FI58404B - Foerfarande foer visuellt paovisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov - Google Patents

Description

f.1 .... KUULUTUSJULKAISU c Q . n , V»v w ("»UTLÄOeNINOSSKRIFT 5 8404 C Patentti ny'Jnnotty 12 01 1931 ^Patent cioddelat —' (S1) Kv.ik.Va3 G 01 N 33/5^ SUOMI —FINLAND (21) ***ttaMunm-r*tnt*takiitog 7515^2 (22) HakwnltpUvl—Anaekninf^ag 27.05.75 (23) AlfwplM—GIHIthvtidai 27.05.75 (41) Tullut JulkMcsl — Bllvlt offantllg 30.11.75

Patentti· Ja rekisterihallitut (44) Nihtivikrtp*»» j. kuuLjultoiam pvm.-

Patent- och registerttyrelsen Antöion utiagd oeh uti.*krMt«i puWkerwi 30.09. o0 (32)(33)(31) Pyy4«tty «tuolkws—Begird priority 29.05.7**

Ruotsi-Sverige(SE) 7**07139~0 (71) Pharmacia Diagnostics AB, Box 17, 751 03 Uppsala 1, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Ulf Ragnar Svante Jonsson, Lund, Ruotsi-Sverige(SE) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä vasta-aineiden visuaaliseksi osoittamiseksi vesipitoisessa näytteessä - Förfarande för visuellt pävisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää vasta-aineiden läsnäolon osoittamiseksi vesipitoisessa näytteessä, jotka vasta-aineet ovat spesifisesti suunnatut antigeeniä vastaan.

Tunnetaan jo useita menetelmiä spesifisten vasta-aineiden osoittamiseksi ja kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisissa näytteissä. Erään tällaisen menetelmän mukaisesti käytetään lasia, polymeeriä, metallia tai sentapaista materiaalia olevia, antigeenillä päällystettyjä pintoja. Sellaisia näytteitä, jotka sisältävät mahdollisesti vasta-aineita, jotka ovat spesifisesti suunnatut pinnalla olevaa antigeeniä vastaan, lisätään tälle pinnalle, jonka jälkeen vasta-aine-antigeeni-kompleksi voidaan osoittaa eri tavoin. Niinpä voidaan radioaktiivisesti merkittyjen vasta-aineiden antaa kilpailla näytteessä olevien vasta-aineiden kanssa ja mitata se radioaktiivisuus, joka on spesifisesti sitoutunut antigeenipinnalle. Haittana tällaisessa radio-aktiivisuutta käyttävässä tekniikassa on mm. suuri ajantarve ja kalliiden ja monimutkaisten laitteiden tarve, sekä ne terveysvaarat, jotka liittyvät radiokatiivisten aineiden käyttöön .

2 58404

On myös ehdotettu (Adams ym. Journal of Immunological Methods 3, (1973), s. 227-232) osoittaa vasta-aine-antigeeni-kompleksi 1) toteamalla kostutettavuuden kasvu kohdistamalla pintaan vesihöyryn vaikutus, 2) värjäämällä proteiiniväreillä (kuten "Coomassie Brilliant Blue R"), sekä 3) toteamalla interferenssivärin siirrot määrätyillä heijastetuilla pinnoilla. Yhtenäisenä haittana näissä menetelmissä on mm., että ne aikaansaavat epätarkkoja reaktioita, koska ei voida estää väärää positiivista reaktiota lisättäessä suuren proteiinivä-kevyyden omaavaa näytettä, kuten laimentamatonta seerumia. Sitäpaitsi ei ole mahdollista suorittaa minkäänlaista reagoivien spesifisten vasta-aineiden analyysiä niiden immunoglobuliiniluokan perusteella, mikä olisi erittäin tärkeätä diagnostisoitaessa mm. infektiosairauksia.

