DE69422210T2

DE69422210T2 - Biospezifischer Festphasenträger

Info

Publication number: DE69422210T2
Application number: DE1994622210
Authority: DE
Inventors: Antti Juhana Iitiae; Timo Nils-Erik Loevgren; Kim Sverker Immanuel Pettersson
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-02-16
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2014-02-17
Also published as: FI93781B; JPH06317593A; EP0617286B1; EP0617286A3; EP0617286A2; ES2139728T3; FI931198A0; DE69422210D1; FI93781C; FI931198A

Description

Die Erfindung betrifft ein biospezifisches Testverfahren, das die gleichzeitige Bestimmung einer Vielzahl von Analyten in der gleichen Probe erlaubt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Mikroteilchen können als ein Festphasenträger in verschiedenen Bioaffinitäts-Tests verwendet werden. Bei solchen Tests ist es oft nützlich oder notwendig, eine Vielzahl von gleichzeitigen Testreaktionen durchzuführen, um so die Wiederholung paralleler Testschritte unnötig zu machen. Eine Möglichkeit, eine Multiparameter-Analyse durchzuführen, wird durch die Verwendung von Mikroteilchen als Festphasenträger geboten (Soini E., US-PS 5 028 545). In einem solchen System sind die spezifischen Sonden an die Teilchen gebunden, wonach Teilchen mit unterschiedlichen Spezifitäten gemischt werden können. Die Mischung kann daher als ein Festphasenträger bei Bioaffinitäts-Tests verwendet werden. Bei der Durchführung der Messung nach Beendigung der Reaktion ist es wichtig, daß man soviele Teilchenkategorien mit unterschiedlichen Spezifitäten wie möglich identifizieren kann. Für die Zwecke der Identifikation können Eigenschaften, wie die Größe der Teilchen (McHugh, T. M. et al., J. Immunol. Methods 1986, 95: 57-61) herangezogen werden oder farbige Teilchen (Streefkerk J. G. Kors, N., Boden, D. Protides Biol. Fluids 1976, 24: 811-814) oder es können Teilchen verwendet werden, die mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen (Dean, K. J. et al., Clin. Chem. 1983, 29: 1051-1056) markiert sind.
Bei Bioaffinitäts-Reaktionen sind zwei biologische Moleküle fähig, sogar in Gegenwart von anderen Molekülen mit großer Genauigkeit zu binden. Solche Moleküle, die fähig sind, einander zu binden, sind z. B. Antikörper und deren entsprechende Antigene, einzelsträngige DNA-Moleküle und deren entsprechende Nukleinsäuresequenzen und Rezeptoren und die Moleküle, die spezifisch an diese binden. Allen diesen Reaktionen kann die allgemeine Bezeichnung Bioaffinitäts-Reaktionen gegeben werden.
Bioaffinitäts-Reaktionen werden für verschiedene praktische Anwendungen und in Tests für Forschungszwecke verwendet. Ein bekanntes Biomolekül, welches aus biologischem Material gereinigt werden kann (z. B. ein Antikörper) oder chemisch synthetisiert werden kann (z. B. eine Oligonukleotid-DNA) kann in einer Weise, die die Detektion nach Beendigung der Bioaffinitäts-Reaktion erlaubt, markiert werden. Gegenwärtig beinhalten die Hauptanwendungen von Bioaffinitäts-Reaktionen Immuntests und Nukleinsäurehybridisierungstests, die verwendet werden, um verschiedene Bestandteile, z. B. aus Blut, zu messen. Auf Rezeptoren als biologische Reaktanten basierende Tests sind wichtig für die Suche nach neuen medizinischen Substanzen.
