JPS59122950A - 生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的に活性な物質を測定する方法およびそ
れに使用する標識剤に関する。

近年、抗原抗体反応を利用し、微量成分を定量的に測定
する方法が臨床検査および゛医学、獣医学、薬学、微生
物学などの研究分野において利用されてきている。

赤血球凝集反応や免疫拡散法などの古典的方法に加えて
、最近では抗原・抗体反応により生じさせた免疫複合体
を光散乱により測定するネフエロメトリー、螢光や放射
性同位元素または酵素などで抗体もしくは抗原を標識し
、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫測定法、さらに
加えて合成ポリマー微粒子に抗原や抗体を固定化し、抗
体や抗原の存在でおこる微粒子の凝集の程度をガラス板
上やマイクロプレートで観察することや、凝集にともな
う光の透過度の変化を分光光度計で測定することで抗体
や抗原の測定をおこなう方法も開発されつつある。

とりわけ、放射性同位元素を用いた免疫測定法（ＲＩＡ
）は、最も高感度の分析法として広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取シ扱うため、被爆の危険
が伴うし、特別の施設も必要となる。したがつ゛てＲＩ
Ａにかわる高感度測定法の実現が求められている。

なかでも、螢光免疫測定法（ＦＩＡ）はＲＩＡの利点を
残し、放射性同位元素のかわりに螢光物質を利用する取
り扱いやすい方法である。しかし、現在のところＦＩＡ
はＲＩＡに比較して、感度が低いので、適用範囲が限ら
れている。また、一部の物質については、ＲＩＡに匹敵
する測定感度をあげている測定法として酵素免疫測定法
（Ｅ・ＩＡ）があるが、必ずしも全ての雪質についてＲ
ＩＡと同様の感度をあげているわけでもなく、試薬も比
較的高価であり、また取り扱いもＲＩＡやＦＩＡはど容
易ではないので、ＲＩＡを凌駕するまでに至っていない
。

一般にＲＩＡ法に代表される標識免疫測定法は原理的に
２方法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサ
ンドウィッチ法と称されている方法である。競争法とは
、抗原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液
と、前もって放射性同位元素などの標識剤で標識してお
いた既知濃度の被測定物質を混合し、そこに抗体もしく
は抗原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができる
が、複合物または複合物を形成しなかった遊離物質には
標識された被測定物質と標識されていない被測定物質が
含まれており、その比率を測定することで検体中の被測
定物質の測定をおこなう方法である。他の１つの方法で
あるサンドウィッチ法は、被測定物質と特異的に結合す
る結合のパートナ−を固定化しておいた固相と、別に用
意した被測定物質と特異的に反応しうる物質を放射性同
位元素などで標識して得た標識した°結合性物質とで被
測定物質をサンドウィッチした後、固相もしくは液相中
の標識物質の測定をおこなうことにより、被測定物質の
測定をおこなう方法である。

本発明者らはＲＩＡにかわる安全で安価でしかも操作が
容易な高感度測定法を開発すべく検討した結果、ＦＩＡ
の長所を生かした方法、すなわち標識免疫測定法におい
て螢光物質を結合したコロイド粒子を使用することによ
り、生物学的に活性な物質を高感度で測定できる新規な
測定法を見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、検体溶液中の生物学的に活性な被測
定物質を標識免疫測定法により測定する方法１でおいて
、標識剤として螢光を発する直径０．０３μｍ−’３μ
ｍの微粒子を用いることを特徴とする生物学的に活性な
物質の測定法である。

本発明の標識免疫測定法には代表的な方法としてサンド
ウィッチ法および競争法がある。

サンドウィッチ法とは、検体溶液中の生物学的に活性な
被測定物質と、被測定物質に特異的に結合する結合のパ
ートナ−を固定化した固相。

および被測定物質に特異的に結合する性質がありかつ標
識剤で標識された物質とを反応させ、次いで液相に残存
した標識物質または、固相に結合した標識物質を測定す
ることにより被測定物質を測定する方法である。また競
争法とは、検体溶液中の生物学的に活性な被測定物質、
および標識剤で標識された既知量の被測定物質を、被測
定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固定化し
た固相に反応させた後、液相に残存した標識物質又は固
相に結合した標識物質を測定することにより被測定物質
を測定する方法である。

