ES2341608T3 - Homologos del receptor de nogo. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2; (b) los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2; (c) los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2; (d) los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido; (e) los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido; (f) los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido; (g) los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido; y (h) los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido; donde dicho polipéptido disminuye la inhibición del crecimiento axonal en neuronas del SNC humano.

Description

Homólogos del receptor de Nogo.

Campo de la invención

La invención hace referencia a la neurología y la biología molecular. Más concretamente, la invención se refiere a neuronas del SNC y al crecimiento axonal.

Antecedentes

Entre los mecanismos a través de los cuales las células de un organismo se comunican entre sí y obtienen información y estímulos de su entorno se encuentran las moléculas receptoras de la membrana celular expresadas sobre la superficie celular. Muchos de tales receptores han sido identificados, caracterizados, y a veces clasificados en superfamilias de receptores principales basadas en los motivos estructurales y los rasgos de transducción de la señal. Los receptores son una primera conexión esencial para traducir una señal extracelular a una respuesta fisiológica celular.

Los receptores de las neuronas son particularmente importantes en el desarrollo del sistema nervioso durante la embriogénesis. Las neuronas forman conexiones con las células diana durante el desarrollo a través de la prolongación axonal de las neuronas hacia las células diana en un procedimiento mediado por los receptores. Los axones y las dendritas tienen una región especializada de sus extremos distales conocida como cono de crecimiento. Los conos de crecimiento permiten que la neurona sienta el entorno local a través de un procedimiento mediado por receptores y dirija el movimiento del axón o la dendrita de la neurona hacia la célula diana de la neurona. Este procedimiento es conocido como alargamiento. Los conos de crecimiento pueden ser sensibles a numerosas señales de orientación, por ejemplo, adherencia superficial, factores de crecimiento, neurotransmisores y campos eléctricos. La orientación del crecimiento en el cono depende de diferentes clases de moléculas de adherencia, señales intercelulares, así como factores que estimulan e inhiben los conos de crecimiento.

De manera interesante, las neuronas dañadas no se alargan en el sistema nervioso central (SNC) después de una lesión debida a un trauma o enfermedad, mientras los axones del sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran rápidamente. El hecho de que las neuronas del SNC dañadas no consigan alargarse no se debe a la propiedad intrínseca de los axones del SNC, si no más bien al entorno del SNC que no es permisivo para el alargamiento axonal. Los experimentos de injerto clásicos de Aguayo y colaboradores (p. ej., Richardson et al., (1980) Nature 284, 264-265) demostraron que los axones del SNC se pueden alargar de hecho sobre distancias sustanciales dentro de los ejes nerviosos periféricos, y que la mielina del SNC inhibe el alargamiento de los axones del SNC. Por lo tanto, dado el entorno apropiado, los axones del SNC pueden regenerarse, implicando que la lesión axonal del SNC puede ser estudiada mediante la manipulación apropiada del entorno del SNC.

La ausencia de regeneración axonal después de una lesión puede ser atribuida a la presencia de inhibidores del crecimiento axonal. Estos inhibidores están asociados predominantemente con la mielina y constituyen una importante barrera para la degeneración. Los inhibidores del crecimiento axonal se encuentran presentes en la mielina derivada del SNC y en la membrana plasmática de los oligodendrocitos que sintetizan la mielina en el SNC (Schwab et al., (1993) Annu. Rev. Neurosci. 16, 565-595). Los inhibidores asociados con mielina parecen ser un colaborador primario del fracaso de la regeneración de los axones del SNC in vivo después de la interrupción de la continuidad axonal, mientras otros inhibidores del crecimiento del axón no asociados con mielina del SNC pueden jugar un papel menor. Estos inhibidores bloquean la regeneración axonal después de la lesión neuronal debida a trauma, ictus o infección viral.

