CH618015A5 - - Google Patents

Description

La présente invention a pour objets un ensemble de réactifs destiné au dosage du monophosphate cyclique d'adénosine-3',5' et/ou du monophosphate cyclique de guanosine-3',5' par radioimmunologie, ainsi que l'utilisation de cet ensemble.

Le rôle d'intermédiaire que joue le monophosphate cyclique d'adénosine-3',5' (désigné, ci-dessous, par l'abréviation cAMP) dans l'action des hormones a fait l'objet de nombreuses études, au cours de ces dernières années. De même, le rôle physiologique du monophosphate cyclique de guanosine-3',5' (désigné, ci-dessous, par l'abréviation cGMP) est en voie de clarification. On prend conscience, actuellement, de la grande importance du dosage des teneurs en ces nucléotides cycliques dans les organismes vivants non seulement pour la recherche médicale fondamentale mais encore pour le diagnostic, la prévention et le traitement des maladies dans le domaine de la médecine clinique. Celà découle, en particulier, des observations qui ont été faites que les teneurs en cAMP et cGMP dans un organisme vivant sont susceptibles de subir des variations lorsque cet organisme est dans un état physiologique altéré ou dans un état pathologique comme c'est le cas lors d'une maladie. Par exemple, l'analyse du cAMP et du cGMP dans des échantillons prélevés sur des organismes vivants tels que des leucocytes provenant de patients asthmatiques, la peau de patients atteints de psoriasis, les plaquettes sanguines de patients atteints de psoriasis, les plaquettes sanguines de patients atteints de throm-bocytose, le sang et l'urine de patients atteints de pseudohypo-parathyroidisme, le sang et l'urine de patients atteints de dystro-phie musculaire, et le fluide cérébrospinal de patients atteints de folie dépressive est utile pour le diagnostic et le traitement de ces maldies. En outre, on espère pouvoir élucider, un jour, les relations qui existent entre le résultat de ces dosages et de nombreuses maladies.

Toutefois, les procédés de dosage du cAMP et du cGMP que l'on connaît jusqu'à présent ne peuvent pas être considérés comme satisfaisants du point de vue de la sensibilité et, en outre, la mise en oeuvre de ces procédés s'accompagne de difficultés ayant trait à la durée et au prix de revient de la préparation d'échantillons d'organes. Par exemple, un échantillon d'organe comporte des paramètres non spécifiques qui perturbent le dosage et, en vue d'éliminer les effets de ces paramètres, on estime nécessaire de diluer l'échantillon avec un facteur de dilution élevé. Toutefois, cette dilution diminue encore la concentration en cAMP et cGMP qui sont présents en très petite quantité dans l'échantillon et, par conséquent, elle rend dès le début le dosage plus difficile. En effet, les concentrations ainsi diminuées tombent au-dessous de la limite inférieure de la teneur mesurable, ce qui rend encore plus difficile un dosage quantitatif.

En outre, étant donné qu'il y a à l'origine une grande différence entre les concentrations de cAMP et cGMP dans un organe, on ne peut pas utiliser une seule préparation d'échantillon comme échantillon commun. A titre d'illustration, les compositions des ensembles de réactifs destinés au dosage du cAMP et du cGMP qui sont actuellement vendus dans le commerce, ainsi que les limites inférieures des quantités mesurables au moyen de ces ensembles de réactifs, sont respectivement indiquées dans le tableau I et dans le tableau II

Tableau I

Produit Composition Limite inférieure de la quantité mesurable (p mole*/tube)

A 1 Tampon tris-EDTA 0.2

2 solution étalon de cAMP

3 cAMP marqué au tritium

4 protéine de fixation

3

618 015

5 substance permettant une séparation

B 1 solution étalon de cAMP 0.05

2 cAMP marqué à l'iode s

3 anticorps à l'égard du cAMP

C 1 solution étalon de cAMP 1

2 cAMP marqué à l'iode

3 anticorps à l'égard du cAMP m

4 anticorps pour séparation

D 1 solution tampon à l'acétate

2 solution étalon de cAMP

3 cAMP marqué au tritium

4 protéine de fixation

5 filtre de séparation

6 solution tampon pour lavage du filtre

20

*picomole

Ensembles de réactifs pour le dosage du cAMP existant dans le commerce

Tableau II

Produit Composition

E 1 Solution étalon de cGMP

2 cGMP marqué à l'iode

3 anticorps à l'égard du cGMP

F 1 solution étalon de cGMP

2 cGMP marqué à l'iode

3 anticorps à l'égard du cGMP

4 anticorps pour séparation

" 40

G 1 solution tampon à l'acétate 0.2

2 cGMP marqué au tritium

3 solution étalon de cGMP

4 protéine de fixation

45

Ensembles de réactifs pour le dosage du cGMP existant dans le commerce

Ainsi, les limites inférieures de la quantité mesurable lors du dosage de cAMP et cGMP au moyen des ensembles commer- so ciaux des réactifs indiqués dans les tableaux ci-dessous sont de 0,05 p mol./tube, ou davantage, et il n'est donc pas possible d'utiliser ces ensembles de réactifs pour effectuer le dosage ultramicro analytique du cAMP et du cGMP, bien qu'il sera inévitablement nécessaire de pouvoir effectuer ce genre de 55 dosage à l'avenir.

On connaît un procédé permettant d'améliorer la sensibilité du dosage par radioimmunologie. Selon ce procédé, on soumet le cAMP à une succinylation, de manière à augmenter son affinité à l'égard de son anticorps, de la manière proposée dans «> la publication suivante: Analytical Biochemistry, volume 56, p.394 à p.407 (1973). Ce procédé petit être mis en oeuvre soit selon un mode opératoire (A), dans un milieu réactionnel comportant un solvant organique, ce premier mode opératoire consistant à dissoudre un échantillon d'organe liophylisé et la 4-65 morpholino-NN'-dicyclohexylcarboxamidine dans la pyridine et à ajouter à la solution ainsi obtenue une solution d'anhydride succinique dans le dioxane, de manière à effectuer une réaction de succinylation soit selon un mode opératoire (B), dans un milieu réactionnel consistant en une solution aqueuse, le second mode opératoire consistant à ajouter de l'anhydride succinique en poudre et de la triéthylamine à une solution aqueuse de l'échantillon à doser, également de façon à effectuer une réaction de succinylation.

