ITUD20060177A1 - Apparecchiatura integrata e metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di sangue intero - Google Patents

Apparecchiatura integrata e metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di sangue intero Download PDF

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ITUD20060177A1
ITUD20060177A1 IT000177A ITUD20060177A ITUD20060177A1 IT UD20060177 A1 ITUD20060177 A1 IT UD20060177A1 IT 000177 A IT000177 A IT 000177A IT UD20060177 A ITUD20060177 A IT UD20060177A IT UD20060177 A1 ITUD20060177 A1 IT UD20060177A1
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IT000177A
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Alfredo Ciotti
Paolo Galiano
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Sire Analytical Systems Srl
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    • G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
    • G01N15/05—Investigating sedimentation of particle suspensions in blood
    • G01N2015/012—
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Description

glp R2- 7729
Descrizione del trovato avente per titolo:
"APPARECCHIATURA INTEGRATA E METODO PER LA
RILEVAZIONE DI STATI INFIAMMATORI PRESENTI IN UN
5 CAMPIONE DI SANGUE INTERO"
a nome SIRE ANALYTICAL SYSTEMS S.r.l. di nazionali-<tà italiana con sede in Via Biella, 121 / 3>-<33100>-UDINE.
CAMPO DI APPLICAZIONE
I1 presente trovato si riferisce ad un'apparecchiatura integrata per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di san-15 gue intero ed al relativo metodo. In particolare, l'apparecchiatura integrata secondo il presente trovato è atta ad effettuare una pluralità di analisi di tipo fisico, come la misura della velocità di eritrosedimentazione VES, di tipo immunologico e<20>di tipo coagulativo, utilizzando un unico campione di sangue intero.
STATO DELLA TECNICA
È noto che, per accertare una possibile patologia, ci si avvale di test diagnostici, in base<25>all'esito dei quali si avvia la terapia più adeguata.
In un laboratorio clinico sono, di norma, previsti almeno tre diversi protocolli pre-analitici, i quali utilizzano tre diversi campioni di sangue, 5 raccolti in tre differenti contenitori, per poter eseguire almeno tre diversi gruppi di test clinici. Un primo gruppo di test comprende test fisici per misurare la velocità di eritrosedimentazione nel sangue (VES-ESR), ad esempio utilizzando il metodo 10 e l'apparato descritti nella domanda di brevetto europeo EP-A-1.098.188 (EPr188) a nome della Richiedente, e per effettuare misure dimensionali della parte corpuscolare del sangue, nonché per determinare valori di anemia ed ematocrito e/o emo-15 globina, come descritto nella domanda di brevetto italiana UDA2006000111 a nome della Richiedente. I1 test di misura della VES è indicativo, in modo aspecifico, della presenza di uno stato di infiammazione, in quanto è noto che i globuli rossi, in 20 particolari stati patologici, tendono ad aggregare formando degli agglomerati, detti rouleaux. Tipicamente, ciò è evidenziato dal test clinico VES che ha il pregio di essere di facile esecuzione e poco costoso.
25 L'aggregazione è, di norma, ostacolata dalla ca-
Il mandatario glp R2-7729
rica negativa dei globuli rossi, che fa sì che questi si respingano tra loro. É possibile, però, che tale carica negativa sia neutralizzata quando sono presenti, nel plasma, proteine a carica positiva 5 che favoriscono, perciò, l'aggregazione.
Si spiega, così, l'aumento della VES nelle situazioni fisiologiche o patologiche che implicano un aumento di fibrinogeno, betaglobuline, alfaglobuline e gammaglobuline.
10 Nelle collagenopatie, nelle malattie reumatiche e nel morbo di Hodgkin esiste un legame tra i valori della velocità di eritrosedimentazione ed il grado di attività della malattia; l'esame VES, in questi casi, è uno strumento utile per monitorare le con-15 dizioni cliniche di un paziente.
Da quanto sopra esposto, è chiaro che la VES rivela indirettamente uno stato di flogosi.
<É>chiaro che 1'aspecificità del1 'esame VES rende necessario il suo utilizzo nel contesto di dati 20 clinici e anamnestici, che mantengono un ruolo primario.
Pertanto, quando il valore della VES eccede i valori di normalità,<è>prassi consolidata eseguire altri test diagnostici, anche se più costosi, aven-25 ti però maggior specificità.
Il<mandatario>Tra questi, un secondo gruppo di test, di tipo immunologico, ossia basati su una reazione antigene -<anticorpo, serve per valutare la concentrazione>di proteina C-reattiva (CRP), di infezioni strepto-5 cocciche (ASO) e del fattore reumatico, RF.
