FI92883B - Testimenetelmä ja reagenssikitti sitä varten - Google Patents

Description

92S83

Testimenetelmä ja reagenssikitti sitä varten Tämä keksintö koskee menetelmää analyytin kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi määrittämiseksi vesi-5 liuoksessa.

Analyyttien toteaminen tai määrittäminen immuno-koemenetelmiä käyttäen tunnetaan hyvin, varsinkin proteiineihin, kuten antigeeneihin ja vasta-aineisiin, samoin kuin sokereihin, lektiineihin ja nukleiinihappoihin liit-10 tyvät. Kuitenkin monet nykyiset menetelmät, vaikka ovatkin hyvin herkkiä, ovat usein hyvin työläitä vaatiessaan lukuisia vaiheita, jotka kaikki voivat kestää kauan. On kuitenkin osoittautunut mahdolliseksi yksinkertaistaa joitain näistä koejärjestelmistä immobilisoimalla joku koejärjes-15 telmän komponenteista kiinteälle kantajalle, koska se hel pottaa reagenssiylimäärien poistoa. Näihin kokeisiin liittyy tavallisesti merkittyjen makromolekyylien käyttö, joka voi olla itse analyytti tai sidoskumppani analyytille ja jolla on sopiva merkki, kuten esimerkiksi radioisotooppi, 20 fluorofori tai entsyymi, joka tuottaa karakteristisen reaktion.

Eräs yksinkertaistus, jota on ehdotettu, on käyttää värillistä ainetta kiinnittyneenä johonkin immunokoe-reagenssiin näkyvänä merkkinä. Kuitenkin erittäin harvat 25 värilliset aineet pystyvät antamaan riittävän voimakkaan merkin. US-patentissa 4 313 734, Akzona Inc., esitetään muun muassa kolloidisen kullan käyttö sellaisenaan värillisenä aineena tähdentäen, että kultapartikkelien tulisi olla partikkelikooltaan vähintään 5 nanometriä, edullises-30 ti 10 - 100 nm.

• Akzona-patentin keksijät ovat sittemmin julkais seet useita artikkeleita, joissa korostetaan, että suurimmat partikkelit ovat edullisia. Niinpä Leuvering et ai.

(J. Immunoassay 1, 77 - 91, 1980) esittävät 60 nm kolloi-35 disen kullan käyttöä; tämä julkaisu liittyy läheisesti pa- 2 92883 tentin mukaiseen keksintöön ja siinä esitetään, että vain korkeammilla antigeenipitoisuuksilla muodostuva väri voidaan nähdä paljaalla silmällä. Tämä on sen menetelmän mukaista, jossa kulta on uutettu liuokseen.

5 Samat keksijät (Leuvering et ai., J. Immunol.

Meth. 45, 183 - 194, 1981, ja 62, 175 - 184, 1983) ovat esittäneet, kuinka vasta-aineet ja antigeenit voivat liittää yhteen metallisooleja liuoksessa saaden siten aikaan muutoksia absorptiomaksimissa ja ekstinktiokertoimissa. 10 Kooltaan 40 - 80 nm:n kultakolloideja testattiin, ja 50 nm todettiin optimaalisiksi.

Nämä keksijät ovat esittäneet myös (J. Immunol. Meth. 62, 175 - 184, 1983) sandwich-kokeen, jossa on kultakolloideja. Kooltaan 25 - 70 nm:n kultakolloideja tes-15 tattiin ja, 55 nm todettiin optimaalisiksi. Tämä koe perustuu tavalliseen levytyyppiseen immunokokeeseen, ja se on samanlainen kuin on esitetty US-patentin 4 313 734 esimerkeissä.

Gribnau et ai. ovat julkaisussaan (J. Chromato-20 graphy, 376, 175 - 189, 1986) käsitelleet kaikki pieniä partikkeleita käyttävät menetelmät immunokokeissa. Kolloidista kultaa käsittelevässä osassa esitetään useita menetelmiä, mutta vain halkaisijaltaan 50 nm:n kulta mainitaan.

25 EP-hakemus 0 158 746A, Janssen Pharmaceutica N.V, koskee blotting overlay -menetelmiä, joita voidaan käyttää aineiden toteamiseen kompleksiseoksissa. Tässä patentissa esitetään muun muassa kolloidisen kullan käyttö komplek-soituneena komponentteihin, jotka reagoivat vastaavien 30 sitovien komponenttien kanssa kiinteällä kantajalla. Pa-. tentissä painotetaan kuitenkin blotting overlay -kokeen spesifistä luonnetta verrattuna analyyttikokeisiin vesiliuoksissa. Vaikka siinä viitataankin kooltaan 3 - 100 nm:n kulta- tai hopeapartikkeleihin, 5-50 nm:n partikkelikoot 35 on esitetty edullisiksi ja esimerkeissä käytetään vain 20 li 3 92883 nm partikkeleita. Ei ole mitään esitystä edusta, joka saadaan käyttäen kultapartikkeleita, joista 75 % on halkaisijaltaan alle 5 nm tai tällaisten partikkeleiden todellista käyttöä.

5 Surek ja Latzko (Biochem. Biophys. Res. Comm. 121, 284 - 289, 1984) esittävät 5 nm:n ja 15 nm:n kolloidisen kullan käyttöä tietyissä blottausmenetelmissä elektrofo-reesigeeleistä. Vaikka he totesivatkin, että 5 nro kulta-partikkelit antoivat terävämmin värjäävän elektroforeetti-10 sen nauhan proteiineille kuin 15 nm kultapartikkelit, he eivät esittäneet voimakkaampaa kokonaisvärjäytyrnistä eivätkä nopeampaa reaktiota, minkä me olemme havainneet.

