DE69527977T2

DE69527977T2 - Stabile wässrige Steroid-Standardproben für Immuntests

Info

Publication number: DE69527977T2
Application number: DE69527977T
Authority: DE
Inventors: I. Aboleneen; R. Groskopf; C. Kuemmerle; T. Williams
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 2003-05-08
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: CA2204027C; WO1996017252A1; ES2184812T3; DE69527977D1; US6767708B1; JPH10512362A; CA2204027A1; ATE223060T1; JP3560979B2; EP0795134B1; EP0795134A1

Description

Gebiet der Erfindung

Biologisch aktiven Steroidverbindungen, die für eine Degradation durch Sauerstoff in wässerigen proteinhaltigen Medien empfindlich sind, bekommen verbesserte Lagerstabilität durch die Zugabe von Übergangsmetallchelatbildnern.

Hintergrund der Erfindung

Ein weit verbreitet eingesetztes Verfahren zur Analyse der Körperflüssigkeiten von Menschen auf die Anwesenheit oder die Menge von sowohl natürlich vorkommenden als auch synthetischen biologisch aktiven Verbindungen geschieht durch Immunoassay. Die Wechselwirkung zwischen dem interessierenden Analyten und einem Antikörper, welcher diesen Analyten erkennt, wird gemessen. Das stellt oft ein relativ schnelles und preiswertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge eines gegebenen Analyten bereit. Die Analyt-Antikörper-Reaktion kann in einer breiten Vielfalt von Verfahren gemessen werden. Ein Verfahren ist der kompetitive Assay, in welchem ein Anti-Analyt-Antikörper auf einer festen Phase immobilisiert wird, und dann sowohl mit einer bekannten Menge eines markierten Analyten als auch mit einer Probe umgesetzt wird, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält. Der Analyt in der Probe konkurriert dann mit dem markierten Analyten um die Bindung an den immobilisierten Antikörper. Die Menge an Marker, die durch immobilisierten Antikörper eingefangen wird, ist dann umgekehrt proportional zu der Menge an Analyt, die in der Probe vorhanden ist.
Alle Analysenverfahren erfordern einen Bezug zu einem Standard, aber ein solcher Bezug ist besonders wichtig für Immunoassays. Die in solchen Assays genutzten Reagenzien umfassen biologische Materialien, deren Reaktivität nicht genau reproduzierbar ist, sondern nur innerhalb eines bestimmten Bereichs reproduzierbar ist. Zusätzlich kann die immunologische Bindung zwischen einem Antikörper und seinem Analyten durch subtile Faktoren beeinflusst werden, welche nicht immer kontrolliert werden können. In dieser Hinsicht sind zu genaue Bemühungen, exakte Reproduzierbar zu erhalten, inkonsistent mit dem Ziel eines schnellen und preiswerten Assays.
Deshalb hat sich die Praxis entwickelt, einen oder mehrere Standards bereitzustellen, die in jeden Lauf eines Immunoassays eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann das IMx®-Instrument, hergestellt durch Abbott Laboratories, mehr als zwanzig Proben pro Lauf analysieren. Es ist typisch, in jeden Lauf mehrere Proben einzuschließen, die eine bekannte Menge an Analyt enthalten, um ein Maß für die Variabilität bereitzustellen. Solche Standardproben werden für gewöhnlich als Kontrollen bekannt.
Zusätzlich ist es typisch, mehrere Proben bereitzustellen, die bekannte Mengen an Analyt aufweisen, um das Analysengerät zu kalibrieren und von Zeit zu Zeit neu zu kalibrieren. Solche Standardproben werden gewöhnlich als Kalibratoren bezeichnet.
Sowohl für Kalibratoren als auch für Kontrollen ist es wünschenswert, dass für sie ein Verdünnungsmittel verwendet wird, welches ein Verhalten in dem Assay ähnlich dem der Körperflüssigkeit zeigt, welche auf Analyt zu untersuchen ist. Wenn zum Beispiel menschliches Serum zu analysieren ist, können die Kalibratoren und Kontrollen beide in geeignet behandeltem normalen menschlichen Serum verdünnt werden. Alternativ dazu kann ein wässeriges Medium mit einem Proteingehalt ähnlich dem von Serum verwendet werden, zum Beispiel eine gepufferte Lösung von Rinderserumalbumin (BSA).
Eine Klasse von interessieren Analyten, die Steroide, zeigen eine Neigung, mit der Zeit in solchen gepufferten wässerigen proteinhaltigen Medien zu degradieren. Diese Neigung ist beobachtet worden sowohl in Aktivkohle-gereinigtem menschlichen Serum als auch in wässerigen Lösungen von BSA. In dieser Hinsicht wird menschliches Serum, das als ein Kalibrator oder eine Kontrollmatrix oder als. Träger beabsichtigt ist, Aktivkohle-gereinigt, um das gesamte Steroid zu entfernen, das vorhanden sein könnte. Somit kann der ursprüngliche Steroidgehalt genau kontrolliert werden, indem einfach eine abgemessene Menge zu dem gereinigten Serum hinzugefügt wird.