本発明の特徴は標識免疫測定法で、被測定物質と特異的
に反応しうる物質（以下、結合性物質と称する）を、放
射性同位元素や酵素または螢光性試薬によって標識した
標識物質を使用するかわりに、螢光物質を多数結合また
は含有させた粒径が０．０３μｍ〜６μｍのコロイド粒
子（以下螢光コロイド粒子と゛称す）で被測定物質もし
くは結合性物質を標識した標識物質（以下螢光コロイド
標識物質と称′ｔ）を使用したことである。螢光コロイ
ド標識物質は、競争法では直接、サンドウィッチ法では
被測定物質を介して固相に結合するが、適当な量の螢光
コロイド標識物質を用いれば、被測定物質の量と、固相
に結合するまたは液相に残存する螢光コロイド標識物質
の量とに定量的な相関が生じる。螢光コロイド標識物質
の測定は、螢光光度計によっておこなえる。コロイド粒
子には多数の螢光物質を結合または含有させることが可
能であり、従来のＦＩＡのように結合性物質を単に螢光
性試薬で標識するのに比較し、格段に螢光強度をあげる
ことができ、そのために測定感度もはるかに向上できる
。

本発明で使用する固相は、螢光コロイド粒子と分離可能
な形状もしくは材質のものが好ましい。すなわち、固相
を螢光コロイド粒子よりも格段に大きい球や板状の物質
として螢光コロイド粒子との混合系からつ寸み出せるよ
うにしたり、固相を微粒子とした場合でも螢光コロイド
粒子より大きい粒径として、膜、フィルターまたは遠心
分離機などで分離できるようにしたり、粒径を変えなく
とも固相微粒子の比重を螢光コロイド粒子の比重より大
きくして、沈降しやすくし遠心操作により分離できるよ
うにしたり、または固相微粒子内部に感磁性物質を封入
しておき磁石で吸いつけることで分離できるようにした
りすることが必要である。以上の具体例は、固相と螢光
コロイド粒子との分離につ゛いて理解されや、すいよう
に記したのであり、特に固相を限定するものではない。

固相の素材としては生体構成成分や金属などでもよいが
、形状を自由に調節できしかも安定な有機高分子化合物
が好ましい。例えばポリスチレン、ポリアクリロニトリ
ル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、
ポリ−ε−カプラミド、ポリエチレンテレフタレートな
どの疎水性重合体群、あるいはポリアクリルアミド、ポ
リメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレ
ート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポ
リ（２，ろ−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（
２，３−ジオキシプロピルメタクリレート、ポリエチレ
ングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合
体群、もしくは−両方の性質を持つ共電体群がある。ま
た固相□　の形状は板、試験管、マイクロプレートなど
でもよいが、微粒子を固相と゛すれば表面積を容易に増
加させることができる。

固相への結合のパートナ−の固定化方法としては、物理
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な固相には蛋白な
どは物理吸着で固定化できるし、アミン基やカルボキシ
ル基が官能基として存在する同相にはカルボジイミドで
カルボキシル基やアミノ基を有する物質を共有結合で固
定化できるし、アミン基またはカルバモイル基を有する
固相にはアミノ基を有する物質をグルタルアルデヒドな
どのポリアルデヒドで共有結合により固定化できるし、
ヒドロキシル基を有する固相には臭化シアンによりアミ
ノ基を有する物質を共有結合で固定化できる。また、ア
ルデヒド基またはエポキシ基を有する固相にはアミン基
を有する物質を直接反応させて共有結合により固定化で
きる。

またメルカプト基を有する固相には、メルカプト基を有
する物質をシマレイミドをバインダーとして結合させる
ことができる。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗
浄液を使用することもあり、固定化方法としては固定化
□゛した物質が脱離する危険のある物理吸着法に比して
共有結合法が好ましい。

