ITUD20060111A1 - Metodo per la rilevazione di stati di anemia presenti in un campione ematico - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"METODO PER LA RILEVAZIONE DI STATI DI ANEMIA PRESENTI IN UN CAMPIONE EMATICO"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un metodo per la rilevazione di stati di anemia presenti in un campione ematico. Più in particolare, il trovato permette di eseguire la rilevazione di stati di anemia contemporaneamente al test clinico di rilevazione della velocità di eritrosedimentazione del sangue (VES o ESR), sfruttando sostanzialmente la stessa apparecchiatura e la stessa metodologia.

STATO DELLA TECNICA

E' noto che l'anemia è una condizione fisiologica rilevabile in un campione ematico quando il quantitativo di emoglobina si riduce sotto i 13 grammi % nell'uomo e 12 grammi % nella donna, a prescindere se il numero dei globuli rossi possa ridursi sotto i 4,5-5 milioni di emazie per mm<3>(oligocitemia).

Il rapporto tra plasma (componente liquida del sangue) e la parte corpuscolata costituisce l'ematocrito o Htc. Esso di norma deve essere compreso tra il 40-45% negli uomini e tra il 37-47% nelle donne. Gli eritrociti normali, o globuli rossi, hanno forma di lente biconcava (di profilo a forma di "pavesino"), con diametro che oscilla tra 6,7-7,7 micron e spessore di 2 micron. Essi contengono una concentrazione emoglobinica corpuscolare pari a 27-32 pg (picogrammi); questa si riduce, per esempio, nelle talassemie e nelle anemie microcitiche iposideremiche (cioè con globuli rossi piccoli e con scarsa Hb). L'emoglobina corpuscolare si calcola dal rapporto Hb%/globuli rossi in milioni/mm<3>. L'emoglobina (Hb) è costituita da una parte proteica (globina), e dal gruppo prostetico dell'eme, che contiene nuclei tetrapirrolici con il ferro al centro della struttura, il quale ha il compito di "ossidarsi", trasportare l'ossigeno e cederlo ai tessuti. Numerose sono le classificazioni utilizzate per catalogare le anemie; una di queste prende in considerazione il VCM, o volume corpuscolare medio, che è uguale al rapporto fra ematocrito e globuli rossi (g.r.) in milioni x mm<3>e del valore globulare = Hb%/numero g.r. X 20, ed è tra le più seguite.

Si avranno quindi le seguenti condizioni:

- anemia normocromica, con valore globulare uguale ad 1;

- anemia ipercromica, con valore globulare > 1;

- anemia ipocromica, con valore globulare < 1.

Inoltre, un altro criterio classifica le anemie a seconda del VCM e della CECM (concentrazione emoglobinica media corpuscolare = Hbg%/Hct (ematocrito));

- anemia ipocromica microcitica (cioè scarso contenuto di Hb per g.r. g.r di dimensioni ridotte, ad esempio talassemia ed anemia iposideremica);

- anemia normocromica normocitica (cioè contenuto normale in Hb per g.r. dimensioni normali, dunque anemia post-emorragica);

- anemia macrocitica ipercromica (cioè g.r. di dimensioni maggiori contenuto in Hb maggiore, ad esempio nelle carenze di B12 e folati, perchè il g.r. non riesce ad avere una eritropoiesi normale per carenza di vitamine).

Altre classificazioni dell'anemia possono essere le seguenti:

su base patogenetica:

- anemia da deficit di produzione;

- anemia da eccesso di consumo;

su base anatomo-funzionale:

- anemia normogenerativa (con normoreticolocitosi); - anemia iporigenerativa (con iporeticolocitosi); - anemia iperrigenerativa (con ipereticolocitosi); basata sui segni di iperemolisi:

- anemie emolitiche

- anemie anemolitiche.

