DE2705897A1 - Mehrkomponenten-reagens zur bestimmung von cyclischem adenosin-3',5'- monophosphat und/oder cyclischem guanosin- 3',5'-monophosphat und seine verwendung - Google Patents

Mehrkomponenten-reagens zur bestimmung von cyclischem adenosin-3',5'- monophosphat und/oder cyclischem guanosin- 3',5'-monophosphat und seine verwendung

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Description

DlPL-CHEM. DR. ELISABETH JUNG SSÄSSÄ
DIFL-PHYS. DR. JÖRGEN SCHIRDEWAHN tclefoi*»«·/
DR.-ING. GERHARD SCHMITT-N I LSON ^^Τ^ψ^ΤαΠ fATEWTANWXLTE *
L 3*»9 C (J/MK/or) 11. Februar 1977
Case 96I7
YAMASA SHOYU KABUSHIKI KAISHA
Choshi-Shi, Chiba-Ken, Japan
"Mehrkomponenten-Reagens zur Bestimmung von cyclischem Adenosin-31> 5'-monophosphat und/oder cyclischem Guanosin-3'»51-monophosphat und seine Verwendung"
beanspruchte Priorität: 12. Februar I976 - Japan - Nr. 1Ί665/76
Die Erfindung betrifft ein Reagens zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-31,5'-monophosphat und/oder eyclischem Guanosin-3'j5'-monophosphat, im folgenden auch als CAMP bzw. cGMP abgekürzt.
In den vergangenen Jahren wurden cyclisches Adenosin-3'»51-monophosphat und cyclisches Guanosin-31,5'-monophosphat wegen ihrer grossen Rolle bei der Hormonwirkung eingehend untersucht. Die Tatsache, dass sich der Gehalt von cAMP und cGMP in einem
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erlebenden Organismus ändert, wenn sich dieser Organismus in einem unphysiologischen oder pathologischen Zustand befindet, wie z.B. einsr Krankheit, und daher die Bestimmung dieser cyclischen Nucleotide sind von grösster Bedeutung nicht nur für die Grundlagenforschung sondern auch in der klinischen Medizin,für die Diagnose, die Vorbeugung und die Therapie. So ist die Bestimmung von cAM? und cGMP aus Proben von z.B. Leukozyten von asthmatischen Patienten, aus der Haut von Psoriasis-Patienten, aus Blutplätt-
chen von Thrombozytose-Patienten, aus Blut und Urin von Pseudohypoparathyreoidismus-
Patienten, aus Blut und urin von Patienten mit
Kuskeldystrophie, aus der cerebrospinalen Flüssigkeit von Banisch-depressiven Patienten, sehr wichtig für die Diagnose und die Behandlung dieser Erkrankungen. Ausserdem sind noch weitere Zusammenhänge zwischen diesen Bestimmungen und verschiedenen anderen Krankheiten zu erwarten.
das
Leider ist/Verfahren zur Bestimmung von cAMP-und cGMP nicht «ufriedenstellend, nicht nur wegen der mangelnden Empfindlichkeit sondern auch weil die Herstellung von Proben aus Organismen Zeit^und Wirtschaf tlichkefcsprobleme auf wirft. Ausserdem beeinträchtigen nichtspezifische Paktoren, die in der Probe aus dem Organismus vorhanden sind, die Bestimmung. Um diese Wirkung auszuschalten, muss man die Probe sehr stark verdünnen, was wiederum die Konzentration des ohnehin in sehr geringen Mengen und deshalb schwer zu bestimmenden cAMP und cGHP noch vermindert. Diese verhinderte Konzentration liegt nun im untereten Bereich der Messbarkeit, quantitative Bestimmungen sind ausserordentlich echwierig. Ausserdem unterscheidet eich der Gehalt von cAMP und
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cGMP in einem lebenden Organismus stark voneinander, so dass eine einsige Probe nicht für die Bestimmung beider Nucleotide ▼erwendet werden kaiin.
In Tabelle I sind die im Handel erhältlichen Reagenzien zur Bestimmung von cAMP und cGMP sowie die messbaren Kindestmengen angegeben.
Tabelle I
Produkt Zusammensetzung
1 Tris/EDTA-Puffer
2 cAMP-Standardlösung
3 Tritium-markierfce3 cAMP M bindendes Protein
5 Material für die Trennung
messbare Mindestmenge (pMol*/Röhrchen)
0,2
1 cAMP-Standardlösung B 2 Jod-markiertes cAMP 3 cAMP-Antikörper
0,05
1 cAMP-Standardlösung
2 Jod-markiertes cAMP
3 cAMP-Antikörper
4 Antikörper für die Trennung
Tabelle I CFortsetzung)
Produkt Zusammensetzung
1 Acetat-Puffer
2 cAMP-Standardlösung
3 Tritium-markiertes cAMP 1I bindendes Protein
5 Trennfilter
6 Puffer zum Waschen des Filters
messbare Mindestmenge (p/MorVRöhrehen)
1 cGMP-Standardlösung
2 Jod-markiertes cGMP
3 cGMP-Antikörper
0,05
1 cGMP-Standardlösung
2 Jod-markiertes cGMP
3 cGMP-Antikörper
1J Antikörper für die Trennung 0,05
1 Acetat-Puffer
2 Tritium-markiertes cGMF
3 cGMP-Standardlösung
0,2
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Iff
- -ar -
Aus Tabelle I ist ersichtlich, das3 die unterste messbare Grenze für die Bestimmung von cAMP und cGMP bei 0,05 pMol/Röhrchen oder darüber liegt, wobei es mit diesen Reagenzien jedoch nicht möglich ist, eine Ultramikrobestimmung von cAMF und cGMP durchzuführen.