本発明で使用する結合のパートナ−とは被測定物質に特
異的に結合しうる物質である。例えば、被測定物質が抗
原、抗体、ホルモン、抗原抗体複合体、糖類、免疫グロ
ブリン、リンフ才力イン、補体などの場合には順に抗体
、抗原、該ホルモンリセプター、リューマチ因子、レク
チン、プロティンＡ１該リンフオカインリセプター、該
補体リセプターなどとの組み合わせがそれぞれ被測定物
質と結合のパートナ−の組み合わせになりうる。また全
ての物質について、特異抗体が存在する場合には、その
特異抗体および対応する抗原がパートナ−となりうる。

サンドウィッチ法では、一般にはまず結合のハードナー
を固定化した固相と検体とを反応させ次に、被測定物質
が結合のハードナーを介して結合した固相と螢光コロイ
ド標識物質とを反応させる。この後にサンドウィッチ法
では一般的に固相と液相とを分離し洗浄する操作がある
。

しかし、固相側と螢光コロイド側とに同一物質に対する
しかも別の抗原結定部位に対する抗体を結合させるなど
して、１段階の反応で固相と螢光コロイド粒子によって
被測定物質をサンドウィッチすることによりこの段階で
の分離および洗浄操作をはふくことも可能であシ、本発
明に関しても同様のことができる。

一方、競争法でも検体と螢光コロイド標識物質とを同時
に加えないで、検体と固相との反応後に螢光コロイド標
識物質を加えることがあるが、どちらにしても螢光コロ
イド標識物質を固相の結合のハードナーと反応させてい
る。

螢光コロイド粒子は測定の精度を出すうえで、分散性が
よくしかも均一な粒径、形状であることが好ましい。反
応効率の点から粒径は小さいほどよく、少くともブラウ
ン運動をおこす程度の粒径すなわち５μｍ以下であるこ
とが好ましい。しかし、あまり粒径が小さくとも操作上
および測定上適当で−はないので、粒径は０．０３μｍ
〜６μｍの範囲であることが適当であり、特に０．１μ
ｍ〜１μｍの粒径が好ましい。

螢光コロイド粒子の素材は均一で適当な粒径の微粒子を
得る目的から有機高分子重合体が好ましい。例えば前記
の固相と同様の疎水性重合体、親水性重合体、両者の共
重合体群がある。

本発明の微粒子は乳化重合、懸濁重合沈澱重合などによ
り調製できる。これらの重合、法は均一な粒径および形
状の微粒子を得るのに適した方法である。コロイド粒子
に結合または含有させる螢光物質としてはど゛のような
物質でもかまわないが、螢光を散乱光から区別する為に
は励起波長のピークと螢光波長のピークとの波長差が大
きい方が好ましい。またコロイド粒子への螢光物質の固
定化法は物理的吸着による方法でも化学的結合による方
法でもかまわない。しかし、螢光物質がコロイド粒子か
ら遊離したりしない為にも化学結合、特に共有結合が好
ましい。共有結合法としては、たとえばコロイド粒子に
官能基としてアミ７基があるならば、フルオレツセイン
インチオシアネート、ジクロロトリアジニルフルオレツ
セインなどのフルオレッセインの誘導体、ロングミンイ
ソチオンアネート、テトラメチルローダミンイソチオン
アネート、９′［Ｉ　Ｈ１５Ｈ１９Ｈ４１，Ｉ　Ｈ１１
５Ｈ〕キサンセノ−（２，３，４−ｉｊ　：　５，６．
７−　ｉ’ｊ’コシキノリリジン〕＝６−１’、　２’
、　３’、　６’、　７’、−１２’、　１５’、１６
’、　１７’−オクタヒドロ−４（または５）−インチ
オシアネート−スピロ〔イソベンゾフラン−１（ろＨ）
〕などのローダミン誘導体、４−アセタミド−４″−イ
ソチオシアノスチルベン−２，２′−ジスルホン酸、ダ
ンンルクロライド、フルオレスアミン誘導体、などの螢
光竺質は容易に結合させられる。またコロイド粒子にカ
ルボキシル基がある場合は、アミノフルオレツセインな
どのアミン基を有する螢光物質をカルボジイミドを用い
て結合させることもできるし、コロイド粒子にメルカプ
ト基がある場合にはやはシ、アミノフルオレツセイ／な
どのアミン基を有する螢光物質をＮ（−４−カルボキシ
シクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシス
クシジイミドエステルなどの試薬を用いて結合できる。

