DE4343842C1 - Reaktionsgefäß zur immunologischn Analytik von Aerosolen - Google Patents
Reaktionsgefäß zur immunologischn Analytik von AerosolenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Reaktionsgefäß zur schnellen
qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von sog.
Luftschadstoffaerosolen mit Hilfe einer immunchemischen
Reaktion, bei der spezifische Antikörper zur selektiven
Bindung der Luftschadstoffaerosole und eine Markierung
bzw. System zur Anzeige oder Kenntlichmachung dieser
Bindung eingesetzt werden.
Natürliche, trockene Luft ist chemisch gesehen ein
Gasgemisch. Luftverunreinigungen durch eine Vielzahl
von Substanzen verändern die Zusammensetzung dieses
"Gases" teilweise erheblich. Besondere Bedeutung in
diesem Zusammenhang haben chemische Verbindungen,
entweder in solider Form oder an/auf Grob- bzw.
Feinstäuben sorptiv gebunden, die der normalen Luft
entweder durch natürliche Prozesse (z. B.
Vulkantätigkeit) zugeführt werden oder durch die
Tätigkeit des Menschen in die Luft gelangen. Diese sog.
"Umweltchemikalien" kann man aufgrund ihrer
physikalischen Eigenschaften grob in Gase und Aerosole
einteilen. Von großer Bedeutung dabei sind diejenigen
Umweltchemikalien (d. h. Umweltnoxen, z. B. Allergene,
Pestizide, usw.), die als "Schadstoffbelastung" der
Außen- und Innenraumluft von Mensch und Tier in
zunehmendem Maße vorkommen. Die Belastung der Luft
durch Grob- und Feinstäube ist dabei in Großstädten und
Industriegebieten besonders zu spüren. Stäube mit
Teilchen unter 5 Mikrometer sind lungengängig, d. h.
sie gelangen in die Lungenbläschen. Sie können sich
dort ansammeln oder ins Blut übergehen, dringen in die
Körperzellen ein und schädigen deren
Stoffwechselenzyme, lösen Allergien aus u. a. Kommen
mehrere Umweltnoxen gleichzeitig in der Luft vor, so
sind synergistische Wirkungen möglich.
Aerosole sind definitionsgemäß Zweiphasensysteme, bei
denen feste oder flüssige Partikel/Stoffe in einer
Gasphase fein dispergiert schweben, d. h. in denen Luft
als Träger- und Verteilungsmedium für diese
Partikel/Stoffe dient. Werden z. B. biologische
Materialien wie Sporen, Viren oder Bakterien in Luft
dispergiert, spricht man von "biologischen Aerosolen"
bzw. "Bioaerosolen"; sog. "solide Aerosole" sind
diejenigen, die feste Stoffe dispers enthalten. Die
Größenverteilung von in Aerosolen enthaltenen Partikeln
überdecken ein Spektrum von Teilchen, deren Durchmesser
von 10-3 Mikrometer bis ca. 10² Mikrometer reicht.
Diese große Spannweite erklärt sich aus der Vielfalt
der Möglichkeiten der Entstehung und unterschiedlichen
physikochemischen Zusammensetzung luftverunreinigender
Partikel. Die Partikelgröße hängt unmittelbar zusammen
mit den für die biologische Wirkung bestimmenden
Parametern: Verweildauer in der Luft, chemische
Aktivität und Lungendeposition. Die Deposition von
Partikeln beim Menschen betrifft einen Größenbereich
von 0,03 bis 20 Mikrometer Partikeldurchmesser. Der
Feinstaubanteil (< 10 Mikrometer) macht im sog.
"Hausstaub" nur ca. 20% der Gesamtstaubmasse aus, kann
aber bis zu 90% der allergen bzw. toxisch wirkenden
Stoffe beinhalten. Dadurch stellen Aerosole, d. h. in
diesem Zusammenhang "luftgetragene Gefahrstoffe", z. B.
in Innenräumen, Wohn- und Arbeitsräumen,
Verkehrsmitteln, Hotels usw. ein nicht zu
unterschätzendes gesundheitliches Risiko dar. Um
Gesundheitsgefahren beispielsweise am Arbeitsplatz
auszuschließen, sind bestimmte Grenzwerte in Verbindung
mit einer entsprechenden Gesetzgebung
(Chemikaliengesetz: ChemG) erlassen worden. Ist das
Auftreten eines gefährlichen Stoffes (Aerosoles) in der
Luft am Arbeitsplatz nicht sicher auszuschließen, so
ist der Arbeitsplatz auf die Unterschreitung der
Grenzwerte (Maximale Arbeitsplatzkonzentration: MAK;
Technische Richtkonzentration: TRK, Biologischer
Arbeitsplatztoleranzwert: BAT) zu überwachen. Eine
solche Überwachung kann durch Vornahme von Messungen
erfolgen.
Heutzutage gibt es ein umfangreiches Sortiment von
Prüfröhrchen zur quantitativen Schnellanalyse von
Gasen, Dämpfen und Aerosolen im Bereich der MAK-Werte.
Für den Meßeinsatz werden dem Prüfröhrchen die Spitzen
abgebrochen, das Prüfröhrchen in die entsprechende
Gasspürpumpe eingeführt und mit dieser das
vorgeschriebene Gas- bzw. Luftvolumen durch die
Reaktionsschicht gesaugt. Die meisten Prüfröhrchen sind
sog. Skalenröhrchen, bei denen sich die Anzeigeschicht
in einer von der Analytkonzentration abhängigen Länge
verfärbt. Ferner sind Prüfröhrchen mit einer
Farbvergleichsschicht bekannt, über die ein
Farbvergleich nach der Reaktion stattfindet. Die
Grundlage der meisten Prüfröhrchen sind rein chemische
Reaktionen der zu messenden Gase bzw. Aerosole mit den
Chemikalien der Röhrchenfüllschicht/en.
(Dräger-Röhrchen Handbuch, (1991): Boden-, Wasser- und
Luftuntersuchung sowie technische Gasanalyse, 8.
Auflage, Drägerwerk AG, Lübeck, DE).
Es gibt Einweg-Reaktionsgefäße bzw. Prüfröhrchen, bei
denen der Nachweis gasförmiger Schadstoffe mit Hilfe
einer enzymatischen Reaktion erfolgt (DE-A 38 42 607
und DE-A 39 14 801).