Aus "Analytical Biochemistry", Band 56, Seiten 391* bis 107 (1973)s ist bekannt, dass man die Empfindlichkeit im Radioimmunität s ve rauch dadurch erhöhen kann, dass man das cAMP Buccinyliert und dadurch seine Affinität zu seinem Antikörper erhöht. Diese Succinylierung kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen: Im Verfahren A wird eine gefriergetrocknete Probe eines Organismus und ll-Morpholino-NjN'-dicyclohexylcarboxamidin in Pyridin gelöst und mit einer Lösung von Bernsteinsäire-anhydrid in Dioxan versetzt. Im Verfahren B wird gepulvertes Bernstein-8äure-anhydrid und- Triäthylamin zu einer wässrigen Lösung der Organismusprobe zugegeben.
Verfahren A ist praktisch wegen verschiedener Schwierigkeiten jedoch nicht durchführbar9 z.B. wegen des gefriergetrockneten Zustande der Probe und wegen der niedrigen Succinylierungsrate, die auf die niedrige Löslichkeit des cAMP in dem Lösungsmittel Eurückzufuhren ist. Im Verfahren B int es wegen der PuI ^e „'form des Bernsteinsäure-;anhydride und seiner Hydrolysierbarkeit in einem wässrigen Lösungsmittelsystem wesentlich, für die rasche Auflösung und die Diffusion des Bernsteinsäure-anhydrids in die wässrige Lösung der Probe zu sorgen, damit die succiny lierang mit genügend hoher Geschwindigkeit stattfinden kann. Zusätzlich
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Il
xur Schwierigkeit der Handhabung dieses Pulvers muss in diesem Verfahren B für eine Schüttelausrüstung gesorgt sein. Die gleichzeitige Bestimmung einer grossen Anzahl von Proben ist deshalb in diesem Verfahren besonders schwierig. Ausserriem wird in diesem Verfahren B zur Trennung des freien cAMP und des nach der Antigen-Antikörperreaktion an den Antikörper gebundenen cAMP die Dialyse verwendet. Auch für die Dialyse ist eine spezielle Ausrüstung notwendig, so dass dieses Verfahren im gesamten keine zufri. lenstellenden Ergebnisse ergibt.
Aufgabe der Erfindung war es, die bei der Bestimmung von cAMP und cGMF mit herkömmlichen Reagenzien anfallenden Probleme zu lösen und die gleichzeitige ültramikroskopische Bestimmun;: von cAMP und cGMP zu ermöglichen.
Die Erfindung betrifft daher ein Mehrkomponenten-Reagens zur Bestimmung von cyclischem Adenosin-3f ,5'-nionopnosphat (cAMP) und/ odercyclischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP), bestehend aus
a) mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-iid.enosin-3f,S'-monophosphat-tyrosinmethyl^eter und/oder cyclischem Succinyl-guanosin-3' ,5'-monophosphat-tyrosinmethy!ester,
b) einem Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-öGMP-Serum,
c) einer Imidazol-Pufferlösung in einer Konzentration von
0,1 Mol OUBr wöiici",
d) Substanzen für eine Trennung,
e) Bernsteinsäure-anhydrid in einem organischen Lösungsmittel,
f) einem organischen tertiären Amin und
g) einer cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung.
* 709833/0943
Die wesentlichen Bestandteile des erfindungsgeniässen Reagens sind das Bernsteinsäure-anhydrid und das organische tertiäre Amin für die Succinylierung und die Imidazol-Pufferlösung für die Antigen-Antikörper-Reaktion.
Es wurde nämlich festgestellt, dass die Succinylierung von cAMP und cGMP mit zufriedenstellenden Ergebnissen erfolgt, wenn man ^ sie in e^-em System von Wasser und einem organischen Lösungsmittel durchführt. Deshalb wird das Bersteinsäure-anhydrid im erfindungsgemäss»n Reagens in Form einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel angeboten, wodurch die Handhabung des Bernsteinsäure-anhydrids wesentlich einfacher wird. Durch einfaches Vermischen der organischen Lösung des Bernsteinsäureanhydrids (Komponente e) mit dem organischen tertiären Amin (Komponente f) unmittelbar vor dem Versuch und Zugeben des Gemisches zur cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung oder einer Probe, erfolgt die Succinylierung des cAMP und/odf r cGMP sofort, ausserdem kann die Empfindlichkeit gegenüber dem Antiserum deutlich erhöht werden. Wegen dieser verbesserten Empfindlichkeit kann man die Probe vor der Reaktion mit dem Antiserum noch einmal verdünnen.