また、螢光コロイド粒子への被測定物質または結合性物
質の固定化は、やはり物理吸着でも化学結合でもかまわ
ないが、被測定物質や結合性物質が螢光コロイド粒子か
ら遊離し力いためには共有結合法によるのが最も好まし
い。

本発明のサンドウィッチ法で使用する結合性物質とは被
測定物質と特異的に結合する物質であシ、固相に固定化
した結合のパートナ−と同一物質であってもかまわない
し、異なる物質であってもかまわない。

例えば被測定物質がイムノグロブリンの場合、固相に結
合させる結合のヘートナーとしてプロティンＡを用い、
活性コロイド粒子の結合性物質として抗イムノグロブリ
ン抗体を用いてもよいし、また両者共に抗イムノグロブ
リン抗体を用いてもよい。

本発明において被測定物質となりうる物質は、生物学的
に特異的な親和性を有する物質をパートナ−として有し
ている物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブドウ
球菌、ジフテリア菌、ザルモネラ菌、赤痢菌などの細菌
およびその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマな
どのスピロヘータおよびその構成成分に対する抗体；マ
イコプラズマおよびその構成成分に対する抗体：マラリ
ア原虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体；
リケソチャアおよびその構成成分に対する抗体；インフ
ルエンザ、アデノウィルス、ポリオーマ、麻疹、風疹、
肝炎、おたふくかぜなどのウィルスおよびその構成成分
ならびにそれらに対する抗体；多糖類、ヒトアルブミン
、卵白アルブミンなどの異種抗原ならびにそれらに対す
る抗体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛性ゴ
ナドトロピンなどのホルモン；リボヌクレアーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵素；
腎臓細胞膜、肝臓細胞膜、α−フェトプロティン、ＯＥ
Ａなとの器管固有の抗原またはりセプター；コラーゲン
、アミロイドなどの結合組織成分；赤血球、血小板など
の血球抗原、またはりセプター；フィブリン、プラスミ
ノーゲンなどの血漿タンパク質；リューマチ因子やＣ反
応性タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合体；細
胞膜などに対する自己抗体；などがある。

固相と螢光コロイド標識物質との反応後、固相に結合し
た螢光コロイ、ド標識物質もしくは、固相に結合しなか
っだ液相の残存螢光コロイド標識物質の螢光を測定する
。既知濃度の被測定物質を本方法で測定し、被測定物質
濃度と螢光強度との関係を求めておき、未知濃度の被測
定物質の螢光強度から逆に被測定物質の定量をおこなう
。本方法は螢光コロイド粒子の螢光強度を増大させるこ
と棲測定感度を高くすることが可能な方法である。また
本方法でおこなう螢光強度の測定は、一般の螢光光度計
でもでき、特にフォトンカウンターなどを必要としない
。

以下に本発明の理解を容易にする為に若干の実施例を示
した。

実施例１ （ヒトイムノクロプリンＧ（ＨＧＧと略記する）の測定
） （固相用微粒子の調製） 固相として使用した微粒子は特開昭５６−１４１５５９
に記載の方法により、グリシジルメタクリレート、２−
オキシエチルメタクリレート、およびトリエチレングリ
コールジメタクリレートの６者を８５．７　：　９，５
　：　４，８のモル比で混合し重合した粒子をアミン化
し、加水分解することにより調製したッ平均粒径４．６
μｍの親水性微粒子である。

（固相用微粒子への抗ＨＧＧ抗体の固定化）抗ＨＧＧ抗
血清（Ｍｉｌｅｓ）をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のカラムクＣｌ
マドグラフィーによりＩｇＧ分画に精製した。

調製した抗ＨＧＧ抗血清のＩｇＧ分画１０ｑ／７Ｍを含
むｐＨ７，２の０．１−５モル生理リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）中に濃度が１優になるように特開５６−１４１５５
９記載の方法に準じてグルタルアルデヒドで活性化した
アミン化微粒子を分散させ２５℃で２時間反応させた度
、ろｏＯｏｒｐｍの遠心操作で粒子を沈降させることで
微粒子の洗浄をおこない、０．１％のウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡと略記する。）中に分散し、抗ＨＧＧ抗体固
定化微粒子を調製した。