Nyt on yllättäen osoittautunut, että aikaisemmin käytettyjen toteamismenetelmien haitat voidaan poistaa esillä olevan keksinnön avulla.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää vasta-aineiden (I) läsnäolon toteamiseksi vesipitoisessa näytteessä, jotka vasta-aineet ovat spesifisesti suunnatut antigeeniä vastaan, jolloin näyte saatetaan kosketuksiin tasaisen, edullisesti tasomaisen tai putkimaisen pinnan kanssa, joka on päällystetty mainitulla antigeenillä vasta-aineiden sitomiseksi pinnalla olevaan antigeeniin, jonka jälkeen täten sidotut, pinnalla olevat vasta-aineet osoitetaan, ja keksinnölle on tunnusomaista se, että vasta-aineiden mainittua osoittamista varten pinta saatetaan kosketuksiin sellaisen suspension kanssa, joka sisältää pieniä, veteen liukenemattomia osasia, joihin biopolymeeri on suoraan sitoutunut, joka biopolymeeri kykenee spesifisesti sitoutumaan vasta-aineisiin jossain ei-antigeenejä sitovassa rakenteessa, edullisesti niiden Fc-osaan, jolloin mainitut osaset kerääntyvät pinnan siihen osaan, johon vasta-aineet ovat spesifisesti sitoutuneet, jolloin muodostuu paljaalla silmällä selvästi todettavissa oleva, osasten muodostama päällyste.

Antigeenin päällystäminen mainitulle tasaiselle pinnalle voi tapahtua joko käyttäen adsorptiovoimia tai kovalenssisidosta antigeenin (hapteenin) ja pinnan reaktiokykyisten ryhmien välillä mahdollisesti blfunktionaalisten reagenesien vaikutuksesta. Reaktiopintana voidaan käyttää lasia, polymeeriä, metallia tai vastaavaa materiaalia olevaa tasaista pintaa, joka on mahdollisesti peitetty jollain sellaisella aineella, joka helpottaa antigeenin sitoutumista tähän pintaan.

3 58404

Pinta voidaan ensin peittää sellaisten vasta-aineiden kerroksella, jotka ovat spesifisesti suunnatut antigeeniä vastaan ja antigeeni adsorboidaan tämän jälkeen tälle vasta-ainepinnalle. Pinta voi tällöin olla edullisesti tasainen tai putkimainen, vaihtoehtoisesti muodostettu pieniksi kappaleiksi tai sauvoiksi. Pintamateriaalin voivat myös muodostaa polymeeriä, metallia yms. olevat ohuet foliot, jotka ovat mahdollisesti sovitetut paperia, polymeeriä, lasia ja sentapaista olevalle kantajalle. Ohuiden folioiden muodossa olevien reaktio-pintojen eräs etu on se, että ne mahdollistavat antigeenillä päällystettyjen pintojen yksinkertaisen varastoimisen ja kuljetuksen, jolloin antigeeni voidaan suojata mahdollista denaturoitumista vastaan esim. sopivan nesteen ohuella kalvolla. Pinnalla olevalla "antigeeni-päällysteellä" tarkoitetaan tässä yhteydessä ja patenttivaatimuksissa sitä, että antigeeni on kiinnittynyt pintaan niin, ettei se irtoa tästä pinnasta joutuessaan kosketukseen vesipitoisen näytteen kanssa siinä määrin, että reaktiot häiriintyvät.

Sellaisina antigeeneinä, jotka voidaan adsorboida tai sitoa kovalent-tisesti lasia, polymeeriä, metallia tai senkaltaista materiaalia oleville pinnoille, voidaan erikoisesti mainita polypeptidiantigeenit, jotka käsittävät proteiinit, glykopropteiinit, lipoproteiinit, kuten seerumialbumiinin, immunoglobuliinit, muut plasmaproteiinit, kuten polypeptidiluonteiset hormonit, bakteeritoksiinit ja muut mikrobiset polypeptidit jne, polysakkaridiantigeenit, kuten dekstraanin, muut kapselipolysakkaridit, lipopolysakkaridit, lipopolysakkaridiproteii-nikompleksit, jotka ovat peräisin bakteereista ja muualta, nukleiinihapot, kuten DNA ja RNA, hapteenit, kuten pienimolekyyliset hormonit, ja lääkeaineet, jotka ovat mahdollisesti liittyneet makromole-kyyleihin paremman adsorboitumisen aikaansaamiseksi pinnalle, virus-antigeenit, kuten Hepatitis B-antigeeni (HBAg, jota aikaisemmin nimitettiin nimellä Australia-antigeeni, Au-ag), osasten muodossa olevat antigeenit, kuten kokonaiset bakteerit ja muut mikrobit yksisoluiset tai useampisoluiset parasiitit, eläinsolut tai sopivat (sub-) solumaiset fragmentit, joista ovat esimerkkeinä kokonaiset Salmonella-, Treponema palladium-(syfilis) ja Chlamydia-bakteerit.