Durch diese Verdünnung ist es nun möglich, die die Reaktion .hemmenden Faktoren zu entfernen, ausserdem wird der Bestimmungsfehler stark vermindert. Dank des grösseren Flüssigkeitsgleichzeitig t
Volumens ist es möglich.mit der gleichen Probe/mehrere Bestimmungen. ■ ; . ■■" von cAMP und cGMP durchzuführen. Ausserdem können K^irperflüssigkeiten, wie Blut,
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cerebrospinale Flüssigkeit, Urin und saure Extrakte von Körpergewebe als solche als Proben verwendet werden.
Ferner wurde festgestellt, dass durch Verwendung eines Imidazol- ] Puffers mit einer Konzentration von 0,1 Mol oder darüber in der Antigen-Antikörper-Reaktion anstelle des bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- oder Citratpvffers die Antigen-Antikörper-Reaktion stabilisiert werden kann und dass die Hemmwirkung des Succinylierungsmittels vollständig ausgeschaltet wird. Deshalb ist das zweite wesentliche Merkmal des erfindungsgemässen Reagens die Verwendung des Imidazol-Puffers.
Auf diese Weise gestattet das erfindungsgemässe Reagens zum ersten Mal die gleichzeitige ultramikroskopische Bestimmung von cAMP und cGMP in einer einzigen Probe auf sehr einfache Weise. Ausserdem liegt die geringste messbare Menge für cAMP und cGMP mit dem erfindungsgemässen Reagens jeweils bei etwa 0,006 pMol/ Röhrchen.
Die Menge an Bernsteinsäure-anhydrid in Komponente e des erfindungsgemässen Reagens beträgt 2 bis 6 mg, vorzugsweise 3,5 bis ^,5 mg/100 ul der zu untersuchenden Probe. Es wurde festgestellt, dass bei einem überschuss von Bernsteinsäure-anhydrid diese Verbindung während der Succinylierungsreaktion ausfällt und möglicherweise die Antigen-Antikörper-Reaktion hemmt.
Als Lösungsmittel für das Bernsteinsäure-anhydrid geeignet ist
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jedes organische Lösungsmittel, das das Berns teinsäure-anhydr ic" stabil auflöst, jedoch keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, z.B. Pyrldin, Dioxan, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxidj Diäthylen-glykol-dimethylather, Hexamethylphosphortriamid, Tetrahydropyran und Äthylenglykolmonomethyläther-acetat.Als Lösungsmittel bevorzugt sind Dioxan und Hexamethylphosphortriamid.
Für die Komponente f des erfindungsgemässen Reagens ist jedes organische tertiäre Amin geeignet, das sich leicht mit der Komponente e homogen vermischen lässt, die An'igen-Antikörper-Reaktion nicht nachteilig beeinflusst und die Succxnylxerungsreaktxon beschleunigt, z.B. Triäthylamin und Ί-Μοτρηοίχηο-Ν,Νfdicyclohexylcarboxamidin. Die Menge an diesem tertiären Amin beträgt im Fall des Triäthylamins z.B. 15 ul oder weniger, vorzugsweise 10 ul/100 ^iI der zu untersuchenden Probe oder darunter.Wird ein Überschuss verwendet, so steigt der pH-Wert und die Succxnylxerungsreaktxon wird gehemmt.
Das Mischverhältnis von Komponente e und f des erfindungsgemäesen Reagens hängt von dem organischen Lösungsmittel und dem organischen tertiären Amin ab. Wird z.B. als Lösungsmif%el Dioxan und Triäthylamin für die Succinylierung von 1 pMol cAMP in Blutplasma verwendet, so sind die Verhältnisse wie in Tabelle II angegeben. Die Succinylierung wird mittels Elektrophorese auf Celluloseestern bestimmt.
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■V - •"I***
Tabelle II
Zusammensetzung des Succinylierungsmittels 0 Dioxan
(μΐ)		 Succinylierung
Bernsteinsäure- Triäthylamin
anhydrid (mg) (μΐ)		 1,25 100 (*)
O 2,5 98,75 0
0,5 5,0 97,5 45
1,0 10,0 95,0 70
2,0 90 100
M 100
Wie aus Tabelle II ersichtlich, ist eine Lösung von U mg Bernsteinsäureanhydrid in 90^1 Dioxan (etwa Mprozentige Bernsteinsäure-anhydridlösung) als Komponente e und 10 μΐ Triäthylamin als Komponente f geeignet. Die Succinylierung von cAMP und cGMP mit diesem Succinylierungsmittel bei verschiedenen Organproben zeigt Tabelle III.