Es ist aus dem USP 5 342 760 bekannt, die Menge von Estradiol in einer Blutprobe durch Immunoassayverfahren zu bestimmen, worin Estron und dessen Derivate an einen Marker konjugiert werden und zusammen mit Estradiol-spezifischen Antikörpern benutzt werden, um Estradiolgehalte in flüssigen Proben zu bestimmen. Kalibratorlösungen, die bekannte Konzentrationen von Estradiol in Steroid-gereinigtem Serum enthalten, werden verwendet, um eine Kalibrierkurve zu erhalten.
Folglich gibt es einen Bedarf an Kalibrator- und Kontrolllösungen für Steroid-Immunoassays, welche ausgedehnte Lagerstabilität unter normalen Einsatzbedingungen aufweisen. Insbesondere gibt es einen Bedarf an solchen Lösungen, welche nicht signifikant degradieren, wenn sie über ausgedehnte Zeiträume bei Temperaturen zwischen ungefähr 2 und 8ºC gelagert werden. Es ist besonders wünschenswert für solche Lösungen, dass sie mehr als sechs Monate stabil sind.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Lagerstabilität von biologisch aktiven Steroidverbindungen, welche für eine Degradation durch Oxidation in verdünnten wässerigen proteinhaltigen Lösungen empfindlich sind, welche für die Standardisierung von Immunoassays von menschlichen Körperflüssigkeiten geeignet sind, wird verbessert durch Einlagerung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DETP) als ein Übergangsmetallchlelatbildner in der Lösung. Die interessierenden Steroide schließen die natürlich vorkommenden hormonellen Steroide wie Estradiol und Progesteron ein.
Das interessierende wässerige Medium umfasst Aktivkohlegereinigtes normales menschliches Serum und wässerige Lösungen von Rinderserumalbumin (BSA), insbesondere solche Lösungen, die auf einen pH-Wert zwischen ungefähr 6 und 9 gepuffert sind. Die Lösungen von besonderem Interesse umfassen solche mit einer Steroidkonzentration zwischen ungefähr 2,5 · 10&supmin;¹¹ und 1,0 · 10&supmin;&sup7; g/ml und einer Chlelatbildnerkonzentration größer als ungefähr 0,1 mM, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,2 und 50 mM.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Serie von Auftragungen des Verlustes von Progesteron in einer Standardlösung über Tagen bei 37ºC für eine Vielfalt von Chelatbildnern und eine Kontrollprobe.
Fig. 2 ist eine Auftragung des Verlustes von Estradiol in einer Standardlösung über Tagen bei 37ºC für einen Chelatbildner und eine Kontrollprobe.
Fig. 3 ist eine Auftragung des Verlustes von Estradiol in einer Standardlösung über Tagen bei 37ºC für einen Chelatbildner und eine Kontrollprobe.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die interessierenden Steroide bezüglich der vorliegenden Erfindung sind jene, welche biologische Aktivität in Menschen zeigen und eine Neigung dazu haben, einer oxidativen Degradation in einem wässerigen Medium zu unterliegen. Diese Steroide sind wahrscheinlich Targets für Immunoassays und sind folglich wahrscheinlich, als Standards für solche Assays verwendet zu werden. Solche Standards nutzen typischerweise wässerige Medien, um das Referenz-Steroid für den Assay in einem Medium zu präsentieren, das der Körperflüssigkeit ähnlich ist, an welcher der Immunoassay durchgeführt wird. Unter diesen Steroiden befinden sich die natürlich vorkommenden hormonellen Steroide, und diejenigen von besonderem Interesse sind jene, deren normale biologische Gehalte fluktuieren, wie z. B. die weiblichen Sexualhormone. Eingeschlossen in dieser Gruppe sind Progesteron, Estron und Estradiol. Andere interessierende Steroide umfassen Cortisol und Testosteron.
Die wässerigen Medien von besonderem Interesse sind jene, welche einen beträchtlichen Proteingehalt haben. Es ist oft wünschenswert für die Standards für einen Immunoassay, dass sie in einem Medium ausgeführt werden, welches dem Verhalten einer menschlichen Körperflüssigkeit wie einem Serum ähnlich ist oder dieses nachahmt. In einigen Fällen ist es vorteilhaft, Proteingehalte zu verwenden, die drastisch anders sind als die der zu untersuchenden menschlichen Körperflüssigkeit. Das kann die Einstellung auf andere Merkmale der Körperflüssigkeit erlauben. Menschliche Körperflüssigkeiten einschließlich Serum haben einen beträchtlichen Proteingehalt. Typische Proteinkonzentrationen können im Bereich zwischen ungefähr 10 und 300 mg/ml sein, wobei ungefähr 50 mg/ml für Serum typisch ist. Dieser Proteingehalt kann natürlich vorhanden sein, zum Beispiel in normalem menschlichen Serum, oder er kann hinzugefügt sein, wie eine fünfprozentige (Masse pro Volumen) wässerige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA).
