DE2523207A1 - Verfahren zur bestimmung von antikoerpern - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von antikoerpernInfo
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Description
RECHTSANWÄLTE ,
DR. JUf?. DtPt.-am WALTER BEÄ 23. Mal
ALFk^/ I-· C ?··?:· M iß
DR. JUk. IJz1.-;j C.-ιί. EtIL
623 FRANkFü R Γ AM MAlN - HOCHSf
Unsere Nummer 19 878
Pharmacia Diagnostics AB TJppsala / Schweden
. Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Antikörpern in wässrigen Proben, die speziell
auf ein Antigen ausgerichtet sind.
Zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von spezifischen Antikörpern in biologischen Proben sind bereits mehrere Methoden
bekannt. In einer der bekannten Methoden werden mit Antigen beschichtete Platten aus Glas, Polymermaterial, Metall oder
ähnlichem Material verwendet. Auf diese Platten werden dann Proben, die möglicherweise Antikörper enthalten, die spezifisch
auf das auf der Oberfläche befindliche Antigen ausgerichtet sind, aufgebracht, worauf die Bildung des Antikörper-Antigen-.
Komplexes auf verschiedenen Wegen festgestellt werden kann. So können der Probe radioaktiv markierte Antikörper zugesetzt
werden, die mit den Antikörpern in der Probe konkurrieren, .;wor,auf die Radioaktivität, die an die Äntigenoberflache gebunden
ist, gemessen wird. Der Nachteil dieser Technik besteht
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unter anderem in dem erforderlichen Zeitaufwand, der Fotv/endigkeit
kostspieliger und komplizierter Ausrüstungen und dem Gesundheitsrisiko, welches mit der Verwendung radioaktiver
Substanzen verbunden ist.
Es ist auch schon vorgeschlagen worden (Adams et al.., Journal of Immunological Methods 3 (1973), S. 227-232), die Bestimmung
des Antikörper-Antigen-Komplexes so vorzunehmen, daß man
1) die Erhöhung der Nutzbarkeit nach Behandlung der Oberfläche
mit Wasserdampf feststellt,
2) eine Anfärbung mit einem Protein-Farbstoff (z. B. Goomassie Brilliant-Blau R) vornimmt oder
3) die Änderung der Interferenzfarben an speziellen reflektierenden Oberflächen beobachtet. Ein allgemeiner
Nachteil dieser Methoden liegt darin, daß sie unspezifische
Reaktionen geben können, weil falsche positive Reaktionen nicht vermieden werden können, wenn Proben mit einer hohen Protein-Konzentration,
z.B. unverdünnte Seren aufgebracht werden. Darüberhinaus ist keine Analyse einer Umsetzung spezifischer
Antikörper hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zu Immunoglobulin-Klassen
möglich, was jedoch bei der Diagnose von beispielsweise Infektionskrankheiten von Interesse ist.
Es hat sich jetzt überraschenderweise gezeigt, daß die Nachteile der bisher angewandten Bestimmungs- und Feststellungsmethoden
durch die vorliegende Erfindung überwunden werden können.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit
von Antikörpern (I), welche spezifisch auf ein Antigen ausgerichtet sind, in einer wässrigen Probe durch Aufbringen der
letzteren auf eine glatte, vorzugsweise flache oder gewölbte Oberfläche, die zum Binden der Antikörper (I) mit dem spezifischen
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Antigen bestrichen worden ist, und anschließende Bestimmung der
an die Oberfläche gebundenen Antikörper (I), welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Oberfläche zur Bestimmung der
Antikörper mit einer Suspension von kleinen wasserunlöslichen Teilchen in Berührung bringt, an die ein Biopolymer direkt gebunden
ist, welches die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an -vorzugsweise zu einer bestimmten Immunoglobulin-Klasse gehörenden-
Antikörper, und zwar vorzugsweise in einer nicht-Antigen
bindenden Struktur der Antikörper hat, wobei die Teilchen an den Teil der Oberfläche, an den speziell die Antikörper gebunden
sind, in einer Schicht adsorbiert werden, die mit bloßem Auge erkennbar ist.
Der Ausdruck "Antigen" schließt im vorliegenden Zusammenhang auch "Haptene" ein.