La proteina C-reattiva CRP è una proteina, presente nel siero ematico, che aumenta significativamente a seguito di danni tissutali, infezioni batteriche e virali, patologie cardiache e neoplasie 10 maligne.
Negli ultimi anni ha assunto rilievo la ricerca di marcatori infiammatori che fungessero da predittori del rischio di eventi cardiovascolari: l'ipotesi accreditata, è che l'aterosclerosi sia il ri-15 sultato di un processo infiammatorio, che si sviluppa in risposta a danni metabolici (diabete, ipercolesterolemia), fisici (ipertensione) o comportamentali (abitudine al fumo).
Le implicazioni cliniche della misurazione di 20 questi marcatori consistono nella possibilità di valutare il rischio individuale di eventi cardiovascolari. La stima dei tradizionali fattori predisponenti (età avanzata, diabete, fumo, ipertensione, iperlipemia e pregressa angina) definisce in-25 fatti con sufficiente accuratezza il rischio a li-Il mandatario vello di popolazione, ma permette di predire soltanto il 50-60 % della variazione del rischio assoluto nel singolo paziente.
E' emersa, così, l'importanza dell'accertamento 5 dei valori di proteina C-reattiva, come predittori di rischio indipendente.
I1 test standard per determinare la CRP, consiste nel misurare il livello di torbidità provocata dalla agglutinazione dalla miscelazione di una deter-10 minata quantità di siero o plasma ematico con dei lattici, costituiti da sfere prevalentemente di polistirene con diametro medio di circa 0,120 micron, ricoperti con anticorpo anti-CRP, e dispersi o diluiti in particolari liquidi, detti tamponi, o 15 buffer.
I1 test CRP utilizzato nella tecnica nota è basato sulla nefelometria e richiede tempi medi di circa 6 minuti per realizzare una significativa cinetica di reazione, poiché la tecnica nefelometrica 20 richiede reagenti a bassa concentrazione.
Altri metodi utilizzano sangue intero, la cui metodica prevede un'iniziale lisi dei globuli rossi presenti e quindi l'agglutinazione dovuta all'antigene, presente nel volume del plasma, che 25 incontra l'anticorpo presente nel lattice sensibi-Il mandatario lizzato. In tal caso, il valore della CRP misurato è corretto con il valore di ematocrito del campione di sangue intero.
Nel corso delle infezioni prodotte da Streptococ-5 cus pyogenes, vengono secrete, da questi microorganismi, numerose sostanze, tra le quali due emolisine: la Streptolisina "O" e la Streptolisina "Su. La streptolisona "O" è una tossina capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici. Con lo stesso 10 principio del test CRP si realizzano reazioni immunologiche per la determinazione quantitativa degli anticorpi anti -streptolisina "O", test ASO.
I1 ritrovamento di questi anticorpi è molto utile per la diagnosi delle infezioni streptococciche e 15 le relative conseguenze ad esso associate, quali febbre reumatica e la glomerulonefrite acuta. I1 test si basa sulla reazione tra anticorpo e le par-<ticelle di lattice legate alla streptolisina "0">.<I>valori di ASO si determinano cineticamente secondo 20 una curva di calibrazione eseguita utilizzando un campione a concentrazione ASO nota secondo una successione di concentrazioni scalari, utilizzando le tecniche già note nel test CRP.
Si effettua, inoltre, un test per quantificare il 25 fattore reumatico RF, che è una macroglobulina che
m ndatario
Rf<E>L<F>f<ANO>LIGI / agglutina particelle di lattice sensibilizzate con gammaglobuline umane, e si riscontra nella maggior parte dei pazienti affetti da poliartrite evolutiva. I1 test di agglutinazione al lattice permette 5 di differenziare tale malattia dal reumatismo articolare o dalla febbre reumatica, in cui il fattore reumatoide non è presente.
Un terzo gruppo di test concerne la coagulazione ed, in particolare, la valutazione della concentra-10 zione di fibrinogeno presente nel sangue. La coagulazione dipende da fattori che si trovano nel plasma e nelle piastrine, trombina, protrombina, tromboplastina.
I1 livello di fibrinogeno nel sangue può variare 15 in situazioni patologiche, ad esempio innalzandosi nelle infiammazioni, reumatismi, connettivite, nei linfomi (oltre 5 g/l), in gravidanza, in taluni casi di nefrosi e in caso di ustioni. Si abbassa, invece, per proprio eccessivo consumo (iperfibrinoge-20 nolisi), in caso di insufficienza epatica e di coagulazione intravascolare disseminata dovuta a cause diverse (shock settico, cancro della prostata).
