DE19645569C1 - Vorrichtung zum quantifizierenden und differenzierenden Nachweis verschiedener Biomoleküle in einem einzigen Testansatz - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener Antigene und/oder Antikörper in Lösung, insbesondere Körperflüssigkeiten, oder anderen komplexen Analysegemischen. Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ist es insbesondere möglich, die nachzuweisenden Antikörper und/oder Antigene zu quantifizieren und zu differenzieren.

Das Aufbringen von Biomolekülen auf feste Träger ist ein im Stand der Technik ausführlich beschriebenes und vielseitig anwendbares Verfahren. Renart [1] und Towbin [2] beschrieben erstmals 1979 den Transfer elektrophoretisch aufge­ trennter Proteine auf eine feste Matrix als "Protein blotting". Hierzu werden bevorzugt Nitrocellulose (NC), Celluloseacetat oder synthetische Polymere wie Nylonmembranen als feste Träger verwendet. Das Dot-blotting-Verfahren stellt eine weitere Methode zur Immobilisierung von Biomolekülen auf feste Träger dar [3, 4]. Hierbei werden die Analyte durch direktes Auftragen auf der Membran immobilisiert. Das Auftragen kann entweder automatisch, z. B. durch einen Drop-, Line- oder Pattern-Printer, oder auch manuell mit einer Pipette erfolgen. Auch in diesen Fällen werden bevorzugt die oben bereits erwähnten, festen Träger als Immobilisierungsmatrices verwendet. Eine spezielle Anwendung dieser Techniken ist der Dot-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), der z. B. bei der Detektion geringer Konzentrationen bestimmter Antikörper im Plasma [4] oder dem selektiven Nachweis spezifischer mikrobieller Antigene [5, 6] eingesetzt wird. Ein ELISA ist im allgemeinen eine Technik, bei der z. B. ein Antikörper A gegen ein bestimmtes Protein auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert wird. Dieser bindet das Antigen, welches dann mit einem zweiten Antikörper B, der ebenfalls das Antigen erkennt und eine Markierung trägt, nachgewiesen werden kann. Im speziellen Fall des Dot-ELISAs wird der Antikörper A oder ein Antigen als Punkt auf einer Trägermembran immobilisiert und durch eine nachgeschaltete immuno­ logische Reaktion nachgewiesen.

Durch den Einsatz solcher Verfahren werden größere Mengen an teuren Anti­ körperlösungen und Nachweisreagenzien sowie Analytlösung (wie z. B. Patien­ tenserum oder -plasma) benötigt, um die gesamte Filtermembran zu überschich­ ten. Stehen nur geringe Mengen an Analytlösung zur Verfügung, müssen die Dot-ELISA-Membranen in kleine Stücke geschnitten werden, die in je eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte passen [3]. Dies Verfahren ist arbeitstechnisch aufwendig und für größere Testreihen nur bedingt geeignet. Ein großer Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß die Ergebnisse nur qualitativ ausgewertet werden können (abgesehen vom ELISA), so daß die Interpretation der Aus­ wertung zu Fehleinschätzungen führen kann. Eine quantitative Auswertung von Dot-ELISA-Membranen ist bisher nur in Form eines Radioimmunoassays be­ schrieben worden [7]. Dies bedeutet ein erhöhtes Sicherheitsrisiko und damit eine eingeschränkte Verwendbarkeit in der klinischen Diagnostik.