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Tabelle III Succinylierung von lebenden Proben nach Säureextraktion
Probe
Konzentration Succinylierung
Rattenlunge Rattenhirn Rattenleber Rattenherz Kaninchenplasma
cerebrospinale Flüssigkeit von Kaninchen
Humanplasma
10 mg/lOOjil ul 99,M
10 Il 98,3
10 11 97,5
10 11 97,2
100 94,0
11
100,0
11 100,0
Die Succinylierung von cAMP und cGMP erfolgt mit guter Wirkung unabhängig von der Art der Probe durch einfaches Vermischen der Komponenten e und f mit der Probe.
Obwohl die Art der Herstellung der Probe nicht kritisch ist, werden vorzugsweise Flüssigkeiten, wie Blut, cerebrospinale
oder
Flüssigkeit und Urin als solche/als Lösungen, denen Äthylendiamin-tetraessigsäure zugesetzt wurde, verwendet. Gewebe werden im allgemeinen extrahiert, z.B. mit Säuren, wie Salzsäure, PerChlorsäure und Trichloressigsäure, in Wasser oder in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, mit Alkali. z.B. Bariumhydroxid und Zinksulfa^ in Wasser oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel oder mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln.
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I?
Die Bedingungen der S.ccinylierungsreaktion sind nicht kritisch, Raumtemperatur und eine Reaktionszeit von 5 bis Hinuten sind im allgemeinen ausreichend.
Für die Komponente e des erfindungsgemässen Reagens ist eine 0,lmImidaZol-Pufferlösung mit einem pH von 5 bis 8, der durch Zugabe einer Säure, wie Salzsäure, die keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, eingestellt wurde, geeignet.
Die Tabellen IV und V zeigen.die günstige Wirkung des Imidazol-Puffers im Vergleich zu bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- und Citrat-Puffern für die Bestimmung von cAMP und cGK..
TabelielV
Pufferl8sung.
(fMol*/Röhrchen)
Imidazol
6,25
Acetat 25
Phosphat 2^
Citrat 25
xFemtomol = 10~15 Mol
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Tabelle V
Pufferlösung Antigen-Antikörper-
Reaktion (%)
Imidazol 65,1
Acetat 68,7
Phosphat <-*7,0
Citrat 38,2
Bei der Verwendung der ±midazol-Pufferlösung erhält man vernünftige Ergebnisse von 15,5 pMol/ml Plasma und 7,5 pMol/0,5 ml Plasma. Wird jedoch ein Acetat- oder Citrat-Puffer verwendet, so liegen die Ergebnisse bei 14,5 bzw. 30 pMoi cAMP/ml Plasma und bei 10,5 bzw. 20 pMol/0,5 ml Plasma.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion eines Plasmas, das kein cAMP und cGMP enthält, d.h. ein Plasma/das 2k Stunden bei 37 C stehengelassen wurde, um das cAMP und cGMP vollständig zn zerstören, und die Antigen-Antikörper-Reaktion in destilliertem Wasser sind theoretisch gleich. Bei Verwendung der Tmidazol-Pufferlösung sind die Reaktionsgrade in beiden Fällen gleich. Verwendet man jedoch Acetat-Puffer, so erhält man eine Reaktion von 73,S % mit dem Plasma und von 68,7 % mit destilliertem Wasser, d.h. es besteht eine Differenz von über 5 %-
Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Plasmaprobe cAMP und cGMP in so niedrigen Mengen enthält, z.B. etwa 10 fMol/ Röhrchen, dass sie mit dem Reagens, das Acetat-Puffer enthält,
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/5
nicht erfasst werden konnten. In einem anderen Fall wurde mit einem Citrat-Puffer eine Antigen-Antikörper-Reaktion von 38,2 % für die Plasmaprobe im Gegensatz zu 3^,5 % ±n destilliertem Wasser gefunden.
Daraus ist ersichtlich, dass die Komponente c des erfindungsgemässen Reagens nicht nur die Empfindlichkeit der Bestimmung erhöht, sondern auch die Antigen-Antikörper-Reaktion stabilisiert. Ausserdem werden mit dem erfxndungsgemässen Reagens viel bessere Werte erhalten, sogar in Proben, aus 4enen die Proteine nicht entfernt wurden.
Die Konzentration der Imidazol-Pufferlösung muss 0,1 Mol oder darüber betragen. Liegt die Konzentration unter 0,1 Mol,so erhält man abnormale Werte. Der optimale pH-Wert für diese Pufferlösung liegt bei 6,5. Ist der pH-Wert niedriger als 5, so ist die Pufferwirkung zu schwach und ist er über 8,so zersetzen sich die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl^adenosin- und Succinyl-guanosin-5?,5f-monophosphattyrosinmethylester.
Es ist bekannt, dass Imidasol die enzymatische Wirkung der Phosphodiesterase begünstigt. Um Fehler bei der Bestimmung in der Probe oder im Antiserum, die auf die Wirkung von eventuell vorhandener Phosphodiesterase beruhen, zu verhindern, kann man vorsorglich einen Phosphodiesterase-Inhibitor,wie Xthylendiamin» tetraessigsäure oder Theophyllin, zusetzen.