Assays, die an Blut oder dessen Bestandteilen durchgeführt werden, können in Gruppen eingeteilt werden, die sich auf bestimmte Krankheiten oder medizinische Handlungen beziehen. Bei Multiparameter-Assays könnten die zu diesen Gruppen gehörenden Analyte, sogenannte Panels, gleichzeitig in der gleichen Probe getestet werden. Dies würde Einsparungen bei den Kosten der Tests ermöglichen, woraus eine größere Anzahl von Tests resultieren würde, die durchgeführt werden könnten, und was daher zu sichereren Diagnosen führt. Multiparameter-Assays würden ebenso deutlich weniger Arbeit bei der Durchführung der Tests erfordern und würden daher schnellere und sicherere Resultate ergeben.
Natürliche Untersuchungsobjekte für Tests unter Verwendung von DNA als biologischem Reaktanten würden Viren und vererbte Erkrankungen, die durch Mutationen in der cellulären DNA verursacht werden, sein. Besonders vererbte Erkrankungen können mehrfache DNA-Mutationen zeigen, und es wäre für die Diagnose von ererbten Erkrankungen zwingend, eine Reihe von DNA-Mutationen gleichzeitig in der gleichen Probe bestimmen zu können. Dies wäre besonders nützlich bei der Suche nach Trägern dieser Mutationen in großen Studien, die ganze Populationen umfassen.
Wegen der geringen Menge an DNA, die analysiert werden soll, muß der Genbereich vor der Identifikation des Bereichs oder der Mutationen oft aus der Probe amplifiziert werden. Verschiedene Genbereiche können gleichzeitig in derselben Reaktion amplifiziert werden. Multiparameter- Assays können in vorteilhafter Weise bei der Analyse solcher verschiedene Genbereiche enthaltenden Reaktiongemische angewandt werden.
Bei Multiparameter-Assays können Markierungen verwendet werden, deren Signale nach Beendigung der Bioaffinitäts- Reaktion auf der Basis von z. B. der Wellenlänge oder der Zerfallszeit des Signals aufgelöst werden können. Solche Test haben vorzugsweise unterschiedliche radioaktive Isotope (Morgan C. R., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1966, 123: 230-233; Wians, F. H., Dev, J., Powell, M. M. Heald, J. I., Clin. Chem. 1986, 32; 887-890), Enzymmarkierungen (Dean, K. J., Thompson, S. G., Burg, J. F., Buckler, R. T., Clin. Chem. 1983, 29: 1051-1056; Bates, D. I., Bailey, W. R, Internationale Patentanmeldung WO89/06802) und Markierungen, die kurzlebige Fluoreszens emittieren, verwendet. Solche Markierungen bringen jedoch oft Probleme mit sich wegen des Überlappens der Wellenlänge der zu messenden Signale (Isotope, Fluoreszensmoleküle), wegen der Nähe von Anregungs- und Emissionswellenlängen (Fluoreszensmoleküle), wegen unterschiedlicher optimaler Bedingungen (Enzymmarkierung) oder wegen Hintergrundfluoreszens des Materials (Markierungen, die kurzlebige Fluoreszens emittieren).
Solche Systeme haben im besten Falle nur zwei gleichzeitige Bestimmungen erlaubt.
Systeme, die eine Markierungstechnologie verwenden, die auf einer Zeit-aufgelösten Fluoreszens basiert, beruhen auf der langlebigen Fluoreszens der Seltenerdmetalle Fig. 1; Soini, E. und Lövgren, T., CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry 1987, 18(2): 105-154). Das Metall ist mit einem organischen Molekül, das fähig ist, Energie während der Anregung des Komplexes zu absorbieren, komplexiert. Andererseits muß der Ligand auch fähig sein, die Anregungsenergie auf das Metallion