DE19808598A1

DE19808598A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen

Info

Publication number: DE19808598A1
Application number: DE19808598A
Authority: DE
Inventors: Rainer Polzius; Jessica Mahn; Thomas Wuske
Original assignee: Draeger Sicherheitstechnik GmbH
Current assignee: Draeger Safety AG and Co KGaA
Priority date: 1998-02-28
Filing date: 1998-02-28
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2018-03-01
Also published as: CA2251444A1; DE19808598B4; US6130097A

Abstract

Bei einem Verfahren zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen wird der zu untersuchende Staub mit einem Lösungsmittel zum Eluieren der nachzuweisenden Substanz aus dem Staub zusammengebracht. Die partikulären Bestandteile werden mittels einer Filtermatrix (2) zurückgehalten, während das Lösungsmittel und die darin gelösten und/oder suspendierten Substanzen durch die Filtermatrix (2) mittels kapillaren Flüssigkeitstransports transportiert werden. Das Lösungsmittel und die darin gelösten und/oder suspendierten Substanzen werden in eine an die Filtermatrix angrenzende Reaktionsmatrix mittels kapillaren Flüssigkeitstransports überführt. Die nachzuweisende Substanz wird in der Reaktionsmatrix mittels einer chemischen und/oder biochemischen Reaktion oder durch das Ausbleiben einer chemischen und/oder biochemischen Reaktion nachgewiesen. Eine Vorrichtung zum Nachweis staubassoziierter Substanzen enthält außer der Filtermatrix (2) und der Reaktionsmatrix (3) vorzugsweise einen Behälter (1) zur Aufnahme des zu untersuchenden Staubes, wobei der Behälter (1) in Fluidverbindung mit der Filtermatrix (2) steht.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen.

Die Analytik von staubassoziierten Substanzen stellt insbesonde re in Innenräumen eine wichtige Möglichkeit dar, Belastungssi tuationen und Expositionskonzentrationen mit bestimmten chemi schen oder biogenen Substanzen zu bewerten. Von besonderer Be deutung sind hierbei toxische Substanzen, wie Pestizide, poly aromatische Kohlenwasserstoffe oder polychlorierte Biphenyle, sowie allergieauslösende biogene Substanzen, wie Allergene von Hausstaubmilben, Haustierepithelien oder Schimmelpilzen.

Der Nachweis staubassoziierter Substanzen erfordert nach derzei tigem Stand der Technik neben einem Extraktionsschritt die Ab trennung der Partikel vom Extraktionsmittel und eine anschlie ßende in der Regel aufwendige Laboranalytik.

Bei anerkannten Analyseverfahren zur Ermittlung krebserzeugender Arbeitsstoffe wird beispielsweise der polyaromatische Kohlen wasserstoff Benzapyren durch Sammlung mit einem Glasfaserfilter im Gesamtstaub bestimmt. Die Quantifizierung von Benzapyren erfolgt nach Extraktion mit einem Lösemittel und Abtrennung der partikulären Bestandteile mit Hilfe eines dünnschichtchromato graphischen oder gaschromatographischen Nachweises.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß die einzelnen Arbeits schritte separat erfolgen und der Handhabungsaufwand für die Gesamtanalyse hoch ist.

Zur Detektion einiger relevanter Innenraumallergene, wie von Milben und Katzen, wurden immunchemische Nachweisverfahren ent wickelt. Hierbei werden die staubassoziierten Allergene unter Abtrennung der Partikel wäßrig eluiert. Die Allergenkonzentra tion wird anschließend separat aus dem Eluat mit Hilfe der ELI- SA-Methode ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") bestimmt.

In der EP 0 377 229 wird ein Verfahren beschrieben, mit dem staubassoziierte Allergene aufgrund ihrer Enzymaktivität nach gewiesen werden. Das zugrundeliegende Verfahren umfaßt eine aufwendige Probenvorbereitung bestehend aus Extraktion, Dialyse und Affinitätschromatographie, bevor die Nachweisreaktion durchgeführt werden kann.

In der US 4,806,490 wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die Allergenbelastung durch Hausstaubmilben anhand des Nachweises der Guaninkonzentration im Hausstaub quantifiziert werden kann. Nach einer aufwendigen Probenvorbereitung, bestehend aus mehre ren Extraktions- und Zentrifugationsschritten, wird der Guanin gehalt des Hausstaubs infolge einer separaten colorimetrischen Reaktion mit aromatischen Diazoverbindungen bestimmt.