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Die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-31,5f-monophosphat-tyrosinmethylester der Komponente a des erfinoungsgemässen Reagens werden im allgemeinen als Lösung in einem Puffer, wie einem Imidazol-Puffer, oder als gefriergetrocknetes Pulver in Kombination mit einem möglicher, Stabilisator, hergestellt. Die Komponente a wird je ^Ch Bedarf mit dem erfindungsgemässen Reagens kombiniert: Wird z.3. nur cAMP oder cGMP bestimmt, so wird nur der eine radioaktiv markierte Tyrosinmethylester verwendet. Werden jedoch beide Nucleotide bestimmt, so werden die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und Succinyl-guanosin-31,5'-monophosphat-tyrosinmethylester entweder getrennt oder vermischt dein erfindungs gemäs sen Reagens zugesetzt. Für die gleichzeitige Bestimmung der beiden Nucleotide im Gemisch ist es günstig,verschiedene Jodisotope zu verwenden, z.B. 12^Jod und "* Jod, und diese getrennt zu bestimmen.
Das Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-cGMP-Serum der Komponente b des erfindungsgemässen Reagens kann in herkömmlicher Weise hergestellt werden. So ist z.B. eine nach Steiner et al. in "J.Biol.Chem." Band 2i»7, Seiten 1106 bis 1113 (1973) hergestellte Lösung eines Kaninchen-Antiserums in einem Imidazol- oder Acetat-Puffer sehr geeignet. Das Antiserum hat eine Bindungsfähigkeit von z.B. 50 % oder drüber, bezogen auf die Gesamtradioaktivität des zugesetzten mit 5Jod markierten cyclischen Adenosin- oder Guanosin-monophosphat-tyrosin-methylester, wenn man 0,03 μΐ (1:9900) Antiseruni eines gewissen Kaninchens für diese Bestimmung verwendet. Die Verwendung dieses Antiserums
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entspricht der Komponente a des erfindungsgemässen Reagens.
Für die Antigen-Antikörper-Reaktion können herkömmliche Bedingungen angewendet werden, z.B. eine Temperatur von 1 bis 5 C und eine Reaktionszeit von 6 bis *»8 Stunden, vorzugsweise 12 bis 2k Stunden.
Die in Komponente d des erfindungsgemässen Reagens verwendeten Substanzen sind für eine Trennung des an den Antikörper gebundenen c'AMP oder cGMP, d.h. des Antigen-Antikörper-Komplexes, von dem freien cAMP oder cGMP bestimmt. Beispiele für geeignete Substanzen für diese Trennung sind Zf1Ii Dextran überzogene KOhIe1 Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol und ein Anti-gamma- Globulin-Serum, die im allgemeinen bei Radioimmunitätsversuchen verwendet werden. Diese Substanzen liegen als solche oder als Dispersion oder Lösung in Wasser oder einer Pufferlösung vor.
Die Trennung hängt von der Art der zu trennenden Verbindungen
125 ab. So kann man z.B. 100 ul eines mit Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin-3* ,5'-nionophosphat-tyrosininethylesters mit 100 ul eines 0,3 molaren Imidazol-Puffers, pH 6,5, und 100 μΐ eines Anti-cAMP-Serums in 0,3 molarem Imidazol-Puffer, pH 6,55 in Eiswasser 16 Stunden umsetzen, zu diesem System 500 ml einer Suspension von mit Dextran überzogener Kohle in Wasser zusetzen, das Gemisch zentrifugieren und anschliessend die Radioaktivität des Überstands messen, der das gebundene cAMP, d.h. den Antigen-Antikörper-Komplex.enthält.
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In Tabelle VI ist die prozentuale Radioaktivität des Antigen-AntikÖrper Komplexes, bezogen auf die Gesamtradioaktivität, unt.er verschiedenen Bedingungen zusammengestellt.
Tabelle VI
mit Dextran überzogenen Kohle Radioaktivität de s Antiger i-Antl-
(mg/500 μΐ) Gesamtaktivität
Versuch 1* ~XX ,.XXX
1,25 52,5 50,0 51,0
2,5 51,5 i»9,o 50,0
5,0 52,5 50,0 50,5
* Versuch 1: Es wird unmittelbar nach der Zugabe der mit Dextran überzogenen Kohle abzentrifugiert.
'"Versuch 2: Es wird erst 30 Minuten nach der Zugabe der Kohle abzentrifugiert.
XX5iVersuch 3:Es wird unmittelbar nach der Zugabe der Kohle abzentrifugiert und 30 Minuten später abgetrennt.
Diese Ergebnisse beweisen, dass eine Menge von 2,5 mg mit Dextran Überzogener Kohle genügen und dass die Trennfähigkeit noch mindestens 30 Minuten nach der Zugabe erhalten bleibt.
Als cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung für die Komponente g des erfindungsgemässen Reagens ist eine Lösung in Wasser oder in einem Imidazol-Puffer von freiem cAMP und/oder cGMP oder dessen Salz, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder eines Salzes, das
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kexne nachteilig»Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion üeigt, geeignet,
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Mehrkomponenten-Reagens zur Bestimmung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat und/oder cyclischem Guanosin-3',5'-monophosphat. Das erfindungsgemässe Reagens wird im allgemeinen wie für Radioimmunitätsversi.ehe üblich verwendet.