in dem Komplex zu übertragen. Die nützlichsten Erdmetalle für Zeit-aufgelöste Markierungen sind Eu, Sm, Tb und Dy. Die Energiestufen der Elektronen dieser seltenen Metalle sind am besten geeignet, die Anregungsenergie zu absorbieren, und andererseits sind Energieübergänge, die die langlebige Fluoreszens erniedrigen bei Komplexen dieser Erdmetalle geringfügig. Die Energieübergänge in den Grundzustand resultieren bei diesen Erdmetallen in einer aus einigen engen Banden unterschiedlicher Wellenlängen bestehenden Fluoreszens. Manche elektronische Übergänge sind jedoch aufgrund des Übergangs zum Grundzustand, verglichen mit anderen, bevorzugt, und daher besitzt die Mehrzahl der beobachteten Fluoreszens Bestandteile bestimmter Wellenlänge. Bei gleichzeitiger Messung der Reaktanten, die diese Zeit-aufgelösten Markierungen besitzen, bei Bioaffinitäts-Tests, kann der Effekt der kleineren Bestandteile der Meßresultate in einfacher Weise durch Rechenmethoden eliminiert werden. Bei Multiparameter-Assays unter Verwendung von Zeit-aufgelösten Markierungen konnten immerhin vier unterschiedliche Biomoleküle gleichzeitig mit der erforderlichen Sensitivität gemessen werden (Xu, Y. Y., Pettersson, K., Blomberg, K., Hemmilä, I., Mikola, H, und Lövgren, T., Clin. Chem. 1992, 38/10: 2038-2043).
Eine alternative Möglichkeit als Prinzip für Multiparameter-Assays ist durch die Verwendung von unterschiedlichen Festphasenträgern zur Unterscheidung spezifischer Sonden bei Bioaffinitäts-Tests verfügbar. Ein Festphasenträger kann in Domänen unterteilt werden, die jede eine Sonde bestimmter Spezifität enthält; unterschiedliche Festphasenträger können gleichzeitig in dem Test verwendet werden, oder der Festphasenträger kann auf Basis der Markierung in verschiedene Kategorien verteilt sein (Soini, E., US-PS 5 028 545). In dem letzten Beispiel trägt jede Festphasenkategorie eine Sonde unterschiedlicher Spezifität, gebunden an der Oberfläche. Die Anwendung dieses alternativen Prinzips auf Multiparameter-Assays bietet einige Vorteile, da jeder Bestandteil des Multiparameter-Systems getrennt hergestellt und dann kombiniert werden kann. Dies ist aus Sicht der Produktionstechnologie wichtig.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein biospezifisches Multiparameter-Assayverfahren, wobei Mikroteilchen verwendet werden, die in unterschiedlichen Kategorien verteilt sind und unterschiedliche Analyte repräsentieren, wobei in diesen Verfahren die Mikroteilchen mit einem fluoreszenten Molekül (1) markiert sind und wobei die Mikroteilchen aus unterschiedlichen Kategorien mit Bioaffinitäts-Reaktanten A, die unterschiedliche Analyte binden, beschichtet sind. In dem genannten Verfahren werden die Mikroteilchen der unterschiedlichen Kategorien gemischt, die zu analysierende Probe wird hinzugefügt, und schließlich werden die Bioaffinitäts-Reaktanten B, die mit einem fluoreszenten Molekül (2) markiert sind, hinzugefügt, entweder unverzüglich oder nach Vervollständigung der Reaktion zwischen dem Analyt- Molekül und dem Bioaffinitäts-Reaktant A. Die fluoreszenten Moleküle (1, 2) werden angeregt, und die Fluoreszensemissionen werden zur Bestimmung der Mikroteilchenkategorie und zur Messung des Gehalts an verschiedenen Analyten quantifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das Markieren der Mikroteilchen und der Bioaffinitäts- Reaktanten B mit unterschiedlichen Molekülen, die langlebige Fluoreszens emittieren (1, 2), charakterisiert.
