesenheit eines vorbestimmten Standard- Analytenlevels durch jeden Bereich erzeugt werden, und zwar gemäß der folgenden Beziehungen:
a) die Intensität des Referenzsignals ist nicht unterscheidbar von der Intensität eines der Tüpfelprobensignale und unterscheidbar von der Intensität des anderen Tüpfelprobensignals; und
b) die Intensität des Referenzsignals ist unterscheidbar über der Intensität des Signals von einer der Tüpfelproben und unterscheidbar unter der Intensität des Signals von der anderen Tüpfelprobe.
Die Anordnung ist derart, daß die Menge des in der Probe befindlichen Analyten relativ zum Standard-Analytenlevel bestimmt werden kann, indem die Intensität des erfassbaren Signals von dem Referenzbereich mit derjenigen von jedem Testbereich verglichen wird.
Die ersten und zweiten Testbereiche können unterschiedliche Mengen von demselben Bestandteil des spezifischen Bindungspaars umfassen. Die Mengen werden vorzugsweise derart ausgewählt, daß der erste, aber nicht der zweite Bereich ein erfassbares Signal erzeugt, das von signifikant geringerer Intensität ist als dasjenige von dem Referenzbereich (bspw. kann vom Referenzbereich mit dem Auge, ohne die Notwendigkeit von Instrumenten unterschieden werden), wenn die Probe eine erste Menge an dem ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar enthält. Beide Bereiche erzeugen erfassbare Signale, die von signifikant geringerer Intensität sind als dasjenige von dem Referenzbereich, wenn die Probe eine zweite, größere Menge an dem ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar enthält. Die Intensität des durch den ersten Testbereich erzeugten Signals kann in im wesentlichen linearer Weise variieren, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer Menge innerhalb eines ersten Bereichs enthält. Zum gleichen Zeitpunkt kann die Intensität von dem zweiten Signal, das durch den zweiten Testbereich erzeugt wird, ebenfalls in im wesentlichen linearer Weise variieren, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer Menge innerhalb eines zweiten, größeren Bereichs enthält. Die beiden Testbereiche sind am besten geeignet, um diese gewünschte lineare Beziehung zu den verschiedenen Bereichen zu zeigen, wenn die Mengen des Bindungspaar-Bestandteils in den Testbereichen derart ausgewählt werden, daß der erste Testbereich gesättigt ist, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer ersten Menge enthält, und der zweite Testbereich bei dieser ersten Menge nicht gesättigt ist, jedoch bei einer zweiten, größeren Menge gesättigt ist. Wenn große Mengenbereiche von dem ersten Bestandteil des spezifischen Bindungspaars von Interesse sind, kann der feste Halter natürlich mehr als zwei Testbereiche tragen, von denen jeder aufgrund der Tatsache, daß er eine unterschiedliche Menge des Bindungspaar-Bestandteils aufweist, eine unterschiedliche maximale Bindungskapazität für den ersten Bestandteil und damit einen größeren Bereich haben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Format der Immunanalyse vom konkurrierenden Typus. Weiterhin enthält das Arbeitsgerät vorzugsweise eine Lösung mit einem bezeichneten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar, das in einer geeigneten Menge vorhanden ist, um konkurrierend an den Paar- Bestandteil in den Testbereichen gebunden zu werden, wobei die Menge des bezeichneten Bestandteils, der sich an den Testbereich bindet, reduziert wird, wenn die Menge des Analyten in der Probe anwächst.
Der konkurrierende Test kann zwei Konfigurationen haben. In einer tragen die Halter-Testbereiche einen zweiten Bindungspaar- Bestandteil (bspw. einen Antikörper oder ein Rezeptor-Protein), und der bezeichnete und erste Bestandteil der Probe konkurrieren, um sich an die Testbereiche zu binden. In der zweiten Konfiguation tragen die Testbereiche einen ersten Bindungs Bestandteil, der mit dem ersten Bindungs-Bestandteil in der Probe konkurriert, um den bezeichneten zweiten Bindungs-Bestandteil zu binden; wobei der erste Bindungs-Bestandteil in der Probe den bezeichneten zweiten Bestandteil bindet, wodurch die Signalerzeugung durch das Binden an die Testbereiche abnimmt.