Allerdings gibt es eine Reihe von Schadstoffen, die
enzymatisch nicht bzw. mit den üblichen
physikalisch-chemischen Methoden nur mittels
aufwendiger Anreicherungs- und Analyseverfahren meßbar
sind. Immunchemische Verfahren (Immunoassays), wie sie
in der Klinischen- oder Lebensmittel-Analytik zum
Nachweis verschiedener Substanzen routinemäßig
eingesetzt werden, sind in jüngster Zeit auch zur
Bestimmung von "Umweltchemikalien" in Boden und
Wasserproben eingesetzt worden und exemplarisch von Van
Emon und Mumma (1990) beschrieben (Van Emon, J.M. &
Mumma, R.O. Hrsg., (1990): Immunochemical Methods for
Environmental Analysis, ACS Symposium series 442, ACS
Washington, USA).
Bei Immunoassays unter Verwendung der sog.
"Affinitätschromatographie" als wichtigen
Verfahrensschritt wurden bisher im wesentlichen
Mehrzweckreaktionsgefäße bzw. wiederverwendbare Säulen,
die mit Antikörpern oder Antigen (Analyt), gebunden an
einem festen Träger, gepackt sind, verwendet.
In der DE 41 26 436 A1 wird ein Einwegreaktionsgefäß für
die Festphasenimmunanalytik in Form einer Einwegsäule
beschrieben, das die Durchführung eines Immunoassays
ermöglicht und das zum sofortigen Gebrauch ohne
vorherige Kalibirier- oder Regeneriermaßnahmen geeignet
ist. Es handelt sich dabei um ein oben und unten
offenes Einwegreaktionsgefäß für die
Festphasenimmunanalytik mit zwei darin befindlichen,
für Flüssigkeiten durchlässigen porösen
Trenneinrichtungen, zwischen denen sich mindestens eine
auf einem Trägermaterial aufgebrachte immunologische
Reaktivkomponente befindet. Die
Durchflußgeschwindigkeit der Flüssigkeiten wird dabei
durch die Durchlässigkeit der oberen und/oder unteren
Trenneinrichtung bestimmt. Ferner bewirkt die hohe
Beladungsdichte des Trägermaterials mit den
Reaktivkomponenten, daß die zu bestimmende Komponente
innerhalb von ca. 1 min. nahezu quantitativ an die
Reaktivkomponente bindet, bevor die durchfließende
Flüssigkeit aus dem Trägerbettvolumen austritt.
Verfahrensgemäß wird dabei die zu bestimmende Komponente
aus der Probe von der immunologischen Reaktivkomponente im
Einwegreaktionsgefäß zurückgehalten und beispielsweise
über eine der zu bestimmenden Komponente konkurrierende
markierte Verbindung bestimmt. Auch wenn das Einweggefäß
und Nachweisverfahren der DE 41 26 436 A1 im Vergleich zu
bisherigen immunchromatographischen Verfahren sehr
vereinfacht ist, kann es nicht direkt für den Nachweis
luftgetragener Schadstoffaerosole eingesetzt werden.
Ferner beinhaltet der immunchemische Nachweis zwischen
Probenauftrag und Detektion zusätzliche Verfahrensschritte
wie Waschen, Eluieren und Markierungs-
(Fluoreszenz-)-Nachweis. Letzteres erfordert darüber
hinaus eine besondere Apparateperipherie.
Aus der DE 41 21 493 A1 ist eine Analysevorrichtung zur
quantitativen, immunologischen Bestimmung von Schadstoffen
bekannt, welche aus einem Träger mit zwei Teilbereichen
von Schichten besteht, von denen eine erste Schicht eine
lichtundurchlässige Reaktionsschicht ist, in der verteilt
sich ein Tracer/Antikörper-Komplex befindet und die zweite
Schicht eine sich an die Reaktionsschicht
anschließende lichtdurchlässige Nachweisschicht ist. Der
Tracer ist hierbei ein mit einem Farbstoff markierter
Analyt. Die nachzuweisenden Analyten diffundieren in die
Reaktionsschicht, verdrängen die Tracer von ihren
Bindungsplätzen an den Antikörpern und nehmen deren Plätze
ein. Die verdrängten Tracer diffundieren dann in die
lichtdurchlässige Nachweisschicht, in welcher sie als
Farbreaktion sichtbar sind. Die Reaktionsschicht kann mit
einer vorgeschalteten Sammelschicht versehen sein und
zusammen mit der Nachweisschicht sandwichartig zwischen
zwei plattenförmigen Deckeln als Gehäuse eingespannt sein,
wobei der der Nachweisschicht zugewandte Deckel einen
Einlaß und der der Reaktionsschicht zugewandte Deckel eine
Auslaß aufweist.
Aus der DE 41 14 159 A1 ist ein faseroptischer Detektor
bekannt, der aus einer mit Antikörpern überzogenen
optischen Faser in einer Kammer besteht. An die aktiven
Bereiche der Antikörper sind Tracer in Form von
fluoreszenzmarkierten Antigenen gebunden. Die
Fluoreszenz-Markierung der Antigene ist durch Licht von
einer bestimmten Wellenlänge aktivierbar, welches über die
Faser in den mit den Antikörpern beschichteten Bereich
gelangt. Wenn nachzuweisende Moleküle in die Kammer
eindringen, ersetzen diese die Antigene an den
Antikörpern, was zu einer Abnahme der Fluoreszenz führt.
Die relative Abnahme der Fluoreszenz ist ein Maß für die
relative Menge der in die Kammer gelangten nachzuweisenden
Moleküle.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe
zugrunde, ein einfaches, direkt anzeigendes und
auswertbares Reaktionsgefäß für solche Umweltchemikalien,
bevorzugt Aerosole, zu entwickeln, die enzymatisch nicht
direkt bzw. mit den üblichen physikalisch-chemischen
Methoden nur mittels aufwendiger Anreicherungs- und
Analyseverfahren meßbar sind.
Die Aufgabe wird durch ein Reaktionsgefäß gemäß dem
Hauptanspruch gelöst.
Vorteil des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes, im
folgenden auch als Prüfröhrchen bezeichnet, ist, daß
alle benötigten Reagenzien (Antikörper, Tracer,
Substrate, Puffer, usw.) direkter Bestandteil des
Prüfröhrchens sind. Die Luftprobe wird mittels einer
Gasspürpumpe direkt in das Prüfröhrchen gesaugt und das
Aerosol auf diese Weise gesammelt/angereichert.