Edellä ja patenttivaatimuksissa käytetty sanonta "biopolymeerit", tarkoittaa edullisesti myös polypeptidejä, proteiineja, glykoproteii-neja, polysakkarideja, lipoproteiinipolysaklcaridi-komplekseja, riippumatta siitä, millä molekyylin osalla on affiniteetti immunoglobu-liinin ei-antigeenejä r.i to vaan rakenteeseen.

H 58404

Biopolymeeri voi olla peräisin mikrobeista, esim. bakteereista, tai sillä voi olla jokin muu biologinen alkuperä, ja biopolymeerin voi muodostaa myös immunoglobuliini (vasta-aineet (II)), joka on suunnattu immunoglobuliinia vastaan (varsinaiset vasta-aineet (I)). Erittäin sopiva esimerkki biopolymeeristä edellä esitetyssä mielessä on ns. proteiini A, joka on saatu Staphylococcus aureuksesta, tai tämän proteiinin osa, joka on luonteeltaan polypeptidi ja kykenee sitomaan itsensä vasta-aineiden ei-antigeenejä sitovaan rakenteeseen. Toinen esimerkki biopolymeereistä, joilla on vastaavat ominaisuudet, on Staphylococcus epidermiksestä peräisin oleva polypeptidi, sekä biopolymeerit, joilla on määrättyjen streptokokkien pintarakenne. Biopolymeeri voi olla sitoutunut sen mikro-organismin pintaan, joka on sen muodostanut. Kun( biopolymeerin muodostaa proteiini A tai sen osa, muodostuvat osaset erittäin edullisesti stafylokokeista, edullisesti tapetuista stafylokokeista. Proteiini A pitoisen stafylokokkien muodostaman reagenssin valmistus voi tapahtua siten kuin S. Jonsson ja G. Kromvall ovat esittäneet (Eur. J. Immunol. 4_, 29-30 (197*0), jolloin saadaan esim. 10 %:nen perussuspensio, joka kestää vähintään yhden vuoden, ja joka IgG-vasta-aineiden osoittamiseksi, jotka ovat sitoutuneet antigeenin pinnalla, on laimennettava ainoastaan noin 1/2 %:seksi suspensioksi fosfaatin avulla puskuroidussa ruokasuolassa lisäämällä samalla sopivaa pinta-aktiivista ainetta.

Keksinnön mukaisesti voi biopolymeeri olla myös sitoutunut polymeerin pieniin osasiin, jotka ovat liukenemattomia veteen. Esimerkkejä tällaisista polymeereistä ovat sellaiset geeliosaset, jotka sisältävät polyhydroksiyhdisteiden ja bifunktionaalisten aineiden kopolymeerejä, esim. dekstraanista ja epikloorihydriinistä saadut kopolymeerit (Sephade^, valmistaa Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala), akrylaattia sisältävät geeliosaset jne. Ne polymeerien pienet osaset, jotka eivät liukene veteen, voivat kuitenkin olla vedessä turpoavia. Biopolymeerin sitominen osasiin voi myös tapahtua polymeroimalla biopolymeeri mahdollisesti kopolymeroimalla muiden polymeerien kanssa, esim. tekemällä liukenemattomaksi sellainen seerumi, joka sisältää vasta-aineita, jotka ovat erikoisesti suunnatut määrättyä immunoglobuliini-luokkaa tai määrättyjä luokkia vastaan. Haluttaessa voivat nämä pienet osaset olla värjättyjä. Edullisesti käytetään sellaisia osasia, jotka ovat suuruusluokkaa 0,1-20, esim. 0,2-10 mikrometriä.

Keksinnön mukaisesti voi biopolymeeri olla sitoutunut pienten osasten pintaan kovalenttisen luonteen omaavilla sidoksilla tai adsorption avulla.

5 58404

Keksinnön mukaisesti voivat bakteerikappaleet pintakerroksessa sisältää biolopolymeerinä niistä peräisin olevaa biopolymeeriä tai muualta peräin olevaa biopolymeeriä, joka on sitoutunut bakteerikap-paleiden pintaan biopolymeerin ja bakteerikappaleiden luonnollisen sitoutumisen johdosta, ja/tai sidoksella, joka on aikaansaatu keinotekoisesti. Bakteerikappaleet niissä olevine biopolymeereineen voivat olla käsitellyt aldehydillä, esim. formaldehydillä ja/tai glutar-aldehydillä. Ne voivat olla myös lämpökäsiteltyjä niiden tappamiseksi ja/tai steriloimiseksi.