Die konkurrierende Immunanalyse gemäß der Erfindung schafft semi-quantitative Resultate ohne die Notwendigkeit der Ausführung von Standards und des Vergleichs eines Testergebnisses mit solchen Standards. Weiterhin gestattet es die Analyse, daß das semi-quantitative Resultat nur mit einer Zugabe der Probe in die Testvorrichtung erzielt werden kann, wodurch ein einfaches, bequemes Testverfahren geschaffen wird. Zusätzlich dazu kann als Bezeichneter (Analyt) ein Enzym verwendet werden, das mit einem farberzeugenden Substrat reagiert, wodurch das semi-quantitative Resultat mit dem Auge abgelesen werden kann, ohne daß ein Radioisotopen-Zähler oder eine ander Vorrichtung nötig ist. Der Referenzbereich enthält Antikörper zu dem Enzym, jedoch keine ersten oder zweiten Bestandteile von dem spezifischen Bindungspaar, und wird dadurch bei jedem Test gefärbt, und zwar durch die enzym-bezeichneten ersten und zweiten Bindungspaar-Bestandteile, die sich in dem Referenzbereich an den Anti-Enzym-Antikörper binden. Weil der Referenzbereich den ersten und zweiten Bestandteil von dem Bindungspaar nicht enthält, ist seine Farbänderung unabhängig von der Menge an dem ersten spezifischen Bindungs-Bestandteil in der Probe. Weiterhin schafft der Referenzbereich eine Kontrolle für Menge-Menge Variationen im Enzym- oder Farberzeugungssubstrat, weil die Farbänderung, so wie die Farbänderung in den Testbereichen, ein Produkt der Wirkung von diesen Reagenzien ist.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur semi-quantitativen Messung eines Analyten in einer flüssigen Probe mittels konkurrierender Immunanalyse gerichtet, um die Menge eines Analyten in der Probe relativ zu einem vorbestimmten Standard- Analytenlevel zu bestimen, wobei der Analyt einen ersten Bestandteil von einem spezifischen Bindungspaar umfaßt, das den ersten Bestandteil und einen zweiten Bestandteil umfaßt, die sich auf spezifische Weise aneinander binden, wobei das Verfahren die Merkmale vorsieht, Schaffung eines festen Halters, der einen ersten Testbereich trägt, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine erste Menge von mindestens einem Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der erste Testbereich ein erstes Signal in der Immunanalyse produziert, das reagierend zum Analyten in der Probe ist; und eines Referenzbereichs (c), der ein Referenzsignal schafft, das unabhängig von der Menge des Analyten in der Probe ist, wobei der Referenzbereich einen bezeichneten Reaktanten umfaßt, der zur Schaffung des Referenzsignals mit einer in der Immunanalyse verwendeten Komponente reagiert. In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein zweiter Testbereich vorgesehen, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine zweite Menge von mindestens einem Bestandteil des spezifischen Bindungspaars umfaßt und ein zweites Signal in der Immunanalyse produziert, das reagierend zur Menge des Analyten in der Probe ist, wobei das zweite Signal eine Intensität hat, die für eine gegebene Menge des Analyten in der Probe unterschiedlich zur Intensität des ersten Signals ist. In übereinstimmung mit dem obigen Arbeitsgerät ist der bezeichnete Reaktant in einer Menge vorhanden, um eine vorbestimmte nachweisbare Referenzsignal-Intensität zu schaffen, die quantitativ auf die Intensitäten von jedem der Signallevel bezogen ist, die durch die Testbereiche erzeugt werden in Anwesenheit eines vorbestimmten Standard-Analytlevels, und zwar gemäß einer der folgenden Beziehungen:
a) die Intensität des Referenzsignals ist nicht unterscheidbar von der Intensität eines der Tüpfelprobensignale und unterscheidbar von der Intensität des anderen Tüpfelprobensignals; und
b) die Intensität des Referenzsignals ist unterscheidbar über der Intensität des Signals von einer der Tüpfelproben und unterscheidbar unter der Intensität des Signals von der anderen Tüpfelprobe.
Wiederum kann die Intensität des erfassbaren Signals von dem Referenzbereich mit der Intensität der erfassbaren Signale von den Testbereichen in Anwesenheit einer unbekannten Menge des Analyten in der Probe verglichen werden, um die Menge des Analyten in der Probe relativ zum Standard-Analytenlevel zu bestimmen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ersichtlich, wobei:
Fig.1 eine perspektivische Explosionsansicht einer Vorrichtung zur Verwendung der Erfindung ist.
Fig.2 die schematische Ansicht eines festen Halters (18, Fig.1) gemäß der Erfindung zur Verwendung in einer konkurrierenden Analyse ist, der einen Referenzbereich und drei Testbereiche trägt.
Fig.3 eine schematische Darstellung der Reaktion auf dem festen Halter gemäß Fig.2 auf verschiedene Konzentrationen einer Substanz in einer Probe ist.
Fig.4 ein Diagramm ist, das die Reaktion der drei Testbereiche auf den Haltern von Fig.2 auf die verschiedenen Konzentrationen eines Substrats (Pferde-Progesteron) zeigt.
Fig.5 die schematische Darstellung einer Membran zur Verwendung in einer Sandwich-Immunanalyse gemäß der Erfindung ist.
Fig.6 die schematische Darstellung der Analyseergebnisse ist, die durch die Verwendung der Membran aus Fig.5 erzielt werden.
Fig.7 eine schematische Darstellung einer Membran zur Verwendung in einer Sandwich-Immunanalyse gemäß der Erfindung ist.
Fig.8 die schematische Darstellung der Analyseergebnisse ist, die durch die Verwendung der Membran aus Fig.7 erzielt werden.