Die Bindung des Antigens an der glatten Oberfläche kann entweder
durch adsorptive Kräfte oder durch kovalente Bindungen zwischen dem Antigen (Hapten) und den reaktiven Gruppen an der Oberfläche,
gegebenenfalls unter Mitwirkung eines bifunktionellen Reagenzes erreicht werden. Als Reaktionsfläche kann auch eine glatte Oberfläche
von Glas, Polymermaterial, Metall oder ähnlichem Material verwendet werden, die zuvor gegebenenfalls mit einer Substanz
beschichtet worden ist, die das Binden des Antigens an die Oberfläche erleichtert. Die Oberfläche kann auch zuerst mit einer
Schicht aus Antikörpern versehen werden, die spezifisch auf das
Antigen ausgerichtet sind, worauf das Antigen an dieser Antikörperschicht adsorbiert wird. Die Oberfläche soll vorzugsweise
flach oder gewölbt sein und gegebenenfalls in Form von kleinen. Schalen oder Stäben vorliegen. Bei dem Material der Oberfläche
kann es sich auch um dünne Filme oder Folien aus Polymeren, Metall u.a. handeln, die gegebenenfalls auf Papier, Polymer,
Glas u.a. angebracht sind. Ein Vorteil der Reaktionsoberflächen in Form dünner Filme ist darin zu sehen, daß sie die Lagerung
und den Transport von Antigen-bedeckten Oberflächen erlauben,
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wobei das Antigen gegen eine mögliche Denaturierung z.B. durch einen dünnen Film aus einer geeigneten Flüssigkeit geschützt
werden kann. Die Ausdrücke "beschichten mit" oder "Aufbringen von" Antigen auf die Oberfläche bedeuten im vorliegenden Zusammenhang,
daß das Antigen so an der Oberfläche fixiert ist, daß es von dieser bei Berührung mit der wässrigen Probe nicht in
einem solchen Ausmaß abgelöst werden kann, daß es die Reaktionen stören kann.
Unter den Antigenen, die an Oberflächen von Glas, Polymermaterialien,
Metall oder ähnlichen Materialien adsorbiert oder durch kovalente Kräfte gebunden werden können, sollen die
folgenden speziell erwähnt werden:
Polypeptid-Antigene einschließlich Proteine, Glycoproteine,
Lipoproteine wie Serumalbumin, Immunoglobuline, andere Plasmaproteine
einschließlich der Hormone polypeptidischer Natur, bakterielle Toxine und andere mikrobielle Polypeptide etc.;
Polysaccharaid-Antigene wie Dextran, andere Kapsel-Polysaccharide,
Lipopolysaccharide, Lipopolysaccharid-Protein-Komplexe bakteriellen
oder anderen Ursprungs; Nucleinsäuren wie DNA und RNA; Haptene wie Hormone mit kleinem Molekül und Drogen, gegebenenfalls
gebunden an Makromoleküle zur Erleichterung der Adsorption an der Oberfläche; Virus-Antigene wie Hepatitis-B-Antigen (HBAg,
früher als Australia-Antigen, Au-ag bezeichnet); besondere Antigene
wie ganze Bakterien und andere Mikroben, monozellulare oder polyzellulare Parasiten, Tierzellen oder geeignete (sub-)Zellularfragmente
wie beispielsweise ganze Salmonella-, Treponema pallidum (syphilis) und Chlamydia-Bakterien.
Der im vorliegenden Zusammenhang gebrachte Ausdruck "Biopolymer" umfaßt Polypeptide, Proteine, Glycoproteine, Polysaccharaide,
Lipoprotein-Polysaccharid-Komplexe unabhängig davon, welcher Teil des Moleküls die Affinität zu einer vorzugsweise nicht-Antigen-bindenden
Struktur eines Immunoglobulins besitzt.
