ES2797547T3 - Receptores del sabor amargo felino y métodos. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido del receptor TAS2R felino (fTAS2R) que comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26, preferiblemente en donde fTAS2R es fTAS2R38 y el aminoácido 74 de la SEQ ID NO:18 es N.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores del sabor amargo felino y métodos
Antecedentes
El sistema del gusto proporciona información sensorial sobre la composición química del mundo exterior. Se cree que los mamíferos tienen por lo menos cinco modalidades básicas del sabor: dulce, amargo, ácido, salado y umami. Se cree que cada modalidad del sabor está medida por uno o más receptores de proteínas distintos que se expresan en las células receptoras del gusto que se encuentran en la superficie de la lengua. Los receptores del gusto que reconocen los estímulos de los sabores amargo, dulce y umami pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G (GPCR). Las diferencias sutiles en un receptor pueden alterar qué ligandos se unen y que señal se genera una vez que el receptor es estimulado.
Varios miembros de la superfamilia de GPCR median muchas otras funciones fisiológicas, como la función endocrina, función exocrina, frecuencia cardíaca, lipólisis y metabolismo de carbohidratos. El análisis bioquímico y la clonación molecular de un número de dichos receptores han revelado muchos principios básicos con respecto a la estructura del dominio y la función de estos receptores.
Se cree que la capacidad de los mamíferos de notar las cinco modalidades es muy similar, no obstante, debido a las diferencias ambientales en las dietas, los receptores del gusto han evolucionado de manera un poco distinta entre las especies mamíferas. Por ejemplo, el gen que codifica el Receptor del gusto, proteína de tipo 1, miembro 2, TAS1R2, un componente del receptor para compuestos dulces, ha mutado a un pseudogén no funcional en felinos y varios otros carnívoros obligados, mientras que los mamíferos acuáticos como el delfín han perdido la mayoría de los receptores del gusto funcionales.
La modalidad del sabor amargo usualmente se describe como desagradable. Muchas toxinas naturales y sintéticas se han caracterizado como sustancias estimuladoras del sabor amargo. En consecuencia, se plantea la hipótesis de que la percepción del sabor amargo ha evolucionado como medio para desalentar el consumo de compuestos tóxicos que a menudo se encuentran en las plantas. Se estima que hay decenas de miles de compuestos con sabor amargo. También se han identificado compuestos que bloquean la percepción del sabor amargo, por ejemplo ácido p-(dipropilsulfamoil)benzoico (probenecid) que actúa como un subconjunto del Receptor del gusto, proteínas Tipo 2 ("TAS2R"), una familia de receptores acoplados a la proteína G monomérica, embebida en la superficie de las células gustativas.
Las investigaciones han demostrado que la diversidad molecular en los TAS2R de seres humanos y otros primates conduce a diferencias funcionales en la percepción del sabor amargo de los individuos (Imai et al., 2012, Biol Lett.
8(4): 652-656; Li et al., 2011, Human Biology 83: 363-377). Se cree que la exposición a la flora específica de una región geográfica es una fuerza motora importante de selección en los TAS2R.
Los seres humanos codifican aproximadamente 26 TAS2R funcionales, lo que permite la detección de una enorme cantidad de compuestos. Hasta la fecha se han identificado aproximadamente 550 compuestos como sustancias que estimulan el sabor amargo para seres humanos. Actualmente, se cree que un subconjunto de TAS2R humanos (hTAS2R) son promiscuos, p. ej., activados por múltiples ligandos que pertenecen a varias clases químicas, mientras que otros hTAS2R se unen a ligandos de clases químicas solamente particulares. Además, varios hTAS2R son receptores huérfanos, aún sin compuestos identificados que los estimulen.
La transducción de señales de estímulos amargos se logra mediante la a-subunidad de gustducina. Esta subunidad de proteína G activa una fosfodiesterasa del gusto y reduce los niveles de nucleótidos cíclicos. Otras etapas en la vía de la transducción todavía se desconocen. La subunidad Py de gustducina también media el gusto activando IP3 (inositol trifosfato) y DAG (diglicérido). Estos segundos mensajeros pueden abrir canales de iones regulados o pueden causar la liberación del calcio interno. Si bien todos los TAS2R se localizan en las células que contienen gustducina, la inactivación de gustducina no suprime por completo la sensibilidad a los compuestos amargos, lo que sugiere un mecanismo redundante para el sabor amargo.
hTAS2R38 es el receptor del sabor amargo más ampliamente estudiado. A principios del siglo XX se observó una dicotomía en la percepción de feniltiocarbamida (PTC), un compuesto de sabor amargo, en una muestra de gente. La mayoría de la gente podía sentir el gusto de la PTC, pero aproximadamente el 25% no. Los investigadores notaron que el fenotipo de catador/no catador tenía un grado de heredabilidad. Posteriormente se determinó que la diferencia en fenotipo entre los dos grupos podía atribuirse a una diferencia en genotipo, más específicamente polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en tres posiciones dentro del ADN de hTAS2R38.
Otras especies exhiben un repertorio de TAS2R muy diferente de aquel de los seres humanos. Por ejemplo, el ratón tiene 34 TAS2R de longitud total en su genoma, mientras que el pollo tiene solamente 3 (Go et al., Genetics. mayo de 2005; 170(1 ):313-26). Si bien algunos compuestos pueden ser detectados por múltiples TAS2R es casi seguro que las diferencias en el repertorio de TAS2R entre las especies resultan en diferencias en la percepción del sabor amargo.
La percepción del sabor amargo es mediada por los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) de la familia de los receptores del gusto 2 (TAS2R). Los genes de TAS2R codifican una familia de siete receptores relacionados acoplados a la proteína G transmembrana implicados en la transducción del gusto, que interactúa con una proteína G para mediar en la transducción de señales del gusto. En particular, TAS2Rs interactúa en un modo específico del ligando con la proteína G Gustducina.
Hasta la fecha, se ha hecho mucho trabajo por caracterizar los TAS2R humanos (hTAS2R). El genoma humano codifica aproximadamente 26 TAS2R funcionales que son glicoproteínas. Todos los hTAS2R comparten un sito conservado para glicosilación enlazada a Asn dentro del centro del segundo bucle extracelular. Los hTAS2R también tienen la capacidad de formar homo- y hetero-oligómeros con otros GPCR cuando se expresan in vitro, no obstante, al presente no existe evidencia de que la oligomerización de los receptores TAS2R tenga implicancias funcionales.
Las células receptoras del sabor amargo representan una subpoblación distinta de células quimiosensoriales caracterizadas por la expresión de genes de TAS2R y son completamente segregadas desde aquellas células receptoras dedicadas a la detección de otros estímulos del gusto. Cada célula del receptor del sabor amargo expresa múltiples receptores del sabor amargo, aunque el grado de co-expresión es aún una cuestión de debate.
Además de su expresión en el sistema gustativo, los TAS2R se encuentran en tejidos no gustativos. Entre estos sitios extra-orales se encuentran los epitelios respiratorios, los tejidos gastrointestinales, los órganos reproductores y el cerebro. Los receptores del sabor amargo están implicados en la diferenciación o maduración de esperma en ratones. Se sabe que la expresión no gustativa de los TAS2R se utiliza para regular la digestión y la respiración.
La activación de los receptores TAS2R en una línea celular enteroendocrina (células STC-1) resulta en la liberación de la hormona del péptido colecistocinina (CCK), que puede reducir la movilidad del intestino. En consecuencia, la ingesta de una toxina potencial que activa la vía de TAS2R puede disminuir la velocidad a la cual pasa por el estómago y reducir el impulso de ingesta continua. La liberación de CCK también excita los procesos neuronales sensoriales del nervio vago para transportar la señal al cerebro, lo que sugiere que la regulación de la ingesta de alimentos implica tanto controles periféricos como centrales. La activación de la red de señalización de TAS2R puede también o alternativamente aumentar de manera indirecta la eliminación de toxinas absorbidas del epitelio intestinal antes de que las toxinas puedan ingresar en la circulación, ya que algunos datos indican que las células enteroendocrinas que segregan CCK están implicadas en un sistema de señalización paracrino que reduce la transferencia de sustancias tóxicas del intestino a la circulación. En la parte inferior del intestino, la activación de los receptores de TAS2R tiene un efecto diferente. Cuando algunos ligandos de sabor amargo se aplican al epitelio colónico, inducen la segregación de aniones, lo cual lleva a la segregación de fluido por el epitelio que puede eliminar cualquier irritante perjudicial del colon.
Las células quimiosensoriales solitarias (SCC) están también presentes en todo el aparato respiratorio superior y expresan todo el conjunto de moléculas de señalización relacionadas con el gusto, incluidos los receptores TAS2R, PLCp2, gustducina y el canal de transducción TrpM5. Las SCC hacen sinapsis hacia las fibras synapse de dolor polimodales del nervio trigeminal. La inhalación de una toxina que activa los receptores TAS2R de las SCC será irritante y evocará cambios reflejos mediados a nivel trigeminal en la respiración. Además, las fibras del nervio activadas liberan moduladores de péptido que resultan en inflamación neurogénica local del epitelio respiratorio, activando el sistema inmune en respuesta a la presencia de las toxinas.
Los receptores humanos del sabor amargo, hTAS2R2, hTAS2R41, hTAS2R42, hTAS2R45, hTAS2R48 y hTAS2R60 todavía se consideran GPCR huérfanos, ya que aún no se han identificado ligandos para estos receptores.
Hasta hace poco, hTAS2R2 se consideraba un pseudogén debido a una eliminación de dos bases en el códón 160 que se hallaba en secuencias recogidas de 10 poblaciones humanas (indios Karitiana, Surui, Waorani de Sudamérica, rusos de Europa del Este, drusos del Medio Oriente, atayal, chinos, japoneses de Asia Oriental, y jemeres y melanesios del Sudeste Asiático) y de recursos de GenBank. Se ha descubierto que hTAS2R2 es polimórfico con respecto a esa eliminación, con el gen intacto hallado en los adigueses (Europa del Este), Mbuti (Pigmeos africanos), y Biaka (Pigmeos africanos) (Go Y et al., Genetics 1 de mayo, 2005, 170 (1): 313-326).
El documento WO 2011/012298 A1 describe métodos para identificar agonistas y antagonistas del TAS2R49 humano. El documento WO 2006/053771 A2 describe métodos de cribado para identificar agonistas y antagonistas para TAS2R1, TAS2R3, TAS2R7 y TAS2R40 humanos.
El genoma felino se ha secuenciado con cobertura mínima (Mullikin et al. BMC Genomics 2010 11: 406; Pontius et al., Genome Research 200717: 1675-1689). Como consecuencia, existen vacíos importantes en la secuencia del genoma felino y solamente apenas más de 2000 genes felinos han sido considerados hasta la fecha. Como comparación, el genoma humano posee aproximadamente 25.000 genes registrados. Las secuencias anteriores a un vacío en el ensamblaje genómico son de mala calidad, entonces además de información faltante, una gran parte de los datos presentes es de mala calidad. En consecuencia, hay mucho por descubrir dentro del genoma felino y en la determinación de la base molecular de la percepción del gusto felino. Ningún TAS2R felino (fTAS2R) ha sido considerado en el genoma felino ni investigado desde el punto de vista bioquímico hasta el momento. Además, con muchas razas de felinos que se originan en una región geográfica particular y por lo tanto expuestas a una flora única, pueden existir diferencias de TAS2R específicas de la raza.
La identificación y caracterización de los receptores amargos de TAS2R felino es útil para poder comprender el perfil del gusto de los felinos y su modulación.
Compendio
Se describe un polipéptido del receptor TAS2R (fTAS2R) felino aislado que comprende un dominio extracelular de un receptor TAS2R felino; una región transmembrana de un receptor TAS2R felino o un dominio intracelular de un receptor TAS2R felino, en donde el receptor fTAS2R comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y s Eq ID NO:26, en donde el polipéptido del receptor fTAS2R aislado no consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 10.
Se describe que el polipéptido del receptor fTAS2R aislado comprende un dominio extracelular de un polipéptido del receptor TAS2R felino que comprende los aminoácidos 1,68-84; 146-179; o 249-257 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 1- 10, 73-88; 151-186; o 256-264 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 1-8; 72-88; 150-186; o 256-265 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 1-2; 69-87; 151-183; o 253-261 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 1-8; 72-88; 150-187; o 257-265 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 1 -6; 72-88; 150-183; o 253-262 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 1; 69-87; 150-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 1-8; 69-88; 150-185; o 252-261 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 1-17: 83-98; 161-198; o 268-277 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 1; 69-88; 150-185; o 255-264 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 1-2; 69-87; 149-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 1-2; 69-87; 149-181; o 251-259 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 1-8; 72-88; 150-185; o 254-263 de la SEQ ID NO:26; una región transmembrana del polipéptido del receptor TAS2R felino que comprende los aminoácidos 2-22, 47-67, 85-105, 125-145, 180-200, 228­ 248 o 258-278 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 11-31, 52-72, 89-109, 130-150, 187-207, 235-255 o 265-285 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 9-29, 51-71, 89-109, 129-149, 187-207, 235-255 o 266-286 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 130-150, 184-204, 232-252 o 262-282 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 9-29, 51­ 71, 89-109, 129-149, 188-208, 236-256 o 266-286 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 7-27, 51-71, 89-109, 129-149, 184-204, 232-252 o 263-283 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 2-22, 2. 48-68, 88-108, 129-149, 182-202, 230-250 o 261-281 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 9-29, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 231-251 o 262-282 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 18-38, 62-82, 99-119, 140-160, 199-219, 247-267 o 278-298 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 2- 22, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 234-254 o 265-285 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 128-148, 182-202, 230-250 o 261 -281 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 128-148, 182-202, 230­ 250 o 260-280 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 9-29, 51-71,89-109, 129-149, 186-206, 233-253 o 264-284 de la SEQ ID NO:26, o un dominio intracelular que comprende: aminoácidos 23-46; 106-124; 201-227; o 279-298 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 32-51; 110-129; 208-234; o 286-304 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 30-50; 110-128; 208-234; o 287-316 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 24-47; 109-129; 205-231; o 283-306 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 30­ 50; 110-128; 209-235; o 287-311 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 28-50; 110-128; 205-231; o 284-337 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 23-48; 109-128; 203-229; o 282-300 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 30-47; 110-128; 207­ 230; o 283-309 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 39-61; 120-139; 220-246; o 299-334 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 23-47; 110-128; 207-233; o 286-322 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 282­ 299 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 281-308 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 30­ 50; 110-128; 207-232; o 285-312 de la SEQ ID NO:26.
También se describe un polinucleótido que codifica el nuevo receptor TAS2R felino, o su fragmento.
Se describe que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID nO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de gran rigurosidad, y el complemento de las secuencias de nucleótidos mencionado anteriormente.
Se describen también vectores de expresión y células hospedantes que comprenden polinucleótidos, además de oligonucleótidos.
También se describen anticuerpos y kits para detectar el receptor fTAS2R.
También se describen en este documento métodos para identificar compuestos que interactúan con o modulan la actividad de un polipéptido del receptor fTAS2R.
En una realización, el método comprende poner en contacto un polipéptido del receptor TAS2R de este documento con un compuesto de ensayo, y detectar la interacción entre el polipéptido del receptor y el compuesto de ensayo.
En una realización, el método comprende poner en contacto un polipéptido del receptor TAS2R como se define en las reivindicaciones 1-3 descritas en este documento con un ligando del receptor en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, y determinar si el compuesto de ensayo modula la unión del ligando al receptor o la activación del receptor por parte del ligando.
También se describen métodos adicionales.
En una realización, un método para preparar composiciones comestibles comprende poner en contacto una composición comestible o un componente de esta con un polipéptido del receptor TAS2R felino como se define en las reivindicaciones 1-3 por un tiempo suficiente para reducir la cantidad de un compuesto amargo de la composición comestible o un componente de esta.
En una realización, un método para preparar composiciones comestibles para controlar la palatabilidad para un animal comprende añadir un compuesto a una composición comestible para reducir la palatabilidad de la composición comestible para un animal, en donde el compuesto es un agonista de un modulador positivo de un polipéptido del receptor TAS2R felino, como se define en las reivindicaciones 1-3.
Se describe también un método para formular una composición comestible con mejor palatabilidad que comprende determinar la presencia de un compuesto que es un agonista, antagonista o modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino en una composición comestible, y potenciar la palatabilidad de la composición comestible: si el compuesto es un agonista o un modulador positivo, aumentar la cantidad de un antagonista para el receptor en la composición comestible o reducir la cantidad del compuesto en la composición comestible, o si el compuesto es un antagonista o un modulador negativo, aumentar la cantidad del compuesto en la composición comestible.
Se describe también un método para administrar un compuesto amargo a un animal que lo necesita, que comprende administrar una composición comestible a un animal, en donde la composición comestible comprende un compuesto amargo y un compuesto antagonista o modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino que altera la aceptación de la composición comestible por parte del animal en comparación con la aceptación de la composición comestible sin el compuesto. El compuesto amargo puede comprender una composición farmacéutica, un material para el cuidado oral, un suplemento nutricional o un repelente.
Se describen también composiciones saporíferas para recubrir o incorporar en una composición comestible para administrar a un animal y métodos para su fabricación.
En una realización, la composición saporífera comprende un agonista o un antagonista de un polipéptido del receptor TAS2R felino, en donde el agonista es denatonio, aloína o PTC, y el antagonista es probenecid; opcionalmente, un potenciador de la palatabildad; opcionalmente, un compuesto para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible; y opcionalmente, un compuesto para aportar color o aroma; en donde la composición saporífera es una formulación líquida, sólida, en polvo, pasta, gel, untable, en gránulos o pulverizable.
Se describe que el método para elaborar la composición saporífera comprende mezclar un agonista o un antagonista de un receptor TAS2R felino, en donde el agonista es denatonio, aloína o PTC, y el antagonista es probenecid; opcionalmente un potenciador de palatabilidad; opcionalmente un compuesto para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible, y opcionalmente un compuesto para aportar color o aroma con un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en productos de carne, derivados de la carne, productos de pescado, derivados de pescado, lácteos, derivados de lácteos, fuentes de proteínas microbianas, proteínas vegetales, carbohidratos y aminoácidos para obtener una composición saporífera, en donde la composición saporífera es una formulación líquida, sólida, en polvo, pasta, gel, untable, en gránulos o pulverizable.
Estas y otras ventajas, además de las características inventivas, serán obvias a partir de los siguientes dibujos, descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es una alineación de secuencias que exhibe la 3a a la 7a regiones transmembrana (TM) (las regiones transmembrana están en gris) de varios receptores amargos humanos y felinos: TAS2R16 humano (SEQ ID NO:30), TAS2R4 (SEQ ID NO:27), TAS2R9 (SEQ ID NO:28). TAS2R10 (SEQ ID NO:29) ADN TAS2R38 (SEQ ID NO:31); y receptores amargos felinos, TAS2R4 (SEQ ID NO:8), 9 (SEQ ID NO:12), 10 (SEQ ID NO:14), 12 (SEQ ID NO:16) y 38 (SEQ ID NO:18).
La Fig. 2 muestra una alineación de secuencia para el polipéptido TAS2R38 humano (SEQ ID NO:31) y el polipéptido TAS2R38 felino (SEQ ID NO:18) determinada a partir de la secuenciación de ADN genómico de cinco gatos individuales.
Descripción detallada
Se describe en este documento una familia de nuevos receptores felinos del sabor amargo, TAS2R felino (fTAS2R). Estos receptores acoplados a la proteína G (GPCR) son componentes de la vía de transducción del gusto felino, específicamente, parte de la vía de transducción del sabor amargo, y están implicados en la detección del gusto felino de sustancias amargas tales como 6-n-propiltiouracil, sacarosa octaacetato, rafinosa undecaacetato, cicloheximida, denatonio, glicinato de cobre y quinina. También se describen polinucleótidos que codifican los receptores del sabor amargo, como vectores de expresión y células hospedantes para la expresión de nuevos receptores felinos del sabor amargo. También se describen métodos para expresar y aislar ácidos nucleicos y polipéptidos codificados.
