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Die vorliegende Erfindung betrifft ein vereinfachtes
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Trennverfahren für eine immunologische Bestimmung wie eine radio-,
fluoreszenz- und/oder enzym-immunologische Bestimmung, bei der ein Antigen-Antikörper-Komplex
vom freien, nicht gebundenen Antigen getrennt werden muß, sowie eine chromatographische
Säule für die Durchführang dieses Verfahrens und einen eine derartige Säule enthaltenden
Kit.
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Der quantitative Nachweis kleinster biologisch bereits wirksamer Substanzmengen
in Körperflüssigkeiten, Lebensmitteln, in Luft und Wasser ist von großer Bedeutung
für die Medizin, Pharmakologie, Toxikologie und ökologie.
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Für Forschungszwecke und für Routineuntersuchungen wurden bereits
zahlreiche Analysemethoden entwickelt, wie z.B.
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die Fluorometrie, die Chromatographie, die Massenfragmentographie
und die Neutronenaktivierungsanalyse.
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Eine besondere- Gruppe von Bestimmungsverfahren sind immunologische
Bestimmungsverfahren, die die extrem hohe Spezifität immunologischer Reaktionen
ausnutzen. Es handelt sich bei derartigen Verfahren im Prinzip um eine Konkurrenzreaktion
von markiertem Antigen (Ag') und nicht markiertem Antigen (Ag) um die Bindung an
einen spezifischen Antikörper (Ak) unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes.
Aus dem Anteil an gebundenem markiertem Antigen läßt sich die zu bestimmende Menge
des nicht markierten Antigens ermitteln. Die Markierung des Antigens erfolgte bisher
mit fluoreszierenden Substanzen, Enzymen und im Falle des als Radio-Immuno-Assay
(RIA) bekannten Verfahrens mit Isotopen. Theoretisch sind auch andere Markierungen
denkbar, sofern eine geeignete Meßmethode gefunden werden kann.
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Neben der fluoreszenz- und enzym-immunologischen Bestimmungsmethode
hat-sich seit 1959 vor allem das radio-
immunologische Untersuchungsverfahren
(Radio-Immuno-Assay - RIA) von Yalow durchgesetzt. Es verbindet die außerordentliche
Spezifität der immunologischen Reaktion und die hohe Nachweisempfindlichkeit radioaktiv
markierter Substanzen mit einer relativ einfachen Durchführbarkeit und ermöglicht
erstmals eine Quantifizierung im Pico- und Femtogrammbereich.
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Auf Grund der besonderen Bedeutung des Radio-Immuno-Assays wird die
vorliegende Erfindung nachfolgend stets anhand ihrer Verwendung bei diesem Verfahren
beschrieben, obwohl sich für den Fachmann sofort erkennen läßt, daß die vorliegende
Erfindung für alle immunologischen Bestimmungsverfahren angewendet werden kann,
beidenenes um eine Trennung eines Antikörper-Antigen-Komplexes von freien Antigenen
geht.
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Wie dem Fachmann gut bekannt ist, muß für eine radioimmunologische
Bestimmung das Antigen, d.h. die nachzuweisende Substanz, zunächst aus biologischem
Material oder durch Synthese gewonnen werden. Es wird teils radioaktiv markiert,
teils für die Immunisierung zur Gewinnung von Antikörpern verwendet, während die
unveränderte Verbindung als Bezugsstandard für die Eichkurve benötigt wird. Für
die Markierung ist die Reinheit des Antigens und der Radionukleide eine unerläßliche
Voraussetzung, damit eine Mitmarkierung etwaiger Begleitsubstanzen bzw. eine Verminderung
der Nachweisempfindlichkeit vermieden wird. Ublicherweise erfolgt die Markierung
mit 125J wegen dessen längerer Halbwertzeit, besserer Nachweisbarkeit und geringerer
Radiolyse.
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Antikörper sind komplexe Proteinmoleküle. Sie gehören zu den Gammaglobulinen
und werden bei der immunologischen Abwehrreaktion auf fremde oder körpereigene Antigene
von bestimmten Antikörper bildenden Zellen produziert.
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Zur Stimulation der Antikörperbildung müssen die Antigene ein Molekulargewicht
über 10 0Q0 aufweisen, wie z.B. Insulin oder das Wachstumshormon. Substanzen mit
niedrigerem Molekulargewicht wie Steroide, Schilddrüsenhormone und Pharmaka wie
Digoxin haben primär keine Antigeneigenschaft und können erst als Derivat und gekoppelt
an ein Protein eine Antikörperbildung auslösen.