Es wird bevorzugt, dass das wässerige Medium im wesentlichen frei von Fibrinogen ist. Somit wird bevorzugt, andere Medien als Plasma zu verwenden. In dieser Hinsicht ist es außerdem bevorzugt, Medien zu vermeiden, welche Partikel-bildende Verbindungen enthalten.
Es wird bevorzugt, dass die Proteinlösung im wesentlichen frei von indigenem Steroid ist. Daher wird, falls die Proteinlösung normales menschliches Serum ist, dieses vorzugsweise Aktivkohle-gereinigt, um die natürlich vorkommenden Steroide zu entfernen. Andererseits werden Proteinpräparationen besonders bevorzugt, aus welchen die Steroide entfernt worden sind durch andere Verfahren, wie kommerziell erhältliches steroidfreies, nicht-Aktivkohle-gereinigtes BSA. Darunter befinden sich diejenigen, die durch eine Waschung mit einer organischen Phase erhalten wurden. Man ist der Ansicht, dass Aktivkohle-Reinigung unerwünschte Übergangsmetalle wie Eisen beitragen könnte.
Man ist der Ansicht, dass das Protein selbst eine Quelle unerwünschter Übergangsmetalle sein könnte. Proteine sind bekannt dafür, mit Metallen auf Arten Komplexe zu bilden, welche es schwierig machen, Übergangsmetall frei von Protein zu erhalten.
Es wird vorgezogen, obgleich es nicht notwendig ist, dass das wässerige Medium einen ähnlichen pH-Wert wie den von menschlichen Körperflüssigkeiten hat. Es wird besonderes bevorzugt, dass das wässerige Medium einen pH-Wert zwischen ungefähr 6 und 9 hat, wobei ein pH-Wert zwischen 7 und 8,5 besonders bevorzugt wird. Der pH-Wert des wässerigen Mediums wird praktischerweise mit irgendeinem der gebräuchlichen Puffer eingestellt, die mit biologischen Materialien eingesetzt werden, wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan, gemeinhin bekannt als Tris.
Die Steroidkonzentrationien der wässerigen interessierenden Lösungen sollten den Bereich von Steroidkonzentrationen umspannen, der bei der Untersuchung von menschlichen Körperflüssigkeiten angetroffen wird. Auf typische verschiedene Steroide wird untersucht bei Gehalten zwischen ungefähr 5 Pikogramm pro ml und 100 Nanogramm pro ml. Von besonderem Interesse sind Konzentrationen zwischen ungefähr 5 · 10&supmin;¹¹ und 4 · 10&supmin;&sup8; Gramm pro ml.
Der Chelatbildner sollte verwendet werden in Mengen, die wirksam sind, um die oxidative Degradation der wässerigen Steroidlösungen zu hemmen. Es wird bevorzugt, ihn in Mengen über ungefähr 0,1 mM zu verwenden, und es ist besonders bevorzugt, ihn in Mengen zwischen ungefähr 0,2 und 50 mM zu verwenden. Es ist besonders vorteilhaft, eine Chelatbildner-Konzentration von mindestens ungefähr 1 mM zu verwenden. Es scheint einen begrenzten Vorteil bei der Verwendung von Chelatbildner-Konzentrationen über ungefähr 20 mM zu geben, besonders mit den wirksameren Eisenchelatbildnern der Aminotetra- und -pentaessigsäureklasse zu sein. Jedoch abgesehen von den Kosten scheint es nicht besonders unvorteilhaft zu sein, höhere Konzentrationen zu verwenden.
Die Hemmung oxidativer Degradation, die durch die Chelatbildner erreicht wird, kann bequem bewertet werden, indem wässerige Steroidlösungen bei erhöhten Temperaturen für verschiedene Zeiten beansprucht werden und der Verlust des Steroidgehalts beobachtet wird, der durch Immunoassay detektierbar ist. Die Ergebnisse, die durch erhöhte Temperaturuntersuchung erhalten wurden, können die Langzeitstabilität von Steroidlösungen vorhersagen, die bei tieferen Temperaturen gehalten werden.
Steroidstandards für Immunoassays werden typischerweise bei einer Temperatur zwischen ungefähr 2 und 8ºC gehalten und haben wünschenswerterweise eine Stabilität von länger als ungefähr sechs Monaten, d. h. sie zeigen keine signifikante Degradation innerhalb von sechs Monaten. Es ist besonders wünschenswert, dass die Standards in einem Immunoassay einen Verlust des Signals von weniger als ungefähr 10 Prozent zeigen, vorzugsweise von weniger als ungefähr 5 Prozent.
Derartige Stabilitäten können bequem projiziert werden aus Hiltzealterung bei ungefähr 37ºC über den Verlauf von zwischen 4 und 5 Wochen. Für Zusammensetzungen, welche weniger als ungefähr 10% Verlust in vier Wochen zeigen, wird angenommen, dass sie eine Stabilität von länger als sechs Monaten besitzen.
Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend für die Erfindung und sind in keiner Weise zu interpretieren als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert wird. Es wird geschätzt, dass sich ein Fachmann viele andere Vorrichtungen und Verfahren der Verwendung vorstellen kann, auf welche die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können.

