DE2537275A1

DE2537275A1 - Immunchemisches verfahren zur bestimmung von antigenen und antikoerpern in biologischen fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2537275A1
Application number: DE19752537275
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Individual
Current assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung
Priority date: 1975-08-21
Filing date: 1975-08-21
Publication date: 1977-02-24
Also published as: DE2537275B2; DE2537275C3

Description

Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten Die Erfindung betrifft ein immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in biologischen Flüssigkeiten.
Mit diesem Verfahren kann gleichzeitig auch die Bestimmung von Steroiden, Hormonen, virulenten und bakteriellen Antigenen, Tumorantigenen, Enzymantigenen, veterinärmedizinischen Antigenen, agrarbiologischen Antigenen, Bakteriolysinen, Allergenen, Pharmakas, Drogen, Metaboliten, Vitaminen, Antitoxinen, Agglutininen, Präzipitinen, botanischen Antigenen, Antigammaglobulinen und Antikörpern aller Art durchgeführt werden.
Weiter betrifft die Erfindung die entsprechenden Testbestecke, üblicherweise Kits oder Sets genannt, sowie die diagnostischen Mittel zur Durchführung des Verfahrens, beispielsweise entsprechend präparierte Folien- oder Papierstreifen oder beschichtete Teststreifen oder Objektträger, wie sie für Einzeltests oder Serientests verwendet werden können.
Im Jahre 1959 erschien in der Zeitschrift "Nature" die klassische Arbeit von Yalow und Berson über die radioimmunologische Bestimmung von Insulin. Die erste Mitteilung der Autoren über diese Methode wurde bereits 1957 auf einem internationalen Kongreß in Bethesda/Maryland, USA gemacht. In den folgenden Jahren wurde die radioimmunologische Methodik weiter vervollständigt und bald erwies sie sich als eines der empfindlichsten und spezifischsten Analysenverfahren, das in der medizinischen Labordiagnostik zur Verfügung steht.
Hauptsächlich wurde das radioimmunologische Verfahren zur Bestimmung von Hormonkonzentrationen angewandt, da Hormone wegen ihrer niedrigen Konzentration mit anderen klinischchemischen Verfahren nicht oder nur sehr schwer zu erfassen sind. Inzwischen sind Radioimmunoassays für nahezu alle bekannten Peptidhormone ausgearbeitet worden. Durch Immunisierung von Tieren mit Hormoflproteinkomplexen gelang es auch, Antiseren gegen Steroide, Schilddrüsenhormone und Pharmaka zu gewinnen und radioimmunologische Bestimmungsmethoden für diese Substanzen zu entwickeln. Mit Hilfe der radioimmunologischen Methoden konnten in den letzten Jahren viele neue Erkenntnisse und Zusammenhänge in Physiologie und Endokrinologie gewonnen werden. Seit einiger Zeit findet der Radioimmunoassay auch außerhalb der Endokrinologie Anwendung, wie z.B.
in der Biochemie oder in der Mikrobiologie. Der Radioimmunoassay eignet sich weiterhin auch zur laufenden Kontrolle von Arzneimittel-Plasmakonzentrationen.
Durch die neuen diagnostischen Möglichkeiten mit Radioimmunoassays sieht man die Lösung der sich permanent vermehrenden Zivilisationskrankheiten, wie Hochdruck (61,2 % der Bevölkerung in der BRD) oder Schilddrüsenerkrankungen (ca. 9 % der Gesamtbevölkerung in der BRD). Die zu 70 % an diesen Zivilisationskrankheiten erkrankte Bevölkerung verursacht jährlich immer höhere Kostenexplosionen im Bereich der medizinischen Betreuung. Die immer größer werdende Kostenlawine setzt sich zusammen aus den Kosten der langen Liegezeit in den Kliniken, aus Frührenten-Ansprüchen, aus Ausfällen im wirtschaftlichen Bereich (Unterbrechung oder Aufgabe der Berufe); vor allem aber aus den Kosten einer vielseitigen außerklinischen Labordiagnostik.
Mit den radioaktiv markierten immunchemischen Methoden sieht man zwar die Möglichkeiten einer Früherkennung dieser Zivilisationserkrankungen, aber gleichzeitig wird das Risiko "Umweltschutz" beträchtlich erhöht.
Der Nachteil radioimmunologischer Nachweise liegt nicht allein im erhöhten Umweltschutz-Risiko, sondern für eine Reihe von besonderen Problemen müssen bestimmte Voraussetzungen geschaffen werden, und zwar eine spezielle Ausstattung der Laborräume nach Vorschriften der Strahlenschutzverordnung, eine spezielle Schulung und Ausbildung und überwachung des Laborpersonals entsprechend den Auflagen der Strahlenschutzverordnung, eine Genehmigung zum Umgang mit radioaktiven Stoffen, sowie spezielle Kenntnisse der Laborleiter, die u.a.
Strahlenschutzkurse absolvieren müssen.
Dazu kommen hohe Kosten der Laborausstattung (Gamma-, Beta-Zählgeräte), eine Beseitigung der radioaktiven Abfälle, besonders der langlebigen Nuklide, wie H3, C14 usw., sowie eine Schädigung der Antigene durch Radiolyse, besonders bei den energiereichen Jod-Isotopen.
