DE10323901A1

DE10323901A1 - Verfahren und Testmittel zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von Biomolekülen und/oder Wirkstoffen in Flüssigkeitsproben

Info

Publication number: DE10323901A1
Application number: DE10323901A
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr. Schobel; Ilona Dr. Kühlmann-Rabens; Friedhelm Dr. Struck
Original assignee: INST VIRION SERION GmbH; INSTITUT VIRION/SERION GmbH
Current assignee: INST VIRION SERION GmbH; INSTITUT VIRION/SERION GmbH
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2003-05-26
Publication date: 2005-01-05
Also published as: EP1627228A1; US20060286683A1; WO2004106931A1; CN1756958A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, bei dem Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen/Wirkstoffen beladen sind, bereitgestellt werden, die Trägerpartikel mit zu untersuchenden bzw. nachzuweienden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und/oder dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, die sich in derselben oder verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequentiell in Kontakt gebracht werden, wobei die ersten und/oder dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe mit einer und/oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markiert sind, und nach einer oder mehreren Reaktionszeiten, in der die in Kontakt gebrachten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe binden können, eine Größe analysiert wird, aus der auf das Vorhandensein und/oder die Menge der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe geschlossen werden kann. Erfindungsgemäß werden die Trägerpartikel in getrockneter, vorzugsweise gefriergetrockneter, Form vordosiert bereitgestellt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Testmittel zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren und ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Testmittel.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, bei dem Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, bereitgestellt werden, die Trägerpartikel mit einer Flüssigkeit, die zu untersuchende bzw. nachweisende erste Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthält, in Kontakt gebracht werden, wobei die ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe markiert sind, oder die Trägerpartikel mit zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und mit dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, die sich in derselben oder in verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequentiell in Kontakt gebracht werden, wobei die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe markiert sind, und nach einer Reaktionszeit, in der die in Kontakt gebrachten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe binden können, eine Größe analysiert wird, aus der auf die Menge der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe geschlossen werden kann. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Testmittel zur Verwendung in einem solchen Verfahren und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Testmittels.

In DE 33 22 373 C2 und EP 0 126 450 ist ein Verfahren beschrieben, welches die simultane Bestimmung von mehreren Antigenen und/oder Antikörpern aus einer Probe ermöglicht. Eine Mischung aus Partikeln, die mit unterschiedlichen Antikörpern und/oder Antigenen beschichtet sind, wird mit einer Flüssigkeit gemischt, die die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper enthält. Nach einer definierten Reaktionszeit, in der die nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper von den an die Partikel beschichteten Antikörpern bzw. Antigenen gebunden werden, erfolgt die Identifizierung der gebundenen Antigene bzw. Antikörper durch Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und/oder Antigenen, die mit den nachzuweisenden bzw. zu untersuchenden Antigenen bzw. Antikörpern spezies-spezifisch reagieren. Die Analyse der Markierungen der einzelnen Partikel erfolgt mit Hilfe von speziell für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometern. Aus dieser Analyse kann auf die Beschaffenheit bzw. auf das Vorhandensein von zu untersuchenden Antigenen bzw. Antikörpern rückgeschlossen werden. Durch geeignete Auswahl der Antikörper bzw. Antigene, mit denen die verwendeten Partikel beladen sind, können vorbestimmte gewünschte Eigenschaften der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. ihrer Inhaltsstoffe untersucht werden. Je nachdem, welche Antigene bzw. Antikörper in der zu untersuchenden Flüssigkeit nachgewiesen bzw. analysiert werden sollen, können Testpartikel, die mit entsprechend korrespondierenden Antikörpern bzw. Antigenen beladen sind, verwendet werden.

Im folgenden werden zur leichten Unterscheidung die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Biomoleküle bzw. Wirkstoffe als „erste" Biomoleküle bzw. Wirkstoffe bezeichnet. Die Biomoleküle bzw. Wirkstoffe, mit denen die Trägerpartikel beladen sind, werden als „zweite" Biomoleküle bzw. Wirkstoffe bezeichnet, und diejenigen Biomoleküle bzw. Wirkstoffe, deren Markierung ggf. zur Analyse ausgewertet wird, werden als „dritte" Biomoleküle bzw. Wirkstoffe bezeichnet.

Unter dem Begriff „Biomolekül" werden dabei alle Moleküle verstanden, die biologischen Ursprungs sind, also z. B. Antigene, Antikörper, DNA, DNA-Fragmente, etc.