Zusätzliche Handhabungsschritte, wie das Aufbringen
oder Dosieren der Probe und weiterer Lösungen mit
üblichen Laborhilfsmitteln oder Pipettierautomaten,
entfallen. Dadurch wird eine unmittelbare
Messung/Überwachung, z. B. am Arbeitsplatz, Wohn- oder
Innenraumbereich, möglich.
Den Ausgangspunkt der Erfindung bilden bereits bewährte
Prüfröhrchen, wie sie im Dräger-Röhrchen Handbuch, 8.
Auflage von 1991 beschrieben sind. Dabei sind
Prüfröhrchen bekannt, die eine oder auch mehrere
brechbare Ampullen mit flüssigen Reagenzien enthalten.
Das Prüfröhrchen ist im Bereich der Ampulle brechbar
und beispielsweise mit einem Schlauchüberzug versehen.
Mit den Ampullen, in der vorliegenden Erfindung einzeln
oder doppelt nebeneinander oder hintereinander
angeordnet, ergibt sich die Möglichkeit, in dem
Prüfröhrchen flüssige Reagenzien zu lagern, ohne daß
sie während der Lagerzeit mit den anderen "Füllungen"
(beschichtete Träger, lyopholisierte Reagenzien,
Sammelschichten, usw.) in Berührung kommen. Beim
Gebrauch des Prüfröhrchens wird es zu dem jeweils für
die Reaktion richtigen Zeitpunkt an der brechbaren
Stelle gebrochen, wobei dann auch die Ampulle zerbricht
und deren Inhalt sich in das Innere des Prüfröhrchens
ergießt. Ein besonders vorteilhaftes, konstruktives
Merkmal ist in der DE-C 29 48 218 beschrieben. Dabei
wird zur Auswertung der eingetretenen chemischen
Reaktion, d. h. zur Aerosolmessung der Verfärbungsgrad
einer zu sammelnden Flüssigkeit in einer zuvor leeren
Prüfröhrchenkammer (Meßkammer) herangezogen. Dabei
verhindert die aus hydrophobisiertem Vlies (Papier)
bestehende Flüssigkeitssperre das Austreten von
Reagenzflüssigkeit in die Ansaugpumpe (Gasspürpumpe)
und damit deren Schädigung. In der vorliegenden
Erfindung wird dieser Prüfröhrchenabschnitt analog zur
DE 29 48 218 C2 für die Meßauswertung herangezogen. Die
Auswertung kann dabei mit bloßem Auge durch Vergleich
mit einem Farbstandard, oder maschinenunterstützt
spektralphotometrisch durchgeführt werden. Darüber
hinaus kann dieser Röhrchenbereich Reaktionsbereich
sein, da in ihm beispielsweise in lyophilisierter Form
Reagenzien bevorratet werden können, die erst nach
Inkontaktbringen mit Flüssigkeit rehydratisiert und z. B.
als Enzymsubstrat verwendet werden. Zusätzlich bzw.
alternativ kann in diesem Bereich eine weitere
Reagenzampulle integriert werden.
Das erfindungsgemäße Prüfröhrchen samt immunologischem
Verfahren ist durch die Kombination der Nachweismethode
auf Basis eines immunologischen Verdrängungstests
(Displacementassays) mit der
Prüfröhrchen-Technologie, die heute zur den klassischen
Meßverfahren der Gas- und Luftanalytik gehört,
geeignet, als einfach und schnell handhabbare,
kostengünstige, direkt qualitativ und/oder quantitativ
auswertbare Analyseeinheit eingesetzt zu werden. Eine
schnelle Analyse von Luftproben wird weiterhin deshalb
möglich, weil das Einwegreaktionsgefäß den sofortigen
Gebrauch erlaubt, da die darin enthaltenen Reagenzien,
Lösungen, Trägermaterialien usw. standardisiert sind
und vor der unmittelbaren Verwendung nicht geeicht
werden müssen. Dadurch wird erstmals eine direkte
Messung/Überwachung, z. B. am Arbeitsplatz bzw. in
Innen- und Wohnräumen von luftgetragenen
Schadstoffaerosolen, die einer schnellen, verläßlichen,
kostengünstigen und in der Handhabung einfachen
Analytik vor Ort nicht zugänglich waren, möglich.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert und in den
zugehörigen Figuren dargestellt. Für die Beispiele der
immunchemischen Reaktion und beteiligten
Reaktivkomponenten wird Dinitrophenyl-Lysin (DNP-L) als
Analyt bzw. DNP-L-Konjugate als Tracer verwendet. Als
spezifischer Antikörper wird der von Stanley et al.
beschriebene monoklonale anti-Dinitrophenol-Antikörper
verwendet (Stanley, C., Lew, A.M. & Steward, M.W.
(1983): The measurement of antibody affinity; a
comparison of five techniques utilizing a panel of
monoclonal anti-DNP antibodies and the effect of high
affinity antibody on the measurement of low affinity
antibody., J. Imm. Methods 64, pp., 119-132). In den
Beispielen wird der Einfachheit halber von Prüfröhrchen
als Reaktionsgefäß gesprochen, auch wenn andere
Ausführungsformen ebensogut einsetzbar sind.
Die Figuren zeigen
Fig. 1 bis 8 Längsschnittdarstellungen
unterschiedlicher Ausführungsformen
von Prüfröhrchen zum
immunchemischen Nachweis von
Aerosolen,
Fig. 9 Schematischer Aufbau der
immunologischen Reaktionskomponente,
Fig. 10 Schematischer Reaktionsablauf an
der immunologischen
Reaktionskomponente.