Aufgrund der Kurzlebigkeit der für die Markierung verwendeten (J131 125 Isotope (J131, J125) bestand bisher nicht die Möglichkeit, die Methoden nach § 12 (Arzneimittelgesetz) zu kontrollieren, standardisieren und registrieren.
Aufgabe der Erfindung sind ein Verfahren und die dazu erforderlichen Mittel, welche die eingangs erwähnten Nachteile der radioimmunologischen Nachweise vermeiden und mindestens die gleiche Genauigkeit haben und darüber hinaus die bei der radioaktiven Markierung häufig auftretende Schädigung oder Zersetzung vermeiden und überdies noch die Möglichkeit einer größeren Sensitivität bieten.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man statt wie bisher Antikörper nun erfindungsgemäß Antigene markiert.
Diese Markierung erfolgt durch Bindung oder Xoppelung an eine Substanz, die im folgenden Arbeitssubstanz genannt wird, und die anschließend einen Bestandteil abgibt, beispielsweise durch Hydrolyse, der leicht einer exakten Messung zugänglich ist und dessen Menge in direktem Verhältnis zur Menge an gesuchtem Antigen, über das Antigen, zum sonstigen gesuchten Körper steht.
Das Verfahren, die Testbestecke und die diagnostischen Mittel eignen sich mit Vorteil zur qualitativen und quantitativen Messung, beispielsweise zur Einzel-, Mehrfach-, Streifentest-oder Objektträger-Bestimmung.
Bei der an der Messung beiteiligten Reaktion handelt es sich um eine echte immunologische Reaktion, an der in an sich bekannter Weise Antikörper/Antigene beteiligt sind.
Die Messung erfolgt nach bekannten klinisch-chemischen Methoden, wobei die gewählte Methode von der verwendeten Arbeitssubstanz abhängt. Bevorzugt wird die fluorometrische Messung, obwohl auch photometrisch, spektrometrisch, chromatographisch, flammenphotometrisch, colorimetrisch, elektrophoretisch, gaschromatographisch, UV-spektrometrisch oder serologisch gemessen werden kann.
Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die Sensitivität und Spezifität - abgesehen von der einfachen Durchführung - wesentlich erhöht wird, z.B. eine Messung im einzelnen Nierennuklei. Die Meßgenauigkeit geht von ng/ml = ( 1 x 10 9 gm) bis pg/ml = (1 x 10 12gm) z.B. lpg/ml - 0,1 pg/ml Die Antigene werden statt wie bisher mit verschiedenen radioaktiven Nukliden, wie JoD125, H3, C14 oder p32, mit der sogenannten nicht radioaktiven Arbeitssubstanz markiert.
Als Arbeitssubstanzen zur Antigenmarkierung eignen sich Cumarinderivate, insbesondere Umbelliferon, 4-Methylumbelliferon, 3-Carboxymethylumbelliferon und 3-Acetylumbelliferon, aber auch Stilbenthioisocyanat, Fluoresceinthioisocyanat und Fluoresceindiacetat, sowie &- und ß-Naphthol.
Mit Abstand wurden die empfindlichsten Meßdaten mit den Bernsteinsäureester von 4-Methylumbelliferon erzielt und die Erfindung wird anhand dieses Beispiels beschrieben.
Wie schon früher erwähnt, können über die Markierung der Antigene auch andere Substanzen bestimmt werden. Bei dem Zusetzen von spezifisch gegen die entsprechenden Antigene gerichteten Antikörpern werden die markierten Antigene unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes kompetitiv gebunden.
Werden die im Verfahren beschriebenen Markierungssubstanzen von den Antigenen nurreversibel gekoppelt, so werden bei der Bildung des Antigen/Antikörper-Komplexes lediglich die Aktivitäten der Markierungsreagentien gehemmt. Durch Zusätze von unmarkierten, zu bestimmenden, Antigenen, wird die Hemmung wieder aufgehoben und die freiwerdenden, nicht gebundenen Antigene können über die ebenfalls freigewordene Arbeitssubstanz gemessen werden.
Im folgenden wird die Herstellung der bevorzugten Arbeitssubstanz sowie die Verfahrensmethode beschrieben: I) Herstellung der Arbeitssubstanz 4-Methylumbelliferon Bernsteinsäure- Bernsteinsäure-M.G. 176,17 anhydrid 4-Methylumbelliferyl-MG. 100,04 ester (MU), M.G.
276,21; Ausbeute 50 - 80 % A) Reinigung der Arbeitssubstanz: Die Reinigung des 4-Methylumbelliferon von eventuell vorhandenen freien Phenol erfolgt durch Extraktion und Rekristallisation mit Athylaikohol oder Diäthyläther. Es bilden sich weiße Kristallnadeln mit einem Schmelzpunkt von 185 - 1860C.
(Pechmann und Duisberg; Ber. 16 (1883) 2122).
Bt Bildung des Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylesters : 5 mg 4-Methylumbelliferon (rekristallisiert) werden in 5 ml Pyridin gelöst und im stöchiometrischen Verhältnis mit Bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht. (Molverhältnis 4-Methylumbelliferon zu Bernsteinsäureanhydrid 1 :1). Die Veresterung findet bei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde statt. Nach Abschluß der Reaktion wird das Pyridin bis zur vollständigen Trockene abgedampft (Raumtemperatur, Vakuum oder Aufblasen von Stickstoff), der Rückstand mit Diäthyläther (wasserfrei, frisch destiliert) rekristallisiert, abgesaugt, der Rückstand getrocknet und gewogen (die Ausbeute soll zwischen 50 und 80 % liegen).