Ein einfacheres Verfahren zur Bestimmung von staubgebundenen makromolekularen Analyten ist in der WO 96/07099 beschrieben. Die hier zugrundeliegende Vorrichtung erlaubt es, aus auf einem Filter gesammelten Staubpartikeln staubassoziierte Makromoleküle, Z.B. Allergene, durch Zugabe von Lösungsmitteln zu eluieren. Dabei werden die Makromoleküle in unmittelbarer Nähe der Parti kel immobilisiert. Anschließend können die immobilisierten Ma kromoleküle mit Hilfe von chemischen/biochemischen Festphasenre aktionen nachgewiesen werden. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Nachweisreaktion anschließend als separater Schritt durchgeführt werden muß.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu schaffen, um den Nachweis staubassoziierter Sub stanzen schnell, zuverlässig und ohne großen Aufwand durchführen zu können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch eine Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen mit den Merkmalen des Anspruchs 11. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens bzw. der Vorrichtung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren läuft also im wesentlichen so ab, daß

a) die aus einer Staubsuspension eluierten Substanzen infolge kapillaren Flüssigkeitstransports durch eine Filtermatrix trans portiert werden,
b) dabei die partikulären Bestandteile durch die Filtermatrix abfiltriert werden,
c) die eluierten Substanzen infolge kapillaren Flüssigkeits transports in eine nachfolgende Reaktionsmatrix transportiert werden und
d) die Substanzen in der Reaktionsmatrix durch eine chemische oder biochemische Reaktion nachgewiesen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den Nachweis staubas soziierter Analyten (nachzuweisender Substanzen) in einem auto nomen Prozeß, weshalb auf die aus dem Stand der Technik bekannte komplizierte Aufarbeitung der Staubproben verzichten werden kann. Hierdurch wird insbesondere erreicht, daß das Analysesy stem vor Ort auch von Nichtfachleuten angewendet werden kann. Dies gelingt mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung da durch, daß die Staubpartikel durch eine Filtermatrix (vorzugs weise ein filterartiges Vlies), die integraler Bestandteil des Nachweissystems ist, separiert werden und die durch ein Lösungs mittel eluierten Substanzen infolge eines kapillaren Flüssig keitstransports in eine nachfolgende Zone des Nachweissystems (Reaktionsmatrix) transportiert werden. In letzterer Zone er folgt der Nachweis des Analyten auf der Basis von chemischen und/oder biochemischen Reaktionen, vorzugsweise als Farbände rung.

Vorzugsweise weist die Vorrichtung einen zur Aufnahme des zu untersuchenden Staubes dienenden Behälter auf, der in Fluidver bindung mit der Filtermatrix steht. In dem Behälter können auf einfache Weise durch Zugabe des Lösungsmittels die staubassozi ierten Analyten aus der Staubprobe eluiert werden, um dann durch kapillaren Flüssigkeitstransport in die Filtermatrix zu gelan gen, durch die eine wirkungsvolle Trennung von den Staubpartikeln erzielt wird.

In den abhängigen Ansprüchen sind viele Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrich tung angegeben, insbesondere im Hinblick auf die grundsätzlichen Reaktionsschritte und den Aufbau der Filtermatrix und der Reak tionsmatrix. Das Nachweissystem für eine bestimmte Substanz hängt im einzelnen von den Eigenschaften diesem Substanz ab. Was den chemischen und/oder biochemischen Reaktionsablauf anbelangt, kann ein Fachmann aufgrund der für den Einzelfall vorbekannten Literatur die geeigneten Reaktionsreagentien auswählen und das Nachweissystem unter Zugrundelegung seines Fachwissens und des Offenbarungsgehalts in dieser Beschreibung in geeigneter Weise gestalten.

Zusammengefaßt gesagt, stellt die Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren bereit, die zur qualitativen oder auch zur quanti tativen Bestimmung von staubassoziierten Substanzen geeignet sind. Dabei erfolgt der Nachweis der staubassoziierten Substan zen in einem Schritt aus einer Staubsuspension, indem die Staub partikel durch eine Filtermatrix mechanisch separiert werden und die gelösten Substanzen in einer Reaktionsmatrix, die in Kontakt mit der Filtermatrix steht, nachgewiesen werden. Die Reaktions matrix ermöglicht durch ihre poröse Struktur den autonomen ka pillaren Transport der löslichen Substanzen, deren Nachweis zum Beispiel infolge der Solubilisierung chemischer oder biochemi scher Reagentien, die in der Filtermatrix bzw. der Reaktions matrix deponiert oder immobilisiert sind, erfolgt, vorzugsweise als Farbreaktion.