Vorrichtung für die konkurrierende Immunanalvse

Unter Bezugnahme auf Fig.1 besteht die Testvorrichtung 10 im allgemeinen aus der Konfiguration, die in der US-PS-4,376,110 beschrieben ist, die hierdurch unter Bezugnahme einbezogen ist. Die Vorrichtung 10 ist geeignet für die Messung von Progesteron in Stutenserum und enthält einen Kunststoffbecher 12, in dem ein Abschlußteil 14 plaziert ist, das absorbierendes Material enthält, welches von der American Filtrona Corporation geliefert wird, und daß eine poröse Polyethylen-Scheibe 16 und eine Glasfasermembran 18 (Porengröße 1 Mikron, bezogen von Gelman Sciences) trägt. Ein Vorfilter 26 (der gleiche wie die Membran 18) ist zwischen der Testmembran 18 und einem Kunststoffdeckel 30 positioniert. Der Filter 26 ist entfernbar, so daß die Testresultate auf der Testmembran 18 gelesen werden können. Zusätzlich zur Vorrichtung 10 ist ein Wischer 32 vorgesehen, der eine Wischerhülse 34 und einen Griff 36 umfaßt. Der Wischer 32 hat die Funktion, die vorher angefeuchtete Membran 18 zu Beginn der Analyse zu setzen.
Gemäß Fig.2 trägt die Membran 18 einen Referenztüpfel C und, wenn eine semi-quantitative Analyse durchgeführt werden soll, mehrere Tüpfelproben 1, 2 und 3, von denen jede eine unterschiedliche Konzentration von Latexpartikeln enthält, die mit einem monoklonalen Antikörper eines Anti-Pferde-Progesterons (Immunosearch, Toms River, N.J.) beschichtet sind. Zum Beladen werden die Polystyren-Latex-Partikel in einen Phosphatpuffer gehängt, der den Antikörper enthält, werden gewaschen und dann wieder in den Phosphatpuffer gehängt, um auf die Membran 18 geträufelt zu werden. Jede Herstellung des mit Antikörpern beschichteten Partikels wird vor dem Abträufeln mit Latekpartikein verdünnt, die mit dem neutralen Protein Rinder-Serum- Albumin (BSA) beschichtet sind, so daß die auf Prozent bezogenen Antikörperpartikel in den Tüpfeln betragen: Tüpfel 1, 60%; Tüpfel 2, 50%; und Tüpfel 3, 40%. Die Konzentration der Antikörper ist derart ausgewählt, daß Tüpfel 1 gesättigt ist, wenn die Serumprobe 1 ng/ml Progesteron enthält, Tüpfel 2 bei 5 ng/ml gesättigt ist und Tüpfel 3 bei 10 ng/ml gesättigt ist. Wenn die Analyse nicht semi-quantitativ (wie oben beschrieben) ist, sondern zum Zwecke der Bestimmung gedacht ist, ob Progesteron in der Probe in einer Menge, die größer ist als die physiologisch signifikante Menge (z.B. 4 ng/ml), vorhanden ist, dann trägt die Membran 18 nur eine Tüpfelprobe, die den signifikanten Farbintensitätswechsel nur unterschreitet, wenn das Progesteron in der Probe in einer Menge vorhanden ist, die größer ist als der physiologisch signifikante Level. Der Referenztüpfel C enthält Latexpartikel, die wie oben mit einem Antikörper zu dem bezeichneten Enzym, Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Accurate Chemicals) beschichtet sind. Über dem Referenztüpfel C ist ein Orientierungspunkt 24 angeordnet. Als Alternative zur Verwendung von Latexpartikeln können die Antikörper direkt auf die Membran 18 geträufelt werden, entweder passiv absorbiert oder durch chemische Kreuzverbindung.