In den Fig. 1 bis 8 ist ein aus Glas bestehendes
Prüfröhrchen (1) gezeigt. Die Enden des Prüfröhrchens
(1) sind jeweils als abbrechbare Spitzen (2, 3)
ausgebildet. An erster Stelle in der
Durchströmungsrichtung (5) gesehen ist eine erste
Kammer (6) angeordnet, in der eine oder zwei brechbare
Ampullen (7, 28, 29, 32, 33) untergebracht sind. In der
Höhe der Ampullen (7, 28, 29, 32, 33) ist das
Glasröhrchen (1) mit einem aufgeschrumpften Schlauch
(8) überzogen. Auf die erste Kammer (6) folgend
befindet sich eine Sammelschicht (9). Diese
Sammelschicht (9) besteht aus inerten PTFE-Membranen
definierter Porengröße (zwischen 0,45-5 Mikrometer),
gefolgt von einer unterstützenden hydrophobierten
Vliesschicht. Möglich ist ferner eine körnige, inerte
Quarzschicht (in den Figuren nicht dargestellt) mit
Körnungen von 0,5 bis 0,8 mm. In der darauf folgenden
Reaktionskammer (10) ist eine immunchemisch reaktive
Füllung (11) angeordnet, gefolgt von einer Meßkammer
(12). Die einzelnen Füllungen (11) bzw. Kammern (6, 10,
12) des Prüfröhrchens (1) werden durch Halteelemente
(13, 14, 15, 16, 17, 26) rüttelsicher gehalten. Ferner
sind die einzelnen Röhrchenkammern (6, 10, 12) in
Durchströmungsrichtung (5) mit den
Flüssigkeitstransport behindernden Sperrschichten (18,
19, 24) aus hydrophobierten Filtermaterial
abgeschlossen. Am Ende (3) des Prüfröhrchens (1)
verhindert eine Flüssigkeitssperre (20) den Austritt
von Flüssigkeit. In den Fig. 3 bis 8 befindet sich
zwischen dem Halteelement (16) und der Meßkammer (12)
eine Enzym-Reaktionskammer (25) mit dem Halteelement (26)
und der Sperrschicht (24). Konfiguration und
Konstitution der Bestandteile bzw. Reagenzien in der
Enzym-Reaktionskammer (25) und der Meßkammer (12)
können in trockener Form (27, 38), als imprägnierte
körnige Reaktionsschicht (49) oder in einer
Brechampulle (36, 39) bevorratet werden.
Der immunchemische Nachweis luftgetragener
Schadstoffaerosole mit den erfindungsgemäß
beschriebenen Prüfröhrchen (Fig. 1) wird wie folgt
durchgeführt:
An dem Glas-Prüfröhrchen (1) werden die Spitzen (2, 3)
abgebrochen und anschließend das Prüfröhrchen in eine
Gasspürpumpe eingesetzt. Anschließend werden
beispielsweise 10 bis 100 l Prüfluft in
Durchströmungsrichtung (5) hindurchgesaugt. Während
dieser "Luftprobenahme" wird das in der Probenluft
vorhandene Aerosol in der Kammer (6), bevorzugt aber
auf der daran angrenzenden Sammelschicht (9),
abgeschieden und gesammelt/angereichert. Danach wird
die Brechampulle (7) an der Sollbruchstelle (21)
zerbrochen. Dadurch gelangt die Ampullenlösung (22) in
die Kammer (6) und durch Schütteln auf die
Sammelschicht (9). Die Art der Lösung (22), mit der die
Ampulle (7) gefüllt wird, ist vom zu untersuchenden
Aerosol abhängig. Die Ampullenlösung (22) wird so
gewählt, daß einerseits eine gute Löslichkeit der auf
den Aerosolpartikeln haftenden Schadstoffe erreicht
wird, andererseits aber die nachfolgende immunchemische
Reaktion nicht inhibiert wird. So ist zu erwarten, daß
Bioaerosole, deren Schadstoffanteil sog. "Exine"
(allergene Proteine bzw. Peptide) sind, in Bezug auf
deren Löslichkeit andere Eigenschaften der
Ampullenlösung (22) benötigen als beispielsweise
Pestizide oder andere aerosolbildende chemische
Verbindungen. In Abhängigkeit der Löslichkeit des zu
untersuchenden Schadstoffs wird das Prüfröhrchen (1),
nach dem Brechen der Ampulle (7) und dem
Inkontaktbringen von Ampullenlösung (22) und
abgeschiedenem Aerosol, einige (z. B. 5 bis 20)
Minuten, z. B. bei Raumtemperatur belassen. Ein
direkter Übergang der so entstandenen Schadstofflösung
in die folgende Reaktionskammer (10) wird durch eine
vorhandene Sperrschicht (18) verhindert bzw. verzögert.
Für den vollständigen Übergang der Lösung (22) von der
Kammer (6) und Sammelschicht (9) in die Reaktionskammer
(10) muß das Röhrchen (1) senkrecht gehalten und mit
der Gasspürpumpe die Schadstofflösung in die
Reaktionskammer (10) gesogen werden. Während des
Durchtritts der Schadstofflösung durch die
Reaktionskammer (10) entlang der immunochemisch
reaktiven Füllung (11) erfolgt die Immunreaktion (Fig.
10). Ein direkter Übergang der Schadstofflösung aus der
Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12) wird durch
eine vorhandene Sperrschicht (19) verhindert bzw.
verzögert. Nach einer definierten Reaktionszeit,
beispielsweise 5 bis 20 Minuten, wird die
Schadstofflösung erneut mittels Gasspürpumpe aus der
Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12) gesogen.
Diese Meßkammer (12) dient der Meßauswertung
beispielsweise anhand sichtbarer Verfärbung.