II) Kopplung der Antigene mit der Arbeitssubstanz 1 ol Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester wird mit einem dem Antigen angepaßten Puffer (Phosphat-, Barbital- oder Trispuffer) mit einem pH-Wert von 6,0 - 6,8 gelöst und mit einem Mol Dicyclohexylcarbodiimid (M.G. 194) versetzt. Dazu wird das zu markierende Antigen, dessen Menge sich nach der Struktur des Antigens (verfügbare Aminogruppen) und seinem Molekulargewicht richtet, gegeben.
Beispiel: Thyroxin oder Trijodthyronin = 1 Aminogruppe = 1 Mol TSH = ca. 6 Aminogruppen = 0,16 Mol Die Kopplung erfolgt prinzipiell über die Carboxylgruppe des Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylesters an die verfügbaren Aminogruppen des Antigens: Bei einigen Antigenen ist es notwendig, um die Kopplung der Arbeitssubstanz an die Aminogruppen nicht zu gefährden, andere reaktive Gruppen, wie Carboxylgruppen, durch Veresterungen oder andere chemische Substitutionen, zu blockieren. Zum Beispiel wird zur Kopplung der Schilddrüsenhormone T3 und T4 die Carboxylgruppe durch Veresterung mit Äthyl- oder Methylalkohol blockiert.
Bei Antigenen, die keine Aminogruppen enthalten, wie z.B.
Pharmaka oder Steroide, wird über eine Aminosäure, deren Carboxylgruppe verestert wird, gekoppelt.
Die Reinigung der markierten Antigene erfolgt zweckmäßigerweise über Dünnschicht- oder Säulenchromatografie.
III) Bestimmung der Antigenkonzentration in unbekannten Proben: Wird eine bestimmte Menge Antigen, mit der Arbeitssubstanz markiert (die einzusetzende Menge ergibt sich aus dem Antikörpertiter; Freisetzung von 50 - 70 % 4-Methylumbelliferon), mit dem Untersuchungsmaterial und mit einer bestimmten MengeAntikörper versetzt, dann erfolgt durch die Einstellung des Äquilibriums der immunologischen Reaktion zwischen dem markierten Antigen, Probenantigen und dem spezifischen Antikörper eine Freisetzung von 4-Methylumbelliferon, da der zur Markierung benutzte Bersteinsäure-4-methylumbelliferylester in wäßriger Lösung ebenfalls dem Massenwirkungsgesetz unterliegt.
Durch die Entfernung des Antigens, an das der Ester durch eine irreversible Peptidkopplungsreaktion gebunden ist, wird vom Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester 4-Methylumbelliferon freigesetzt. Der antigenspezifische Antikörper verschiebt also das-Ester-Gleichgewicht nach dem Massenwirkungsgesetz zugunsten von 4-Methylumbelliferon.
Reaktion 1: Ester-Darstellung nach dem Massenwirkungsgesetz.
Reaktion 2: Schematische Einstellung des immunologischen Aquilibriums bei Anwesenheit von Probenantigen und die dadurch bedingte Abspaltung von freiem 4-Methylumbelliferon (Reaktion 1).
Reaktion 3: Angriffspunkt des antigenspezifischen Antikörpers am markierten Antigen und damit die Eliminierungsreaktion eines Partners aus der Esterreaktion (Reaktion 1).
Bedingt durch die Freisetzung von 4-Methylumbelliferon durch die immunologische Reaktion (Reaktionen 1 bis 3) erübrigt sich auch die Trennung des antikörpergebundenen vom freien Antigen, da die freigewordene 4-Methylumbelliferon-Menge ein zuverlässiger Parameter für den Antigen-Antikörper-Komplex ist. Eine Trennung des ebenfalls freiwerdenden markierten Antigens vom freien 4-Methylumbelliferon ist nicht notwendig, da bei Alkalisierung (pH = 10,3) der an das Antigen konjugierte Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester bei einer anderen Wellenlänge (380 nm) fluoresziert als das durch die OH-Ionen gebildete 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ion (448 nm).
Die Antigenmarkierung mit dem Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester emöglicht die Durchführung von qualitativen und quantitativen Antigennachweisen: A) Quantitative Antigenbestimmunq in unbekannten Proben: Zu diesen Bestimmungen steht derzeit nur das mittlerweile bewährte radioimmunologische Verfahren zur Verfügung (L. Raith, Einführung in die radioimmunologischen Methoden, 1974).
Beim vorliegenden neuen Verfahren ändern sich die Mengenverhältnisse bei der fluorimetrischen Methode gegenüber dem bekannten RIA kaum. Auch die chemischen Zusammensetzungen der verwendeten Pufferlösungen bleiben unverändert, die einzige Abwandlung betrifft deren pH-Wert. Die immunologische Reaktion nach dem Verfahren der Fluoreszenzmarkierung muß wegen der leichten Hydrolisierbarkeit des Antigen-Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylesters im leicht alkalischen Milieu in den leicht sauren Bereich (pH = 6,0 - 6,8) verschoben werden. Diese Maßnahme hat jedoch keinen Einfluß auf die immunologische Reaktion. Die beim RIA oft langwierige und zeitraubende Separation zur Abtrennung der antikörpergebundenen Phase von der freien Phase entfällt nach dem neuen Verfahren völlig. Zur Messung der Fluoreszenz wird nach der immunologischen Reaktion ein alkalischer Puffer (pH = 10,3) zugesetzt und die intensive weißblaue Fluoreszenz des 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ions, das durch die immunologische Reaktion aus der Kopplung an das Antigen freigesetzt wurde, bei einer Wellenlänge von 448 nm in einem empfindlichen Fluorimeter oder Spektrofluorimeter gemessen. Die Standardisierung und Endauswertung der Meßergebnisse erfolgt nach den gleichen Kriterien wie beim Radioimmunoassay (Standardkurve, erhalten durch den Assay von bekannten Mengen unmarkierten Antigens und Berechnung der Konzentration nach der Eichreihe).