Un'altra classificazione è quella biochimica, in base alla quale si distinguono:

- anemie iposideremiche (ferrocarenziali vere, ed anemie ferrocarenziali come difetto congenito di mobilizzazione del ferro);

- anemie ipersideremiche (da difetto di utilizzazione del ferro - sideroacrestiche);

- aplastiche, da distruzione eccessiva dei globuli rossi (talassemie, anemie emolitiche in genere); - morfologica (molto seguita, vedi sopra);

- anemie normocitiche (cioè volume normale);

- anemie macrocitiche (cioè a globuli rossi di volume aumentato, con Volume Corpuscolare Medio (MCV) ≥ 95 micron<3>;

- anemie microcitiche (cioè globuli rossi di volume MCV < 76 micron<3>;

e quindi per la concentrazione di emoglobina (Hb) in ogni globulo rosso:

- anemie nonnocromiche (quindi con normale concentrazione emoglobinica per globulo di 27 picogrammi);

- anemie ipercromiche (quindi con concentrazione accresciuta di Hb);

- anemie ipocromiche (quindi con concentrazione ridotta di Hb).

In ogni caso, l'anemia può essere sostanzialmente divisa,in:

I) Anemie da diminuita produzione di globuli rossi;

ii) Anemie da aumentata distruzione;

ni) Anemie dovute a perdita.

Al contrario, la policitemia provoca un aumento della produzione dei globuli rossi e quindi un aumento dell'ematocrito.

L'anemia non è causa diretta di un valore alto di velocità di eritrosedimentazione (VES), quanto il fatto che i globuli rossi, aggregandosi, formano dei rouleaux e quindi, come descritto da Stokes, ne provocano la sedimentazione con aumentata velocità, fenomeno visibile indirettamente con il noto metodo di Westergren.

In riferimento al metodo di Westergren, la letteratura ha descritto tipi di anemia in cui la VES è aumentata, altri in cui è assente. Ad esempio la VES è aumentata nell'anemia megaloblastica piuttosto che in quella sideropenica. Invece, una marcata policitemia ne inibisce la sedimentazione.

Allo stesso modo, marcate modifiche alla forma dei globuli rossi ne inibiscono la sedimentazione come, ad esempio, l'anemia sferocitica, la falciforme, così pure la sedimentazione è ridotta nella microcitemia talassemica. Da quanto sopra si può concludere che presenza di anemia non equivale necessariamente ad aumentati valori di VES. E' evidente che i globuli rossi, sottoposti alla forza di gravità, anche in mancanza di aggregazione, sedimenteranno ma ad una velocità che il metodo di Westergren non sarà in grado di apprezzare.

In base a tutte le considerazioni sopra esposte, lo scopo del presente trovato è quello di ottenere una rilevazione, la più possibile oggettiva e rigorosa, di stati di anemia di un campione ematico utilizzando le informazioni desumibili dalla rilevazione della velocità di eritrosedimentazione in particolare nel momento in cui si provoca la disgregazione dei rouleaux eventualmente formatisi. Tale disgregazione dei rouleaux può essere ottenuta ad esempio, ma non solo, utilizzando il metodo e l'apparato descritti nella domanda di brevetto europeo EP-A-1.098.188 (EP'188) a nome della Richiedente; oppure il metodo che utilizza il sistema a cella con agitatore descritto nell'US-A-4.352.557; od ancora il metodo che utilizza un sistema a vibrazione selettivamente attivabile ed associato ad un contenitore del campione ematico, o più in generale un qualsiasi metodo che determina, dopo una fase transitoria di aggregazione dei rouleaux, dovuta ad uno stato di quiete, una disgregazione dovuta ad una istantanea interruzione dello stato di quiete.

Per ottenere tale scopo, ed altri vantaggi nel seguito evidenziati, la Richiedente ha ideato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato essenzialmente nella rivendicazione principale.

Altre caratteristiche innovative del trovato sono espresse nelle rivendicazioni secondarie.

Nel seguito della descrizione, si farà principalmente riferimento, come metodo applicativo, all'apparato di rilevazione ottica dell'assorbenza ottica descritto nel sopra menzionato EP-A1.098.188; il trovato, come detto, può essere utilizzato impiegando anche altri sistemi di interruzione dello stato di quiete di un campione ematico, ad esempio quello a cella dell'US'557, od altri ancora.