Bei der erfindungsgemäßen Immunreaktion ist die
Aerosol-Schadstoffkonzentration der farberzeugenden
Markierungskonzentration direkt proportional, so daß
die resultierende Farbintensität in der Meßkammer
direkt proportional zur Schadstoffmenge ist. Die
Auswertung der verschiedenen Markierungsintensitäten
ist sowohl mit dem bloßen Auge als auch mit Hilfe
optolelektrischer Abtastvorrichtungen möglich. Im Falle
von Farbmarkierungen können die verschiedenen
Farbintensitäten mit einem Farbstandard verglichen
werden. In der vorliegenden Erfindung ist die Meßkammer
(12) in den Fällen, in denen mit Enzymen als
farbgebender Komponente gearbeitet wird, gleichzeitig
Kammer für die Enzymreaktion. In ihr werden
beispielsweise Reagenzien (Substrate, Salze oder
Puffersubstanzen) in trockener lyophilisierter Form
(23) oder als Lösung (40) in einer brechbaren Ampulle
(39) (Fig. 2) bevorratet. Erst zum gewünschten
Zeitpunkt, bei Übergang der Flüssigkeit aus der
Reaktionskammer (10) in die Meßkammer (12), werden
diese Reagenzien im Falle des Lyophilisates (23)
rehydratisiert und als farbloses Enzymsubstrat durch
die immunchemisch freigesetzten Enzymtracer in eine
detektierbare Verfärbung umgesetzt. Die Inkubation und
anschließende Auswertung erfolgt nach definierten
Zeitvorgaben. Dabei verhindert die aus hydrophobiertem
Papier bestehende Flüssigkeitssperre (20) das Austreten
von Reagenzflüssigkeit in die Ansaugpumpe und damit
deren Schädigung.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
(Fig. 3-8) ist in direktem Anschluß an die
Reaktionskammer (10), versehen mit einer weiteren
Sperrschicht (24) und Halteelement (26), eine
Enzym-Reaktionskammer (25) angeordnet. Die
Enzym-Reaktionskammer (25) enthält in trockener Form
(38) (Fig. 7) bzw. als mit einem Enzym-Substrat (23)
imprägnierte körnige Reaktionsschicht (49) (Fig. 3-6)
oder in einer Brechampulle (39) (Fig. 8) spezifische
farbgebenden Enzym-Substrate für die Enzym-Tracer. Nach
der erfindungsgemäßen Immunreaktion in der
Reaktionskammer (10), beispielsweise nach 5 bis 20
Minuten, wird die Lösung mittels Gasspürpumpe aus der
Reaktionskammer (10) in die Enzym-Reaktionskammer (25)
gesogen. Hier erfolgt die enzymatische Umwandlung der
beispielsweise farblosen Substrate zu farbgebenden
Produkten. Nach einer definierten Reaktionszeit wird
erneut mittels Gasspürpumpe die nun mehr oder weniger
farbige Flüssigkeit aus der Enzym-Reaktionskammer (25)
in die Meßkammer (12) gesogen. Erfindungsgemäß befinden
sich bei dieser Ausführungsform in der Meßkammer (12)
Enzym-inhibierende Reagenzien (27) in lyophilisierter
Form, die nach Rehydratisierung durch die hinzukommende
Flüssigkeit die farbgebende Reaktion abstoppen und
somit ein über längere Zeit stabilisiertes Meßsignal
erzeugen. In der Ausführung nach Fig. 6 liegen die
Enzym-inhibierenden Reagenzien als Lösung (37) in einer
Brechampulle (36) vor.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
(Fig. 4), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie
Fig. 3, wird die Ampulle (7) durch beispielsweise zwei
nebeneinander angeordnete Brechampullen (28) und (29)
mit den Ampullenfüllungen (30) und (31) ersetzt. Dieses
ermöglicht die Bevorratung von Ampullenlösungen für die
nachfolgende Aerosolreaktion, die z. B. im vermischten
Zustand für längere Zeit chemisch inkompatibel,
instabil, nicht lagerbar o. a. sind. In einer weiteren
erfindungsgemäßen Ausführungsform (Fig. 5), mit
analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 3, wird
die Ampulle (7) durch zwei ineinander angeordnete
Brechampullen (32) und (33) mit den Ampullenfüllungen
(34) und (35) ersetzt. Diese Ausführungsform ermöglicht
die gleichzeitige Bevorratung von Reagenzien in zwei
unterschiedlichen Phasen, beispielsweise eine
Reagenzlösung oder einen Puffer in flüssiger Form (34)
und Reagenzien als Trockensubstanz (35). Wird die
Doppelampulle (32, 33) zum gegebenen Zeitpunkt an der
Sollbruchstelle (21) zerbrochen, wird die trockene
Reagenzsubstanz (35) durch den Puffer (34) gelöst und
kann anschließend als gebrauchsfertiges Ampullenreagenz
für den Aerosolnachweis wie beschrieben eingesetzt
werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
(Fig. 6), mit analoger Bestandteilzusammensetzung wie
Fig. 1 bzw. Fig. 3, wird das als Trockensubstanz in der
Meßkammer (12) bevorratete Reagenz (23) bzw.
enzyminhibierende Reagenz (27) durch eine Brechampulle
(36) mit der Ampullenlösung (37) ersetzt. Diese
Anordnung ermöglicht im Bereich der Meßkammer (12) die
Bevorratung von flüssigen Reagenzien. In den weiteren
erfindungsgemäßen Ausführungsformen (Fig. 7 und 8), mit
analoger Bestandteilzusammensetzung wie Fig. 3, wird
die Füllung der Enzym-Reaktionskammer (25) variiert.
Enthält die Enzym-Reaktionskammer (25) in Fig. 3 einen
trockenen, körnigen mit spezifischen farbgebenden
Enzymsubstraten (23) imprägnierten Träger (49), so
werden in Fig. 7 die spezifischen farbgebenden
Enzymsubstrate als reines Reagenz-Lyophilisat
beispielsweise in Pulver- oder als Pillen-Form (38), in
Fig. 8 als Ampullenflüssigkeit (40) in einer
zusätzlichen Brechampulle (39) bevorratet.
Welche der oben beschriebenen beispielhaften
Ausführungsformen zur Anwendung kommt, wird maßgeblich
von physiko-chemischen Eigenschaften des
nachzuweisenden Aerosols und weiteren
Reaktionsbestandteilen, der Qualität der Antikörper
sowie der Stabilität und Lagerbarkeit der verwendeten
Reagenzien beeinflußt.
In den beschriebenen Ausführungsbeispielen ist der
immunchemisch nicht reaktive Anteil der Füllung (11) in
der Reaktionskammer (10) auf einer Kugel (41) als
Träger (Fig. 9) dargestellt. Kunststoffkugeln,
beispielsweise aus Polystyrol als sog. Festphase, wie
sie dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunanalytik
bekannt sind, mit geeignetem Durchmesser für die
Reaktionskammer (10) für das erfindungsgemäße
Einwegreaktionsgefäß sind im Vergleich zu Glasgrieß
oder Silicagel besonders gut geeignet. Der Durchmesser
bzw. die Gestalt der Kugel (41) wird dabei so gewählt,
daß stets ein Luft- und Flüssigkeitsdurchtritt durch
das Prüfröhrchen gewährleistet wird, und daß beim
Einsatz dieser Kugel (41) in die Reaktionskammer nicht
auf eine bestimmte Orientierung geachtet werden muß.