（結合性物質固定化用螢光コロイド粒子の調製）メチル
メタクリレート、グリンジルメタクリレート、メタクリ
ル酸、スルホプロピルメタクリ費レートナトリウム塩、
エチレングリコールジメタクリレートを、５０：２０：
１５：５：１０のモル比で混合し、０．’１２５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（８ＤＳ）水溶液にこれらモノマー
の合計重量が１０％となるように加え、窒素雰囲気下で
激しく攪拌し、モノマーを乳化させた。

重合は、１ｍＭの過硫酸アンモニウムを開始剤として６
０℃で約１．５時間おこなった。次に反応液中の未反応
のモノマーを四塩化炭素で抽出し除去した。得られた直
径的０．１５μｍのコロイド微粒子は０．０２５％硫酸
水溶液中で６０℃で１時間加水分解した後、水酸化ナト
リウムで中和し、洗浄した。洗浄は１７．５０　Ｏｒｐ
ｍで２０分間遠心することでおこなった。洗浄後、コロ
イド微粒子をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分
散し、ＤＭＳＯ中で１２係のアンモニアによりアミン化
した。反応は６５℃で６．５時間おこなった。充分洗浄
し、アンモニアを除去した後、過ヨー素酸で酸化したア
ラビアゴム０．１係を含むＰＨ１０の水溶液に１係のア
ミン化コロイド粒慴騙散し、６０℃でろ時間反応させた
。

過剰のアラビアゴム酸化物を遠心による洗浄操作で除い
た後、コロイド粒子を０．１％となるようにＤＭＳＯに
分散させ、０．２ｍグ／ｍｉのジクロロトリアジニルア
ミノフルオレセインと４０℃で１時間反応させた。螢光
コロイド微粒子はｐＨ１０，０の０．　Ｉ　Ｍ　　Ｎａ
ＨＯＯｓとＮａＯＨで、洗浄した後、０．１係となるよ
うに同洗浄液中に分散し、保存した。

（抗ＨＧＧ抗体の螢光コロイド粒子への固定化）ヤギで
作製した抗ＨＧＧ抗体ＩｇＧ分画（Ｍｉ　ｌｅｓ　）２
４０μｇ／ｍＡ溶液ｓ　ｏ　ｏ　ｐｔと０．１’％結合
性物質固定化用螢光コロイド粒子５００μｔ＆″を混合
し、４℃で２日間反応させた。反応後シアン水素化ホウ
素ナトリウムを１５■を加えて、２５℃で１時間反応さ
せて、シック塩基を還元した。

得られた抗ＨＧＧ抗体結合コロイド粒子をｐＨ８，００
０，１Ｍ　トＩＪス塩酸緩衝液で洗浄し、１乃のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含む同緩衝液中に保存した。

（ＨＧＧの測定） ＨＧ　Ｇ　（Ｍｉ　ｌｅｓ　）の１０μｇ／ｒｎｔ〜１
ｎｇ／ｍｔ″！での１０倍稀釈系列（各’９ｏｕｚ）を
作製し、ガラス試験管内で１％の抗ＨＧ（）抗体固定化
固相微粒子分散液１００μｔと振盪しながら２５℃で１
時間反応させて、３０００ｒｐｍで遠沈、再分散させる
操作により固相微粒子をトリス緩衝液で６回洗浄し、Ｈ
ＧＧが抗ＨＧＧ抗体を介して結合している固相を得た。

抗１−Ｉ　Ｇ　Ｇ抗体固定化螢光コロイド粒子０．０２
係分散液１０μｔととの固相微粒子１％分散液１００μ
ｔとを試験管内で混合−し、２５℃で１時間反応させ、
固相をトリス緩衝液で充分洗浄した。洗浄後、固相粒子
を２ｍｔのトリス緩衝液に分散し、４５０＋ｍの光で励
起して５６０藺の螢光強度を測定した。螢光光度計は日
立６５〇−４０を使用した。