Das biospezifische Multiparameter-Assayverfahren wird entweder in einem Schritt durchgeführt, wobei alle Komponenten der Reaktion gleichzeitig vorliegen, oder in zwei Schritten, wobei in diesem Falle der markierte Bioaffinitäts-Reaktant B nach der Vervollständigung der Reaktion zwischen dem Bioaffinitäts-Reaktanten A und dem Analytmolekül hinzugefügt wird.
Entsprechend einem nützlichen abgewandelten Verfahren wird die Zeit-aufgelöste Fluoreszens, d. h. ein Molekül, das langlebige Fluoreszens emittiert, zur Identifikation der Mikroteilchen-Kategorie und auch für das Markieren des Bioaffinitäts-Reaktanten B verwendet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Fluoreszens als Funktion der Zeit für langlebige und kurzlebige Fluoreszens.
Fig. 2 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve für Europium, wobei die Standards (EuCl&sub3;) in einer Fluoreszens-verstärkenden Lösung hergestellt wurden und die Fluoreszens über 1 Sekunde mit einem Zeit-aufgelösten Fluorometer gemessen wurde.
Fig. 3 zeigt die Wellenlänge, Verzögerungs- und Intensitätsprofile der Emission aus einer Mischung von PTA- cheliertem Eu&spplus;³, Tb&spplus;³, Sm&spplus;³ und Dy&spplus;³.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung verwendet die Zeit-aufgelöste Fluoreszens (Soini, E. und Lövgren, T, CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry 1987, 18(2): 105-154) für das Markieren der Teilchen oder anderer Typen von Festphasenträgern. Die Zeit-aufgelöste Fluoreszens erlaubt die Eliminierung der von den natürlichen verschiedenen Bestandteilen des Systems verursachten kurzlebigen Hintergrundfluoreszens. Wenn die Teilchen mit unterschiedlichen Konzentrationen, der Zeit-aufgelösten Markierung markiert werden, kann daher eine extrem geringe Konzentration der Markierung detektiert werden. Die Sensitivität und die hohe Linearität der Messung der Zeit-aufgelösten Fluoreszens erlauben die Messung der Zeit-aufgelösten Markierung über einen extrem großen Konzentrationsbereich. Fig. 2 zeigt die Dosis- Antwort-Kurve von Europium, wobei die Standards (EuCl&sub3;) in einer Fluoreszens-verstärkenden Lösung hergestellt wurden und die Fluoreszens über eine Sekunde mit einem Zeit- aufgelösten Fluorometer (1230 Fluorometer, LKB-Wallac, Turku, Finnland) gemessen wurde. Auf der anderen Seite ermöglicht ein breiter Konzentrationsbereich die Identifizierung einer Vielzahl von unterschiedlichen Kategorien bei der Unterscheidung der Festphasenträger. Die Zeit- aufgelöste Fluoreszenstechnologie erlaubt außerdem die Verwendung von Markierungen, die Strahlungen unterschiedlicher Wellenlängen emittieren (Saarma, M., Järvekulg, L., Hemmilä, I., Siitari, H., & Sinijärv, R., Journal of Virological Methods 1989, 23: 47-54; Xu, Y,Y, Pettersson, K., Blomberg, K., Hemmilä, I., Mikola, H. und Lövgren, T., Clin. Chem. 1992, 38/10: 2038-2043; Iitiä, A., Liukkonen, L. und Siitari, H., Molecular and Cellular Probes 1992, 6: 505-512). Die Erfindung zieht ebenso Nutzen aus der Kombination der Konzentrationen dieser Markierungen, die unterschiedliche Wellenlängen emittieren, bei der Markierung der Teilchen oder anderer Typen von Festphasenträgern.