Toutefois, le mode opératoire (A) n'est pas pratique à cause des difficultés résultant de la nécessité de préparer l'échantillon à doser sous forme lyophilisées et du faible rendement de la réaction de succinylation à cause de la faible solubilité du cAMP dans le solvant. Dans le mode opératoire (B), compte tenu du fait que l'anhydride succinique est utilisée à l'état de poudre, et en tenant compte également de la nature hydrolysable de l'anhydride succinique dans un milieu réactionnel consistant en une solution aqueuse, il est de la plus haute importance de provoquer de manière instantannée la dissolution et la diffusion de l'anhydride succinique dans la solution aqueuse de l'échantillon à doser, au moyen d'une agitation vigoureuse, pour permettre à la réaction de succinylation de se dérouler avec un rendement élevé. En conséquence, mis à part les difficultés de manipulation de la poudre, ce mode opératoire entraîne la nécessité de disposer d'un appareillage permettant d'effectuer l'agitation indiquée ci-dessus. Le dosage simultanné d'un grand nombre d'échantillons est particulièrement difficile à mettre en oeuvre par ce procédé, qui ne se prête donc pas à la mise en oeuvre au moyen d'un simple ensemble de réactifs de dosage. En outre, dans ce procédé, on utilise une méthode de dialyse pour effectuer la séparation du cAMP libre et du cAMP qui est combiné avec l'anticorps après la réaction antigène-anticorps, ce qui entraîne donc la nécessité de disposer d'un appareillage spécial pour effectuer cette dialyse et ce qui rend ce procédé inapproprié comme procédé de dosage d'emploi général.

Le but de l'invention est de permettre d'obvier aux inconvénients, qui viennent d'être mentionnés, des ensembles connus de réactifs destinés au dosage du cAMP et du cGMP, en fournissant un ensemble de réactifs permettant d'effectuer, en utilisant des moyens très simples, le dosage ultra-microanalytique simultanné du cAMP et du cGMP.

A cet effet, l'ensemble de réactifs selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il comprend un réactif 1 comprenant l'ester méthyl tyrosinique du cAMP succinylé marqué à l'iode radioactif et/ou l'ester méthyl tyrosinique du cGMP succinylé marqué à l'iode radioactif; un réactif 2 comprenant un antisérum à l'égard du cAMP et/ou du cGMP; un réactif 3 comprenant une solution tampon d'imidazole ayant une concentration au moins égale à 0,1 M; un réactif 4 comprenant une substance permettant une séparation; un réactif 5 comprenant une solution d'anhydride succinique dans un solvant organique; un réactif 6 comprenant une amine organique tertiaire et un réactif 7 comprenant une solution étalon de cAMP et/ou de cGMP.

Dans le dessin annexé:

Les fig. 1 et 2 sont des graphiques montrant les courbes d'étalonnage établies respectivement dans les conditions indiquées dans l'exemple 1 et dans l'exemple 2 d'utilisation de l'ensemble de réactifs selon l'invention, l'ordonnée et l'abscisse de chacun de ces graphiques correspondant respectivement au taux de fixage par l'anticorps (B/T), ce taux étant exprimé en %, et à la quantité de cAMP ou de cGMP.

L'une des principales caractéristiques de l'ensemble de réactifs selon l'invention consiste dans le fait que cet ensemble comprend les réactifs 5 et 6 comme agents de succinylation, et qu'il comprend, en outre, le réactif 3 comme solution tampon pour la réaction antigène-anticorps.

L'invention est fondée sur la découverte du fait que la réaction de succinylation du cAMP et du cGMP dans un échantillon à doser, peut se dérouler avec un rendement largement suffisant dans un milieu réactionnel mixte comprenant de l'eau

Limite inférieure de la quantité mesurable (p mole/tube)

.10

0.05

35

0.05

618 015

4

et un solvant organique. En conséquence, selon l'invention, on utilise l'anhydride succinique sous la forme d'une solution dans un solvant organique ce qui simplifie sa manipulation. L'invention est également fondée sur la découverte du fait que, par simple mélange de la solution d'anhydride succinique dans un solvant organique constituant le réactif 5 et de l'amine organique tertiaire constituant le réactif 6, immédiatement avant le dosage et en ajoutant le mélange liquide ainsi obtenu à la solution étalon de cAMP et/ou de cGMP ou un échantillon du cAMP et/ou du dGMP, on peut succinyler de manière instan-tannée le cAMP et/ou le cGMP cette succinylation étant en outre complète ce qui augmente de manière remarquable l'affinité du cAMP et du cGMP à l'égard de leur antisérum.

En outre, grâce à l'amélioration de la sensibilité, il devient possible de diluer considérablement l'échantillon avant la réac- i tion avec l'antisérum. En conséquence, il devient possible d'éliminer vraiment la cause de l'inhibition de la réaction dans l'échantillon, ce qui réduit considérablement l'erreur commise sur le résultat du dosage, et rend en outre possible d'effectuer des dosages répétés sur le même échantillon et de doser simulta- : nément la teneur en cAMP et en cGMP dans le même échantillon grâce à l'augmentation de la quantité de liquides résultant de la dilution. En outre, on peut utiliser tels quels comme échantillons des fluides provenant du corps, comme le sang, le liquide cérébrospinal, l'urine et des produits d'extractions acides des -tissus.