É noto, inoltre, come riportato in uno studio pubblicato su Clinica1 Chemistry, "Mistakes in a 25 stat laboratory: types and frequency", che il flus-
Il mandatario so analitico di ogni test clinico subisce tre fasi principali di lavorazione, ossia una fase preanalitica, una fase analitica ed una fase postanalitica. Secondo quanto riportato nella stessa pubblica-5 zione, il 68,2% degli errori avvengono durante la fase preanalitica, il 13,3% durante la fase analitica ed il restante 18,5% durante la fase postanalitica.
É chiaro, inoltre, che la prima e fondamentale 10 richiesta che il clinico e il paziente rivolgono a chi effettua le analisi è l'affidabilità del risultato analitico.
Uno scopo del presente trovato è quello di realizzare un'apparecchiatura che consenta 15 l'esecuzione di una pluralità di test diagnostici, che utilizzano diverse tecniche di reazione ed un unico campione di sangue intero che ha subito un unico trattamento pre-analitico, per realizzare i diversi fenomeni di reazione da studiare, sia fisi-20 ci, sia imrnunologici, sia coagulativi.
Un ulteriore scopo è quello di mettere a punto un metodo che riduca intrinsecamente le probabilità di errore nella fase pre-analitica che sia economico, permettendo di eseguire una pluralità di test dia-25 gnostici, che utilizzano diverse tecniche di rea-
I l mandatario zione ed un unico campione di sangue intero che ha subito un unico trattamento pre-analitico.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantag-5 gi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
I1 presente trovato è espresso e caratterizzato nelle relative rivendicazioni indipendenti.
10 Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell'idea di soluzione principale.
In accordo con i suddetti scopi, un'apparecchiatura integrata per la rilevazione di 15 stati infiammatori presenti in un campione di sangue intero secondo il presente trovato comprende un gruppo di rilevazione della velocità di eritrosedimentazione VES del campione di sangue intero. Nel caso in cui il valore di VES rilevato sia superiore 20 alla norma, è considerato come indice di probabili stati infiammatori presenti nel campione.
L'apparecchiatura integrata comprende, inoltre, un reattore di lisi per effettuare una reazione di lisi di una parte del campione di sangue intero per 25 ottenere un campione lisato, un primo gruppo di re-Il mandatario glp R2-7729
azione per effettuare almeno una reazione immunologica tra una parte del campione lisato ed un lattice sensibilizzato, e mezzi ottici per misurare la cinetica della reazione immunologica, la quale, 5 vantaggiosamente secondo una curva di calibrazione precedentemente memorizzata, consente di misurare la concentrazione dell'analita cercato ed è, pertanto, indicativa di uno stato infiammatorio del campione di sangue.
10 I1 gruppo di rilevazione della velocità di eritrosedimentazione VES 6 atto, inoltre, a misurare il fattore di ematocrito equivalente del campione di sangue intero, per utilizzare, successivamente, questo valore come fattore di correzione delle con-15 centrazioni dei vari analiti determinati, attraverso la specifiche cinetiche di reazione che coinvolgono il campione lisato. Vantaggiosamente, così, si ottengono le concentrazioni dei vari analiti corrispondenti alle concentrazioni standard, eseguite su 20 plasma o siero nella tecnica nota.
Secondo una forma di realizzazione del trovato, il primo gruppo di reazione comprende uno o più reattori scelti in un gruppo di reattori comprenden-te:
25 - un primo reattore, in cui si effettua una prima
Il mandatario STEFANO LIGI reazione tra una prima porzione del campione lisato ed un primo lattice sensibilizzato con un anticorpo anti-proteina C reattiva;
-<un secondo reattore, in cui si effettua una se->5 conda reazione tra una seconda porzione del campione lisato ed un secondo lattice sensibilizzato con una emolisina, quale streptolisina " 0 " ;
-<un terzo reattore, in cui si effettua una terza>reazione tra una terza porzione del campione lisato 10 ed un terzo lattice sensibilizzato per la reazione<antigene>-<anticorpo dovuta ad una macroglobulina>la cui presenza è collegata al fattore reumatoide<RF>.
- un quarto reattore, in cui si effettua una 15 quarta reazione tra una quarta porzione del campione lisato ed un quarto lattice comprendente un anticorpo anti-fibrinogeno, per la misura del contenuto di fibrinogeno nel campione di sangue intero. Secondo una variante alternativa del trovato, ap-20 plicata nel caso in cui il primo gruppo di reazione non comprenda il suddetto quarto reattore per la rilevazione del fibrinogeno, l'apparecchiatura comprende, inoltre, un secondo gruppo di reazione per effettuare almeno una reazione di coagulazione tra 25 una parte del campione di sangue intero ed un rea-
Il mandatario gente standard di coagulazione.