Los ácidos nucleicos proporcionan sondas para identificación de células en donde se expresan los ácidos nucleicos, p. ej., células gustativas. Por ejemplo, las sondas para expresión de polipéptidos de TAS2R se pueden usar para identificar células gustativas presentes en foliato, circumvalato y papilas fungiformes. En particular, las sondas de TAS2R son útiles para identificar células sensibles al sabor amargo y pueden servir como herramientas para la generación de mapas anatómicos que esclarecen la relación entre las células sensibles al sabor amargo y sus proyecciones hacia el sistema nervioso. Se describen métodos para identificar compuestos que se unen a nuevos receptores felinos del sabor amargo y modular su actividad. En los métodos, los miembros de la familia fTAS2R actúan como moléculas indicadoras directas o indirectas para identificar moduladores del receptor del gusto que expresan actividad celular. Dichos compuestos son útiles para modulación de la actividad del receptor felino del sabor amargo. Modular la actividad de los receptores felinos del sabor amargo se puede lograr con agonistas, antagonistas, inhibidores y/o potenciadores. Estos compuestos moduladores se pueden usar en las industrias de alimentos y productos farmacéuticos para personalizar alimentos o fármacos, por ejemplo, para reducir el sabor amargo de alimentos o fármacos. Por tanto, los métodos descritos en este documento son útiles para diseñar o formular alimentos, mejoradores de la palatabilidad de los alimentos y dulces, y medicamentos en los que los compuestos aversivos se evitan o bloquean, particularmente para felinos.
Un "agonista" o "agonista del receptor" tal como se emplea en este documento, se refiere a una molécula que posee afinidad hacia y estimula la actividad funcional de un receptor celular. El nivel de estimulación de la actividad funcional en el receptor puede ser, p. ej., por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 80%, por lo menos 100%, por lo menos 200%, por lo menos 300%, por lo menos 500%, por lo menos 1,000%, por lo menos 10.000% frente a la situación inicial.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales o sintéticos, así como también a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan en un modo similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, además de aquellos aminoácidos que son modificados posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o esqueletos de péptidos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Miméticos de aminoácidos significa compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan en un modo similar a un aminoácido natural. Se puede hacer referencia en este documento a los aminoácidos o bien por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica (Biochemical Nomenclature Commission) IUPAC-IUB.
Un "antagonista" del receptor, tal como se emplea en este documento, se refiere a un tipo de ligando del receptor que se une al receptor en el mismo sitio que un agonista, pero no activa la respuesta funcional iniciada por la forma activa del receptor. Una vez unido, un antagonista bloquea la unión del agonista inhibiendo así la respuesta funcional producida por la unión del agonista. Ya que los agonistas y antagonistas "compiten" por el mismo sitio de unión en el receptor, el nivel de actividad del receptor será determinado por la afinidad relativa de cada molécula hacia el sitio y sus concentraciones respectivas. La inhibición de la respuesta funcional producida por un agonista o por un antagonista aplicada antes, en forma concomitante o después de la aplicación del agonista puede ser, p. ej., por lo menos 10%, por lo menos 15%; por lo menos 20%; por lo menos 30%; por lo menos 40%; por lo menos 50%; por lo menos 60%; por lo menos 70%; por lo menos 80%; por lo menos 90%; por lo menos 95%; por lo menos 98%; por lo menos 99%; por lo menos 99.5%; o por lo menos 100%. En determinadas realizaciones, el antagonista y el agonista se aplican en la misma concentración molar.
"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que se une específicamente y reconoce un antígeno. El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina", tal como se emplea de manera intercambiable en este documento, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión al antígeno (porción de unión al antígeno) o sus análogos de cadena sencilla. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. La expresión "anticuerpo monoclonal" significa un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. En algunas realizaciones, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un clon unicelular.
Un "anticuerpo" comprende por lo menos una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L). En IgG naturales, por ejemplo, estas cadenas pesada y ligera están interconectadas por enlaces disulfuro y hay dos pares de cadenas pesadas y ligeras; estos dos están también interconectados por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden además subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementaridad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR) o regiones de unión (J) (JH o JL en las cadenas pesada y ligera, respectivamente). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR, tres FR y un dominio J, dispuesto entre el término amino y el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, J. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se unen con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos hospedantes o factores, incluidas varias células del sistema inmune (p. ej., células efectoras) o factores humorales tales como el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
La expresión "porción de unión al antígeno" o "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo, tal como se emplea en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de un unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que ciertos fragmentos de un anticuerpo de longitud total pueden desempeñar la función de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión ilustrados como una porción o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro a la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un grupo individual de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y VL; (vi) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), que consiste en un dominio VH; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una región determinante de complementaridad aislada (CDR) o (ix) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden opcionalmente unirse mediante un enlazador sintético. Asimismo, si bien los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, con un enlazador sintético que les permite elaborarse como una cadena de proteína sencilla en donde las regiones VL y VH se unen para formar moléculas monovalentes (como un análogo de cadena sencilla de un fragmento de inmunoglobulina se conoce como Fv de cadena sencilla (scFv)). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también se abarcan dentro de la expresión "fragmento de anticuerpo". Los fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas en el campo, y se estudia la utilidad de los fragmentos en el mismo modo general que los anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión al antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinantes, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Un anticuerpo "anti-TAS2R" o "TAS2R" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido codificado por un gen TAS2R, ADNc o su secuencia.
La expresión "polipéptido quimérico" se refiere a una molécula, que no ocurre en la naturaleza, en donde todo o una porción de una secuencia de polipéptidos fTAS2R es parte de una secuencia de polipéptidos quimérica lineal. La porción de una secuencia de polipéptido fTAS2R puede ser la secuencia de aminoácidos de uno o más dominios del polipéptido de fTAS2R completo. Por ejemplo, la porción puede ser un dominio extracelular de un polipéptido de fTAS2R. El polipéptido quimérico puede ser elaborado por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido quimérico puede ser elaborado por un sistema de expresión recombinante o se puede sintetizar.
"Optimización de codones" describe un método aplicado a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido para modificar la secuencia de nucleótidos para expresión potenciada del polipéptido en las células de un organismo no felino de interés, p. ej., Drosophila melanogaster o Saccharomyces cerevisae, reemplazando por lo menos uno, más de uno o todos los codones de la secuencia felina nativa con codones más frecuentemente o lo más frecuentemente utilizados en los genes del organismo de expresión sin cambiar los aminoácidos del polipéptido expresado. En realizaciones preferidas, todos los codones del ácido nucleico que codifican una secuencia de polipéptidos, o su fragmento, son optimizados con codones. Muchos organismos exhiben un sesgo para uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptidos en desarrollo. Las diferencias en el uso de codones, algunas veces denominadas sesgo o preferencia de codones, entre los organismos son proporcionadas por la degeneración del código genético, y están documentadas entre muchos organismos. El sesgo de codones a menudo se correlaciona con la eficiencia de traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende de, entre otros, las propiedades de los codones que están siendo traducidos y la disponibilidad de las moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es en general un reflejo de los codones utilizados más frecuentemente en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden personalizar para expresión génica óptima en un organismo determinado en base a la optimización de codones. Los métodos de optimización de codones se conocen en la técnica, por ejemplo, el programa de acceso gratuito en internet JCat (Grote A, et al. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res. 1 de julio de 2005;33(edición web):W526-31.) o la metodología descrita en los documentos US20130017217 o WO2004058166.
"Variantes modificadas de manera conservadora" se aplica tanto a aminoácidos como a secuencias de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes modificadas de manera conservadora hace referencia a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todo el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que se especifique una alanina mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico de este documento que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. El experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es comúnmente el único codón para metionina, y TGG, que es comúnmente el único codón para triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita. El experto en la técnica reconocerá además que sustitución, eliminación o adición individual a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altere, añada o elimine un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservadora" en donde la alteración produce la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservadora se suman a, y no excluyen, las variantes polimorfas, los homólogos interespecies y los alelos de la invención.
"Dominio C terminal" se refiere a la región que abarca el final del último dominio transmembrana y el término C de la proteína, y que normalmente está localizada dentro del citoplasma.
"Dominios citoplásmicos" o "dominios intracelulares" se refiere a los dominios de proteínas de TAS2R que miran hacia el interior de la célula, p. ej., el "dominio C terminal" y los bucles intracelulares del dominio transmembrana, p. ej., los bucles intracelulares entre las regiones transmembrana 1 y 2, los bucles intracelulares entre las regiones transmembrana 3 y 4, y los bucles intracelulares entre las regiones transmembrana 5 y 6.
La expresión "dominios extracelulares" se refiere a los dominios de polipéptidos de TAS2R que sobresalen de la membrana celular y están expuestos a la cara extracelular de la célula. Dichos dominios incluyen el "dominio N terminal" que está expuesto a la cara extracelular de la célula, así como también a los bucles extracelulares del dominio transmembrana que están expuestos a la cara extracelular de la célula, es decir, los bucles entre las regiones transmembrana 2 y 3, y entre las regiones transmembrana 4 y 5. La región del "dominio N terminal" comienza en el término N y se extiende a una región cercana al comienzo del dominio transmembrana. Estos dominios extracelulares son útiles para ensayos de unión al ligando in vitro, tanto en fase soluble como sólida.
El término "felino" se refiere en este documento a cualquier miembro de la familia Felidae, incluidos gatos domésticos y gatos no domésticos. En algunas realizaciones, felinos puede incluir gatos salvajes o cautivos, incluidos gatos salvajes y exóticos, como pumas, guepardos, linces, ocelotes, leones, tigres, yaguares, panteras y leopardos.
Tal como se emplea en este documento, "heterólogo" significa que la secuencia o célula se origina a partir de una especie exógena, o si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención intencional humana, o que la secuencia está diseñada de novo sin referencia a ninguna secuencia natural. Por ejemplo, un promotor operativamente unido a un polinucleótido heterólogo parte de una especie diferente de la especie de la cual deriva el polinucleótido, o, si es de la misma especie o de una especie análoga, uno o más se modifican sustancialmente de la forma original y/o del locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operativamente unido. "Secuencias heterólogas" son aquellas que no están operativamente unidas o no son contiguas unas con otras por naturaleza. Un "polipéptido heterólogo", tal como se emplea en este documento, se refiere a un polipéptido que no está naturalmente incluido en la secuencia de polipéptidos del polipéptido del receptor fTAS2R. Una "célula heteróloga" para expresión de un polipéptido o ácido nucleico se refiere a una célula que normalmente no expresa ese polipéptido o ácido nucleico.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre las moléculas de polinucleótido y polipéptido. Dos ADN, o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" unas con otras cuando las secuencias exhiben por lo menos aproximadamente 50%, específicamente por lo menos aproximadamente 75%, más específicamente por lo menos aproximadamente 80%-85%, por lo menos aproximadamente 90%, y lo más específicamente por lo menos aproximadamente 95%-98% identidad de secuencia en una longitud definida de las moléculas. Tal como se emplea en este documento, sustancialmente homólogas se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia de polipéptido o ADN identificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente.
El término "inmunoensayo" es un ensayo que usa un anticuerpo para unirse específicamente a un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, dirigir y/o cuantificar el antígeno.
Tal como se emplea en este documento, "inhibición" o "bloqueo" de la actividad de un receptor TAS2R, o su fragmento de unión al ligando, significa que la respuesta funcional de un receptor TAS2R, o fragmento, a un agonista se reduce o previene en presencia del inhibidor, por ejemplo, el receptor TAS2R interactúa con una vía de señalización intracelular para producir una respuesta funcional más pequeña, p. ej., el receptor TAS2R interactúa con una proteína G para promover la transducción de señales que produce un incremento más pequeño en el Ca2+ intracelular que el producido por el agonista en ausencia de inhibición.
La "interacción" de un compuesto con un receptor TAS2R puede significar la unión del compuesto al receptor o la modulación de una respuesta funcional del receptor por el compuesto.
Los términos "aislado" o "purificado", utilizados de manera intercambiable en este documento, se refieren a un ácido nucleico, un polipéptido u otro resto biológico que se elimina de los componentes con los cuales se asocia naturalmente. El término "aislado" puede hacer referencia a un polipéptido que se separa y es discreto del organismo entero con el cual se encuentra la molécula en la naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido puede hacer referencia a una molécula de ácido nucleico desprovista, total o parcialmente, de secuencias normalmente asociadas en la naturaleza; o una secuencia, ya que existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con esto; o una molécula disasociada del cromosoma. La pureza y la homogeneidad típicamente se determinan usando técnicas químicas analíticas, por ejemplo electroforesis de gel poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante en una preparación se purifica sustancialmente. En particular, se separa un ácido nucleico de TAS2R aislado de marcos de lectura abierta que flanquean el gen TAS2R y codifican las proteínas distintas de TAS2R. En algunas realizaciones, el término "purificado" significa que el ácido nucleico o la proteína es por lo menos 85% puro, específicamente por lo menos 90% puro, más específicamente por lo menos 95% puro, o incluso más específicamente por lo menos 99% puro.
Un "ligando", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula que se une a una macromolécula, tal como un receptor TAS2R. El ligando puede ser una molécula pequeña, o un resto biológico, tal como una proteína, un azúcar, ácido nucleico o lípido. El ligando puede ser una molécula que modula la actividad del receptor TAS2R. Una molécula que modula la actividad de un receptor puede ser un agonista, un antagonista o un modulador como se define en este documento.
Los ligandos para diversos receptores TAS2R se conocen en la técnica. Por ejemplo, los ligandos de un TAS2R1 mamífero pueden incluir adhumulona, adlupulona, amarogentin, arborescin, cascarillin, cloranfenicol, cisisocohumulona, cis-isoloadhumulona, cohumulona, colupulona, dextrometorfan, difenidol (difeniltiourea, sulfocarbanilida, sim-difeniltiourea o tiocarbanilida), humulon (humulona), isoxantohumol, lupulon, lupulona, partenolida, picrotoxinin, ciclamato sódico, tiocianato sódico, tiamina, trans-isoadhumulona, trans-isocohumulona, trans-isohumulona, xantohumol y yohimbina. El TAS2R1 mamífero puede ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R1 mamífero es un TAS2R1 felino.
Los ligandos de un TAS2R3 mamífero pueden incluir cloroquina. El TAS2R3 mamífero puede ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, TAS2R3 es TAS2R3 felino.
Los ligandos de un TAS2R4 mamífero pueden incluir amarogentin, arborescin, artemorin, azatioprina, brucina, alcanfor, clorfeniramina, colquicina, dapsona, benzoato de denatonio, difenidol, partenolida, cuasina, quinina y yohimbina. El TAS2R4 mamífero puede ser de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R4 mamífero es TAS2R4 felino.
Los ligandos de un TAS2R7 mamífero pueden incluir cafeína, clorfeniramina, cromolina, difenidol, papaverina y quinina. El TAS2R7 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R7 mamífero es TAS2R7 felino.
Los ligandos de un TAS2R9 mamífero pueden incluir ofloxacina, pirenzapina y procainamid. El TAS2R9 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R9 mamífero es TAS2R9 felino.
Los ligandos de un TAS2R10 mamífero pueden incluir (-)-alfa tujona, absintina, arborescin, arglabin, artemorin, azatioprina, benzoína, cafeína, alcanfor, cascarillin, clorafenicol, cloroquina, clorfeniramina, cumarina, cucurbitacina b, cucurbitacina e, cucurbitacinas, cicloheximid, cicloheximida, dapsona, benzoato de denatonio, dextrometorfán, difenidol, eritromicina, famotidina, haloperidol, papaverina, partenólido, picrotoxinin, cuasina, quinina, etricnina y yohimbina. El TAS2R10 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R10 mamífero es un TAS2R10 felino.
Los ligandos de TAS2R38 mamífero pueden incluir 6-metil-2-tiouracilo, acetiltiourea, alil isotiocianato, caprolactama, clorfeniramina, dimetiltioformamida, difenidol, (difeniltiourea, sulfocarbanilida, sim-difeniltiourea, tiocarbanilida), etileno tiourea, n,n-etileno tiourea, etilpirazina, limonina, metimazol, n-etiltiourea, n-metiltiourea, fenetil isotiocianato, feniltiocarbamida (ptc), probenecid, propiltiouracilo, sinigrin, ciclamato de sodio, tiocianato de sodio y yohimbina. El TAS2R38 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R38 mamífero es TAS2R38 felino.
Los ligandos de TAS2R43 mamífero pueden incluir acesulfamo K, aloína, amarogentina, arborescin, arglabin, ácido aristolóquico, cafeína, cloranfenicol, cromolina, benzoato de denatonio, difenidol, falcarindiol, grosheimina (grossheimin), helicina, probenecid, quinina y sacarina. El TAS2R43 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R43 mamífero es un TAS2R43 felino.
Los ligandos de TAS2R44 mamífero pueden incluir acesulfamo K, aloína, ácido aristolóquico, difenol, famotidina, partenólido, quinina y sacarina. El TAS2R44 mamífero puede provenir de un ser humano, roedor, canino o felino. En una realización, el TAS2R44 mamífero es TAS2R44 felino.
La expresión "fragmento de unión al ligando" de un receptor TAS2R, tal como se emplea en este documento, se refiere a uno o más fragmentos del receptor TAS2R que retienen la capacidad de unirse específicamente a un ligando del receptor TAS2R.
Un "modulador" es una molécula que modula la respuesta funcional de un receptor uniéndose al sitio de unión que es distinto del sitio de unión al agonista. Un modulador positivo o "potenciador" potencia la respuesta funcional de un receptor, mientras que un modulador negativo o "inhibidor" inhibe la respuesta funcional de un receptor. Un "modulador alostérico" induce un cambio en la conformación del receptor, que altera la afinidad del receptor hacia los ligandos, particularmente en el sitio de unión al agonista. Los moduladores alostéricos positivos incrementan la afinidad hacia los ligandos en el sito de unión al agonista y/o potencian la actividad funcional de un receptor, mientras que los moduladores alostéricos negativos reducen la afinidad hacia los ligandos en el sitio de unión al agonista y/o inhiben la actividad funcional de un receptor. Los moduladores pueden incluir moléculas no peptídicas tales como miméticos no peptídicos, efectores alostéricos no peptídicos y péptidos.
La actividad "moduladora" o "modificadora" de un receptor TAS2R en este documento puede hacer referencia a cualquier cambio en el receptor TAS2R que ocurre en respuesta a la unión de un agonista, antagonista o modulador al receptor TAS2R o su fragmento de unión al ligando, es decir la alteración puede estimular, antagonizar o modular la respuesta funcional del receptor.
"No natural" en referencia a un polinucleótido significa que la secuencia de polinucleótidos no ocurre por naturaleza en el ADN genómico de un organismo.
La expresión "ácido nucleico", "polinucleótido" u "oligonucleótido" incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN. Un polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario. Los polinucleótidos pueden contener análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de esqueleto modificado que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, péptido-ácidos nucleicos (PNA). Un polinucleótido se puede obtener por cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluido aislamiento de fuentes naturales, síntesis química o síntesis enzimática. Se puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
La expresión "operativamente unido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico dispuesta en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder segregador está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la segregación del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado como para facilitar la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se están enlazando son contiguas, y, en caso de un líder segregador, contiguo en una fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra por ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional. Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, operativamente unido significa que las secuencias de ADN que se están enlazando son contiguas y, si es necesario se unen dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura.
Un "potenciador de la palatabilidad " o "mejorador de la palatabilidad" para una composición comestible animal, p. ej., un alimento, es un aditivo que proporciona un aroma, sabor, gusto después de ingerir, sensación en la boca, textura y/o sensación organoléptica que es atractivo para el animal diana.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en este documento para hacer referencia a una molécula formada a partir de la unión, en un orden definido, de por lo menos dos aminoácidos. La unión entre un residuo de aminoácido y el siguiente es un enlace amida y algunas veces se denomina enlace peptídico. Un polipéptido se puede obtener por un método adecuado conocido en la técnica, incluido el aislamiento de fuentes naturales, expresión en un sistema de expresión recombinante, síntesis química o síntesis enzimática. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como también polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.