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Das Biopolymer kann sich von Mikroben, z.B. von Bakterien
herleiten oder auch anderen biologischen Ursprungs sein; ■das Biopolymer kann auch aus Immunoglobulinen (Antikörpern (H))
bestehen, die gegen die genannten Immunoglobuline (Antikörper (I)) gerichtet sind. Ein besonders typisches Beispiel eines
Biopolymeren gemäß vorsläiender Ausführungen ist das sogenannte
Protein A aus Staphylococcus aureus oder ein Fragment dieses Proteins, wobei die Fragmente ebenfalls polypeptidischer Natur
sind und die Fähigkeit zur Bindung an eine nieht-Antigen-bindende Struktur der Antikörper haben. Weitere Beispiele für Biopolymere
mit entsprechenden Eigenschaften sind Polypeptide aus Staphylococcus epidermidis sowie Biopolymere, die an der Oberflächenstruktur
bestimmter Streptococcten vorkommen. Das Biopolymer kann
an die Oberfläche des Mikroorganismus gebunden sein, der es gebildet hat. Wenn das Biopolymer aus einem Protein A. oder einem
Fragment desselben besteht, können die Teilchen vorteilhafterweise aus Staphylococeen, insbesondere abgetöteten S.taphylococcen
bestehen. Die Herstellung eines Reagenz von Protein A enthaltenden Staphylococeen kann nach der Methode von S. Jonsson und
G. Kronvall (Eur-J.Immunol·4 (1974), S. 29-50) erfolgen, gemäß
welcher man eine 10$ige Suspension gewinnt, die wenigstens ein Jahr beständig bleibt; diese Suspension kann zur Bestimmung von
IgG-Antikörpera verwendet werden, die an ein Antigen an der
Oberfläche gebunden sind. Zu diesem Zweck muß die Suspension auf etwa 1/2 $>
in Phosphat-gepufferter Salzlösung verdünnt und mit einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel versetzt werden.
Erfindungsgemäß kann das Biopolymer auch an kleine Teilchen eines Polymeren gebunden sein, welches in Wasser unlöslich ist.
Beispiele für solche Polymere sind Gelteilchen, die Copolymere von Polyhydroxyverbindungen und bifunktionellen Substanzen enthalten,
z.B. das Copolymer aus Dextran und Epichlorhydrin
(Handelsprodukt "Sephadex" der Firma Pharmacia Fine Chemicals, TJpps'ala) sowie Gelteilchen, die Acrylate usw. enthalten. Die
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kleinen, in Wasser unlöslichen Polymerteilchen können jedoch
in Wasser quellbar sein. Die Bindung des Biopolymeren an die Teilchen kann auch durch Polymerisation des Biopolymeren,
möglicherweise durch Copolymerisation mit anderen Polymeren,
z.B. durch TJnlöslichmachen des Serums, welches die gegen eine bestimmte Immunoglobulin-Klasse oder gegen "bestimmte Immunoglobulin-Klassen
gerichteten Antikörper enthält, erfolgen. Gegebenenfalls können die kleinen Teilchen auch gefärbt sein. Teilchen
mit einer Größe von 0,1 bis 20, vorzugsweise 0,2 bis 10 Mikrometer werden bevorzugt verwendet,
Erfindungsgemäß kann das Biopolymer an die Oberfläche der kleinen
Teilchen durch kovalente Bindungskräfte oder durch Adsorption gebunden sein.
Erfindungsgemäß können die Bakterienkörper in ihren OberflächensQhichten
ein Biopolymer enthalten, welches aus ihnen selbst stammt oder ein Biopolymer anderen Ursprungs ist. Das Biopolymer
kann an die Oberfläche der Bakterienkörper durch natürliche, swis.chen Biopolymer und Bakterienkörper vorhandene Bindung
gebunden sein und/oder die Bindung, kann auf künstlichem Wege erfolgt sein. Die Bakterienkörper mit anhaftendem Biopolymer
können mit einem Aldehyd, z.B. Formaldehyd und/oder Glutaraldehyd behandelt werden. Sie können gegebenenfalls auch zur Abtötung
und/oder Sterilisation mit Wärme behandelt werden.
Antikörper der IgG-Klasse können mit Protein A enthaltenden
Staphylococcen festgestellt werden.