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Derartige Substanzen werden als Haptene bezeichnet, und da die gegen
die Antigene gebildeten Antikörper spezifisch auch die Haptene binden, ist auch
deren Bestimmung nach immunologischen Bestimmungsmethoden möglich.
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Bei Thyroxin ist trotz eines Molekulargewichts von 777 der Umweg über
eine Proteinbindung nicht erforderlich; man kann direkt das spezifisch bindende
Transportprotein im Serum als Antikörper verwenden, d.h. es ist eine sog.
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Proteinbindungsanalyse möglich.
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In reiner Form isolierte Antikörper und Antigene gehören in der Immunreaktion
spezifisch zueinander wie Schlüssel zu Schloß. Der Antikörper kann dabei zwischen
den zu bestimmenden unmarkierten Antigenen (Ag) und den in bekannter Menge vorhandenen
markierten Antigenen (Ag') nicht unterscheiden. Bei einer ausreichenden Bindungsaffinität
stellen sich somit die folgenden Gleichgewichte ein:
Für eine quantitative Bestimmung von Antigenen (Ag) müssen drei Voraussetzungen
erfüllt sein: 1. Die Bindungskonstante k ist für die komplexe Ag.Ak und Ag'.Ak gleich.
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2. Ak liegt im Unterschuß vor, so daß neben dem Komplex Ag'.Ak auf
jeden Fall noch freies Ag' vorliegt.
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3. Ag, die unmarkierte zu bestimmende Substanz, ist die einzige Variable.
Die Konzentration von Ag' und Ak bleibt konstant.
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Die an die Antikörper (Ak) gebundene Menge von markiertem Antigen
(Ag') steht im umgekehrten Verhältnis zur Menge des zu bestimmenden Antigens (Ag).
Um quantitativ festzustellen, welcher Anteil des markierten Antigens nach Einstellung
des Gleichgewichts komplex gebunden ist, müssen alle Antigen-Antikörper-Komplexe
(Ag.Ak, Ag'.Ak) vom freien, nicht gebundenen Antigen (Ag, Ag') abgetrennt werden.
Dieser Trennschritt ist im allgemeinen technisch und zeitlich aufwendig und meist
mit nicht unerheblichen Fehlern behaftet. Die verschiedenen angewandten Separationsverfahren-stellen
daher die größten Unterschiede zwischen den bekannten RIA-Systemen dar.
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Zu den bekannten universell anwendbaren Trenntechniken gehören das
Solid-Phase-System, die Doppelantikörpermethode und die Polyäthylenglykol- (PEG-)
Fällung. Bei der Solid-Phase-Methode wird ein an einen festen Träger kovalent oder
durch Adsorption gebundener Antikörper eingesetzt. Dient das Inkubationsröhrchen
selbst als feste Phase (coated tube), so ist zusbedenken, daß bisweilen die Fixierung
des Antikörpers unregelmäßig ist und der Antikörper sich während der Inkubations-
und Waschschritte teilweise ablösen kann. Die Doppelantikörper-Trenntechnik nutzt
die Vergrößerung und damit die bessere Sedimentierung des Antigen-Antikörper-Komplexes
aus. Hierbei reagiert ein zweiter Antikörper, der seinerseits gegen den Antigen-Antikörper-Komplex
gerichtet ist, unter Bildung eines sehr viel größeren hochmolekularen Komplexes.
Bei dieser Methode ist die unspezifische Bindung
deutlich geringer
als bei der PEG-Fällungsmethode, nachteilig ist jedoch die im Vergleich zur PEG-Fällung
sehr geringe Präzipitation (Fällung) des Doppelantikörperkomplexes. Durch Zugabe
kleiner Mengen dieses PEG-Fällungsmittels läßt. sich die Doppelantikörpermethode
bisweilen verbessern.
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Mit Ausnahme des Coated-Tube-Assays ist bei allen herkömmlichen Methoden
eine Zentrifugation erforderlich, was wegen der Anschaffungskosten für die Zentrifuge
und des Zeitaufwandes als nachteilig anzusehen ist.
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Zusätzlich fallen bei allen bisherigen radio-immunologischen Separationsverfahren
radioaktive Flüssigkeiten an, die dekantiert bzw. aspiriert werden müssen, was neben
dem Zeitaufwand vor allem eine Kontaminationsgefahr mit.
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sich bringt.
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Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein präzises Verfahren
zur vollständigen Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von der freien, ungebundenen
Antigen-Phase zu entwickeln, welches die Zentrifugation und das Dekantieren bzw.