Las estructuras macromoleculares de los polipéptidos se pueden describir en términos de distintos niveles de organización. "Estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido particular. "Estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales localmente ordenadas, estructuras tridimensionales dentro de un polipéptido. Estas estructuras comúnmente se conocen como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y habitualmente tienen 50 a 350 aminoácidos de longitud. Los dominios típicos están conformados por secciones de organización menor tales como tramos de láminas beta y hélices alfa. "Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero de polipéptido. "Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes.
El término "cebador" hace referencia a un oligonucleótido monocatenario aislado de entre aproximadamente 10 y 50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15 y 50, más preferiblemente 15 y 30 nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente entre aproximadamente 18 y 28 nucleótidos de longitud, que forma un dúplex con una secuencia de ácido nucleico monocatenaria de interés, y que es capaz de actuar como punto de partida de la síntesis de ácido nucleico para permitir la polimerización de una hebra complementaria usando una polimerasa bajo condiciones apropiadas (es decir, en presencia de nucleótidos y de un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El cebador debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, fuente del cebador y uso del método. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. Con el fin de facilitar la clonación subsiguiente de secuencias ampliadas, los cebadores pueden tener secuencias del sitio de enzimas de restricción anexadas a sus extremos 5'. Dichas enzimas y sitios se conocen en la técnica. Los cebadores por sí mismos se pueden sintetizar usando técnicas conocidas en el campo. En general, los cebadores se pueden fabricar usando máquinas de síntesis de oligonucleótidos comercialmente disponibles. Un "par cebador" es un par de secuencias de cebadores seleccionado para ampliar una secuencia diana de ADN particular por PCR. Un cebador del par es complementario al extremo 3' de la hebra "sentido" del ADN diana, p. ej., ADNc, y el otro es complementario al extremo 3' de la hebra "anti-sentido" del ADN diana.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "sonda" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridarse a otro ácido nucleico de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria, Una sonda de la presente invención es un oligonucleótido de entre aproximadamente 10 y 100 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15 y 80, más preferiblemente 20 y 50 nucleótidos de longitud. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos particulares, por ejemplo mediante hibridación Southern u otros métodos conocidos en la técnica. Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invención será etiquetada con cualquier "molécula indicadora", de manera tal que sea detectable en cualquier sistema de detección como, entre otros, sistemas enzimáticos (p. ej., ELISA, además de ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. La presente invención no está destinada a estar limitada a ningún sistema de detección o etiqueta particular.
El término "recombinante" se puede usar para describir una molécula de ácido nucleico y se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ARN, ADN, ADNc, vírico, semisintético o sintético, que en virtud de su origen o manipulación no se asocia con todo o parte del polinucleótido al cual se asocia en la naturaleza. El término "recombinante" tal como se utiliza con respecto a una proteína o polipéptido puede hacer referencia a un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y luego expresa en organismos transformados, por un método conocido en la técnica. El organismo hospedante expresa el gen exógeno para producir la proteína bajo condiciones de expresión.
La expresión "soporte sólido" se refiere a un material o grupo de materiales que tienen una superficie o superficies rígidas o semi-rígidas. Los ejemplos de materiales incluyen plásticos (p. ej., policarbonato) carbohidratos complejos (p. ej., agarosa y sefarosa), resinas acrílicas (p. ej., poliacrilamida y perlas de látex), nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio y nylon positivamente cargadas. En algunos aspectos, por lo menos una superficie del soporte sólido puede ser prácticamente plana, aunque en algunos aspectos puede ser conveniente separar físicamente regiones de diferentes moléculas, por ejemplo, con pozos, regiones elevadas, pernos, superficies grabadas o similares. En ciertos aspectos, el soporte(s) sólido adoptará la forma de perlas, resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas.
La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "inmunorreactivo específicamente (o selectivamente) con" cuando hace referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Por lo tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular por lo menos dos veces el fondo y prácticamente no se unen en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir que se seleccione un anticuerpo por su especificidad hacia una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales contra un fTAS2R se pueden seleccionar para obtener solamente aquellos anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con la proteína de fTAS2R o su porción inmunogénica y no con otras proteínas, excepto por ortólogos o variantes polimórficas y alelos de la proteína de TAS2R. Esta selección se puede lograr sustrayendo anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con las moléculas de TAS2R de otras especies u otras moléculas de TAS2R. Pueden también seleccionarse anticuerpos que reconocen solamente miembros de la familia fTAS2R GPCR pero no otros GPCR. Se puede emplear una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se usan habitualmente para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, p. ej., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayos y condiciones que se pueden usar para determinar inmunorreactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será por lo menos dos veces la señal o ruido de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo.
Con respecto a receptores, las expresiones "unión específica", "que se une específicamente", "unión selectiva" y "que se une selectivamente" significan que un receptor, tal como un receptor TAS2R, exhibe afinidad apreciable hacia un ligando particular. Afinidad de unión "apreciable" incluye la unión con una afinidad de por lo menos 104 M-1, por lo menos 105 M-1, específicamente por lo menos 106 M-1, más específicamente por lo menos 107 M-1, incluso más específicamente por lo menos 108 M-1, o incluso más específicamente por lo menos 109 M-1. Una afinidad de unión puede también indicarse como un intervalo de afinidades, por ejemplo, 104 M-1 a 1010 M-1, específicamente 105 M-1 a 1010 M-1, más específicamente 106 M-1 a 1010 M-1. La unión específica se puede determinar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para determinar dicha unión. En algunas realizaciones, la unión específica se determina de acuerdo con el análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitivos.
Tal como se emplean en este documento, "estimulación" o "activación" de un receptor TAS2R, o su fragmento de unión al ligando, significa que el receptor TAS2R, o el fragmento, se dispone en un estado en el que produce una respuesta funcional, por ejemplo, el receptor TAS2R interactúa con una vía de señalización intracelular para producir la respuesta funcional, p, ej., el receptor TAS2R interactúa con una proteína G para promover la transducción de señales que produce aumento de Ca2+ intracelular.
"Sustancialmente la misma" actividad biológica se refiere a un fragmento de polipéptido, derivado, homólogo, análogo o variante que retiene por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, y lo más preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más actividad biológica del polipéptido madre. El grado al cual el fragmento de polipéptido, derivado, homólogo, análogo o variante retiene la actividad biológica del polipéptido madre se puede evaluar por cualquier medio disponible en la técnica que incluye, aunque sin limitarse a ello, los ensayos enumerados o descritos en este documento.
Una "pareja de unión a TAS2R" es un compuesto que se une directa o indirectamente a un polipéptido TAS2R descrito en este documento.
Un "polipéptido del receptor TAS2R" (o receptor TAS2R o TAS2R) para uso en ensayos descritos en la presente invención para medir la unión al ligando o la actividad del receptor puede comprender un receptor TAS2R; un dominio de un receptor TAS2R, tal como un dominio extracelular, región transmembrana, dominio transmembrana, dominio citoplásmico, un fragmento de unión al ligando, dominio de asociación de subunidad, sitio activo y similares; o una proteína quimérica en donde o bien un receptor TAS2R o su dominio está covalentemente enlazado a una proteína heteróloga.
En este documento, una "sustancia que estimula el sentido del gusto" significa un ligando que se une a un receptor TAS2R específico o conjunto de receptores TAS2R.
La expresión "percepción del sabor", tal como se usa en la presente invención, se refiere a una respuesta (p. ej., bioquímica, conductual) o sensibilidad de un receptor TAS2R a un estímulo gustativo. La modificación de la percepción del sabor incluye una alteración (potenciación, reducción o cambio) de una respuesta bioquímica, una respuesta a la ingesta, una preferencia del sabor, una respuesta metabólica o una conducta general de un mamífero en respuesta a una sustancia que estimula el gusto. "Percepción del sabor" no requiere, aunque puede incluir, transmisión de una señal neuronal que resulta en la sensación in vivo del sabor por un mamífero.
El "dominio transmembrana", que comprende las siete regiones transmembrana, se refiere al dominio de polipéptidos de TAS2R que yace dentro de la membrana plasmática, y puede incluir los correspondientes bucles citoplásmicos (intracelulares) y extracelulares, que también se denomina "regiones" de dominio transmembrana. Las regiones transmembrana pueden también unirse a ligando o bien en combinación con el dominio extracelular o solo, y por lo tanto son también útiles para ensayos de unión al ligando in vitro.
La expresión "región transmembrana", tal como se emplea en este documento, ilustra una estructura de proteína tridimensional en forma termodinámicamente estable en una membrana, p. ej., una hélice alfa de una sola transmembrana o un cilindro beta transmembrana.
El término "vector" significa una secuencia de ácido nucleico para expresar un gen diana en una célula hospedante. Los ejemplos incluyen un vector de plásmido, un vector de cósmido, un vector de bacteriófago y un vector vírico. Los ejemplos de vectores víricos incluyen un vector de bacteriófago, un vector de adenovirus, un vector de retrovirus y un vector de virus adeno-asociado. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de expresión que incluye una secuencia diana membrana o una secuencia de señalización de segregación o una secuencia líder, además de un elemento de control de expresión tal como un promotor, operador, codón de inicio, codón de terminación, señal de poliadenilación y potenciador. El vector se puede fabricar de varias formas conocidas en la técnica dependiendo del propósito. Un vector de expresión puede incluir un marcador de selección para seleccionar una célula hospedante que contiene el vector. Además, un vector de expresión replicable puede incluir un origen de replicación. La expresión "vector recombinante" o "vector de expresión" significa un vector operativamente unido a una secuencia de nucleótidos heteróloga para el propósito de expresión, producción y aislamiento de la secuencia de nucleótidos heteróloga. La secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica todo o parte de un receptor fTAS2R o un polipéptido quimérico descrito en este documento.
El gen de TAS2R (hTAS2R) y las secuencias de nucleótidos de pseudogenes se usaron como referencias para identificar, mediante un planteamiento de bioinformática, genes de TAS2R felinos (fTAS2R) previamente desconocidos. Posteriormente, el ADN genómico felino aislado se usó para clonar los genes de fTAS2R. La secuencia de nucleótidos de los genes de fTAS2R clonados de varios felinos luego se determinó por secuenciación, p. ej., secuenciación de Sanger, y se usó para establecer una secuencia de nucleótidos de consenso para el gen, y para identificar cualquier sitio de variante en la secuencia.
Se describen polinucleótidos que codifican un receptor fTAS2R. En una realización, se aíslan los polinucleótidos. El polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que codifica un fTAS2R que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de homología a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, s Eq ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SeQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que codifica un fTAS2R y que tiene por lo menos 70% de homología a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ iD NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de gran rigurosidad; una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores; y el complemento de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores. En una realización, el porcentaje de homología es por lo menos 90%. En una realización, el porcentaje de homología es por lo menos 95%, preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente por lo menos 99%. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de gran rigurosidad; y el complemento de las secuencias de nucleótidos anteriores. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene la SEQ ID NO: 17 bajo condiciones de gran rigurosidad; y el complemento de las secuencias de nucleótidos anteriores. En una realización, la secuencia de nucleótidos es optimizada por codones para expresión en una célula no felina. En una realización, la célula no felina es Escherichia coli, una célula de Saccharomyces cerevisae, una célula de Drosophila melanogaster, una célula de Caenorhabditis elegans o una célula mamífera. En una realización, la célula mamífera es una célula humana o murina. Los ejemplos de secuencias optimizadas por codones para expresión de los nuevos polipéptidos del receptor fTAS2R en células de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, células humanas o murinas se describen en las SEQ ID NO: 58­ 135.
Se describen también polinucleótidos que comprenden una secuencia que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% homología con las SeQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, o el complemento de las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23 o 25.
Se describen también composiciones que comprenden por lo menos dos polinucleótidos descritos en este documento. En una realización, cada polinucleótido codifica una porción de un receptor fTAS2R distinto. En una realización, la composición comprende por lo menos 3, 4 o 5 de los polinucleótidos descritos en este documento.
Se describe que la composición comprende por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 de los polinucleótidos descritos en este documento. En una realización, cada polinucleótido de la composición codifica un receptor fTAS2R diferente, o su fragmento. En una realización, la composición comprende un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 17 y/o la SEQ ID NO: 21. La composición comprende un par cebador para ampliar una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de TAS2R felino. En una realización, los pares de cebadores se seleccionan entre los pares de cebadores de la Tabla 5. Los pares de cebadores descritos en este documento son útiles para determinación de la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de TAS2R particular, o su fragmento, usando PCR. Los pares de cebadores de ADN monocatenario se pueden anelar a secuencias dentro o que rodean el gen de fTAS2R con el fin de cebar ampliando la síntesis de ADN del gen de fTAS2R propiamente dicho. También se pueden emplear cebadores específicos de alelos. Dichos cebadores se anelan solamente a alelos mutantes de fTAS2R particulares, y por lo tanto solamente ampliarán un producto en presencia del alelo mutante como molde.
Se identificó un polimorfismo de un solo nucleótido en la secuencia de ácido nucleico que codifica fTAS2R38 en el nucleótido 220 de la secuencia de ADNc (SEQ ID NO:17) a partir de la secuenciación de ADN genómico felino ampliado de múltiples sujetos. Los dos alelos observados en el nucleótido 220 fueron G y A. La variación del ácido nucleico G220A corresponde a una variación del aminoácido D74N en la secuencia de proteínas de fTAS2R38 (SEQ ID NO:18). En una realización, un polinucleótido descrito comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:17 que contiene el nucleótido 220, en donde una A está presente en el nucleótido 220; o el complemento de la secuencia de nucleótidos. En una realización, el polinucleótido comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:17 que contiene el nucleótido 220, en donde una A está presente en el nucleótido 220; o el complemente de la secuencia de nucleótidos. En una realización, un polipéptido de fTAS2R38 descrito comprende la SEQ ID NO:18 con N presente en el residuo 74 de la secuencia, o su fragmento que comprende el residuo N74.
En otro aspecto, se describen polipéptidos del receptor fTAS2R aislados.
En una realización, el polipéptido de fTAS2R aislado es codificado por un polinucleótido descrito en este documento.
En una realización, el polipéptido de fTAS2R aislado puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SeQ ID NO:22, SeQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26; o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SeQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26. En una realización, el polipéptido de fTAS2R aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o s Eq ID NO:26; o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% de homología con una de las secuencias de aminoácidos anteriores. En una realización, el polipéptido de fTAS2R aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:22.
Los GPCR sensoriales, como los receptores del sabor amargo TAS2R, tienen una estructura de dominio que incluye un dominio N-terminal; dominios extracelulares; un dominio transmembrana que comprende siete regiones transmembrana, bucles citoplásmicos y extracelulares; dominios citoplásmicos; y un dominio C-terminal. Estos dominios se pueden identificar estructuralmente usando métodos conocidos en la técnica, como programas de análisis de secuencias que identifican dominios hidrófobos e hidrófilos. Dichos dominios son útiles para elaborar proteínas quiméricas y para los ensayos in vitro descritos en este documento, p. ej., ensayos de unión al ligando.
Las siete regiones transmembrana y bucles extracelulares y citoplásmicos se pueden identificar usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, las regiones transmembrana de las proteínas de fTAS2R se pueden identificar usando software, TOPCONs , disponible en la internet de Stockholm Bioinformatics Center, Stockholm University (Andreas Bernsel, et al. (2009) Nucleic Acids Research 37 (edición web), W465-8). Las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos del fTAS2R que se identifican con TOPCONS se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 1. Predicción de TOPCONS de siete regiones transmembrana, bucles extracelulares y bucles intracelulares
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Se pueden generar predicciones alternativas de las regiones transmembrana y bucles extracelulares y citoplásmicos de las proteínas de fTAS2R usando un software distinto también disponible en internet de Stockholm Bioinformatics Center, como SCAMPI (Andreas Bernsel, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7177-7181.); PRODIV ( Hákan Viklund y Arne Elofsson (2004) Protein Science 13, 1908-1917) y OCTAPUS (Hákan Viklund y Arne Elofsson (2008) Bioinformatics. 24, 1662-1668.) Otros métodos conocidos en la técnica para pronosticar las regiones estructurales incluyen métodos de predicción de hidropatía de Goldman-Engleman-Steitz, o Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105­ 132 (1982), o Hopp-Woods. Los métodos de predicción de estructura secundaria incluyen Garnier-Robson, o Deléage & Roux o Chou-Fasman. Como se conoce en la técnica, los distintos algoritmos disponibles pueden pronosticar límites ligeramente diferentes para regiones transmembrana basadas en la secuencia de aminoácidos.
En una realización, el polipéptido del receptor TAS2R aislado puede comprender por lo menos un dominio extracelular de un receptor TAS2R felino; por lo menos un dominio transmembrana de un receptor TAS2R felino; o por lo menos un dominio intracelular de un receptor TAS2R felino, en donde el receptor TAS2R felino comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26; en donde el polipéptido del receptor fTAS2R aislado no consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 10.
Se describe que el dominio extracelular del polipéptido de fTAS2R puede comprender los aminoácidos 1,68-84; 146­ 179; o 249-257 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 1 -10, 73-88; 151-186; o 256-264 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 1 -8; 72-88; 150-186; o 256-265 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 1-2; 69-87; 151-183; o 253-261 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 1-8; 72-88; 150-187; o 257-265 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 1-6; 72-88; 150-183; o 253-262 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 1; 69-87; 150-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 1-8; 69-88; 150-185; o 252-261 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 1-17: 83-98; 161-198; o 268-277 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 1; 69­ 88; 150-185; o 255-264 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 1-2; 69-87; 149-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 1-2; 69-87; 149-181; o 251-259 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 1-8; 72-88; 150-185; o 254-263de la SEQ ID NO:26.
Se describe que el dominio transmembrana del polipéptido de fTAS2R puede comprender los aminoácidos 2-22, 47­ 67, 85-105, 125-145, 180-200, 228-248, o 258-278 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 11-31, 52-72, 89-109, 130-150, 187-207, 235-255, o 265-285 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 9-29, 51-71, 89-109, 129-149, 187-207, 235-255, o 266-286 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 130-150, 184-204, 232-252, o 262-282 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 9-29, 51-71,89-109, 129-149, 188-208, 236-256, o 266-286 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 7­ 27, 51-71, 89-109, 129-149, 184-204, 232-252, o 263-283 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 2-22, 2. 48-68, 88-108, 129-149, 182-202, 230-250, o 261 -281 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 9-29, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 231 -251 o 262-282 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 18-38, 62-82, 99-119, 140-160, 199-219, 247-267, o 278-298de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 2-22, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 234-254 o 265-285 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 128-148, 182-202, 230-250 o 261-281de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 3-23, 48­ 68, 88-108, 128-148, 182-202, 230-250 o 260-280 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 9-29, 51-71,89-109, 129-149, 186-206, 233-253 o 264-284de la SEQ ID NO:26.
Se describe que el dominio intracelular del polipéptido de fTAS2R puede comprender los aminoácidos 23-46; 106-124; 201-227; o 279-298 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 32-51; 110-129; 208-234; o 286-304 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 30-50; 110-128; 208-234; o 287-316 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 24-47; 109-129; 205-231; o 283­ 306 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 30-50; 110-128; 209-235; o 287-311 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 28-50; 110-128; 205-231; o 284-337 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 23-48; 109-128; 203-229; o 282-300 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 30-47; 110-128; 207-230; o 283-309 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 39-61; 120-139; 220-246; o 299-334 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 23-47; 110-128; 207-233; o 286-322 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 282-299 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 281 -308 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 30-50; 110-128; 207-232; o 285-312 de la SEQ ID NO:26.