Unter dem Begriff „Wirkstoffe" sind alle Moleküle zu verstehen, die nicht biologischen Ursprungs sind, jedoch z. B. zu therapeutischen Zwecken Lebewesen appliziert werden können (z. B. synthetische Medikamente).

Das bekannte Verfahren umfaßt folgende Schritte:

– Dispensierung der Mischung aus Partikeln, die mit zweiten Antikörpern/Antigenen beschichtet sind, in ein Reaktionsgefäß,
– Zugabe einer Flüssigkeit, die die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Antigene/Antikörper enthält,
– Inkubation,
– Waschen der Partikel nach Ende der Reaktionszeit zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen,
– Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten dritten Antikörpern und/oder Antigenen, die mit den nachzuweisenden oder zu untersuchenden ersten Antigenen/Antikörpern spezies-spezifisch reagieren,
– Inkubation,
– Waschen zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen, und
– Analyse der Markierungen der einzelnen Partikel mit Hilfe von speziell für Partikel-Messungen abgestimmten Durchflußzytometern.

Zu Beginn des Analyseverfahrens ist eine Dispensierung der mit Biomolekülen/Wirkstoffen beschichteten Partikel bzw. Partikelmischung in ein Reaktionsgefäß vorzunehmen. Dieser Pipettierschritt beeinflußt die Testqualität ganz entscheidend, da hiermit die Konzentration der auf den Partikeln beschichteten Biomolekü len/Wirkstoffen in der Testlösung festgelegt wird. Die Konzentration der auf den Partikeln beschichten Biomolekülen/Wirkstoffen in der Testlösung hat Einfluß auf die Testeinstellung und das Testniveau und damit die Bewertung des untersuchten Probenmaterials. Von der Testeinstellung abweichende Partikelzahlen haben auch Einfluß auf die Zählraten z. B. bei der Analyse in einem Durchflußzytometer.

Werden die zu dispensierenden Partikel z. B. in wäßrigen Pufferlösungen (z. B. PBS) geliefert, kommt es aufgrund der höheren Dichte der Partikel (z. B. 1,05 g/ml für Partikel aus Polystyrol) zu einem Sedimentationsprozeß. Vor der Weiterverwendung muß somit eine Homogenisierung der Suspension durchgeführt werden, wobei das Schäumen der Suspension und die Bildung von Luftblasen sorgfältig vermieden werden muß. Im darauffolgenden Prozeß muß darauf geachtet werden, daß eine erneute Sedimentation der Partikel vermieden wird.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren, ein verbessertes Testmittel und Herstellungsverfahren für das Testmittel anzugeben, mit denen eine vereinfachte Verfahrensführung bei gleichzeitig hoher Richtigkeit und Präzision möglich ist.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1, einem Testmittel mit den Merkmalen des Anspruches 9 bzw. einem Herstellungsverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 16 gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die mit den zweiten Biomolekülen bzw. Wirkstoffen beladenen bzw. beschichteten Trägerpartikel vordosiert in getrockneter Form bereitgestellt. Ein Labormitarbeiter kann so auf die vordosierte Menge der beschichteten Trägerpartikel zurückgreifen, ohne daß er zunächst in einem aufwendigen Pipettierschritt die Menge der Trägerpartikel genau festlegen müßte. Der Schritt der genauen Festlegung der Menge der Trägerpartikel wird im Vorhinein bei der Herstellung entsprechender Testmittel vorgenommen. Bei der Untersuchung bzw. dem Nachweis der Biomoleküle und/oder Wirkstoffe unter Verwendung des so vordosierten Testmittels ist dieser besonders kritische und fehler intensive Schritt also nicht mehr notwendig und kann auch unter vereinfachten Bedingungen ohne große Expertise durchgeführt werden.

Wird die vordosierte Menge der Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form bzw. getrockneter Form bereitgestellt, so ist zudem eine verlängerte Haltbarkeit der zweiten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe gegeben, mit denen die Trägerpartikel beschichtet sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Untersuchung z. B. der Menge einer vorhandenen Sorte von Biomolekülen bzw. Wirkstoffen bzw. zum Nachweis, ob überhaupt entsprechende Biomoleküle oder Wirkstoffe enthalten sind, verwendet werden. Dabei kann die vordosierte Menge Trägerpartikel enthalten, die unterschiedlich beladen sind und so zum Nachweis bzw. zur Untersuchung unterschiedlicher erster Biomoleküle und/oder Wirkstoffe eingesetzt werden.