In einer speziellen Ausführungsform vermischt man die Lösung des Bersteinsäure-anhydrids in einem organischen Lösungsmittel (Komponente e) mit dem organischen tertiären Amin (Komponente f), gibt dieses Gemisch zu der zu untersuchenden Probe und zu der cAMP-und/oder cGMP-Standardlösung (Komponente g), verdünnt mit der Imidazol-Pufferlösung (Komponente c) und vermischt mit dem radioaktiv markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethyliSer/unfdem^ntiserum (Komponente b), versetzt das Gemisch mit den Trennsubstanzen (Komponente d), trennt den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex ab und bestimmt in herkömmlicher Weise die Radioaktivität dieses Antigen-Antikörper-Komplexes.
Mit dem erfindungsgemässen Mehrkomponenten-Reagens werden die
in einer Pr>nhe> crlsir-htio-ii--!™ , ι ,
..^- o -^„.^ »unianaenen cAMP und cGMP
gleichzeitig succinyliert.So kann man eine Probe dieser succinylierten Nucleotide aufbewahren und das cAMP und cGMP im Verhältnis zueinander radioimmunologisch bestimmen. Enthält die Komponente a des erfindungsgemässen Reagens z.B, ein Gemisch von
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mit li::>Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-monophosphattyrosinmethyle3ter und mit ■* Jod markiertem cyclischem Succmylguanosin-monophosphat-tyrosinmethylester, so kann man nicht nur die Succinylierung sondern auch den radioimmunologischen Versuch in dem gleichen Röhrchen durchführen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Ein Mehrkomponenten-Reagens für die Bestimmung von cAMP in 75 Proben wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:
a) 8 nl einer Lösung von mit Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester (1 /ic ) in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
b) 8 ml Anti-cAMP-Serum aus Hauskaninchen in 0,3 m Imidazol-Puff er, pH 6,5
c) 12 ml 1,5m Imidazol-Puffer, pH 6,5, der auf das fünffache vor der Verwendung verdünnt wird-,
d) 200 mg Kohle, 200 mg Rinderserumalbumin, eine Suspension von 30 mg Dextran in 20 ml Wasser, die auf das Doppelte vor der Verwendung verdünnt wird,
e) 400 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 9 ml Dioxan,
f) 1 ml Triäthylamin und
g) 320 pMol cAMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser.
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Beispiel 2
Ein Reagens für die Bestimmung von cGMP in 75 Proben wird wie folgt hergestellt:
a) 8 ml mit 125Jod markierten cyclischen Succinyl-guanosin-3',5'-
monophosphat- Imidazol-Puffer,
tyrosinme thy !ester ^A/"- > x" ^*-> m »
pH 6,5,
b) 8 ml Anti-cGMP-Serum aus Hauskaninchen in 0,3m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
Komponenten c) bis e) gemäss Beispiel 1 und f) 320 pMol cGMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser.
Beispiel3
Ein Reagens für die gleichzeitige Bestimmung von eAITP und cGMP in 75 Proben besteht aus den Komponenten a) und b) des Beispiels 23 den Komponenten a), b), c), e) und f) des Beispiels 1, der Komponente d) des Beispiels 1 in doppelter Menge und als Komponente g) 320 pMol cAMP (Natriumsalz) und 32OpMoI cGMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser.
Beispiel 1J
Ein Reagens für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP
125 in 75 Proben enthält als Komponente a) 8 ml mit Jod .
markierten cyclischen Succinyl-adenosin-mcnophosphat-tyrosininethylester und ;r,it1-51Jcd markierten cyclischen Succinylguanosin-monophosphat-tyrosinmethylester (1/uc) in 0,3 m Imidazoi-Puffer, pH 6,5 sowie die anderen Komponenten gemäss Beispiel 3- 1
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lfc
Beispiel 5
Ein Reagens für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben enthält als Komponente c) 2k ml 1,5m Imidazol-Puffer, pH 6,5, der 12,5 mMol Äthylendiamin-tetraessigsäure enthält, und die anderen Komponenten wie in Beispiel 3-
Beispiel 6
Ein Reagens für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben enthält als Komponente e) 400 mg Bernsteinsäureanhydrid in 9 ml Hexamethylphosphortriamid. Die anderen Komponenten sind gemäss Beispiel 3.
Beispiel 7
Das Reagens des Beispiels 1 wird zur Bestimmung von cAMP in Blutplasma verwendet.
1. Die Komponenten e) und f) werden in einem Volumenverhält.nis von 9:1 zum Succinylierungsmittel vermischt.
2. Die Komponente c), die vor der Verwendung auf ein Fünftel der Konzentration verdünnt wird, destilliertes Wasser und das Succinylierungsmittel werden in einem Voli>menverhältnis von 8:1:1 vermischt.