Aspirieren erübrigt und gleichzeitig die Bindung der flüssigen Radioaktivität ohne
Kontaminationsgefahr an einen festen Träger ermöglicht, und das somit zeit- und
kostensparend und gleichzeitig umweltfreundlich ist. Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, eine für die Durchführung eines derartigen Verfahrens erforderliche neue
Trennvorrichtung sowie einen eine derartige Trennvorrichtung enthaltenden Kit zur
Erleichterung der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu schaffen.
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Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren, eine trockene chromatographische
Säule und einen Kit gelöst, wie sie in den Ansprüchen beschrieben sind und sich
für den
Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung ergeben.
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Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Schwerpunkt der Erfindung
auf der Verwendung eines neuartigen Trennmittels liegt. Überraschenderweise war
nämlich festgestellt worden, daß eine sichere und einfache Trennung von Antikörper-Antigen-Komplex
und freien Antigenen sowie im Falle von radio-immunologischen Bestimmungsverfahren
auch noch eine vollständige Bindung der gesamten Radioaktivität der Reagenzlösung
möglich wird, wenn man nach erfolgter Inkubation in das flüssige Reaktionsgemisch
eine geeignete trockene, senkrecht stehende chromatographische Säule einführt ,
in die das radioaktive Reaktionsgemisch durch Kapillarkräfte vollständig eingesaugt
wird, wobei gleichzeitig die freie und die gebundene Phase weitestgehend voneinander
getrennt werden.
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Die Radioaktivität der unterschiedlichen Phasen kann anschließend
beispielsweise im Gammacounter exakt gemessen werden.
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Die nähere Erläuterung der Erfindung und ihrer Vorteile erfolgt nachfolgend
im Rahmen der Figurenbeschreibung und eines konkreten Ausführungsbeispiels.
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Es zeigen: Fig. 1 in schematischer Schnittansicht eine bevorzugte
Ausführungsform der erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen Säule; Fig.
2 eine schematische Schnittansicht einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen
trockenen chromatographischen Säule; Fig. 3 in Ansichten a) bis f) die zur immunologischen
Bestimmung einer Substanz nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen wichtigsten
Arbeitsschritte;
Fig. 4 eine typische Standardkurve, die durch
Messung von Standardkonzentrationen erhalten wurde und zur Bestimmung einer unbekannten
Antigenkonzentration herangezogen wird.
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Erfindungsgemäß erfolgt die Trennung der Antigen-Antikörper-Komplexe
von den freien, nicht an Antikörper gebundenen Antigenen bei der immunologischen
Bestimmung von Antigenen nach dem Radio-Immuno-Assay dadurch, daß man eine besondere
trockene chromatographische Säule verwendet, wie sie in einer bevorzugten Ausführungsform
in Fig. 1 dargestellt ist. Eine erfindungsgemäße trockene, chromatographische Säule
besteht aus einem trockenen, feinverteilten, relativ inerten Material (1), das im
Verhältnis zu seiner Korngröße eine große Oberfläche aufweist, wodurch eine Adsorption
und gleichzeitig eine selektive Trennung von Antigen-Antikörper-Komplex und freien
Antigenen ermöglicht wird. Obwohl es denkbar ist, die Säule direkt als säulenförmigen
Preßling aus einem geeigneten Granulat herzustellen, ist es sowohl aus praktischen
Gründen als auch zur Erzielung einer besseren Trennwirkung bevorzugt, das Säulenmaterial
mit mindestens einer oben und unten offenen, wasserfesten und wasserdichten Umhüllung
zu versehen, in der das trockene feinverteilte inerte Material (1) derart enthalten
ist, daß es beim bestimmungsgemäßen Gebrauch der Säule unter Eintauchen derselben
in senkrechter Lage in ein inkubiertes Reaktionsgemisch nicht aus der Säule herausfallen
kann. Diese Sicherung des Säulenmaterials ist in gewisser Abhängigkeit vom jeweils
verwendeten Säulenmaterial in verschiedener Weise möglich. In Fig. 1 ist eine trockene
chromatographische Säule dargestellt, bei der als Säulenmaterial (1) ein homogen
verfilztes, kreppförmiges oder gewelltes Filterpapier mit hohem Reinheitsgrad verwendet
wird, das zu einer dichten runden Säule zusameengerollt ist und durch eine erste
Umhüllung (2) in Form einer
wasserfesten und wasserdichten Polymerfolie
in Säulenform fest zusammengehalten wird. Es ergibt sich bei dieser Ausführungsform
von selbst, daß das als Säulenmaterial verwendete Kreppapier (1) bei einer senkrechten
Anordnung der Säule nicht aus der Umhüllungsfolie (2) herausrutschen kann. Als Folie
für die Umhüllung (2) kommt an sich jede inerte wasserfeste und wasserdichte Polymerfolie
in Frage. Als besonders vorteilhaft hat sich jedoch eine Umhüllung (2) aus einer
Celluloseesterfolie, insbesondere einer Celluloseacetatfolie erwiesen. An sich kann
die durch das Säulenmaterial Kreppapier (1) und die Umhüllungsfolie (2) gebildete
Säule direkt in dieser Form zum Aufsaugen des Reaktionsgemisches unter Auftrennung
in seine Komponenten verwendet werden.