Es können dazu zweite Biomoleküle und/oder /Wirkstoffe eingesetzt werden, die zu den ersten zu untersuchenden bzw. ggf. nachzuweisenden Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und/oder dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen komplemetär sind. Als komplementär werden dabei derartige Biomoleküle oder Wirkstoffe bezeichnet, die über eine Kovalente, Affinitäts- bzw. Hybridisierungsreaktion weitere Biomoleküle und/oder Wirkstoffe binden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenso eingesetzt werden, um zu prüfen, ob in der Flüssigkeitsprobe eine bestimmte Sorte Biomoleküle bzw. Wirkstoff enthalten ist, indem Trägerpartikel mit zweiten Biomolekülen/Wirkstoffen eingesetzt werden, die mit den ggf. nachzuweisenden ersten Biomolekülen/Wirkstoffen reagieren würden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch im Rahmen einer kompetitiven Reaktion eingesetzt werden. Bei einem solchen Test sind die dritten Moleküle komplementär zu den ersten und zweiten (bzw. die zweiten Moleküle sind komplementär zu den dritten, jedoch nicht zu den ersten). Bei einer solchen kompetitiven Reaktion, bei der die ersten und zweiten Moleküle sehr ähnlich oder sogar gleich sind, stehen die ersten bzw. zweiten Moleküle um die Bindung zum markierten komplementären dritten Molekül in Kompetition. Ist kein erstes Molekül in der Flüssigkeit enthalten, binden alle dritten Moleküle an die zweiten Moleküle und damit an die Trägerpartikel und werden detektiert. Sind andererseits viele erste Moleküle vorhanden, binden alle dritten Moleküle an die ersten Moleküle und nicht an die zweiten und somit nicht an die Trägerpartikel und werden somit nicht detektiert.

Die Bereitstellung der Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form ist besonders einfach zu bewerkstelligen und präzise.

Entweder die ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in der Flüssigkeit oder dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe sind mit einer oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markiert, z. B. mit einem fluoreszierenden Bestandteil.

Die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel können in Reaktionsgefäßen bereitgestellt werden, die ohne weitere zusätzliche Maßnahmen direkt zur Analyse der zu untersuchenden Flüssigkeit eingesetzt werden können, z. B. Mikro-Titerplatten oder Röhrchen. Der Laborant muß dann nur noch das Reaktionsgefäß mit der vordosierten und vorbekannten Menge an gefriergetrockneten Trägerpartikeln mit der zu untersuchenden Flüssigkeit in Kontakt bringen, ohne daß ein Umfüllprozeß oder eine Mengenbestimmung notwendig wäre.

Bei einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Presslinge verwendet, die die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel in vordosierter Form enthalten. Diese Presslinge sind leicht zu handhaben und können in beliebigen Reaktionsgefäßen eingesetzt werden. Zudem ist eine individuelle Zusammenstellung der Partikelmischungen möglich, wenn z. B. mehrere Presslinge verwendet werden, die jeweils gefriergetrocknete Trägerpartikel umfassen, die mit unterschiedlichen Biomolekülen bzw. Wirkstoffen beladen sind.

Nach der bzw. den Reaktionszeiten der ersten und/oder dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe mit den an den Trägerpartikeln gebundenen zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen wird das Resultat untersucht, um Information über das Vorhandensein bzw. die Beschaffenheit der ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in der zu untersuchenden Flüssigkeit zu erhalten. Dazu können unterschiedliche Parameter untersucht werden. Zum Beispiel können unterschiedlich große Trägerpartikel mit unterschiedlichen zweiten Biomolekülen bzw. Wirkstoffen beladen sein und in einer Mischung verwendet werden. Nach den Reaktionszeiten sind an diesen Trägerpartikeln unterschiedliche erste Biomoleküle und/oder Wirkstoffe und gleiche dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe gebunden. Entsprechend kann durch Analyse der Größe der Trägerpartikel auf die Art und durch Analyse der charakteristischen Größe der ersten und/oder dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe auf die Menge der ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in der zu untersuchenden Flüssigkeit zurückgeschlossen werden. Die Trägerpartikel können sich andererseits auch durch einen zusätzlichen z. B. fluoreszierenden Bestandteil unterscheiden. Werden Trägerpartikel, die mit unterschiedlichen zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, auch mit unterschiedlich fluoreszierenden Bestandteilen versehen, läßt sich aufgrund der unterschiedlichen Fluoreszenz der Trägerpartikel auf die Art und durch Analyse der charakteristischen Größe der ersten und/oder dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe auf die Menge der ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in der zu untersuchenden Flüssigkeit zurückschließen. Die Kodierung der Trägerpartikel geschieht z. B. in bekannter Weise durch Einbringen des Fluorophoren in die Partikel oder durch Anhängen fluoreszierender Nanopartikel an die Oberfläche der Trägerpartikel. Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren jedoch vereinfachen, wenn zusammen mit den vordosierten Trägerpartikeln eine vordosierte Menge dritter Biomoleküle und/oder Wirkstoffe, die aus einer oder mehreren Komponenten bestehen können und mit einer oder mehreren charakteristischen Größen markiert sind und dabei eine oder mehrere zu den zweiten und/oder ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen komplementäre Strukturen aufweisen, in getrockneter bzw. gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden.