Beispielhafte Gestaltungsformen der Kugeln (41), die
erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind in der
DE 34 48 006 C2 beschrieben. So kann beispielsweise
beim Einsatz von Kugeln mit radial herausragenden
Vorsprüngen eine koaxiale Anordnung der Kugeln in dem
erfindungsgemäßen zylindrischen Prüfröhrchen erreicht
werden. Hat die Kugel ebenfalls axiale und stirnseitige
Vorsprünge, so können diese dafür sorgen, daß bei
Verwendung eines Prüfröhrchens mit ebenem Boden bzw.
erfindungsgemäßer, ebener Halteelemente (15) und/oder
Sperrschichten (19), die Kugel in Abstand zu diesen
gehalten wird und dadurch den freien Flüssigkeitszugang
zu einer möglichst großen, die Immunreaktionszeit
verringernden Kontaktfläche der Füllung (11) aufrecht
erhalten wird.
Der Träger (41) der immunchemischen Füllung (11)
besteht aus Polystyrolkugeln (Fa. Spherotech,
Durchmesser = 4,76 mm). Diese Kugeln werden in einem
ersten Schritt (Fig. 9, A) mit anti-Antikörpern (42),
in diesem Beispiel anti-Maus-Immunglobulinen (Fa. DAKO,
Art.-Nr.: Z 109), beschichtet:
- - je Kugel wird 0,1 Mikroliter der
anti-Maus-Antikörperlösung eingesetzt, d. h.:
0,12 Mikrogramm Protein/Kugel, - - zusätzlich werden je Kugel + Proteinlösung, 150 Mikroliter 0,05 M PBS-Puffer dazugegeben,
- - Kugeln und Protein-Pufferlösung werden über Nacht bei 37°C inkubiert,
- - anschließend wird der Überstand abgesaugt bzw. dekantiert; danach werden die Kugeln dreimal mit Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) gewaschen.
Im zweiten Verfahrensschritt (Fig. 9, B) wird die Kugel
mit dem für das zu analysierende Aerosol spezifischen
monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörper (43), in
diesem Beispiel mit monoklonalen anti-DNP-Antikörper
#51 beschichtet:
- - je Kugel wird 1 Mikroliter der anti-DNP-Antikörper #51-Lösung eingesetzt, d. h.: 1 Mikrogramm Protein/Kugel,
- - zusätzlich werden je Kugel + Proteinlösung, 150 Mikroliter 25 mM Na-Acetatpuffer eingesetzt,
- - Kugeln und Protein-Pufferlösung werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Mögliche freigebliebene Bindungsstellen werden
anschließend mit Mausserum (Fa. Sigma, Art.-Nr.: M5905)
abgesättigt:
- - je Kugel werden 1,5 Mikroliter des Mäuseserums eingesetzt,
- - Kugeln und Mäuseserum werden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
- - anschließend wird der Überstand abgesaugt bzw. dekantiert; danach werden die Kugeln dreimal mit Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) gewaschen.
Ab diesem Verfahrensschritt können die vorbereiteten,
jetzt immunchemisch reaktiven Kugeln bis zur weiteren
Verwendung in beispielsweise 0,05 M PBS-Puffer mit
0,1% (w/v) Na-Azid (Fa. Merck, Art.-Nr.: 882 335) bei
4°C, bzw. in Anwesenheit der dem Fachmann bekannten
Stabilisatoren, trocken bei Raumtemperatur gelagert
werden.
Im dritten Verfahrensschritt (Fig. 9, C) werden die
spezifischen Antikörperbindungsstellen mit den während
der eigentlichen Aerosolmessung zu verdrängenden
Tracermolekülen (48) abgesättigt. Die beispielhaft
gewählten Tracer (48) bestehen aus Dinitrophenyl-Lysin
(DNP-L) (44), Biotin (45) und
Streptavidin-beta-Galactosidase (46).
Zur Kopplung von DNP-L mit Biotin werden:
- - 3,2 mg NE-2,4-DNP-L-Lysin Hydrochlorid (Fa. Sigma, Art.-Nr.: D-0380) und 4,5 mg Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester (Fa. Sigma, Art-Nr.: B-2643) in 500 Mikroliter Wasser- und Amin-freiem DMF gelöst, und
- - 25 Mikroliter Pyridin (Fa. Aldrich, Art.-Nr.: 27,097-0, 99%ig) zugefügt,
- - die Lösung mindestens 18 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert,
- - mit 500 Mikroliter Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) die Reaktion gestoppt,
- - die Reaktionsprodukte und Bestandteile mittels Chromatographie über Tris-Acryl GF05 Säulenmaterial (Fa. LKB, Art.-Nr.: 300-2500/810-2204) getrennt, Laufpuffer: 0,05 M PBS-Puffer, pH = 8,0,
- - der Chromatographieverlauf mittels Photometer verfolgt, das Säuleneluat fraktioniert aufgefangen und anschließend auf die dem Fachmann bekannte Weise spektralphotometrisch und immunchemisch analysiert.
Von dem auf diese Weise hergestellten
DNP-L-Biotin-Konjugat (44, 45) werden im nachfolgenden
Schritt:
- - 200 Mikroliter einer 1 : 1000 Verdünnung der immunchemisch aktiven, zusammengefaßten Chromatographiefraktionen, je Kugel, in 0,05 M PBS-Puffer eingesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
- - der verbleibende DNP-L-Biotin-Überschuß danach gründlich durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt,
- - anschließend erfolgt die Bindung zwischen Antikörper gebundenem "biotiniliertem" Analytderivat (DNP-L-Biotin) und dem Streptavidin-Enzym-Konjugat:
- - es werden 200 Mikroliter einer 1 : 1000 Verdünnung des Streptavidin-beta-Galactosidase-Konjugats (Fa. Boehringer Mannheim, Art.-Nr.: 1112481, 500U), je Kugel, in 0,05 M PBS-Puffer eingesetzt und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert,
- - der verbleibende Streptavidin-beta-Galactosidase- Konjugat-Überschuß wird danach gründlich durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt.
Der auf diese Weise aufgebaute Tracer (48) kann nun
in der nachfolgenden immunologischen
Verdrängungsreaktion aus seiner Bindung mit dem
Antikörper (43) durch den spezifischen Analyten (47)
verdrängt werden.
Die Immunreaktion zum erfindungsgemäßen Nachweis von
Schadstoffaerosolen erfolgt nach dem sog.