En plus, la présente invention repose sur la récente découverte du fait que, en utilisant une solution tampon d'imidazole ayant une concentration de 0,1 M ou davantage, au moment où se produit la réaction antigène-anticorps, à la place d'une solu- ' tion tampon à l'acétate, d'une solution tampon au phosphate ou d'une solution tampon au citrate, généralement utilisée dans l'art antérieur, on peut stabiliser de manière remarquable la réaction antigène-anticorps et éliminer complètement l'effet inhibiteur du réactif de succinylation à l'égard de cette réaction. 1 Cette découverte est à la base d'une seconde caractéristique importante de l'ensemble de réactifs conforme à l'invention.

Ainsi, l'ensemble de réactifs de dosage du cAMP et du cGMP conforme à l'invention, rend pour la première fois possible le dosage ultra micro analytique du cAMP et du cGMP dans ■» un échantillon, par un procédé très simple et très pratique en utilisant les nouveaux réactifs qui font partie de cet ensemble. La limite inférieure de la quantité de cAMP et de cGMP que l'on peut doser au moyen de l'ensemble de réactifs conforme à l'invention est de l'ordre de 0,006 p mol./tube, dans les deux ■» cas.

Les compositions particulières des réactifs que l'on peut utiliser sont indiquées ci-dessous:

5

Réactif 5

La quantité d'anhydride succinique dans le réactif 5 est de l'ordre de 2 à 6 mg, de préférence comprise entre 3,5 et 4,5 mg. pour 100 (il de l'échantillon. On a constaté que, si la quantité d'anhydride succinique est trop élevée, l'anhydride succinique 55 précipite dans le milieu réactionnel de la réaction de succinylation et il peut provoquer l'inhibition de la réaction antigène-anticorps.

Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser tout solvant organique capable de dissoudre de manière stable l'anhydride W) succinique et, en même temps, n'ayant aucun effet nuisible sur la réaction antigène-anticorps. De tels solvants sont, par exemple, les suivants: la pyridine, le dioxane, l'acétone, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxide, le diméthyléther du diéthylèneglycol, la triamide de l'acide hexaméthylphosphorique, le tétrahydropy-rane, et l'acétate de méthyl cellosolve. Le dioxane et la triamide de l'acide hexaméthylphosphorique conviennent particulièrement bien.

Réactif 6

Les aminés organiques tertiaires qui conviennent pour constituer le réactif 6 sont celles que l'on peut facilement mélanger de manière homogène avec le réactif 5, qui n'exerce aucun effet . nocif sur la réaction antigène-anticorps et qui favorise la réaction de succinylation. On peut, par exemple, utiliser, comme amine organique tertiaire, la triéthylamine et la 4-morpholino-NN'-dicyclohexylcarboxamidine. La quantité de cette amine tertiaire que l'on utilise est, dans le cas de la triéthylamine, par i exemple, de 15 [il ou moins, est de préférence comprise entre 10 (il ou moins, pour 100 (il d'échantillons à doser. Si l'on utilise une quantité trop grande de cette amine, le pH augmente et la réaction de succinylation est inhibée.

La proportion selon laquelle on effectue le mélange des réactifs 5 et 6 est déterminée d'après la nature du solvant organique et de l'amine organique tertiaire que l'on utilise. Par exemple, dans le cas où l'on utilise le dioxane comme solvant organique et la triéthylamine comme amine organique tertiaire, pour effectuer la succinylation d'une p mole de cAMP dans le i plasma sanguin au moyen d'anhydride succinique, les rapports entre les quantités de ces substances et le degré de succinylation du cAMP qui ont été déterminés expérimentalement, sont indiqués dans le tableau III. Les degrés de succinylation indiqués dans ce tableau ont été déterminés par électrophorèse sur cellogel.

Tableau III

Composition des réactifs de succinylation anhydride Triéthylamine Dioxane succinique (fil)

M

Taux de succinylation

(mg)

(%)

0

0

100

0

0.5

1.25

98.75

45

1.0

2.5

97.5

70

2.0

5.0

95.0

100

4.0

10.0

90

100

. Le tableau III indique que, dans le cas de ce système, on peut utiliser, comme réactif 5, une solution de 4 mg d'anhydride succinique dans 90 (il de dioxane (ce qui correspond approximativement à une solution d'anhydride succinique à 4,4%) et, comme réactif 6,10 (il de triéthylamine. Le tableau IV indique le résultat de mesures du degré de succinylation du cAMP et du cGMP dans divers échantillons en utilisant les réactifs 5 et 6 préparés de la manière indiquée ci-dessus.

Tableau IV

Nature de l'échantillon

Taux de succinylation (%)

Produit d'extraction acide de

poumon de rat

10 mg/100

(il

99.4

Matière cervicale de rat

10 mg/100

iß

98.3

Foie de rat

10 mg/100

(il

97.5

Coeur de rat

10 mg/100

(il

97.2

Plasma de lapin

100 ni

94.0

Liquide cérébrospinal de

lapin

100 (il

100.0

Plasma humain

100 (il

100.0

Ainsi, par simple mélange des réactifs 5 et 6 avec les échantillons à doser, on obtient la succinylation du cAMP et du cGMP, avec un rendement de réactions élevé, quelle que soit la nature de l'échantillon.

Bien que la manière de préparer les échantillons ne soit en principe soumise à aucune limitation particulière, le mode opératoire optimal consiste en général à préparer des fluides tels

5

618 015

que le sang, le liquide cérébro-spinal et l'urine, dans leur état originel ou sous forme de solution auxquelles on a ajouté de l'EDTA. En ce qui concerne les échantillons de tissu, la meilleure façon de les préparer est sous forme d'extrait obtenu en utilisant, comme agent d'extraction, des solutions aqueuses d'acide (tels que l'acide chlorhydrique, l'acide perchlorique et l'acide trichloracétique) ou des solutions de ces mêmes acides dans des solvants organiques hydrophiles, ou encore des solutions d'agents alcalins (tel que le mélange d'hydroxyde de baryum et de sulfate de zinc) soit dans l'eau, soit dans des solvants organiques hydrophiles, ou encore des solvants organiques hydrophiles.