Die DE 195 26 675 A1 beschreibt eine Teststreifenanalyse zur Erfassung von autoallergenen menschlichen Pathologien, insbesondere die Herstellung und Anwendung von Teststreifen mit multiplem Auftrag von Oligosaccharidepitop-Trägern zum Nachweis von autoallergenen Pathologien und Charakterisierung anomaler Antikörpertiter in Körperflüssigkeiten. Die DE 37 22 271 A1 betrifft den Nachweis bzw. die Bestimmung von Antikörpern gegen verschiedene Viren, die bekannt dafür sind, daß sie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) hervorrufen, insbesondere die Analyse von Körperflüssigkeiten zur Bestimmung dieser Antikörper als Anzeichen für eine AIDS-Exposition.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die dargelegten Nachteile zu beseitigen und eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Verfah­ ren bereitzustellen, worin verschiedene Biomoleküle auf einer Trägermatrix immobilisiert werden, dann die daran bindenden Antigene oder Antikörper in einem einzigen Analyseprozeß nachgewiesen werden, und welche somit eine Differenzierung und Quantifizierung erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Merkmale der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie deren Verwendung in einem Verfah­ ren zum quantifizierenden und differenzierenden Nachweis verschiedener Biomoleküle an fester Phase in einem einzigen Testansatz gelöst.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Anmeldung betrifft eine Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Analyten in einer zu unter­ suchenden Lösung, umfassend ein erstes Element mit einer Aussparung und einer Vertiefung, wobei die Vertiefung einen Träger aufnehmen kann, auf dem mindestens zwei unterschiedliche Biomoleküle aufgebracht und immobilisiert sind, und ein zweites Element mit einer Konfiguration, die der Aussparung des ersten Elements angepaßt ist, und durch eine Aussparung eine Vertiefung ausbildet, die am Boden einen Durchbruch aufweist, wobei das zweite Element in die Aussparung des ersten Elements derart eingefügt werden kann, daß es den in der Vertiefung des ersten Elements angeordneten Träger fixiert und einen definierten Reaktionsraum für ein Verfahren ausbildet.

Diese zweiteilige Vorrichtung zur Fixierung des Trägers zeichnet sich besonders dadurch aus, daß in einem von zwei Gehäuseelementen eine Vertiefung angeord­ net ist, in welche der feste Träger eingelegt werden kann. Mit dem zweiten Gehäuseelement dieser erfindungsgemäßen Vorrichtung wird der Träger so mit dem ersten Gehäuseelement verbunden, daß er fest, beispielsweise durch Einklemmen oder Kleben, zwischen diesen beiden Elementen angeordnet bzw. fixiert wird. Das zweite Element der Vorrichtung ist mit einer der Konfiguration der Aussparung des ersten Elements angepaßten Aussparung und einer Durch­ brechung ausgestattet. Diese Durchbrechung ist so ausgebildet, daß sie den reaktiven Teil des in der Vertiefung der Aussparung des ersten Elements an­ geordneten Trägers freiläßt. Die durch Einfügen des zweiten Elements in die Aussparung des ersten Elements ausgebildete Vertiefung stellt einen Reaktions­ raum über dem Träger dar, welcher die Analytlösung und die Nachweislösungen vollständig aufnimmt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von unterschiedlichen Analyten in einer zu untersu­ chenden Lösung, umfassend die Schritte

• (a) des Aufbringens und Immobilisierens von mindestens zwei unterschiedli­ chen Biomolekülen auf einen Träger, wobei die unterschiedlichen Biomole­ küle jeweils örtlich getrennt voneinander aufgebracht werden,
• (b) des Inkubierens der auf dem Träger aufgebrachten Biomoleküle mit der zu untersuchenden Lösung, und
• (c) des Durchführens einer Nachweisreaktion für Biomolekül/Analyt-Kom­ plexe.

Im ersten Schritt (a) werden spezielle Antigene und/oder Antikörper ("Biomolekü­ le") auf eine feste Matrix als Träger immobilisiert. Im zweiten Schritt (b) werden Antikörper oder Antigene ("Analyte") aus Körperflüssigkeiten oder anderen komplexen Analysegemischen ("Analytlösung") an die immobilisierten Biomole­ küle gebunden und durch eine anschließende Nachweisreaktion gemäß Schritt (c) in Form einer Farbreaktion sichtbar gemacht. Diese Nachweisreaktion beruht auf einer visuellen und/oder computergestützten Bildauswertung, bei welcher die entstandene Färbung auf der Trägermatrix mit Hilfe eines Scanners digitalisiert wird. Ein entsprechendes Computerprogramm wertet dann das digitalisierte Färbemuster so aus, daß die im Schritt (b) gebundenen Analyte quantifiziert und, wenn verschiedene Analyte nachgewiesen werden sollen, auch differenziert werden können.