Bashong et ai. (Histochemistry, 1985, 83(s) 409-II) esittävät kolloidisen kultareagenssin käyttöä kudos-15 värjäyselektonimikroskopiassa kultapartikkeleiden partikkelikoon ollessa tasaisesti 2,6 nm. Elektronimikroskopia perustuu kuitenkin kultapartikkelien elektroninsirontaomi-naisuuksiin, eivätkä pienten partikkelien edut siinä yhteydessä liity voimakkaan värin kehittymiseen, joka voi-20 daan todeta visuaalisesti tai yksinkertaista spektrometriä käyttäen.

On esitetty, että suuremmilla kultapartikkeleilla, jotka on päällystetty immunoreagenssilla, olisi se etu, että ne sitovat melko suuria määriä merkkiä analyyttiin 25 tai muuhun reagenssiin. Kokeemme ovat kuitenkin osoittaneet, että käytettäessä keskihalkaisijaltaan alle 5 nm:n kultapartikkeleita kiinteän faasin koesysteemeissä reaktionopeus immunokokeissa nousee tietyissä tapauksissa ja immobilisoidun kultasoolin värin voimakkuus on yllättäen 30 suurempi kuin suurempia kultapartikkeleita käytettäessä, j· Esillä oleva keksintö koskee menetelmää analyytin kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi testinäytteestä, jossa menetelmässä reagenssi, joka käsittää kultasoolin sidottuna aineeseen, joka pystyy spesifi-35 sesti sitoutumaan kyseiseen analyyttiin tai sen spesifi- 92883 4 seen sidoskumppaniin, immobilisoidaan sidotussa muodossa kiinteään faasiin, jolloin se osoittaa analyytin läsnäolon tai määrän näytteessä toteamalla immobilisoidun kultasoo-lin läsnäolon tai väri-intensiteetin, jolloin menetemälle 5 on tunnusomaista, että vähintään 75 pai-no-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijaltaan alle 5 nano-metriä muttei alle 3 nanometriä.

Monissa kiinteän faasi koetyypeissä on eduksi kytkeä analyyttianalogi tai kyseiselle analyytille spesifinen 10 sidoskumppani kiinteään kantajaan, jolloin saadaan kiinteä faasi, jolle merkitty reagenssi immobilisoidaan. Keksinnön eräänä piirteenä on vielä menetelmä analyytin kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi nestenäyt-teessä, jossa kyseinen näyte saatetaan kosketukseen vesi-15 pitoisessa koeliuoksessa (i) analyyttianalogin tai kyseiselle analyytille spesifisen sidoskumppanin kanssa, joka on immobilisoitu kiinteälle kantajalle, ja (ii) merkityn reagenssin kanssa, joka käsittää kultasoolin liittyneenä molekyyliin, joka pystyy spesifisesti sitomaan kyseisen 20 analyytin tai sille spesifisen sidoskumppanin, jolloin tietty määrä kultasoolireagenssia immobilisoidaan kantajalle, jonka värin tutkimista tai määritystä käytetään osoittamaan analyytin läsnäolo tai määrä näytteessä, vähintään 75 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista ollessa 25 keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nano metriä .

Kiinteä faasi, jolle merkitty reagenssi on immobilisoitu, voi vaihtoehtoisesti olla inertti ja immobilisoi-da merkityn reagenssin sidotun muodon sieppaamalla jälkim-30 mäisen fysikaalisesti esim. estämällä merkityn reagenssin • sidotun muodon pääsy kiinteän faasin huokosten läpi mutta sallimalla samalla sitomattoman, merkityn reagenssin läpäistä nämä huokoset.

Termin "analyyttianalogi" tässä käytettynä tulisi 35 ymmärtää viittaavan mihin tahansa aineeseen, joka pystyy

II

92883 Ο spesifisesti sitoutumaan kokeen aikana analyytille spesifiseen sidoskumppaniin ja sisällyttämällä sitten piiriinsä lisää tuota analyyttiä.

Kuten edellä ositettiin, keksinnön mukaisella me-5 netelmällä on etuna kultasoolireagenssin nopeampi reaktio inunobilisoidun reagenssin kanssa, mikä näkyy lyhyempänä inkubointiaikana. Lisäksi kultasoolin värin intensiteetti on yllättäen parempi systeemeissä, joissa reagenssi suodatetaan liukenemattoman kalvokantajan läpi. Tämä voi olla 10 toinen etu, joka liittyy nopeampaan reaktioon.

Partikkelin, jonka ei tarvitse olla täysin pallomainen, keskihalkaisija on partikkelin suurimman ja pienimmän halkaisijan keskiarvo. On erityisen edullista, että vähintään 80 paino-% kultapartikkeleista on keskihalkaisi-15 jaltaan alle 5 nm. Tietyt ryhmät Janssen Life Sciences Products -tuotteesta Colloidal Gold Sol G5, jota myydään käytettäväksi histologisena väriaineena, ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi. Eräässä erityisessä ryhmässä 85 % partikkeleista oli halkaisijaltaan alle 5 nm keskimääräi-20 sen halkaisijan ollessa 4,5 nm ja Gaussin jakautuman välillä 1,1 nm ja 7,6 nm. Kultasooleja, joiden keskimääräiset halkaisijat ovat 2-4 nm, voidaan helposti valmistaa tunnettua metodologiaa hieman modifioimalla, esim. muuttamalla tanniinihappokonsentraatiota Slot ja Geuze -mene-r 25 telmässä (Eur. J. Cell. Biol. 38, 87 - 93, 1985). Olemme todenneet, että keskihalkaisijaltaan 4 - 4,5 nm:n partikkelit ovat edullisia, koska pienemmät partikkelit (siis 3 nm pienemmät partikkelit) eivät laskeudu yhtä hyvin pesu-vaiheiden aikana.