Se han caracterizado numerosos inhibidores del crecimiento derivados de mielina (véanse, para una revisión, David et al., (1999) documento WO995394547; Bandman et al., (1999) Patente de los Estados Unidos Núm. 5.858.708; Schwab, (1996) Neurochem. Res. 21, 755-761). También han sido descritos diferentes componentes de la materia blanca del SNC, NI35, NI250 (Nogo) y glicoproteína asociada a Mielina (MAG), que tienen actividad inhibidora de la prolongación axonal (Schwab et al., (1990) documento WO90051191; Schawb et al., (1997) Patente de los Estados Unidos Núm. 5.684.133). En particular, Nogo es un inhibidor del crecimiento del axón asociado con mielina de 250 kDa que fue caracterizado originalmente basándose en los efectos de la proteína purificada in vitro y los anticuerpos monoclonales que neutralizan la actividad de la proteína (Schwab (1990) Exp. Neurol. 109, 2-5). El ADNc de Nogo fue identificado primero por medio del análisis al azar de ADNc de cerebro y no se insinuó que tuviera ninguna función (Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364). La identificación de este ADNc de Nogo como el ADNc que codificaba el inhibidor del crecimiento axonal asociado con mielina de 250 kD se ha llevado a cabo sólo recientemente (GrandPre et al., (2000)
Nature 403, 439-444; Chen et al., (2000) Nature 403, 434-439; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 383-384).

En gran medida, se ha demostrado que Nogo es el componente primario de la mielina del SNC responsable de inhibir el alargamiento y la regeneración axonal. La expresión selectiva de Nogo por los oligodendrocitos y no por la células de Schawn (las células que mielinizan los axones P.S.) coincide con los efectos inhibidores de la mielina del SNC, en contraste con la mielina P.S. (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 434-439). En cultivo, Nogo inhibe el alargamiento axonal y ocasiona el colapso del cono de crecimiento (Spillmann et al., (1998) J. Biol. Chem. 272, 19283-19293). Se ha demostrado que los anticuerpos (p. ej., IN-1) contra Nogo bloquean la mayor parte de la acción inhibidora de la mielina del SNC sobre el crecimiento de las neuritas in vitro (Spillmann et al., (1998) J. Biol. Chem. 272:19283-19293). Estos experimentos indican que Nogo es el componente principal de la mielina del SNC responsable de la inhibición del alargamiento axonal en cultivo. Además, in vivo, se ha demostrado que el anticuerpo IN-1 intensifica la regeneración axonal después de una lesión de la médula espinal, dando como resultado la recuperación de comportamientos tales como la ubicación del contacto y la longitud de la zancada (Schnell y Schwab (1990) Nature 343, 260-272; Bregman et al., (1995) Nature 378, 498-501). De este modo, existe una evidencia sustancial de que Nogo es una diana molecular relevante para la enfermedad. Cabría esperar que los agentes que interfieren en la unión de Nogo a su receptor mejoren la regeneración axonal en estados clínicos en los que los axones han sido dañados, y mejoren el rendimiento del paciente.

La modulación de Nogo ha sido descrita como un método para el tratamiento de regeneración de las neuronas dañadas por trauma, infarto y trastornos degenerativos del SNC (Schwab et al., (1994) documento WO9417831; Tatagiba et al., (1997) Neurosurgery 40, 541-546) así como por tumores malignos del SNC tales como el glioblastoma (Schwab et al., (1993) Patente de los Estados Unidos Núm. 5.250.414); Schwab et al., (2000) Patente de los Estados Unidos Núm. 6.025.333).

Se ha sugerido que los anticuerpos que reconocen Nogo son útiles en la diagnosis y el tratamiento de la lesión nerviosa resultante de trauma, infarto y trastornos degenerativos del SNC (Schnell y Schwab, (1990) Nature 343-269-272; Schwab et al., (1997) Patente de los Estados Unidos Núm. 5.684.133). Para los axones del SNC, existe una correlación entre la presencia de mielina y la inhibición de la regeneración del axón a lo largo de grandes distancias (Savio y Schwab (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4130-4133; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 11664-11668). Una vez que Nogo es bloqueado por los anticuerpos, las neuronas pueden extenderse a través de las lesiones causadas por la lesión nerviosa (Schnell y Schwab (1990) Nature 343, 269-272).

NgR1 es un receptor de Nogo que fue identificado escrutando moléculas que interaccionan con los 66 aminoácidos del dominio activo de Nogo, como se describe en el Ejemplo 7 del documento WO0151520, un documento que forma parte del estado de la técnica solamente bajo las disposiciones del Artículo 54(3) EPC.