In particolare, in fig. 1 si è rappresentato un fotometro utilizzabile nel metodo secondo il presente trovato, in fig. 2 un diagramma sillectrometrico, in fig. 3 un diagramma del fattore di anemia ed in fig. 4 un diagramma dell'ematocrito fotometrico.

Secondo il trovato, il metodo e l'apparato descritti nellΈΡ' 188 consentono di valutare, in modo rapido, semplice e riproducibile, non solo un valore di aggregazione della parte corpuscolare del sangue, da cui ne discende il valore di VES espresso in mm/h, ma anche un valore di "difficoltà di aggregazione" dei globuli rossi (difficoltà a formare rouleaux). Tali valori sono, con una probabilità molto elevata, rappresentativi e collegabili a patologie presenti nel soggetto da cui il campione ematico è stato prelevato.

Per una maggior comprensione del fenomeno, si faccia riferimento alla tabella che segue, relativa alle principali caratteristiche della parte corpuscolare del sangue, da cui si ricava che mediamente circa il 98% di tale parte corpuscolare è rappresentato dai globuli rossi, mentre il restante 2 % dalle altre cellule.

Filosofia del Fattore di Anemia (Anaemia Factor)

Sono stati misurati 362 campioni ematici valutando fotometricamente la densità del sangue intero, impiegando nel caso specifico il fotometro dell'apparato descritto nell'ΕΡ'188 (fig. 1), che utilizza un percorso ottico di 0,8 nun.

In sintesi, l'apparato 10 comprende un tubo capillare 12 attraverso il quale viene fatto scorrere un campione ematico prelevato da un organo di prelievo 11 che agisce direttamente su una parte di prelievo del corpo umano, o su un raccoglitore 21, ove sono contenute una pluralità di provette 22, selezionabili mediante attivazione di un motore 23. Lungo il tubo capillare 12 è previsto un sistema di rilevazione ottico comprendente un emettitore di luce 16 ed un coniugato ricevitore 17. Al tubo capillare 12 è inoltre associato un organo di pompaggio 14 che determina il prelievo del campione ematico ed il suo transito attraverso il tubo capillare 12, nonché l'interruzione istantanea del flusso per provocare l'aggregazione e la formazione dei rouleaux. A valle dell'organo di pompaggio 14 è previsto un condotto di scarico 15 per il campione ematico.

L'apparato 10 comprende inoltre un'unità di comando e controllo 18 che gestisce il funzionamento dell'apparato 10 ed elabora le informazioni acquisite, costruendo la curva di assorbenza del campione ematico dopo l'interruzione del flusso sanguigno e la formazione dei rouleaux.

La curva di assorbenza, in modo noto, come descritto ad esempio nel summenzionato US'557, è rappresentata dal sillectogramma illustrato in fig. 2, in cui il punto P rappresenta l'istante di interruzione del flusso sanguigno, ovvero il momento di massima disgregazione dei rouleaux formatisi durante il normale flusso non ostacolato.

In termini di assorbanza, sono stati misurati valori che vanno da 0,5 a 0,95. La causa principale dell'assorbimento della luce nel fotometro è determinata dalla presenza dei globuli rossi, elementi cellulari che, come visto sopra, costituiscono il componente principale (98% - vedere Tabella 1) della parte corpuscolata e la cui densità è determinata dalla quantità di emoglobina singolarmente presente.

Sugli stessi campioni è stato eseguito l'esame dell ’emocromo, utilizzando nel caso specifico il contaglobuli Coulter MAXM, per determinare i principali parametri di sangue quali, il conteggio dei globuli bianchi (WC), dei globuli rossi (RC), del valore di ematocrito (Hct), dell'emoglobina (Hb), ecc. E' noto che in condizioni normali il valore assoluto dell'ematocrito è circa 3 volte superiore al valore dell'emoglobina, mentre in presenza di talune anemie questo equilibrio può variare in più (anemia ipercromica), o in meno (anemia ipocromica).