Betrieb der semi-quantitativen konkurrierenden Analyse

Unter erneuter Bezugnahme auf Fig.1 wird die Membran 18 vorbefeuchtet mit einigen Tropfen einer Waschlösung, die 0.25-1 M Natriumchlorid, 2% Trockenmilch, 5% Rinder-Serum-Albumin und Konservierungsstoffe enthält. 10 bis 15 Tropfen des Serums werden dann auf die Membran 18 aufgebracht und diesen wird gestattet, für fünf Minuten zu reagieren, damit sich in der Probe vorhandenes Progesteron an die Antikörper in den Tüpfelproben 1, 2 und 3 binden kann. Der Becher 30 und der Vorfilter 26 werden dann entfernt und es wird eine Waschlösung zugegeben, und dann werden drei bis vier Tropfen des HRP-bezeichneten Progesterons (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo) zugegeben; dieser bezeichnete Analyt bindet sich an jeden Antikörper in den Tüpfelproben 1, 2 und 3, die nicht an das Progesteron in der Probe gebunden sind. Das bezeichnete Progesteron kann für eine Minute reagieren, die Membran wird erneut mit der Waschlösung gewaschen, und dann werden drei bis vier Tropfen des farberzeugenden Substrats Tetramethylbenzidin zugegeben und können für eine Minute reagieren, wodurch sich die Farbe verändert. Dann werden 10 bis 15 Tropfen einer Standard-Stop-Lösung zugegeben, wodurch die Analyse komplettiert wird.
Fig.3 zeigt die Ergebnisse der Tests, die mit Lösungen durchgeführt wurden, die vier verschiedene progressiv größere Konzentrationen von Pferde-Progesteron enthielten. Auf jeder der vier gezeigten Membranen hat der Tüpfel C den gleichen Grad an Farbänderung unterschritten, und zwar unabhängig von der Konzentration des Progesterons in der Probe. Auf der Membran A, die mit einer Probe behandelt wurde, die weniger als eine Einheit (1 ng/ml) an Progesteron enthielt, ist der Referenztüpfel C heller als alle drei Tüpfelproben. Auf Membran B, die mit einer Probe behandelt wurde, die eine Einheit an Progesteron enthielt, zeigt der Referenztüpfel C die gleiche Färbung wie die Tüpfelprobe 1, jedoch eine hellere Färbung als die Tüpfelproben 2 und 3. Die Membran C, die mit einer Probe behandelt wurde, die zwischen einer und fünf Einheiten an Progesteron enthielt, zeigt, daß der Referenztüpfel heller als die Tüpfelproben 1 und 2, jedoch dunkler als die Tüpfelprobe 3 ist. Auf Membran D, die mit einer Probe behandelt wurde, die fünf Einheiten an Progesteron enthielt, hat der Referenztüpfel C die gleiche Farbe wie die Tüpfelprobe 2, und ist dunkler als die Tüpfelprobe 1 und heller als die Tüpfelprobe 3. Auf Membran E, die mit einer Probe behandelt wurde, die zwischen fünf unf zehn Einheiten an Progesteron enthielt, ist der Tüpfel C dunkler als die Tüpfel 1 und 2, jedoch heller als Tüpfel 3. Auf Membran F, die mit einer Probe behandelt wurde, die zehn Einheiten an Progesteron enthielt, hat der Tüpfel C die gleiche Intensität wie Tüpfel 3, ist jedoch dunkler als die Tüpfel 1 und 2. Auf Membran G, die mit einer Probe behandelt wurde, die mehr als zehn Einheiten an Progesteron enthielt, ist der Tüpfel C dunkler als alle drei Tüpfelproben.
Die Kapazität der drei Tüpfelproben 1, 2 und 3, um auf die gleiche Konzentration an Progesteron unterschiedlich zu reagieren, ist in Fig.4 dargestellt. Diese zeigt, daß für jeden Tüpfel eine unterschiedliche Konzentration an Progesteron in der Probe erforderlich ist, um einen linearen Abfall in der Farbintensität zu erzeugen. Fig.4 zeigt, daß die Tüpfelprobe 1 genügend Antikörper enthält, so daß der Farbintensitätsabfall von 50 auf 20 Einheiten im wesentlichen linear über der Konzentration von 1 bis 5 ng/ml an Progesteron verläuft; der Farbintensitätsabfall von 50 auf 20 Einheiten der Tüpfelprobe 2 ist im wesentlichen linear über einer Progesteronkonzentration zwischen 5 und 10 ng/ml; und ein Farbintensitätsabfall von 50 auf 20 Einheiten für die Tüpfelprobe 3 ist im wesentlichen linear für eine Progesteronkonzentration zwischen 10 und 15 ng/ml.
Somit schafft der Vergleich der Farbintensität der Tüpfelproben mit derjenigen von dem Referenztüpfel eine semi-quantitative Anzeige von der Menge an Progesteron in der Testprobe. Dies ist für dieses Hormon von großer Bedeutung, weil sein Level als Anzeige für die Empfängnisbereitschaft und die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft bei Pferden dient. Bei einer schwangeren Stute zeigt ein Serum-Progesteron-Level von über ca. 4 ng/ml an, daß die Schwangerschaft aufrechterhalten wird, während ein Level unter 4 ng/ml anzeigt, daß es ein Problem mit der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft gibt und daß eine korrigierende Maßnahme erforderlich ist. Im Falle einer Stute, die nicht schwanger ist, zeigt ein Serum-Progesterton-Level unter ca.1 ng/ml die Empfängnisbereitschaft an, z.B. daß die Stute bereit zur Fortpflanzung ist. Weil jede Stute ihre eigene unterschiedliche Physiologie hat, ist es zusätzlich zu diesen generellen Prinzipien für jede sich fortpflanzende Stute bedeutsam, die Progesteron-Level über die Zeit zu verfolgen, um ein historisches Profil des Hormonzyklus von der Stute zu erzielen, so daß das Decken und die Aufrechterhaltung von der Schwangerschaft optimiert werden kann.
Wie oben ausgeführt wurde, können die Tüpfelproben lieber Progesterase als Antikörper enthalten. In diesem Fall wird ein bezeichneter Antikörper zu Progesteron verwendet.

Betrieb einer konkurrierenden Einzeltüpfelanalyse

Wenn die Membran 18 nur eine Tüpfelprobe trägt, die Progesteron oder einen Anti-Progesteron-Antikörper in solch einer Menge enthält, daß der signifikante Farbwechsel nur durchgemacht wird, wenn der Progesteron-Level in der Probe über dem physiologisch signifikanten Level liegt, wird die Analyse wie oben beschrieben ausgeführt, außer das die Membran 18 nur eine Tüpfelprobe trägt.