Beispiel Zu 100 - 200 Mikroliter Untersuchungsmaterial (Serum, Plasma, Urin-Liquor, wäßrige Lösungen) werden 100 - 200 Mikroliter Antigen, das mit Arbeitssubstanz (z.B. Bernsteinsäure, 4-Methylumbelliferylester = B-4-MU) markiert ist, und 100 Mikroliter des Antiserums gegeben und inkubiert. Die Verdünnungen der eingesetzten Reagentien und die Inkubationszeit sind von Antigen zu Antigen unterschiedlich und müssen vor dem Bestimmungsansatz individuell ausgetestet werden.
Nach Abschluß der Inkubationszeit werden dem Ansatz 1 - 2 ml Puffer pH = 10,3 zugesetzt und die Fluoreszenz des freigerdenen 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ions bei 448 nm in einem empfindlichen Fluorjmeter oder Spektrofluorimeter gemessen.
Durch die Ytführung von Standardproben {unmarkierte Antigene in verschiedenen Konzentrationen), die gleich der Untersuchungsprobe behandelt werden, ist es moglich, nach dem Eintragen der genessenen Emissionswerte in ein Koordinantensystem an der Eichkurve die Antigenkonzentration der unbekannten Proben zu ermitteln.
Bei einigen Antigenen besteht durchaus die Möglichkeit, daß ihre Affinität zum Antikörper zu gering ist, um aus der immunologischen Reaktion 4-Methylumbelliferon freizusetzen. In diesem Fall kann man den Antikörper an Festkörper (Sephadex)' oder an die Röhrchenwand (Polystyrolröhrchen) koppeln.
Kopplung des Antikörpers an Polystyrolröhrchen: Zur Kopplung des Antikörpers an die Wände der Röhrchen (Polystyrol) wird das Antiserum zuerst mit Rivanol (Hoechst) behandelt. 0,4 ml des Antiserums, in entsprechender Endverdünnung (Barbitalpuffer), wird in die Röhrchen gegeben und 18 Stunden bei 40C oder für 3 Stunden bei 37 0C inkubiert. Der pH-Wert des Barbitalpuffers soll zwischen 9,6 und 10,2 liegen. Danach werden die Röhrchen dreimal mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH = 7 bis 7,4) gespült. Anschließend werden 0,6 ml zugesetzt. Dann sind die Röhrchen bei 4 0C für 2 bis 3 Wochen lagerfähig. Für den Assay wird der Phosphatpuffer entfernt und es werden die zur immunologischen Reaktion notwendigen Reagentien zugesetzt (siehe oben). Nach Abschluß der immunologischen Reaktion wird der überstand abgekippt und der an die Röhrchenwand gekoppelte Antigen-Antikörper-Komplex mit einem geeigneten Lösungsmittel (Äthanol oder Methanol) eluiert, mit Puffer (10,3 pH)verseift und das freigewordene 4-MU-Phenolat-Ion fluorimetrisch gemessen.
Die quantitative TSH-Bestimmung: Vorgereinigtes, international standardisiertes TSH (Thyroid Stimulating Hormone) wird, wie eingangs beschrieben, an das 4-Methylumbelliferon gebunden.
Zur quantitativen TSH-Bestimmung wird eine bekannte Menge Humanserum mit einer durch den Antikörpertiter genau definierten Menge (40 bis 60 % Bindungskapazität) mit 4-Methylumbelliferon markiertem TSH inkubiert. Bei 37 cm genügt eine Inkubationszeit von ca. 8 Stunden. Die Inkubationszeit kann variiert werden, besonders bei niedrigeren Temperaturen (z.B. Zimmertemperatur) auf 24 Stunden erhöht werden.
Während der Inkubationszeit stellt sich das immunologische Gleichgewicht nach dem Massenwirkungsgesetz ein und es wird dabei eine der unbekannten TSH-Menge (Probe) proportional entsprechende Menge an 4-Methylumbelliferon aus der Bindung an das TSH verdrängt.
Da die 4-Methylumbelliferon-TSH-Verbindung keine fluoreszierenden Eigenschaften besitzt, kann das freiqesetzte 4-Methylumbelliferon leicht und bequem ohne Trennungsverfahren direkt fluorometrisch gemessen werden.
Durch Erstellung einer Standardreihe, wie oben beschrieben, die durch eine Verdünnung einer bekannten Menge von unmarkiertem TSH dargestellt wird, kann anhand einer Eichkurve der TSH-Gehalt der zu bestimmenden Proben direkt abgelesen werden.
Bei der Antigenmarkierung mit z- oder ß-Naphthol zum Beispiel und nach dessen Freisetzung wird zweckmäßig eine colorimetrische oder photometrische Messung angewandt. Im folgenden ist ein immunchemischer Diagnose-Kit (IDK) für Bestimmungen in Blut, Plasma, Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen zusammengestellt. Ein solcher Kit wird zweckmäßig beispielsweise für jeweils 100 Bestimmungen ausgelegt.