Se describe que el polipéptido del receptor fTAS2R comprende una región transmembrana 2, una región transmembrana 3, una región transmembrana 4, una región transmembrana 5, una región transmembrana 6 y una región transmembrana 7, en donde cada región transmembrana comprende por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de la región transmembrana correspondiente seleccionadas en forma independiente entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26; o una región transmembrana 3, una región transmembrana 6 y una región transmembrana 7, en donde cada región transmembrana comprende por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de la región transmembrana correspondiente seleccionadas en forma independiente entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26; un dominio extracelular 3 que comprende por lo menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados entre los aminoácidos 146-179 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 151-186 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 150-186 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 151-183 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 150-187 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 150­ 183 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 150-181 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 161-198 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 149-181 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 149-181 de la SEQ ID NO:24; y aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:26; y un dominio extracelular 4 que comprende por lo menos 8 aminoácidos consecutivos seleccionados entre los aminoácidos 249-257de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 256-264 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 256-265 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 253-261 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 257-265 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 253-262 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 251-260 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 252-261 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 268­ 277 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 255-264 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 251-260 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 251-259 de la SEQ ID NO:24; y aminoácidos 254-263 de la SEQ ID NO:26.
Se describen también polinucleótidos que codifican el polipéptido que comprende por lo menos un dominio extracelular de un receptor TAS2R felino; por lo menos un dominio transmembrana de un receptor TAS2R felino; o por lo menos un dominio intracelular de un receptor TAS2R felino.
En otro aspecto, se describen polipéptidos quiméricos que comprenden un dominio extracelular, un dominio intracelular o una región transmembrana de un polipéptido del receptor TAS2R felino, y que además comprenden un polipéptido heterólogo. El dominio intracelular, dominio extracelular o la región transmembrana del polipéptido del receptor TAS2R felino puede ser cualquiera de aquellos descritos en este documento.
El polipéptido heterólogo puede ser cualquier polipéptido adecuado conocido en la técnica, o una porción de dicho polipéptido que pueda ser útil en este documento. El polipéptido heterólogo puede ser, por ejemplo, una secuencia para determinar la localización y expresión celular, para permitir el correcto pliegue del polipéptido quimérico en un sistema de expresión y/o para facilitar el aislamiento del polipéptido quimérico. El polipéptido heterólogo puede enlazarse a cualquier porción del polipéptido quimérico, por ejemplo al extremo amino terminal o al extremo carboxi terminal de la secuencia fTAS2R. Por ejemplo, el polipéptido heterólogo puede ser los primeros 45 aminoácidos de somatostatina de rata, la marca FLAG®, una marca 6x histidina (his), MYC, una marca de proteína fluorescente, V5 y/o glutatión S-transferasa (GST). Cuando el polipéptido heterólogo consiste en los primeros 45 aminoácidos de somatostatina de rata, típicamente se dispone en el extremo amino terminal del polipéptido quimérico para permitir el direccionamiento de la membrana. Cuando el polipéptido heterólogo es una marca, para permitir que el aislamiento del polipéptido quimérico sea más fácil, p. ej., una marca 6x histidina, se puede disponer en el término amino del polipéptido quimérico. El experto en la técnica puede tomar la determinación de una localización adecuada para el polipéptido heterólogo en el polipéptido quimérico en relación al extremo amino o al extremo carboxi de la secuencia fTAS2R para obtener un aspecto funcional particular del polipéptido heterólogo en el polipéptido quimérico.
Se describen también polinucleótidos que codifican polipéptidos quiméricos.
Se describe también una composición que comprende por lo menos dos polipéptidos de fTAS2R descritos en este documento. En una realización, la composición comprende por lo menos 3, 4 o 5 polipéptidos descritos en este documento. En una realización, la composición comprende por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 polipéptidos descritos en este documento. En una realización, cada polipéptido en la composición es un receptor fTAS2R diferente. En una realización, la composición comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:18 y un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:22.
A menos que se indique otra cosa, una secuencia de polipéptidos particular también abarca implícitamente sus variantes modificadas en forma conservadora. Una sustitución de aminoácido conservadora en una secuencia de polipéptidos incluye la sustitución de un aminoácido en una clase por un aminoácido de la misma clase, en donde una clase se define mediante propiedades físico-químicas comunes de la cadena lateral del aminoácido y altas frecuencias de sustitución en proteínas homólogas que se hallan en la naturaleza, según lo determinado, por ejemplo, por la matriz de intercambio de frecuencias Dayhoff o la matriz BLOSUM. Se han categorizado seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (Ile, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro residuo de clase III tal como Asn, Gln o Glu, es una sustitución conservadora. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las regiones de la molécula de interés que pueden tolerar el cambio por referencia a Hopp/Woods y Kyte- Doolittle plots.
A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca explícitamente sus variantes modificadas de manera conservadora (p. ej., sustituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias, además de la secuencia que se indica explícitamente. Concretamente, las sustituciones de codones degeneradas se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) de los codones seleccionados se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxivinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.
19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 -98 (1994)).
El porcentaje de identidad (homología) se puede determinar por comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas, alineando las secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. Se pueden usar programas de ordenador fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, como ALIGN (Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC), que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman 1981 Advances in Appl Math 2:482-489, para análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad de secuencias de nucleótidos están disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que solamente dependen del algoritmo Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en Wisconsin Sequence Analysis Package anteriormente mencionado. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos particular a una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización de espacio de seis posiciones de nucleótidos.
Alternativamente, la homología de los nucleótidos se puede determinar por hibridación bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguida de digestión con nucleasa(s) específicas monocatenarias y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas, como se define para ese sistema particular. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del campo técnico. Véanse, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) o Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. En una realización, las condiciones de gran rigurosidad son 6X SSC (IX SSC = cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7) a 45° C., seguido de un lavado en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65° C o equivalente. Las condiciones de hibridación moderadas se definen como el equivalente a la hibridación en 2X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 30° C., seguido de un lavado en 1X SSC, 0,1% SDS a 50° C. Las condiciones de gran rigurosidad se conocen en la técnica, y para los fines de la presente invención, incluyen condiciones equivalentes a la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 45° C., seguido de un lavado en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65° C.
Se describe en este documento un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de TAS2R felino descrito en este documento, o su fragmento. En una realización, el vector recombinante comprende un polinucleótido que consiste en la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, o 25; un polinucleótido que consiste en el complemento de la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 o 25; o un polinucleótido que consiste en una secuencia que tiene por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% homología con SEQ iD NO:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, o el complemento de la SEQ ID NO:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23 o 25. En una realización, el vector recombinante comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de gran rigurosidad; y el complemento de las secuencias de nucleótidos anteriores. En una realización, el vector comprende una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO:17 o la SEQ ID NO:21. También se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico descrito en este documento.
El vector recombinante se puede construir para uso en células hospedantes procariotas o eucariotas. Por ejemplo, cuando una célula procariota se usa como célula hospedante, el vector de expresión utilizado en general incluye un promotor fuerte capaz de iniciar la transcripción (por ejemplo, un promotor pLA, promotor trp, promotor lac, promotor tac, promotor T7), un sitio de unión al ribosoma para iniciar la traducción, y una secuencia de finalización de la transcripción/traducción. Cuando se usa una célula eucariota como célula hospedante, el vector utilizado en general incluye el origen de replicación que actúa en la célula eucariota, por ejemplo el origen de replicación f1, el origen de replicación SV40, el origen de replicación pMB1, el origen de replicación adeno, el origen de replicación AAV o el origen de replicación BBV, aunque sin limitarse a estos. Un promotor que es un vector de expresión para una célula hospedante eucariota puede ser un promotor derivado de los genomas de células mamíferas (por ejemplo, un promotor de metalotioneína o un promotor de EF-1 alfa) o un promotor derivado de virus mamíferos (por ejemplo, un promotor tardío de adenovirus, un promotor del virus Vaccinia 7,5K, un promotor Sindbis, un promotor SV40, un promotor de cytomegalovirus y un promotor tk de HSV). Una secuencia de terminación de la transcripción en un vector de expresión para una célula hospedante eucariota puede ser, en general, una secuencia de poliadenilación.
Se describe también una célula hospedante que comprende un vector de expresión o un polinucleótido descrito en este documento. Una célula hospedante adecuada se puede transformar con por lo menos uno de ejemplo de un polinucleótido descrito en este documento, por ejemplo un polinucleótido que consiste en la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23 o 25.
La célula hospedante del vector puede ser cualquier célula que pueda ser utilizada en términos prácticos por el vector de expresión. Por ejemplo, la célula hospedante puede ser una célula eucariota superior, como una célula mamífera, o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura. Además, la célula hospedante puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. Una célula hospedante procariota puede ser una bacteria del género Bacillus, como E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis;o una bacteria intestinal, como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y varias especies de Pseudomonas. Una célula eucariota puede ser una levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae), una célula de insecto, una célula vegetal o una célula animal, por ejemplo, Sp2/0 de ratón, CHO (ovario de hámster chino) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, HeLa, HEK-293, o una línea celular de MDCK. En algunas realizaciones, son útiles en este documento las células de peces.
El polinucleótido o vector recombinante, incluido el polinucleótido, se puede transferir a una célula hospedante usando un método conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando se usa una célula procariota como la célula hospedante, la transferencia se puede realizar usando un método CaCl2 o un método de electroporación, y cuando se usa una célula eucariota como la célula hospedante, la transferencia se puede llevar a cabo por microinyección, precipitación de fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por liposomas, transfección LIPOFECTAMINE® (Life Technologies Corporation) o bombardeo de genes, aunque sin limitarse a esto.
Después de introducir el vector de expresión en las células, las células transfectadas se pueden cultivar bajo condiciones que favorecen la expresión de fTAS2R. fTAS2R se puede recubrir del cultivo usando técnicas convencionales conocidas en el campo.
Los vectores de expresión descritos en este documento son particularmente útiles para ensayos a fin de identificar y caracterizar sustancias que estimulan el sentido del gusto. Los medios para introducir/expresar los ácidos nucleicos y vectores, o bien individualmente o como bibliotecas, se conocen en la técnica. Se puede medir una diversidad de parámetros individuales de células, órganos o animales completos mediante una diversidad de métodos. Las secuencias de fTAS2R descritas se pueden expresar, por ejemplo, en tejidos de gusto animal por administración con un agente transmisible, p. ej., vector de expresión de adenovirus.
Los ensayos de ácido nucleico para presencia de ADN y ARN para un miembro de la familia de TAS2R en una muestra incluyen numerosas técnicas conocidas por los expertos en la materia, como análisis Southern, análisis Northern y dot blots, protección de RNasa, análisis S1, técnicas de ampliación como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y reacción en cadena de la ligasa (LCR), e hibridación in situ. A su vez, una proteína de TAS2R se puede detectar con diversas técnicas de inmunoensayo conocidas en el campo. La muestra de ensayo típicamente se compara tanto con un control positivo (p. ej., una muestra que expresa una proteína TAS2R recombinante) como con un control negativo.
La información de la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico descrita en este documento hace posible la identificación de los compuestos que son parejas de unión con los que interactuará un polinucleótido o polipéptido de TAS2R. Los métodos para identificar los compuestos que son parejas de unión incluyen ensayos de disolución, ensayos in vitro en los que se inmovilizan polipéptidos TAS2R, y ensayos basados en células.
Las moléculas de unión específicas, incluidos ligandos naturales y compuestos sintéticos, se pueden identificar o desarrollar usando productos TAS2R aislados o recombinantes, variantes de TAS2R, o células que expresan dichos productos. Las parejas de unión son útiles para purificar productos TAS2R y detectar o cuantificar productos TAS2R en muestras de fluido y tejido usando procedimientos inmunológicos conocidos. Las moléculas de unión son también útiles para modular (es decir, bloquear, inhibir o estimular) las actividades biológicas de TAS2R, especialmente aquellas actividades implicadas en la transducción de señales. Las moléculas de unión son también útiles para pronosticar la percepción del gusto de un organismo tal como un mamífero, detectando un polipéptido de TAS2R en una muestra biológica de un felino.
Se describen métodos para identificar compuestos que se unen y/o modulan los receptores fTAS2R.
En una realización, el método comprende poner en contacto el receptor TAS2R definido en las reivindicaciones 1-3 con un compuesto de ensayo que se sospecha que se une al receptor TAS2R; y detectar la unión entre el compuesto y el receptor TAS2R. La unión se puede determinar con cualquier ensayo de unión conocido por el experto en la técnica, incluidos ensayos de desplazamiento de gel, Western blot, ensayos de competición radiomarcados, expresión basada en fagos, clonación de expresión basada en fagos, co-fraccionamiento por cromatografía, co-precipitación, reticulación, análisis de interacción de atrapamiento/doble híbrido, análisis southwestern y ELISA. Los métodos pueden también emplear ligandos que se unen a una etiqueta, como una radioetiqueta (p. ej., 125I, 35S, 32P, 33P, 3H), una etiqueta de fluorescencia, una etiqueta quimioluminiscente, una etiqueta enzimática y una etiqueta inmunogénica.
En una variación, se usa en el método una composición que comprende una célula que expresa el receptor TAS2R en su superficie. En otra variación, se emplea el receptor TAS2R aislado o las membranas celulares que comprenden el receptor TAS2R. La unión se puede medir directamente, p. ej., usando un compuesto etiquetado, o se puede medir en forma indirecta. Los compuestos identificados por unir un receptor TAS2R se pueden ensayar también en otros ensayos, incluida la actividad de TAS2R y/o modelos in vivo, con el fin de confirmar o cuantificar su actividad.
La unión del ligando a una proteína TAS2R, un dominio o una proteína quimérica se puede ensayar en disolución, en una membrana bicapa, adjunta a una fase sólida, en una monocapa de lípido, o en vesículas. La unión del ligando a un receptor TAS2R se puede ensayar usando, p. ej., cambios en las características espectroscópicas (p. ej., fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), o en las propiedades hidrodinámicas (p. ej., forma), cromatográficas o de solubilidad.
El polipéptido o polinucleótido de TAS2R empleado en dicha prueba puede o bien estar libre en la disolución, unido a un soporte sólido, transportado en una superficie celular, localizado en forma intracelular, o asociado con una porción de una célula. El experto en la técnica puede, por ejemplo, medir la formación de complejos entre un polinucleótido o receptor TAS2R y el compuesto que se está ensayando. De manera alternativa, el experto en la técnica puede examinar la disminución en la formación de complejo entre un polinucleótido o receptor TAS2R y su sustrato causado por el compuesto que se está ensayando. En algunas realizaciones, los sitios de reconocimiento del polinucleótido o receptor TAS2R se acoplan con un sistema de monitoreo, o bien eléctrico u óptico. Un estímulo químico apropiado puede unirse al dominio de unión al ligando del receptor, cambiando la conformación del receptor hasta un grado en que los electrónicos acoplados o los cambios ópticos puedan observarse en una lectura. En una realización, el soporte sólido se formula en la lengua o biosensor electrónico específico de un felino.
En una realización de un ensayo de disolución, los métodos pueden comprender las etapas de poner en contacto un receptor TAS2R definido en las reivindicaciones 1 -3 con uno o más compuestos de ensayo e identificar los compuestos que se unen al receptor TAS2R. La identificación de los compuestos que se unen al receptor TAS2R se puede lograr aislando el complejo de polipéptido TAS2R/pareja de unión, y separando el compuesto pareja de unión del polipéptido TAS2R. En un aspecto, el complejo de polipéptido TAS2R/pareja de unión se aísla usando un anticuerpo inmunoespecífico o bien para el receptor TAS2R o el compuesto de ensayo. Incluso en otras realizaciones, el receptor TAS2R o el compuesto de ensayo comprende una etiqueta o marca que facilita su aislamiento, y métodos para identificar los compuestos que son parejas de unión incluyen la etapa de aislar el complejo de polipéptido TAS2R/pareja de unión a través de la interacción con la etiqueta o marca.
En una variación de un ensayo in vitro, el método comprende las etapas de poner en contacto un receptor TAS2R inmovilizado con un compuesto de ensayo y detectar la unión del compuesto de ensayo al receptor TAS2R. En una realización alternativa, el compuesto de ensayo se inmoviliza y se detecta la unión del receptor TAS2R. La inmovilización se logra usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluido el enlace a un soporte, una esfera o una resina cromatográfica, además de interacciones no covalentes de gran afinidad, como unión a anticuerpos, o uso de unión de estreptavidina/biotina en donde el compuesto inmovilizado incluye un resto biotina. El soporte se puede formular, por ejemplo, en una lengua o biosensor electrónico específico de un felino.
Se describe que los ensayos basados en células se usan para identificar compuestos que son parejas de unión de un receptor TAS2R. En una realización, el método comprende las etapas de poner en contacto un receptor TAS2R expresado en la superficie de una célula con un compuesto de ensayo y detectar la unión del compuesto de ensayo al receptor TAS2R. En algunas realizaciones, la detección comprende detectar un evento fisiológico en la célula causado por la unión de la molécula.
Se describe que se emplea selección de alto rendimiento (HTS) para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a un receptor TAS2R. En síntesis, se sintetizan grandes compuestos de ensayo distintos en un sustrato sólido. Los compuestos de ensayo se ponen en contacto con un receptor TAS2R y se lavan. El receptor TAS2R unido luego se detecta por métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos purificados de la invención pueden también recubrirse directamente en placas para uso en las técnicas de evaluación de fármacos anteriormente mencionadas. Además, los anticuerpos no neutralizantes se pueden usar para capturar la proteína e inmovilizarla sobre el soporte sólido.
En general, el receptor TAS2R expresado se puede usar para ensayos de unión HTS junto con un ligando, tal como un aminoácido o carbohidrato. El ligando identificado se etiqueta con un radioisotopo adecuado, incluidos 121I, 3H, 35S o 32P, por métodos conocidos por el experto en la técnica. Alternativamente, los ligandos se pueden etiquetar por métodos conocidos con un derivado fluorescente adecuado (Baindur et al., Drug Dev. Res., 1994, 33, 373-398; Rogers, Drug Discovery Today, 1997,2, 156-160). El ligando radiactivo específicamente unido al receptor en las preparaciones de membranas elaborado a partir de la línea celular que expresa la proteína recombinante se puede detectar en ensayos HTS en una de varias formas convencionales, incluida la filtración del complejo receptor-ligando para separar el ligando unido del ligando no unido. Los métodos alternativos incluyen un ensayo de proximidad de centelleo (SPA) o un formato FlashPlate en el que dicha separación es innecesaria. La unión de ligandos fluorescentes se puede detectar de diversas formas, incluida la transferencia de energía de fluorescencia (FRET), análisis espectrofotofluorométrico directo de ligando unido o polarización con fluorescencia.
Se describe que o bien el receptor TAS2R o el compuesto de ensayo comprende una etiqueta o una marca que facilita su aislamiento, y los métodos para identificar compuestos de ensayo incluyen una etapa de aislar el complejo de polipéptido TAS2R/compuesto de ensayo a través de la interacción con la etiqueta o marca. Una marca ilustrativa de este tipo es una secuencia de poli-histidina, en general aproximadamente seis residuos histidina, que permite el aislamiento de un compuesto así etiquetado usando quelación con níquel. Otras etiquetas y marcas, como la etiqueta FLAG (Eastman Kodak, Rochester, NY), se conocen y utilizan habitualmente en la técnica.
La detección de la unión se puede lograr usando una etiqueta radiactiva en el compuesto no inmovilizado, usando una etiqueta fluorescente en el compuesto no inmovilizado, usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, usando una etiqueta en el compuesto no inmovilizado que excita un soporte fluorescente al que se une el compuesto inmovilizado, además de otras técnicas conocidas y que se ponen en práctica habitualmente en la técnica.
Se pueden usar otros ensayos para identificar ligandos específicos de un receptor TAS2R, incluidos ensayos que identifican ligandos de la proteína diana a través de medir la unión directa de ligandos de ensayo a la diana, además de ensayos que identifican ligandos de proteínas diana a través de ultrafiltración de afinidad con métodos de espectroscopia de masas por pulverización HPLC u otros métodos físicos y analíticos. Alternativamente, dichas interacciones de unión se evalúan indirectamente usando el sistema de dos híbridos de levadura, un ensayo genético para detectar interacciones entre dos proteínas o polipéptidos.