Proteiinissa A olevien stafylokokkien avulla voidaan erikoisesti osoittaa IgG-luokkaan kuuluvia vasta-aineita.

Jos tämän sijasta halutaan osoittaa sellaisia vasta-aineita, jotka eivät kykene sitoutumaan proteiiniin A, voidaan keksinnön mukaisesti käyttää osasia, joihin on kiinnittynyt muita biopolymeerejä, jotka reagoivat spesifisesti näiden vasta-aineiden kanssa.

Keksinnön erään toisen toteuttamismuodon mukaisesti voidaan myös osoittaa sellaisia vasta-aineita, jotka eivät kykene sitoutumaan proteiiniin A, sovittamalla pinnassa oleva vasta-aine-antigoeni-kompleksi proteiiniin A:n reagoivien FgA-vasta-aineiden liuokselle alttiiksi, jotka ovat suunnatut vasta-aineiden jotain tai joitain (ala) luokkia (esim. IgA, IgE ja IgM) vastaan, jotka eivät reagoi proteiinin A kanssa. Tämän jälkeen lisätään proteiini A-pitoinen stafylo-kokkireagenssi ja mahdollista reaktiota tarkkaillaan samalla tavoin kuin edellä on kuvattu.

Keksinnön vielä erään toteuttamismuodon mukaisesti voidaan antigeeniin sidottujen vasta-aineiden (I) pinta saattaa kosketuksiin sellaisten bakteerikappaleiden suspension kanssa, joiden pintaan on suoraan sidottu vasta-aineita (II) (niiden Fc-osien välityksellä), jotka ovat suunnatut mainittuja vasta-aineita (I) vastaan vasta-aineilla (I) peitetyn pinnan näkemiseksi.

Vasta-aineiden puolikvantitatiiviseksi määrittämiseksi näytteessä voidaan käyttää erilaisia menetelmiä. Voidaan esim. kokeilla sarja näytteen erilaisia laimennuksia ja vertailla tulosta vertailunäytteellä suoritettujen analogisten kokeiden kanssa. Tällöin todetaan näytteen se suurin laimennus, joka aiheuttaa positiivisen reaktion.

6 58404

Keksinnön erään erittäin edullisen toteuttamismuodon mukaisesti voidaan kvantitatiivisesti osoittaa vasta-aineiden läsnäolo näytteessä lisäämällä se näytepinnalle antigeeneillä peitetyn osan ulkopuolelle ja saattamalla näyte kulkemaan määrätyssä suunnassa vyöhykkeessä, edullisesti kapeassa vyöhykkeessä, antigeeneillä päällystetyn pinnan yli. Näytteen siirtymisen jälkeen, joka voidaan todeta esim. näytteen värjääntymisen yms. avulla, lisätään suspensioon biopolymeeripitoi-sia osasia. Se pinta, joka tällöin tulee näiden osasten peittämäksi, muodostaa näytteessä olevan vasta-ainesisällön mittapuun ja voidaan verrata tunnetun vertailunäytteen vastaavaan pintaan.

Näytteen kulkemisen aikaansaamiseksi antigeenillä peitetyn pinnan yli voidaan soveltaa menetelmää, jota on käytetty ohutkerrosgeeli-kromatografiatekniikassa, esim. lisäämällä ohut kerros (mahdollisesti monta vierekkäistä kerrosta) kapillaarista väliainetta, esim. osasia, kuten Sephadej^ G-75 Superfine (poikittaissidottu dekstraanigeeli, valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). Nestettä siirtävänä väliaineena voidaan myös käyttää kehrättyjen tai kehtäämättömien kuitujen säikeitä. Ennen tarkastelua käyttäen biopolymeerejä kantavia osasia on luonnollisesti ensin poistettava mainittu väliaine.