Immunchemischer Diagnostika-Kit (IDK) für 1oo Bestimmungen in Blut, Plasma, Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen

Reagens (Fläschchen) Zusammensetzung

Standard O

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin,krist.

Standard 1

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin krist.

Antigen 0,5 ng

Standard 2 4

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin,krist.

Antigen 1,0 ng

Standard 3

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin, krist.

Antigen 2,0 ng

Standard 4

(lyophilisiert) ; Phosphat-Puffer 7,4,

Rinderserum-Albumin , krist.

Antigen 4,0 ng

.Standard 5

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin,krist.

Antigen 0,8 ng

Standard 6

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Rinderserum-Albumin, krist.

Antigen 16 ng

Antiserum Antiserum

(lyophilisiert) Phosphat-Puffer 7,4

Arbeitsverdünnung 1 : 4.ooo

Endverdünnung 1 :12.ovo

Arbeitssubstanz/Antigen

(B - 4 - MU)lyophilisiert B - 4 - MU

Antigen

Phosphat-Puffer 7,4 (Konzentr.: 40ng/n

Puffer

(lyophilisiert) Phosphatpuffer pH 10,3 / 0,1 M

Objektträger

(lyophilisiert) Antigen

Grundsätzlich enthält also ein solcher Kit 1. eine Standardreihe von Antigen (0-6) lyophilisiert, 2. ein Antiserum (lyophilisiert), wobei diese Substanzen normalerweise in Pufferlösung vorliegen, 3. ein mit Arbeitssubstanz markiertes und lyophilisiertes Antigen, üblicherweise ebenfalls in Pufferlösung, wobei eine bestimmte Konzentration an Antigen eingestellt ist, 4. eine weitere Pufferlösung (ophilisiert), normalerweise Phosphatpuffer, pH = 10,3 / 0,1 m, sowie 5. Objektträger, die mit lyophilisiertem Antigen versehen sind, und zwar zweckmäßig auf unterschiedliche Gebrauchsdichten eingestellt.