En cualquiera de los métodos descritos en este documento, para que sea considerado un ligando del polipéptido del receptor TAS2R, el compuesto de ensayo debe alterar la interacción medida por una cantidad suficiente para lograr una diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas en la presencia frente a la ausencia del compuesto de ensayo. La significación estadística se puede determinar mediante cualquier prueba estadística adecuada conocida en la técnica, como una prueba de la t. Por ejemplo, para que sea de significación estadística, el valor p es por lo menos 0,05, por lo menos 0,01 o por lo menos 0,001.
Se describen también métodos para identificar compuestos que modulan (es decir aumentan o reducen) la actividad del receptor TAS2R que comprenden poner en contacto un receptor TAS2R con un compuesto, y determinar si el compuesto modifica la actividad del receptor TAS2R. En otra realización, el método comprende poner en contacto un receptor TAS2R con un ligando del receptor TAS2R conocido en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo. La actividad en presencia del compuesto de ensayo se compara con la actividad en ausencia del compuesto de ensayo. Si la actividad de la muestra que contiene el compuesto de ensayo es mayor que la actividad de la muestra que carece del compuesto de ensayo, el compuesto es un agonista. De modo similar, si la actividad de la muestra que contiene el compuesto de ensayo es inferior a la actividad en la muestra que carece del compuesto de ensayo, el compuesto es un antagonista.
En una realización, la proteína TAS2R se mide expresando un gen de TAS2R en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que enlaza el receptor a una vía de transducción de señales C de fosfolipasa (véase Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)). Opcionalmente, la línea celular eucariota no expresa naturalmente los genes de TAS2R (p. ej.,. Life Technologies Cat# R700-07) y la proteína G promiscua es Ga15 (Offermanns & Simon, supra).
En una realización, un polipéptido de TAS2R se expresa en una célula eucariota como receptor quimérico con una secuencia chaperona heteróloga que facilita su maduración, dirigiéndose a través de la vía segregadora o localización de la membrana. En una realización preferida, la secuencia heteróloga es una secuencia de rodopsina, como un fragmento N-terminal de una rodopsina. Dichos receptores TAS2R quiméricos se pueden expresar en cualquier célula eucariota, como las células Life Technologies Cat# R700-07. Preferiblemente, las células comprenden una proteína G funcional, p. ej., Ga15, que es capaz de acoplar el receptor a una vía de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa Cp. La activación de dichos receptores expresados en dichas células se puede detectar usando cualquier método convencional, como detectando cambios en el calcio intracelular detectando fluorescencia dependiente del calcio FURA-2 en la célula.
En otra realización, los niveles de transcripción se pueden medir para evaluar los efectos de un compuesto de ensayo sobre la transducción de señales. Una célula hospedante que contiene una proteína TAS2R de interés se pone en contacto con un compuesto de ensayo durante un tiempo suficiente para efectuar cualquier interacción, y luego se mide el nivel de expresión génica. La cantidad de tiempo para efectuar dichas interacciones se puede determinar en forma empírica, como dejando transcurrir un curso de tiempo y midiendo el nivel de transcripción en función del tiempo. La cantidad de transcripción se puede medir usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica como adecuados. Por ejemplo, la expresión de ARNm de la proteína de interés se puede detectar usando Northern blots o se pueden identificar sus productos de polipéptidos usando inmunoensayos. Alternativamente, los ensayos basados en transcripción que usan un gen indicador se pueden usar como se describe en la patente de EE. UU. 5.436.128. Los genes indicadores pueden ser, p. ej., cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa, [beta]-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Asimismo, la proteína de interés se puede usar como un gen indicador indirecto mediante la sujeción a un segundo indicador, como proteína fluorescente verde (véase, p. ej., Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)). La cantidad de transcripción se compara luego con la cantidad de transcripción o bien en la misma célula en ausencia del compuesto de ensayo, o se puede comparar con la cantidad de transcripción en una célula prácticamente idéntica que carece de la proteína de interés. Una célula prácticamente idéntica puede derivar de las mismas células de las cuales se preparó la célula recombinante pero que no había sido modificada por introducción de ADN heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo tiene en algún modo alterada la actividad de la proteína de interés.
Se describe un método para identificar un agonista del receptor TAS2R felino que comprende poner en contacto un polipéptido del receptor Tas2R felino descrito en este documento con un compuesto de ensayo, y detectar un incremento en la actividad biológica del receptor en presencia del compuesto en relación con la actividad biológica del polipéptido en ausencia del compuesto.
Se describe un método para identificar un antagonista de un receptor Tas2R felino que comprende poner en contacto un polipéptido del receptor Tas2R felino descrito en este documento con un compuesto de ensayo; y detectar una reducción en la actividad biológica del receptor en presencia del compuesto en relación con la actividad biológica del polipéptido en ausencia del compuesto.
Las interacciones entre el receptor y la proteína G pueden también examinarse. Por ejemplo, se puede examinar la unión de la proteína G con el receptor o su liberación del receptor. Por ejemplo, en ausencia de GTP, un agonista conducirá a la formación de un complejo estrecho de una proteína G (las tres subunidades) con el receptor. Este complejo se puede detectar en una diversidad de formas, como se observó anteriormente. Dicho ensayo se puede modificar para buscar antagonistas, p. ej., añadiendo un agonista al receptor y la proteína G en ausencia de GTP, que forma un complejo estrecho, y la evaluación para antagonistas mirando la disociación del complejo del receptor y la proteína G. En presencia de GTP, la liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos subunidades de proteína G sirve como criterio de activación.
En algunos casos, las interacciones TAS2R-Gustducina se monitorean en función de la activación del receptor TAS2R. El acoplamiento dependiente del ligando de los receptores TAS2R con Gustducina se pueden usar como un marcador para identificar modificadores de cualquier miembro de la familia TAS2R.
Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de las enzimas diana, canales y otras proteínas efectoras. Los ejemplos clásicos son la activación de cGMP fosfodiesterasa por transducina en el sistema visual, adenilato ciclasa por la proteína G estimuladora, fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G análogas, y modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. También se pueden examinar secuencias en dirección 3’ como la generación de diacil glicerol e IP3 por fosfolipasa C, y a su vez, para inmovilización de calcio por IP3.
La activación del receptor típicamente inicia eventos intracelulares subsiguientes, p. ej., aumentos en los segundos mensajeros tal como IP3, que libera depósitos intracelulares de iones de calcio. La activación de algunos receptores acoplados a la proteína G estimula la formación de inositol trifosfato (IP3) a través de hidrólisis de fosfatidilinositol mediada por fosfolipasa C (Berridge & Irvine, Nature 312:315-21 (1984)). IP3 a su vez estimula la liberación de depósitos de iones de calcio intracelular. Por lo tanto, un cambio en los niveles de iones de calcio citoplásmico, o un cambio en los niveles de segundos mensajeros tal como IP3 se pueden usar para evaluar la función del receptor acoplado a la proteína G. Las células que expresan dichos receptores acoplados a la proteína G pueden exhibir aumento en los niveles de calcio citoplásmico como resultado de la contribución de ambos depósitos intracelulares y mediante la activación de los canales de calcio, en cuyo caso puede ser conveniente aunque no necesario llevar a cabo dichos ensayos en tampón libre de calcio, opcionalmente complementado con un agente quelante tal como EGTA, para distinguir la respuesta de fluorescencia que resulta de la liberación del calcio de los depósitos internos. La generación de IP3 se puede medir usando diversos kits comercialmente disponibles. Algunos kits ilustrativos para detectar la generación de IP3 usan anticuerpos específicos para IP3 que pueden detectar IP3 en un lisado celular en un ensayo western blot o ELISA; alternativamente los anticuerpos se etiquetan fluorescentemente y se detectan usando una lectora de placas.
La modulación de la actividad del receptor (transducción del gusto) se puede ensayar midiendo cambios en los niveles de Ca2+ intracelular, en donde el cambio en respuesta a la modulación de la vía de transducción de señales de TAS2R mediante la administración de una molécula se asocia con una proteína TAS2R. Los cambios en los niveles de Ca2+ opcionalmente se miden usando tintes indicadores de Ca2+ fluorescentes e imágenes fluorométricas.
Se describen ensayos para receptores acoplados a proteína G incluidas células que se cargan con tintes sensibles a iones o voltaje para indicar la actividad del receptor. Los ensayos para determinar la actividad de dichos receptores pueden también usar agonistas y antagonistas conocidos para otros receptores acoplados a la proteína G como controles positivos o negativos para evaluar la actividad de los compuestos ensayados. En ensayos para identificar compuestos moduladores (p. ej., agonistas, antagonistas, moduladores), cambios en el nivel de iones en el citoplasma o el voltaje de membrana se vigilarán usando un indicador fluorescente de voltaje de membrana sensible a iones, respectivamente. Los indicadores sensibles a iones y las sondas de voltaje que se pueden emplear son comercializados por una variedad de fuentes. Para receptores acoplados a la proteína G, las proteínas G promiscuas tales como Ga15 y Ga16 se pueden usar en el ensayo de elección. Dichas proteínas G promiscuas permiten acoplar una amplia gama de receptores.
Las proteínas GPCR activadas se convierten en sustratos para cinasas que fosforilan el extremo C-terminal del receptor (y posiblemente otros sitios también). Por tanto, los agonistas promoverán la transferencia de 32P de GTP etiquetado con gama al receptor, que se puede ensayar con un recuento de centelleos. La fosforilación del extremo C-terminal promoverá la unión de proteínas de tipo arrestina e interferirá con la unión de proteínas G. La vía de cinasa/arrestina cumple una función clave en la desensibilización de muchas proteínas GPCR. Por ejemplo, los compuestos que modulan la duración en que un receptor del gusto permanece activo serían útiles para prolongar un sabor deseado o reducir uno desagradable.
Los cambios en el flujo de iones se pueden evaluar determinados cambios en la polarización (es decir, potencial eléctrico) de la célula o membrana que expresa una proteína TAS2R. Un medio para determinar cambios en la polarización celular consiste en medir cambios en la corriente (midiendo así cambios en la polarización) con técnicas de pinza de voltaje y fijación de membranas, p. ej., el modo "sujetado a la célula", el modo de adentro hacia afuera" y el modo "célula completa". Las corrientes de la célula completa se determinan convenientemente usando metodología convencional conocida en la técnica. Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujo de iones radiomarcados y ensayos de fluorescencia que usan tintes sensibles al voltaje. En general, los compuestos que se han de ensayar están presentes en el intervalo de 1 pM a 100 mM.
Otros ensayos pueden implicar determinar la actividad de los receptores que, cuando se activan, resulta en un cambio en el nivel de nucleótidos cíclicos intracelulares, p. ej., cAMP o cGMP, activando o inhibiendo enzimas tales como adenilato ciclasa. Existen canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos, p. ej., canales celulares de fotorrceptores bastón y canales neuronales olfativos que son permeables a los cationes tras la activación mediante la unión de cAMP o cGMP (véanse, p. ej., Altenhofen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 88:9868-9872 (1991) y Dhallan et al., Nature 347:184-187 (1990)). En casos en los que la activación del receptor resulta en una disminución de los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser preferible exponer las células a agentes que incrementan los niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares, p. ej., forskolina, antes de añadir un compuesto activador del receptor a las células en el ensayo. Las células para este tipo de ensayo se pueden preparar por co-transfección de una célula hospedante con ADN que codifica un canal iónico empaquetado en el nucleótido cíclico, GPCR fosfatasa y ADN que codifica un receptor (p. ej., ciertos receptores de glutamato, receptores de acetilcolina muscarínica, receptores de dopamina, receptores de serotonina y similares), que, cuando se activa, causa un cambio en los niveles de nucleótido cíclico en el citoplasma.
Los cambios en cAMP o cGMP intracelular se pueden medir empleando inmunoensayos. El método descrito en Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995) se puede usar para determinar el nivel de cAMP. Además, el método descrito en Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol, Biol. 11:159-164 (1994) se puede usar para determinar el nivel de cGMP. Asimismo, un kit de ensayo para medir cAMP y/o cGMP se describe en la patente de EE. UU. núm. 4.115.538.
La hidrólisis de fosfatidil inositol (PI) se puede analizar de acuerdo con la patente de EE. UU. núm. 5.436.128. En síntesis, el ensayo implica etiquetar las células con 3H-mioinositol durante 48 o más. Las células etiquetadas se tratan con un compuesto de ensayo durante una hora. Las células tratadas se lisan y extraen en cloroformo-metanol-agua después de lo cual se separan los inositol fosfatos por cromatografía de intercambio iónico y se cuantifican por recuento de centelleos. Se determinan las veces de estimulación calculando la relación de recuentos por minuto (cpm) en presencia de agonista a cpm en presencia de tampón control. Asimismo, las veces de inhibición se determinan calculado la relación de cpm en presencia de antagonista a cpm en presencia de tampón control (que puede o no contener un agonista).
Los efectos de los compuestos de ensayo tras la función de los polipéptidos se pueden medir examinando cualquiera de los parámetros anteriormente descritos. Se puede usar cualquier cambio fisiológico adecuado que afecte la actividad de GPCR para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo en los polipéptidos descritos en este documento. Cuando las consecuencias funcionales se determinan usando células intactas, los animales o la conducta animal, uno puede también medir una diversidad de efectos tales como liberación de neurotransmisores, liberación de hormonas, cambios en la transcripción para ambos marcadores genéticos conocidos y no caracterizados (p. ej., Northern blots), cambios en el metabolismo celular tal como crecimiento celular o cambios en el pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares como Ca2+, IP3, cGMP o cAMP.
Las muestras o ensayos que se tratan con un compuesto de ensayo que es un agonista de TAS2R potencial se comparan con las muestras control sin el compuesto de ensayo, para examinar el grado de modulación. La activación de una proteína TAS2R se logra cuando el valor de la actividad de TAS2R relativo al control es 110%, opcionalmente 150%, 200-500% o 1000-2000%.
Las muestras o ensayos que se tratan con un agonista conocido y un compuesto de ensayo que es un antagonista de TAS2R potencial se comparan con muestras control tratadas con el agonista conocido sin el compuesto de ensayo, para examinar el grado de modulación. Las muestras control se asignan a un valor relativo de 100%. La inhibición de una proteína TAS2R se logra cuando el valor de la actividad de TAS2R relativo al control es aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%.
Los agentes que modulan la actividad o la expresión del receptor TAS2R también se pueden identificar, por ejemplo, incubando un modulador putativo con una célula que contiene un polipéptido o polinucleótido de TAS2R y determinando el efecto del modulador putativo sobre la actividad o expresión del receptor TAS2R. En una realización, para que se considere un modulador, el modulador putativo debe alterar la interacción medida por una cantidad suficiente para lograr una diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas en presencia frente a ausencia del modulador putativo. La significación estadística se puede determinar por cualquier prueba adecuada conocida en la técnica, como la prueba de la t. Por ejemplo, para que sea de significación estadística, el valor p es por lo menos 0,05, por lo menos 0,01 o por lo menos 0,001. La selectividad de un compuesto que modula la actividad del receptor TAS2R se puede evaluar comparando sus efectos sobre el receptor TAS2R con su efecto sobre otros receptores TAS2R. Los moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos y otras proteínas, péptidos o moléculas orgánicas que se unen específicamente a un polipéptido de TAS2R o a un ácido nucleico que codifica el receptor TAS2R. Los compuestos identificados como moduladores de la actividad del receptor TAS2R pueden además ensayarse en otros ensayos que incluyen modelos in vivo, con el fin de confirmar o cuantificar su actividad.
Los polinucleótidos y polipéptidos de TAS2R, y sus homólogos, son herramientas útiles para identificar células que expresan los receptores del gusto, para percepción del sabor y para examinar la transducción del gusto. Los reactivos específicos de miembros de la familia TAS2R que se hibridan específicamente a ácidos nucleicos de TAS2R, como sondas y cebadores de TAS2R, y reactivos específicos de TAS2R que se unen específicamente a una proteína TAS2R, p. ej., los anticuerpos de TAS2R, se utilizan para examinar la expresión de células del gusto y la regulación de la transducción del gusto. Por ejemplo, un anticuerpo de TAS2R se puede usar para identificar y/o aislar células del sabor felinas que expresan el TAS2R particular de una población de células felinas mixta. Por ejemplo, las sondas de polinucleótidos descritas en este documento se pueden usar en estudios de distribución de tejido y ensayos diagnósticos.
También se proveen kits para evaluar moduladores de los miembros de la familia de TAS2R. Dichos kits se pueden preparar con cualquier material y reactivo fácilmente disponible. Por ejemplo, dichos kits pueden comprender uno cualquiera de los siguientes materiales: ácidos nucleicos o proteínas TAS2R, tubos de reacción e instrucción para ensayar la actividad de TAS2R. Opcionalmente, el kit contiene un receptor de TAS2R biológicamente activo. Se puede preparar una amplia variedad de kits y componentes, dependiendo del usuario final del kit y de las necesidades particulares del usuario.
También se describen los anticuerpos a los receptores de fTAS2R y los polipéptidos quiméricos.
Para preparar anticuerpos anti-fTAS2R monoclonales o policlonales, se puede emplear cualquier técnica conocida. Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE. UU. núm. 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos a los polipéptidos descritos en este documento. Además, los ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, se puede usar tecnología de exhibición de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados. En una realización, secuencias de ADN aisladas que codifican un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión se obtienen detectando una biblioteca de ADN de células B humanas de acuerdo con el protocolo general señalado por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989).
Los sueros de anticuerpos monoclonales y policlonales se pueden recoger y titular contra el inmunógeno de proteína en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Típicamente, los antisueros policlonales con una titulación de 104 o más se seleccionan y ensayan para su reactividad cruzada contra proteínas no TAS2R, o incluso otros miembros de la familia TAS2R u otras proteínas relacionadas de otros organismos, usando un inmunoensayo de unión competitiva. Los antisueros policlonales específicos y anticuerpos monoclonales usualmente se unirán con Kd de por lo menos aproximadamente 0,1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente 1 pM, específicamente por lo menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, y más específicamente 0,01 pM o mejor.
Los inmunoensayos también se pueden usar para detectar, cualitativa o cuantitativamente, un fTAS2R, p. ej., para identificar células receptoras del gusto, especialmente células receptoras del sabor amargo, y variantes de miembros de la familia TAS2R.
Los anticuerpos anti-fTAS2R también se pueden utilizar para aislar células gustativas felinas de una población mixta de células obtenidas de un felino. En una realización, el aislamiento de células gustativas felinas unidas al anticuerpo anti-fTAS2R se puede obtener por citometría de flujo. También se pueden emplear otros métodos conocidos en la técnica.
Como se conoce en el campo, la conducta del gusto se puede determinar en un ensayo de tiempo corto que mide directamente las preferencias del gusto contando las respuestas de lamedura de un animal, p. ej., un ratón, usando un gustómetro de múltiples canales (p. ej., el gustómetro Davis MS160-Mouse, DiLog instruments, Tallahassee, FL). La tasa media a la que un ratón lamerá una sustancia que estimula el sentido del gusto en relación a su muestreo de un control apropiado (relación definida como la tasa de lamedura en relación al control) indica si el estímulo es apetitivo, neutro o aversivo. A su vez, el cambio en la ingesta de estímulos sabrosos se puede evaluar en presencia de estímulos de prueba para determinar la potenciación o supresión del estímulo sabroso.
Se puede entrenar a los animales para que discriminen estímulos cualitativamente distintos usando métodos de prueba conocidos en la técnica. Estos animales pueden luego utilizarse para determinar similitud cualitativa entre dos estímulos, más allá de la palatabilidad o preferencia.
Para determinar si los receptores fTAS2R activan áreas del cerebro que se describe están implicadas en respuestas del gusto apetitivas o aversivas, se pueden conectar electrodos a estas áreas del cerebro y ensayar a los animales despiertos o anestesiados.
Alternativamente, se pueden emplear otros métodos no invasivos para vigilar la actividad neuronal, como tomografía por emisión de positrones (PET) o electroencefalografía para vigilar la actividad neuronal asociada con respuestas del gusto apetitivas o aversivas. Dichos métodos pueden también utilizarse para evaluar el impacto de diversos factores como la edad, experiencia o estado nutricional sobre la actividad neuronal producida por los estímulos identificados en los experimentos basados en células a fin de modificar la función de los receptores.