On myös mahdollista aikaansaada lineaarinen nestevirtaus tai useita rinnakkaisia lineaarisia nestevirtauksia levyn ylitse ilman, että on olemassa minkäänlaista kiinteän materiaalin tukea antigeenien peittämällä pinnalla, mikäli pinta ensin kosteutetaan käyttäen lineaarista linjaa tai rinnakkaisia lineaarisia linjoja ja sovitetaan nesteen sisään ja poisvirtaus hieman kaltevalle levylle ja siitä pois käyttäen sopivaa kapillaarista materiaalia.

Näytteessä olevien vasta-aineiden siirtyminen voidaan myös aikaansaada suunnassa antigeenien peittämän pinnan yli käyttäen elektrofo-reettista tekniikkaa.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan myös määrittää epäsuorasti puolikvantitatiivisesti tai kvantitatiivisesti näytteessä olevan antigeenin väkevyys kokeilemalla antigeenin sisältävien näytteiden seoksia ja standardisoidun määrän vasta-ainetta sisältäviä annoksia tämän antigeenin suhteen ja osoittamalla sitten sen mahdollinen vasta-aineylimäärä, jota näytteessä oleva antigeeni ei ole kyennyt estämään.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan määrittää vasta-aineita 7 58404 periaatteessa erilaisten antigeenilajien suhteen. Niinpä pinnalla olevana antigeeninä voidaan käyttää sekä liukoista että liukenematonta (esim. osasten muodossa olevaa) antigeeniä. Tämä on erittäin suuri etu verrattuna aikaisempaan tekniikkaan, että vasta-aineet voidaan osoittaa liukenemattomien (esim. osasten muodossa olevien) antigeenien suhteen yksinkertaisella tavalla ja käyttäen erittäin pientä määrää antigeenimateriaalia.

Keksintöä kuvataan seuraavassa lähemmin viittaamalla seuraaviin ei-rajoittaviin toteuttamisesimerkkeihin.

Esimerkki 1

Ns. objektilasin muodossa oleva lasipinta 76 x 26 mm pestään bikro-maattirikkihapolla, huuhdotaan hyvin vedellä sekä kuivapuhalletaan paineilmalla. Noin 5 min tai pidemmän ajan on pinta kosketuksessa sellaisen dektraanin 1 #:sen liuoksen kanssa, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 2 x 10^ ("Dextran 2000", valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa (nimitetään alempana nimellä PBS ja sisältää 0,12-m NaCl, 0,03-m fosfaattia, pH 7j4), jonka jälkeen se huuhdotaan hyvin tislatulla vedellä ja kuivapuhalletaan paineilmalla. Lasi käsiteltiin samalla tavoin tämän jälkeen 1 JS:sella liuoksella koejärjestelmässä inertis-tä proteiinia, esim. siitä lajista peräisin olevaa seerumialbumiinia, josta näyte oli peräisin. Näyte lisätään 3-10 mikrolitran tippoina riveissä, joissa kussakin on aina 8 tippaa, automaattipipetin avulla. Näytteen laimennus oleellisesti yli 1/100 tapahtuu vasta-ainevapaalla seerumilla, joka on peräisin samasta lajista, joka on laimennettu suhteessa 1/100 tai seerumialbumiinin 0,1 %:sessa liuoksessa. 5~10 minuutin jälkeen huuhdotaan tipat pois sellaisella PBS:llä, joka sisältää 0,1 %:sen seerumialbumiiniliuoksen. 5“10 minuutin kuluttua huuhdotaan tipat pois PBS:llä, joka sisältää 0,1 $:sen Tween^ 20 (polyoksietyleenisorbitaanimonolauraatti, valmistaa Atlas Chemie G.m.b.H.) (käytetään seuraavassa lyhennystä T-PBS), jonka jälkeen lasi pannaan vaaka-asentoon ja peitetään 1/2 %:sella suspensiolla formaliinilla käsiteltyjä lämmössä tapettuja proteiini A-pitoisia stafylokokkeja (S. Jonsson, G. Kronvall, Europ, J. Immunol. 4_, s.