Erfindungsgemäß werden die verwendeten Biomoleküle so auf einen festen Träger aufgebracht, daß sie irreversibel an den Träger bzw. Trägermatrix gebun­ den werden. Dies wird dadurch erreicht, daß als Immobilisierungsmatrix ein Trägermaterial verwendet wird, an welches die Biomoleküle zum einen kovalent binden, zum anderen aber auch durch verschiedenartige nicht-kovalente Bindun­ gen (z. B. ionische Wechselwirkungen, van der Waals-Kräfte, hydrophobe Wech­ selwirkungen) adsorptiv gebunden werden. Das Aufbringen der Biomoleküle ge­ schieht durch im Stand der Technik bekanntes Verfahren, bevorzugt mit Hilfe dazu geeigneter Geräte. Zu diesem Zweck eignen sich besonders ein Micro-Drop-System oder ein Line-Printing-System. Es können aber auch andere entsprechen­ de Geräte verwendet werden. Ebenso ist ein manuelles Aufbringen der Biomole­ küle mit Hilfe üblicher Pipettierhilfen möglich.

Die Bezeichnung "Biomoleküle" umfaßt zum einen spezifische Antikörper, die distinkte Antigene erkennen, welche dann durch eine Nachweisreaktion detek­ tiert werden, zum anderen aber auch beliebige Antigene, die durch spezifische Antikörper erkannt und die dann ihrerseits nachgewiesen werden.

Die zu detektierenden Antigene oder Antikörper ("Analyte") werden typischer­ weise aus Körperflüssigkeiten oder anderen komplexen Analysegemischen durch immunologische Verfahren nachgewiesen. Unter Körperflüssigkeiten werden erfindungsgemäß sämtliche Flüssigkeiten verstanden, die aus einem tierischen Körper, insbesondere einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, erhalten werden können. Solche Flüssigkeiten umfassen vorzugsweise Serum, Plasma, Vollblut, Lymphe, Speichel, Ascites und Urin. Weiterhin sind auch solche Flüssig­ keiten umfaßt, die aus festen Geweben gewonnen werden können. Unter den "anderen komplexen Analysegemischen" werden insbesondere Fermentations­ überstände, Zellkulturüberstände, Gewebeextrakte sowie Proben aus dem Bereich der Umweltanalytik (Boden und Wasserproben), der Lebensmittelanalytik und der Rückstandsanalytik verstanden. Alle dargelegten Analysegemische können sowohl unverdünnt als auch in verdünnter Form eingesetzt werden. Zur Verdünnung können zu diesem Zweck übliche, im Stand der Technik bekannte Lösungen verwendet werden.

Die zu detektierenden Analyte werden erfindungsgemäß derart nachgewiesen, daß die Trägermatrix mit den aufgebrachten Biomolekülen mit Körperflüssigkei­ ten oder anderen komplexen Analysegemischen (im folgenden zusammengefaßt und als "Analytlösung" bezeichnet) inkubiert wird, so daß die darin enthaltenen Analyte an die trägerfixierten Biomoleküle binden. Die gebundenen Analyte werden entweder mit spezifischen, markierten Detektorantikörpern, die gegen die Analyte gerichtet sind, oder mit unmarkierten Detektorantikörpern und diese dann mit markierten, gegen die Detektorantikörper gerichteten Nachweisantikör­ pern nachgewiesen, wobei die Markierung in beiden Fällen nicht-radioaktiv ist.

Die Markierung der Antikörper ergibt am Ende der Nachweisreaktion eine Farb­ reaktion, die in ihrer Intensität direkt proportional zur Konzentration der gebunde­ nen, nachzuweisenden Analyte ist.

Die Markierung der Antikörper erfolgt typischerweise so, daß sie entweder direkt sichtbar werden, wie z. B. bei Kopplung mit kolloidalem Gold, oder die Markie­ rung ist ein Enzym, welches nach Zugabe eines Substrats eine Farbreaktion katalysiert, die dann sichtbar wird. Zu diesem Zweck können Enzyme wie z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Glucose-Oxidase oder sonstige bekannte Markerenzyme verwendet werden. Die Nachweisreaktion kann auch das bekannte Biotin-Streptavidin- bzw. Biotin-Avidin-Verstärkungssystem um­ fassen.