In tal caso, il secondo gruppo di reazione comprende il suddetto quarto reattore, in cui, però, avviene una reazione di coagulazione tra una por-5 zione del campione di sangue intero, oppure una porzione del campione lisato ed un reagente di coagulazione, quale trombina, protrombina o tromboplastina.
Di conseguenza, i suddetti mezzi ottici sono at-10 ti, inoltre, a misurare una cinetica di reazione della reazione di coagulazione, indicatore anche di stati infiammatori presenti nel campione.
L'apparecchiatura è, vantaggiosamente, gestita da un'unità di comando e controllo, che comanda e con-15 trolla almeno il gruppo di rilevazione, il primo gruppo di reazione ed i primi mezzi ottici, elaborando i dati ricevuti per generare informazioni, disponibili per un operatore, sullo stato di infiammazione del campione di sangue intero.
20 Secondo una variante, l'unità di comando e controllo comanda e controlla, inoltre, il secondo gruppo di reazione.
Vantaggiosamente, l'apparecchiatura secondo il trovato funge efficacemente da unico punto analiti-25 co e consente l'esecuzione di una pluralità di test
Il mandatario diagnostici, che utilizzano diverse tecniche di reazione e diverse aliquote di sangue intero, derivate da un unico campione di sangue intero che ha subito un unico trattamento pre-analitico, per rea-5 lizzare le diverse reazioni da studiare, sia fisiche, sia immunologiche, sia coagulative.
Secondo il presente trovato, un metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di sangue che comprende le fasi di effettuare 10 una misura del valore del fattore di ematocrito equivalente del campione di sangue intero; di effettuare una misura del valore della velocità di eritrosedimentazione VES-ESR del campione stesso; di effettuare una reazione di lisi di una parte del 15 suddetto campione di sangue, per ottenere un campione lisato.
Inoltre, il metodo secondo il trovato comprende le fasi di effettuare una reazione immunologica tra una parte del campione lisato ed un lattice, oppor-20 tunamente sensibilizzato; di effettuare almeno una misura della cinetica della reazione immunologica; di effettuare una correzione della concentrazione dell'analita ricercato mediante il suddetto fattore di ematocrito equivalente.
25 Secondo una variante del trovato, il metodo com-
Il mandatario
S
P.le Cavedalis, 612 - 33100 UDINE prende, inoltre, le fasi di effettuare una reazione di coagulazione tra una parte del campione di sangue intero o una porzione del campione lisato ed un reagente di coagulazione; di effettuare almeno una 5 misura della cinetica della reazione di coagulazione.
I1 metodo secondo il trovato permette di eseguire una pluralità di test diagnostici, che utilizzano diverse tecniche di reazione e diverse aliquote, 10 derivate da un unico campione di sangue intero che ha subito un unico trattamento pre-analitico. I1 metodo risulta, così, economico ed affidabile, riducendo la possibilità di errori dovuti alle diverse fasi pre-analitiche della tecnica nota.
15 ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con 20 riferimento agli annessi disegni in cui:
- la fig.<1 è>una rappresentazione schematica complessiva di un'apparecchiatura secondo il presente trovato;
- la fig. 2 è una rappresentazione schematica det-25 tagliata dell'apparecchiatura di fig.
Il mandatario glp R2-7729
1;
-<la fig. 3 è una rappresentazione schematica di>una parte dell'apparecchiatura di fig.
1;
5-la fig. 4 è un diagramma di confronto di dati di un test CRP misurati mediante l'apparecchiatura di fig. 1, valori sull'asse delle ordinate e mediante la metodica nota di riferimento, valori 10 sull'asse delle ascisse;
- la fig. 5 è un diagramma di confronto di dati di un test ASO misurati mediante l'apparecchiatura di fig. 1, valori sull'asse delle ordinate e mediante la metodica nota di riferimento, valori sull'asse delle ascisse; e
-<la fig. 6 è un diagramma di confronto di dati di>un test RF misurati mediante l'apparecchiatura di fig. 1, valori sull'asse delle ordinate e mediante la metodica nota di riferimento, valori sull'asse delle ascisse.
DESCRIZIONE DI UNA FORMA PREFERENZIALE
DI REALIZZAZIONE
25 In accordo con il presente trovato, in fig. 1 si
Il mandatario /n;EFANO LICI/
P.le ~avedal is, 612 - 33100UDINEè rappresentata un'apparecchiatura integrata 10 per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione 11 di sangue intero.
L'apparecchiatura 10 comprende un'analizzatore 12 5 della velocità di sedimentazione del sangue VES, ad esempio come nellrEP'188, il quale è provvisto di una microcalcolatore che coordina tutte le operazioni analitiche, ossia omogeneizzazione dei campioni, prelievo del campione, misura analitica del 10 campione, scarico del campione.