Strumento ;

La legge di Lambert-Beer è una relazione empirica che correla la quantità di luce assorbita da un mezzo per la sua natura chimica, per la sua concentrazione e per lo spessore del mezzo attraversato. Nei fotometri (spettrofotometri, colorimetri, turbidimetri ) quando un fascio di luce (mono o policromatico) di intensità "I0" attraversa uno strato di spessore "L" del campione in analisi da misurare, in questo caso il campione ematico, una parte di esso viene assorbita dal mezzo stesso e una parte ne viene trasmessa con intensità residua "1/'. Il rapporto tra l'intensità luminosa trasmessa attraverso il mezzo e quella emessa è detto Trasmittanza, e la formula che la esprime è la seguente:

T = Ι,/Ι,,

Quando T è pari al 100% significa che la luce attraversa un campione trasparente.

Un altro parametro utilizzato è 1'Assorbenza, il quale rappresenta la quantità di luce assorbita dal campione analizzato ed è espresso dalla formula: A = log(1/T)*L = log(Io/Ij)*L

dove L è la lunghezza del cammino ottico (spessore) che per convenzione è pari a 1, equivalente ad 1 centimetro.

Tale misura esprime direttamente la concentrazione del campione, quando quest'ultimo si trova in una specifica ed idonea concentrazione.

Infatti, la massima accuratezza del fotometro è espressa con un valore pari a 36,8% di trasmittanza e, operativamente, tra il 20% e l'80% dei casi, l'errore relativo è contenuto entro il ± 2%.

Al fine di poter utilizzare lo strumento in questo ottimale intervallo di misura, il campione analitico viene opportunamente diluito, per essere cosi adattato al mezzo di misura.

Poiché la misura della VES può essere determinata solo sul campione ematico primario nativo e del quale non possono essere fatte diluizioni, al fine di adattarlo allo strumento di misura, nel presente trovato è stata studiata una particolare dimensione del percorso ottico (L) per far rientrare l'utilizzo dello strumento nel predetto ottimale intervallo di misura.

L'utilizzo di un percorso ottico (L) di 0,8 mm ha consentito di utilizzare il microfotometro dello strumento di rilevazione della VES descritto nellΈΡ' 188 nell'intervallo relativo di assorbenza 0,500 ÷ 0,950.

Metodo:

In considerazione del fatto che questa misura fotometrica è influenzata, in maniera prevalente, dal numero dei globuli rossi, quindi dall'ematocrito, e dal relativo valore di emoglobina, è stata costruita una curva (fig. 3) di corrispondenza che lega questi valori dell'emocromo con il valore di assorbanza misurata dall'apparato illustrato in fig. 1.

Ne risulta una curva di corrispondenza dei valori, espressa nella forma numerica descrivibile con l'equazione:

Y = 15,59x<6>'<55>, con una correlazione R<2>= 0,87.

Confrontando la curva ottenuta sopra con quella risultante dalla misura dei valori di ematocrito ottenuta, come detto, con lo strumento contaglobuli Coulter MAXM (si veda la fig. 3), si è potuto ricavare, come si vedrà dalla tabella di comparazione fornita nel seguito, che la misura dell'assorbenza ottica, ottenuta con il suddetto strumento fotometrico, fornisce valori di anemia sufficientemente coerenti ed affidabili.

Considerando esclusivamente il valore di ematocrito, ne discende una forma numerica esprimbile con l'equazione Y = 68,388x<3>'<2754>, con una correlazione R<2>= 0,8737.

Sperimentalmente, come visibile nel grafico di fig. 4, valori di ematocrito e/o di emoglobina bassi, con valori di assorbenza misurati dal fotometro illustrato in fig. 1 compresi tra 0,500 e 0,800, permettono di costruire una curva in cui la dispersione di dati è contenuta in un ristretto ambito di valori.

Sono stati applicati i predetti algoritmi di calcolo e sono state eseguite delle misure indipendenti su 362 campioni ematici, con il contaglobuli, per ottenere i valori di ematocrito e di emoglobina, allo scopo di costruire i valori di riferimento, e con l'apparato illustrato in fig. 1 per ottenere i corrispondenti valori di assorbenza.