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Es ist jedoch bevorzugt, die von einer Folie (2) umhüllte Säule in
einer weiteren festen Umhüllung mit rundem Querschnitt(3) anzuordnen, die an beiden
Seiten offen ist, wobei das obere Ende jedoch bevorzugt durch eine Kappe (4) so
abgedeckt ist, daß ein nicht dichtenderVerschluß erhalten wird, so daß am oberen
Ende ein Druckausgleich zur Umgebung erfolgen kann. Die Anordnung des mit einer
ersten Umhüllung (2) versehenen Säulenmaterials (1) in. einer zweiten, steifen rohrförmigen
Umhüllung (3) mit einer nicht luftdicht schließenden Kappe (4) hat den Vorteil,
daß die mechanische Festigkeit der erhaltenen trockenen Säule und damit deren Handhabbarkeit
verbessert wird, und daß im Inneren des äußeren Umhüllungsrohres (3) mit der nicht
luftdicht schließenden Kappe (4) eine stabile Umgebung für das eigentliche Säulenmaterial
(1) erhalten wird, was bekanntlich die Arbeit von chromatographischen Trennsäulen
und ihre Trennwirkung in der Regel verbessert. Die Abmessungen der inneren Säule
aus dem trockenen inerten Material (1) mit der ersten Umhüllung (2) in Folienform
sind dabei bevorzugt so auf die Abmessungen der äußeren rohrförmigen Umhüllung (3)
abgestimmt, daß das Material (1) mit seiner Umhüllung (2) die Innenwand
der
rohrförmigen äußeren Umhüllung (3) leicht berührt, so daß die innere Säule nicht
aus der äußeren Umhüllung (3) herausfällt, selbst wenn man diese mit ihrem offenen
Ende nach unten anordnet. Durch leichtes Klopfen auf das Ende der steiferen äußeren
Umhüllung (3) ist es aber ohne weiteres möglich, die innere Säule der äußeren Umhüllung
(3) zu entnehmen.
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Die Abmessungen der gesamten in Fig. 1 dargestellten Säulenanordnung
sind dabei bevorzugt so, daß die ganze Anordnung in ein üblichesProbenröhrchen senkrecht
hineingestellt werden kann, ohne zu kippen oder in Schräglage zu kommen. Typische,
für übliche Verwendungen bevorzugte Maße für die Säulenanordnung betragen 50 bis
100 mm in Längsrichtung und 4 bis 6 mm im Durchmesser. Es können jedoch auch für
besondere Zwecke Säulenanordnungen mit anderen Abmessungen verwendet werden. Sollte
es beispielsweise erforderlich sein, ein relativ weites Probenröhrchen zu verwenden
und gleichzeitig eine langgestreckte, relativ dünne Säule, so kann die entsprechende
äußere steife - bevorzugt Kunststoff-, z.B. PVC- - Urtihüllung (3) mit Abstandhaltern
versehen sein, die für die senkrechte Anordnung der Säule im Probenröhrchen sorgen,
oder es können besondere Halteteile vorgesehen sein, beispielsweise durchbohrte
Stopfen, zu einem Ring zusammenbiegbare gewellte Kunststoffteile, mit einer öffnung,
die gebördelt sein kann, versehene Deckel oder ähnliche, auf verwandten Gebieten
verwendete einfache Elemente zur Aufrechterhaltung der senkrechten Anordnung der
Säulenanordnung gemäß Fig. 1 in einem Proberöhrchen.