"Verdrängungsprinzip" (Kusterbeck, A.W., Wemhoff, G.A.,
Charles, P.T., Yeager, D.A., Bredehorst, R., Vogel,
C.-W. & Ligler, F.S. (1990): A continuous flow
immunoassay for rapid and sensitiv detection of small
molecules. J. Imm. Methods 135, pp. 191-197.) Mit
diesem Verdrängungs-Immunassay
(Displacement-Immunoassay) entfällt ein Mischen der
Proben mit dem Tracer (hierunter sollten Analyt oder
Analytderivat verstanden werden, woran ein oder mehrere
Markierungselemente gebunden sind), wie es bei
kompetitiven Assays erforderlich ist, um die
Konkurrenz-Reaktion für die begrenzten antigenen
Bindeplätze am Träger zu starten. In einem solchen
Displacementassay entfallen ebenfalls gesonderte
Reagenzgefäße bzw. Reagenzschichten samt zugehöriger
Reagenzien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Enzyme mit
den entsprechenden Farbsubstraten bevorzugte
Markierungselemente (Tracer) für den Schadstoff-Aerosol-
Nachweis.
In Fig. 10 sind schematisch die drei wesentlichen
Reaktionsschritte während der immunchemischen Reaktion
zwischen Analyt (47) und den beteiligten Reagenzien der
immunchemischen Füllung (11) in der Reaktionskammer
(10) des erfindungsgemäßen Prüfröhrchens dargestellt.
Der Ausgangszustand an der Füllung (11) während z. B.
der Lagerung des Reaktionsgefäßes und auch noch während
der Aerosol-Sammel- und Lösungsphase ist in Abschnitt D
der Fig. 10 dargestellt. Dabei sind alle verfügbaren
Bindeplätze der auf dem Träger (41) immobilisierten
spezifischen Antikörper (43) mit einem Analytderivat in
Form eines Enzym-markierten Tracers (48) abgesättigt.
Während des Inkontaktbringens der Lösung aus Kammer (6)
und/oder Sammelschicht (9) mit der Füllung (11) sowie
während der anschließenden definierten Inkubationszeit
wird dabei der Tracer (48) durch den Analyten (47)
verdrängt (Fig. 10, E). Zur Meßwerterfassung werden die
mit einer Markierung versehenen Tracer, die
proportional zur Analytkonzentration während der
immunchemischen Reaktion freigesetzt wurden,
herangezogen (Fig. 10, F).
Im hier beschriebenen Beispiel werden die nach Beispiel
2 hergestellten Kugeln mit DNP-L-Standards, d. h.
Lösungen unterschiedlich definierter Konzentrationen
(Fa. Sigma, Art.-Nr.: D0380), inkubiert:
- - 200 Mikroliter der DNP-L-Standardlösung werden je Kugel eingesetzt und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert,
- - anschließend werden 150 Mikroliter der Reaktionslösung entnommen und in einem weiteren Reaktionsgefäß zusammen mit dem Enzymsubstrat (s. u.) inkubiert.
Auf die Ausführungsform des Einwegreaktionsgefäßes
angewandt, bedeutet dies:
- - die Lösung wird in die körnige Reaktionsschicht (49)
des Enzym-Reaktionsbereichs (25) der Prüfröhrchen
überführt. Diese Reaktionsschicht enthält als
Enzymsubstrat:
Chlorophenolrot-beta-D-galactopyranosid (CPRG, Fa. Boehringer Mannheim, Art.-Nr.: 884308), - - nach einer Inkubationszeit von beispielsweise 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von je 50 Mikrolitern Stopplösung/Kugel abgestoppt.
Für die Ausführungsform des Einwegreaktionsgefäßes als
Röhrchen bedeutet dies:
- - nach einer definierten Reaktionszeit wird z. B. mittels Gasspürpumpe, die mehr oder weniger farbige Flüssigkeit aus der Enzym-Reaktionsschicht (25) in die Meßkammer (12) gesogen. In der Meßkammer (12) befinden sich Enzym-inhibierende Reagenzien (27) beispielsweise in lyophilisierter Form, die nach Rehydratisierung durch die hinzukommende Flüssigkeit die farbgebende Reaktion abstoppen und somit ein für längere Zeit stabilisiertes Meßsignal erzeugen.
Die Auswertung der Messung kann durch Farbvergleich mit
einem Farbstandard oder alternativ
spektralphotometrisch bei 574 bzw. 578 nm erfolgen.
In Fig. 9 sind schematisch die drei Phasen (A, B und C)
des Aufbaus der immunchemisch reaktiven Füllung (11)
dargestellt. Als Träger bzw. Festphase (41) für die
Immunreaktion werden Kunststoffkugeln beispielsweise
aus Polystyrol verwendet, auf/an denen der vorgeformte
Immunkomplex für die nachfolgende immunchemische
Reaktion aufgebaut wird. Der Komplex besteht aus einem
ersten immobilisierten spezifischen
anti-Antikörper-Immunglobulin (42) (Fig. 9, A), das
selektiv die anti-Analyt-Antikörper (43) bindet
(Fig. 9, B). Daran werden anschließend Analytderivate
beispielsweise in Form der hier verwendeten
Enzym-Konjugat-Tracer selektiv gebunden (Fig. 9, C).
In Fig. 10 sind schematisch die drei erfindungsgemäßen
Phasen (D, E, F) während des immunchemischen Nachweises
dargestellt. Fig. 10, D stellt den Ausgangszustand dar,
in dem ein Analytderivat Tracer (48) an den
spezifischen Antikörper (43) gebunden ist. Bei gleich
hoher Spezifität, aber unterschiedlicher Affinität von
Analyt (47) und Tracer (48) gegenüber der
Antikörperbindung, wird der Tracer (48) beim
Hinzukommen von Analyt (47) durch diesen aus seiner
Antikörperbindung verdrängt (Fig. 10, E) und
freigesetzt (Fig. 10, F). Die mit einer Markierung bzw.
farbgebenden oder farberzeugendem System verbundenen,
freigesetzten Tracer (48) erlauben nun eine direkt
proportionale Meßauswertung. Dabei ist das erzeugte
Signal/Markierung direkt proportional zur
Analytkonzentration in der untersuchten Probe.
A) Enzymsubstratlösung (CPRG-Lösung): 3,29 mM CPRG in
100 m M HEPES (Fa. Biochrom, Art.-Nr.: L1613); 150 mM
NaCl (Fa. Sigma, Art.-Nr. S9625); 10 mM MgCl₂ (Fa.