Aufgrund der Markierung und in Abhängigkeit der Analyte in der Analytlösung entsteht am Ende der Nachweisreaktion ein Färbemuster auf dem Träger, wel­ ches entweder visuell oder mit Hilfe einer computergestützten Bildauswertung ausgewertet wird. In beiden Fällen ist sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung möglich, weil die Farbintensität proportional zur Kon­ zentration der gebundenen Analyte ist. Je höher die Analytkonzentration ist, desto intensiver ist auch die Färbung.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine quantitative Auswertung dadurch ermöglicht, daß auf einen Träger sowohl ein spezifischer Antikörper gegen ein nachzuweisendes Antigen als auch das Antigen selbst als Standard in unterschiedlichen Konzentrationen aufgebracht wird. Selbstverständlich kann auch umgekehrt ein spezifischer Antikörper als Standard und das Antigen für diesen spezifischen Antikörper auf einen Träger aufgebracht werden. Nach der Inkubation mit der Analytlösung und der folgenden Nachweisreaktion werden die Standards entsprechend ihrer Konzentration unterschiedlich stark angefärbt. Ebenso wird der Analyt entsprechend seiner Konzentration angefärbt, so daß ein direkter Vergleich mit dem Standard möglich ist.

In solchen Fällen, in denen nur eine qualitative Aussage getroffen werden soll, ist das Aufbringen von Standards auf den Träger nicht erforderlich.

Ein Färbemuster entsteht dann, wenn erfindungsgemäß verschiedene Biomolekü­ le an distinkten (d. h. örtlich voneinander getrennten) Stellen auf den Träger aufgebracht werden. Das Muster kann in verschiedenen Formen angelegt sein, so z. B. in Linien oder Punkten. Entscheidend ist hierbei nur, daß an definierten Stellen des Trägers auch nur eine Sorte bzw. Art von Biomolekülen aufgebracht ist.

Bei der rein visuellen Auswertung des Färbemusters kann durch einen Vergleich mit einer externen Schablone eine Zuordnung von angefärbten Bereichen auf dem Träger mit bestimmten Analyten erfolgen. Auf diese Weise ist eine qualitati­ ve Aussage möglich. Anhand der Farbintensität des nachgewiesenen Analyten ist darüber hinaus eine Quantifizierung möglich, wenn Standards mit auf den Träger aufgebracht waren, oder wenn auf einer externen Schablone eine Farb­ skala angegeben ist, so daß über die Farbintensität eine Konzentrationszuord­ nung erfolgen kann.

Erfindungsgemäß wird bei Verwendung einer computergestützten Bildauswer­ tung in einem ersten Schritt das Färbemuster mittels eines Scanners digitalisiert. Danach wird das digitalisierte Färbemuster mit Hilfe eines speziellen Computer­ programms in 256 Graustufen aufgeschlüsselt, so daß aus jedem angefärbten Bereich des Trägers ein Grauwert errechnet wird. Aufgrund der Standards auf dem Träger wird eine Korrelation zwischen Konzentration und Grauwert (also Farbintensität) ermittelt. Anhand dieser Korrelation kann über den ermittelten Grauwert eines angefärbten Analyten dessen Konzentration berechnet werden. Mit diesem Verfahren ist es darüber hinaus möglich, zwischen verschiedenen Analyten in einem Gemisch zu unterscheiden, wenn an verschiedenen Stellen des Trägers solche Biomoleküle aufgetragen sind, die spezifisch mit nur einem Analyten aus diesem Gemisch reagieren.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Vorrichtung in einem vorstehend aufge­ führten Verfahren läßt somit eine Differenzierung und Quantifizierung von verschiedenen Analyten in einem einzigen Testansatz zu.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform des Trägers und zeigt ein Allergen-Panel. Auf einer verstärkten Nitrocellulosemembran (1) sind verschiedene Al­ lergene (2) als Biomoleküle sowie Standards (3) in Form von Linien aufgebracht.

Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor­ richtung, bestehend aus zwei Gehäuseelementen, von denen das eine als Grund­ element (4) und das andere als Einlegerahmen (5) ausgebildet ist.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels unter Her­ anziehung der Figuren näher erläutert. Als beispielhafte Anwendung der vor­ liegenden Erfindung wird die Herstellung, Anwendung und Auswertung eines in vitro-Allergietests beschrieben.

Beispiel

Zunächst wird die Immobilisierung der Biomoleküle an den festen Träger be­ schrieben werden. Eine Aufsicht ist in Fig. 1 dargestellt.