Les conditions dans lesquelles on peut effectuer la réaction de succinylation ne sont, en principe, soumises à aucune restriction particulière, et il est généralement suffisant d'effectuer cette réaction à la température ambiante et pendant une durée comprise entre 5 et 60 minutes.

Réactif 3

Comme indiqué plus haut, l'une des caractéristiques de la présente invention consiste dans l'utilisation d'une solution tam pon d'imidazole ayant une concentration relativement élevée, de l'ordre de 0,1M ou davantage, pour constituer le réactif 3. Selon la présente invention, cette solution tampon est une solution aqueuse d'imidazole dont le pH a été ajusté à la valeur désirée, comprise entre 5 et 8, en y ajoutant un acide, tel que l'acide chlorhydrique, qui n'a pas d'effet nocif sur la réaction antigène-anticorps.

Des exemples permettant la comparaison entre l'utilisation d'une solution tampon d'imidazole et l'utilisation usuelle de solution tampon à l'acétate, au phosphate et au citrate, sont indiqués ci-dessous:

(1) limite inférieure de la quantité mesurable

Nature de la solution tampon Limite inférieure de la quantité mesurable f mol*/tube

Solution tampon d'imidazole 6.25

Solution tampon d'acétate 25

Solution tampon de phosphate 25

Solution tampon de citiate 25

*femtomole

(2) Réaction antigène anticorps (taux de réaction des réactifs 1 et2)

Nature de la solution tampon NTaux de réaction antigène anticorps (%)

E

Solution tampon d'imidazole 65.4

Solution tampon d'acétate 68.7

Solution tampon de phosphate 47.0

Solution tampon de citrate 38.2

(3) Effet de dilution d'un échantillon de plasma.

En utilisant une solution tampon d'imidazole, on /obtient, pour cAMP, les résultats raisonnables suivants:

15,5 p mol./ml de plasma et 7,5 p mol./0,5 ml de plasma. Par contre, en utilisant une solution tampon d'acétate, on obtient les résultats suivants: 14,5 p mol. de cAMP/ml de plasma et 10,5 p mol. de cAMP par 0,5 ml de plasma. Si l'on utilise une solution tampon de citrate, on obtient les résultats suivants:30 p mol. de cAMP/ml de plasma et 20 p mol. de cAMP par 0,5 ml de plasma. Ces derniers résultats ne sont pas raisonnables à moins qu'il ne se produise un effect de dilution.

(4) Phénomènes anormaux observés lors du dosage d'échan-. tillons riches en protéines.

Théoriquement, les taux de réaction antigène-anticorps dans le cas où l'on utilise, comme échantillons, un plasma qui ne contient pas de cAMP et de cGMP, c'est-à-dire un plasma obtenu à partir d'un plasma laissé au repos à 37° , pendant 24 heures, après son prélèvement, et dans le cas où l'on utilise, comme échantillons, de l'eau distillée, sont égaux. Ceci correspond à ce que l'on observe effectivement lorsque l'on utilise une solution d'imidazole, mais, dans le cas où l'on utilise une solution tampon d'acétate, le taux de réaction est de 73,9% dans le ! _ premier cas et de 68,7 % dans le dernier cas, ce qui correspond à une différence supérieure à 5 %. D'après ces résultats, on doit supposer que, dans le cas où l'on utilise un échantillon contenant des protéines, comme le plasma, et que les concentrations de cAMP et de cGMP sont faibles, par exemple de l'ordre de quelques dizaines de f mol/tube, on obtient, en utilisant une solution tampon dans l'acétate, une valeur inférieure à la concentration réelle. En outre, on a trouvé dans un cas, en utilisant une solution tampon au citrate, une valeur du taux de réaction de 38,2 % dans le premier cas, et une valeur de 34,5 % dans le second cas.

Ainsi, le réactif 3 permet d'augmenter la sensibilité du dosage, ainsi que de stabiliser la réaction antigène-anticorps. En outre, l'utilisation de ce réactif permet d'obtenir des valeurs de mesure exactes même dans le cas du dosage d'échantillons dont ,n on n'a pas éliminé les protéines.

Il est nécessaire que la concentration des solutions tampons d'imidazole soit de 0,1 M ou davantage. Si la concentration est inférieure à 0,1 M, on obtient des valeurs de mesure aberrantes comme décrit au point (4) ci-dessus. D'autre part, le pH doit être compris entre 5 et 8, avec une valeur optimale proche de 6,5. Si le pH est inférieure à 5, l'effet tampon est faible. Si le pH est supérieur à 8, le (I*) ScAMP-TME et le (I*) ScGMP-TME du réactif 1 se décompose. On peut remarquer à ce sujet qu'il est bien connu que l'imidazole favorise l'action enzymatique de 40 la phosphodiestérase. Si nécessaire, on peut empêcher les fluctuations des valeurs de mesure qui pourraient être provoquées par effet de la phosphodiestérase restant dans l'échantillon dosé ou dans l'antisérum, en y ajoutant avant l'essai un inhibiteur de phosphodiestérase tels que le EDTA ou la théophyline.

45

Réactif 1.

On prépare habituellement le (F)ScAMP-TME et/ou le (I*)ScGMP-TME sous forme d'une solution dans une solution tampon telle qu'une solution tampon d'imidazole, ou encore ,0 sous forme d'une poudre liophylisée renfermant éventuellement un stabilisateur de cette poudre. On utilise le réactif 1 selon les besoins de l'analyse. Par exemple, pour doser seulement le cAMP ou le cGMP, on choisit indépendamment un (I*)ScAMP-TME ou (I*)ScGMP-TME, respectivement, tandis que pour le s- dosage simultané du cAMP et du cGMP, on combine, dans l'ensemble de réactifs, du (I*)ScAMP-TME et du (I*)ScGMP-TME soit séparément, soit sous forme de mélange. Pour effectuer le dosage simultané du (I*)ScAMP-TME et du (I*)ScGMP-TME à l'état de mélange, il est avantageux d'utilizo ser de manière distincte les deux sortes différentes d'iode radioactif par exemple le I125 et le I131, de manière à permettre de mesurer respectivement les deux produits indiqués ci-dessus.