Vorrichtung für die Sandwich-Immunanalyse

Die in Fig.1 dargestellte Vorrichtung wird ebenfalls bei der Sandwich-Analyse verwendet, außer das die Membran 18 durch die Membran 38 ersetzt wird, wie dies in Fig.5 dargestellt ist. Die Membran 38 ist geeignet, um eine semi-quantitative Messung von Pferde IgG in Fohlenserum vorzusehen. Die Vorrichtung, einschließlich der Membran 38, ist kommerziell erhältlich bei Agritech Systems, Inc, 100 Fore Street, Portland, Maine und wird unter dem Warenzeichen CITE verkauft. Der Tüpfel S auf der Membran 38, der unter dem Orientierungspunkt 40 angeordnet ist, umfaßt Latexpartikel, die mit dem Antikörper zum Pferde IgG (Jackson, Immunoresearch, P.O.Box 683, Avondale, Pa) beschichtet sind. Kalibrierungstüpfel 1, 2 und 3 enthalten keinen Anti-IgG- Antikörper, aber jeweils Pferde IgG äquivalent zur Menge, die durch den Tüpfel S aus einer 200 mg/dl, 400 mg/dl und 800 mg/dl - Probe erhalten worden ist, das auf Latexpartikeln aufgeschichtet ist. Der Antikörper zum Pferde IgG, der ebenfalls aus einer Anzahl von Quellen kommerziell erhältlich ist, wird auf die Latexpartikel aufgeladen, wie dies oben für das Pferde-Progesteron beschrieben worden ist.

Betrieb der semi-quantitativen Sandwich-Analyse

Die Vorrichtung gemäß Fig.1, einschließlich der Membran 38, wird in Verbindung mit Serum, Plasma oder anti-koagulierten Gesamtblut - Proben, die von Fohlen entnommen worden sind, verwendet. Wegen der Unterschiede im Hämatokrit unter den Fohlen ist es vorteilhaft, Serum oder Plasma zu verwenden, das entweder frisch oder vorher eingefroren sein kann. Wenn Gesamtblut verwendet wird, muß dieses vor der Analyse mit Heparin, EDTA oder Zitrat anti-koaguliert werden. Hämolisierte Proben können ohne das Risiko falscher Positiver verwendet werden.
Zwei ml von Fohlenplasma oder -serum werden in eine kapillare Mikrotitrierpipette eingefüllt, und überschüssiges Probenmaterial wird von der Außenseite der Pipette abgewischt. Die Probe wird dann in einen Behälter eingeführt, der einen Standard-Phosphatpuffer mit 5% BSA enthält, was die Probe verdünnt, diese wird gemischt und zehn Tropfen der verdünnten Probe werden dann über die Pipette in das Zentrum der Analysevorrichtung aus Fig.1 zugeführt. Die Probe kann mit der Membran 38 für 3 Minuten reagieren, und danach werden 4 Tropfen einer Lösung hinzugefügt, die einen zweiten Anti-Pferde IgG-Antikörper enthält, der paarweise mit dem Enzym Alkalin-Phosphatase verbunden ist. (Der Anti-Pferde IgG-Antikörper, der paarweise mit Alkalin-Phosphatase verbunden ist, ist bei Jackson, Immunoresearch, Avondale, PA. erhältlich) Dieser zweite, bezeichnete Antikörper bindet jedes Pferde IgG, daß durch den Referenztüpfel S festgehalten wird und auch dasjenige, das vorher auf die Tüpfel 1, 2 und 3 aufgeschichtet worden ist. Die Reaktion kann für 2 Minuten ablaufen, und nach dieser Zeit werden 5 bis 10 Tropfen einer Waschlösung (Zusammensetzung wie oben beschrieben) hinzugegeben. Der Behälter 12 ist dann fast mit Waschlösung vollgefüllt. und, nachdem die Waschlösung von dem Absorbens 14 komplett absorbiert worden ist (zu diesem Zeitpunkt sollte die gesamte blaue Farbe aus der mit dem Enzym konjugierten Lösung ausgewaschen sein), werden 4 Tropfen des farberzeugenden Substrats für Alkalin-Phosphatase (Indoxyl Phosphat, JBL Scientific, CA) hinzugegeben. Die Substratlösung kann drei Minuten lang stehen, so daß sich die Farbe vollständig entwickeln kann, und nach dieser Zeit wird die Membran 38 inspiziert, so daß das IgG Level in der Probe bestimmt werden kann.
Fig.6 zeigt die Ergebnisse, die mit 6 verschiedenen Konzentrationen des Pferde IgG erzielt worden sind. Auf jeder der 6 Membranen A bis F haben die Kalibrierungstüpfel 1, 2 und 3 in der gleichen Weise reagiert, z.B. Tüpfel 1 ist korrespondierend zu 200 mg/dl IgG der hellste, Tüpfel 2 ist korrespondierend zu 400 mg/dl IgG der nächst dunklere und Tüpfel 3 ist korrespondierend zu 800 mg/dl IgG der dunkelste der drei; die Intensität von jedem Tüpfel ist wie oben erklärt unabhängig von der IgG Konzentration in der Probe, wenn die Tüpfel IgG enthalten, jedoch keinen Antikörper zu IgG. Auf der Membran A bleibt der Probentüpfel weiß oder ist heller als der Kalibrierungstüpfel 1, was anzeigt, daß die Probe weniger als 200 mg/dl an Pferde IgG enthält; Auf Membran B ist der Probentüpfel dunkler als der Kalibrierungstüpfel 1, jedoch heller als der Kalibrierungstüpfel 2, was anzeigt, daß die IgG Konzentration zwischen 200 mg/dl und 400 mg/dl liegt; Auf Membran C ist die Farbintensität des Probentüpfels gleich der Intensität von dem Kalibrierungstüpfel 2, was eine IgG Konzentration von 400 mg/dl anzeigt; Auf Membran D ist der Probentüpfel dunkler als der Kalibrierungstüpfel 2, jedoch heller als der Kalibrierungstüpfel 3, was anzeigt, daß die IgG Konzentration zwischen 400 und 800 mg/dl liegt; Auf Membran E ist der Probentüpfel gleich der Intensität von dem Kalibrierungstüpfel 3, was eine IgG Konzentration von 800 mg/dl anzeigt; Und auf Membran F ist der Probentüpfel dunkler als der Kalibrierungstüpfel 3, was eine IgG Konzentration von mehr als 800 mg/dl anzeigt.
Der dargestellte Test ist von großer Bedeutung bei der Überwachung des Immunstatus von Fohlen, die geboren werden mit einer geringen oder keiner Zirkulation von Immunglobulin. Die Immunität von Neugebohrenen gegen infektiöse Keime erfordert die Aufnahme und Absorption von mütterlichen Antikörpern des Colostrums. Ein Fehlen oder eine passive Übertragung kann sich ergeben als Resultat aus verfrühtem Stillen, mangelhaftem Säugen, fehlerhafter Absorption oder geringen Leveln an IgG im Colostrum. Das teilweise oder gesamte Fehlen der Immunübertragung ereignet sich bei 10 bis 25% aller Fohlen, und diese Tiere sind einem hohen Risiko für ernste Krankheiten oder den Tod ausgesetzt. Als adäquates Immunlevel wird mehr als 800 mg an IgG in 100 ml Serum angesehen. Level zwischen 400 und 800 mg/dl können adäquat sein, aber Fohlen mit diesem Level sind einem möglichen Risiko ausgesetzt. IgG Level zwischen 200 und 400 mg/dl zeigen das teilweise Fehlen der Immunübertragung an, während Konzentrationen von weniger als 200 mg/dl das totale Fehlen anzeigen. Ein schnelles Erkennen von geringen IgG Leveln ist wesentlich für den schnellen Beginn der Behandlung von Fohlen mit Immunmängeln. Weiterhin gestattet das Nachbehandlungs-Testen eine Bewertung des Erfolgs von der IgG Zugabe in Zeitabständen.