Beispiel 1: IMx® Estradiol-Assay

Estradiol-Assays wurden mit dem folgenden Format auf IMx®- Wegwerfpatronen durch ein IMx®-Instrument durchgeführt. Fünfundsiebzig Mikroliter (75 ul) einer Serumprobe wurden gemischt mit 35 ul 5-α-Dihydrotestosteron-Puffer (DHT-Puffer), 50 ul einer Kaninchen-Anti-Estradiol-Antikörper-überzogenen Mikropartikelsuspension und 90 ul IMx®-Puffer. Das Reaktionsgemisch wurde 27,5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Der DHT-Puffer war eine wässerige Lösung mit einem pH-Wert von 4, 5 von 2 ug/ml 5-α- Dihydrotestosteron, 0,75% (m/V) Saponin, 0,5 M Glycin, 0,25 mM Natriumcitrat und 0,12% Methylisothiazolinon. Die Kaninchen- Anti-Estradiol-Antikörper-überzogene Mikropartikelsuspension enthielt 0,01% Feststoffe, die in Mikropartikelpuffer suspendiert waren, welcher eine wässerige Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 von 0,1 M Bis-(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan (Bis-Tris), 0,1 M Natriumchlorid, 13,6% Sucrose, 0,1% Natriumazid und 0,2 mg/ml normalem Kaninchen-IgG war. Der IMx®- Puffer war eine wässerige Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 von 0,3 M NaCl, 0,1 M TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) und 0,1% Natriumazid. IMx®-Estradiol-Reagenzien (einschließlich DHT- Puffer, Kaninchen-Anti-Estradiol-Antikörper-überzogene Mikropartikelsuspension, Konjugat und Methylumbelliferonphosphatsubstrat), IMx®-Puffer, IMx®-Wegwerfpatronen und IMx®-Instrumente sind kommerziell erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, und sind beschrieben in US 5.342.760, EP-A-288 793 und in Fiore et al., Clin. Chem. 34/9: 1726-1732, 1988.
Einhundertfünfundsiebzig Mikroliter (175 ul) des Reaktionsgemisches wurden auf die Fasermatrix einer IMx®-Wegwerfpatrone überführt. Die Fasermatrix befindet sich über einem absorbierenden Kissen der IMx®-Patrone. Die Mikropartikel wurden durch die Fasermatrix eingefangen und die Lösung wurde von dem absorbierenden Kissen absorbiert. Die Mikropartikel wurden dann mit IMx®-Puffer gewaschen. Sechzig Mikroliter (60 ul) Estron- 6-(O-carboxymethyl)oxim-alkalische Phosphatase-Konjugatlösung wurden zu der Matrix hinzugegeben, 12 Sekunden lang bei 37ºC inkubiert und dann wieder mit IMx®-Puffer gewaschen. Die Konjugatlösung war eine wässerige Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 von 0,1 M Bis-Tris, 0,5 M Natriumchlorid, 1% Casein, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Zinkchlorid und 0,1% Azid, die ausreichend Konjugat enthält, um eine bestimmte Signalstärke zu ergeben, wenn sie in einem Assay einer Analyt-freien Probe eingesetzt wird.
Fünfundsechzig Mikroliter (65 ul) einer wässerigen Lösung mit einem pH-Wert von 9 von 1,2 mM 4-Methylumbelliferonphosphat und 0,1 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol wurden zu der Matrix hinzugegeben und die Geschwindigkeit der 4-Merthylumbelliferonbildung wurde durch Fluoreszenzextinktion gemessen. Das IMx®- Instrument maß die Fluoreszenz mit einem Fluorofotometer, welches eine Quecksilberdampflampe als seine Lichtquelle verwendete (wie beschrieben in Fiore et al., Clin. Chem. 34/9: 1726- 1732, 1988).
Unter Verwendung von Kalibratoren, die 0, 50, 250, 750, 1500 und 3000 pg/ml Estradiol enthielten, wurde eine Standardkurve erstellt. Unter Verwendung dieser Kurve wurde für diesen Assay bestimmt, dass er eine mittlere Sensitivität von 13,9±4,3 pg/ml aufweist.