Merck, Art.-Nr. 5832); 0,1% (w/v)Na-Azid (Fa. Merck,
Art.-Nr. 882335); 1% (w/v) Rinderserumalbumin (Fa.
Sigma, Art.-Nr.: A3294); pH = 7,0.
- B) Abstopplösung: 1 M Galactose (Fa. Sigma, Art.-Nr.: G0750); 0,1 M EDTA (Fa. Merck, Art.-Nr.: 8418) in Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O).
- C) PBS-Puffer (0,05 M): 87 g di-Kaliumhydrogenphosphat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 5104) und 17 g Kalimu-di-hydrogenphosphat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 4873) in 900 ml Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) lösen, pH-Wert auf 7,0 einstellen, ad 1000 ml mit Reinstwasser. Anschließend: 1 : 10 in 0,9%iger (w/v) NaCl-Lösung (Fa. Clintec, Art.-Nr.: 45 358) verdünnen.
- D) Na-Acetat-Puffer (25 mM): 2,05 g Natriumacetat (Fa. Merck, Art.-Nr.: 6268) und 1,5 ml Essigsäure (Fa. Merck, Art.-Nr.: 818755) in 1 Liter Reinstwasser (d. h. bi-destilliertes H₂O) lösen.; pH-Wert auf 4,5 einstellen.
Claims (18)
1. Reaktionsgefäß zur Bestimmung von an Aerosolen
anhaftenden Schadstoffen in Luftproben, welches in
Durchströmungsrichtung angeordnet mindestens eine
brechbare mit einer Reagenzlösung gefüllte
Ampulle, eine Sammelschicht, eine Reaktionskammer,
eine Meßkammer, in der der Schadstoff mittels
einer Farbreaktion bestimmt wird, und eine
Flüssigkeitssperre enthält, dadurch
gekennzeichnet, daß zwischen Sammelschicht (9)
und Reaktionskammer (10) sowie zwischen
Reaktionskammer (10) und Meßkammer (12) eine den
Flüssigkeitstransport behindernde Sperrschicht
(18, 19) angeordnet ist, daß die Sammelschicht (9)
dafür vorgesehen ist, das Aerosol aus der Prüfluft
zurückzuhalten, und die Reagenzlösung (22) dafür
vorgesehen ist, den Schadstoff von dem Aerosol zu
lösen und in die Reaktionskammer (10) zu
transportieren, daß die Reaktionskammer (10) eine
an ein Trägermaterial (41) gebundene
immunologische Reaktionskomponente (43, 48) als
immunochemisch reaktive Füllung (11) enthält, die
nach dem Prinzip der immunochemischen Verdrängung
spezifisch mit dem als Analyt (47) wirkenden
Schadstoff und der Reagenzlösung (22) zu einer
Schadstofflösung umgesetzt wird, und daß ein
farbgebendes System (46; 23, 38, 40) vorgesehen
ist, welches die Schadstofflösung proportional zum
Schadstoffgehalt der Luftprobe anfärbt.
2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die immunologische
Reaktionskomponente aus einem für den Analyten
(47) spezifischen Antikörper (43) und einem daran
gebundenen Tracer (48) gebildet wird und der
Tracer (48) dafür vorgesehen ist, durch den
Analyten (47) verdrängt zu werden.
3. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das farbgebende System aus
einem ein Enzym (46) enthaltenden Tracer (48) und
einem für das Enzym (46) spezifischen farbgebenden
Enzym-Substrat (23, 38, 40) aufgebaut ist.
4. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat in
trockener lyophilisierter Form (23) oder als
Lösung (40) innerhalb einer Brechampulle (39) in
der Meßkammer (12) vorliegt.
5. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat (23, 38,
40) in einer Enzym-Reaktionskammer (25)
aufgenommen ist, die zwischen der Reaktionskammer
(10) und der Meßkammer (12) angeordnet ist und zu
beiden Kammern (10, 12) hin durch eine den
Flüssigkeitstransport behindernde Sperrschicht
(19, 24) begrenzt ist.
6. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat in
trockener Form (38) als Pulver oder Pille
vorliegt.
7. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat (23) in
trockener Form an eine körnige Reaktionsschicht
(49) gebunden vorliegt.
8. Reaktionsgefäß nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym-Substrat als Lösung
(40) innerhalb einer Brechampulle (39), die in der
Enzym-Reaktionskammer (25) angeordnet ist,
vorliegt.
9. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 3 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb der
Meßkammer (12) Enzym-inhibierende Reagenzien in
lyophilisierter Form (27) oder als in einer
Brechampulle (36) aufgenommene Lösung (37)
vorliegen.
10. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die immunologische
Reaktionskomponente (43, 48) kovalent oder
adsorptiv an das Trägermaterial (41) gebunden ist.
11. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß an das Trägermaterial (41) ein
anti-Antikörper (42) gebunden ist, der dafür
vorgesehen ist, die immunologische
Reaktionskomponente (43, 48) zu binden.
12. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1, 10 oder
11, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial
Kunststoffkugeln (41) verwendet werden.
13. Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß der Tracer aufgebaut ist aus
a) einem derivatisierten Analytmolekül (44) oder
einer vom Analyt (47) abgeleiteten chemischen
Verbindung (44), b) einem Enzym (46) und c) einem
die beiden Komponenten (44, 46) verbindenden
Biotin-Molekül (45).
14. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sperrschichten (18, 19,
24) aus hydrophobiertem Material, bevorzugt
Filtermaterial, gebildet sind.
15. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sammelschicht (9) aus
inerten Membranen mit definiertem Porendurchmesser
und/oder Quarzglasgewebe gebildet wird.
16. Reaktionsgefäß nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sammelschicht (9) körnigen
Quarz enthält.
17. Reaktionsgefäß nach einer der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Abstoppen der
Farbreaktion der Schadstofflösung mit dem
farbgebenden System (46; 23, 38, 40) ein
enzym-inhibierendes Reagenz verwendet wird.
18. Reaktionsgefäß nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß das enzym-inhibierende Reagenz
eine selektive Substrathemmung bewirkt.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE4343842A DE4343842C1 (de) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Reaktionsgefäß zur immunologischn Analytik von Aerosolen |
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ID=6505775
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