29, 1974) T-PBS:ässä. 5-10 minuutin kuluttua saa lasi valua ja se huuhdotaan T-PBS:ällä niin, että stafylokoklcireagenssiylimäärä poistetaan lasipinnalta. Lasi upotetaan tämän jälkeen sellaisiin kyvet-teihin, jotka sisältävät T-PBS:ää. Tulos voidaan joko lukea tällai- 8 58404 silta märiltä laseilta tai jatketun huuhtomisen jälkeen tislatulla vedellä, jolloin mahdollisesti on lisätty Tweeri^ 20 kuivaamisen jälkeen imupaperin ja ilman avulla. Lukeminen tapahtuu parhaiten vinosti lankeavassa valossa tummaa taustaa vasten. Positiivisen reaktion muodostaa keltaisen valkoinen stafylokokkiläiskä alueella, jossa näy-tetippa on sijainnut, ja negatiivisen reaktion tapahtumatta jäänyt stafylokokkien adsorboituminen pinnalle. Tällä menetelmällä saatiin käytettäessä sellaista kaniinin anti-dekstraaniseerumia, joka sisälsi 1,3 mg spesifistä vasta-ainetta ml kohden, positiivinen reaktio jopa 1/10 000 suuruisen laimentamisen jälkeen. Suurin osa ihmis- ja kaniinin seerumeista voidaan lisätä laimentamattomina ja aiheuttavat negatiivisen reaktion.

Seeruminäytteillä, joista voitiin osoittaaa ainoastaan erittäin herkän radioimmunologisen tekniikan avulla vasta-aineita dekstraanin kanssa, saadaan varsinaisessa kokeessa positiivisia reaktioita silloinkin, kun näytteen laimentaminen on 25-125-kertainen.

Samalla tavoin on kaniinissa vast, ihmisissä olevia IgG-vasta-ainei-ta osoitettu käyttäen muunlaisen kemiallisen rakenteen omaavia antigeenejä, johon ovat sisältyneet hapteenit ja kompleksiset, osasten muodossa olevat antigeenit. Esimerkkejä tällaisista antigeeneistä (vasta-aine-kombinaatiot), joita on tutkittu hyvin tuloksin, ovat naudan seerumialbumiini, muna-albumiini, kentamysiini (antibiootti esim. hapteenilla), edeltävän kovalenssi-sitomisen jälkeen syaani-bromidilla aktivoituun dekstraaniin 2000, "Hepatitis B"-antigeeni (HBAg, nimitettiin aikaisemmin nimellä Australia-antigeeni, Au-ag), Salmonella-bakteerit, Chlamydiabakteerit kaikissa tapauksissa soveltuvat hyvin aikaisemmin käytettyjen monimutkaisempien tai huomattavasti enemmän aikaa vaativien menetelmien kanssa.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistetaan käyttäen näytteitä, jotka muodostavat seokset, joissa on määrätty tilavuus sellaisia liuoksia, jotka sisältävät dekstraania punnituissa määrissä, ja määrätyn ti-lavuusmäärän dekstraanin vasta-aineiden laimennusta, joka seos on saanut reagoida huoneen lämpötilassa 5-10 min. Käytetty antidekstraa-nilaimennus 1/2000 sekoittamisen jälkeen antigeeniä sisältävän liuoksen kanssa on valittu niin, että se silloin, kun antigeeniä ei ole näytteessä, aiheuttaa pinnalle selvän stafylokokkipäällysteen sisältämättä voimakasta vasta-aineylimäärää. Näissä olosuhteissa jo pieni 9 58404 minimaalinen antigeenimäärä estää reaktion avulla esiintyvän pienen vasta-ainemäärän kanssa viimemainitun sitoutumisen pinnalla olevaan antigeeniin, jolloin täten jää jäljelle stafylokokkipäällyste osoituksena antigeenin esiintymisestä. Kokeiltaessa liuoksia, jotka sisältävät punnittuja väkevyyksiä dekstraania sekoitettuina yhtä suurten tilavuusmäärien kanssa edellä mainittuja anti-dekstraaniantiseerumi-laimennuksia, aikaansaatiin täydellisen stafylokokkien adsorption estyminen käytettäessä sellaista antidekstraaniliuosta, jonka väkevyys oli 0,1/Ug/ml, ja positiivinen stafylokokkiadsorptio käytettäessä dekstraaniliuosta, jonka väkevyys oli 0,01/Ug/ml. Täten on osoitettu, että tämän tekniikan herkkyys on tasolla, joka saavutetaan radioimmu-lologisten kokeiden avulla.