Réactif 2

h? On peut préparer de manière usuelle l'anti-sérum pour le cAMP et/ou l'anti-sérum pour le cGMP du réactif 2. Par exemple, on peut utiliser une solution, dans une solution tampon d'imidazole ou dans une solution tampon à l'acétate, d'un

618 015

6

anti-sérum obtenu en utilisant un animal comme le lapin, conformément à la méthode de Steiner et al, décrite dans la publication suivante: Journal of Biological Chemistry, No. 247, p. 1106àp. 1113 (1972). La puissance de l'anti-sérum correspond par exemple à un taux de fixation de 50% ou davantage, par rapport à la radioactivité totale du (I125)cAMP-TME ou du (I125)cGMP-TME ajoutés, lorsque l'on utilise 0,03 ml (1:9900) d'anti-sérum provenant d'un lapin donné, dans ce système de mesure. La combinaison du genre d'anti-sérum utilisé dans le réactif 2 correspond avec celle qui est utilisée dans le réactif 1.

Pour effectuer la réaction antigène-anticorps, on peut directement adopter les conditions opératoires usuelles, par exemple en effectuant la réaction à une température comprise entre 1 et 5° C pendant une durée comprise entre 6 et 48 heures, de préférence comprise entre 12 et 24 heures.

Réactif 4

La substance permettant une séparation qui constitue les réactifs 4, est utilisée pour séparer le cAMP ou le cGMP lié à l'anticorps, c'est-à-dire le complexe antigène-anticorps, du cAMP ou du cGMP libre. Cette substance peut être, par exemple, l'une des substances suivantes: charbon actif revêtu de dextrane, sulfate d'ammonium, polyéthylène glycol, et sérum anti-gamma globuline. De telles substances sont couramment utilisées pour le dosage radioimmunologique, et on peut les utiliser, conformément à la présente invention, soit dans leur état original, soit sous forme de dispersion ou de solution dans l'eau ou dans une solution tampon.

On peut, naturellement, utiliser toute autre substance de séparation convenable, permettant d'obtenir le même résultat que les substances énumérées ci-dessus.

Les conditions dans lesquelles on effectue la séparation sont déterminées en fonction de la nature de la substance utilisée à cet effet. Par exemple, on peut faire réagir 100 jaI de (I12S)ScAMP-TME, 100 jxl d'une solution, ayant un pH de 6,5, d'anti-sérum-cAMP dans une solution tampon d'imidazole 0,3 M, et 100 [tl d'une solution tampon d'imidazole 0,3 M, ayant un pH de 6,5, cette réaction étant effectuée dans l'eau glacée pendant une durée de 16 heures, ajoutés à ce système réactionnel 500 ml d'une suspension aqueuse de charbon actif revêtu de dextrane (DCC), soumettre le milieu réactionnel ainsi obtenu à une séparation par centrifugation, et mesurer ensuite la radioactivité du liquide qui renferme le cAMP fixé, c'est-à-dire le complexe antigène-anticorps. On peut obtenir de cette façon, le rapport B/T, exprimé en pourcentages, de la radioactivité du complexe antigène-anticorps à la radioactivité totale dans différentes conditions. Ce rapport est indiqué dans le tableau V.

Tableau V DDC

(mg/500 jxl)

1.25

2.5

5.0

*Essai 1

**Essai 2

***Essai 3

No. de l'essai

1*

52.5 51.5 52.5

2**

50.0 49.0 50.0

2***

51.0 50.0 50.5

Séparation par centrifugation effectuée immédiatement après addition du DCC.

Séparation par centrifugation effectuée 30 minutes après addition du DCC.

Centrifugation effectuée immédiatement après l'addition du DCC et séparation effectuée 30 minutes après.

D'après ces résultats, on voit qu'une quantité de DCC de 2,5 mg est suffisante et que l'aptitude à la séparation après adjonction du charbon actif se maintient de manière stable pendant une durée d'au moins 30 minutes, après l'addition du charbon actif.

Réactif 7

s La solution étalon du cAMP et/ou du cGMP qui constitue le réactif 7 consiste en une solution, dans l'eau ou dans une solution tampon d'imidazole, d'un acide libre de cAMP et/ou de cGMP ou d'un sel soluble d'un tel acide d'un cation tel que le sodium, le potassium, ou un cation métallique analogue, n'ayant io pas d'effet nuisible sur la réaction antigène-anticorps, la concentration de cette solution étant choisie de manière à permettre d'obtenir une courbe d'étalonnage.

Mode d'utilisation de l'ensemble de réactifs qui vient d'être décrit:

i s L'ensemble des réactifs conforme à la présente invention est donc une combinaison de 7 réactifs différents.

On peut utiliser ces réactifs de façon analogue à la manière de procédés employés pour le dosage radio-immunologique du cAMP et du cGMP. Plus particulièrement, l'utilisation de l'en-2o semble de réactifs selon l'invention, est caractérisée par le fait que l'on effectue les opérations successives suivantes:

1. On mélange les réactifs 5 et 6, de manière à préparer un agent de succinylation:

2. On ajoute cet agent à l'échantillon à doser et à une

25 solution étalon préparée à partir du réactif 7 et on mélange ces substances de manière à provoquer une réaction de succinylation;

3. On dilue les produits ainsi obtenus avec le réactif 3;

4. On mélange ensuite chacun de ces produits avec le réactif 30 1 et ensuite avec le réactif 2, de manière à provoquer, concurre-

ment, des réactions antigène-anticorps dans chacun de ces mélanges;

5. On sépare le complexe antigène-anticorps ainsi formé de l'antigène libre, en utilisant le réactif 4; et

35 6. On mesure la radioactivité de ce complexe ou de l'antigène libre en déterminant le contenu de cAMP ou de cGMP dans l'échantillon à doser au moyen de la courbe d'étalonnage des valeurs du rapport B/T (%) obtenue en utilisant la solution étalon.