Ｈ（）Ｇ　１０　ｐｇ／ＭＬ　〜１ｍｙ／ｍｔまでの範
囲におけるＨＧＧ濃度と螢光強度との関係を第１図に示
した。

実施例２ （ウサギイムノグロブリンＧ（ＲＧＧと略記する。）の
測定） ＲＧＧおよび抗ＲＧＧ抗体ＩｇＧ分画はＭｉｌｅｓより
購入した。測定は実施例１のＨＧ　Ｇ測定の場合と同様
に、固相に結合した螢光コロイド微粒子の螢光を測定し
た以外に、結合しなかった螢光コロイド粒子の螢光につ
いても測定をおこなった。ただし固相微粒子は０．５　
ｍＷとした。各々について１００μｇ／ｍｔ〜１ｎｇ／
ｍｔまでの範囲のＲ，ＧＧ濃度と螢光強度（相対強度）
の関係を第２図、第６図に示した。

実施例６ （ＢＳＡの測定） Ｂ、ＳＡおよびヤギで作製した抗ＢＳＡ抗血清はＭｉｌ
ｅｓより購入した。抗ＢＳＡ抗血清の固相への固定化は
、グルタルアルデヒド化した粒子分散液１ｍｔと抗血清
０．１ｍ、！とを混合し、実施例１と同様にして固定化
した。螢光コロイド粒子へのＢＡＡの固定化は実施例１
に準じ、ＢＳＡ５ｒｑ／ｍｔを抗ＨＧＧ抗体のかわりに
使用することでおこなった。固相、螢光コロイド粒子の
両方ともＢ’　Ｓ　Ａのかわシに１％のヒト血清アルブ
ミン（Ｈ８Ａ）を含むトリス塩酸緩衝液中に保存した。

ＢＳＡの測定はパ競争法゛°でおこなった。抗ＢＡＡ抗
血清固定化固相の１％分散後ＩＯ［ｌμＬとＢＳＡ濃度
１　ｎｇ　／ｒ＋Ａ　〜１００　μｇ／ｎ７までの１０
倍稀釈系列検体、各９０μｔとを２５℃で１時間反応さ
せた後、実施例１と同様に洗浄した。次にＢＳＡ螢光コ
ロイド粒子０．０２％分散後１０μｔを上記、固相分散
ｉ１０’ｃｌμＬに加え、２５℃で１時間反応させた後
、実施例１と同様に固相を洗浄し、固相に結合した螢光
コロイド粒子の螢光強度を測定した。

Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｉ　００　μｇ　／　ｍｌ　〜１　ｎｇ　
／　ｎｔまでの範囲におけるＢＳＡ濃度と螢光強度とめ
関係を第４図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１のサンドウィッチ法によるＨＧＧ測定
結果を、第゛２図および第６図は実施例２のサンドウィ
ッチ法によるＲＧＧ測定結果を第４図は実施例６の競争
法によるＢＳＡ測定結果をそれぞれ示す。 特許出願人　東　し　株　式　会　社 づ １Ｑ５ Ｒ６６衰度　）ｋ ；１′３図 荒 Ｒ顛濃度　７６見

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体溶液中の生物学的に活性な被測定物質を標識
   免疫測定法により測定する方法において、標識剤として
   螢光を発する直径０．０６μｍ〜６μｍの微粒子を用い
   ることを特徴とする生物学的に活性な物質の測定法。
2. （２）標識免疫測定法が、検体溶液中の生物学的に活性
   な被測定物質と、被測定物質に特異的に結合する結合の
   パートナ−を固定化した固相、および被測定物質に特異
   的に結合する性質がありかつ標識剤でｉ゛識された物質
   とを反応させ、次いで液相に残存した標識物質または、
   固相に結合した標識物質を測定することにより被測定物
   質を測定する方法である特許請求の範囲第（１）項記載
   の生物学的に活性な物質の測定法。
3. （３）標識免疫測定法が、検体溶液中の生物学的に活性
   な被測定物質、および標識剤で標識された既知量の被測
   定物質を、被測定物質に特異的に結合する結合のパート
   ナ−を固定化した固相に反応させた後、液相に残存した
   標識物質又は固相に結合した標識物質を測定するととに
   より被測定物質を測定する方法である特許請求の範囲第
   （１）項記載の生物学的に活性な物質の測定法。
4. （４）螢光を発する直径０．０３μｍ〜６μｍの微粒子
   からなる免疫測定用標識剤。