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Die Kappe (4), die die äußere steife rohrförmige Umhüllung (2) nicht
dicht abschließen darf, kann, wie in Fig. 1 dargestellt, ausgeführt sein, wobei
zwischen dem eingeschobenen Teil der Kappe und der Innenwand der rohrförmigen Umhüllung
(3) ein Spiel vorgesehen ist. Es sind aber beliebige andere nicht dicht schließende
Ausführungsformen für die Kappe (4) möglich, beispielsweise Kappen
mit
Einschubteilen, die Längsrippen oder Längskanäle aufweisen, außen auf die Umhüllung
(3) aufschiebbare Kappen mit Längsrippen oder Kanälen oder Kappen beliebiger Form
mit kleinen öffnungen, bevorzugt in den seitlichen Flächen der Kappen. Es ist dann
möglich, relativ festsitzende Kappen zu verwenden, an denen die gesamte Säulenanordnung
gehalten und gehoben werden kann. Bevorzugt ist auch die Kappe (4) aus einem relativ
steifen Kunststoff hergestellt.
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In der eben unter Bezugnahme auf Fig. 1 geschilderten Ausführungsform
war das Säulenmaterial (1) ein homogen verfilztes, kreppförmiges Filterpapier hoher
Reinheit, das dicht in Säulenform gerollt war. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung
ist es besonders bevorzugt, ein derartiges Material (1) zu verwenden, das aus reinen
Linters, d.h. kurzen Fasern von der Oberfläche von Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad
von 2000-3000 besteht und frei von löslichen Stoffen wie Leimen und von Lignin ist.
Es kann jedoch auch ein anderes ligninfreies Cellulosematerial wie beispielsweise
Regeneratcellulose mit einem Polymerisationsgrad von 800 bis 3000 verwendet werden.
Die Verwendbarkeit verschiedener möglicher trockener, inerter, feinverteilter Materialien
als Säulenmaterialien für die vorliegende Erfindung hängt in erster Linie von der
Gleichmäßigkeit der Textur und von einer einheitlichen Saugfähigkeit des gesamten
Säulenmaterials über die Höhe der Säule ab. Es ist dabei von Vorteil, wenn das Material
Poren in der Größenordnung von 1 bis 14 ßm aufweist.
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Zur Sicherung des eigentlichen Säulenmaterials (1), das gegebenenfalls
eine erste Umhüllung (2) aufweist, in der äußeren steifen Kunststoffumhüllung (3)
sind an sich beliebige konstruktive Ausführungsformen möglich.
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Außer der schon oben beschriebenen Sicherung durch Einpassen ist es
z.B. auch möglich, zwischen dem eigentlichen Säulenmaterial (1) mit der ersten Umhüllung
(2) und der äußeren Umhüllung (3) einen gewissen Abstand vorzusehen, wobei in einem
derartigen Fall
die innere Säule (1,2) gegen ein Herausfallen aus
der äußeren Umhüllung (3) z.B. durch eine Schicht eines porösen Materials, ein geeignetes
Gitter, nach innen weisende Vorsprünge oder auch einen Querstag oder dergleichen
am unteren Ende der Isnhuilung (3) gesichert sein kann.
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Außer demin Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen Säulenmaterial (1)
in Form eines gerollten Filterpapiers, können auch eine Vielzahl von verschiedenen
pulverförmigen Säulenmaterialien verwendet werden. Voraussetzung für die Verwendung
derartiger Pulvermaterialien ist dabei ebenfalls, daß sie eine im Verhältnis zur
Korngröße große Oberfläche aufweisen, inert sind und feinverteilt vorliegen. Die
Materialien können polare Substanzen wie Kieselgel und Aluminiumoxid sein, wobei
sich trockenes Kieselgel und Aluminiumoxid mit einer Porengröße von 0,01 bis 0,4
mm, vorzugsweise 0,06 mm, als gut geeignet erwiesen, oder es können unpolare Substanzen
wie hochreines Cellulosepulver oder Holzkohle sein.
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Pulverförmige Materialien müssen zur Erzielung guter, reproduzierbarer
Trennergebnisse sehr homogen gepackt sein. Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform einer
erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen Säule, die ein Säulenmaterial in
Form eines Pulvers enthält. Das pulverförmige Säulenmaterial (6) kann bei einer
geeigneten Ausführungsform unter kontinuierlicher Vibration in ein 50-100 mm langes
PVC-Röhrchen (7) mit einem Durchmesser von 4 bis 6 mm eingefüllt werden, wobei die
kontinuierliche Vibration während des Einfüllens für eine gleichmäßige Packung sorgt.
Das bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2 gezeigte Röhrchen (7), das die Umhüllung
des Säulenmaterials (6) bildet, kann dabei ein Röhrchen sein, wie es bei der Ausführungsform
gemäß Fig. 1 als äußere Umhüllung (3) verwendet wurde. Im Falle der Ausführungsform
von Fig. 2 ist es erforderlich, durch besondere Maßnahmen dafür zu sorgen, daß das
pulverförmige Säulen-
material (6) nicht aus dem Röhrchen (7) herausfallen
kann, wenn es beim Transport oder während des Gebrauchs senkrecht gestellt wird.