•40 En utilisant l'ensemble de réactifs conforme à l'invention, on peut succinyler de manière simultanée le cAMP et le cGMP présents dans un même échantillon à doser. C'est pourquoi, on peut partager en deux fractions un échantillon ayant subi la succinylation en une opération et effectuer le dosage radioim-45 munologique du cAMP et du cGMP dans chacune des deux moitiés ainsi obtenues. Ainsi, par exemple, si l'on utilise, pour le réactif 1, un mélange de (I125)ScAMP-TME et de (I131)ScGMP-TME, on peut effectuer dans le même tube à essai, non seulement la succinylation mais également le dosage radioimmunolo-50 gique.

Les exemples ci-dessous illustrent, à titre non limitatif, la composition et l'utilisation de l'ensemble de réactifs conforme à l'invention.

55 Exemple 1

Ensemble de réactifs destiné au dosage du cAMP, convenant pour le dosage de 75 échantillons, et ayant la composition suivante:

Réactif 1 constitué par du (I125)ScAMP-TME (1 [ici/8 ml, fio solution tampon d'imidazole 0,3 M, pH 6,5) ;

Réactif 2 constitué par un antisérum-cAMP de lapin domestique/8 ml; solution tampon d'imidazole 0,3 M, pH 6,5;

Réactif 3 comprenant une solution tampon d'imidazole 1,5 M, pH 6,5,12 ml, diluée à la concentration de l/5ème au f>5 moment de son utilisation ;

Réactif 4 constitué par 200 mg de charbon actif; 200 mg d'albumine de sérum de boeuf; 30 mg de suspension de dextrane dans 20 ml d'eau distillée, ce réactif devant être dilué à la

7

618 015

concentration de 'h au moment de son utilisation;

Réactif 5 constitué par 400 mg d'anhydride succinique et 9 ml de dioxane ;

Réactif 6 constitué par 1 ml de triéthylamine ; et

Réactif 7 constitué par 320 p mol de cAMP (sel de sodium) 5 et 1 ml d'eau qui constitue la solution étalon de réserve.

Exemple 2

Ensemble de réactifs destinés au dosage de cGMP, pour 75 échantillons, comprenant les ingrédients suivants: m

Réactif 1 (I12S)ScGMP-TME (1 |ici/8 ml, solution tampon d'imidazole 0,3 M, pH 6,5) ;

Réactif 2 constitué par antisérum-cGMP de lapin domestique/8 ml; solution tampon d'imidazole 0,3 M, pH 6,5 ;

Réactifs 3,4, 5 et 6 ayant respectivement la même composi- u tion que les réactifs correspondants utilisés selon l'exemple 1 ; et

Réactif 7 constitué par du cGMP (sel de sodium) 320 p mol et 1 ml d'eau qui constitue la solution étalon de réserve.

Exemple 3 20

Ensemble de réactifs destinés au dosage simultané de cAMP et de cGMP pour 75 échantillons et comprenant, en combinaison, les réactifs 1 et 2 de l'exemple 2 et les réactifs 1,2,3,5 et 6 de l'exemple 1, le réactif 4 de l'exemple 1 en quantité double, et, comme réactif 7,320 p mol de cAMP (sel de sodium) ainsi que 320 p mol de cGMP (sel de sodium) dissout dans 1 ml d'eau.

Exemple 4

Ensemble de réactifs pour le dosage simultané de cAMP et de cGMP, pour 75 échantillons, comprenant un réactif 1 consti- 10 tué par une solution tampon d'imidazol 0,3 M, ayant un pH de 6,5, 8 ml, cette solution contenant du (I125)ScAMP-TME 1 |xci et (I131)ScGMP-TME 1 (ici, un réactif 4 identique à celui que l'on utilise dans l'exemple 1, et des réactifs 2,3,5,6 et 7 respectivement identiques à ceux qui sont utilisés conformément,, à l'exemple 3.

Exemple 5

Ensemble de réactifs destinés au dosage simultané du cAMP et du cGMP, pour 75 échantillons, cet ensemble comprenant un 4{l réactif 5 constitué par 24 ml de solution tampon d'imidazole 1,5 M, contenant de l'EDTA à 12,5 mM, cette solution ayant une pH de 6,5, et des réactifs 1,2,4, 5, 6 et 7 respectivement identiques aux réactifs correspondants utilisés dans l'exemple 4.

45

Exemple 6

Ensemble de réactifs pour le dosage de cAMP et de cGMP, pour 75 échantillons, cet ensemble comprenant un réactif 5 constitué par 400 mg d'anhydride succinique dans 9 ml de tri-amidehexaméthylphosphorique et des réactifs 1,2,3,4,6 et 7 50 respectivement identiques aux réactifs correspondants utilisés selon l'exemple 3.

Exemple d'utilisation 1:

On peut procéder de la manière suivante au dosage dans le 55 cas où l'échantillon à doser est constitué par du plasma sanguin, en utilisant l'ensemble de réactifs de dosage du cAMP décrit dans l'exemple 1 :

(1) On mélange les réactifs 5 et 6 dans un rapport volumique de 9 à 1, de manière à préparer un agent de succinylation. M

(2) On mélange le réactif 3 (dilué à une concentration de ■/5'm= 1 avant usage) de l'eau distillée et l'agent de succinylation. dans un rapport en volume de 8:1:1, de manière à préparer une solution tampon pour la dilution.

(3) On place 100 (il de réactif 7 dans un petit tube à essai et on les mélange avec 100 (il de l'agent de succinylation. On maintient à la température ambiante le mélange ainsi obtenu, pendant une durée de 10 minutes et on y ajoute ensuite 800 (il du réactif 3, de manière à préparer 1 ml d'une solution étalon de cAMP succinylé ayant une concentration correspondant à 3,2 p mol./100 (il. (No. I).