Esimerkki 3

Lasilevy 20 x 20 cm, joka on pesty bikromaattirikkihapolla esimerkin 1 mukaisesti, käsitellään 1 %:sella nautaseerumialbumiiniliuoksella PBS:ssä antamalla noin 1 ml:n liuosta levitä kahden yhtä suuren lasilevyn välillä, jotka työnnetään päällekkäin siten, että noin 3 cm:n reunus jätetään antigeenivapaaksi. Huuhtominen ja kuivapuhallus suoritetaan esimerkin 1 mukaisesti pitäen kuitenkin huolta siitä, että neste ja ilma puhalletaan suunnassa poispäin antigeenivapaasta reunuksesta. Koko levylle levitetään ohut kerros geeliä Sephade^ G-75 Superfine (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi). Levy sovitetaan sitten laitteeseen, jolla voidaan suorittaa ns. ohutkerrosgeeli-kromatografia, ja saatetaan kosketukseen ylemmän ja alemman astian kanssa, jotka sisältävät PBS:ää suodatinpaperin välityksellä, joiden astioiden välillä neste tulee virtaamaan imulappoperiaatteen mukaisesti. Näyte lisätään 5-10/Ul:n muodossa seerumitippoja tai tämän laimennusta ylöspäin suunnatulle antigeenivapaalle reunukselle. Korkeusero nestekylpyjen välillä säädetään siten, että näyte siirtyy levyn ylitse noin 3 tunnissa. Tämän jälkeen geeli huuhdotaan pois PBS:n avulla, levy huuhdotaan edelleen T-PBS:llä, sitä käsitellään tämän jälkeen noin 5 min tavanomaisella kaniinin seerumilla, joka on laimennettu suhteeseen 1/100, huuhdotaan jälleen T-PB5:llä ja käsitellään lopuksi stafylokokkireagenssilla ja huuhtomisnesteellä esimerkin 1 mukaisesti. Tulos ilmenee parhaiten vinosti läpilankea-vassa valossa tummaa taustaa vasten kolmion muotoisina pintoina pohjan ollessa antigeenipinnan ja raja-alueen rajalinjalla, ja huipun nesteen virtaussuunnassa. Pinta on suoraan verrannollinen näytteessä olevaan vasta-ainemäärään.

ίο 5 8404

Analogisesti edellä esitetylle menetelmälle on nesteen kuljetuksen tukemiseksi kokeiltu kehrättyjen ja kehräämättömien kuitujen (ns. non-woven) säikeitä, jolloin aikaansaadaan kaksi etua: osaksi vältetään näytteen sivuttainen diffuusio siirtämisen aikana, osittain jää pois tarve käsitellä levyä esim. normaalilla kaniinin seerumilla, joka on laimennettu suhteessa 1/100 ennen stafylokokkireagenssia.

On myös mahdollista aikaansaada useita rinnakkaisia nestevirtauksia ilman minkäänlaista lasilevyllä olevan kiinteän faasin tukea, jos levy on ensin kosteutettu yhdensuuntaisia linjoja pitkin esim. kostutetuilla säikeillä sekä virtaus järjestetään joukon kautta säikeitä muutamia asteita vinoon sovitetulle levylle sellaisesta astiasta, joka on sovitettu siten, että sen nestepinta on noin 1 cm:n lasilevyn yläreunan yläpuolella. Nesteen poisvirtaus järjestetään sellaisten säikeiden kautta, jotka ulottuvat kylvyn sisään juuri levyn alareunan alapuolella. Viimemainitun menetelmän avulla aikaansaadaan sen pinnan terävämpi määrittely, jonka stafylokokkireagenssi rajoittaa.

Esimerkki M

Esimerkin 1 mukaisesti lisättiin kaniini-anti-dekstraani-vasta-ai-neita lasilevylle adsorboituun antigeeniin. Vasta-aineet, jotka olivat spesifisesti sitoutuneet antigeeniin, osoitettiin saattamalla lasilevy sitten kosketuksiin sellaisten reagenssiosien suspension kanssa, jotka saatiin käsittelemällä polymetyylimetakrylaattiosasia, joiden keskimääräinen suuruus oli 1 ^um, marsu-antikaniini-immuno-globuliini-antiseerumilla, joka oli laimennettu suhteessa 1/25, tai tällaisen seerumin immunoglobuliinifraktioilla. Osaset pestiin fosfaatin avulla puskuroidulla fysiologisella ruokasuolaliuoksella ja säädettiin 0,5-1 %:n suspensioksi ennen käyttöä. Tämän reagenssin ja lasipinnan kosketuksen aikana johdettiin suspensio varovasti edestakaisin lasipinnalla, jolloin nopeutetaan reagenssiosasten spesifistä kiinnittymistä niihin vasta-aineisiin, jotka on sidottu lasilevylle adsorboituun antigeeniin. Saadut tulokset osoittautuivat täysin samanarvoisiksi kuin ne, jotka saatiin käytettäessä esimerkin 1 mukaista stafylokokkireagenssia.