In der beigefügten Zeichnung ist das Prinzip der Messung eines Antikörpers mit markiertem Probenantigen gezeigt.
Br Qualitative Antiqenbestimmunq in unbekannten Proben: Völlig neue diagnostische Möglichkeiten eröffnen sich unter Anwendung des beschriebenen Verfahrens durch die Kopplung der Antikörper auf Objektträger, Papier- oder Kunststoffstreifen. Bei dieser Methode werden die Antikörper auf einem Objektträger fixiert (z.B.durch Polyvinylpyrrolidon) oder an einen Papier-, oder Kunststoffstreifen adsorbiert (reaktivierte Nylonstreifen). Dem Untersuchungsmaterial wird unter entsprechenden Verhältnissen (Puffer, pH-Wert) eine Lösung des Dicyclohexylcarbodiimid und der Arbeitssubstanz zugesetzt, worauf die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wird. Dadurch werden sämtliche im Untersuchungsmaterial vorhandenen Antigene, die eine Aminogruppe enthalten, markiert. Das so präparierte Untersuchungsmaterial wird nun auf den gebundenen oder fixierten Antikörper aufgebracht und inkubiert.Nach Beendigung der Inkubationszeit wird der Objektträger, Papier- oder Nylonstreifen mit einem Puffer gespült, getrocknet und unter einem Fluoreszenzmikroskop oder nur mit einer UV-Lampe beobachtet. Läßt sich eine Fluoreszenz feststellen, ist dies ein Beweis dafür, daß in der Untersuchungsprobe das zum spezifischen Antikörper passende Antigen vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig zum Nachweis von bakteriellen, virulenten und mikrobiologischen Antigenen.
Ein schnelles und sicheres diagnostisches Verfahren für Screening-Untersuchungen und Notfälle ergibt sich nach der oben beschriebenen Methode (Objektträger-, Papier-, oder Nylonstreifenbeschichtung mit Antikörpern) und Bereitstellung von zwei Standardproben, die den oberen und unteren Normalbereich charakterisieren und die gleich der zu untersuchenden Probe mit Dicyclohexylcarbodiimid und Arbeitssubstanz markiert werden. Nach dem Aufbringen auf den Antikörper und dem Ablauf der immunologischen Reaktion kann die Fluoreszenz der Untersuchungsprobe mit der der Standardproben verglichen werden oder zu deren quantitativen Nachweis mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, alkalisiert und gemessen werden.
Der Fluoreszenzvergleich bietet dann eine sichere und schnelle Aussage über einen eventuellen phathologischen Wert im Untersuchungsmaterial.
Für die Durchführung solcher Untersuchungen wurde weiter gefunden, daß sich lyophilisierte Antigene auf Trägern, beispielsweise auf Objektträgern, unter Vakuum konservieren lassen. Solche gefriergetrocknete Antigene, die sich leicht auf eine gewünschte Gebrauchsdichte einstellen lassen, bieten ganz allgemein verschiedene Vorteile. Nicht nur zusätzliche Arbeitsgänge fallen weg, die üblicherweise mit einer hohen Fehlerbreite belastet sind, sondern das Präparat ist sofort verwendbar, es ermöglicht eine maximale Ausnutzung der Antigene und ist bei normalen Bedingungen bis zu sechs Monaten lagerungsfähig. Da in der medizinischen Diagnostik ohnehin zur Bestimmung von Antikörpern gegen Krankheitserreger im Blut vielfach Objektträger benutzt werden, ist auch das Personal mit dem Arbeiten mit solchen Objektträgern vertraut.
Der Herstellungsgang ist kurz zusammengefaßt wie folgt: 1. Einstellen der Antigene (z.B. Bakterien wie Staphylococcus aureus, Parasiten wie, Toxoplasma gondii, oder andere Krankheitserreger) in ihrem Suspensionsmedium auf die gewünschte Gebrauchsdichte.
2. Auftragen je eines Tropfens auf die vorbereiteten Antigenfelder der Objektträger.
3. Lufttrocknung (bis 200C maximal ca. 1 Stunde) 4. Lyophilisierung 5. Sofortiges Abpacken und Einschweißen in gasdichte Folie unter Vakuum.