Die vordosierten dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe sind dann je nach Ausgestaltung des Verfahrens z. B. in den Presslingen oder in den vorgefertigten Reaktionsgefäßen, in denen sich die Trägerpartikel befinden, mit enthalten und können aus einer oder mehreren Komponenten bestehen.

Die charakteristische Markierung kann z. B. Fluroeszenz, Phosphoreszenz, Bio-, Chemielumineszenz, Chromophore, Radioaktivität oder Enzymaktivität umfassen.

Bei einer solchen Verfahrensführung, in der markierte dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe bereits mit den vordosierten Trägerpartikeln bereitgestellt werden, ist eine weitere Verringerung der Fehler durch Einsparung eines weiteren Dispensierschrittes gewährleistet. Zusätzlich wird die Testbearbeitung durch Reduktion der Anzahl der Verfahrensschritte weiter vereinfacht. Bei einer solchen vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens sind im Gegensatz zu den oben geschilderten Verfahrensschritten des Standes der Technik nur noch die Zugabe einer Flüssigkeit, die ggf. die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthält, und die Analyse der Markierungen der einzelnen Partikel z. B. mit Hilfe von speziell für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometern notwendig.

Ein erfindungsgemäßes Testmittel zur Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Analyseverfahren zeichnet sich durch eine vordosierte Menge von Trägerpartikeln in getrockneter bzw. gefriergetrockneter Form z. B. als Pressling oder in einem Reaktionsgefäß aus. Dieses Testmittel kann von einem Laboranten ohne Pipettier- oder Dispensierschritt direkt verwendet werden, so daß in beschriebener Weise eine wesentliche Fehlerquelle reduziert ist. Solche Testmittel können in großen Mengen im Vorhinein hergestellt und als solche z. B. vertrieben werden.

Das Testmittel kann zusätzlich markierte dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthalten, die mit zu untersuchenden ersten Biomolekülen bzw. Wirkstoffen spezies-spezifisch reagieren können. Aus diesen besonderen Ausführungsformen der Testmittel ergeben sich die oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Vorteile in analoger Weise.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Testmittels zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt das Dispensieren von Trägerpartikeln in vorbestimmter Menge in ein Reaktionsgefäß und deren Trocknung bzw. Gefriertrocknung. Die Trägerpartikel können in einem zentralen Prozeß unter genau überwachten Bedingungen in die Reaktionsgefäße dispensiert werden und ggf. z. B. durch Ultraschall und/oder mechanisches Rühren homogenisiert werden. Durch die Trocknung bzw. Gefriertrocknung werden sie haltbar und einfach handhabbar gemacht.

Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Testmittels zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren werden Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen/Wirkstoffen beladen sind, getrocknet bzw. gefriergetrocknet und zu Presslingen geformt, die jeweils eine vorbestimmte Menge Trägerpartikel enthalten.