Beispiel 2: IMx® Progesteron-Assay

Progesteron-Assays wurden auf IMx®-Wegwerfpatronen durch ein IMx®-Instrument unter Verwendung eines Formats ähnlich dem des Estradiol-Assays in Beispiel 1 durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Fünfzehn Mikroliter (15 ul) einer Serumprobe wurden gemischt mit 80 ul Progesteronprobenpuffer, 80 ul einer Anti-Progesteron-Antikörper-überzogenen Mikropartikelsuspension und 75 ul IMx®-Puffer. Das Reaktionsgemisch wurde 20,8 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Der Progesteronprobenpuffer war eine wässerige Lösung mit pH 2,8 von 2,25 M Glycin, 0,5 ug/ml 5-α-Dihydrotestosteron, 0,2% (m/V) Saponin, 0,1 M Natriumchlorid und 0,1% Methylisothiazolinon (erhältlich von Rohm und Haas, Philadelphia, PA). Die Anti-Progesteron- Antikörper (erhältlich von University of Surry, Australien)- überzogene Mikropartikelsuspension enthielt 0,001% Feststoffe (Mikropartikel erhältlich von Seradyne, Indianapolis, IN), die in einem Puffer suspendiert waren, welcher eine wässerige Lösung mit pH 6,5 ist von 0,5 M Morpholinethansulfonsäure (MES), 0,1 M Natriumchlorid, 10% Sucrose, 2% Rinderserumalbumin (erhältlich von Intergen, Hawthorne, NY), 0,1 mg/ml Schaf-igG (50% Ammoniumsulfatschnitt von Schafserum, erhalten von Irvine Scientific, Santa Ana, CA) und 0,2% Natriumazid.
Einhundertfünfundsiebzig Mikroliter (175 ul) des Reaktionsgemischs wurden auf die Fasermatrix einer IMx®-Wegwerfpatrone überführt. Die Mikropartikel wurden dann mit IMx®-Puffer gewaschen. Sechzig Mikroliter (60 ul) 17-Hydroxyprogesteron- 3-(O-carboxymethyl)oxim-alkalische Phosphatase-Konjugatlösung wurden zu der Matrix hinzugegeben, das Reaktionsgemisch wurde 8 Sekunden lang bei 37ºC inkubiert und dann wieder mit IMx®-Puffer gewaschen. Die Konjugatlösung enthielt 17-Hydroxyprogesteron (erhältlich von Steraloids, Wilton, NH), gekoppelt an alkalische Phosphatase (erhältlich von Boehringer Mannheim, Germany) mittels des EDAC-Kopplungsverfahrens, wie beschrieben in US 5.342.760. Die Konjugatlösung war eine wässerige Lösung mit pH 7,4 von 50 mM Tris, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Zinkchlorid, 0,5% Casein (erhältlich von Sigma Chemical, St. Louis, MO.) und 0,1% Azid, die ausreichend Konjugat enthält, um eine bestimmte Signalstärke zu ergeben, wenn sie in einem Assay einer Analyt-freien Probe eingesetzt wird.
Die Zugabe von 4-Methylumbelliferonphosphat und die Quantifizierung der Geschwindigkeit der 4-Methylumbelliferon- Bildung war wie in Beispiel 1 beschrieben. Unter Verwendung von Kalibratoren, die 0, 1, 4, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron enthielten, wurde eine Standardkurve erstellt. Unter Verwendung dieser Kurve wurde für diesen Assay bestimmt, dass er eine mittlere Sensitivität von 0,13 ng/ml aufweist.