Im folgenden werden die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

Die Zeichnungen zeigen in

Fig. 1(a) eine schematische Querschnittsdarstellung einer ersten Ausführungsform einer Vorrichtung zum Nach weis von staubassoziierten Substanzen und

Fig. 1(b) eine schematische Querschnittsdarstellung einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen.

Die Vorrichtung gemäß Fig. 1(a) bzw. Fig. 1(b) besteht aus einem Behälter (1), der zur Aufnahme des zu untersuchenden Staubs bzw. einer Staubsuspension dient, einer Filtermatrix (2), die den Boden des Behälters (1) darstellt, und einer Reaktionsmatrix (3), die in der Lage ist, einen Fluidkontakt mit der Filterma trix (2) aufzubauen. Dabei kann die Anordnung der Komponenten derart erfolgen, daß ein vertikaler (Fig. 1(a)) oder ein latera ler (Fig. 1(b)) Flüssigkeitstransport zwischen Filtermatrix (2) und Reaktionsmatrix (3) erreicht wird.

Der Behälter (1) hat die Aufgabe, ein bestimmtes Volumen des zu untersuchenden Staubs bzw. einer Suspension des zu untersuchen den Staubs aufzunehmen, das typischerweise bei 0,05 ml bis 5 ml liegt. Als Materialien für den Behälter (1) kommen verschiedene Kunststoffe oder Metalle in Frage, die eine Dichtigkeit bzw. Beständigkeit gegenüber wäßrigen und organischen Lösungsmitteln aufweisen.

Der Boden des Behälters (1) wird von der Filtermatrix (2) gebil det, die als Membran oder Vlies ausgebildet sein kann und z. B. aus Glasfaser, Cellulose, Kunststoffen oder Silika bestehen kann. Um neben der Filterfunktion auch eine kapillaraktive Wir kung zu erreichen, werden für die Filtermatrix (2) bevorzugt Materialien eingesetzt, deren Porendurchmesser zwischen 0,1 µm und 50 µm liegt und die eine lineare Wasseraufnahmerate (lineare Fließgeschwindigkeit der aufgenommenen Flüssigkeit) von 1 mm/min bis 10 cm/min aufweisen. Besonders bevorzugt sind Materialien, die durch einen Porendurchmesser zwischen 0,5 µm und 10 µm und eine lineare Wasseraufnahmerate von 5 mm/min bis 5 cm/min ge kennzeichnet sind. Die Dicke des Materials kann zwischen 100 µm und 0,5 cm variieren.

Als Materialien für die Reaktionsmatrix (3) kommen alle Arten von Material in Frage, die nach Applikation einer Staubsuspen sion einen Fluidkontakt zur vorgeschalteten Filtermatrix (2) ausbilden und die dadurch gekennzeichnet sind, daß die in der Elutionsflüssigkeit (Lösungsmittel) gelöste, nachzuweisende Substanz nicht oder nur in geringem Maße an die Matrix bindet. Die Reaktionsmatrix (3) kann aus nur einem Material oder aus mehreren unterschiedlichen Materialien bestehen, die einen Fluidkontakt zueinander ermöglichen. Besonders bevorzugt sind Membranen oder Vliese, die eine Dicke zwischen 25 µm und 0,5 cm aufweisen, deren Porendurchmesser zwischen 0,1 µm und 50 µm liegt und die eine lineare Wasseraufnahmerate von 1 mm/min bis 10 cm/min aufweisen. Weiterhin bevorzugt sind Membranen oder Vliese, die eine Immobilisierung von Nachweisreagentien über ad sorptive oder kovalente Bindungen ermöglichen, wie z. B. Nitro cellulose oder aktivierte Nylonmembranen.

Die Filtermatrix (2) und die Reaktionsmatrix (3) können einstückig miteinander ausgebildet sein. Sie können aber auch zwei ge trennte Teile sein, die aneinandergrenzen. Um dabei einen kapil laren Flüssigkeitstransport von der Filtermatrix (2) in die Reaktionsmatrix (3) zu gewährleisten, können die Filtermatrix (2) und die Reaktionsmatrix (3) zum Beispiel in überlappender Anordnung stehen. Es ist auch denkbar, daß die Filtermatrix (2) und/oder die Reaktionsmatrix (3) ihrerseits mehrstückig aufge baut sind, also zwei oder mehr als zwei Teile aufweisen. Dabei können zum Beispiel aneinandergrenzende Teile überlappen. So kann beispielsweise ein erstes Teil der Filtermatrix (2) an eine Matrix angrenzen, die ein markiertes Reagenz enthält (siehe unten) und ebenfalls einen Filtereffekt aufweist. Diese Matrix grenzt zum Beispiel an die Reaktionsmatrix (3) an, die zum Bei spiel einen immobilisierten Bindungspartner (siehe unten) ent hält. Es kann vorteilhaft sein, wenn die Reaktionsmatrix mit einer Flüssigkeitsaufsaugmatrix in Fluidkontakt steht, zum Bei spiel einem mit der Reaktionsmatrix überlappenden Vlies, deren Zweck es ist, überschüssiges Lösungsmittel aufzusaugen.