Im folgenden werden Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren und Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Testmittel im Detail erläutert.
1 zeigt den Temperatur- bzw. Druckverlauf bei der Gefriertrocknung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens.
Zur Analyse einer Flüssigkeit mit unbekannten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen oder mit unbekannter Menge einer Sorte von ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen greift ein Labormitarbeiter auf ein Reaktionsgefäß mit einer vordosierten Menge an Trägerpartikeln zurück, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, die mit den zu untersuchenden bzw. möglicherweise nachzuweisenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und/oder dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen spezifisch reagieren können. In einer Ausgestaltung sind in dem Reaktionsgefäß die Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form vorhanden. Der Labormitarbeiter bringt die zu untersuchende Flüssigkeit, die die ersten Biomole küle und/oder Wirkstoffe enthält, entweder gleichzeitig oder sequentiell mit den dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen in das Reaktionsgefäß ein. Nach einer oder mehreren typischen Reaktionszeiten kann eine Untersuchung der charakteristischen Größe z.B. in einem für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometer durchgeführt werden, um Rückschlüsse auf die Art und die vorhandene Menge an zu untersuchenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen zu erhalten.
Bei einer anderen Ausgestaltung sind in dem Reaktionsgefäß sowohl die Trägerpartikel als auch die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in gefriergetrockneter Form vorhanden. Der Labormitarbeiter bringt die zu untersuchende Flüssigkeit, die die ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthält, in das Reaktionsgefäß ein. Nach einer typischen Reaktionszeit kann eine Untersuchung der charakteristischen Größe z.B. in einem für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometer durchgeführt werden, um Rückschlüsse auf die Art und die vorhandene Menge an zu untersuchenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen zu erhalten.
Bei einer anderen Verfahrensführung greift der Labormitarbeiter auf einen vorbereiteten Pressling zurück, der die Trägerpartikel enthält, die mit komplementären zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, die mit den zu untersuchenden bzw. möglicherweise nachzuweisenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und/oder dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen spezifisch reagieren können. In einer Ausführungsform sind in dem Pressling die Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form vorhanden. In einer weiteren Ausführungsform sind in dem Pressling sowohl die Trägerpartikel als auch die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in gefriergetrockneter Form vorhanden. Der Benutzer kann ein beliebiges Reaktionsgefäß verwenden, in welches er die Presslinge zur Analyse überführt. Im Falle von Presslingen, die nur eine Sorte mit komplementären zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladene Trägerpartikel enthalten, kann die Mischung der Trägerpartikel durch Kombination entsprechender Trägerpartikel/Presslinge in einem Reaktionsgefäß individuell hergestellt werden. Die weiteren Verfahrensführungen entsprechen den oben geschilderten Ausgestaltungen.
Zum Beispiel beim Nachweis von Nukleinsäuresequenzen (z. B. DNA) können bei einer Ausgestaltung auch bereits die ersten zu untersuchenden/nachzuweisenden Biomoleküle/Wirkstoffe fluoreszenzmarkiert sein. Bei einem solchen Test wird die nachzuweisende DNA zunächst amplifiziert. Dieser Schritt kann mit bereits fluoreszenzmarkierten Primern erfolgen, so daß die Amplifikate der nachzuweisenden DNA (also der ersten Biomoleküle) bereits einen Fluorophor enthalten. An die erfindungsgemäß aufbereiteten Trägerpartikel sind zweite Biomoleküle (DNA) gekoppelt. Bei einer Ausführungsform eines solchen Testes binden die fluoreszenzmarkierten Amplifikate (erste Biomoleküle) direkt an die zweite DNA an den Trägerpartikeln. Bei einer solchen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Testsystems sind keine dritten Biomoleküle vorgesehen, so daß sich in dem gefriergetrockneten Testmittel nur die mit den zweiten Biomolekülen beladenen Trägerpartikel befinden. Andererseits können bei einer weiteren Ausführungsform eines solchen Testes markierte und nicht markierte dritte DNA-Moleküle eingesetzt werden, die als Brücke zwischen den ersten und zweiten Molekülen fungieren, so daß bei einer solchen Ausführungsform das gefriergetrocknete Testmittel mit zweiten Biomolekülen beladene Trägerpartikel und markierte oder nicht markierte dritte DNA-Moleküle umfaßt.
Bei allen Ausgestaltungen können zur Entfernung ungebundener Substanzen nach den jeweiligen Reaktionszeiten an sich bekannte Waschschritte durchgeführt werden.
Die verwendeten Testmittel werden z. B. an zentraler Stelle hergestellt oder als solche vertrieben, so daß sie im Labor ohne weiteren Dispensier- oder Pipettierschritt direkt verwendet werden können. Die Herstellung der Testmittel geschieht dabei wie folgt.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems werden die Trägerpartikel unter genau überwachten Bedingungen in Reaktionsgefäße dispensiert, wobei ein spezielles Puffer-Stabilisator-System (z.B. 50 mM Phosphatpuffer, 150 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid, 8 g/L Gelatine Hydrolysat, pH 7,4, zusätzlich Gerüstbildner und Hilfsstoffe wie z.B. Saccharose, Phenylalanin) ver wendet wird und die Homogenisierung der Trägerpartikel durch Ultraschall und/oder mechanisches Rühren erfolgt. Anschließend werden die vordosierten Trägerpartikel durch die Technik der Gefriertrocknung oder Trocknung haltbar gemacht. Dabei wird z. B. ein Temperatur- und Druckprofil eingesetzt, wie es der 1 zu entnehmen ist. Je nachdem, für welche Analysen das jeweilige Testmittel eingesetzt werden soll, können Partikel mit nur einer Sorte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe beladen sein oder eine Mischung von Partikeln darstellen, die mit unterschiedlichen Biomolekülen/Wirkstoffen beladen sind.
Zur Herstellung einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testmittels werden die gefriergetrockneten Partikel, die mit nur einer Sorte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe beladen sind oder eine Mischung von Partikeln darstellen, die mit unterschiedlichen Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, als Presslinge (z. B. in Form von Tabletten) zur Verfügung gestellt.
Für eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testmittels, bei dem die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe in dem Testmittel enthalten sein sollen, werden sowohl die Trägerpartikel als auch die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe unter Verwendung eines speziellen Puffer-Stabilisator-Systems unter genau überwachten Bedingungen in die Reaktionsgefäße dispensiert und anschließend durch die Technik der Gefriertrocknung oder Trocknung haltbar gemacht. In analoger Weise können entsprechende Presslinge hergestellt werden.