Während bei der jetzigen Arbeitstechnik unter Verwendung von Objektträgern die Präparierung und Fixierung zeitraubend und, da als Fixierungsmittel Aceton oder Äther benutzt wird, auch nicht ungefährlich ist und die präparierten Objektträger bei Temperaturen von etwa -20°C- gelagert werden müssen und trotzdem nicht sehr haltbar sind, bietet das erfindungsgemäße Diagnosemittel auch den Vorteil der sofortigenund problemlosen Verwendbarkeit.
Als zweckmäßiges Suspensionsmittel kann an sich jede auf diesem Gebiet bekannte Suspensionsflüssigkeit verwendet werden. Selbstverständlich soll sie keinen Schaden auf das jeweilige Antigen ausüben. Geeignet ist vorzugsweise eine Kochsalzlösung, eine 10 %ige Glucoselösung, eine 5-10 %ige Glyzerinlösung und dergleichen. Bei industrieller Fertigung wird aus den bekannten Gebrauchsdichten eine mittlere gewählt, bei der eine ausreichende Menge Antigene bei der mikroskopischen Betrachtung im Blickfeld ist. Eine solche Gebrauchsdichte kann jederzeit ohne Schwierigkeiten bestimmt werden.
Nach dem Auftragen, der Lufttrocknung und der Lyophilisierung werden die Objektträger mit der lyophilisierten Suspension aus dem Vakuum entnommen und in eine Hülle aus gasdichter Folie eingelegt, die enthaltene Luft wird evakuiert und die Hülle verschweißt. Dabei ist es möglich, in einer Folienhülle mehrere Objektträger im Abstand nebeneinander einzulegen und die einzelnen Objektträger durch Schweißnähte voneinander zu trennen.
Als Verpackungsmaterialien können alle Arten verwendet werden, an denen die Antigene nicht kleben, z.B. Metallfolien, insbesondere Aluminiumfolien, wobei die Hüllen vorzugsweise wenigstens einseitig mit Polyvinylchlorid beschichtet sein sollte. Die einseitige Beschichtung der Objektträger erfolgt zweckmäßig mit Polyfluoräthylen. In diese Kunststoffschicht werden zweckmäßig bis zu zehn Durchbrechungen in zwei Reihen nebeneinander angeordnet. Die Lufttrocknung im Vakuum sollte etwa zwei Stunden betragen. Das Vakuum soll möglichst niedrig sein und vorzugsweise unter 1 mm Quecksilbersäule betragen. Auch in den verschweißten Folien sollte ein niedriges Vakuum vorhanden sein. Dieses Verfahren ermöglicht die industrielle Fertigung von lyophilisierte Antigene tragenden Objektträgern, die auch bei Normaltemperatur über Monate lagerfähig sind. Die industrielle Fertigung stellt sicher, daß auf allen Objektträgern immer die gleiche Menge an Antigenen vorhanden ist. Vergleichende Untersuchungen und Diagnosen werden erheblich vereinfacht und vereinheitlicht und nicht mehr von Zufälligkeiten und Unaufmerksamkeit im Labor beeinflußt. Die lyophilisierten Objektträger werden aus der Folie entnommen und können sofort benutzt werden.
In den beigefügten Zeichnungen ist ein solcher lyophilisierter Objektträger beispielsweise dargestellt. Es zeigen: Fig. 1 einen in einer Kunststoffhülle verpackten Objektträger in perspektivischer Ansicht; Fig. 2 einen unverpackten Objektträger in perspektivischer Ansicht und Fig. 3 einen senkrechten Schnitt durch einen verpackten Objektträger nach Fig. 1.
Der Objektträger 1 ist mit einer Schicht 2 aus Polyfluoräthylen versehen, in die Durchbrechungen 3 angeordnet sind, in denen sich die Antigene 4 befinden.
Der Objektträger 1 ist von einer Hülle 5 aus gasdichten Kunststoff-Folien, vorzugsweise beidseitig polyvinylchloridbeschichteter Metallfolie umschlossen. Der Innenraum ist evakuiert. Diese Kunststoff-Folie 5 ist allseitig durch eine Schweißnaht 6 verschlossen.
Fig. 4 zeigt schematisch auf einem Objektträger fixierten Antikörper und Fig. 5 zeigt schematisch den fixierten Antikörper, der das markierte Probenantigen gebunden enthält, dessen Markierungssubstanz nach Inkubieren für die Messung freigesetzt ist und somit der z.B. Fluoreszenzmessung unterzogen werden kann.