L'analizzatore 12 comprende un caricatore 47 dei campioni ematici ed un agitatore 46 dei campioni ematici (fig. 2).
Ciascun campione 11 ematico viene identificato 15 mediante un proprio codice a barre, oppure un tag RFID, che riporta informazioni sul campione e sul trattamento da effettuare e che può essere letto da un apposito lettore di codici a barre oppure di RFID.
20 L'analizzatore 11 comprende un dispositivo 17 di tipo CPS costituito da un microfotometro ed un capillare dove viene realizzato lo "stopped-flow" per la misura della cinetica di densità ottica del sangue e per la lettura del relativo sillectogramma. 25 L'analizzatore 11 è comandato e controllato da
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un<f>unità di comando e controllo 50, la quale, inoltre, calcola i parametri del sillectogramma, la velocità di sedimentazione VES ed il fattore di anemia il quale è correlato al valore di ematocrito 5 equivalente, come descritto nella domanda di brevetto UDA2006000111 a nome della Richiedente.
I dati elaborati dall'unità di comando e controllo 50 sullo stato di infiammazione del campione di sangue intero sono disponibili per un operatore, ad 10 esempio a mezzo stampante 52.
Inoltre, è previsto un dispositivo sigillato per il prelievo ematico dotato di una pompa 43 di movimentazione del campione ematico, a valle del microfotometro.
15 Terminata la misura della VES, parte del campione utilizzato, circa 10 microlitri, viene inviata dalla pompa 43, ad un reattore di lisi 13. La portata in uscita dalla pompa 43 è regolata da una prima microvalvola 44 primaria di controllo, comandata 20 elettricamente dall<f>unità di comando e controllo 50 e che consente di dosare volumi di circa 10 nanolitri ad impulso.
Le caratteristiche tecniche della prima microvalvola 44 consentono di erogare 1000 gocce al secon-25 do.
Il mandatario Variando il numero di impulsi totali è facilmente variabile e controllabile il volume totale erogato.
L'uscita della prima microvalvola 44 che eroga il volume di sangue al reattore di lisi 13 è control-5 lata otticamente da un sistema fotometrico 45 che conta le gocce realmente erogate dalla microvalvola 44, determinando così il volume realmente dispensato. I1 lettore ottico è sintonizzato a 540 nm che corrisponde al colore medio dell'emoglobina, conte-10 nuta nei globuli rossi.
La massa del reattore di lisi 13 , termostatata a 37 'C, è sufficientemente grande da non subire apprezzabili variazioni di temperatura ( k 1 'C) dovute all'aggiunta del campione ematico e del volume 15 di lisante chimico, conservati a temperatura ambiente (25 'C).
I1 lisante chimico può svolgere anche la funzione di diluente in modo da calibrare la giusta concentrazione del campione ematico per realizzare la 20 successiva reazione immunologica.
Nel reattore di lisi 13 è distribuita una quantità di materiale sufficiente per poter realizzare le diverse reazioni immunologiche dello stesso campione 11, ossia il test per la proteina C-reattiva, il 25 test ASO ed il test RF.
I l mandatario I1 rapporto indicativo di diluizione è di circa 1/10, ossia un volume di campione 11 ematico e nove volumi di lisante chimico.
I1 lisante chimico è prelevato, mediante un di-5 spensatore dotato di una seconda microvalvola 35 da un serbatoio di lisante 26.
Le due microvalvole 35 e 44 lavorano in maniera coordinata in modo da favorire la miscelazione dei due liquidi, con vantaggiosi risultati di miscela-10 zione quando il tempo totale di erogazione è coincidente, ossia, stabilito il volume che devono erogare le due microvalvole, che può essere anche molto diverso tra le due, il tempo di erogazione sarà uguale per ciascuna microvalvola e, quindi, varierà 15 la loro portata.
Vantaggiosamente, le due microvalvole 35 e 44 sono orientate in modo da erogare in un unico punto comune, detto fuoco di erogazione.
Vantaggiosamente, lo stesso campione lisato può 20 essere utilizzato per eseguire un test di coagulazione, essendo inalterate le sostanze utilizzate nei test della coagulazione.
L'apparecchiatura 10 comprende, inoltre, un analizzatore delle reazioni immunologiche 14, disposto 25 a valle del reattore di lisi 13.
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L'analizzatore delle reazioni immunologiche 14 comprende una pluralità di reattori 18, 19, 20, 25.
L'uscita del reattore di lisi 13, attraverso un capillare, è connessa ad una successiva microvalvo-5 la mobile 36, che ha il compito di erogare i volumi necessari per realizzare nei reattori relativi, le reazioni immunologiche.