.. 30 Tuloksemme osoittavat, että kultasoolipartikkelei- » • den, joiden keskihalkaisija on alle 5 nm, ja vasta-ainei den, joihin ne voivat sitoutua, välillä on noin l:l-stö-kiometria. Tämä stökiometrinen suhde kasvaa yli yhteen kultapartikkeliin vasta-ainetta kohti, kun partikkeleiden 35 keskihalkaisi ja on alle noin 3 nm. Tämä noin l:l-suhde voi 92883 6 osaksi selittää pienten partikkelien edullisemman reaktio-kinetiikan verrattuna tekniikan tason mukaisiin partikkeleihin, joissa on paljon vasta-ainetta kultapartikkelia kohden. Vaikka voidaankin saavuttaa korkea vasta-aine:kul-5 tapartikkeli-suhde partikkelikoolla, jota Leuvering et ai. (laajemmin edellä) ovat ehdottaneet, yhden vasta-aineen sitominen antigeeniin voi vaikuttaa liiaksi muiden vasta-aineiden saatavuuteen tuossa partikkelissa sitomaan muita antigeenimolekyylejä.

10 Esillä olevaa menetelmää voidaan soveltaa mihin tahansa kiinteään faasisysteemiin analyyttien toteamiseksi tai määrittämiseksi. Seuraavantyyppiset kokeet ovat tyypillisiä: 1. Sandwich-koe, jossa komponentti A on sidottu 15 kiinteään kantajaan. Lisätään testiliuos, jossa on ana- lyyttiä B, jolloin B sitoutuu A:han. Kultamerkitty komponentti C lisätään, ja koska C sitoutuu B:hen, kolloidinen kulta immobilisoituu ja värjää kiinteän kantajan.

Komponentit A, B ja C ovat kaikki reseptori-ligan- 20 di-tyyppisiä, joissa sekä A että c vaikuttavat B:hen kun taas A ja C eivät suoraan sitoudu toisiinsa.

2. Sandwich-koe kuten esimerkissä 1 paitsi, että testiliuos, jossa on analyytti B, ja kultamerkitty komponentti C sekoitetaan, ja seos lisätään kiinteään kanta- • 25 jaan, johon komponentti A on sidottu.

3. Kilpaileva koe, jossa komponentti A on sidottu kiinteään kantajaan. Testiliuos, jossa on analyytti B, sekoitetaan tunnetun määrän kanssa kultamerkittyä analyytti B:tä ja lisätään kiinteään kantajaan. B ja kultamerkit- 30 ty B kilpailevat A:n sitomisessa, ja kolloidisen kullan värin heikentyminen kiinteällä kantajalla osoittaa suurempaa määrää analyytti B:tä testiliuoksessa.

4. Kilpaileva koe kuten esimerkissä 3, mutta testiliuos ja kultamerkitty B lisätään perättäin.

35 5. Ylimäärä komponentti A:ta merkitään kolloidi-

II

7 92883 kullalla ja sekoitetaan testiliuokseen, joka sisältää tuntemattoman määrän B:tä. A ja B kytkeytyvät sitten. Seos lisätään huokoiselle kantajalle, jolle B immobilisoidaan. Jäljelle jäänyt sitoutumaton A kytkeytyy immobilisoituun 5 B:hen kiinteällä kantajalla.

6. Analyytti B:n annetaan reagoida kultamerkityn komponentti C:n kanssa mahdollisesti yhdessä yhden tai useamman muun analyytti B:n sidoskumppanin kanssa komplek-siaggregaatin muodostamiseksi. Reaktioseos saatetaan dif-10 fundoitumaan inertin suodatusväliaineen läpi, jonka huoko set ovat liian pieniä päästääkseen kompleksiaggregaatin lävitseen mutta tarpeeksi isoja salliakseen kultamerkityn komponentti C -ylimäärän kulkemaan läpi.

Kiinteä faasi tai kantaja, jolle merkitty reagens-15 si on saatu immobilisoitumaan, voi esiintyä lukuisissa eri muodoissa, joista seuraavat ovat havainnollistavia: - Muovitikku, peitetty mahdollisesti pehmusteella jostain huokoisesta aineesta. Tikku voidaan kastaa reak-tioliuoksiin, jotta kokeen eri vaiheet voidaan suorittaa; 20 - Koeputken seinämä, syvennys mikrotitrauslevyssä tai jonkin muun sopivan reaktioastian seinämä; - Huokoinen aine, suotavimmin kalvo, jossa reaktio-liuokset voivat diffundoitua poikittain läpi tai sivuttain. Tapauksessa, jossa käytetään suodatusperiaatetta, : 25 tällaiset materiaalit sallivat edullisesti ylimäärärea-genssien läpimenon, ja ne voidaan helposti yhdistää adsor-benttiin näitä nesteylimääriä varten; - Helmet (mukaan luettuna mikropalloset), jotka voidaan eristää sentrifugoimalla, suodatuksella tai mikäli 30 helmet sisältävät ferromagneettisia yhdisteitä, magnetis-. .. millä.

Analyyttianalogin tai analyytille spesifisen sidoskumppanin kytkeytyminen kokeessa voi tapahtua kovalent-tisin, elektrostaattisin tai hydrofiilisin keinoin tai 35 näiden tapojen yhdistelmällä. Nämä tavat ovat alalla hyvin vakiintuneita.