In der Reaktionsmatrix (3) kann die nachzuweisende Substanz infolge einer chemischen oder biochemischen Reaktion vorzugs weise visuell als Farbänderung detektiert werden. Die hierzu notwendigen Reagentien, bei denen es sich um Chemikalien, wie z. B. pH-Indikatoren, oder um Bioreagentien, wie z. B. Enzyme oder spezifische Antikörper, handeln kann, werden in der Filtermatrix (2) oder in der Reaktionsmatrix (3) in getrockneter Form depo niert oder immobilisiert. Deponierte Reagentien werden durch die Elutionsflüssigkeit resolubilisiert und können so mit dem Analy ten reagieren. Im Falle einer Immobilisierung der Nachweisre agentien findet eine chemische oder biochemische Festphasenreak tion statt. Der Nachweis kann aber auch über eine homogene Reak tion in der flüssigen Phase erfolgen.

Besonders bevorzugt sind biochemische Festphasenreaktionen, die auf der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung basieren. Solche Ver fahren sind als Immunchromatographie oder auch als Immunkonzen tration (Price und Newman 1991, Principles and Practice of Immu noassay, Stockton Press, 563-609) dem Fachmann bekannt. Dabei wird ein spezifischer Bindungspartner in der Reaktionsmatrix (3) immobilisiert. Die Kopplung an die Festphase kann adsorptiv, ionisch, kovalent oder durch Verbrückung des spezifischen Bin dungspartners mit z. B. Protein A, Avidin oder Latexpartikeln erfolgen. Abhängig vom Format des immunchemischen Nachweises besteht die Festphasenreaktion in der Ausbildung (a) eines Kom plexes aus dem immobilisierten Bindungspartner, der nachzuwei senden Substanz und einem markiertem Bindungspartner (Zweisei tentest) oder (b) eines Komplexes aus dem immobilisierten Bin dungspartner und einem markiertem Bindungspartner, dessen Bin dungseigenschaften durch Bindung an die nachzuweisende Substanz beeinflußt werden (kompetitiver Test).

Als Bindungspartner werden vorzugsweise Antikörper, die monoklo nal oder polyklonal sein können, oder deren Fragmente verwendet. Im kompetitiven Test werden neben den spezifischen Antikörpern oder deren Fragmenten die nachzuweisende Substanz bzw. Derivate der nachzuweisenden Substanz, die an Makromoleküle gekoppelt sein können, als Bindungspartner verwendet. Beim kompetitiven Test sind solche Ausführungsformen bevorzugt, bei denen der markierte Bindungspartner durch eine Abfangzone gebunden wird und die durchbrechenden, infolge von Bindung an die nachzuwei sende Substanz von der Abfangzone nicht gehaltenen markierten Bindungspartner angezeigt werden. Dieses Prinzip ist aus der Durchbruchchromatographie bekannt (C.R. Lowe und P.D.G. Dean, Affinity Chromatography, Wiley & Sons, New York, 1974) und liegt beispielsweise der EP 0 052 769 zugrunde. Detaillierte Beispiele für einen Zweiseitentest und einen kompetitiven Test sind unten angegeben.

Die markierten Bindungspartner können in der Filtermatrix (2) oder in der Reaktionsmatrix (3) in trockener Form enthalten sein. Infolge des Flüssigkeitstransports der Elutionsflüssigkeit werden die markierten Bindungspartner aus der Matrix heraus ge löst und in die Zone transportiert, in der die immunchemische Festphasenreaktion stattfindet.

Als Markierungssubstanzen, also als signalgebende Komponenten, kommen Enzyme, Fluorophore, radioaktive Isotope oder gefärbte Partikel in Frage. Besonders geeignet für das Verfahren ist die Verwendung von direkten optischen Markern, wie Metallkolloiden, gefärbten Latexpartikeln oder Fluorophoren.