Un sistema motorizzato posiziona il campione lisato dalla posizione iniziale di lavaggio e di in-10 nesco alla posizione di miscelazione per l'analisi della proteina C-reattiva.
Una prima parte del campione lisato è iniettata, così, in un primo reattore 18, dove avviene una prima reazione immunologica tra la prima parte del 15 campione lisato ed un primo lattice 21, comprendente un anticorpo anti proteina C-reattiva.
I1 primo lattice 21 è dispensato da un primo serbatoio 27 mediante un primo dispensatore 31, all'interno del primo reattore 18. I1 primo dispen-20 satore 21 è provvisto di due microvalvole, delle quali, una prima ha il compito di provocare l'inizio della specifica reazione, aggiungendo un adeguato volume del primo lattice 21 sensibilizzato ed una seconda, quando la concentrazione del cam-25 pione in analisi supera una determinata soglia di
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concentrazione, permette di eseguire una seconda reazione a maggiore diluizione del campione, erogando una determinata quantità di diluente (buffer), per evitare così l'effetto gancio, che è 5 tipico in questo tipo di reazioni.
Secondo una forma di realizzazione vantaggiosa, il primo serbatoio 27 del primo lattice 21 è conservato in una cella termostatata, ad esempio con celle di Peltier a circa 4-8 'C, per non compromet-10 terne l'efficienza.
La parte terminale del capillare 53, che preleva il primo lattice 21 dal primo serbatoio 27, ed il primo dispensatore 31 sono termostatati a 37 'C da un termostato 51, in modo da erogare il volume di 15 reagente necessario alla reazione ad una temperatura standardizzata di 37 'C i 1 (fig. 3).
Inoltre, la dispensazione del primo lattice 21 è controllata otticamente da un fotometro 54, dotato di un emettitore 48 ed un ricevitore 55 che, in so-20 stanza, conta le gocce realmente erogate, analogamente al suddetto sistema fotometrico 45 (fig. 3). L'omogeneità del reagente lattice per la reazione immunologica è assicurata da un sistema tipo vortex che è messo in azione prima di iniziare il ciclo 25 analitico.
Iniziata la reazione immunologica specifica, un fotometro 16 multicanale misura la cinetica di reazione e l'unità di comando e controllo 50 determina i parametri della reazione secondo una curva di ca-5 librazione memorizzata. Quest'ultima è costruita attraverso la determinazione di campioni a concentrazione nota e serve a collegare il valore della cinetica misurata dal fotometro 16 alla efficienza del lattice o reagente utilizzato.
10 I volumi ed i rapporti di volume che le microvalvole ed i dispensatori possono erogare, possono essere variati secondo un determinato algoritmo presente nel unità di comando e di controllo 50.
L'analizzatore di reazioni immunologiche 14 com-15 prende, inoltre, un secondo reattore 19, in cui avviene una seconda reazione tra una seconda parte del campione lisato ed un secondo lattice 22 comprendente un'emolisina, quale la streptolisina "O", per effettuare il test ASO.
20 É previsto, inoltre, un terzo reattore 20, dove avviene una terza reazione tra una terza parte del campione lisato ed un terzo lattice 23 comprendente un antigene di gammaglobulina umana IgG, per il test RF.
25 I1 secondo reattore 19 ed il terzo reattore 20 di
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reazione immunologiche operano in maniera analoga e sono provvisti delle soluzioni sopradescritte per il primo reattore 18, per il controllo della dispensazione e la termostatazione, e si differenzia-5 no per il tipo di lattice, sensibilizzato specificatamente per la reazione immunologica cercata e dispensato da corrispondenti dispensatori 32, 33, connessi a rispettivi serbatoi 28, 29. La seconda e la terza reazione immunologica sono analizzate dal 10 fotometro 16, in maniera analoga a quanto già illustrato per la prima reazione.
L'apparecchiatura 10 comprende, inoltre, un quarto reattore 25, per effettuare misure del livello di fibrinogeno nel sangue.
15 Secondo una variante, l'analizzatore di reazioni immunologiche 14 comprende, inoltre, il suddetto quarto reattore 25, per effettuare una quarta reazione immunologica, la cui cinetica è, analogamente, misurata dal fotometro 16, tra una quarta parte 20 del campione lisato ed un quarto lattice 24, comprendente un anticorpo anti-fibrinogeno, dispensato da un proprio dispensatore 34, collegato ad un serbatoio 30.
Secondo un ulteriore variante, il quarto reattore 25 25 fa parte di un analizzatore di reazioni coagula-Il mandatario
3100 UDINE tive 15. In tal caso, non si utilizza il quarto lattice 24, bensì si miscela un volume del campione 11 primario, non lisato, alimentato dalla prima microvalvola 44, freccia tratteggiata nelle figg. 1 e 5 2, con un adeguato volume di reagente di coagulazione, quale trombina, protrornbina o tromboplastina, opportunamente dispensato dal serbatoio 30, che provoca il fenomeno coagulativo.