Compendio de la invención

Se han descubierto los genes que codifican homólogos (NgR2 y NgR3) de un receptor de Nogo (NgR1) en ratones y seres humanos. Se han identificado diferentes dominios de los polipéptidos codificados por los genes NgR2 y NgR3 y se han comparado con los dominios de los polipéptidos NgR1 de ratón y humano. Esta comparación ha conducido a la identificación de una secuencia consenso (secuencia consenso NgR) que caracteriza a una familia de proteínas (familia NgR). Basándose en estos y otros descubrimientos, la invención ofrece moléculas y métodos para modular el crecimiento axonal en las neuronas del SNC.

De este modo, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2;

(b)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2;

(c)

los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2;

(d)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

(e)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido;

(f)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

(g)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido; y

(h)

los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

donde dicho polipéptido disminuye la inhibición del crecimiento axonal en neuronas del SNC humano.

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La presente invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 70% a los aminoácidos 1 a 420 del SEQ ID NO: 2;

(b)

los aminoácidos 1 a 420 del SEQ ID NO: 2

(c)

una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 70% a los aminoácidos 31 a 420 del SEQ ID NO: 2; y

(d)

los aminoácidos 31 a 420 del SEQ ID NO: 2;

donde dicho polipéptido disminuye la inhibición del crecimiento axonal en neuronas del SNC humano.

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Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender adicionalmente un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo puede ser seleccionado del grupo que consiste en Fc, Glutation-S-transferasa (GST), y una etiqueta de Histidina (etiqueta His).

La presente invención también proporciona un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención. El polinucleótido puede comprender adicionalmente uno o más elementos de control de la expresión conectados operablemente a dicho ácido nucleico.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención.

La presente invención también proporciona una célula anfitriona que comprende un polinucleótido de la presente invención o un vector de la presente invención, donde la célula anfitriona excluye una célula capaz de formar un ser humano. La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica.

La presente invención también proporciona un polipéptido receptor de NOGO de acuerdo con la presente invención, expresado por una célula anfitriona de la presente invención.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se pueden seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, y anticuerpos humanos.

La presente invención también proporciona composiciones que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un vector de la presente invención, un polipéptido de la presente invención, o un anticuerpo de la presente invención, y un portador.

La presente invención también proporciona un método in vitro para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del SNC que comprende poner en contacto una neurona con un polipéptido de la presente invención o un anticuerpo de la presente invención.

La presente invención también proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o un anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para modular la inhibición del crecimiento axonal.

La presente invención también proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o un anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (SNC) en un mamífero, donde dicha enfermedad, trastorno, o lesión del SNC se selecciona del grupo que consiste en lesión cerebral, lesión de la médula espinal, ictus, o una enfermedad desmielinizante. Las enfermedades desmielinizantes que se pueden tratar incluyen esclerosis múltiple, desmielinización monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, degeneración Esponjiforme, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática, y enfermedad de Krabbe.

Las composiciones farmacéuticas que se preparan de acuerdo con este aspecto de la presente invención se pueden formular para la administración mediante una ruta seleccionada de un grupo que consiste en la administración parenteral, la administración subcutánea, la administración intravenosa, la administración transmucosal, la administración intradérmica, y la administración transdérmica.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente comprendido por los expertos normales en la técnica a la cual pertenece la invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluyendo las definiciones.

Los materiales, métodos y ejemplos presentados más abajo son meramente ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes. Otros rasgos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1A-1B muestra un alineamiento de NgR2 (SEQ ID NO: 2) y NgR3 (SEQ ID NO: 4) con el NgR conocido, NgR1 (SEQ ID NO: 5) y la Secuencia Consenso (SEQ ID NO: 6).

Fig. 2. mNgR3 no se une a hNogoA (1055-1120). Las células COS-7 fueron transfectadas con vectores que codifican myc-NgR1 o myc-NgR3, fijadas, y teñidas con anticuerpos anti-myc o AP-hNogoA (1055-1120).