« δ 92883

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää lukuisten analyyttien toteamiseen tai määritykseen, jotka voivat olla esimerkiksi joitakin seuraavista ligandi-re-septori-pareista: antigeeni/vasta-aine, hapteeni/vasta- 5 aine, hormoni/hormonireseptori, sokeri/lektiini, biotii-ni/avidiini-(streptavidiini), proteiini A/immunoglobulii-ni, entsyymi/entsyymikofaktori, entsyymi/entsyymi-inhi-biittori ja nukleiinihappoparit (DNA-DNA, DNA-RNA tai RNA-DNA) . Ainakin yksi näistä reaktiokumppaneista voi olla 10 sidottu tai kompleksoitu muiden molekyylien kanssa. Siten biotiini tai avidiini tai monet vasta-aineet voidaan kytkeä muihin roolekyyleihin testauskeinon saamiseksi jälkimmäisille. Esimerkiksi spesifinen nukleiinihappokoetin voidaan merkitä biotinyloitujen nukleosiditrifosfaattien li-15 säyksen kautta. Tämä koetin, sen jälkeen kun analyytti DNA tai RNA on sidottu, voidaan todeta tai määrittää käyttämällä avidiinia tai streptavidiinia, joka on merkitty kul-tasoolilla.

Yleisesti jos analyytti on jokin edellä luetel-20 luista, on keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä sidoskumppani parin toinen komponentti. Sandwich-systee-meissä, joissa analyytti sitoutuu sekä immobilisoituun si-doskumppaniin että kultasoolilla merkittyyn sidoskumppa-niin, sidoskumppanit voivat olla samoja tai erilaisia.

• 25 Edullisesti sidoskumppanit voivat kukin olla vasta-aine- reagensseja, jotka on tarkoitettu erilaisille, hyvin si-joitetuilie analyyttimäärittäji1le.

Tulee ymmärtää, että termi "vasta-aine" tässä käytettynä pitää sisällään 30 (a) kaikki tavanomaisesti käytetyistä eläimistä saadut immunoglobiinin, esim. IgG, IgM, ryhmät tai alaryhmät; (b) monokloonaaliset vasta-aineet; sekä (c) vasta-ainefragmentit, monokloonaaliset tai po-35 lykloonaaliset, jotka sisältävät antigeeninsidospaikan,

II

9 92883 esim. Fc-osuutta vailla olevat fragmentit (esim. Fab, Fab', F(ab')2) tai niin sanotut puolimolekyylifragmentit, jotka on saatu pelkistäen katkomalla disulfidisidokset, jotka yhdistävät raskasketjuiset komponentit ehjässä vas-5 ta-aineessa.

Alla on ei-tyhjentävä luettelo immunogeenityypeis-tä, jotka voidaan todeta tai määrittää kvantitatiivisesti keksinnön mukaisella menetelmällä, proteiinit glykoproteiinit 10 nukleoproteiinit peptidihormonit seerumiproteiinit komplementtiproteiinit hyytymistekijät mikrobiosidiset tuotteet virustuotteet bakteerituotteet sienituotteet spesifiset immunogeenit 15 albumiini angiotensiini bradykiniini kalsitoniini kars inoembryoninen antigeeni kloriomamotropiini korogonadotropiini kortiokotropiini

20 erytropoietiini tekijä VIII

fibrinogiini alfa-2-H-globuliini follitropiini gastriini gastriinisulfaatti glukagoni gonadotropiini haptoglobuliini 25 hepatiitti B -pinta- immunoglobuliinit antigeeni (A,D,E,G,M) insuliini lipotropiini kallidiini melanotropiini oksitosiini 30 pankreotsymiini plasentaalinen laktogeeni „ . pratryiini proangiotensiini relaksiini sekretiini somatomadiini somatostatiini tryrotropiini vasotosiini 35 tymopoietiini vasopressiini alfa-l-fetoproteiini alfa-2-H-globuliini 10 92883

Erityisen kiinnostavia analyyttejä tutkittavaksi keksinnön mukaisella menetelmällä ovat veren valkuaisaineiden, kuten fibriinin hajoamistuotteet esim. D2, joka on sidottu immunoglobuliinilla kuten IgGrllä, sekä ihmisen 5 c-reaktiivinen valkuaisaine.

Analyyttiliuosta voidaan käyttää suoraan tai se voidaan laimentaa esim. sopivalla puskuriliuoksella. Kul-tasoolivalmiste voidaan myös valmistaa eri laimennuksilla käyttämällä sopivaa puskuriliuosta laimennusten ollessa 10 valitut antamaan halutun intensiteetin omaava väri (esim.

optinen tiheys tai heijastus) koemenetelmän lopussa. Saattaa olla toivottavaa pestä kantaja ylimääräreagenssin poistamiseksi esim. puskuriliuoksella ennen koetta taustavärin heikentämiseksi.

15 Kun koe perustuu immobilisoidulle kantajalle jää neen kultasoolin kokonaismäärään, väri voidaan arvioida reflektometrin, densitometrin tai muun vastaavan laitteen avulla.

Kantaja, jota käytetään immobilisoimaan toinen 20 kokeen sidoskumppaneista tai analyyttianalogi, voi esimerkiksi olla nitroselluloosa, paperi tai selluloosa-asetaat-ti, joka on aktivoitu reagenssilla, kuten syanogeenibromi-dilla, sekä nylon, joka on modifioitu tuomalla tertiääri-siä aminoryhmiä. Näitä kantajia käytetään mukavasti huo-• 25 koisten kalvojen muodossa.