I1 reagente per la coagulazione è conservato ter-10 mostatato a 4-8 "C con l'utilizzo di celle di Pel-<tier>.
I1 campione di sangue intero necessario alla reazione di coagulazione viene erogato nel quarto reattore 25, dopo la misura della VES, con l'uso del-15 la prima microvalvola 44.
Anche in questo caso, la parte terminale del capillare, che preleva il reagente dal serbatoio è termostatato a 37 'C ed il reagente è omogeneizzato mediante un sistema tipo vortex, che è messo in a-20 zione prima di iniziare il ciclo analitico.
I1 fotometro 16 misura la cinetica di reazione coagulativa e l'unità di comando e controllo 50 determina i parametri della reazione secondo una curva di calibrazione memorizzata, costruita secondo 25 la metodologia già descritta.
glp R2-7729
I1 fotometro 16, rilevato lo stato iniziale della reazione di coagulazione, quando i composti della reazione sono percentualmente ancora allo stato liquido, abilita un ciclo di lavaggio che ripristina 5 le condizioni iniziali di ciascun reattore 18, 19, 20, 25.
I1 circuito di lavaggio comprende un serbatoio del liquido di lavaggio 40 ed una pompa del liquido di lavaggio 41 che coopera con una valvola di con-10 trollo del lavaggio 42.
All'uscita del fotometro 16 vi è un collettore di controllo dello scarico 37, collegato ad una pompa di scarico 38 che eroga in uscita ad un serbatoio di scarico 39.
15 Secondo un'altra variante, si realizza un sistema a multicelle del tipo a micropiastra, del tipo standardizzato a 96 o 182 pozzetti, in cui realizzare le singole reazioni di lisi e successivamente negli stessi pozzetti le reazioni imrnunologiche o 20 coagulative.
Vantaggiosamente, l'apparecchiatura 10 sfrutta un solo campione 11 di sangue intero, solitamente utilizzato per la misura dell'emocromo o contaglobuli, per eseguire, in uno stesso strumento, diversi test 25 diagnostici, a conferma di uno stato infiammatorio.
Il mandatario Vantaggiosamente, la determinazione delle concentrazioni delle sostanze ricercate è equivalente alla determinazione eseguita su siero e plasma ematicol standardizzando i valori misurati grazie 5 all'utilizzo dei valori fotometrici correlati al valore del fattore di ematocrito equivalente, senza la necessità di adottare un sistema per la misura dell'ematocrito, misura tipica dei contaglobuli oppure dei sistemi a centrifuga.
10 Infatti, nelle figg. 4, 5 e 6, si osserva la correlazione tra i dati ottenuti mediante i metodi noti (gold standard), rispettivamente per il test CRP in mg/l, il test ASO ed il test RF in UI/ml, riportati in ascissa, ed i valori ottenuti con il 15 presente trovato per i suddetti test, riportati in ordinata.
I fattori di correlazione dei suddetti test sono pari, rispettivamente, a 0,982, 0,9698 e 0,975, rivelando l'efficacia della sperimentazione condotta.
20 Vantaggiosamente, inoltre, si riduce il tempo di reazione, impiegando reagenti concentrati.
Infatti, si possono utilizzare reagenti concentrati sfruttando una cella di misura del fotometro 16 con cammino ottico breve, compreso, tra circa 25 0,4 e 0,9 mm, vantaggiosamente tra circa 0,6 e 0,8 glp R2-7729
mrn, che consente al fotometro di lavorare nellfintervallo di misura ideale, compreso tra circa 20% e 80% di trasmittanza, dove l'errore relativo è inferiore al 2%.
5 L'utilizzo di questa maggiore concentrazione di reagenti permette di realizzare e misurare la reazione immunologica in tempi relativamente più brevi, compresi tra circa 0,5 e 6 minuti, vantaggiosamente tra circa 0,5 e 2 minuti.
10 Vantaggiosamente, la conseguente dimensione della cella di misura e del cammino ottico consente di realizzare reazioni con volumi globali compresi tra<i 2>-<3 microlitri, contro i 700>-<800 microlitri>della tecnica nota.
15 È chiaro che all'apparecchiatura ed al metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di sangue intero fin qui descritti possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall'arnbito del presente 20 trovato.