Beispiel 3: Herstellung der Serummatrix

Steroid-gereinigtes Serum wurde hergestellt, indem ein Liter normales menschliches Serum (erhältlich von Interstate Blood Bank, Memphis, TN) mit 50 Gramm Aktivkohle (erhältlich von R. W. Greef and Co., Orland Park, IL) gemischt wurde. Nach zwei Stunden Mischen bei Raumtemperatur wurde die Aktivkohle durch Filtration entfernt. Alkaligeschocktes Serum wurde für Estradiolserummatrizen verwendet (erhältlich von Abbott Laboratories als IMx®-Estradiol Specimen Diluent). Alkaligeschocktes Serum wurde hergestellt aus Aktivkohle-gereinigtem Serum, indem der pH-Wert mit 6 N Natriumhydroxid auf pH 11 angehoben wurde, die Mischung bei 2-8ºC ungefähr 18 Stunden inkubiert wurde, der pH- Wert auf ungefähr 8,0 mit 6 N HCl eingestellt wurde und das Endgemisch filtriert wurde. Natriumazid wurde zu 0,2% (m/V) für alle Serummatrizen hinzugegeben. Estradiol (erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO) oder Progesteron (erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO) wurden zu Aliquoten von Steroid-gereinigtem Serum hinzugegeben, um Kalibratoren, Kontrollen oder Testproben für die unten beschriebenen Stabilitätsexperimente zu bilden.

Beispiel 4: Herstellung der BSA-Matrix

Eine Rinderserumalbimun-(BSA)-basierte Kalibratormatrix für IMx Estradiol wurde hergestellt, indem BSA, gereinigt von Steroiden durch eine organische Waschung (erhältlich von Miles Pentex, Kankakee, IL), zu einer Konzentration von 5% (m/V) in einer wässerigen Lösung mit pH 8 von 0,1 M Tris(hydroxymethyl) aminomethan und 0,2% Natriumazid gelöst wurde.

Beispiel 5: Wirkungen von verschiedenen Chelatbildnern auf die Stabilität von Progesteron in Serum