Eräässä erityisen edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä inertti kantaja on kalvo, esim. nylonkalvo kuten Hybond N (myy Amersham International), joka adsorboi proteiineja helposti ja jossa on nesteen lävitseen päästä-30 viä reikiä. Absorbenttitäyte, kuten selluloosaimupaperi, sijoitetaan edullisesti kalvon toiselle puolelle, ja nestettä läpäisemätön kalvo, edullisesti valkoinen, sijoitetaan täytteen päälle. Samanlainen nestettä läpäisemätön kalvo sijoitetaan kalvon toiselle puolelle tämän kalvon 35 ollessa varustettu reiällä, esim. noin 3,5 mm leveällä, li 11 92883 jotta analyyttiliuos ja koenesteet pääsevät levittyinään kalvoon. Aluksi kalvo aktivoidaan levittämällä pieni määrä, esim. noin 2 μΐ vesiliuosta, joka sisältää tunnetun määrän analyytin sidoskumppania, mitä seuraa kuivaus, 5 esim. jättäminen kuivumaan huoneen lämpötilaan. Tunnettu tilavuus analyytin sisältävää vesiliuosta, esim. noin 25 μΐ, levitetään sitten kalvolle ja annetaan mennä läpi alapuoliseen absorptiiviseen täytteeseen. Sitten lisätään vesiliuos, esim. 25 μΐ, joka sisältää tunnetun määrän kol-10 loidisia kultasoolipartikkeleita, jotka on merkitty analyytin sidoskumppanilla, joka voi olla sama tai erilainen kuin kalvolle alussa levitetty, ja annetaan mennä kalvon läpi.

Pieni määrä vettä tai puskuria voidaan mahdolli-15 sesti lisätä huuhtomaan kultasoolireagenssi ja minimoimaan siten taustaväriä. Kalvolle immobilisoidun kultasoolin määrä määritetään sitten reflektometrillä tai paljaalla silmällä vertaamalla väriskaalan kanssa.

Edellä esitetyssä toimintamenetelmässä (6) kalvo 20 voi olla huokoisuudeltaan haluttu kalvomateriaali, joka voi olla inertti, jos sen ainoa tehtävä on toimia suodattajana. Analyytin aggregoitumista komponentin C kanssa voidaan parantaa kahdella tai useammalla erilaisella analyytin sidoskumppanilla, mikä vaikuttaa ristisitoutumisen : 25 muotoon, jolloin saadaan suurempia aggregaatteja. Vaihtoehtoisesti komponentti C voi käsittää analyytin sidoskump-panin, joka on immobilisoitu helmille, esimerkiksi mono-dispersiohelmille, kuten Dynosphereille (Dyno Particles AS, Oslo, Norja).

30 Keksintöön kuuluvat myös testipakkaukset analyytin , kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi näytteessä, joka testipakkaus käsittää (a) kiinteän faasin, jolle merkitty reagenssi im-mobilisoidaan analyytin läsnäolon tai määrän osoittamisek-35 si näytteessä ja ,, 92683 12 (b) merkityn reagenssin, jolloin testipakkaukselle on tunnusomaista, että merkitty reagenssi käsittää kultasoolin sidottuna aineeseen, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan mainittuun analyyttiin tai 5 sen spesifiseen sidoskumppaniin, jolloin vähintään 75 pai-no-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijal-taan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä.tähän jatko vaa. 7: Edullinen testipakkaus käsittää (a) kiinteän kantajan, joka immobilisoi analyyttianalogin tai analyy-10 tille spesifisen sidoskumppanin tai analyytin kompleksin yhden tai useamman reagenssin kanssa, (b) mainitun ana-lyyttianalogin tai sidoskumppanin ja (c) reagenssin, joka käsittää kultasoolin sidottuna molekyyliin, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan molekyyliin tai spesifisesti si-15 toutumaan sen sidoskumppaniin, vähintään 75 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista ollessa keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä. Testipakkaukseen sisältyvä kiinteä faasi voi mahdollisesti olla valmis kiinteä kantaja, jonka käyttäjä voi saattaa kosketukseen 20 kantajan kanssa kytkemällä analyyttianalogi tai analyytil-le spesifinen sidoskumppani alustavasti kantajaan. Joissain kokeissa tällainen kitti voi sisältää vakiomäärän analyyttiä, vakiomäärän sille spesifistä sidoskumppania ja kultasoolireagenssia. Vakiomäärät analyyttiä tai spesifis-- 25 tä sidoskumppania tai reagenssia voivat olla vesiliuosmuo-dossa tai tavallisemmin lyofilisoituina valmisteina, jotka on sovitettu liukenemaan käyttöhetkellä. Kokeen eräässä muodossa kiinteä kantaja voi olla inertti, huokoinen kalvo, joka toimii analyyttikompleksin ja sidoskumppanin ag-. 30 gregoidun muodon pidättäjänä mutta sallii kultasoolirea-genssin diffuusion, kuten menetelmässä 6 edellä. Tällaisessa systeemissä analyyttikompleksin kokoa voidaan kasvattaa käyttämällä sidoskumppania tai analyyttianalogia kiinnittyneenä suhteellisen suuriin partikkeleihin, esim.

35 Dynosphereihin, kuten edellä mainittiin.

13 92883

Seuraavat esimerkit on annettu ainoastaan havain-nollistamistarkoituksessa.

Esimerkki 1

Kolloidiset kultapartikkelit 5 Partikkelit, joiden keskikooksi ilmoitettiin alle 5 nm, hankittiin Janssen Pharmaceuticals -yhtiöstä. Partikkelien keskikooksi varmistettiin 4,5 nm 85 %:n partikkeleista ollessa alle 5 nm käyttäen Coulterin alimikronipa-rikkelianalysaattoria malli A4.

10 Partikkelit merkittiin hiiren monokloonaalisella

IgG:lla, joka oli spesifinen D2:lle, fibriinipolymeerien hajoamistuotteelle käyttäen Slot ja Geuze -menetelmää (Eur. J. Cell. Biol. 38:87 - 93, 1985). Partikkeliliuoksen tiheys säädettiin puskurilla; laimennuksen 1:20 tulisi 15 antaa optiseksi tiheydeksi 2,0 580 nm:ssa.