Il mandatario

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Apparecchiatura integrata per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione (11) di sangue intero, caratterizzata dal fatto che compren-5 de: -<un gruppo di rilevazione (12) della velocità di>eritrosedimentazione VES di detto campione (Il), indicativa di detti stati infiammatori presenti in detto campione (11); 10 - un reattore di lisi (13) atto a realizzare una reazione di lisi di una parte di detto campione (11) per ottenere un campione lisato; - un primo gruppo di reazione (14) atto ad effettuare almeno una reazione immunologica tra una parte di 15 detto campione lisato ed un lattice (21, 22, 23, 24), opportunamente sensibilizzato per provocare detta reazione immunologica; -<mezzi ottici (16) atti a misurare una cinetica di>reazione di detta reazione immunologica, indicativa 20 di detti stati infiammatori presenti in detto campione (11).
  2. 2. Apparecchiatura come nella rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detto gruppo di rilevazione (12)<é>atto, inoltre, a misurare il fattore di 25 ematocrito equivalente di detto campione (11). Il mandatario
  3. 3. Apparecchiatura come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che comprende un secondo gruppo di reazione (15) atto ad effettuare almeno una reazione di coagulazione tra una parte di detto 5 campione (11) ed un reagente di coagulazione.
  4. 4. Apparecchiatura come nella rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto che detti mezzi ottici (16) sono atti, inoltre, a misurare una cinetica di reazione di detta reazione di coagulazione, indicativa 10 di stati infiammatori presenti in detto campione (11).
  5. 5. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto primo gruppo di reazione (14) comprende un 15 primo reattore (18), in cui è atta ad avvenire una prima reazione tra una prima porzione di detto campione lisato ed un primo lattice (21) comprendente un anticorpo anti proteina C-reattiva.
  6. 6. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle ri-20 vendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto primo gruppo di reazione (14) comprende un secondo reattore (19), in cui è atta ad avvenire una seconda reazione tra una seconda porzione di detto campione lisato ed un secondo lattice (22) compren-25 dente streptolisina "O". Y mandatario P.le Cavedalis, 612 - 33100 UDINE
  7. 7. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto primo gruppo di reazione (14) comprende un terzo reattore (20), in cui è atta ad avvenire una 5 terza reazione tra una terza porzione di detto campione lisato ed un terzo lattice (23) sensibilizzato per la rilevazione del fattore reumatico.
  8. 8. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto 10 che detto primo gruppo di reazione (14) comprende un quarto reattore (25), in cui è atta ad avvenire una quarta reazione tra una quarta porzione di detto campione lisato ed un quarto lattice (24) comprendente un anticorpo anti-fibrinogeno, per la misura 15 del contenuto di fibrinogeno in detto campione (11).
  9. 9. Apparecchiatura come nella rivendicazione 3 o 4, caratterizzata dal fatto che detto secondo gruppo di reazione (15) comprende un quarto reattore (25), in cui è atta ad avvenire una reazione tra una porzione 20 di detto campione (11) oppure una porzione di detto campione lisato e detto reagente di coagulazione.
  10. 10. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che comprende un'unità di comando e controllo (50) 25 atta a comandare e controllare detto gruppo di rile-Il mandatario P.le Cavedalis, 612 - 33100 UDINE vazione (11) e detto primo gruppo di reazione (14).
  11. 11. Apparecchiatura come nella rivendicazione 10, caratterizzata dal fatto che detta unità di comando e controllo (50) è atta, inoltre, a comandare e con-5 trollare detto secondo gruppo di reazione (15).
  12. 12. Metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione (11) di sangue intero caratterizzato dal fatto che comprende le fasi di: - effettuare una misura del valore del fattore di 10 ematocrito equivalente di detto campione (11); - effettuare una misura del valore della velocità di eritrosedimentazione VES di detto campione (Il), indicativa di detti stati infiammatori presenti in detto campione (11); 15-effettuare una reazione di lisi di una parte di detto campione (11) per ottenere un campione lisato; -<effettuare almeno una reazione scelta in un gruppo>comprendente: almeno una reazione immunologica tra una parte di detto campione lisato ed un lattice 20 (21, 22, 23, 24) ed almeno una reazione di coagulazione tra una parte di detto campione (11) o una porzione di detto campione lisato ed un reagente di coagulazione; - effettuare almeno una misura della cinetica di re-25 azione di detta reazione, indicativa di detti stati &I mandatario glp R2-7729 infiammatori presenti in detto campione (11); -<effettuare una correzione di detta misura della>cinetica di reazione di detta reazione eseguita con detta porzione di campione lisato, mediante detto 5 fattore di ematocrito equivalente.
  13. 13. Apparecchiatura e metodo per la rilevazione di stati infiammatori presenti in un campione di sangue intero, sostanzialmente come descritto, con riferimento agli annessi disegni. 10 p. SIRE ANALYTICAL SYSTEMS S.r.1 LF/SL 13.07.2006 P.leC 33100 UDINE
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