Wenn Antikörper festgestellt werden sollen, die keine Fähigkeit zur Bindung an Protein A haben, kann man erfindungsgemäß Teilchen
verwenden, an die andere Biopolymere direkt gebunden sind^ die
spezifisch mit diesen Antikörpern reagieren können.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform äer Erfindung können auch
Antikörper, denen die Fähigkeit zur Bindung an Protein A fehlt, festgestellt werden, indem man den Antikörper-Antigen-Komplex
auf der Oberfläche einer Lösung von Antikörpern aussetzt, die mit Protein A über ihre Fc-Teile reagieren können und auf die Antikörper
ausgerichtet sind, die nicht mit Protein A reagieren. Nachdem das Reagenz mit den Protein A enthaltenden Staphylococcen
zugesetzt worden ist, kann eine mögliche Reaktion in der "beschdebenen
Weise beobachtet werden.
Gemäß einer weiteren Ausfünrungsform der Erfindung kann die Oberfläche
mit den Antigen-gebundenen Antikörpern (I) mit einer Suspension
von Bakterienkörpern, an deren Oberfläche auf die Antikörper (I) ausgerichtete Antikörper (II) (über die Fc-Teile derselben)
direkt gebunden sind, in Berührung gebracht werden, um den mit Antikörpern (I) bedeckten Oberflächenbereich sichtbar zu
machen.
Für eine halb-quantitative Bestimmung der Antikörper in einer Probe können verschiedene Techniken angewendet werden. Beispielsweise
kann eine Reihe verschiedener Verdünnungen der Probe geprüft werden und die Ergebnisse können mit denen von analogen Versuchen
mit Bezugsproben verglichen werden. Die größte Verdünnung einer Probe, die noch eine positive Reaktion gibt, wird festgestellt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Anwesenheit von Antikörpern in einer Probe quantitativ
festgestellt werden, indem man die Probe auf die Oberfläche außerhalb des Teiles aufbringt, der mit Antigen beschicktet ist, und
die Probe in einer Richtung in einem Bereich, vorzugsweise einem schmalen Bereich, über die Antigen-beschiehtete Oberfläche hinweggehen
läßt. Nachdem die Probe über die Oberläche gelaufen ist, was durch Anfärben o.a. festgestellt werden kann, wird die Sussension
der das Biopolymer tragenden Teilchen zugefügt. Die Oberfläche, die auf diese Weise mit Teilchen bedeckt wird, ist ein
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Maß für den Antikörpergehalt der Probe und kann mit dem entsprechenden
Oberflächenbereich einer "bekannten Bezugsprobe verglichen werden.
Um das Hinübergehen bzw. Hinüberlaufen der Probe über die
antigenbeschichtete Oberfläche zu erreichen, kann eine in der
Dünnschicht-Gel-Chromatographie bekannte Methode angewandt werden, indem man beispielsweise eine dünne Schicht (oder
mehrere Schichten nebeneinander) eines Kapillarmediums wie !Teilchen von "Sephadex G-75 Superfine" (das ist ein von der
Firma Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala, vertriebenes vernetztes Dextrangel) aufbringt. Als Übertragungsmedium für die
flüssigkeit können auch gesponnene oder nicht-gesponnene Pasern verwendet v/erden, Vor äer Sichtbarmaeh^ung mit den
Biopolymer-haltigen Teilchen muS dieses Tßedium wieder entfernt
werden.
Ss ist auch möglich, einen linearen Fluß oder mehrere parallele
lineare Flüsse eier Flüssigkeit ohne Unterstützung eines festen
Miteriales auf der antigenbesehichteten Oberfläche zu erreichen.
In diesem Pail muß die Oberfläche zuerst in einer geraden Linie
oder in mehreren parallelen geraden Linien angefeuchtet bzw. benetzt werden, worauf der Zufluß und der Abfluß cer Flüssigkeit
auf die bzw, von der leicht geneigten Platts mit Hilfe eines
geeigneten Kapillarmateriales erreicht werden kann.