Es hat sich in diesem Zusammenhang als vorteilhaft erwiesen, die Enden eines Röhrchens
(7) mit einem porösen, saugfähigen Material zu verschließen, beispielsweise mit
einem Zellstoffstopfen o.dgl.
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Zur weiteren Vereinfachung des eigentlichen radio-immunologischen
Bestimmungsverfahrens kann es ferner vorteilhaft sein, auf das Säulenmaterial des
Endabschnitts der Säule, der in das Reaktionsgemisch taucht, eines der in konstanter
Konzentration verwendeten Reagenzien aufzutragen.
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Beispielsweise kann es vorteilhaft sein, die erforderliche Menge an
Antikörper oder an markiertem Antigen (Tracer) in den unteren Säulenabschnitt einzuimprägnieren
und zu lyophilisieren. Es ist in einem solchen Falle nur noch die Pipettierung der
restlichen Substanzen, d.h. der Standards bzw. der Seren und Antikörper bzw. Tracer
erforderlich. Ein besonderer Vorteil-wird erhalten, wenn man den radioaktiven Tracer
an das poröse Material lyophilisiert, da dann der freie Umgang mit radioaktivem
Material und damit die Kontaminationsgefahr völlig vermieden wird. Da es in der
Praxis schwierig ist, eine kontinuierliche Säule abschnittweise definiert zu imprägnieren
bzw. auf der Säule auf homogene Weise Substanzen zu lyophilisieren, ist es aus praktischen
Gründen bevorzugt, die Säule schichtweise aufzubauen, wobei die lyophilisierte Schicht
und die Schicht aus neutralem Säulenmaterial getrennt erzeugt werden und erst anschliessend
zu einer homogenen Säule vereinigt werden können.
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Fig. 3 zeigt in schematischer Darstellung die an sich bekannten Schritte
eines Radio-Immuno-Assay, bei demjedoch erfindungsgemäß eine trockene chromatographische
Säule verwendet wird, wie sie eben unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 beschrieben
wurde. Das Verfahren läuft
generell - unabhängig davon, ob es sich
um die Bestimmung der Eichkurve unter Verwendung einer Standardlösung oder um die
eigentliche Messung handelt - so ab, daß man in an sich bekannter üblicher Weise
ein flüssiges radioaktives Reaktionsgemisch aus Antikörper, markiertem und unmarkiertem
Antigen sowie gegebenenfalls Hilfssubstanzen erzeugt, dieses Gemisch die erforderliche
Zeit inkubiert, und daß man dann gemäß der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße
trockene, chromatographische Säule in das erhaltene Reaktionsgemisch eintaucht.
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Infolge der Wirkung von Kapillarkräften wird das Reaktionsgemisch
dann in die chromatographische Säule aufgesaugt. Da diese Säule so bemessen ist,
daß sie das gesamte Reaktionsgemisch aufnehmen kann, bleibt nach dem Eintauchen
der chromatographischen Säule ein trockenes Probenröhrchen zurück. Um dieses gänzlich
von zurückgebliebenen Substanzen zu reinigen, und um ferner die während der Adsorption
erfolgende Trennung in Antigen-Antikörper-Komplex und freie Antigene zu verbessern,
wird nach dem Aufsaugen der ursprünglichen Reaktionslösung noch etwas destilliertes
Wasser, beispielsweise in einer Menge von 1,0 ml, zugegeben, das ebenfalls von der
Säule aufgesaugt wird. Die Säule enthält nunmehr in schichtweiser Auftrennung die
gesamte Reaktionsmischung, und die Radioaktivität der verschiedenen Zonen der Säule
kann exakt gemessen werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens taucht die chromatographische Säule mit ihrem unteren Ende in die Reaktionsmischung,
es ist jedoch ohne weiteres auch möglich, diese auf das obere Ende der Säule aufzugeben.