Testilaite 1 x 1 cm:n nylonkaIvopala (Amershamin Hybond N, huokoskoko 450 nm) sijoitettiin valkean polyvinyyliklori-di- (PVC) liuska alle, joka oli 0,28 mm paksu ja jossa oli 20 3,5 mm:n reikä, keskeisesti kalvon yli. Kalvo kiinnitet tiin muoviin kaksipuolisella teipillä. PVC-liuska ja siihen kiinnitetty kalvo kiinnitettiin sitten 1 mm paksuun selluloosaimupaperitäytteeseen (Schleicher & Schuell) teippialueelle, jota kalvo ei peittänyt. Laite suljettiin ' 25 alapuolelle toisella PVC-liuskalla, paksuus 0,40 mm, kiinnittäen täytteeseen kaksipuolisella teipillä. Tämä rakenne mahdollistaa nesteen kulun ylemmän PVC-nauhan läpi, kalvon läpi ja kerääntymään täytteeseen.

Kalvon aktivointi 30 Kalvo aktivoitiin lisäämällä 2 μΐ 3,6 mg/ml-liuosta toista hiiren monokloonaalista IgG:tä, joka on suunnattu D2:ta vastaan. Laitteessa olevan kalvon annettiin kuivua huoneen lämpötilassa ennen käyttöä.

Testin suoritus 35 25 μΐ plasmaa, joka mahdollisesti sisälsi D2:ta, tai « 14 92883 plasmaa, joka on rikastettu puhdistetulla D2:lla, levitettiin kalvon pinnalle testilaitteessa. Noin 1 minuutin jälkeen liuos oli kulkenut kalvon läpi ja täytteen sisään. 25 μΐ kultaliuosta lisättiin sitten kalvolle. Sen mentyä läpi 5 D2:n läsnäolo näytteessä sai aikaan kalvolla olevalle kullalle punertavan värin. Värin intensiteetti suhteutettiin visuaalisesti näytteen D2-pitoisuuteen tiettyjen pitoisuusrajojen sisään. Verrokkien taustaväriä voitiin heikentää lisäämällä 25 μΐ vettä.

10 Testitulosten instrumentaalianalyysi

Testitulokset luettiin instrumentaalisesti käyttäen reflektometriä (Color Eye, Macbeth), joka oli liitetty IBM PC:hen, ja Macbethin softwear-ohjelmaa. Tällä laitteella saadut reflektometriarvot osoittivat tietyllä välillä li-15 neaarista korrelaatiota väri-intensiteetin ja D2-pitoisuu-den välillä.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin käyttäen kultakolloideja, joiden keskikoko oli 4,7 nm, 15 nm ja 30 20 nm. Kaikki kolloidit hankittiin Janssen Pharmaceuticals-yhtiöstä. Kolloidit merkittiin vasta-aineilla kyllästymis-pisteeseen (mitattuna Slot ja Geuze -memetelmällä).

Kaikki kolloidisuspensiot laimennettiin pitoisuuteen OD525 = 0,1 2 mmol/1 natriumfosfaattipuskurilla (pH : 25 6,4) .

Testi suoritettiin kuten esimerkissä 1 kullekin partikkelikoolle. Positiiviset tulokset antoivat kiinteällä kalvolla värin, jonka intensiteetti oli suunnilleen sama 15 ja 30 nm kolloideille. Tämä intensiteetti on noin 30 puolet 4,7 nm kolloidin intensiteetistä. Mittaukset ref-• lektometrillä kuten esimerkissä 1 vahvistivat visuaaliset havaintomme.

Esimerkki 3

Esimerkin 2 mukaiset menetelmät ja koeasetelma 35 toistettiin hiiren monokloonaalisella vasta-aineella, joka 15 92883 suuntautui ihmisen c-reaktiivista proteiinia (CRP) vastaan. Koska CRP on pentameeri, käytettiin samaa vasta-ainetta (lisättiin 5 μΐ, joka sisälsi 2 μς vasta-ainetta) kalvossa samoin kuin kultakonjugaateilla. Kalvolle asetet-5 tu näyte oli ihmisen seerumi, joka sisälsi noin 40 μg CRP-/ml laimennettuna 15 kertaa tislatulla vedellä. 20 μΐ lisättiin kalvolle, mitä seurasi 20 μΐ kolloidisia kultakon-jugaatteja, jotka oli kyllästetty vasta-aineella ja laimennettu kuten esimerkissä 2. Tulokset olivat suunnilleen 10 samat kuin esimerkissä 2 osoittaen, että 4,7 nm:n kullalla muodostunut väri-intensiteetti oli ainakin 1,5-kertainen sekä 15 nm:n että 30 nm:n kultakolloidilla muodostuneeseen intensiteettiin nähden.

Esimerkki 4 15 Esimerkin 2 mukainen menetelmä ja koeasetelma tois tettiin käyttäen kultakolloideja, joiden keskimääräiset koot olivat noin 3, 4 ja 4,5 nm. Kolloidit oli valmistettu MUhlpfordtin (1982, Experientia 38, ss. 1127 - 28) menetelmällä suurentamalla tanniinihapon määrää partikkelikoon 20 pienentämiseksi. Partikkelikoot varmistettiin elektroni mikroskoopilla. Koska näin pienten partikkelien titraus vasta-ainekyllästykseen olisi ollut todennäköisesti vaikeaa, titraus suoritettiin 4,5 nm partikkeleille ja samaa vasta-ainemäärää käytettiin 3 ja 4 nm:llä. Kaikilta muilta • 25 osin menetelmä oli sama kuin esimerkissä 2. Tulokset osoittivat, että syntynyt väri oli hieman voimakkaampi 3 nm:n kuin 4 nm:n kultakolloideilla, joille se puolestaan oli sama kuin 4,5 nm:11a.