Ein Verfahren wurde ersonnen, welches die notwendige Beobachtungszeit verringert, die zum Messen der Steroidprobenzersetzung erforderlich ist, um nützliche Informationen zur Stabilität von Progesteron- und Estradiolkalibratoren und -kontrollen aus Matrixstabilitätsexperimenten in einem vernünftigen Zeitraum zu erhalten. Testproben wurden bei 37ºC inkubiert und über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen beobachtet. Die höhere Temperatur beschleunigte die Steroiddegradation, die normalerweise Beobachtung über Zeiträume von Monaten erfordert hätte, wären die Kalibratoren und Kontrollen die ganze Zeit über bei 2-8ºC gelagert worden.
Aktivkohle-gereinigtes menschliches Serum, wie hergestellt in Beispiel 3, (nicht alkaligeschockt) (10 ml) wurde in aliquoten Teilen in Szintillationsglasfläschchen eingefüllt und verschiedene Metallchelatbildner wurden zu den folgenden Endkonzentrationen hinzugegeben:
a) 1,0 mM Diethylentriaminpentaessigsäure (DETP, erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO)
b) 10,0 mM Diethylentriaminpentaessigsäure (DETP)
c) 1,0 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO)
d) 10,0 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
e) 1,0 mM Deferoxaminmesylat (erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO)
Proben wurden auf einem Schaukelrahmen 12 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann zu 5 ng/ml versetzt mit 10 ug/ml Progesteron (erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO), hergestellt in einer Ethanol-Vorratslösung. Proben wurden auf Basislinienkonzentrationen von Progesteron im Anschluss an 8 Minuten Inkubation auf einem Schaukelrahmen bei Raumtemperatur untersucht. Vier 1,0-ml-Aliquote von jeder Zusammensetzung wurden in TDx® Mikrozentrifugenröhrchen (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) gebracht und gefroren bei -20ºC gelagert. Die Szintillationsglasfläschchen wurden bei 37ºC inkubiert. An den angezeigten Tagen wurden Aliquote aufgetaut und mit den entsprechenden Aliquoten getestet, die von den Glasfläschchen gezogen wurden, die bei 37ºC gelagert wurden, um den prozentualen Verlust zu bewerten.
Der prozentuale Verlust (% Verlust) ist eine absolute Bestimmung des Verlustes von Progesteron in einer beanspruchten Probe in Bezug auf ein gefrorenes Aliquot. Es können 24 Proben während eines einziges Laufs auf dem IMx®-Instrument getestet werden. Das IMx® misst der Geschwindigkeit der 4-Methylumbelliferonbildung, welche proportional zu der Menge an Steroid-alkalischer Phosphatase-Konjugat-Bindung ist. Da die IMx® Estradiol- und Progesteron-Assays kompetitiv sind, ist die Geschwindigkeit der 4-Methylumbelliferonbildung umgekehrt proportional zur Analytkonzentration. Der Vergleich der Konzentrationen für Testproben aus einem einzigen Lauf kann deshalb eine intern kontrollierte Anzeige der Analytkonzentration bereitstellen. Solche Vergleiche werden nicht durch Schwankungen zwischen Läufen oder von Instrument zu Instrument verkompliziert.
Für diese Experimente wurden Aliquote ohne Zusatz von Progesteron zusammen mit den mit Progesteron versetzten Aliquoten in den gleichen Lauf eingeschlossen. Konzentrationen wurden bestimmt für jeden Alterungszustand durch Dividieren des Signals von einer beanspruchten oder gefrorenen mit Progesteron versetzten Probe durch das Signal eines Aliquots ohne Zusatz von Progesteron und Auftragen des Ergebnisses auf einer Verdrängungskurve, die zuvor für diesen Assay entwickelt wurde. Der prozentuale Verlust wird bestimmt durch Dividieren des Unterschiedes zwischen den gefrorenen und beanspruchten Konzentrationen durch die Konzentration, die für das gefrorene Aliquot erhalten wurde. Die Ergebnisse werden angezeigt als prozentualer Verlust, d. h. [(gefroren-beansprucht)/gefroren] · 100%. Fig. 1 veranschaulicht die Reduktion des prozentualen Verlustes über der Zeit (Tag 0, 3, 8, 15 und 29) durch die Zugabe von Deferoxamin, DETP und EDTA im Vergleich zu keinem hinzugefügten Reagenz. Die Reduktion des prozentualen Verlustes war am wirksamsten für 10 mM DETP, gefolgt von 1 mM DETP. Der prozentuale Verlust war mit 10 mM DETP nach 29 Tagen eliminiert im Vergleich zu ungefähr 80% Verlust ohne zugesetztes Reagenz.

Beispiel 6: Stabilisierung von Estradiol in Serum durch DETP

Fünfzehn Milliliter (15 ml) eines alkaligeschockten Aktivkohle-gereinigten menschlichen Serums, hergestellt in Beispiel 3, wurden in aliquoten Teilen in ein Szintillationsglasfläschchen eingefüllt und Diethylentriaminpentaessigsäure (DETP) wurde zu 10 mM hinzugegeben. Eine Kontrollprobe wurde ohne zugesetzte DETP hergestellt. Die Proben wurden auf einem Schaukelrahmen 8 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, 2 Stunden lang ins Gleichgewicht kommen gelassen, und dann zu 750 pg/ml versetzt mit einer 500-ng/ml-Vorratslösung von Estradiol (erhältlich von Sigma Chemical, Saint Louis, MO), hergestellt in Aktivkohlegereinigtem Serum. Im Anschluss an eine 5-minütige Inkubation auf einem Schaukelrahmen bei Raumtemperatur wurden Proben auf Basislinienkonzentrationen untersucht. Vier Ein-Milliliter-Aliquote wurden abgelegt in TDx®-Mikrozentrifugenröhrchen (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) und bei -20ºC gefroren. Die Szintillationsglasgefäschchen wurden bei 37ºC inkubiert. An den angezeigten Tagen wurden gefrorene Aliquote aufgetaut und mit den entsprechenden Aliquoten getestet, die von den Glasfläschchen gezogen wurden, die bei 37ºC gelagert wurden, um den prozentualen Verlust unter Verwendung der Datenbehandlung zu bewerten, die in Beispiel 5 ausgeführt wurde, aber unter der Annahme, dass die Ergebnisse normalisiert werden konnten unter Verwendung des Standardsignals für eine Probe ohne Zusatz von Estradiol. Fig. 2 veranschaulicht die Reduktion des prozentualen Verlustes über der Zeit (Tag 0, 7, 14, 21 und 28) durch die Zugabe von 10 mM DETP im Vergleich zu keinem hinzugefügten Reagenz. Für den prozentualen Verlust wurde beobachtet, dass er sich durch die Zugabe von 10 mM DETP von über 20% auf nahezu keinen Verlust nach 28 Tagen verringert.