Claims (10)

1. 58404
2. 1. Menetelmä vasta-aineiden (1) esiintymisen visuaaliseksi osoittamiseksi vesipitoisessa näytteessä, jotka vasta-aineet ovat spesifisesti suunnatut antigeeniä vastaan, jolloin näyte saatetaan kosketuksiin tasaisen, edullisesti tasomaisen tai putkimaisen pinnan kanssa, joka on päällystetty mainitulla antigeenillä vasta-aineiden sitomiseksi pinnalla olevan antigeenin kanssa, jonka jälkeen täten sidotut pinnalla olevat vasta-aineet (I) osoitetaan, tunnet- t u siitä, että vasta-aineiden silmämääräiseksi toteamiseksi pinta saatetaan kosketuksiin pienten, veteen liukenemattomien osasten suspension kanssa, joihin osasiin biopolymeeri on suoraan sidottu, joka biopolymeeri kykenee spesifisesti sitoutumaan vasta-aineisiin (I) jossain ei-antigeenejä sitovassa rakenteessa, edullisesti niiden Pc-osaan, jolloin nämä osaset kerääntyvät pinnan siihen osaan, johon vasta-aineet ovat spesifisesti sitoutuneet, jolloin muodostuu paljaalla silmällä selvästi todettavissa oleva osaspäällyste.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osaset muodostaa bakteerikappaleet tai muut mikrobit tai näiden osaset, joiden ulkokerros sisältää mainittuja biopolymeerejä tai joihin mainitut biopolymeerit on sidottu adsorboivien voimien tai kovalenssisidosten avulla.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osaset muodostaa pienet keinotekoisesti valmistetut synteettisen tai biologisen materiaalin osaset, joiden ulkokerros sisältää mainitut biopolymeerit tai joihin nämä biopolymeerit on sidottu adsorboivien voimien tai kovalenssisidosten avulla.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä IgG-luokkaan kuuluvien vasta-aineiden osoittamiseksi, tunnettu siitä, että osaset muodostaa proteiini-A-kantaja, edullisesti tapetut stafylokokit.
6. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenisidottuja vasta-aineita (I) sisältävä pinta saatetaan kosketuksiin sellaisten bakteerikappaleiden pinnan kanssa, joiden pintoihin mainittujen vasta-aineiden (I) vasta-aineita (II) on suoraan sidottu. 58404
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pinta, jolla on antigeeniin sidottuja vasta-aineita (I), saatetaan kosketuksiin sellaisten vasta-aineiden (II) kanssa, jotka on suunnattu mainittuja vasta-aineita (I) vastaan ja joiden Fc-osat spesifisesti sitoutuvat proteiiniin A, ja että tämän jälkeen lisätään proteiini-A-pitoisten stafylokokkien suspensio mainitun kaksinkertaisella vasta-ainekerroksella peitetyn pinnan toteamiseksi silmämääräisesti.
8. 7. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että näyte saatetaan kulkemaan määrätyssä suunnassa vyöhykkeesä, edullisesti kapeassa vyöhykkeessä, antigeeneillä päällystetyn pinnan ylitse.
9. 8. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenillä peitetyn pinnan päälle sovitetaan yksi tai useampi ohut kerros nestettä kuljettavaa väliainetta, jonka tai joiden kerrosten lävitse näyte saatetaan kulkemaan, sekä että mainittu kerros poistetaan ennen vasta-aineilla päällystetyn pinnan silmämääräistä tarkastelua.
10. 9. Patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mahdollisesti antigeeniä sisältävä näyte sekoitetaan tunnetun määrän kanssa tämän antigeenin vasta-ainetta, jonka jälkeen se mahdollinen vasta-aineylimäärä, joka ei ole estynyt näytteessä olevan antigeenin johdosta, osoitetaan näytteessä olevan antigeenimäärän epäsuorana mittapuuna.