Ponendo a 4,5 i due fattori di anemia, quello ottenuto elaborando i valori di ematocrito e di emoglobina con quello ottenuto dalla applicazione della formula numerica Y=15,59x<6>'<55>ai valori di assorbanza, si sono ottenute le seguenti prestazioni analitiche.

In altre parole, per la determinazione di un fattore di anemia si è dimostrata una concordanza del 93% fra i risultati ottenuti dallo studio della curva di assorbenza, rispetto a quelli ottenuti con la misura dell'ematocrito, che ovviamente richiede tempi molto più lunghi, strumentazione più complessa e procedure dei elaborazione più sofisticate. Lo studio implementato, basato sulla costruzione di una curva di assorbenza, consente pertanto di valutare un livello di allarme determinato dalla misurazione fotometrica di detta parte corpuscolata, dell'ematocrito e dell'emoglobina, quale agente adatto alla segnalazione di detto "Anaemic Factor". Detto "fattore di anemia" può essere considerato anche un indicatore di buon funzionamento per i normali contaglobuli, poiché il suo risultato posto a riferimento o controllo dei due dati forniti separatamente, ovvero ematocrito ed emoglobina, può rilevare, se difformi dallo stato indicato, delle anomalie strutturali o funzionali dei singoli canali di misurazione.

Il fattore di anemia, nelle verifiche effettuate, presenta un valore al di sotto del quale esiste la conferma di valori bassi o di ematocrito o di emoglobina nelle risultanze finali e quindi conferma la sua funzione di allarme per la convalida del dato clinico fornito dalle singole misurazioni con il contaglobuli ed illustra un potenziale quadro clinico non evidenziabile dalla sola misurazione della VES secondo Westergren.

Allo stesso modo il "fattore di anemia" può essere utilizzato per segnalare un quadro clinico inverso, ossia un aumentato valore dell'ematocrito, la policitemia.

Al trovato fin qui descritto possono essere apportate modifiche e varianti che rientrano nel campo protetto dalle rivendicazioni che seguono.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la rilevazione di stati di anemia presenti in un campione ematico, caratterizzato dal fatto che prevede le seguenti fasi: - disporre detto campione ematico in una sede di contenimento associata ad un sistema di rilevazione ottica comprendente almeno un emettitore di luce (16) e un coniugato ricevitore di luce (17); - provocare la disgregazione dei rouleaux formatisi tramite una interruzione dello stato di quiete del campione ematico; - costruire la curva dell'assorbenza ottica, o quantità di luce assorbita, del campione ematico in corrispondenza dell'istante (P) di massima disgregazione di detti rouleaux; - identificare un valore di anemia e correlarlo ai dati relativi all'assorbanza come definiti lungo detta curva per definire un fattore in base al quale definire o meno uno stato di anemia.
2. 2. Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la curva che descrive 1'assorbanza in termini di detto fattore di anemia è esprimibile con la formula Y = 15,59x<6>'<55>, con una correlazione R<2>= 0,87.
3. 3. Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizza to dal fatto che detta sede di contenimento del campione ematico è costituita da un tubo capillare (12) e detta interruzione dello stato di quiete è ottenuta mediante una interruzione del flusso sanguigno attraverso detto tubo capillare (12).
4. 4. Metodo come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto tubo capillare (12) definisce un percorso ottico (spessore) pari a 0,8 mm, il quale determina un intervallo relativo di assorbenza ottica compreso tra 0,500 e 0,950.
5. 5. Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta sede di contenimento del campione ematico è costituita da una cella di contenimento associata ad una sistema di agitazione selettivamente attivabile.
6. 6. Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta sede di contenimento è costituita da un contenitore associato ad un sistema a vibrazione selettivamente attivabile.
7. 7. Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fattore di anemia è pari a 4,5.
8. 8. Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto campione ematico è sangue nativo non diluito.
9. 9. Metodo per la rilevazione di stati di anemia presenti in un campione ematico, sostanzialmente come descritto, con riferimento agli annessi disegni.