Claims

Patentansprüche

1. Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten durch Markierung einer Komponente der immunchemischen Reaktion und Messung einer Komponente, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Antigene durch Bindung an eine damit eine Reaktion eingehende Arbeitssubstanz markiert, die selbst oder mittels eines Bruchstückes davon leicht der Bestimmung zugänglich ist, das markierte Antigen mit der zu untersuchenden Substanz immunchemisch reagieren läßt und die freigesetzte Arbeitssubstanz oder deren der Bestimmung zugängliches Bruchstück direkt mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Arbeitssubstanz verwendet, deren Verbindung mit dem Antigen keine fluoreszierenden Eigenschaften oder von der Arbeitssubstanz selbst oder deren zu bestimmenden Bruchstücke wesentlich verschiedene fluoreszierende Eigenschaften besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Cumarinderivat, insbesondere 4-Methylumbelliferon oder dessen Bernsteinsäureester, als Arbeitssubstanz verwendet und fluorometrisch mißt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Antigenen, welche außer Aminogruppen andere reaktive Gruppen, wie Carboxylgruppen, aufweisen, diese, z.B.

durch Veresterung, blockiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Antigenen, die keine Aminogruppe enthalten, über eine Aminosäure, deren Carboxylgruppe verestert wird, koppelt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Antigene über Dünnschicht- oder Säulenchromatografie reinigt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen oder den Antikörper auf einen Träger aufschichtet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Wände von Teströhrchen, insbesondere aus Polystyrol oder Polypropylen, und/oder Oberflächen von Kunststoffpartikelchen oder Kunststoffgeweben und/oder Folien-oder Papierstreifen und/oder andere anorganische neralen über chemische Reaktionen beschichtet.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Objektträger auEgebrachtes, lyophlsiertes und unter Vakuum konzentriertes Antigen verwendet

10.Diagnostisches Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 9, bestehend aus mit Antigenen oder Antikörpern beschichteten Trägern, insbesondere FolienoderPapierstreifen bzw Teststreifen, gegebenenfalls als Bestandteil eines Bestimmungssatzes, der zusätzlich Antigenstandard, markiertes Antigen sowie die erforderlichen Puffer enthält.

11. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Satzes vorliegt, der eine Reihe von eingestellten Standards von Antigen, zweckmäßig in Phosphatpuffer, (pH = 7,4), unter Zusatz von Rinderserumalbumin, mit Arbeitssubstanz markiertes Antigen von ebenfalls eingestellter Konzentration, zweckmäßig in Phosphatpuffer (pH = 7,4), zusätzlich weiteren Puffer, insbesondere Phosphatpuffer (pH = 10,3), sowie gegebenenfalls lyophilisiertes Antigen, jeweils abgepackt in Standardeinheiten für jeweils eine Bestimmung oder eine Bestimmungsreihe, enthält.

12.Diagnostisches Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen in auf einem Objektträger aufgebrachter, lyophilisierter und in eine Hülle aus gasdichter Folie verpackter Form vorliegt.

13.Diagnostisches Mittel nach Anspruch 12, dadurch geXennzeichnet, daß das Antigen in Vertiefungen von Objektträgern vorliegt, welche durch Durchbrechungen einer einseitig aufgebrachten Kunststoffbeschichtung, vorzugsweise Polyfluoräthylenbeschichtung, des Objektträgers gebildet sind.