Wenn das Mikroteilchen als ein Festphasenträger zur Identifikation unterschiedlicher Analyte in einem Multiparameter-Assay verwendet wird, werden nur eine Markierung oder wenige Markierungen zur Detektion des aktuellen Analyten benötigt. Wenn die Markierungstechnologie auf der Zeit- aufgelösten Fluoreszens basiert, die die Auflösung verschiedener Markierungen erlaubt, wird die Verwendung eines kategorisierbaren Festphasenträgers eine Markierung oder mehrere Markierungen für die Verwendung zur Identifikation der Kategorien des festen Trägers freistellen. Fig. 3 zeigt die Wellenlängen, Verzögerungs- und Identitätsprofile der Emission aus einer Mischung von PT-cheliertem Eu&spplus;³, Tb&spplus;³, Sm&spplus;³ und Dy&spplus;³.
Der Festphasenträger kann in Kategorien auf Basis von entweder Zeit-aufgelösten Markierungen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, auf Basis von unterschiedlichen Konzentrationen der Zeit-aufgelösten Markierung, auf Basis der gleichzeitigen Verwendung von Zeit- aufgelösten und kurzlebigen Fluoreszensmarkierungen oder einer Kombination von diesen verteilt sein. Beispielsweise können durch die Verwendung von zwei Zeit-aufgelösten Markierungen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, in zehn unterschiedlichen Konzentrationen zur Identifikation der Kategorien des Festphasenträgers, einhundert unterschiedliche Festphasenträger-Kategorien identifiziert werden.
Eine extrem große Anzahl von identifizierbaren Festphasenträger-Kategorien kann in einen Multiparameter-Assay eingebaut werden durch die Verwendung von Mikroteilchen, die fluoreszierende Lanthanidchelate enthalten. Unterschiedlich fluoreszierende Moleküle können an unterschiedliche oder an die gleichen Mikroteilchen gebunden werden. Es ist vorteilhaft, die gleichen Mikroteilchen mit vielen verschiedenen Fluoreszensmolekülen zu markieren, da die Kombinationen dieser unterschiedlichen fluoreszierenden Che late und/oder die Kombinationen ihrer Konzentrationen in einer großen Anzahl von möglichen Kombinationen resultieren wird. Die Festphasenträger-Kategorien werden durch Messung der Fluoreszensintensität des (der) Lanthanidchelats/Chelate, die in den jeweiligen Mikroteilchen enthalten sind, unter Verwendung von Zeit-aufgelöster Fluoreszens identifiziert. Nach Identifikation wird das Ergebnis der allgemein bekannten spezifischen Bioaffinitäts- Reaktion, die auf dem Teilchen durchgeführt wurde, mit Hilfe der fluoreszierenden Lanthanidchelat-Markierung des identifizierten Mikroteilchens zur Messung des markierten Bioaffinitäts-Reaktanten bestimmt; ein Lanthanid, das sich von dem für die Identifikationsmessung verwendeten unterscheidet, wird nun verwendet. Beim Multiparameter-Assay werden Teilchen mit einem Durchmesser von < 1 mm als Festphasenträger verwendet.
Die Markierung(en), die für die Identifikation der Mikroteilchen verwendet wird, kann/können an die Mikroteilchen während ihrer Herstellung durch z. B. Copolymerisation gebunden werden. Alternativ kann (können) die Markierung(en) chemisch an die Oberfläche des Mikroteilchens nach dem Herstellungsprozeß gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nichtrestriktiven Beispiele detaillierter beschrieben werden.