Als Trägermaterial zur Immobilisierung der Biomoleküle wird eine Nitrocellulose­ membran (1) mit einer Porenweite von 0,1 µm, die vom Hersteller auf ein festes Trägermaterial aufgebracht worden ist, verwendet. Die Biomoleküle in diesem Anwendungsbeispiel sind Allergene (2) (wie z. B. Milben, Pollen von Gräsern oder Bäumen, Bestandteile aus Nahrungsmittel oder Hausstaub), die in einer Lösung aus PBS und Glycerin suspendiert vorliegen. Als Standard (3) wird IgE (Immun­ globulin E) in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Die Konzentrationen der Standards sind so eingestellt, daß sie den international bekannten 6 RAST-Klassen entsprechen. Die so vorliegenden verschiedenen Allergen-Lösungen bzw. Standard-Lösungen werden nun mit Hilfe eines Line-Printers (Bio·Dot Limited, Diddington, England) in Form von Linien auf die Nitrocellulosemembran so aufgetragen, daß ein leiterartiges Muster entsteht (vgl. Fig. 1). Nachdem alle Allergene und Standards aufgebracht worden sind, wird die Membran für 1 Stunde in einer 1%igen BSA-Lösung (Rinderserumalbumin) inkubiert, um die nicht mit Allergenen beschichteten Stellen abzusättigen. Die beschichtete Mem­ bran wird im folgenden als Allergen-Panel bezeichnet. Die in der Fig. 1 dar­ gestellten Banden repräsentieren die auf der Membran aufgetragenen Biomo­ leküle. Sie sind auf der Membran natürlich transparent und damit nicht sichtbar.

Nachfolgend wird die Herstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung (vgl. Fig. 2) und der Zusammenbau von Vor­ richtung und Allergen-Panel zum fertigen Allergietest beschrieben.

Die zweiteilige Vorrichtung wird durch ein industrielles Spritzgußverfahren aus einem handelsüblichen Kunststoffmaterial in zwei Teilen hergestellt. Die beiden Teile sind in Form eines größeren Grundelements (4) und eines kleineren Ele­ ments als Einlegerahmen (5) ausgebildet. In dem größeren Grundelement (4) ist eine Aussparung (6) eingearbeitet, in die der Einlegerahmen (5) fest eingefügt, beispielsweise geklemmet werden kann. Am Boden dieser Aussparung ist eine Vertiefung (7) eingefügt, die so ausgestaltet ist, daß sie das Allergen-Panel vorzugsweise vollständig aufnimmt. Der Einlegerahmen (5) enthält ebenfalls eine Vertiefung (8), die konisch zuläuft und vorzugsweise der Konfiguration der Aussparung (6) des ersten Elements angepaßt ist, und die eine Durchbrechung (9) aufweist. Der Zusammenbau erfolgt nun so, daß zuerst das Allergen-Panel in die dafür vorgesehene Vertiefung (7) am Boden des größeren Gehäuseele­ ments (4) eingelegt wird, und das Allergen-Panel dann mit dem Einlegerah­ men (5), also dem zweiten Gehäuseelement, beispielsweise fest eingeklemmt wird. Der reaktive Teil des Allergen-Panels bleibt durch die Durchbrechung (9) in dem Einlegerahmen (5) frei. Die Vertiefung (8) im Einlegerahmen (5) definiert über dem Allergen-Panel einen Reaktionsraum mit festgelegtem Volumen in den die Analytlösung und die nachfolgend zu verwendenden Lösungen eingefüllt werden können.

Auf dem größeren Gehäuseelement (4) kann ferner eine definierte Fläche (10) vorliegen, die beispielsweise dazu geeignet ist, Etiketten oder Aufkleber auf­ zunehmen. Insbesondere können solche Etiketten, wie sie aus der klinischen Praxis als Patientenetiketten mit patientenspezifischen Daten und Barcode bekannt sind, verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Gehäuseelement eine weitere Fläche (11) aufweisen, die dazu geeignet ist, produktspezifische Daten, wie Produktbezeichnung, Lot-Nr. oder Haltbarkeitsdatum aufzunehmen.

Der so vollständig zusammengebaute "Allergietest-Chip" wird zur Bestimmung von allergenspezifischem IgE in Serum eingesetzt.