Vorrichtung für die semi-quantitative Sandwich-Immunanalyse (Alternative Konfiguration)

Unter Bezugnahme auf Fig.7 verwendet die alternative semi-quantitative Immunanalyse die Vorrichtung aus Fig.1, und anstelle der Membran 38 (Fig.5), die oben beschrieben wurde, wird eine Membran 42 verwendet, die einen Orientierungspunkt 44, einen positiven Kontrolltüpfel C und Tüpfelproben 1 und 2 trägt; die Membran 42 ist geeignet, um zum Beurteilen von IgG Leveln in Fohlenserum verwendet zu werden. Die Tüpfelprobe 1 enthält ungefähr 60% Latexpartikel, die mit einem Anti-Pferde IgG-Antikörper beschichtet sind (die anderen 40% sind BSA beschichtete Partikel), während die Tüpfelprobe 2 ungefähr 5% an mit Antikörpern beschichteten Latexpartikeln enthält. Wegen der hohen Konzentration von Antikörpern in der Tüpfelprobe 1 wird sich eine vorteilhafte Reaktionskinetik einstellen, und es wird sich eine wesentliche Farbreaktion entwickeln (mehr als 50% des Potentials), selbst bei Anwesenheit von weniger als 400 mg/dl an IgG. Wegen der unvorteilhaften Reaktionskinetik in der Tüpfelprobe 2, die von der geringen Antikörper-Konzentration herrührt, wird eine IgG Konzentration von weniger als 400 mg/dl in der Probe keine wesentliche Farbentwicklung erzeugen, und für solch eine Entwicklung ist eine höhere Konzentration erforderlich.
Der positive Kontrolltüpfel C enthält keine Antikörper zu der IgG des Fohlens, sondern nur Latexpartikel, die mit Antikörpern zu HRP beschichtet sind; die einzige Funktion des Tüpfels 44 ist es, als Indikator dafür zu dienen, daß das farberzeugende System in Betrieb ist (das Fehlen von Farbe in dem Tüpfel zeigt eine fehlerhafte Analyse an).

Betrieb der alternativen Sandwich-Immunanalyse

Die alternative Sandwich-Immunanalyse für Pferde IgG wird wie oben beschrieben ausgeführt, außer das anstelle der Membran 38 die Membran 42 (Fig.7) verwendet wird.
Typische Ergebnisse der Analyse sind in Fig.8 dargestellt. Auf allen drei Membranen A, B und C trägt der positive Kontrolltüpfel eine dunkle Farbe, die anzeigt, daß die Analysereagenzien in Betrieb sind. Auf Membran A hat weder die Tüpfelprobe 1 noch die Probe 2 eine veränderte Farbe, was das Fehlen in der Probe des Fohlenserums anzeigt. Auf der Membran B hat die Tüpfelprobe 1, die stark mit Antikörpern beladen ist, eine entwickelte dunkle Farbe, während die Tüpfelprobe 2, die nur wenige Antikörper trägt, nur eine leichte Farbentwicklung aufweist. Dies zeigt an, daß ein geringer Level an IgG, z.B. < 400 mg/dl in der Probe vorhanden ist. Auf Membran C haben beide Tüpfelproben 1 und 2 eine dunkle Farbe entwickelt, was anzeigt, daß die Probe eine hohe Konzentration an IgG, z.B. mehr als 400 mg/dl enthält.