Se describen también kits que comprenden por lo menos una composición, polipéptido o ácido nucleico descritos en este documento, opcionalmente contenidos en un solo envase. Los kits pueden opcionalmente incluir, p. ej., instrucciones de uso de los componentes del kit para detectar un receptor fTAS2R o un polinucleótido que codifica un receptor fTAS2R, o compuestos que alteran la actividad de un receptor TAS2R.
El kit puede comprender por lo menos un anticuerpo anti-TAS2R descrito en este documento y reactivos para detectar un complejo entre el anticuerpo y el antígeno de TAS2R. Por ejemplo, el kit puede incluir un tampón que permite la reacción de unión entre el anticuerpo y el antígeno de TAS2R en una muestra biológica, o componentes para producir el tampón.
La actividad de los polipéptidos de TAS2R se puede evaluar usando una diversidad de ensayos in vitro e in vivo para determinar los efectos funcionales, químicos y físicos, p. ej., medir la unión al ligando (p. ej., unión al ligando radiactivo), segundos mensajeros (p. ej., cAMP, cGMP, IP3, DAG o Ca2+), flujo iónico, niveles de fosforilación, niveles de transcripción, niveles de neurotransmisores y similares. Asimismo, dichos ensayos se pueden utilizar para ensayar inhibidores y activadores de miembros de la familia TAS2R. Dichos moduladores de la actividad de transducción del gusto son útiles para personalizar la percepción del gusto, por ejemplo para modificar la detección de sabores amargos.
La proteína TAS2R del ensayo típicamente se seleccionará de un polipéptido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SeQ ID NO:26; una variante modificada en forma conservadora de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26; o una secuencia que es por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26. En una realización, el polipéptido tiene una secuencia de la SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:22.
Se describe que el polipéptido de los ensayos comprenderá un dominio de una proteína TAS2R, como un dominio extracelular, región transmembrana, dominio transmembrana, dominio citoplásmico, dominio de unión al ligando, dominio de asociación de subunidades, sitio activo y similares. O bien la proteína TAS2R o su dominio se pueden enlazar covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica utilizada en los ensayos descritos en este documento. En una realización, el polipéptido tiene un dominio de SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:22.
Los moduladores de la actividad de un receptor TAS2R se ensayan usando polipéptidos de TAS2R como se describió anteriormente, o bien recombinantes o naturales. La proteína se puede aislar, expresar en una célula, expresar en una membrana derivada de una célula, expresada en tejido o en un animal, o bien recombinante o natural. Por ejemplo, se pueden utilizar secciones o células disociadas de un tejido que expresa TAS2R, células transformadas o membranas. También se pueden preparar ensayos usando polipéptidos de TAS2R en sistemas de membranas artificiales / sintéticas. La modulación se ensaya usando cualquiera de los ensayos in vitro o in vivo descritos en este documento. La transducción del gusto puede también examinarse in vitro con reacciones de estado soluble o sólido, usando un TAS2R-GPCR de longitud total o una molécula quimérica tal como un dominio extracelular o una región transmembrana, o una combinación de estos, de un receptor TAS2R covalentemente enlazado a un dominio de transducción de señales heterólogas, o un dominio extracelular heterólogo y/o región transmembrana covalentemente enlazada al dominio transmembrana y/o citoplásmico de un receptor TAS2R. Asimismo, los dominios de unión al ligando de la proteína de interés se pueden usar in vitro en reacciones en estado soluble o sólido para ensayar la unión al ligando. En diversas realizaciones, se formulará un receptor quimérico que comprende todo o parte de un polipéptido TAS2R además de una secuencia adicional que facilita la localización del TAS2R a la membrana, como rodopsina, p. ej., un fragmento N-terminal de una proteína de rodopsina.
Los compuestos ensayados como moduladores o ligandos de un miembro de la familia TAS2R pueden ser cualquier compuesto, incluidas moléculas pequeñas, o moléculas más complejas como moléculas biológicas, por ejemplo, una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Alternativamente, los moduladores pueden ser versiones genéticamente modificadas de un gen de TAS2R. Se puede usar esencialmente cualquier compuesto químico como modulador potencial o ligando en los ensayos y métodos descritos en este documento. En determinadas realizaciones útiles, los compuestos se pueden disolver en disoluciones acuosas u orgánicas (por ejemplo, disoluciones DMSO). Los ensayos están diseñados para detectar bibliotecas de compuestos químicos, incluidas bibliotecas grandes, automatizando las etapas del ensayo y proporcionando compuestos provenientes de cualquier fuente conveniente para los ensayos, que se realizan en paralelo (p. ej., en formatos de microtitulación en placas de microtitulación en ensayos robóticos).
El conocimiento de la estructura de dos o más agonistas para un solo receptor permite que el experto en la técnica diseñe racionalmente otras bibliotecas de compuestos para detectar la interacción con el receptor. El modelado por ordenador de dichos compuestos también se facilita. La detección de las bibliotecas de compuestos permite el desarrollo de composiciones para suprimir o eliminar componentes del sabor amargo en alimentos particulares, nutrientes y suplementos dietarios para animales, y en preparaciones farmacéuticas u homeopáticas que contienen dichas sustancias fitoquímicas. De manera alternativa, la detección posibilita la identificación de agonistas estructuralmente relacionados para potenciar la respuesta amarga en la producción de supresores del apetito, repelentes animales y similares.
Se describen en este documento composiciones saporíferas, composiciones comestibles y métodos para fabricar las composiciones comestibles y las composiciones saporíferas descritas en la presente memoria.
Una composición saporífera es una composición que se puede añadir a una composición comestible para un animal a fin de mejorar la aceptación de la composición comestible para consumo por parte del animal. Los ejemplos de las composiciones comestibles incluyen alimentos, dulces, suplementos nutricionales, productos farmacéuticos, material para el cuidado oral como productos dentales, productos masticables, productos bebibles y similares. La composición comestible puede estar en la forma de un comprimido, cápsula, película comestible, alimento húmedo, dulce o pienso.
En un aspecto, una composición saporífera comprende un compuesto que es un agonista, antagonista o modulador de un receptor TAS2R felino. En una realización; la composición saporífera comprende un potenciador de la palatabilidad; opcionalmente un compuesto adhesivo para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible; y opcionalmente un compuesto para aportar color o aroma para un ser humano, en donde la composición saporífera es una formulación sólida, líquida, en polvo, pasta, gel o untable. En una realización, la composición saporífera es una composición de recubrimiento y comprende además el compuesto adhesivo. La alteración o enmascaramiento del amargor percibido de una composición comestible se puede ensayar usando cualquiera de los ensayos conductuales de palatabilidad descritos en este documento, como una comparación convencional de dos platos.
"Composición alimentaria basal", tal como se emplea en este documento, se refiere a un alimento animal combinable con la composición saporífera. En una realización, el alimento animal se formula para felinos e incluye alimento deshidratado, alimento enlatado, alimento semi-deshidratado, dulces comestibles y similares, y combinaciones que comprenden uno o más de los alimentos anteriormente mencionados. Se pueden emplear varios tamaños y formas de la composición alimentaria basal siempre y cuando el alimento sea aceptablemente consumible por un receptor (como un animal, particularmente un felino) en una cantidad como para que el animal reciba una ración diaria normal que proporcione los nutrientes esenciales conocidos. Una composición alimentaria basal puede no estar recubierta, o puede estar recubierta, por ejemplo, con un recubrimiento que comprenda lípidos. Si se desea, la alimentación se puede llevar a cabo alimentando al animal una o más veces por día.
Se describe que la composición saporífera se combina con una composición comestible, por ejemplo, una composición basal (p. ej., para un felino), en una cantidad eficaz para impartir mayor palatabilidad de la composición comestible al animal. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las cantidades eficaces de dichas composiciones saporíferas sin experimentación indebida, particularmente en vista de la guía general provista a continuación.
La composición saporífera se puede combinar con una composición alimentaria basal en un modo tal que la composición saporífera se incorpore a la composición alimentaria basal. Por incorporada se entiende que la composición saporífera está íntimamente asociada con la composición comestible y prácticamente no se disocian, por ejemplo, durante las condiciones de almacenamiento normales. En una realización, la composición saporífera se dispersa prácticamente en forma uniforme por la composición comestible. En otras realizaciones, la distribución de la composición saporífera puede intencionalmente no ser uniforme. En dichas realizaciones, la composición saporífera puede proporcionar pequeños trozos o porciones que se mezclen con el alimento basal. En diversas realizaciones, la composición saporífera se puede depositar en la composición comestible en una cantidad eficaz para proporcionar aproximadamente 0,5 % en peso a aproximadamente 3 % en peso, específicamente aproximadamente 0,8 % en peso a aproximadamente 2,5 % en peso, y más específicamente aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 2 % en peso del peso seco de la composición comestible.
La composición saporífera se deposita en la superficie de la composición comestible, por ejemplo en la forma de un recubrimiento. Recubrir la composición comestible incluye la deposición tópica de la composición saporífera en la superficie de la composición comestible, como pulverizando, espolvoreando y similar. El recubrimiento que comprende la composición saporífera puede comprender una o más grasas para ayudar a adherir la composición saporífera a la superficie. Puede asimismo o alternativamente comprender otros componentes útiles para facilitar la adhesión de la composición saporífera a la superficie de la composición comestible. Es posible, aunque no necesario, que la composición saporífera se recubra en la composición comestible de manera uniforme, o que se obtenga la distribución uniforme de la composición saporífera, por ejemplo, volteando repetidamente el alimento recubierto. Se pueden aplicar uno o más recubrimientos. La composición saporífera se puede depositar en la superficie de la composición comestible en una cantidad eficaz para proporcionar aproximadamente 0,5 % en peso a aproximadamente 3 % en peso, específicamente aproximadamente 0,8 % en peso a aproximadamente 2,5 % en peso, y más específicamente aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 2 % en peso del peso seco de la composición de alimento animal basal.
La composición saporífera puede estar tanto dispersada como recubierta en la composición comestible, tal como una composición para alimento animal deshidratada. En una realización, el producto para alimento animal terminado se envasa para la venta y en última instancia se administra al animal. En otras realizaciones, la composición saporífera se puede envasar para combinación con un alimento antes de servir. En algunas realizaciones, el animal es un felino.
La composición saporífera puede además comprender un potenciador de la palatabilidad adicional tal como un saborizante. Los saborizantes adecuados incluyen, por ejemplo, un saborizante vegetal, un saborizante de carne (p. ej., saborizante de hígado), un saborizante de queso, levadura, pirofosfato sódico, una grasa, un fosfato ácido, una sal de fosfato y/u otros ingredientes saborizantes o de alimentos utilizados por la industria de saborizantes para mejorar la palatabilidad. Los saborizantes de carne adecuados incluyen, por ejemplo, saborizantes derivados de la carne (p. ej., saborizantes de carne vacuna, cerdo, tocino, cordero, jamón, pescado, pollo, pavo y/u otras aves).
La palatabilidad o aceptación de un alimento hace referencia al deseo total de un animal, como un felino, de comer un alimento determinado. El desarrollo de saborizantes y potenciadores de la palatabilidad preferidos para animales como mascotas es subjetivo. Los saborizantes que funcionan para seres humanos no siempre lo hacen con felinos. De manera similar, un saborizante que es eficaz con una especie animal puede no funcionar tan bien con una especie animal distinta. El experto en la técnica apreciará las pruebas de palatabilidad utilizadas habitualmente para determinar preferencias para animales con respecto a alimentos y saborizantes. Para los fines de la presente invención, dichas pruebas de palatabilidad serán eficaces y fáciles de implementar para ensayar preferencias de saporíferos para cualquier animal, incluidos felinos. Los métodos tradicionales para desarrollar composiciones saporíferas para incrementar la palatabilidad emplean una diversidad de saborizantes candidatos seleccionados en forma empírica, en base al conocimiento de cómo estos ingredientes son percibidos por los seres humanos, y se utiliza un planteamiento de "ensayo y error" para ensayar empíricamente cada candidato en relación a un producto diana conocido o para identificar más los mejoradores de la palatabilidad preferidos. Los polipéptidos del receptor TAS2R felino descritos permiten el diseño intencional de potenciadores de la palatabilidad basados en receptores del gusto para las especies diana, y mejoran y acortan sustancialmente el proceso de desarrollo de mejoradores de la palatabilidad.
La composición saporífera puede ser un mejorador de la palatabilidad para un alimento felino, y la composición saporífera exhibe mejor palatabilidad para el felino en comparación con el alimento felino sin la composición saporífera, según lo medido por el mejor consumo del alimento felino que comprende el mejorador de palatabilidad en comparación con el alimento animal en ausencia del mejorador de palatabilidad.
La composición saporífera se puede usar como un saborizante líquido o bien en forma concentrada o no concentrada. Si la composición saporífera va a ser una composición saporífera seca, la composición saporífera se puede secar en una secadora adecuada tal como, por ejemplo, una secadora por pulverización o una estufa. La composición saporífera puede comprender una variedad de otros componentes útiles, por ejemplo, maltodextrano, goma o una combinación que puede ser útil para aportar a la composición una o más funcionalidades preferidas tales como la capacidad de unirse a un alimento o de retener una textura, viscosidad, fluidez, color o aroma deseado, o similares. El científico en alimentos experimentado entenderá fácilmente dichos componentes y sus usos.
Las pruebas de palatabilidad se pueden realizar mediante una comparación convencional de dos platos. En este ensayo, se le presentan dos platos de alimento a cada animal, en donde cada uno contiene una cantidad medida de una ración control o una ración de prueba. Las raciones control y de prueba contienen las mismas composiciones basales. Se deja que el animal seleccione el alimento que prefiere. Se mide la cantidad de alimento ingerida de cada plato. Una comparación directa de la cantidad ingerida de las dos raciones proporciona una indicación fiable de la palatabilidad relativa.
Por ejemplo, se le pueden ofrecer dos platos a un felino con cantidades iguales de alimento, uno que contenga la composición saporífera a ensayar y el otro sin la composición saporífera. La cantidad de alimento en los dos platos se pesa antes de dárselos al felino. Durante los ensayos, se deben tomar medidas para asegurar que el felino no finalice un plato y siga con el siguiente porque todavía está hambriento. Esto se puede lograr, por ejemplo, limitando el tiempo del felino con los dos platos o proporcionando alimento suficiente para satisfacer por completo al felino.
Al final del ensayo, se pesan los dos platos nuevamente para determinar la cantidad de alimento ingerido de cada plato. Si se ingiere más alimento del plato con la composición saporífera de ensayo (plato A), la relación de la ingesta se registra como valor positivo para indicar que la composición saporífera tuvo un efecto positivo en la preferencia del animal. Si se ingiere más alimento del plato con el alimento control (plato B), la relación se registra como valor negativo para indicar que la composición saporífera no se desempeñó tan bien como el alimento control.
Por ejemplo, las composiciones saporíferas se aplican a una composición alimentaria basal seca, y se alimentan múltiples felinos, p. ej., diez, durante un periodo de tiempo (p. ej., dos días). La posición del plato se cambia diariamente para eliminar sesgo si los animales exhiben una preferencia por la disposición derecha o izquierda de los platos. La preferencia de cada animal por cada plato se puede calcular como una relación de ingesta (IR) para ese animal particular, por ejemplo la IR para el animal 1 = (gramos consumidos del plato A)/(gramos totales consumidos del plato A plato B). La preferencia promedio se calcula como el valor promedio de cada día por la duración del periodo de ensayo. Por lo tanto, un valor IR cercano a 0,5 indica una preferencia equivalente. Los valores IR superiores a 0,5 y típicamente encima de 0,55 indican preferencia. El grado de estimación de la preferencia basado en puntuaciones de IR se puede determinar con el número de animales utilizados y el análisis estadístico de los datos.
Se describe un método para preparar la composición saporífera para recubrimiento o para incorporar una composición comestible que se ha de administrar a un animal.
El método comprende mezclar un agonista, un antagonista o un modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino; opcionalmente un potenciador de la palatabilidad; opcionalmente un compuesto para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible; y opcionalmente un compuesto para proporcionar color o aroma con un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en productos de carne, derivados de carne, productos de pescado, derivados de pescado, lácteos, derivados de lácteos, fuentes de proteínas microbianas, proteínas vegetales, carbohidratos y aminoácidos para obtener una composición saporífera, en donde la composición saporífera es una formulación líquida, sólida, en polvo, pasta, gel, untable, en gránulos o pulverizable. En una realización, un agonista o un antagonista del polipéptido del receptor TAS2R felino se mezcla en la composición. En una realización, el agonista es denatonio, aloína o PTC, y el antagonista es probenecid.
Para formular una composición saporífera líquida, por ejemplo, se combinan ingredientes líquidos comerciales en una mezcladora con un agonista, un antagonista o un modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino. Se trituran o emulsionan los ingredientes húmedos hasta una suspensión y se combinan con los ingredientes líquidos. Se puede añadir una proteasa comercialmente disponible a la suspensión para hidrolizar las proteínas, y luego se inactiva con calor, ácido u otro método. Se pueden añadir también conservantes tales como ácido sórbico. Se añade agua para ajustar la viscosidad y el contenido de sólido de la suspensión para facilitar la aplicación de pulverización.
Se puede preparar una formulación seca de la composición saporífera combinando ingredientes secos disponibles comercialmente, incluidos aminoácidos, sales inorgánicas y materiales orgánicos con un agonista, un antagonista o un modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino en las proporciones deseadas en una mezcladora de lotes y mezclando hasta homogeneidad antes de secar.
De acuerdo con otra formulación seca, se combinan ingredientes húmedos y secos mezclando los ingredientes húmedos con todos o algunos de los ingredientes secos en una mezcladora hasta que se forma una mezcla homogénea. La mezcla se seca por evaporación o liofilización, por ejemplo, para formar un producto seco o en polvo que luego se mezcla con cualquier ingrediente seco remanente en un tambor hasta formar una mezcla homogénea.
Se describen métodos para preparar una composición comestible para un animal.
En una realización, el método comprende poner en contacto una composición comestible o su componente con un polipéptido del receptor fTAS2R descrito en este documento por un periodo de tiempo suficiente para reducir la cantidad de un compuesto amargo de la composición comestible o su componente. Un experto en la técnica puede determinar el tiempo para reducir la cantidad del compuesto amargo. El contacto puede ocurrir en un proceso continuo, semi-continuo o por lotes. En una realización, la composición comestible es para un felino.
El método comprende añadir un compuesto a una composición comestible para reducir la palatabilidad de la composición comestible a un animal, en donde el compuesto es un agonista o un modulador positivo de un receptor del sabor amargo felino. En una realización, la palatabilidad se reduce hasta un grado en que el felino consume 10 a 30% menos de la composición comestible con el compuesto añadido que la composición comestible sin el compuesto añadido. En una realización, la reducción de la palatabilidad se mide como la reducción en las calorías de la composición comestible consumida, el peso de la composición comestible consumida o el volumen de la composición comestible consumida.
Se describe un método para formular una composición comestible con mejor palatabilidad para un animal.
El método comprende determinar la presencia de un compuesto que es un agonista, antagonista o modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino en una composición comestible; y potenciar la palatabilidad de la composición comestible si el compuesto es un agonista o un modulador positivo, aumentar la cantidad de un agonista del receptor en la composición comestible o reducir la cantidad del compuesto en la composición comestible, o si el compuesto es un antagonista o un modulador negativo, aumentar la cantidad del compuesto en la composición comestible. La cantidad del compuesto se puede aumentar aplicando una composición saporífera que comprende el compuesto a la composición comestible de modo tal que la composición comestible se incorpore o recubra al menos parcialmente la composición comestible.
Se describen también métodos para administrar un compuesto amargo a un animal (p. ej., un felino) que lo necesita. El experto en la materia apreciará que en algunos casos un ser humano o animal puede necesitar un compuesto amargo (p. ej., una composición farmacéutica, un nutriente o similar) y que puede ser problemático administrar el compuesto al animal.