On verse 500 (il de la solution tampon de dilution préparée lors de l'opération (2) dans 9 petits tubes à essai (No. II à X) (500 (il dans chaque tube), et on ajoute aux petits tubes à essai (No. II) 500 (il de la solution étalon de cAMP succinylée à 3,2 p Mol./100 (il préparés au cours de l'opération (3) et l'on mélange cette dernière solution étalon avec le contenu de ces petits tubes à essai. On procède ensuite à des dilutions dont chacune correspond à une diminution de moitié de la concentration de façon à préparer des solutions étalon de cAMP succinylé ayant des concentrations respectives suivantes: 3200 f mol, 1600 f mol; 800 f mol; 400 f mol; 200 f mol; 100 f mol; 50 f mol; 25 f mol; 12,5 f mol ; et 6,5 f mol par 100 (il.

(5) On place 100 (il de plasma dans un petit tube à essai et on y ajoute, tout en mélangeant, 100 (il d'agent de succinylation. On maintient le mélange ainsi obtenu à la température ambiante, pendant 10 minutes, après quoi on y ajoute 800 (il du réactif 5, de manière à préparer un échantillon de plasma. A cet effet, on détermine la quantité de réactifs 3 que l'on utilise de façon que la concentration d'acide succinique au moment de la réaction antigène-anticorps prenne une valeur telle qu'elle ne gêne pas cette réaction (approximativement 0,15% ou moins).

(6) On prépare des petits tubes à essai de la manière indiquée ci-dessous:

pour le comptage total: 3 tubes, nos. 1 à 3 pour les essais à blanc: 2 tubes, nos. 4 et 5 pour les essais zéro: 2 tubes, nos. 6 et 7 pour la solution étalon: 20 tubes, nos. 8 à 27 pour l'échantillon de plasma: 2 tubes, nos. 28 et 29.

(7) On verse 100 (il du réactif 1 dans chacun des tubes à essai préparés comme indiqué ci-dessus.

(8) On ajoute 100 |il de la solution tampon de dilution à chacun des tubes à essai pour le comptage total (No. 1,2 et 3) pour les essais à blanc (nos. 4 et 5) et pour les essais de zéro nos. 6 et 7).

(9) On ajoute 100 (il des solutions étalon de cAMP succinylé nos. I à X à chacun des tubes à essai nos. 8 à 27.

(10) On ajoute 100 |il de plasma succinylé aux tubes à essai nos. 28 et 29 destinés à l'échantillon de plasma.

(11) On ajoute 100 (il du réactif 2 à chacun des tubes à essai • nos. 6 à 29, pour les essais zéro, pour la solution étalon et pour l'échantillon de plasma et, après mélange des produits ainsi obtenus, on maintient les mélanges résultants dans l'eau glacée pendant une durée comprise entre 12 et 24 heures, (18 heures dans le cas particulier du présent exemple).

(12) On ajoute 100 (il de solution tampon d'imidazole 0,3 m dans chacun des tubes à essai no. 1 à 5 pour le comptage total et pour l'essai à blanc. Ensuite, après mélange, on maintient les mélanges obtenus dans des conditions similaires à celles qui sont identiquées dans l'opération (11) ci-dessus.

(13) On ajoute 500 (il du réactif 4 (dilués à une concentration V2 avant l'utilisation) à chacun des tubes à essai autres que ceux qui sont réservés pour le comptage total et l'on soumet ces tubes à essai à une séparation par centrifugation à une vitesse de 3000 tours/minute, pendant 5 minutes.

(14) On ajoute 500 |il d'eau à chacun des tubes à essai réservés au comptage total, dont on mélange ensuite les contenus.

(15) On prélève 500 |il du liquide surnageant dans chacun des tubes à essai et on les transfère dans chacun des tubes à essai réservés aux mesures par radioactivité.

(16) On mesure la radioactivité de chacune des fractions surnageantes.

(17) On soustrait la valeur moyenne (BL) des comptages à blanc de chacune des valeurs moyennes (T) du comptage total et

618 015

8

l'on calcule la valeur moyenne (B) du comptage pour chaque solution étalon, ainsi que le taux de fixage [B/T (%)] d'après l'équation suivante:

(B)-(BL)

(T)-(BL) X"")(%)

Les résultats des mesures et des calculs effectués conformément au présent exemple sont indiqués dans le tableau VI.

Tableau VI

Exemple d'utilisation 2:

Dans le cas où l'échantillon à doser est constitué par du plasma, et en utilisant l'ensemble de réactifs de dosage du cGMP ayant la composition indiquée dans l'exemple 2, on 5 effectue, de la même manière que celle qui est indiquée ci-dessus, les opérations (1 à 16) de l'exemple d'utilisation 1. On calcule les taux de fixage à partir de valeurs de mesure obtenues de manière similaire à celle qui est décrite dans l'opération (17) de l'exemple d'utilisation 1. Les résultats correspondant au m présent exemple sont indiqués dans le tableau VII.

Valeur moyenne

cmp cpm-BL

B/T%

Tableau VII

Valeur moyenne

Valeur moyenne

1S

cpm cpm-BL

B/T

comptage à

300

-

-

Valeur moyenne

blanc (BL)

comptage à

200

—

Valeur moyenne

blanc (BL)

comptage total

9109

8809

100

Valeur moyenne

Valeur moyenne

6065

5765

65.4

2o comptage total

9885

9685

100.0

comptage zéro

Valeur moyenne

Valeur moyenne

62.5

comptage zéro

6540

6340

65.5

comptage pour

5806

5506

Valeur moyenne

solution étalon

comptage pour

6296

6095

62.9

6.25 t mole

25 solution étalon

do.

12.5

f mole

5543

5243

59.5

6.25 f mole

do.

25

f mole

5069

4769

54.1

do.

12.5

f mole

5821

5621

58.0

do.