Der Transport dor Antikörper in der Probe in einer Richtung
über die mit Antigen beschichtete Oberfläche kann auch mit
Hilfe einer Elektrophorese-Technik durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß kann ein Antigen in einer Probe (semi)-quantitativ
auf Objektträgerplatten bestimmt werden, die mit auf das Antigen ausgerichteten Antikörpern beschichtet sind, nachdem die
Blatte einer zweiten Lösung eines spezifischen Antikörpers und schließlich einer Suspension der Reagenzteilchen ausgesetzt
wogirden ist. Das Anhaften der Teilchen an einem Oberflächen-
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"bereich zeigt die Anwesenheit von Antigen in der Probe ■
an.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode kann die Konzentration
eines Antigens in einer Probe auch indirekt, semiquantitati'v oder quantitativ bestimmt werden, indem man eine antigenhaltige
Probe und eine Dosis einer standardisierten Menge eines auf dieses Antigen ausgerichteten Antikörpers mischt und dann den
möglichen Überschuß der Antikörper, die durch das Antigen in der Probe nicht inhibiert worden sind, feststellt.
Durch die erfindungsgemäße Methode können Antikörper, die auf
prinzipiell unterschiedliche Arten von Antigenen ausgerichtet sind, bestimmt werden. So können beispielsweise lösliche
wie auch unlösliche (z.Beispiel partikulare, d.h. als Einzelteilchen
vorliegende) Antigene an der Oberfläche verwendet werden. Es ist ein großer Vorteil im Vergleich zu früher bekannten
Techniken, daß Antikörper, die auf unlösliche (auf z.B. partikulare) Antigene ausgerichtet sind, in einer so
einfachen Weise und unter Verwendung von so wenig Antigenmaterial bestimmt werden können.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Die Oberfläche eines Objektträgers aus Glas mit Abmessungen
von 76 χ 26 mm wurde mit Chromschwefelsäure gewaschen, gut mit V/asser gespült und mit Druckluft getrocknet. Etwa 5 Minuten
oder langer wurde die Oberfläche mit einer 1$igen Lösung von' Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von
2x10 (Dextran 2000 der Firma Pharmacia Pine Chemicals,
Uppsala) in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (im Folgenden als PBS bezeichnet; die Lösung enthält .0,12m NaCl, 0,03m Phosphat
und hat einen pH-Wert von 7,4) in Berührung gebracht.
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Anschließend wurde gut mit destilliertem Wasser gespült und
mit Druckluft getrocknet. Die Glasoberfläche wurde dann in derselben Weise einer 1$igen Lösung eines Proteins, welches
gegen das Testsystem inert ist, z.B. Serum-Albumin derselben
Art, von der auch die Probe stammt, ausgesetzt. Die Probe wird in 5 - 10 Mikroliter-Tropfen in Reihen mit bis zu 8 Tropfen
in jeder Reihe mit Hilfe einer automatischen Pipette"aufgebracht.
Eine Verdünnung der Proben über ein Hundertstel wird in einem Antikörper-freien Serum derselben Art, verdünnt auf
ein Hundertstel oder in einer 0,1 $igen Lösung von Serum-Albumin vorgenommen.
ITach 5-10 Minuten wurden die Tropfen mit PBS gespült,
welches 0,1 ^ "Tween 20" (das ist Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat,
ein Produkt der Firma Atlas Chemie GmbH) enthielt; diese Mischung wird im Folgenden mit der Abkürzung T-PBS bezeichnet.
Danach wurde das Plättchen in horizontaler Lage abgelegt und mit einer i/2^igen Suspension von mit Formalin
behandelten und durch Wärme abgetöteten, Protein A enthaltenden Staphylococcen (S.Johsson, G.Kronvall, Europ.J.Immunol..4
(1974), S. 29) in T-PBS beschichtet. Nach 5 bis 10 Minuten wurde die Flüssigkeit von der Platte abgegossen und mit
T-PBS nachgespült, um den Überschuß des Staphylococcen-Reagenzes zu entfernen. Danach wurden die Platten in Kuvetten,
die T-PBS enthielten, eingetaucht. Das Ergebnis kann an den feuchten Gläsern nach fortgesetztem Spülen mit destilliertem
Wasser, gegebenenfalls nach Zugabe von "Tween 20" und Absaugen auf Filterpapier und Trocknen an der Luft festgestellt werden.