Claims

Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, bei dem a) Trägerpartikel bereitgestellt werden, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, b) die Trägerpartikel mit einer Flüssigkeit, die zu untersuchende bzw. nachzuweisende erste Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthält, in Kontakt gebracht werden, wobei die ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe mit einer und/oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markiert sind, oder die Trägerpartikel mit zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen und mit dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, die sich in derselben oder in verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequenziell in Kontakt gebracht werden, wobei die dritten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe mit einer und/oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markiert sind, und c) nach einer oder mehreren Reaktionszeiten, in der die miteinander in Kontakt gebrachten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe binden können, eine Größe analysiert wird, aus der auf das Vorhandensein und/oder die Menge der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomoleküle und/oder Wirkstoffe geschlossen werden kann, wobei die mit den zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladenen Trägerpartikel in getrockneter Form vordosiert bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form vordosiert bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß unterschiedlich beladene Trägerpartikel, die mit unterschiedlichen zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel als Presslinge bereitgestellt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, bei dem mehrere Presslinge verwendet werden, die sich durch die unterschiedliche Beladung der darin enthaltenen Trägerpartikel mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen unterscheiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel in Reaktionsgefäßen vordosiert bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die vordosierten Trägerpartikel zusammen mit einer vordosierten Menge mit einer oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markierten dritten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen in getrockneter bzw. gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden, die geeignet sind, mit zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen spezies-spezifisch zu reagieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem als charakteristische Markierungsgröße eine Fluoreszenzmarkierung eingesetzt wird und in Schritt c) die Fluoreszenz ausgewertet wird.
Testmittel zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von ersten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen, das Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, umfaßt, wobei die Trägerpartikel in getrockneter Form vordosiert sind.
Testmittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form vordosiert sind.
Testmittel nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es unterschiedlich beladene Trägerpartikel umfaßt, die mit unterschiedlichen zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind.
Testmittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmittel einen Pressling mit getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikeln umfaßt.
Testmittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmittel in einem Reaktionsgefäß vordosierte und getrocknete bzw. gefriergetrocknete Trägerpartikel umfaßt.
Testmittel nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmittel zusätzlich dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe enthält, die mit einer oder mehreren charakteristischen Markierungsgrößen markiert sind.
Testmittel nach Anspruch 14, bei dem die charakteristische Markierungsgröße ein fluoreszierender Bestandteil ist.
Verfahren zur Herstellung eines Testmittels nach Anspruch 9 zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, in ein Reaktionsgefäß in vorbestimmter Menge dispensiert und getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet werden.
Verfahren zur Herstellung eines Testmittels nach Anspruch 9 zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Trägerpartikel, die mit zweiten Biomolekülen und/oder Wirkstoffen beladen sind, getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet, und zu Presslingen geformt werden, die jeweils eine vorbestimmte Menge Trägerpartikel enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, bei dem zusammen mit den Trägerpartikeln dritte Biomoleküle und/oder Wirkstoffe getrocknet, bzw. gefriergetrocknet werden, die mit einer charakteristischen Markierungsgröße markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die charakteristische Markierungsgröße ein fluoreszierender Bestandteil ist.