Beispiel 1

Gleichzeitiger Test von Thyrotropin(TSH)-, Thyroxin(T3)-, freiem Thyroxin(T4)- und Thyroglobulin(TG)-Konzentrationen in Blutproben.
Ein Multiparameter-Assay könnte typischerweise auf die Bestimmung der Schildrüsenfunktion beim Menschen durch gleichzeitige Messung der Konzentrationen von Thyrotropin (TSH), Thyroxin (T3), freiem Thyroxin (T4) und Thyroglobulin (TG) in z. B. einer Blutprobe angewendet werden. In diesem Beispiel wurden vier Teilchenkategorien identischer Größe und Eigenschaften zum Zwecke der Identifikation der Teilchenkategorien mit unterschiedlichen Terbiumchelat- Konzentrationen markiert (1 · Tb, für den TSH-Test; 5 · Tb für den T3-Test; 10 · Tb für den freien T4-Test; und 15 · Tb für den TG-Test). Während der Produktionsphase werden die Teilchenkategorien getrennt gehalten, bis es bestätigt wurde, daß sie in den genannten Tests funktionell sind, wonach sie für den Multiparameter-Assay gemischt werden. Die TSH- und TG-Tests sind nicht-kompetitiv, während T3- und freie T4-Tests kompetitiv sind. 1 · Tb-Teilchen werden mit einem monoclonalen TSH-spezifischen Antikörper beschichtet, 5 · TB-Teilchen mit einem anti-T3-Antikörper, 10 · Tb-Teilchen mit einem anti-T4-Antikörper (für freies T4) bzw. 15 · Tb-Teilchen mit einem monoclonalen TGspezifischen Antikörper beschichtet. Bei dem Multiparameter-Assay werden folgende Bioaffinitäts-Reaktanten, markiert mit einem fluoreszierenden Eu-Chelat verwendet: Eumarkierter monoclonaler TSH-spezifischer Antikörper, Eumarkiertes T3-Derivat, Eumarkiertes T4-Analog und Eumarkierter monoclonaler TG-spezifischer Antikörper. Bei dem Multiparameter-Assay wird es der Mischung aus Teilchenkategorien, der Probe und den mit dem Eu-Chelat markierten Reaktanten erlaubt, gleichzeitig in einem Ein- Schritt-Test zu reagieren. Nach Inkubation werden die Teilchenkategorien auf Basis ihrer Konzentration des Tb- Chelats identifiziert, und die Eu-Konzentration der individuell identifizierten Teilchen wird gemessen. Zeit- aufgelöste Fluoreszens wird sowohl für die Identifikation als auch die Messung verwendet. Die Konzentration jedes Analyten (TSH, T3, freies T4 und TG) wird aus den gemessenen Eu-Konzentrationen berechnet. Zur Zeit-aufgelösten Fluoreszensmessung werden entweder ein Durchfluß-Cytometer, ein Zeit-aufgelöstes Mikroskop oder ein Zeit-aufgelöstes Mikrofluorometer oder andere Meßinstrumente, die auf Zeit-aufgelöster Technologie basieren, verwendet (US- PS 5 028 545, Xu, Y. Y. et al., Clin. Chem. 1992, 38/10: 2038-2043; Seveus, L. et al., Cytometry 1992, 13: 329-338).

Beispiel 2

Gleichzeitiger Nachweis einer Vielzahl von Mutationen Der Multiparameter-Assay kann zur Diagnose einer vererbten Krankheit durch gleichzeitiges Detektieren einer Vielzahl von Mutationen, die mit der Krankheit assoziiert sind, auf Genebene verwendet werden. Beispielsweise müssen bei der Diagnose der Duchenne musukulären Dystrophie (DMD) neun unterschiedliche Deletionsmöglichkeiten, alle Krankheitsassoziiert, exakt im Gen identifiziert werden. Der Multiparameter-Assay wird auf folgende Weise durchgeführt. Die zu untersuchende Genregion wird durch z. B. die PCR-Methode (PCR = polymerase chain reaktion) amplifiziert, wonach achtzehn (neun normale und neun mutierte Allele) Teilchenkategorien identisch in Größe und Eigenschaft verwendet werden, deren Kategorien aufgrund der Konzentration des fluoreszierenden Tb-Chelats, das sie enthalten, identifiziert werden können (1x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x, 64x, 128x, 256x, 521x, 1024x, 2048x, 4096x, 8192x, 16384x, 32768x, 65536x, 131072xTb). Im Herstellungsschritt wird eine Nukleinsäuresonde (Bioaffinitäts-Reaktant), welche eine der vorher erwähnten achtzehn Mutationen spezifisch identifiziert, auf der Oberfläche jeder Mikroteilchen-Kategorie immobilisiert. Für den Multiparameter-Assay wird eine Mischung aus den Teilchenkategorien hergestellt, die alle achtzehn Teilchenkategorien, die für die Detektion der DMD-Mutationen nötig sind, enthält. Im eigentlichen Test sind die Teilchenmischung, Probe und neun unterschiedliche Nukleinsäursesonden, die alle mit fluoreszierendem Eu- Chelat markiert sind, erforderlich. Nach Inkubation wird die Kategorie der individuellen Teilchen anhand der Inten sität ihrer Tb-Fluoreszens identifiziert, und die Eu- Konzentration der individuellen Teilchen wird gemessen.
Der Multiparameter-Assay erlaubt so die Detektion von allen bekannten neuen Mutationen, die mit DMD assoziiert sind. Zeit-aufgelöste Fluoreszensmessungen werden mit entweder einen Durchfluß-Cytometer, einem Zeit-aufgelösten Fluoreszensmikroskop oder Mikrofluorometer durchgeführt (US-PS 5 028 545, Xu, Y. Y. et al., Clin. Chem. 1992, 38/10: 2038-2043; Seveus, L. et al., Cytometry 1992, 13: 329-338).
Ein Spezialist auf dem Gebiet wird es positiv bewerten, daß die verschiedenen Anwendungen der Erfindung im Rahmen der Ansprüche variieren können. Es wird positiv bewertet werden, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung in eine Verschiedenheit von Ausführungen eingebaut werden können, von denen nur wenige hier mit aufgenommen sind. Dem Fachmann wird offensichtlich sein, daß andere Ausführungsformen existieren. Die beschriebenen Ausführungen sind daher illustrativ und sollten nicht als restriktiv verstanden werden.