Fig. 3. Un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de NgR1 humano, NgR1 murino, NgR3 murino, NgR3 humano y NgR2 humano. La numeración comienza con el aminoácido núm. 1 de NgR3 murino. La secuencia consenso se enumera más abajo. El dominio LRR NT se indica por medio de un recuadro sombreado; los dominios LLR 1, LLR 3, LLR 5, y LLR 7 se indican en recuadros abiertos; LLR2, LLR4, LLR6 y LLR8 están indicados por recuadros sombreados, y el dominio LLR CT está indicado por un recuadro sombreado. Los aminoácidos en negrita en LLR 8 indican sitios de glicosilación conservados. Un punto indica un residuo cistina conservado en LRR4. El recuadro del extremo C indica supuestas señales GPI.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción hace referencia a moléculas y métodos para modular el crecimiento axonal en neuronas del SNC.

La descripción proporciona un polipéptido que contiene un polipéptido que contiene un dominio LRRCT rico en triptófano que consiste en la secuencia de aminoácidos:

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1

donde X es cualquier aminoácido de la proteína o un espacio, y el polipéptido no incluye la secuencia de aminoácidos desde el residuo 260 al 309 del SEQ ID NO: 5 (NgR1 humano) o del SEQ ID NO: 17 (NgR1 de ratón).

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Preferiblemente, X17 y X23 son (independientemente) arginina o lisina. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos del dominio LRRCT es desde los residuos 261-310 del SEQ ID NO: 2, o los residuos 261-310 del SEQ ID NO: 2 hasta con 10 sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos casos, el polipéptido contiene la siguiente secuencia de aminoácidos NTLRRCT:

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2

donde X es cualquier residuo aminoácido o espacio y donde el polipéptido no es el polipéptido de SEQ ID NO: 5 (NgR1 humano) o SEQ ID NO: 17 (NgR1 de ratón). Por ejemplo, X_{6}, X_{37} y X_{38} pueden representar un espacio. Los ejemplos específicos de polipéptidos de esta descripción son el SEQ ID NO: 2 (NgR2 humano), el SEQ ID NO: 4 (NgR3 de ratón), y el SEQ ID NO: 14 (NgR3 humano). En algunos casos, el polipéptido contiene: (a) un dominio NTLRRCT, y (b) menos de un dominio CTS completo, siempre que un dominio CTS parcial, si está presente, consista en no más de los primeros 39 aminoácidos del dominio CTS. Mientras el polipéptido puede contener un dominio GPI funcional, el dominio GPI puede estar ausente, p. ej., cuando se desea un polipéptido soluble. Un polipéptido de esta descripción incluye opcionalmente una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo, p. ej., una porción Fc de un anticuerpo.

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La descripción también proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptidos descrito antes, un vector que contiene el ácido nucleico, cuyo ácido nucleico puede estar unido operablemente a una secuencia de control de la expresión; y una célula anfitriona transformada que contiene el vector. Asimismo se proporciona un método para producir un polipéptido de la descripción. El método incluye introducir un ácido nucleico que codifica el polipéptido anterior en una célula anfitriona, cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y recuperar el polipéptido.

La descripción también proporciona una molécula antisentido cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido que consiste en los residuos 311-395 del SEQ ID NO: 2, un polipéptido que consiste en los residuos 256-396 del SEQ ID NO: 14 y un polipéptido que consiste en los residuos 321-438 del SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico tiene de 8 a 100 aminoácidos de longitud, p. ej., aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 nucleótidos. La descripción también proporciona un ácido nucleico que codifica semejante molécula antisentido.

La descripción también proporciona un anticuerpo que se une a un polipéptido descrito antes. Los polipéptidos o anticuerpos de esta descripción se pueden formular en composiciones farmacéuticas que contienen el polipéptido o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable.

La descripción también proporciona un método para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del SNC. El método incluye la etapa de poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido o anticuerpo de la descripción. La descripción también proporciona un método para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central. El método incluye administrar a un mamífero, p. ej., un ser humano, una cantidad eficaz de un polipéptido o anticuerpo de esta descripción. Las enfermedades, trastornos y lesiones ilustrativas que pueden ser tratadas utilizando las moléculas y métodos de esta descripción incluyen, pero no están limitadas a, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, ictus, enfermedades desmielinizantes, p. ej., esclerosis múltiple, desmielinización monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, degeneración espongiforme, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática, y enfermedad de Krabbe.