El método puede comprender administrar una composición comestible felina a un felino, en donde la composición comestible comprende un compuesto amargo felino y un compuesto que altera el amargor percibido de la composición comestible, enmascara el compuesto amargo en la composición comestible, o actúa como agonista, antagonista o modulador de un receptor TAS2R felino en el felino para alterar la percepción del sabor amargo por parte del felino. En una realización, el compuesto amargo comprende un producto terapéutico, un suplemento nutricional o un producto para el cuidado oral. Un suplemento nutricional se refiere a un suplemento destinado a proporcionar nutrientes que de otra forma no serían consumidos en cantidades suficientes e incluye vitaminas, minerales, fibra, probióticos, ácidos grasos y aminoácidos. Un producto terapéutico o farmacéutico se refiere a un compuesto, elemento o mezcla que cuando se administra a un sujeto, solo o combinado con otro compuesto, elemento o mezcla, confiere, directa o indirectamente, un efecto fisiológico en el sujeto. Un producto para el cuidado oral se refiere a un producto utilizado para promover dientes y encías sanos, refrescar el aliento o prevenir o tratar enfermedades bucales.
Se describen además métodos para fabricar composiciones comestibles felinas.
En una realización, el método comprende poner en contacto una composición de alimento felino o un componente de esta con un polipéptido del receptor TAS2R de la presente invención por un periodo de tiempo suficiente para eliminar el compuesto amargo del producto o componente alimentario. En una realización, el receptor TAS2R se une a un soporte sólido que se pueda separar de la composición alimentaria. En una realización, el contacto es una operación continua. En una realización, la composición alimentaria se pone en contacto con una pluralidad de polipéptidos del receptor TAS2R.
El método puede comprender determinar la presencia de uno o más compuestos amargos en una composición comestible; determinar un perfil de amargor de la composición comestible en base a uno o más compuestos amargos que se determina que están presentes; y añadir un compuesto o eliminar un compuesto de la composición comestible para potenciar la palatabilidad de la composición comestible, en donde el compuesto altera el perfil de amargor de la composición comestible, enmascara uno o más de los compuestos amargos presentes en la composición comestible o actúa como agonista, antagonista o modulador de un receptor del sabor amargo felino. En una realización, añadir el compuesto a la composición comestible comprende aplicar una disolución de recubrimiento a la composición comestible que comprende el compuesto, tal como un recubrimiento que rodea por lo menos parcialmente la composición comestible felina. En una realización, la composición comestible es un alimento basal, una composición saporífera, un dulce, un producto terapéutico o un suplemento nutricional. La presencia de un compuesto amargo en una composición comestible se puede determinar por un método descrito en este documento, o por cualquier otro método conocido en la técnica. Un perfil de amargor de una composición comestible se refiere a una enumeración de compuestos amargos que se determina que están presentes en la composición comestible, y opcionalmente también incluye la cantidad de un compuesto amargo determinado en la composición comestible. En una realización, la composición comestible es para un felino.
Se describen también composiciones repelentes. En una realización, la composición repelente puede comprender un agonista del receptor TAS2R felino o un modulador positivo en una cantidad suficiente para producir rechazo, por ejemplo por lo menos 0,05% a aproximadamente 30% en peso, y opcionalmente sustancias aromáticas o perfumes como aceite de romero, aceite de menta, aceite de canela, limoneno o eugenol, y uno o más ingredientes inertes tales como diluyentes líquidos, vehículos, espesantes, agentes activos de superficie, conservantes, compuestos aromáticos, desodorizantes, antibacterianos, antifúngicos, antimicrobianos, biocidas, y uno o más de varios tipos de adyuvantes incluidos, entre otros, humectantes, dispersantes, adherentes, retardantes de espuma, tampones y acidificantes. Los diluyentes líquidos adecuados incluyen agua, destilados de petróleo u otros vehículos líquidos con o sin agentes activos de superficie. Los ejemplos de vehículos incluyen bentonita, tierra de Fuller, arcillas adicionales, talco, tiza, cuarzo, atapulgita, montmorilonita o tierra diatomácea, vermiculita, ácido silícico altamente dispersado, alúmina y silicatos, calcita, mármol, piedra pómez, sepiolita y dolomita, metales inorgánicos y orgánicos, aserrín, cáscara de coco, mazorca de maíz y tabaco. En una realización, la composición repelente comprende además un gas propulsor para dispensar un aerosol, como Figen 11/12 o propano/butano, p. ej., en una relación de 15:85. En una realización, el agonista de fTAS2R es denatonio, aloína o PTC.
Otras realizaciones de la presente invención se describen en los siguientes Ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Determinación del receptor del gen y de las secuencias de polipéptidos del sabor amargo felino (TAS2R)
En este ejemplo, se identificaron genes de TAS2R felino, consultando la base de datos de cóntigos de secuenciación shotgun del genoma completo Felis catus de NCBI con secuencias de genes del receptor amargo humano. Las secuencias de genes humanos utilizadas se identifican con las ID de genes de NCBI en la Tabla 2.
Tabla 2. ID de genes de NCBI para todos los genes funcionales y pseudogenes de hTAS2R utilizados para identificar genes amargos felinos
Genes funcionales
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Se descargaron cóntigos individuales entre los hits para identificación manual de los codones de inicio (ATG) y finalización (TAA, TGA, o TAG) y para determinar si el gen es probablemente de longitud total. Una vez que se obtuvieron las secuencias de ambos ensamblajes felinos, se compararon.
Se identificaron los genes funcionales pronosticados en base a un conjunto de reglas seleccionadas para incluir una proteína que tiene aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, el sitio de inicio y el sitio de finalización se encuentran en ubicaciones similares que la proteína humana cuando se alinean las secuencias Blast, luego la secuencia se comparó con la secuencia del gen amargo canino ortólogo para verificar que la similitud fuese razonable. La Tabla 3 identifica las secuencias de genes amargos caninos utilizados.
Tabla 3. ID de genes NCBI para todos los genes y pseudogenes funcionales TAS2Rs utilizados
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10
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La siguiente Tabla 4 resume los genes felinos de longitud total identificados. El % de similitud de la proteína entre el gen felino y el homólogo humano más próximo se presenta en la tabla.
Tabla 4. Genes del receptor amargo felino de longitud total identificados
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La clonación de cada uno de los genes amargos felinos para confirmar la secuencia de ADN se efectuó después de ampliar el gen deseado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el ADN genómico de un solo gato. Se diseñaron cebadores potenciales para ampliar cada gen felino usando un software comercial. Se seleccionaron conjuntos de cebadores entre aquellos diseñados basados en la temperatura de anelación pronosticada, fidelidad, potencial de dimerización y cebado defectuoso, y localización de la secuencia deseada con el fin de ampliar la secuencia de genes felinos y determinar la secuencia de ADN del ADN genómico felino aislado. Se usaron pares de cebadores para ampliar cada gen y se exponen en la Tabla 5.
Tabla 5. Cebadores para ampliación genómica
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El proceso de ampliación y clonación de un gen representativo, TAS2R38, se describe sintéticamente. La secuencia de fTAS2R38 se amplió mediante PCR usando Easy A High Fidelity PCR Cloning Enzyme (Agilent, Santa Clara CA), cebadores habituales y ADN genómico como molde.
El producto PCR resultante se ligó al vector pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison WI). Se transformaron células bacterianas DH5-a (Life Technologies; Carlsbad, CA) con el vector. Se purificó plásmido de cultivos de las células DH5-alfa transformadas usando el kit Plasmid Miniprep Kit (Omega BioTec, Norcross, GA). La secuenciación del gen usando el ADN de plásmido purificado se efectuó en la Instalación de Secuenciación Core ADN Sequencing Facility en la Universidad de Illinois, Champaign-Urbana. Los datos de la secuenciación se analizaron con SeqMan Pro (DNAStar, Madison WI) para determinar la calidad de los datos y para editarlos.
La secuencia génica determinada a partir de la secuenciación de ADN genómico felino aislado se comparó contra las secuencias obtenidas de los cóntigos shotgun del genoma completo y se analizó para identificar diferencias de nucleótidos específicos y estructura de la proteína. Las secuencias descritas en el listado de secuencias para cada uno los ADNc y polipéptidos de genes del receptor del sabor amargo felino se identifican con las SEQ ID NO que se indican en la Tabla 6.
Tabla 6. SEQ ID NO de ADNc y polipéptido del gen receptor del sabor amargo felino
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En general, el gen felino se nombra después de su contrapartida humana homóloga, como se muestra en la Tabla 7. No obstante, para un gen felino similar a muchos genes humanos, tal como fTAS2R43, el gen felino se nombra como su contrapartida canina homóloga.
Tabla 7. Genes correspondientes en felinos, caninos y seres humanos
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Una alineación de secuencias de la 3a a la 7a regiones transmembrana (TM) de varios receptores amargos humanos y felinos se muestra en la Fig. 1. La alineación de las secuencias ilustra el grado sustancia de homología de esta región en los receptores del sabor amargo de las dos especies.
Una alineación de secuencias del polipéptido de TAS2R38 humano (SEQ ID NO:31) y del polipéptido de TAS2R38 felino (SEQ ID NO:18) determinada a partir de secuenciación de ADN genómico de cinco gatos individuales se muestra en la Fig. 2. Los aminoácidos en hTAS2R38 que difieren de aquellos en fTAS2R38 se recuadran en la Fig. 2. Las posiciones de los polimorfismos humanos conocidos por afectar la percepción del gusto de 6-n-propiltiouracil (PROP), A49P, V262A, I293V (en donde AVI no es un degustador y PAV es un degustador) están sombreadas en gris en la Fig. 2. Los residuos conocidos por ser importantes para la unión de feniltiocarbamida (PTC) al receptor TAS2R38 humano se ilustran en la Fig. 2 con un recuadro negro (residuos 99-100, 103, 255 y 259) Estos aminoácidos o bien se unen directamente a PTC, contribuyen al saco de unión o están implicados en la activación de los receptores asociándolos con otros aminoácidos.
Se usó TOPCONS para identificar las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos de cada polipéptido de fTAS2R. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 1.
Ejemplo 2. Sistemas de expresión para TAS2R felino
A. Generación de vectores de expresión para TAS2R felino
Este ejemplo describe la generación de un vector de expresión para un receptor amargo felino representativo, TAS2R38. Se lleva a cabo un proceso análogo para cada uno de los receptores TAS2R.
El gen de longitud total de TAS2R38 felino se amplió por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos de genes que abarcan toda la región codificante.
Se subclonó ADNc TAS2R38 en un cassette de expresión basado en el plásmido/vector de expresión pcDNA3.1D-V5His (Life Technologies, Carlsbad, Calif., EE. UU.), que contiene dentro de sus múltiples sitios de clonación la secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo FLAG a fin de permitir la detección superficial del receptor, luego los primeros 45 aminoácidos del receptor de somatostatina de rata, subtipo 3 (marca RSS) para facilitar la focalización de la superficie celular del transgén, y la secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo de la glucoproteína D (epítopo VHS) del virus del herpes simple (VHS) para facilitar la detección inmunocitoquímica (marca VHS) en el término carboxi.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican la marca FLAG, marca RSS, TAS2R38, y la marca HSV se condensaron, en ese orden, en marco para crear un constructo que permitiera la traducción a la proteína del receptor. El ADNc del receptor resultante en el vector de expresión codifica las secuencias de aminoácidos unidas de TAS2R38 precedidas por la marca RSS y seguidas por la marca VHS.
El vector de expresión que incluye el constructo se denomina pcDNA3.11D-FLAGV5His-TAS2R38 y permite la expresión de la proteína TAS2R38 (SEQ ID NO:18).
La generación de un vector de expresión para cada uno de los otros fTAS2R descritos en este documento se efectuó por etapas análogas.
B. Generación de líneas celulares que expresan transitoriamente fTAS2R
Se generaron líneas celulares que expresan transitoriamente un TAS2R deseado, transfectando un vector de expresión apropiado, p. ej., pcDNA3.1D-FLAGV5His-TAS2R38, construido como se describió anteriormente en el Ej.
2A en células de una línea celular eucariota (Life Technologies, Cat# R700-07).
El día 0, se dispusieron 60-000 células por pocillo en placas negras de 96 pocillos con fondo claro recubiertas con polilisina (Costar). Al día siguiente, las células se transfectaron con 150 ng del vector de expresión TAS2R38, p. ej., pcDNA3.1D-FLAGV5His (Invitrogen) junto con 45ng de la quimera Ga16 que contenía los últimos 44 aminoácidos de gustducina de rata (Ga16gust44) con 0,5 ul Lipofectamina 2000 (Invitrogen) por pocillo. Las células luego se incubaron 22-44 horas a 37°C 5% CO2.
La expresión de fTAS2R38 se evaluó ensayando la presencia de una respuesta funcional a un ligando hTAS2R38 conocido (p. ej., PTC), determinada mediante imágenes automáticas del calcio usando un ensayo de calcio Fluo-4AM (Life Technologies Corporation). Fluo-4AM es un indicador fluorescente de la dinámica de calcio intracelular (cambio en concentración) y en respuesta a la activación del receptor que ocurre después de la exposición del agonista.
La generación de líneas celulares que expresan transitoriamente los otros fTAS2R descritos en este documento fue análoga.
La expresión de los fTAS2R en las diversas líneas celulares generadas se evaluó por citometría de flujo. La marca FLAG extracelular se detectó con un anticuerpo específico de FLAG conjugado a fluoresceína isotiocianato (FITC). El porcentaje de células que expresan un fTAS2R determinado se determinó por el porcentaje de células positivas para la señal de FITC. El nivel de expresión de fTAS2R se determinó con la media geométrica de la intensidad de fluorescencia medida. Los resultados para cada uno de los fTAS2R expresados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Resultados de citometría de flujo para líneas celulares que expresan transitoriamente los fTAS2R
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C. Detección de líneas celulares transfectadas transitoriamente
Las pruebas para una respuesta funcional de fTAS2R38 a los ligandos de hTAS2R38 conocidos, PTC y PROP, y de fTAS2R43 a los ligandos de hTAS2R43 conocidos, aloína, denatonio y sacarina) se determinaron mediante imágenes automáticas del calcio usando el ensayo de calcio Fluo-4AM (Life Technologies Corporation).
Se activó fTAS2R3881% frente a la situación inicial con 100 qM PTC, pero no se estimuló con 30 qM PROP. Se activó fTAS2R4345% frente a la situación inicial con 300 qM aloína, y 17% frente a la situación inicial con 1 mM denatonio, pero no se estimuló con sacarina 6,7 mM. Asimismo, las respuestas a PTC, denatonio y aloína se inhibieron con 1 mM probenecid.
Las pruebas para una respuesta funcional de cada uno de los otros fTAS2R descritos en este documento se pueden efectuar por métodos análogos, usando ligandos conocidos a un homólogo correspondiente de cada fTAS2R.
D. Generación de líneas celulares que expresan establemente fTAS2R
También se obtienen líneas celulares que expresan establemente fTAS2R.
Para estos experimentos, el ADNc de fTAS2R38 se subclona en un cassette de expresión basado en el plásmido/vector de expresión pcDNA3.1Zeo (Life Technologies, Carlsbad, Calif., EE. UU.), que contiene dentro de sus múltiples sitios de clonación la secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 45 aminoácidos del receptor de somatostatina de rata, subtipo 3 (marca RSS) para facilitar la focalización de la superficie celular del transgén, y la secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo de la glucoproteína D del virus del herpes simple (VHS) (epítopo VHS) para facilitar la detección inmunocitoquímica (marca VHS).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican la marca RSS, marca VHS y fTAS2R38 se condensaron, en ese orden, en marco para crear un constructo que permita la traducción a la proteína del receptor. El ADNc del receptor resultante en el vector de expresión codifica las secuencias de aminoácido unidas de fTAS2R38 precedidas por la marca RSS y la marca VHS.
El vector de expresión que incluye el constructo se denomina pcDNA3.1Zeo-TAS2R38 y permite la expresión de la proteína fTAS2R38 (SEQ ID:18).
La generación de un vector de expresión para los otros fTAS2R descritos en este documento es análoga. Las enzimas de restricción utilizadas se adaptan de manera acorde.
Se generan líneas celulares que expresan establemente un fTAS2R deseado, transfectando el vector de expresión apropiado, p. ej., pcDNA3.1Zeo-TAS2R38, construido como se describió anteriormente en el Ej. 2A en una línea de células hospedantes eucariotas (Life Technologies Cat# R700-07) transformada con la quimera Ga16 que contiene los últimos 44 aminoácidos de gustducina de rata (células G[alfa] 16-gustducina 44) como se describe en el documento WO2004/055048 (US7919236).
El día 0, las células G[alfa] 16-gustducina 44 se disponen en una placa de 6 pocillos a una densidad de 900.000 células por pocillo y se desarrollan durante la noche en un medio de desarrollo selectivo (DMEM con 10% (v/v) suero bovino fetal inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/ml penicilina, 100 qg/ml estreptomicina).
El día 1, el medio se intercambia con 2 ml de medio de desarrollo libre de antibiótico y libre de suero. Se disuelven 10 ql Lipofectamine 2000 (Life Technologies Corporation) en 250 ql DMEM, y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. En paralelo, se disuelven 4 qg pcDNA3.1Zeo-TAS2R38 Ad N en 250 ql DMEM. Estas dos disoluciones resultantes se mezclan e incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se añaden a las células en el medio de cultivo. Después de 4 horas, el medio se reemplaza con medio de desarrollo libre de antibiótico que contiene suero. Las células se incuban en atmósfera humidificada (37 C., 5% CO2).
Después de 24 horas, las células se vuelven a disponer en placas en medio de desarrollo selectivo (DMEM con 10% (v/v) suero bovino fetal inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina, 200 pg/ml G418 y 200 pg/ml zeocina) y se incuban en una atmósfera humidificada (37 C, 5% CO2).
Después de 2 a 4 semanas de cultivo (reemplazando el medio según sea necesario), se seleccionan y expanden colonias resistentes a la zeocina.
La expresión de fTAS2R38 se evalúa ensayando la presencia de una respuesta funcional a un ligando de hTAS2R38 conocido (p. ej., PTC y PROP), determinada por imágenes automáticas de calcio usando el ensayo de calcio Fluo-4AM (Life Technologies Corporation). Fluo-4AM es un indicador fluorescente de la dinámica del calcio intracelular (cambio en la concentración) y permite controlar los cambios en la concentración del calcio, particularmente un incremento en respuesta a la activación de un receptor que ocurre después de la exposición al agonista. Se selecciona un clon que resulta en la línea celular G[alfa] 16-gustducina 44/TAS2R38. La línea celular G[alfa] 16-gustducina 44/TAS2R38 se estimuló 90% frente a la situación inicial en presencia de 100 pM PTC pero no se estimuló con 30 pm PROP.
La generación de líneas celulares que expresan establemente los otros fTAS2R descritos en este documento es análoga.
Ejemplo 3. Detección basada en células para ligandos y efectores de TAS2R felinos
La identificación de agonistas, antagonistas y moduladores del receptor TAS2R38 felino se lleva a cabo en un ensayo de detección basado en células en el que el efecto de un compuesto de ensayo sobre las células transfectadas con TAS2R38 felino y Ga16gust44 se compara con el efecto del compuesto de ensayo sobre células no transfectadas.
Antes del ensayo de detección, las células se cargan con el tinte sensible al calcio Fluo-AM (Life Technologies) durante una hora a 37 °C como se describe en el Ejemplo 2B. El tinte se elimina, y las células se ensayan en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS; Life Technologies) que contiene HEPES 20mM en un Flexstation II (Molecular Devices). Se usan diluciones en serie de 10 veces 0,01 mM - 1mM de los compuestos de ensayo para estimular las células. PTC, un agonista de TAS2R38 humano conocido, está entre los compuestos de ensayo
Los estímulos se inyectan y vigilan durante 100-180 segundos. Los datos se analizan y grafican como un porcentaje frente a la señal inicial, que es la lectura anterior a la estimulación. La estimulación de la línea celular que expresa fTAS2R38 con un compuesto de ensayo particular se considera que ocurre cuando la señal es mayor que la señal del tampón sola en la línea celular que expresa el receptor y la señal de la muestra de la línea celular no transfectada a la que se le inyecta el compuesto de ensayo.