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überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß bei Verwendung
der erfindungsgemäßen chromatographischen Säule in vielen Fällen eine solche Auftrennung
des Reaktionsgemischs erfolgt, daß der hochmolekulare Antigen-
Antikörper-Komplex
nach oben in den oberen Säulenabschnitt wandert, während im Gegensatz zu den üblichen
Erfahrungen und Erwartungen die niedermolekularen Bestandteile (Ag, Ag', Ak) im
unteren Säulenabschnitt zurückbleiben. Die Ursachen für diese ungewöhnliche Art
der Bindung an die Adsorbentien innerhalb der chromatographischen Säule sind nicht
genau bekannt. Wahrscheinlich überwiegen bei den bevorzugt verwendeten unpolaren
Adsorbentien, insbesondere bei dem gerollten Filterpapier, van der Waals' und hydrophobe
Wechselwirkungen, die das Wanderungsverhalten erklären können, während bei den polaren
Adsorbentien ionische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken entscheidend
sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen
trockenen chromatographischen Säule ist in der Praxis besonders einfach durchzuführen,
wenn alle erforderlichen Reagenzien zusammen mit der Säule in Form eines Testsatzes
oder Kits bezogen werden, da bei derartigen Kits die Möglichkeit besteht, die Konzentrationen
und das Verhalten von Antikörpern, Standardantigenzubereitungen und markierten Antigenen
genau aufeinander abzustimmen, so daß optimale Ergebnisse erhalten werden. Die Kits
werden spezifisch für die zu bestimmenden Substanzen zusammengestellt und enthalten
in der Regel in definierten Konzentrationen Antikörper, markierte Antigene, eine
Reihe von Standard-Antigenzubereitungen, gegebenenfalls Hilfssubstanzen wie Puffer
oder Substanzen zum Freisetzen der eigentlichen zu messenden Substanz sowie mindestens
ein, in der Regel jedoch mehrere, üblicherweise 100 erfindungsgemäße chromatographische
Säulen. Derartige Kits können beispielsweise für die Bestimmung von Thyreotropin
(TSH), Trijodthyronin (T3), Tetrajodthyronin (T4), Progesteron, Ustriol, Lutropin,
Follitropin, Cortisol, Digoxin u.a.
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ausgelegt sein.
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Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines konkreten
Ausführungsbeispiels noch näher erläutert.
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Beispiel Bestimmung von Thyreotropin (TSH) durch Radio-Immuno-Assays:
Zur Bestimmung des Thyreoidea stimulierenden Hormons (TSH) Thyreotropin werden die
folgenden, alle in einem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Reagenzien verwendet:
1. Antiserum: Das hochspezifische Antiserum gegen TSH wurde durch Immunonisierung
von Kaninchen mit hochgereinigten humanem Thyreotropin gewonnen. Die Kreuzreaktion
mit anderen Hypophysenhormonen ist unbedeutend. Ein Kit enthält 22 ml Antiserum.
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2. Mit125J markiertes TSH (Tracer), 11 ml. Das markierte.
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TSH liegt in einer gebrauchsfertigen Lösung in Puffer vor.
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3. TSH-Standards, lyophilisiert, 1,0 ml/Flasche. Hochgereinigtes humanes
TSH, lyophilisiert in TSH-freiem Humanserum, kalibriert mit der WH0 First International
Reference Preparation of Thyreoid Stimulating Hormon.
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Ein Kit enthält 8 Standards mit folgenden Konzentrationen (U/ml):
0,1,2,5,10,25,50,75.
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4. Trockene chromatographische Trennsäulen, die als Säulenmaterial
ein gekrepptes Filterpapier von hohem Reinheitsgrad enthalten, das eine homogene
Verfilzung aufweist und aus reinen Linters besteht und frei von löslichen Stoffen
ist. Das Säulenmaterial ist in einer oben und unten offenen Umhüllung aus Cellulose-Acetatfolie
angeordnet, und die erhaltene patronenartige Säule ist m eindurch eine lose sitzende
Kappe abgedecktes rundes Kunststoffröhrchen eingeschoben.
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5. Puffer, 25 ml, gebrauchsfertige Lösung.
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Zur Bestimmung einer unbekannten Menge von TSH werden zu Serumsproben
von 20 bis 600 ßl, vorzugsweise 100 ßl, 0,1 ml -TSH-
Antikörper
zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 370C oder über Nacht bei
Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend werden 0,1 ml Tracer (markiertes TSH-Antigen)
hinzugefügt, und es wird noch einmal 2 Stunden bis zur Einstellung des Reaktionsgleichgewichts
inkubiert. Nach Erreichen des Reaktionsgleichgewichts erfolgt die Trennung der gebundenen
Phase, d.h. des Antigen-Antikörper-Komplexes von der freien Phase, d.h. den nichtgebundenen
Antigenen und Antikörpern dadurch, daß die trockene chromatographische Säule senkrecht
in das flüssige radioaktive Reaktionsgemisch eingetaucht wird. Die im Probenröhrchen
enthaltene Flüssigkeit wird vollständig von der Säule aufgesaugt. Um die Trennung
während der Adsorbtion zu verbessern, werden nach dem vollständigen Aufsaugen noch
einmal 1,0 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Das Wasser wird ebenfalls von der
Säule aufgesaugt.