Die Beobachtung erfolgt am besten schräg bei durchscheinendem Licht gegen einen dunklen Hintergrund. Eine positive Reaktion
erscheint in Form γοη gelb-weißen Staphylococcen-Flecken in
einem Bereich, in den ein Testtropfen gesetzt worden ist; eine negative Reaktion zeigt sich durch Abwesenheit von Stapliyloeoccen
-an.'der Oberfläche an. Mit dieser Technik konnte eine positive
Reaktion mit einem Kaninchen-Antidextran-Antiserum erreicht
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werden, welches 1,3 mg spezifische Antikörper pro ml enthielt, und zwar auch noch nach einer Verdünnung auf 1/10 000. Menschliches
Serum und Kaninchen-Serum können unverdünnt aufgebracht werden, ohne daß es zu einer negativen Reaktion kommt.
Bei menschlichen Seren, in welchen gegen Dextran gerichtete Antikörper bisher nur mit Hilfe einer extrem empfindlichen
radioimmunologischen Technik festgestellt werden konnten, konnten positive .Reaktionen in den Testproben noch nach 25 bis
125-facher Verdünnung erhalten werden.
In analoger V/eise wurden IgG-Antikörper von Kaninchen bzw.
Menschen, die gegen Antigene anderer chemischer Struktur, einschließlich Haptene, sowie Komplexe partikulare Antigene
gerichtet sind, festgestellt. Beispiele für Antigene (Antikörper-Kombinationen)
, die mit guten Ergebnissen geprüft werden konnten, sind Schweine-Serumalbumin, Eialbumin, Gentamycin
(ein Antibiotikum als Beispiel eines Haptens) nach vorheriger kovalenter Bindung an mit Cyanogenbromid aktiviertem
Dextran 2000, Hepatitis B-Antigen (HBAg, früher genannt Australia-Antigen,
Au-ag), Salmonella-Bakterien und Chlamydia-Bakterie:i:
in allen Fällen konnte eine gute Übereinstimmung mit früheren komplizierteren und wesentlich mehr Zeit beanspruchenden
Methoden festgestellt werden.
Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt mit Proben, die sus Mischungen einer bestimmten Volumenmenge von Lösungen,
die Dextran in abgemessenen Mengen enthielten, und einer bestimmten Volumenmenge einer Verdünnung von Antikörpern in
Dextran bestanden. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 bis 10 Minuten zur Reaktion gebracht. Die Verdünnung des
benutzten Antidextrans, 1/2000 nach Mischung mit der Antigeniialti^en
Lösung, war gewählt worden, damit in Abwesenheit von Antigen in der Probe eine sichtbare Schicht von Staphylococcen
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an der Oberfläche entstand, und zwar ohne einen großen Über- .
schuß an Antikörpern- Unter diesen Bedingungen verhindert selbst eine minimale Menge an Antigen die Bindung der Antikörper
an das Antigen an der Oberfläche durch Umsetzung mit der kleinen Menge der vorhandenen Antikörper. Dies ist in
Abwesenheit einer Staphylococcen-Schicht ein Anzeichen für die Anwesenheit von Antigen. Beim Testen einer Dextranlösung bekannter
Konzentration in Mischung mit dem gleichen Volumen der o«.a. Antidextran-Antiserum-Verdünnung wurde eine vollständige
Inhibierung der Staphylococcen-Adsorption mit einer Lösung von Antidextran, deren Konzentration 0,1 Mikrogramm pro Milliliter
betrug, und eine positive Staphylococcen-Adsorption mit einer Lösung von Dextran, deren Konzentration 0,01 Mikrogramm pro
Milliliter betrug, erreicht. Dies zeigt, daß die Empfindlichkeit der beschriebenen Methode der der radioimmunologischen
Tests entspricht.