La descripción también proporciona un método para identificar una molécula que se une a un polipéptido de esta descripción. El método incluye las etapas de: (a) proporcionar un polipéptido de esta descripción: (b) poner en contacto el polipéptido con la molécula candidato; y (c) detectar la unión de la molécula candidato al polipéptido.

Una parte de la descripción contenida en la presente memoria proporciona los polipéptidos, polinucleótidos, vectores, células anfitrionas, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno, composiciones, métodos, y usos de la presente invención. Estos aspectos de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

La presente descripción proporciona polinucleótidos purificados y aislados (p. ej., secuencias de ADN y transcritos de ARN, hebras tanto efectoras como antisentido complementarias, de hebra sencilla o doble, incluyendo sus variantes de empalme) que codifican los homólogos de NgR, referidos en la presente memoria como NgR. A menos que se indique de otro modo, según se utiliza en la presente memoria, la abreviatura en minúsculas (NgR) hace referencia a un gen, ADNc, ARN o secuencia de ácido nucleico, mientras la versión en mayúsculas (NgR) hace referencia a una proteína, polipéptido, péptido, oligopéptido, o secuencia de aminoácidos. Las proteínas especificas se designan por números, p. ej., "NgR2" es un homólogo de NgR humano, "NgR3" es un homólogo de NgR derivado de múrido, y "NgR1" es el NgR conocido identificado por el Dr. Stephen Strittmatter. Los NgR conocidos son referidos en la presente memoria como "NgR". Los polinucleótidos de ADN de esta descripción que incluyen los de la presente invención incluyen ADN genómico, ADNc y ADN que ha sido sintetizado químicamente en su totalidad o en parte.

Los trabajos de referencia convencionales que muestran los principios generales de la tecnología del ADN recombinante conocidos por los expertos en la técnica incluyen Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Nueva York (1998); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^{a} Ed., Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, Nueva York (1989); Kaufinan et al., Eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Ratón (1995); McPherson, Ed., DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford (1991).

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Según se utiliza en la presente memoria, el término "axón" hace referencia a una protrusión celular larga de una neurona, por medio de la cual son conducidos los potenciales de acción, ya sea hacia o desde el cuerpo celular.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "crecimiento axonal" hace referencia a una prolongación del proceso largo o axón, que se origina en el cuerpo celular y prosigue mediante el cono de crecimiento.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "trastorno del sistema nervioso central" hace referencia a cualquier estado patológico asociado con una función anormal del sistema nervioso central (SNC). El término incluye, pero no está limitado a, una función alterada del SNC resultante de trauma físico en el tejido cerebral, infección viral, mecanismos autoinmunitarios y mutación genética.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "enfermedad desmielinizante" hace referencia a un trastorno patológico caracterizado por la degradación de la vaina de mielina de la membrana celular del oligodendrocito.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "cono de crecimiento" hace referencia a una región especializada en la punta de la neurita de crecimiento que es responsable de la percepción del entorno local y el movimiento del axón hacia su célula diana sináptica apropiada.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "movimiento del cono de crecimiento" hace referencia a la prolongación o colapso del cono de crecimiento hacia una célula diana de la neurona.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "neurita" hace referencia a un proceso que crece fuera de una neurona. Como a veces es difícil distinguir una dendrita de un axón en cultivo, el término "neurita" se utiliza para ambos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "oligodendrocito" hace referencia a una célula neuroglial del SNC cuya función es mielinizar los axones del SNC.

Según se utiliza en la presente memoria y se entiende en la técnica, "sintetizado" hace referencia a polinucleótidos producidos mediante métodos puramente químicos, en contraposición a los enzimáticos.