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Es zeigte sich, daß im unteren Abschnitt der chromatographischen Säule
die freie Phase gebunden ist, während sich die gebundene Phase räumlich davon getrennt
im oberen Säulenbereich befindet. Die Radioaktivität der verschiedenen Phasen konnte
im Gammacounter exakt gemessen werden.
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Die Auswertung der Meßergebnisse erfolgte unter Verwendung einer Eichkurve
aus 6 Standards. Zur Erstellung der Standard-Eichkurve wurde die gemessenen Prozent-Bindung
gegen die entsprechende Standardkonzentration nach der Spline-Approximation-Standartkurve
aufgetragen.
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Eine typische Standard kurve (Mittelwert + 2fache Standardabweichung)
ist in Abbildung 4 dargestellt.
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In Abbildung 4 zeigt das schraffierte Rechteck den Bereich der maximalen
Empfindlichkeit des Bestimmungs-
verfahrens, die nach dem Nullwert
unterschieden werden kann (Bo-3S). Der Mittelwert zur Bestimmung der Nachweisempfindlichkeit
liegt bei 0,1 ßU/ml TSH, d.h. TSH Konzentrationen unter0,2 ßU/ml TSH können ebenfalls
mit guter Reproduzierbarkeit gemessen werden. Die Bestimmung der Intercept-Werte
gibt an, ob das Verhältnis der einzelnen Testkomponenten (Ak, Ag, Ag') und die Diskriminierungsfähigkeit
des Testsystems in einem idealen Bereich liegen.
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Die gefundenenTSH-Werte für den 90 %- und den 50 %-Interzptpunkt liegen
mit 0,5 bis 1,5 ßU/ml TSH bzw. 15 bis 25 ßU/ml TSH im optimalen Bereich. Die Wiederfindung
zugesetzter TSH-Mengen verläuft über den gesamten Meßbereich annähernd linear. Die
relative Wiederfindung schwankt dabei zwischen 98 bis 105 %.
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Als ein wichtiger erwünschter Nebeneffekt der radioimmunologischen
Bestimmungen mit der erfindungsgemäßen Säule ist anzusehen, daß die gesamte Radioaktivität
der Probe zusammen mit dem Reaktionsgemisch in die Säule aufgesaugt wurde. Nach
der Auszählung der Probe liegt somit die Radioaktivität in einer bequem handhabbaren
Form vor und die Gefahr einer Kontaminierung mit Resten des flüssigen Reaktionsgemischs
ist gegenüber den üblichen Verfahren stark gesenkt) auch wenn der Antikörper stationär
an eine Trägersubstanz innerhalb des Proberöhrchen gebunden ist, wird die gesamte
flüssige Radioaktivität in der Säule absorbiert und dabei werden gleichzeitig die
freien Antigene im unteren Säulenabschnitt gebunden. In diesem Fall verbleibt der
Antigen-Antikörper-Komplex innerhalb des flüssigkeitsfreien Probenröhrchens an die
Trägersubstanz gebunden und kann nach Herausnahme der Säule gemessen werden. Es
ist darauf hinzuweisen, daß die erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen
Säulen so preiswert hergestellt werden .denen, daß sie auch zum Aufsaugen von ähnlichen
radioaktiven Ge-
mischen verwendet werden können, die nicht ausgezählt
werden sollen, sondern die nur unschädlich gemacht werden sollen.
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Obwohl in der obenstehenden Beschreibung das erfindungsmäße Verfahren
insbesondere an Hand eines Radio-Immuno-Assays beschrieben wurde, ist es für den
Fachmann aufgrund der für ihn gut übersehbaren Wirkung einer Trennung mit einer
erfindungsgemäßen chromatographischen Säule selbstverständlich, daß diese Säule
eine Trennung aller anderen bei immonulogischen Bestimmungsverfahren erhaltenen
Gemische ermöglicht, daß sie also genauso für fluoreszenz- und enzym-immunologische
Untersuchungsverfahren geeignet ist.
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Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Separationsverfahren
unter Verwendung der erfindungsgemäßen trockenen Säule äußerst präzise und im Vergleich
zu den bisher bekannten Trennverfahren für radio-immunologische Bestimmungen einfacher,
wirtschaftlicher und umweltfreundlicher ist, und daß es aufgrund seiner Anwendbarkeit
für andere immunologische Untersuchungen auch sehr vielseitig ist.