Eine Glasplatte, 20 χ 20 cm, wurde mit Chromschwefelsäure wie
in Beispiel 1 angegeben gereinigt, dann einer 1$igen Lösung von Schweine-Serumalbumin in PBS ausgesetzt, indem man etwa
1 ml der Lösung zwischen zwei gleiche Glasplatten spritzte und diese übereinander legte und zwar in einer solchen Weise, daß
ein Rand von etwa 3 cm Antigen-frei blieb. Das Spülen und Trocknen erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch wurden
die Flüssigkeit und die Luft in die Richtung von dem Antigenfreien
Rand geblasen. Über die gesamte Platte wurde eine dünne Schicht eines Gels aus "Sephadex G-75 Superfine" (Produkt der
Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) aufgebracht. Danach wurde die Platte in eine Vorrichtung für die Dünnschicht-Gel-Chromatographie
gesetzt und mit einem oberen und einem unteren Gefäß, die PBS enthielten, verbunden, und zwar mit Hilfe
von Filterpapieren zwischen den Gefäßen, so daß die Flüssigkeit
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nach dem Siphon-Prinzip floß. Proben wurden in Form von 5
10 Mikroliter-Tropfen des Serums oder der Verdünnung desselben
.auf den oberen Teil des Antigen—freien Randes aufgebracht. Der
Unterschied in der Höhe zwischen den Flüssigkeiten wurde so ' eingestellt, daß die Probe über die Platte in etwa 3 Stunden
transportiert wurde. Fach dem das Gel mit PBS gewaschen worden war, wurde die Platte nochmals mit T-PBS gespült und dann einem
normalen Kaninchenserum, verdünnt auf 1/100, etwa 5 Minuten
ausgesetzt; danach wurde erneut mit T-PBS gespült, worauf schließlich das Staphylococcen-Reagenz aufgebracht und wie in
Beispiel 1 beschrieben gespült wurde. Das Ergebnis erkennt man am besten in schräg durchscheinendem Licht gegen einen dunklen
Hintergrund, und zwar zeigen sich dreieckige Bereiche, deren Basis an der Grenzlinie zwischen der Antigen-Oberflache und
dem Rand liegt und deren Spitze in die Fließrichtung der Flüssigkeit zeigt. Der Bereich ist der Menge der Antikörper in
der Probe direkt proportional.
Analog der vorstehend beschriebenen Technik wurden gesponnene und nicht gesponnene } sogenannte"non-woven"Fasern als
Material für den Flüssigkeitstransport verwendet. Zwei Vorteile konnten so erreicht werden; einerseits ergibt sich keine seitliche
Diffusion der Probe während des Transportes und andererseits besteht keine Notwendigkeit, die Platte beispielsweise
einem auf 1/100 verdünnten normalen Kaninchenserum auszusetzen, bevor das Staphylococcen-Reagenz aufgebracht wird. Es ist auch
möglich, mehrere parallele Flüssigkeitsströme zu erreichen, ohne daß man auf der Glasplatte eine feste Phase als Unterlage
haben muß, vorausgesetzt, daß die Platte zuerst in parallelen Linien befeuchtet worden ist, z.B. mit nassen Fäden und daß der
Zufluß über die etwas geneigte Platte mit einer Anzahl von Fäden von einem Gefäß aus vorgenommen wird, dessen Flüssigkeitsspiegel
etwa 1 cm über der oberen Kante der Glasplatte liegt. Der Abfluß der Flüssigkeit erfolgt über Fäden, die in ein Bad unmittel-
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-H-
bar unter der unteren Kante der Platte eintauchen. Mit dieser
zuletzt "beschriebenen Technik wird ein genaueres Ende der mit dem Staphylococcen-Reagenz "beschichteten Oberfläche
erreicht.
Kaninchen-Antidextran-Antikörper, welches spezifisch an ein an
der Platte adsorbiertes Antigen gebunden ist - als Ergebnis der in Beispiel 1 im einzelnen beschriebenen Arbeitsweise,
jedoch ohne die Platte dem Staphylococcen-Reagenz auszusetzen wurde auch festgestellt, indem man die Platte Reagenzteilchen
aussetzte, die durch Behandlung von Polymethylmetacrylat-Teilehen
mit einer durchschnittlichen Größe von 1 Mikron mit einem Meerschweinchen-Antikaninchen-Immunoglobulin-Antiserum,
verdünnt auf 1/25 oder oder Immunoglobulin-3?raktion eines solchen Serums hergestellt worden waren. Die Teilchen wurden
mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung gewaschen und vor
der Verwendung auf eine 0,5 bis 1$ige Suspension (V/V) eingestellt.