Zu diesem Zweck wird ein definiertes Volumen (in diesem Beispiel 400 µl) unverdünntes oder verdünntes Patientenserum in den Reaktionsraum über der aktiven Fläche der Membran (gebildet durch die Vertiefung (8) gegeben und für eine bestimmte Zeit, beispielsweise zwischen 45 und 60 Minuten, inkubiert. Sind im Serum allergenspezifische IgE Moleküle vorhanden, so binden diese spezifisch an die auf der Membran aufgebrachten Allergene. Nach der Inkubation wird das Serum von der Membran durch Absaugen oder Abwaschen entfernt und die Membran mit Puffer gewaschen. Zu diesem Zweck wird beispielsweise PBS + 0,5% Tween verwendet. Es kann aber auch jede andere, zu diesem Zweck geeignete Lösung oder Wasser verwendet werden. Im Anschluß an diesen Waschvorgang wird eine Nachweislösung in den Reaktionsraum pipettiert. Diese Nachweislösung enthält typischerweise Antikörper, die gegen IgE Moleküle gerichtet sind. Der Nachweisantikörper ist entweder mit einem Markerenzym oder mit kolloidalem Gold oder mit Biotin gekoppelt. Als Markerenzyme können typischerweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucose-Oxidase oder andere zu diesem Zweck übliche Enzyme verwendet werden. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird bevorzugt ein mit Biotin gekoppelter Nachweisantikörper eingesetzt. Die Nachweislösung wird ebenfalls 45 bis 60 Minuten inkubiert und danach entfernt. Die Membran wird danach wieder gründ­ lich gewaschen und anschließend mit einer Lösung inkubiert, die ein Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase oder Avidin und alkalischer Phos­ phatase enthält. Streptavidin bzw. Avidin bindet mit hoher Affinität an das Biotin des Nachweisantikörpers. Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die Membran nochmals gewaschen und danach mit einer Lösung überschichtet, die ein Substrat für das Markerenzym enthält. Als Substrat für die alkalische Phosphatase wird bevorzugt NBT/BCIP (NBT: Nirto-blue Tetrazoliumchlorid, BCIP: 5-Brom-4-chlorindolylphosphat) verwendet, welches durch das Marke­ renzym in eine farbige Verbindung umgesetzt wird.

Die Intensität der Färbung ist direkt proportional zum gebundenen allergenspezifi­ schen IgE.

Die Standards auf der Membran sind ebenfalls IgE Moleküle, die in 6 unter­ schiedlichen Konzentrationen aufgetragen sind. Es ist aber auch möglich, weni­ ger als 6 Standardkonzentrationen aufzubringen. Die Standards werden von den Nachweisantikörpern erkannt und im Zuge der weiteren Reaktionen ebenfalls angefärbt. Die Intensität der Färbung ist proportional zur Konzentration des aufgetragenen Standards, so daß eine Eichgerade ermittelt werden kann, an der dann über die Intensität der Färbung der gebundenen allergenspezifischen IgE Moleküle deren Konzentration im Serum bestimmt wird.

Die Färbung auf dem Allergietest-Chip kann sowohl visuell als auch mit elek­ tronischen/optischen Hilfsmitteln ausgewertet werden. Im ersten Fall ist eine qualitative bzw. eine semiquantitative Auswertung möglich. Anhand der Farb­ intensität kann mit Hilfe der Standards die Konzentration von allergenspezifi­ schen IgE Molekülen abgeschätzt werden.

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird der gefärbte Allergietest-Chip mit Hilfe eines computergestützten Verfahrens ausgewertet. Hierzu wird das Färbemuster auf dem Allergietest-Chip mit einem Scanner digitalisiert und mit einem Compu­ terprogramm in 256 Graustufen aufgeschlüsselt. Dieses Computerprogramm ordnet dann jedem Balken auf dem Allergen-Panel einen bestimmten Grauwert zu. Anhand der Standards wird eine Eichgerade errechnet (Grauwert gegen IgE Konzentration), mit deren Hilfe dann die Konzentration der allergenspezifischen IgE Moleküle jedes einzelnen Balkens berechnet und einer bestimmten RAST-Klasse zugeordnet wird. Der Begriff RAST-Klasse bezeichnet international festge­ legte Konzentrationsbereiche für allergenspezifische IgE Moleküle in Serum.