Andere Ausführungsformen

Andere Ausführungsformen ergeben sich aus den Ansprüchen. Bspw. kann bei jeder der obengenannten Analysen, die mehrere Referenz-, Test- oder Kalibrierungstüpfel haben, die Anzahl der Tüpfel größer sein als in den Beispielen dargestellt ist. Zusätzlich dazu kann eine Haltermembran Antigene und Antikörper tragen, wodurch sie geignet ist, um mehr als einen Analyten zu messen. So können bspw. zur gleichen Zeit zwei oder mehr Drogen, Toxine, Proteine oder Antikörper erfaßt werden. Es kann jede Variation von Bezeichneten (Analyten) verwendet werden, die maschinenlesbare Signal-Erzeugungs-Systeme, z .B. Radioisotope einschließen, obwohl Enzym-farberzeugende Systeme am meisten bevorzugt sind, da sie die Verwendung von Instrumenten zum Lesen der Ergebnisse überflüssig machen. Die Membranen können aus anderen natürlichen oder synthetischen Fasern, z.B. Nylon hergestellt werden.

Claims

1.Arbeitsgerät für die semi-quantitative Messung von einem Analyten in einer flüssigen Probe mittels Imunanalyse, mit einem festen Halter (18), der einen ersten Testbereich trägt, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine erste Menge von mindestens einem Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der erste Testbereich geeignet ist, um ein erstes Signal in der Imunanalyse zu produzieren, das reagierend zum Analyten in der Probe ist; und einem Referenzbereich (c), der ein Referenzsignal schafft, das unabhängig von der Menge des Analyten in der Probe ist, wobei der Referenzbereich einen bezeichneten Reaktanten umfaßt, der geeignet ist, um zur Schaffung des Refernzsignals mit einer in der Imunanalyse verwendeten Komponente zu reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß das Arbeitsgerät einen zweiten Testbereich aufweist, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine zweite Menge von mindestens einem Bestandteil des spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der zweite Testbereich geeignet ist, um ein zweites Signal in der Imunanalyse zu produzieren, das reagierend zur Menge des Analyten in der Probe ist, wobei das zweite Signal eine Intensität hat, die für eine gegebene Menge des Analyten in der Probe unterschiedlich zur Intensität des ersten Signals ist; und daß der bezeichnete Reaktant in einer Menge vorhanden ist, um eine vorbestimmte nachweisbare Referenzsignal-Intensität zu schaffen, die quantitativ auf die Intensitäten von denjenigen Signalen bezogen ist, die in Anwesenheit eines vorbestimmten Standard-Analytenlevels durch jeden Bereich erzeugt werden, und zwar gemäß einer der folgenden Beziehungen:

a) die Intensität des Referenzsignals ist nicht unterscheidbar von der Intensität eines der Tüpfelprobensignale und unterscheidbar von der Intensität des anderen Tüpfelprobensignals; und

b) die Intensität des Refernzsignals ist unterscheidbar über der Intensität des Signals von einer der Tüpfelproben und unterscheidbar unter der Intensität des Signals von der anderen Tüpfelprobe;

wobei die Intensität des nachweisbaren Signals vom Referenzbereich (c) verglichen werden kann mit der Intensität der nachweisbaren Signale von jedem Testbereich in Anwesenheit einer unbekannten Menge des Analyten in einer Probe, um die Menge des Analyten in solch einer Probe relativ zum Standard-Analytenlevel zu bestimmen.

2.Arbeitsgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Testbereich unterschiedliche Mengen des gleichen Bestandteils von dem spezifischen Bindungspaar umfaßt, daß die Mengen derart ausgewählt werden, daß der erste Bereich (1), nicht jedoch der zweite Bereich (2), ein nachweisbares Signal mit einer geringeren Intensität als derjenigen des Referenzbereichs (c) erzeugt, wenn die Probe eine erste Konzentration des Analyten enthält, und daß beide Bereiche (1,2) nachweisbare Signale erzeugen, die eine geringere Intensität haben als dasjenige des Referenzbereichs (c), wenn die Probe eine zweite Konzentration des Analyten enthält, die größer als die erste Konzentration ist.

3.Arbeitsgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Imunanalyse eine konkurrierende Imunanalyse ist.

4.Arbeitsgerät nach Anspruch 2 oder 3 einschließlich einer Lösung mit einem bezeichneten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar, das in einer geeigneten Menge vorhanden ist, um konkurrierend an den Paarbestandteil in den Testbereichen gebunden zu werden, wobei die Menge des bezeichneten Bestandteils, das sich an den Testbereich bindet, reduziert wird, wenn die Menge des Analyten in der Probe anwächst.

5.Arbeitsgerät nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Testbereiche (1,2) jeweils den zweiten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar umfassen, der sich unbeweglich gemacht auf dem Halter (18) befindet, und daß das Arbeitsgerät weiterhin den ersten Bestandteil von dem Bindungspaar umfaßt, der mit einem Enzym bezeichnet ist, daß der Referenzbereich (c) Antikörper zu diesem Enzym umfaßt und frei ist von Molekülen, die auf spezifische Weise den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar binden, wobei die Imunanalyse eine Enzym-Imunanalyse ist, bei der der erste Enzym-bezeichnete Bestandteil des spezifischen Bindungspaars mit dem ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar konkurriert, der in der Probe vorhanden ist, um den zweiten Bestandteil des spezifischen Bindungspaars in dem ersten und zweiten Testbereich zu binden.