Yfährend der Berührung zwischen Reagenz und Platte wurde die Suspension vorsichtig über die Oberfläche der Platte
hin "und her bewegt, so daß die spezifische Bincjung der Reagenzteilchen
an die Antikörper, die an das auf der Oberfläche der Platte adsorbierte Antigen gebunden waren, erhöht wurde. Die
auf diese Weise erzielten Ergebnisse sind denen äquivalent, die mit dem Staphylococcen-Reagenz gemäß Beispiel 1 erhalten
wurden.
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Claims (9)
- - 15PatentansprücheVerfahren zur Peststellung der Anwesenheit von Antikörpern (i), welche spezifisch auf ein Antigen ausgerichtet sind, in einer wässrigen Probe durch Aufbringen der letzteren auf eine glatte, vorzugsweise flache oder gewölbte Oberfläche, die zum Binden der Antikörper (i) mit dem spezifischen Antigen bestrichen worden ist, und anschließende Bestimmung der an die Oberfläche gebundenen Antikörper (i), dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberfläche zur Bestimmung der Antikörper mit einer Suspension von kleinen wasserunlöslichen Teilchen in Berührung bringt, an die ein Biopolymer direkt gebunden ist, welches die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an - vorzugsweise zu einer bestimmten Immunoglobulin-Klasse gehörenden - Antikörper, und zwar vorzugsweise in einer nicht-Antigen bindenden Struktur der Antikörper hat, wobei die Teilchen an den Teil der Oberfläche, an den speziell die Antikörper gebunden sind, in einer Schicht adsorbiert werden, die mit bloßem Auge erkennbar ist.
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Teilchen um Bakterienkörper oder andere Mikroben oder Fragmente derselben handelt, die in ihren Oberflächenschichten das Biopolymer enthalten oder an die das Biopolymer durch adsorbtive Kräfte oder kovalente Bindungen gebunden ist.
- 3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen aus kleinen, künstlich erzeugten Teilchen eines synthetischen oder biologischen Materiales bestehen, die in ihren Oberflächenschichten das Biopolymer enthalten oder an die das Biopolymer durch adsorbtive Kräfte oder kovalente Bindungen gebunden ist.509850/0724
- 4) Verfahren, nach Anspruch 1 oder 2 zur Feststellung von Antikörpern der IgG-Klasse, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen aus Protein A enthaltenden, vorzugsweise abgetöteten Staphylococcen bestehen.
- 5) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche mit den Antigen-gebundenen Antikörpern (i) mit einer Suspension von Bakterienkörpern, an deren Oberfläche auf die Antikörper (i) ausgerichtete Antikörper (II) direkt gebunden sind, in Berührung gebracht wird.
- 6) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Feststellung nichtProtein Α-enthaltender Antikörper (I), dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche mit den Antigen-gebundenen Antikörpern (I) mit Protein Α-reaktiven Antikörpern (II), die auf die Antikörper (i) ausgerichtet sind, in Berührung gebracht wird, worauf eine Suspension von Protein A enthaltenden Staphylococcen zugefügt wird, um die Oberfläche mit der doppelten Schicht der Antikörper sichtbar zu machen.
- 7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe in einer Richtung in einer Zone, vorzugsweise einer engen Zone, über die Antigen beschichtete Oberfläche geleitet wird.
- 8) Verfahren nach Anspruch T bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere dünne Schichten eines Mediums mit Kapillarräumen über die Antigen beschichtete Oberfläche gelegt werden, durch welche die Probe hindurchgeleitet wird, wobei die Schichten vor der Sichtbarmachung der Antikörper beschichteten Oberfläche entfernt werden.509850/0724
- 9) Verfahren nach Anspruch 1 "bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die möglicherweise das Antigen enthaltende Probe mit einer bekannten Menge gegen das Antigen gerichteter Antikörper vermischt wird, worauf der mögliche Überschuß der Antikörper, der durch das Antigen in der Probe nicht inhibiert worden ist, festgestellt wird und als indirektes Maß für die Antigenmenge in der Probe dient.E1Ur·'Pharmacia Diagnostics AB Uppsala / SchwedenDr.H.JfWolffRechtsanwalt509850/0724
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7407139A SE387746B (sv) | 1974-05-29 | 1974-05-29 | Forfarande for visuellt pavisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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