Beispiel 7: Stabilisierung von Estradiol in einer 5%igen BSA- Matrix durch DETP

Eine BSA-Matrix wurde hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und in zwei Hauptaliquote geteilt. DETP wurde zu einem Aliquot zu 20 mM hinzugegeben. Estradiol wurde zu beiden Aliquoten zu einer Konzentration von 750 pg/ml hinzugegeben, und jedes Aliquot wurde weiter in Aliquote geteilt in 10 Polyethylentropfflaschen. Fünf Tropfflaschen von jedem Hauptaliquot wurden bei 37ºC inkubiert und die anderen fünf wurden bei -20ºC eingefroren. An den angezeigten Tagen wurde ein gefrorenes Aliquot aufgetaut und mit einem entsprechenden 37ºC-Aliquot getestet, um den prozentualen Verlust wie in Beispiel 6 beschrieben zu bewerten. Fig. 3 veranschaulicht die Reduktion des prozentualen Verlustes über der Zeit (Tag 0, 7, 14, 21, 28 und 35) durch die Zugabe von 20 mH DETP im Vergleich zu keinem hinzugefügten Reagenz. Für den prozentualen Verlust wurde beobachtet, dass er sich durch die Zugabe von 20 mM DETP von über 10% auf nahezu keinen Verlust nach 28 Tagen verringert.

Claims

1. Eine Kalibratorzusammensetzung zur Verwendung als ein Referenz-Standard in einem Immunoassay, die ein Steroid und Diethylentriaminpentaessigsäure in einem wässerigen Medium umfasst.

2. Die Zusammensetzung von Anspruch 1, worin das Steroid ein degradationsempfindliches biologisch aktives Steroid ist.

3. Die Zusammensetzung von Anspruch 2, worin das Steroid, katalysiert durch ein Übergangsmetall, in einem wässerigen Medium oxidativ degradierbar ist.

4. Die Zusammensetzung von Anspruch 3, die ein Protein umfasst.

5. Die Zusammensetzung von Anspruch 4, worin der Proteingehalt von ungefähr 10 mg/ml bis ungefähr 300 mg/ml ist.

6. Die Zusammensetzung von Anspruch 5, worin die Lösung gepuffert ist.

7. Die Zusammensetzung von Anspruch 5, worin der Proteingehalt durch Rinderserumalbumin geliefert wird.

8. Die Zusammensetzung von Anspruch 7, worin der Proteingehalt durch normales, Holzkohle-gereinigtes menschliches Serum geliefert wird.

9. Die Zusammensetzung von Anspruch 5, worin das Steroid Estradiol oder Progesteron ist.

10. Die Zusammensetzung von Anspruch 9, worin das Steroid Estradiol ist.

11. Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin der Proteingehalt durch Steroid-gereinigtes Rinderserumalbumin geliefert wird.

12. Die Zusammensetzung von Anspruch 11, worin das wässerige Medium im wesentlichen frei von Fibrinogen ist.

13. Die Zusammensetzung von Anspruch 11, worin das wässerige Medium kein Plasma ist.

14. Die Zusammensetzung von Anspruch 4 oder 5, worin die Steroid-Verbindung in einer Konzentration zwischen 2,5 · 10&supmin;¹¹ und 1,0 · 10&supmin;&sup7; g/ml vorliegt.

15. Die Zusammensetzung von Anspruch 4 oder 5, worin die Diethylentriaminpentaessigsäure in einer Konzentration größer als 0,1 mM vorhanden ist.

16. Die Zusammensetzung von Anspruch 15, worin die Diethylentriaminpentaessigsäure in einer Konzentration zwischen 0,2 und 50 mM vorhanden ist.

17. Ein Verfahren zur Stabilisierung von Metallionen enthaltenden Lösungen von Steroid-Immunoassay-Referenz-Standards, die den Schritt Hinzufügen einer effektiven chelatisierenden Menge von mindestens 0,1 mM Diethylentriaminpentaessigsäure und einem Steroid in einer wässerigen Lösung umfasst, worin die Säure Metallionen aus der Lösung maskiert.

18. Das Verfahren von Anspruch 17, worin die chelatisierende Menge von Diethylentriaminpentaessigsäure von 0,2 mM bis 50 mM beträgt.

19. Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Steroid und Diethylentriaminpentaessigsäure in einem wässerigen Medium als ein Referenz-Standard in einem Immunoassay umfasst.