La detección basada en células para agonistas, antagonistas y moduladores de los otros fTAS2R descritos en este documento es análoga.
Ejemplo 4. Composiciones saporíferas y repelentes
Las composiciones saporíferas secas ilustrativas para un animal que comprenden un agonista, un antagonista o un modulador de un receptor TAS2R felino descrito en este documento se preparan en general de conformidad con la siguiente formulación.
Tabla 9. Composición saporífera seca
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El agonista identificado en la composición saporífera seca es denatonio, aloína o PTC, o el antagonista identificado es probenecid.
Las composiciones saporíferas líquidas ilustrativas para un animal que comprende un agonista, un antagonista o un modulador de un receptor TAS2R felino se preparan en general de acuerdo con la siguiente formulación.
Tabla 10. Composición saporífera líquida
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El agonista identificado en la composición saporífera líquida es denatonio, aloína o PTC, o el antagonista identificado es probenecid.
Una composición repelente ilustrativa en la forma de un aerosol para pulverizar en un objeto a fin de impedir que un gato de compañía mastique o ingiera el objeto se prepara formulando 50% disolución de ingrediente activo, en donde el ingrediente activo es un agonista de TAS2R felino o un modulador positivo, en donde 50% es un gas propulsor tal como Frigen 11/12 (un hidrocarburo halogenado) o propano/butano (p. ej., en una relación 15:85) en un recipiente en aerosol. La disolución de ingrediente activo consiste en aproximadamente 0,5% a aproximadamente 30 % en peso de un agonista TAS2R felino o modulador positivo disuelto en un diluyente líquido, p. ej., agua, opcionalmente 0,5 - 1,5% de una sustancia aromática o un perfume, y hasta 29,5% isopropanol. El agonista de TAS2R felino es denatonio, aloína o PTC.
Realización 1. Un polipéptido del receptor TAS2R felino (fTAS2R) aislado que comprende un dominio extracelular de un receptor TAS2R felino; una región transmembrana de un receptor TAS2R felino, o un dominio intracelular de un receptor TAS2R felino, en donde el receptor fTAS2R comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SeQ ID NO:26, en donde el polipéptido del receptor felino TAS2R (fTAS2R) aislado no consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 4, 6, o 10.
Realización 2. El polipéptido de la realización 1 en donde: el dominio extracelular del polipéptido del receptor TAS2R felino comprende: aminoácidos 1,68-84; 146-179; o 249-257 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 1-10, 73-88; 151-186; o 256-264 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 1-8; 72-88; 150-186; o 256-265 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 1-2; 69­ 87; 151-183; o 253-261 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 1-8; 72-88; 150-187; o 257-265 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 1-6; 72-88; 150-183; o 253-262 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 1; 69-87; 150-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 1-8; 69-88; 150-185; o 252-261 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 1-17: 83-98; 161-198; o 268-277 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 1; 69-88; 150-185; o 255-264 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 1-2; 69­ 87; 149-181; o 251-260 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 1-2; 69-87; 149-181; o 251-259 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 1-8; 72-88; 150-185; o 254-263 de la SEQ ID NO:26; la región transmembrana del polipéptido del receptor TAS2R felino comprende: aminoácidos 2-22, 47-67, 85-105, 125-145, 180-200, 228-248, o 258-278 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 11-31,52-72, 89-109, 130-150, 187-207, 235-255 o 265-285 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 9­ 29, 51-71,89-109, 129-149, 187-207, 235-255, o 266-286 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 130­ 150, 184-204, 232-252, o 262-282 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 9-29, 51-71,89-109, 129-149, 188-208, 236-256, o 266-286 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 7-27, 51-71, 89-109, 129-149, 184-204, 232-252, o 263-283 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 2-22, 48-68, 88-108, 129-149, 182-202, 230-250, o 261-281 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 9-29, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 231-251, o 262-282 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 18-38, 62-82, 99-119, 140-160, 199-219, 247-267, o 278-298 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 2-22, 48-68, 89-109, 129-149, 186-206, 234­ 254, o 265-285 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 128-148, 182-202, 230-250, o 261-281 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 3-23, 48-68, 88-108, 128-148, 182-202, 230-250, o 260-280 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 9-29, 51-71,89-109, 129-149, 186-206, 233-253, o 264-284 de la s Eq ID NO:26; y el dominio intracelular comprende: aminoácidos 23-46; 106-124; 201-227; o 279-298 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 32-51; 110-129; 208­ 234; o 286-304 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 30-50; 110-128; 208-234; o 287-316 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 24-47; 109-129; 205-231; o 283-306 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 30-50; 110-128; 209-235; o 287-311 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 28-50; 110-128; 205-231; o 284-337 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 23-48; 109-128; 203­ 229; o 282-300 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 30-47; 110-128; 207-230; o 283-309 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 39-61; 120-139; 220-246; o 299-334 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 23-47; 110-128; 207-233; o 286­ 322 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 282-299 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 24-47; 109-127; 203-229; o 281 -308 de la SEQ ID NO:24; o aminoácidos 30-50; 110-128; 207-232; o 285-312 de la SEQ ID NO:26.
Realización 3. El polipéptido de la realización 1 o 2 que comprende una región transmembrana 2, una región transmembrana 3, una región transmembrana 4, una región transmembrana 5, una región transmembrana 6 y una región transmembrana 7, en donde cada región transmembrana comprende por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de la correspondiente secuencia de región transmembrana seleccionada en forma independiente entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SeQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26; o una región transmembrana 3, una región transmembrana 6 y una región transmembrana 7, en donde cada región transmembrana comprende por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de la correspondiente secuencia de región transmembrana seleccionada en forma independiente entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26; un dominio extracelular 3 que comprende por lo menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados entre aminoácidos 146-179 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 151-186 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 150-186 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 151 -183 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 150-187 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 150-183 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 150-181 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 161­ 198 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 149-181 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 149-181 de la SEQ ID NO:24; y aminoácidos 150-185 de la SEQ ID NO:26; y un dominio extracelular 4 que comprende por lo menos 8 aminoácidos consecutivos seleccionados entre aminoácidos 249-257 de la SEQ ID NO:2; aminoácidos 256-264 de la SEQ ID NO:4; aminoácidos 256-265 de la SEQ ID NO:6; aminoácidos 253-261 de la SEQ ID NO:8; aminoácidos 257-265 de la SEQ ID NO:10; aminoácidos 253-262 de la SEQ ID NO:12; aminoácidos 251-260 de la SEQ ID NO:14; aminoácidos 252-261 de la SEQ ID NO:16; aminoácidos 268-277 de la SEQ ID NO:18; aminoácidos 255-264 de la SEQ ID NO:20; aminoácidos 251-260 de la SEQ ID NO:22; aminoácidos 251-259 de la SEQ ID NO:24; y aminoácidos 254-263 de la SEQ ID NO:26.
Realización 4. El polipéptido según una cualquiera del as realizaciones 1-3, que además comprende un polipéptido heterólogo.
Realización 5. El polipéptido de la realización 4, en donde el polipéptido heterólogo está enlazado al término amino o al término carboxi de un polipéptido del receptor TAS2R felino.
Realización 6. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-5 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26.
Realización 7. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-6 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26.
Realización 8. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-7 que no ocurre naturalmente.
Realización 9. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-8 que tiene actividad del receptor fTAS2R o unión a un ligando de un receptor fTAS2R.
Realización 10. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1 -9, en donde la secuencia es SEQ ID NO:18.
Realización 11. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1 -10, en donde el fTAS2R es fTAS2R38 y el aminoácido 74 de la SeQ ID NO:18 es N.
Realización 12. El polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-11, en donde el dominio extracelular comprende una secuencia de por lo menos 15 aminoácidos consecutivos del dominio extracelular 2 o 3 o de por lo menos 8 aminoácidos consecutivos de dominio extracelular 4 de una secuencia del receptor fTAS2R; la región transmembrana comprende una secuencia de por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de una región transmembrana de la secuencia del receptor fTAS2R, y el dominio intracelular comprende una secuencia de por lo menos 17 aminoácidos consecutivos de un dominio intracelular de la secuencia del receptor fTAS2R.
Realización 13. Una composición que comprende por lo menos dos polipéptidos según una cualquiera de las realizaciones 1-12
Realización 14. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-12.
Realización 15. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido del receptor TAS2R (fTAS2R) felino, o su fragmento que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; una secuencia de nucleótidos que se hibrida al complemento del polinucleótido que tiene la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, s Eq ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de gran rigurosidad; y el complemento de las secuencias de nucleótidos anteriores.
Realización 16. Un polinucleótido que comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:17, en donde los nucleótidos contiguos contienen el nucleótido 220 y está presente una A en el nucleótido 220; o el complemento de la secuencia de nucleótidos.
Realización 17. El polinucleótido de la realización 16, que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos.
Realización 18. El polinucleótido de la realización 16 o 17, que comprende por lo menos 25 nucleótidos contiguos.
Realización 19. El polinucleótido según una cualquiera de las realizaciones 14-18, en donde la secuencia de nucleótidos está optimizada por codones para expresión en una célula no felina.
Realización 20. El polinucleótido de la realización 19, en donde la célula no felina es Escherichia coli., una célula de Saccharomyces cerevisae, una célula de Drosophila melanogaster, una célula de Caenorhabditis elegans o una célula mamífera.
Realización 21 El polinucleótido de la realización 20, en donde la célula mamífera es una célula murina o humana.
Realización 22. El polinucleótido según una cualquiera de las realizaciones 14-21 que no ocurre naturalmente.
Realización 23. Una composición que comprende por lo menos dos polinucleótidos según una cualquiera de las realizaciones 14-22.
Realización 24. Un par cebador para ampliar por lo menos una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de TAS2R felino.
Realización 25. La composición de la realización 24 que comprende un par cebador seleccionado entre los pares de cebadores de la Tabla 5.
Realización 26. Un polipéptido del receptor TAS2R felino codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las realizaciones 14-22.
Realización 27. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las realizaciones 14-22.
Realización 28. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de la realización 27.
Realización 29. La célula hospedante de la realización 28 en donde la célula es una célula mamífera, una célula de pez, una célula de levadura, una célula bacteriana o una célula de insecto.
Realización 30. La célula hospedante de las realizaciones 28 o 29 en donde la célula es una célula humana, murina o felina.
Realización 31. La célula hospedante de la realización 28 o 29 en donde la célula es una célula bacteriana, de insecto o levadura.
Realización 32. Un cultivo celular que comprende por lo menos una célula según una cualquiera de las realizaciones 28-31.
Realización 33. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 15 y hasta 100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO: 25; o el complemento de la secuencia de nucleótidos.
Realización 34. El oligonucleótido según la realización 33, que comprende por lo menos 18 y hasta 50 nucleótidos contiguos.
Realización 35. El oligonuclóetido según la realización 33 o 34, que comprende por lo menos 18 y hasta 30 nucleótidos contiguos.
Realización 36. Un anticuerpo aislado o su fragmento, que se une específicamente a un epítopo del receptor fTAS2R del polipéptido de cualquiera de las realizaciones 1-12 y 26.
Realización 37. Un método para identificar un compuesto que interactúa con un polipéptido del receptor TAS2R felino que comprende: poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1-12 y 26 con un compuesto de ensayo, y detectar la interacción entre el polipéptido y el compuesto del ensayo.
Realización 38. El método de la realización 37, en donde detectar la interacción entre el polipéptido y el compuesto de ensayo comprende medir una propiedad eléctrica, medir un cambio en una concentración iónica, medir un cambio en la conformación de la proteína, medir la unión del compuesto de ensayo al polipéptido, medir un cambio en el nivel de fosforilación, medir un cambio en el nivel de transcripción, medir un cambio en el nivel de un segundo mensajero, medir un cambio en el nivel del neurotransmisor, medir un cambio en una característica espectroscópica, medir un cambio en una propiedad hidrodinámica (p. ej., forma), medir un cambio en una propiedad cromatográfica, o medir un cambio en solubilidad.
Realización 39. El método de la realización 37 o 38, que además comprende identificar el compuesto de ensayo como un compuesto que interactúa con el receptor.
Realización 40. Un método para identificar un compuesto que modula un polipéptido del receptor TAS2R felino, que comprende: poner en contacto el polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 24 con un ligando del receptor TAS2R tanto en presencia como en ausencia de un compuesto de ensayo en ensayos separados, y determinar si el compuesto de ensayo modula la unión del ligando al polipéptido del receptor o la activación del polipéptido del receptor por el ligando.
Realización 41. El método según la realización 40, en donde determinar si el compuesto de ensayo modula la unión del ligando al receptor o la activación del receptor por el ligando comprende medir una propiedad eléctrica, medir una concentración iónica, medir un cambio en la conformación de la proteína, medir una unión del compuesto de ensayo al polipéptido, medir un cambio en el nivel de fosforilación, medir un cambio en el nivel de transcripción, medir un cambio en el nivel del segundo mensajero o medir un cambio en el nivel de neurotransmisor.
Realización 42. El método de la realización 40 o 41 que además comprende identificar el compuesto de ensayo como un modulador.
Realización 43. El método según una cualquiera de las realizaciones 37 a 42, en donde el polipéptido se une a un soporte sólido, expresado en una célula hospedante, en una membrana bicapa, en una monocapa de lípido o en una vesícula.
Realización 44. Un método para preparar una composición comestible que comprende poner en contacto una composición comestible o su componente con un polipéptido según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26 por un tiempo suficiente para reducir la cantidad de un compuesto amargo de la composición comestible o su componente.
Realización 45. El método de la realización 44 en donde el polipéptido se une a un soporte sólido que se puede separar de la composición comestible.
Realización 46. El método de la realización 44 o 45 en donde poner en contacto es una operación continua, una operación semi-continua o una operación por lotes.
Realización 47. El método según una cualquiera de las realizaciones 44-46, en donde la composición comestible es una composición alimentaria felina, y la composición o un componente de esta se pone en contacto con una pluralidad de polipéptidos diferentes.
Realización 48. Un método para formular una composición comestible con palatabilidad potenciada que comprende determinar la presencia de un compuesto que es un agonista, antagonista o modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26 en una composición comestible; y potenciar la palatabilidad de la composición comestible si el compuesto es un agonista o un modulador positivo, incrementar la cantidad de un antagonista hacia el receptor en la composición comestible o reducir la cantidad del compuesto en la composición comestible, o si el compuesto es un antagonista o un modulador negativo, aumentar la cantidad del compuesto en la composición comestible.
Realización 49. El método de la realización 48 en donde aumentar la cantidad del compuesto comprende aplicar una composición saporífera que comprende el compuesto a la composición comestible de modo tal que la composición saporífera se incorpore en o por lo menos recubra parcialmente la composición comestible.
Realización 50. El método de la realización 48 o 49, en donde la composición comestible comprende un alimento, una composición saporífera, un dulce, un producto farmacéutico, un material para el cuidado oral, un suplemento nutricional, un producto masticable o un producto bebible.
Realización 51. Un método para administrar un compuesto amargo a un animal que lo necesita, que comprende administrar una composición comestible a un animal, en donde la composición comestible comprende un compuesto amargo y un compuesto que es un agonista, antagonista o modulador de un polipéptido del receptor TAS2R felino según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26 que altera la aceptación de la composición comestible por el animal en comparación con la aceptación de la composición comestible sin el compuesto.
Realización 52. El método de la realización 51, en donde el compuesto amargo comprende una sustancia farmacéutica, material para cuidado oral, un repelente o un suplemento nutricional.
Realización 53. Un método para preparar una composición comestible para controlar la palatabilidad de la composición comestible en un animal, que comprende añadir un compuesto a una composición comestible para reducir la palatabilidad de la composición comestible para un animal, en donde el compuesto es un agonista de un modulador positivo de un polipéptido del receptor TAS2R felino según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26.
Realización 54. El método de la realización 53, en donde la palatabilidad se reduce a un grado tal que un animal al que se le administra la composición comestible consume 10 a 30% menos de la composición comestible con el compuesto que de la composición comestible sin el compuesto añadido.
Realización 55. El método de la realización 53 o 54, en donde la reducción se mide en calorías de la composición comestible consumida, peso de la composición comestible consumida o volumen de la composición comestible consumida.
Realización 56. Un método para elaborar una composición saporífera para recubrir o incorporar en una composición comestible que se ha de administrar a un animal, que comprende: mezclar un agonista o un antagonista de un polipéptido del receptor TAS2R felino según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26, en donde el agonista es denatonio, aloína o PTC, y el antagonista es probenecid con un vehículo para obtener una composición saporífera; opcionalmente, mezclar en la composición saporífera un potenciador de palatabilidad, un compuesto para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible o un compuesto para proporcionar color o aroma; en donde la composición saporífera es una formulación líquida, sólida, en polvo, pasta, gel, untable, en gránulos o pulverizable.
Realización 57. Una composición saporífera para recubrir o incorporar a una composición comestible que se ha de administrar a un animal, que comprende un agonista o un antagonista de un polipéptido del receptor TAS2R felino según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12 y 26, en donde el agonista es denatonio, aloína o PTC, y el antagonista es probenecid; opcionalmente, un potenciador de palatabilidad; opcionalmente, un compuesto para ayudar a adherir la composición saporífera a la composición comestible; y opcionalmente un compuesto para aportar color o aroma; en donde la composición saporífera es una formulación líquida, sólida, en polvo, pasta, gel, untable o pulverizable.
Realización 58. La composición saporífera de la realización 57 o el método según una cualquiera de las realizaciones 53-56, en donde la composición comestible es un alimento, dulce, suplemento nutricional, sustancia farmacéutica, material para el cuidado oral, producto masticable, repelente o producto bebible.
Realización 59. La composición saporífera de la realización 57 o 58 o el método según una cualquiera de las realizaciones 53-56, en donde la composición comestible es un alimento seco, un alimento blando, un alimento semi

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido del receptor TAS2R felino (fTAS2R) que comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26,
preferiblemente en donde fTAS2R es fTAS2R38 y el aminoácido 74 de la SEQ ID NO:18 es N.
2. El polipéptido según la reivindicación 1 que además comprende un polipéptido heterólogo.
3. El polipéptido según la reivindicación 2, en donde el polipéptido heterólogo está enlazado al término amino o al término carboxi del polipéptido del receptor TAS2R felino.
4. Un polinucleótido aislado seleccionado entre
(a) un polinucleótido que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y
(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido del receptor TAS2R felino (fTAS2R), que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25;
una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26; y el complemento de las secuencias de nucleótidos anteriores.
5. Una composición que comprende por lo menos
(a) dos polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, o
(b) dos polinucleótidos según la reivindicación 4.
6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.
7. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión según la reivindicación 6, preferiblemente en donde la célula es una célula mamífera, una célula de pez, una célula humana, una célula murina, una célula felina, una célula de levadura, una célula bacteriana o una célula de insecto.
8. Un anticuerpo aislado o su fragmento, que se une específicamente a un epítopo del receptor fTAS2R del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
9. Un método para identificar un compuesto que interactúa con un polipéptido del receptor TAS2R felino, que comprende:
poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 con un compuesto de ensayo, y detectar la interacción entre el polipéptido y el compuesto de ensayo.
10. Un método para identificar un compuesto que modula un polipéptido del receptor TAS2R felino, que comprende: poner en contacto el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un ligando del receptor TAS2R tanto en presencia como en ausencia de un compuesto de ensayo en ensayos separados, y
determinar si el compuesto de ensayo modula la unión del ligando al polipéptido del receptor o la activación del polipéptido del receptor por parte del ligando.
11. Un método para preparar una composición comestible que comprende poner en contacto una composición comestible o un componente de esta con un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 por un tiempo suficiente para reducir la cantidad de un compuesto amargo de la composición comestible o su componente, preferiblemente en donde la composición comestible es una composición alimentaria para un felino, y la composición o su componente se pone en contacto con una pluralidad de polipéptidos diferentes.
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