Las secuencias de ADN "totalmente" sintetizadas son producidas por lo tanto mediante métodos enteramente químicos, y los ADN "parcialmente" sintetizados abarcan aquellos en los que solamente las porciones del ADN resultante fueron producidas mediante métodos químicos. Mediante el término "región" se quiere significar una porción físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de las proteínas, se define una región por medio de una porción contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína. El término "dominio" se define en la presente memoria en referencia a una porción estructural de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser co-extensivos con regiones o sus porciones; los dominios también pueden incorporar una porción de una biomolécula que es distinta de una región concreta, además de toda o parte de esta región. Los ejemplos de los dominios de la proteína NgR incluyen, pero no están limitados a, péptido señal, dominio extracelular (esto es N-terminal), y dominios de repeticiones ricas en leucina.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "actividad" hace referencia a una variedad de indicios medibles que sugieren o revelan la unión, ya sea directa o indirecta; que afecta a una respuesta, esto es, que tiene un efecto medible en respuesta a cierta exposición o estímulo, incluyendo, por ejemplo, la afinidad de un compuesto para unirse directamente a un polipéptido o polinucleótido de esta descripción, o, por ejemplo, la medida de cantidades de proteínas aguas arriba o aguas abajo u otras funciones similares después de cierto estímulo o evento. Tales actividades se pueden medir mediante análisis tales como análisis de inhibición competitiva de la unión de NgR1 a Nogo donde, por ejemplo, el NgR2 soluble, no marcado se añade a un sistema de análisis a concentraciones crecientes para inhibir la unión de Nogo a NgR1 expresado sobre la superficie de células CHO. Como otro ejemplo, se puede evaluar la capacidad de las neuronas para extenderse a través de lesiones causadas por el deterioro nervioso (como en Schnell y Schwab (1990) Nature 343, 269-272) después de la inhibición de Nogo por diversas formas de NgR2 y/o NgR3 como indicador biológico de la función de NgR.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "anticuerpo" haga referencia a anticuerpos intactos, completos, y a fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, y otros fragmentos de los mismos. Los anticuerpos intactos, completos incluyen anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos, anticuerpos anti-anti-idiotípicos, y anticuerpos humanizados.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "unión" representa la interacción física o química entre dos proteínas o compuestos o proteínas o compuestos asociados o sus combinaciones. La unión incluye enlaces iónicos, no iónicos, de hidrógeno, de Wan der Waals, interacciones hidrófobas, etc. La interacción física, la unión, puede ser directa o indirecta, siendo la indirecta a través de o debida a los efectos de otra proteína o compuesto. La unión directa hace referencia a interacciones que no tienen lugar a través de o debido al efecto de otra proteína o compuesto si no que en vez de eso se producen sin otros intermedios químicos sustanciales.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "compuesto" representa cualquier agente químico o molécula identificable, incluyendo, pero no limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, azúcares, nucleótidos o ácidos nucleicos, y semejante compuesto puede ser natural o sintético.

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Según se utiliza en la presente memoria, el término "complementario" hace referencia al emparejamiento de bases de Watson-Crick entre unidades de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "poner en contacto" significa poner juntos, ya sea directamente o indirectamente, un compuesto en proximidad física con un polipéptido o polinucleótido de esta descripción. El polipéptido o polinucleótido puede estar en cualquiera de los numerosos tampones, sales, soluciones etc. Poner en contacto incluye, por ejemplo, colocar el compuesto en un vaso de precipitados, placa de microtitulación, matraz de cultivo de tejidos, o una micromatriz, tal como un chip génico, o similar, que contiene la molécula de ácido nucleico, o polipéptido que codifica el NgR o uno de sus fragmentos.

Según se utiliza en la presente memoria, la frase "secuencia de nucleótidos homóloga", o "secuencia de aminoácidos homóloga", o una de sus variaciones, hace referencia a secuencias caracterizadas por una identidad a nivel de nucleótidos, o una homología a nivel de aminoácidos, de al menos el porcentaje especificado. Las secuencias de nucleótidos homólogas incluyen aquellas secuencias que codifican las isoformas de las proteínas. Tales isoformas pueden ser expresadas en diferentes tejidos del mismo organismo como resultado, por ejemplo, del empalme alternativo de ARN. Alternativamente, las isoformas pueden estar codificadas por diferentes genes. Las secuencias de nucleótidos homólogas incluyen secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de una especie distinta de la humana, incluyendo, pero no limitada a, mamíferos. Las secuencias de nucleótidos homólogas también incluyen, pero no están limitadas a, variaciones alélicas de origen natural y mutaciones de las secuencias de nucleótidos mostradas en la presente memoria. Una secuencia de nucleótidos homóloga no incluye, sin embargo, la secuencia de nucleótidos que codifica NgR1. Las secuencias de aminoácidos homólogas incluyen aquellas secuencias de aminoácidos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas y cuyos polipéptidos tienen la misma unión y/o actividad. Una secuencia de aminoácidos homóloga no incluye, sin embargo, la secuencia de aminoácidos que codifica otros NgR conocidos. El porcentaje de homología se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI), utilizando los ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981), 2, 482-489, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad).