3. 100 μΐ der Komponente g) werden in ein kleines Proberöhrchen eingefüllt und mit 100 jil des Succinylierungsmittels vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit 800 μΐ der Komponente c) versetzt. Auf diese Weise erhält man 1 ml -Succinyl-cAMP-Standardlösung mit einem Gehalt von 3,2 pMol/100 ^tI (Probe I).
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Ί. In jedes von 9 Proberöhrchen (Proben II bis X) werden 500 ja des gemäss 2. für die Verdünnung hergestellten Puffers und 500 μΐ der Suecinyl-cAMP-Standardlösung gemäss 3. eingefüllt und vermischt. Die Röhrchen III bis X werden jeweils um die Hälfte verdünnt, so dass man Succinyl-cAMP-Standardlösungen mit einer Konzentration von 3200, 1600, 800, 400, 200, ICO, 50, 25, 12,5 und 6»25 fMol/100 ul erhält. 5. 100 μ\ Plasma werden in einem Röhrchen mit 100 ul Succinylierungsmittel ermischt, das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 800 μΐ der Komponente c) versetzt. Die Komponente c) wird in einer solchen Menge verwendets c^ss die Bernsteinsäure-anhydrid-Konzentration zur Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion die Reaktion nicht stört (etwa 0^,15 1 oder weniger).
6* Folgende Röhrchen werden vorbereitet:
für die Gesamtzählung : 3 Röhrchen, Nr. 1 bis 3 für den Leerwert : 2 Röhrchen, Nr= 1J und 5 für den Nullwert : 2 Röhrchen, Nr. 6 und 7 für die Standardlösung : 20-Röhrchen, Nr. 8 bis 27 für die Plasmaprobe : 2 Röhrchen, Nr. 28 und 29.
7. 100 ul der Komponente a) werden in jedes Röhrchen eingefüllt.
8. 100 μΐ Puffer werden in die Röhrchen 1 bis 3 (Gesamtzählung), ι una 5 (Leerwert) und 6 und 7 (N'üllvert) eingefüllt.
9. 100 μΐ der Succinyl-cAMP-Standardlösung I bis X werden in jedes der Röhrchen 8 bis 27 eingefüllt.
10. 100 jil succinyliertes Plasma wird den Röhrchen 28 und 29 zugesetzt.
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11. 100 jil Komponente b) werden in jedes Röhrchen Nr. 6 bis 29
für den Nullwert, für die Standardlösung und für die Plasmaprobe zugesetzt. Nach dem Vermischen werden die Gemische in
Eiswasser 12 bis 24 Stunden (18 Stunden in diesem Beispiel)
stehengelassen.
12. 100 μΐ 0s3s; Imidazo 1-Puffer werden in jedes Röhrchen
1 bis 5 für die Gesamtzählung und den Leerwert eingefüllt.
Nach dem Vermischen werden die Lösungen gemäss 11, stehengelassen.
13. 500 JiI Komponente d), die vor der Verwendung auf das zwei- |
fache verdünnt wird,weiden zu jedem Röhrchen ausser zu den |
Röhrchen, die für die Gesanitsählung bestimmt sind, zugegeben. p
Die Röhrchen werden dann bei 3000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert. |
llj, Die Röhrchen für die Gesamtzählung werden mit 500 ^il Wasser |
vermischt. t
15. 500 jal des Überstands aus jedem Röhrchen werden für die |
Radioaktivitätsbestimmung in ein anderes Röhrchen übergeführt. |
16. Die Radioaktivität jedes Überstands wird gerne sen. |
17. Der mittlere Leerwert BL wird von dem mittleren Gesamtwert T E und dem Mittelwert B jeder Standardlösung abgezogen. Die F Bindungsfähigkeit B/T in % wird gemäss folgender Gleichung ί
berechnet: s
B/T (?) = ■■ x 100 (?) ' I
(T) - (BL) j
pie Ereebnisse sind in Tabelle VII zusammengefasst. ·
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Tabelle VII
Mittelwerte Plasma 6,25 fMol cpm cpm
-BL		 Β/Τ
(?)
Leerwert (BL) 12,5 π 300 - -
Gesamtwert (T) 25 31 9109 8809 100
Nullwert 50 11 6065 5765 65,4
Standardlösung 100 ft 5806 5506 62,5
ti 200 It 5543 52ί*3 59,5
π 400 Il 5069 4769 54,1
Il 800 Il H 600 Il 300 48,8
Il 1600 It 36lH 3314 37,6
It 3200 11 2837 2537 28,8
It 1992 1692 19,2
Il 1391 1091 12,4
It 888 588 6,7
Il 620 320 3,6
3119 2819 32,0
18. Die Bindungsfähigkeit der verschiedenen Standardlösungen wird gegen deren Konzentrationen halblogarithmisch aufgetragen (Fig. 1).
19. Anhand der Standardkurve wird die cAMP-Konzentration des untersuchten Plasmas aus dein B/T-Wert auf 150 fMol/Röhrchen, entsprechend 15 000 fMol/ml Plasma berechnet.
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3<r
Beispiel 8
Die Arbeitsweise von Beispiel 7 wird für die Bestimmung von cGMP mit dem Reagens des Beispiels 2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusairanengefasst.