Tulee huomata, että 3 nm:n kultakolloidikonjugaat-30 tien käsittely pesuvaiheissa edellytti ultrasentrifuugin käyttöä, jotta hyvin pienet partikkelit sedimentoituisi-vat. Kaikissa muissa suhteissa näiden partikkelien ominaisuudet olivat samat kuin 4 ja 4,5 nm:n partikkeleiden.

Esimerkki 5 35 Käytettiin 15 nm:n ja 30 nm:n kolloidikulta- (hän- 16 92883 kittu Janssen Pharmaceuticals-yhtiöstä Belgiasta) ja 4,5 nm:n kultapartikkeleita, jotka on valmistettu esimerkin 4 mukaisella menetelmällä. Kolloidit konjugoitiin hiiren monokloonaaliseen IgG:hen, joka oli spesifinen D2:lle, ku-5 ten esitettiin esimerkissä 1. Kolloidikultapartikkelit laimennettiin lopuksi pitoisuuteen ODJ25 = 0,010 käyttäen 2 mmol/1 natriumfosfaattipuskuria (pH 6,4).

Noin 0,5 x 2,0 cm:n kalvot, jotka oli valmistanut Hybond C (Amersham, UK), täplitettiin 10 /xl:lla D2:ta (0,5 10 mg/ml 0,15 mol/1 NaCl:ssä) ja kuivattiin noin 30 minuuttia. Vapaat sidospaikat blokattiin sitten inkuboimalla kalvoja 2 ml:11a l-%:ista naudan seerumialbumiinia fos-faattipuskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,4) 30 minuuttia.

Seitsemän kalvoa testattiin kullakin kultakolloidi-15 koolla. Kukin edellä valmistettu kalvo sijoitettiin vastaavaan koeputkeen, johon lisättiin 2 ml yhtä laimennetuista kolloidikultakonjugaateista. Kalvot poistettiin putkista sopivan ajan päästä, huuhdeltiin fosfaattipusku-roidulla suolaliuoksella ja kuivattiin. Kultakolloidin 20 määrä mitattiin reflektometrillä kuten esimerkissä 1.

Tulokset osoittivat, että värinkehitys koeputkissa 4,5 nm:n kultapartikkeleilla oli yli kolminkertainen 15 nm:n tai 30 nm:n kultakolloidiin nähden. 15 nm ja 30 nm antoivat hyvin samanlaisen tulossarjan toisiinsa nähden.

* 25 Esimerkki 6

Esimerkki 5 toistettiin käyttäen valmista sandwich-ia. Kalvot täplitettiin monokloonaalisella hiiren IgG:-llä, joka oli D2-spesifinen (10 ml sisälsi yhteensä 5 Mg vasta-ainetta) ja kuivattiin.

30 Kalvot blokattiin ja inkuboitiin sitten 2 ml: n kanssa liuosta, joka sisälsi 0,1 mg/ml puhdistettua D2:ta fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,4), joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, tunnin ajan 37 °C:ssa. Kalvot huuhdottiin sitten ja inkuboitiin kultakolloidikon-35 jugaattien kanssa esimerkin 5 mukaisella menetelmällä.

17 92883

Saatiin samanlaiset tulokset, jotka osoittivat että värinkehitys 4,5 nm:n kultakolloidikonjugaatteja käytettäessä oli noin kaksinkertainen intensiteettiin nähden, joka saatiin joko 15 nm:n tai 30 nm:n kolloideilla.

5 Esimerkki 7

Esimerkki 6 toistettiin korvaamalla D2spesifiset vasta-aineet samalla CRP-spesifisellä vasta-aineella kalvossa ja kultakonjugaateilla. Menetelmä ja väliaineet olivat kaikilta muilta osin identtiset.

10 4,5 nm:n kultakolloidikonjugaattien värinkehitys oli noin kolminkertainen intensiteettiin nähden, joka saatiin 15 nm:n kullalla, joka puolestaan oli noin 1,2 kertaa voimakkaampi kuin 30 nm:n kulta.

Esimerkki 8 15 D2:lle spesifiset hiiren monokloonaaliset vasta-ai neet, joita käytettiin edellisissä esimerkeissä, käsiteltiin seuraavasti:

Yksi vasta-aineista konjugoitiin 4,5 nm:n, 15 nm:n ja vastaavasti 30 nm:n kultakolloideihin. Kolloidit saa-20 tiin samoin kuin esimerkissä 5. Konjugaatit valmistettiin kuten esimerkissä 5 ja laimennettiin väkevyyteen OD52J = 0,010 50 mmol/1 Tris HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl, 0,01 % Tween 20 ja 1 % naudan see-rumialbumiinia.

25 Toinen vasta-aine konjugoitiin kolmen mikronin par tikkeleihin (Dynospheres CA-031-A, Dyno Particles AS, Norja) . Valmistajan toimesta partikkelit oli esiaktivoitu proteiiniin kytkemistä varten. Vasta-aine liuotettiin väkevyyteen 170 Mg/ml 10 mmol/1 natriumfosfaattipuskurilla 30 (pH 7,5), jossa oli 0,15 mol/1 NaCl ja 30 mg/ml partikkeleita. Tähän seokseen lisättiin puoli tilavuutta 0,05 mol/1 natriumboraattipuskuria (pH 9,5), ja seosta päästä päähän-pyöritettiin 20 tuntia 20 °C:ssa. Partikkelit pestiin sen jälkeen, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudel-35 leen fosfaattipuskurissa (pH 7,5). Kaikki jäljelle jääneet 18 92883 aktiiviset ryhmät blokattiin inkuboimalla 1 mol/1 etanoli-amiinilla (pH 9,5), joka sisälsi 0,1 % Tween 20:tä, 20 °C:ssa vielä 20 tuntia. Partikkelit pestiin sitten kahdesti 50 mmol/1 Tris HCl:llä (pH 7,4), joka sisälsi 0,1 mol/1 5 NaCl:a, 0,01 % naudan seerumialbumiinia ja 0,1 % Tween 20:ta.