Claims

1. Biospezifisches Multiparameter-Assay-Verfahren unter Verwendung von Mikroteilchen, die in verschiedene Kategorien verteilt sind und verschiedene Analyten darstellen, wobei Mikropartikel, die verschiedenen Kategorien angehören, mit einem fluoreszierenden Molekül (1) markiert sind, und wobei die Mikropartikel, die verschiedenen Kategorien angehören, mit Bioaffinitätsreaktanten A, die verschiedene Analyten binden, beschichtet sind, wobei

- Mikropartikel, die verschiedenen Kategorien angehören, vermischt werden und die zu analysierende Probe dem Gemisch zugesetzt wird und Bioaffinitätsreaktanten B, die mit einem fluoreszierenden Molekül (2) markiert sind, dem Gemisch entweder sofort oder nach Beendigung der Reaktion zwischen dem Analytmolekül und dem Bioaffinitätsreaktanten A zugesetzt werden,

- die fluoreszierenden Moleküle (1, 2) angeregt werden und die Fluoreszenzemissionen quantitativ zur Identifikation der Mikroteilchenkategorie und zur Messung des Gehalts der verschiedenen Analyten bestimmt werden,

dadurch gekennzeichnet, daß

- die Mikropartikel und die Bioaffinitätsreaktanten B mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen, die eine langlebige Fluoreszenz emittieren (1, 2), markiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von zwei oder mehr fluoreszierenden Molekülen (1a, 1b ...), die langlebige Fluoreszenz emittieren, zur Identifikation der Mikropartikelkategorie so, daß die verschiedenen Moleküle (1a, 1b ...) auf dem gleichen oder auf verschiedenen Mikropartikeln lokalisiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Auftreten von mindestens einem der Moleküle, die eine langlebige Fluoreszenz emittieren (1, 1a, 1b ...), in verschiedenen Konzentrationen auf den Mikropartikeln.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel mit einem Molekül, das kurzlebige Fluoreszenz emittiert (3), zusätzlich markiert werden, das auf den gleichen Mikropartikeln, die mit einem oder mehreren Molekülen markiert sind, die langlebige Fluoreszenz (1, 1a, 1b ...) emittieren, oder auf verschiedenen Mikropartikeln vorkommen kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül, das eine kurzlebige Fluoreszenz emittiert, in verschiedenen Konzentrationen verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Eu-, Tb-, Sm- oder Dy-Chelate diejenigen Moleküle (1, 2) sind, die langlebige Fluoreszenz emittieren.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Mikropartikel weniger als 1 mm beträgt.