-Tabelle VIII
Mittelwerte Plasma 6,25 fMol cpm cpm
-BL		 B/T
(2)
Leerwert (BL) 12,5 Il 200 - -
Gesamtwert (T) 25 Il 9885 9685 100,0
Nullwert 50 Il 65^0 63MO 65,5
Standardlösung 100 Il 6296 6096 62,9
Il 200 Il 5821 5621 58,0
11 IJOO 11 5058 U858 50,2
ir 800 Il 1033 3833 39,6
Il 1600 Il 2870 2670 27,6
π 3200 Il 1866 1666 17,2
11 1288 1088 11,2
It 8H6 SkS 6,7
Il 563 363 3,7
Il 428 228 2,4
1113 3933 i»0,6
18. Diese Werte werden wie in Beispiel 7 halblogarithroisch aufgetragen (Fig. 2).
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19. Anhand dieser Kurve wird die cGMP-Konzentration des untersuchten Plasmas auf kl fMol/Röhrchen, entsprechend Ί700 fMol/ml Plasma berechnet.
Das erfindungsgemässe Mehrkomponenten-Reagens kann in Form einer Gesamtpackung vorliegen, welche die Komponenten (a) bis (e) gebrauchsfertig abgepackt enthält. Hierdurch wird die Anwendung bei Routineuntersuchungen erleichtert. Gegebenenfalls ist nur noch eine Verdünnung der Komponenten erforderlich.
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Claims (1)

  1. • ar -
    Patentansprüche
    /lJ Mehrkomponenten-Reagens zur Bestimmung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und/oder cyclischem Guanosin-3f,ö'-monophosphat (cGMP), bestehend aus a) mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-31,5'-monophosphat-tyrosinmethylester und/oder cyclischem Succinyl-guanosin-3' ,5' -monophosphat-tyrosirimethy!ester i I)) einem Anti-cAMP-i .-um und/oder Anti-cGMP-Serum,
    c) einer Imidazol-Pufferlösung in einer Konzentration von O1I Mol oder höher,
    d) .aos tanzen für eine Trennung,
    e) Bersteinsäure-anhydrid in einem organischen Lösungsmittel,
    f) einem organischen tertiären Amin und
    e) einer cANP- und/oder cGMP-S'candardlösung.
    2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Imidasol-Pufferlösung einen pH-Wert von 5 bis 8 hat.
    3. Reagens nach Anspruch 1 und'2, dadurch gekennzeichnet, dass die Imidazol-Pufferlösung einen Phosphodiesterase-Inhibitor enthält.
    '■i. Reagens nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet _, dass das Bernsteinsäureanhydrid in Pyridin, Dioxan, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Diäthylenglykol-dimethylather. Hexamethylphosphortriamid, Tetrahydropyran oder Äthylenglykolmonomethyläthe>acetat gelöst ist.
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    5. Reagens nach Anspruch 1 bis Ii, dadurch gekennzeichnet, dass das Bernsteinsäureanhydrid in Dioxan gelöst ist.
    6. Reagens nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das tertiäre Amin ^-Morpholino-NjN'-dicyclohexylcarboxamidin oder .Triäthylasf'n ist.
    7. Reaj.eiis nach Anspruch i bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen für die Trennung mit Dextran überzogene Kohle,
    Ammoniumsulrat, Polyäthylenglykol, ein
    Anti-gamma-globulinserum oder eine Lösung oder Dispersion dieser Substanzen ist.
    8. Verwendung des Mehrkomponenten-Reagens nach Anspruch 1 bis zur Bestimmung von cyclischem Adenosin-31,5'-monophosphat und/ oder cyclischem Guanosin-3f,5'-monophosphat.
    9. Ausführungsform nach Anspruch 84 dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung des Bernsteinsäure-anhydrids in einem organischen Lösungsmittel (Komponente e) mit dem organischen tertiären /min (Komponente f) vermischt, dieses Gemisch zu der zu untersuchenden Probe und zu der cAMP- ur-l/oder cGMP-Standardlösung (Komponente g) gibt, mit der Imidasol-Pufferlösung (Komponente c) verdünnt nua mit dem radioaktiv markierten 5uccinyl-adsriOöin=mcr.cphosphat-tyro5inTnf!fchyiester und/oder Succinyl-guanosin-raonophosphat-tyrosinmethylester (Komponente a) und mit dera Antiseruiü (Komponente b) vermischt, das Gemisch mit' den Trennsubstanzen (Komponente d) versetzt, den gebildeten
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    Antigen-Antikörper-Komplex abtrennt und in herkömmlicher Weise die Radioaktivität des Antigen-AntikÖrper-Komplexes bestimmt.
    10. Ausführungsform nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bersteinsäure-anhydridlösung mit dem tertiären Amin unmittelbar vor der Zugabe zur Probe und der Standardlösung vermischt.
    11. Ausführungsform nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (a) bis (e) gebrauchsfertig abgepackt sind und in Form einer Gesamtpackung vorliegen.
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