Tällä tavoin valmistetut partikkelit voivat olla homogeenisena suspensiona vähintään tunnin. Yksi mg partikkeleita sitoo arviolta 5 μg vasta-ainetta.

10 Noin 1 mg partikkelinäytteet sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan kutakin kolmea kulta-kolloidikonjugaattiliuosta, jotka oli säädetty pitoisuuteen 0,1 mg/ml puhdistettua D2:ta, ja inkuboitiin päästä päähän sekoittamalla 20 °C:ssa. Tietyin aikavälein seok-15 sesta otettiin 50 μ1:η näytteet ja lisättiin esimerkin 1 mukaiseen testilaitteeseen, jossa kalvo oli kokonaan blo-kattu naudan seerumialbumiinilla.

Tällä menetelmällä kultakolloidipartikkelit tarttuvat partikkeleihin laitteessa suodattamalla värilliset 20 kultakolloidit jäävät suodattimeen. Sitoutumattomat kultakon jugaatit menevät suodattimen läpi.

Inkuboinnissa puolen tunnin aikana otettiin näytteitä joka viides minuutti. Muodostuneen värin intensiteetti 15 nm:n ja 30 nm:n kolloideilla oli melkein sama • 25 kaikissa kohdissa kasvaen lineaarisesti noin 20 minuut tiin. 4,5 nm:n kolloideilla syntynyt väri oli noin 2,5 kertaa suurempi 5 minuutin jälkeen ja tämä intensiteet-tiero heikkeni 10 minuutin kuluttua.

Edellä esitetyistä esimerkeistä voidaan nähdä, että 30 kultakolloideilla, joiden keskihalkaisija on alle 5 nm, . päästään nopeampaan reaktiokinetiikkaan ja saadaan voimak kaampi värinkehitys kuin tekniikan tason mukaisilla kulta-kolloidikonjugaateilla.

Claims (10)

19 92883

1. Menetelmä analyytin kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi testinäytteestä, jossa me- 5 netelmässä reagenssi, joka käsittää kultasoolin sidottuna aineeseen, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan kyseiseen analyyttiin tai sen spesifiseen sidoskumppaniin, immobili-soidaan sidotussa muodossa kiinteään faasiin, jolloin se osoittaa analyytin läsnäolon tai määrän näytteessä totea- 10 maila immobilisoidun kultasoolin läsnäolon tai väri-intensiteetin, tunnettu siitä, että vähintään 75 pai-no-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijal-taan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että näyte saatetaan kosketukseen vesipitoisessa koeliuoksessa (i) analyyttianalogin tai kyseiselle analyytille spesifisen sidoskumppanin kanssa, joka on immobilisoitu kiinteälle kantajalle, ja (ii) merkityn reagenssin kanssa, joka käsittää kultasoolin liit- 20 tyneenä molekyyliin, joka pystyy spesifisesti sitomaan kyseisen analyytin tai sille spesifisen sidoskumppanin, jolloin tietty määrä kultasoolireagenssia immobilisoidaan kantajalle, jonka värin tutkimista tai määritystä käytetään osoittamaan analyytin läsnäolo tai määrä näytteessä, !·.. . 25 vähintään 75 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista ol lessa keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään 80, edullisesti 30 vähintään 85 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään 85 pai- 35 no-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 nanometriä. 92683

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä faasi tai kantaja on kastettava tikku, huokoinen materiaali tai reaktioastian seinämä, ja että kiinteän faasin tai kiin- 5 teän kantajan materiaalina on nitroselluloosa, paperi, selluloosa-asetaatti, nylon tai muu polymeerimateriaali, johon biologiset aineet voidaan sitoa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä faasi tai kiinteä 10 kantaja on huokoinen aine ja siinä on välikappaleet nesteen kulun helpottamiseksi huokoisen aineen läpi.

7. Testipakkaus analyytin kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi näytteessä, joka testi-pakkaus käsittää 15 (a) kiinteän faasin, jolle merkitty reagenssi im- mobilisoidaan analyytin läsnäolon tai määrän osoittamiseksi näytteessä ja (b) merkityn reagenssin, tunnettu siitä, että merkitty reagenssi käsittää 20 kultasoolin sidottuna aineeseen, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan mainittuun analyyttiin tai sen spesifiseen sidoskumppaniin, jolloin vähintään 75 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijaltaan alle 5 nano-metriä muttei alle 3 nanometriä. ·’· 25 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että kiinteä faasi tai kantaja on kastettava tikku, huokoinen kalvo tai reaktioastian seinämä, ja että kiinteän faasini tai kantajan materiaali on nitroselluloosa, paperi, selluloosa-asetaatti, nylon tai 30 muu polymeerimateriaali, johon biologisia aineita voidaan .· sitoa.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on huokoinen aine ja siinä on välikappaleet nesteen kulun hel-35 pottamiseksi huokoisen aineen läpi. Il 92883

10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen kitti, tunnettu siitä, että vähintään 80, edullisesti vähintään 85 paino-% kultasoolin kultapartikkeleista on keskihalkaisijaltaan alle 5 nanometriä muttei alle 3 5 nm. 92883