Beispiele für nachweisbare Substanzen im Hausstaub sind Umwelt schadstoffe wie z. B. polyaromatische Kohlenwasserstoffe, poly chlorierte Biphenyle und Pestizide. Von besonderem Interesse sind jedoch biogene Schadstoffe wie Hausstaubmilbenallergene, Haustierallergene, Schimmelpilze, Bakterien, Viren, Nukleinsäu ren und Endotoxine.

Die Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen kann vorzugsweise auf zwei unterschiedliche Weisen angewendet werden. Im ersten Fall wird eine wäßrige Staubsuspension, die in einem vorangegangenen Präparationsschritt hergestellt wurde, auf die Vorrichtung appliziert. Dies kann auch in der Weise erfol gen, daß der Behälter (1), der die Staubsuspension enthält, mit der Filtermatrix (2) und der Reaktionsmatrix (3) derart in Kon takt gebracht wird, daß sich über die Filtermatrix (2) ein Ka pillareffekt ausbildet und die beschriebene Filtrations- und Nachweisreaktion ablaufen kann.

Im zweiten Fall wird der Behälter (1) mit einer definierten Menge des Staubes, die typischerweise zwischen 5 mg und 100 mg liegt, gefüllt, so daß die Filtermatrix (2) von einer Staub schicht bedeckt ist. Anschließend wird die Extraktions- und Nachweisreaktion durch die Zugabe von Elutionsflüssigkeit (Lö sungsmittel), deren Volumen typischerweise zwischen 0,05 ml und 5 ml liegt, in Gang gesetzt. Hierbei hat sich überraschend ge zeigt, daß bedingt durch die physikochemischen Eigenschaften von Hausstaub eine hydrophobe Barriere entsteht, so daß die Elu tionsflüssigkeit (Elutionsmittel) nur langsam in die Staub schicht eindringt. Dieser Säuleneffekt hat zur Folge, daß die Verweilzeit des Elutionsmittels in der Staubphase verlängert wird und sich dadurch eine hohe Extraktionseffizienz ergibt.

Als Elutionsmittel werden bevorzugt gepufferte wäßrige Lösungen mit einem pH-Wert zwischen 4 und 12 verwendet, die einen Anteil von bis zu 50 Vol% organischer Lösungsmittel enthalten können. Desweiteren können ionische und nicht-ionische Detergentien zwischen 0,01 Vol% und 10 Vol% im Elutionsmittel enthalten sein.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft anhand des Nachwei ses von Pentachlorphenol und des Katzenallergens Fel d I aus Hausstaub beschrieben.

Beispiel 1 Nachweis von Pentachlorphenol (PCP) aus Staub (kompetitiver Test)

Prinzip: Die Filtermatrix enthält einen mit kolloidalem Gold markierten, für PCP spezifischen Bindungspartner (Goldmarker- Konjugat). Wenn PCP in der Elutionsflüssigkeit vorliegt, kann dieser Bindungspartner wegen seiner hohen Affinität zu PCP nicht von einem in der Reaktionsmatrix in immobilisiertem Zustand vor liegenden Bindungspartner (PCP-Konjugat) abgefangen werden, was bei Fehlen von PCP der Fall wäre.

a) Herstellung des Goldmarkers

Es wurden 0,5 l destilliertes und filtriertes (0,2 µm) Wasser in einem silikonisierten Becherglas unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 ml 1%ige Goldsäure hinzugefügt. Die Lösung wurde weitere 5 Minuten gekocht und dann 20 ml 1%ige Natriumcitrat-Lösung rasch hinzugegeben. Nach weiteren 10 Minuten zeigte ein Farb umschlag von blau nach rot das Ende der Reaktion an. Das Kolloid wurde im Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von 5 ml 2%iger NaN₃-Lösung und von 0,5 ml 1%igem PEG (Polyethy lenglykol) 20000 stabilisiert.

b) Herstellung des Goldmarker-Konjugats

Der pH-Wert der Goldkolloid-Lösung wurde durch Zugabe von 0,2 M K₂CO₃ auf pH 9 eingestellt. 10 mg eines für PCP spezifischen monoklonalen Antikörpers wurde zur Lösung zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 200 mg Crotein C zur Lösung und einer Inkubation für weitere 30 Minuten wurden die Konjugate aus Antikörpern und Goldmarkern durch 15- minütige Zentrifugation bei 40 000 × g erhalten, indem das Pellet in 0,1 M HEPES (Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure)-Puffer, pH 7,0, mit den Zusätzen 0,1% Crotein C und 0,05% PEG 20 000 aufgenommen wurde.