6.Arbeitsgerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Bestandteil von dem Bindungspaar unbeweglich gemacht in dem ersten Testbereich (1) ist und zwar in einer Menge, die durch den ersten Bestandteil in der Probe gesättigt ist, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer ersten Menge enthält; und daß der zweite Bestandteil von dem Bindungspaar unbeweglich gemacht in dem zweiten Testbereich (2) ist und zwar in einer Menge, die durch den ersten Bestandteil in der Probe nicht gesättigt ist, wenn die Probe den Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in der ersten Menge enthält, die aber durch den ersten Bestandteil in der Probe gesättigt ist, wenn dieser in einer zweiten, größeren Menge vorhanden ist.

7.Arbeitsgerät nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Testbereiche (1,2) jeweils den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar umfassen, der sich unbeweglich gemacht auf dem Halter (18) befindet, und daß das Arbeitsgerät weiterhin den zweiten Bestandteil von dem Bindungspaar umfaßt, der mit einem Enzym bezeichnet ist, daß der Referenzbereich (c) Antikörper zu diesem Enzym umfaßt und frei ist vom ersten Bestandteil des Bindungspaars,

wobei die Imunanalyse eine Enzym-Imunanalyse ist, bei der der erste Bestandteil des spezifischen Bindungspaars, das sich unbeweglich gemacht auf dem Halter (18) befindet, mit dem ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar konkurriert, der in der Probe vorhanden ist, um den Enzym-bezeichneten zweiten Bestandteil des spezifischen Bindungspaars in dem ersten und zweiten Testbereich zu binden.

8.Arbeitgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensität des Signals, das durch den ersten Testbereich (1) erzeugt wird, im wesentlichen in linearer Weise variiert, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer Menge innerhalb eines ersten Bereichs enthält, und daß die Intensität des Signals, das durch den zweiten Testbereich (2) erzeugt wird, im wesentlichen in linearer Weise variiert, wenn die Probe den ersten Bestandteil von dem spezifischen Bindungspaar in einer Menge innerhalb eines zweiten, größeren Bereichs enthält.

9.Arbeitsgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Bindungspaar ein Hormon ist.

10.Arbeitsgerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Hormon Pferde-Progesteron ist.

11.Arbeitsgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Signal ein sichtbares Signal ist, daß das zweite Signal ein sichtbares Signal mit im wesentlichen gleicher Farbe wie beim ersten Signal ist, und daß das vorbestimmte nachweisbare Referenzsignal ein sichtbares Signal mit im wesentlichen gleicher Farbe wie beim ersten und zweiten Signal ist.

12.Verfahren für die semi-quantitative Messung von einem Analyten in einer flüssigen Probe mittels konkurrierender Imunanalyse zur Bestimmung der Menge eines Analyten in der Probe in Relation zu einem vorbestimmten Standard-Analytenlevel, wobei der Analyt einen ersten Bestandteil von einem spezifischen Bindungspaar umfaßt, das den ersten Bestandteil und einen zweiten Bestandteil umfaßt, die sich auf spezifische Weise aneinander binden, wobei das Verfahren die Merkmale vorsieht,

Schaffung eines festen Halters (18), der einen ersten Testbereich trägt, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine erste Menge von mindestens einem Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars umfaßt, wobei der erste Testbereich ein erstes Signal in der Imunanalyse zu produziert, das reagierend zum Analyten in der Probe ist; und eines Referenzbereichs (c), der ein Referenzsignal schafft, das unabhängig von der Menge des Analyten in der Probe ist, wobei der Referenzbereich einen bezeichneten Reaktanten umfaßt, der zur Schaffung des Referenzsignals mit einer in der Imunanalyse verwendeten Komponente reagiert,

dadurch gekennzeichnet,

daß ein zweiter Testbereich (2) vorgesehen ist, der freiliegt, um eine Probe aufzunehmen und der eine zweite Menge von mindestens einem Bestandteil des spezifischen Bindungspaars umfaßt und ein zweites Signal in der Imunanalyse produziert, das reagierend zur Menge des Analyten in der Probe ist, wobei das zweite Signal eine Intensität hat, die für eine gegebene Menge des Analyten in der Probe unterschiedlich zur Intensität des ersten Signals ist;

und daß der bezeichnete Reaktant in einer Menge vorhanden ist, um eine vorbestimmte nachweisbare Referenzsignal-Intensität zu schaffen, die quantitativ auf die Intensitäten von jedem der Signallevel bezogen ist, die durch die Testbereiche erzeugt werden in Anwesenheit eines vorbestimmten Standard-Analytlevels, und zwar gemäß einer der folgenden Beziehungen:

wobei die Intensität des nachweisbaren Signals vom Referenzbereich verglichen werden kann mit der Intensität der nachweisbaren Signale von den Testbereichen in Anwesenheit einer unbekannten Menge des Analyten in der Probe, um die Menge des Analyten in der Probe relativ zum Standard-Analytenlevel zu bestimmen.