Im folgenden werden weitere Anwendungsbeispiele aufgeführt, die ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können:

• - Zytokinzusammensetzung in Körper- und Gewebeflüssigkeiten bzw. in Gewebeextrakten
• - Immunoglobulinsubklassenbestimmung
• - akute komplexe Hormonmusterbestimmung
• - Überprüfung einer Tumormarkerpalette
• - Blutgruppenbestimmung (inkl. Rhesusantigenmuster)
• - Autoimmunreaktion
• - alle denkbaren immunologisch nachweisbaren Antigene, die in der Diffe­ rentialdiagnostik nachgefragt werden
• - Nachweis und Differenzierung von komplexen Enzymaktivitätsmustern
• - Nachweis und Differenzierung von unterschiedlichen Inhibitoren
• - Nachweis und Differenzierung von immunologisch detektierbaren Um­ welttoxinen.

Literatur

[1] Renart, J., Reiser, J. and Stark, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 3116-3120.
[2] Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 4350-4354.
[3] Hawkes, R., Niday, E. and Gordon, J., Anal. Biochem. 1982, 119 142-147.
[4] Porat, Y.B., Zan-Bar, I. and Ravid, A., J. Immunol. Methods 1995, 180, 213-218.
[5] Requejo, H.I., Alkim, M., Almeida, R.G., Casagrande, S.T., Cocozza, A.M., Lotufo, J.P., Waetge, A.R. and Rodrigues, J.C., Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo 1994, 36, 531-537.
[6] Bosompem, K.M., Assoku, R.K. and Nantulya, V.M., J. Immunol. Methods 1995, 187, 23-31.
[7] Jahn, R., Schiebler, W. and Greengard, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 1684-1687.

Claims (6)

1. Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Analyten in einer zu untersuchenden Lösung, umfassend ein erstes Ele­ ment (4) mit einer Aussparung (6) und einer Vertiefung (7), wobei die Vertiefung (7) einen Träger aufnehmen kann, auf welchem mindestens zwei unterschiedliche Biomoleküle aufgebracht und immobilisiert sind, wobei die unterschiedlichen Biomoleküle jeweils örtlich getrennt vonein­ ander aufgebracht sind) und ein zweites Element (5) mit einer der Aussparung (6) angepaßten Aussparung (8) und einem Durchbruch (9), wobei das zweite Element (5) in die Aus­ sparung (6) des ersten Elements (4) derart eingefügt werden kann, daß es den in der Vertiefung (7) des ersten Elements (4) positionierten Träger fixiert und einen definierten Reaktionsraum für ein Verfahren ausbildet.

2. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von unterschiedlichen Analyten in einer zu untersuchenden Lösung, umfassend die Schritte

• (a) des Aufbringens und Immobilisierens von mindestens zwei unter­ schiedlichen Biomolekülen auf einen Träger, wobei die unterschied­ lichen Biomoleküle jeweils örtlich getrennt voneinander aufgebracht werden,
• (b) des Inkubierens der auf dem Träger aufgebrachten Biomoleküle mit der zu untersuchenden Lösung, und
• (c) des Durchführens einer Nachweisreaktion für Biomolekül/Analyt-Komplexe.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Nachweisreaktion in Schritt (c) das Inkubieren der Biomoleküle und/oder der Biomolekül/Analyt-Komplexe auf dem Träger mit mindestens einem spezifischen, markierten Detektor­ antikörper, der gegen die jeweiligen Biomolekül/Analyt-Komplexe oder Analyten gerichtet ist, umfaßt.

4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Nachweisreaktion in Schritt (c) das Inkubieren der Biomoleküle und/oder der Biomolekül/Analyt-Komplexe auf dem Träger mit mindestens einem spezifischen, unmarkierten Detektorantikörper, der gegen die jeweiligen Biomolekül/Analyt-Komplexe oder Analyten gerichtet ist, und das Inkubieren der Biomolekül/Ana­ lyt/Detektorantikörper-Komplexe mit markierten, gegen die Detektorantikörper gerichteten Nachweisantikörper umfaßt.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Nachweisre­ aktion in Schritt (c) ein Färbemuster auf dem Träger ergibt, welches visuell und/oder mit Hilfe einer computergestützten Bildauswertung ausgewertet wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die zu untersu­ chende Lösung aus Säugern, Fermentations- und Kulturüberständen, Gewebeextrakten, Böden, Wasser, Lebensmittel oder Rückständen stammt.