c) Herstellung des PCP-Konjugats

1 mg 5-(4-Hydroxy-2,3,5,6-Tetrachlorphenoxy)-Valeriansäure wur den zusammen mit 1,7 mg N-Hydroxy-Succinimid (NHS) und 6,2 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in DMF gelöst und für 18 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend gab man die Mischung tropfenweise zu einer Lösung von 2 mg Ziegen-IgG in 2 ml 0,15 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, inkubierte weitere 3 h und dia lysierte für 2 Tage gegen PBS-Puffer.

d) Präparation der Filtermatrix

GF/F Glasfaservliesmaterial (Whatman, UK) wurde in Streifen mit 0,8 cm Breite und 2,5 cm Länge geschnitten, in der Goldmarker- Konjugat Lösung (Optische Dichte bei 520 nm auf 2 eingestellt) getränkt und bei 40°C für 20 Minuten im Umluftofen getrocknet.

e) Aufbau der Reaktionsmatrix

Als Reaktionsmatrix wurde eine Nitrocellulose-Membran mit der Porengröße 5 µm (Schleicher & Schüll, Deutschland), die eine Breite von 0,8 cm und eine Länge von 5 cm aufwies, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands auf einem Kunststofflaminat mit einer Stärke von 1 mm fixiert. Mit Hilfe eines Camag-Linomaten IV (Camag, Schweiz) wurde 1 cm vom vorderen Rand der Nitrocellu lose entfernt das PCP-Konjugat in einer Konzentration von 5 mg/ml als Linie aufgesprüht (1 µl/cm). Anschließend wurde die Membran für 30 Minuten bei 40°C im Umluftofen getrocknet, mit 0,1%iger Rinderserumalbuminlösung für 10 Minuten blockiert und erneut für 30 Minuten bei 40°C getrocknet.

f) Zusammenbau des Analysesystems

Die mit Goldmarker-Konjugat getränkte Filtermatrix wurde derart mit doppelseitigem Klebeband auf dem Kunststofflaminat fixiert, daß sie die Reaktionsmatrix um 2 mm an ihrem vorderen Ende über lappte. Somit erhielt man einen Teststreifen mit einer Breite von 0,8 cm, bestehend aus einer 2,5 cm langen Filtermatrix und angrenzend einer 5 cm langen Reaktionszone, dessen einzelne Kom ponenten im Fluidkontakt zueinander standen.

g) Analyse von Staubproben

In einem Behälter (Durchmesser: 1 cm, Höhe 2 cm) wurden 50 mg Hausstaub in 1 ml Elutionsflüssigkeit (0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, 25% Methanol, 0,05% Triton 100) durch 5-minütiges Schütteln extrahiert.

Die Nachweisreaktion von PCP wurde anschließend dadurch gestar tet, daß das Analysesystem (f) vertikal in den Behälter gestellt wurde, wobei die Filtermatrix in die Staubsuspension eintauchte. Im Falle einer unbelasteten Staubprobe entwickelte sich nach ca. 5 Minuten eine rote Linie in der Reaktionsmatrix. Bei PCP-Bela stungen von mindestens 1 µg/g Staub wurde die rote Linie nicht sichtbar.

Beispiel 2 Nachweis des Katzenallergens Fel d I aus Staub (Zweiseitentest)

Prinzip: Die Filtermatrix enthält einen mit kolloidalem Gold markierten, für Fel d I spezifischen Bindungspartner (Goldmar ker-Konjugat). In der Reaktionsmatrix ist ein zweiter für Fel d I spezifischer Bindungspartner immobilisiert, der im Falle des Vorliegens von Fel d I durch von Fel d I vermittelte Bindung des Goldmarker-Konjugats sichtbar wird.

a) Herstellung des Goldmarkers

Es wurden 0,5 l destilliertes und filtriertes (0,2 µm) Wasser in einem silikonisierten Becherglas unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 ml 1%ige Goldsäure hinzugefügt. Die Lösung wurde weitere 5 Minuten gekocht, und dann wurden 20 ml 1%ige Natriumcitrat- Lösung rasch hinzugegeben. Nach weiteren 10 Minuten zeigte ein Farbumschlag von blau nach rot das Ende der Reaktion an. Das Kolloid wurde im Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von 5 ml 2%iger NaN₃-Lösung und von 0,5 ml 1%igem PEG (Polyethylenglykol) 20 000 stabilisiert.