50

f mole

4600

4300

48.8

do.

25

f mole

5058

4858

50.2

do.

100

f mole

3614

3314

37.6

do.

50

f mole

4033

3833

39.6

do.

200

f mole

2837

2537

28.8

Mi do.

100

f mole

2870

2670

27.6

do.

400

f mole

1992

1692

19.2

do.

200

f mole

1866

1666

17.2

do.

800

f mole

1391

1091

12.4

do.

400

f mole

1288

1088

11.2

do.

1600

f mole

888

588

6.7

do.

800

f mole

846

646

6.7

do.

3200

f mole

620

320

3.6

do.

1600

f mole

563

363

3.7

Valeur moyenne

'

ss do.

3200

f mole

428

228

2.4

pour le plasma

3119

2819

32.0

Valeur moyenne

pour le plasma

4113

3933

40.6

(18) On établit une courbe d'étalonnage sur un graphique

en échelle semilogarithmique dont l'ordonnée représente le taux de fixage des différentes solutions étalon et dont l'abcisse repré-sente les concentrations correspondant à ces solutions étalon (la courbe d'étallonage correspondant au présent exemple étant représentée à la fig. 1 du dessin annexé).

(19) En utilisant cette courbe d'étallonnage, on détermine les concentrations en cAMP de l'échantillon de plasma d'après le rapport B/T ( %) correspondant à cet échantillon. Dans le présent exemple, 150 f mol/tube correspondent à 15 000 f mol/ml de plasma.

(18) On établit une courbe d'étalonnage de manière similaire à celle qui est indiquée dans l'exemple d'utilisation 1. La courbe d'étalonnage correspondant au présent exemple est représentée à la fig. 2 du dessin annexé.

(19) En utilisant la courbe d'étalonnage indiquée ci-dessus, on détermine la concentration en cGMP de l'échantillon de plasma à partir des valeurs du rapport B/T (en %) de cet échantillon. Dans cet exemple, une valeur de 45 f mol/tube correspond à une valeur de 4500 f mol/ml de plasma.

1 feuille dessins

Claims (9)

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1. Ensemble de réactifs destiné au dosage du monophosphate cyclique d'adénosine-3',5' désigné ci-dessous par l'abréviation cAMP, et/ou du monophosphate cyclique de guanosine-

2, de façon à provoquer des réactions antigène-anticorps dans 55 chacun de ces mélanges; on ajoute à chacun des produits ainsi obtenus le réactif 4, de façon à provoquer la séparation du complexe antigène-anticorps ainsi formé ou de l'antigène libre; et on mesure la radioactivité de ce complexe antigène-anticorps ou de l'antigène libre, de façon à réaliser le dosage ultramicro- m> analytique du cAMP et/ou du cGMP.

2. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le pH de la solution tampon d'imidazole du réactif 3 et au moins égal à 5 et au plus égal à 8. :o

2

REVENDICATIONS

3. Ensemble selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que la solution tampon d'imidazole du réactif 3 contient ua inhibiteur de Phosphodiesterase.

3 ',5' désigné ci-dessous par l'abréviation cGMP, par radioim- 5 munologie, caractérisé par le fait qu'il comprend: un réactif 1 comprenant l'ester méthyl tyrosinique du cAMP succinylé marqué à l'iode radioactif et/ou l'ester méthyl tyrosinique du cGMP succinylé marqué à l'iode radioactif; un réactif 2 comprenant un antisérum à l'égard du cAMP et/ou du cGMP ; un réactif 3 1 n comprenant une solution tampon d'imidazole ayant une concentration au moins égale à 0,1 M; un réactif 4 comprenant une substance permettant une séparation ; un réactif 5 comprenant une solution d'anhydride succinique dans un solvant organique; un réactif 6 comprenant une amine organique tertiaire ; et un 15 réactif 7 comprenant une solution étalon de cAMP et/ou de cGMP.

4. Ensemble selon l'une des revendications 1,2 et 3, caractérisé par le fait que le solvant organique du réactif 5 est choisi 25 parmi les composés suivants: la pyridine, le dioxane, l'acétone, Tacétonitrile, le dimethylsulfoxyde, l'ester diméthylique du di- . éthylène-glycol, l'hexaméthylphosphotriamide, le tétrahydro-pyranne, et l'acétate de méthyl-cellosolve.

5. Ensemble selon l'une des revendications 1,2 et 3, carac- m térisé par le fait que le solvant organique du réactif 5 est le dioxane.

6. Ensemble selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'amine organique tertiaire du réactif 6 est la 4-morpholino-N,N' -dicyclohexylcarboxamidine ou la triéthyl- 3 s amine.

7. Ensemble selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé parle fait que la substance permettant une séparation contenue dans le réactif 4 est choisie parmi les substances suivantes:

charbon actif revêtu de dextrane, dispersion de charbon actif -in revêtu de dextrane, sulfate d'ammonium, solution de Sulfate d'ammonium, polyéthylène-glycol, solution de polyéthylène-glycol, sérum anti-gamma globuline et solution de sérum antigamma globuline.

8. Utilisation de l'ensemble de réactifs selon la revendica- 45 tion 1, pour le dosage du monophosphate cyclique d'adénosine-3',5' et/ou du monophosphate cyclique de guanosine-3',5', caractérisée par le fait que l'on effectue les opérations successives suivantes: on mélange le réactif 5 avec le réactif 6; on ajoute le mélange ainsi obtenu d'une part à un échantillon à doser et, 50 d'autre part, au réactif 7, de façon à succinyler le cAMP et/ou le cGMP ; on dilue les produits ainsi obtenus avec le réactif 3 et, ensuite, on mélange ces mêmes produits avec le réactif 1 ; on mélange les produits résultant de cette opération avec le réactif

9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée par le fait que l'on effectue le mélange du réactif 5 avec le réactif 6 immédiatement avant d'ajouter le mélange ainsi obtenu à l'échantillon à doser et au réactif 7. f>s