b) Herstellung des Goldmarker-Konjugats

Der pH-Wert der Goldkolloid-Lösung wurde durch Zugabe von 0,2 M K₂CO₃ auf pH 9 eingestellt. 10 mg eines ersten für Fel d I spe zifischen monoklonalen Antikörpers wurde zur Lösung zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 200 mg RSA zur Lösung und einer Inkubation für weitere 30 Minuten wurden die Konjugate aus Antikörpern und Goldmarkern durch 15-minütige Zentrifugation bei 40 000 × g erhalten, indem das Pellet in 0,1 M HEPES (Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfon säure)-Puffer, pH 7,0, mit den Zusätzen 0,1% RSA und 0,05% PEG 20 000 aufgenommen wurde.

c) Präparation der Filtermatrix

F075-14 Glasfaservliesmaterial (Whatman, UK) wurde in Streifen mit 0,8 cm Breite und 2,5 cm Länge geschnitten, in der Goldmar ker-Konjugat-Lösung (Optische Dichte bei 520 nm auf 3 einge stellt) getränkt und bei 40°C für 20 Minuten im Umluftofen ge trocknet.

d) Aufbau der Reaktionsmatrix

Als Reaktionsmatrix wurde eine Nitrocellulose-Membran mit der Porengröße 5 µm (Schleicher & Schüll, Deutschland), die eine Breite von 0,8 cm und eine Länge von 2,5 cm aufwies, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands auf einem Kunststofflaminat mit einer Stärke von 1 mm fixiert. Mit Hilfe eines Camag-Linomaten IV (Camag, Schweiz) wurde 1 cm vom vorderen Rand der Nitrocellu lose entfernt ein zweiter für Fel d 1 spezifischer monoklonaler Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml als Linie aufge sprüht (1 µl/cm). Anschließend wurde die Membran für 30 Minuten bei 40°C im Umluftofen getrocknet, mit 0,1%iger Rinderserumal buminlösung für 10 Minuten blockiert und erneut für 30 Minuten bei 40°C getrocknet.

e) Zusammenbau des Analysesystems

Die mit Goldmarker-Konjugat getränkte Filtermatrix wurde derart mit doppelseitigem Klebeband auf dem Kunststofflaminat fixiert, daß sie die Reaktionsmatrix um 2 mm an ihrem vorderen Ende über lappte. Ebenfalls mit 2 mm Überlappung wurde am hinteren Ende der Reaktionsmatrix ein 2 cm langes und 0,8 cm breites Glasfa servlies GF/F (Whatman, UK) fixiert, das als Flüssigkeitsauf saugmatrix diente. Somit erhielt man einen Teststreifen mit einer Breite von 0,8 cm, bestehend aus einer 2,5 cm langen Fil termatrix und angrenzend einer 2,5 cm langen Reaktionszone und einer 2 cm langen Flüssigkeitsaufsaugmatrix, dessen einzelne Komponenten im Fluidkontakt zueinander standen.

Ein Hülse aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,5 cm und einer Höhe von 1 cm wurde auf die Filtermatrix des Analyse systems aufgepreßt und mit einem Klebestreifen fixiert.

f) Analyse von Staubproben

In den durch das Aufpressen der Hülse entstandenen Behälter wurde 30 mg Hausstaub, der mit 10 µg Fel d I/g Staub belastet war, eingefüllt. Durch Zugabe von 0,3 ml Elutionsflüssigkeit (0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, 0,1% Tween 20) wurde die Nach weisreaktion gestartet. Nach ca. 5 Minuten wurde eine rote Linie in der Reaktionsmatrix sichtbar. Bei unbelasteten Staubproben ergab sich keine Verfärbung in der Reaktionsmatrix.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen, mit den Schritten:

- Zusammenbringen des zu untersuchenden Staubes mit einem Lösungsmittel zum Eluieren der nachzuweisenden Substanz aus dem Staub,
- Zurückhalten der partikulären Bestandteile mittels einer Filtermatrix und Transportieren des Lösungsmittels und der darin gelösten und/oder suspendierten Substanzen durch die Filtermatrix mittels kapillaren Flüssigkeitstransports,
- Überführen des Lösungsmittels und der darin gelösten und/oder suspendierten Substanzen in eine an die Filtermatrix angrenzende Reaktionsmatrix mittels kapillaren Flüssigkeits transports,
- Nachweisen der nachzuweisenden Substanz in der Reaktions matrix mittels einer chemischen und/oder biochemischen Reak tion oder durch das Ausbleiben einer chemischen und/oder biochemischen Reaktion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Substanz mit einem in der Filtermatrix ent haltenen Reagenz zu einem Produkt reagiert, das mittels kapillaren Flüssigkeitstransports in die Reaktionsmatrix überführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Substanz oder ein Reaktionsprodukt der nachzuweisenden Substanz mit einem in der Reaktionsma trix enthaltenen Reagenz zu einem Produkt reagiert, das mit tels kapillaren Flüssigkeitstransports in der Reaktionsma trix weitergeleitet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß für das in der Filtermatrix bzw. das in der Reaktions matrix enthaltene Reagenz ein mit einer Markierungssubstanz markiertes Reagenz verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungssubstanz ein Enzym und/oder eine Fluorophore und/oder ein radioktives Isotop und/oder Farbpartikel, vor zugsweise kolloidales Gold, verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß in der Reaktionsmatrix bei Vorliegen der nach zuweisenden Substanz eine chemische und/oder biochemische Festphasenreaktion mit einem immobilisierten Nachweisreagenz stattfindet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß in der Reaktionsmatrix bei Vorliegen der nach zuweisenden Substanz eine chemische und/oder biochemische Festphasenreaktion mit einem immobilisierten Nachweisreagenz ausbleibt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, daß eine Antikörper-Antigen-Reaktion angewendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß die nachzuweisende Substanz mittels einer Farbänderungsreaktion nachgewiesen wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß das Zusammenbringen des zu untersuchenden Staubes mit dem Lösungsmittel in einem mit der Filtermatrix in Fluidverbindung stehenden Behälter erfolgt.

11. Vorrichtung zum Nachweis von staubassoziierten Substanzen,

- mit einer Filtermatrix (2), die dazu eingerichtet ist, partikuläre Bestandteile des zu untersuchenden Staubes zu rückzuhalten und ein Lösungsmittel zum Eluieren der nachzu weisenden Substanz aus dem Staub sowie die in dem Lösungs mittel gelösten und/oder suspendierten Substanzen mittels kapillaren Flüssigkeitstransports zu transportieren, und
- mit einer Reaktionsmatrix (3), die in für kapillaren Flüs sigkeitstransport eingerichteter Fluidverbindung mit der Filtermatrix (2) steht und ein Nachweisreagenz zum Nachweis der nachzuweisenden Substanz aufweist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) und die Reaktionsmatrix (3) einstückig miteinander ausgebildet sind.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) und die Reaktionsmatrix (3) zwei ge trennte Teile sind, die aneinandergrenzen.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) und die Reaktionsmatrix (3) in über lappender Anordnung stehen.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeich net, daß die Filtermatrix (2) mehrteilig aufgebaut ist und/oder daß die Reaktionsmatrix (3) mehrteilig aufgebaut ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Reaktionsmatrix (3) eine Flüssigkeitsaufsaugmatrix anschließt.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) eine Membran und/oder ein Vlies aufweist.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) Glasfaser, Cellulo se, Kunststoffe und/oder Silika aufweist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) Poren mit einem Porendurchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 50 µm, vorzugs weise im Bereich von 0,5 µm bis 10 µm, hat.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) eine Dicke im Be reich von 0,1 mm bis 5 mm hat.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) eine Membran und/oder ein Vlies aufweist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) Nitrocellulose und/oder eine aktivierte Nylonmembran aufweist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) Poren mit einem Porendurchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 50 µm hat.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) eine Dicke im Bereich von 0,025 mm bis 5 mm hat.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermatrix (2) ein Reagenz ent hält, das dazu eingerichtet ist, mit der nachzuweisenden Substanz zu einem Produkt zu reagieren, das mittels kapilla ren Flüssigkeitstransports in die Reaktionsmatrix (3) über führbar ist.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) ein Reagenz ent hält, das dazu eingerichtet ist, mit der nachzuweisenden Substanz oder einem Reaktionsprodukt der nachzuweisenden Substanz zu einem Produkt zu reagieren, das mittels kapilla ren Flüssigkeitstransports in der Reaktionsmatrix (3) wei terleitbar ist.

27. Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeich net, daß das in der Filtermatrix (2) bzw. das in der Reak tionsmatrix (3) enthaltene Reagenz mit einer Markierungs substanz markiert ist.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungssubstanz ein Enzym und/oder eine Fluorophore und/oder ein radioktives Isotop und/oder Farbpartikel, vor zugsweise kolloidales Gold, aufweist.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmatrix (3) ein immobili siertes Nachweisreagenz aufweist.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 29, gekennzeich net durch einen Behälter (1) zur Aufnahme des zu untersu chenden Staubes, wobei der Behälter (1) in Fluidverbindung mit der Filtermatrix (2) steht.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden oder ein Teil des Bodens des Behälters (1) durch die Filtermatrix (2) gebildet ist.

32. Vorrichtung nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeich net, daß der Behälter (1) an seiner Oberseite eine Öffnung aufweist.