Según se utiliza en la presente memoria, el término molécula de ácido nucleico "aislada" hace referencia a una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) que está esencialmente libre de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas con las cuales está asociado en la naturaleza, esto es, un ácido nucleico que ha sido separado de su entorno nativo. Los ejemplos de las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen, pero no están limitados a, moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector, moléculas de ADN recombinante mantenidas en una célula anfitriona heteróloga, moléculas de ácido nucleico parcialmente o esencialmente purificadas, y moléculas de ADN o ARN sintético. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de las secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diferentes realizaciones, la molécula de ácido nucleico de NgR aislada puede contener menos de aproximadamente 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otros agentes químicos cuando es sintetizada químicamente.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "heterólogo" hace referencia a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que es diferente, o a una secuencia no correspondiente, o a una secuencia derivada de una especie diferente. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de NgR de ratón es heteróloga con respecto a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de NgR humana, y una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de NgR humana es heteróloga con respecto a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de inmunoglobulina humana.

Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido de NgR soluble" es un polipéptido de NgR que no se ancla por si mismo a la membrana. Semejantes polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo, polipéptidos NgR2 y NgR3 que carecen de una porción suficiente de su señal de anclaje GPI para anclarse al polipéptido o están modificados de manera que la señal de anclaje GPI no es adecuada para producir un remplazo del péptido con un ancla GPI. En casos preferidos, se separan hasta 5, 10, 20 o 25 aminoácidos del extremo C de NgR2 o NgR3 para hacer solubles las respectivas proteínas. Según se utiliza en la presente memoria los polipéptidos NgR solubles incluyen NgR completos o truncados (p. ej., con deleciones internas).

Los polipéptidos NgR solubles pueden incluir la proteína NgR completa hasta la supuesta secuencia señal GPI (p. ej., del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 395 de NgR2, y desde el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 438 de NgR3). En otros casos, el péptido señal de las proteínas puede ser separado o truncado (p. ej., toda o parte de la secuencia señal de NgR2, que abarca desde el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 30 del SEQ ID NO: 2, puede ser separada; toda o parte de la secuencia señal de NgR3, que abarca del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 40 del SEQ ID NO: 4, puede ser separada). En algunos casos, se utilizan el NgR2 maduro (SEQ ID NO: 8) y el NgR3 maduro (SEQ ID NO: 9).

Los polipéptidos de NgR solubles incluyen al menos una de las supuestas porciones de unión al ligando de NgR, incluyendo la primera región rica en cisteína (SEQ ID NO: 10, la región con repeticiones de leucina (SEQ ID NO: 12) y la segunda región rica en cisteína (SEQ ID NO: 11). En algunos casos, los polipéptidos NgR solubles consisten en el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 395 del SEQ ID NO: 2, o del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 438 del SEQ ID NO: 4.

En otros casos, los polipéptidos NgR solubles son proteínas de fusión que contienen desde el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 395 del NgR2 maduro o del aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 438 de NgR3, conteniendo los 10 aminoácidos del extremo C terminal de una región bisagra de IgG 1 humana los dos residuos cisteína que se piensa que participan en la unión disulfuro intercatenaria, y las regiones CH2 y CH3 de un dominio constante de la cadena pesada de la IgG1 humana. Este tipo de proteína recombinante se diseña para modular la inhibición del alargamiento axonal a través de la inhibición del ligando Nogo a NgR1, o inhibiendo la interacción del ligando de NgR con el NgR de la superficie celular. La porción de NgR de la fusión se une al ligando Nogo y la porción IgG1 se une a los receptores Fc\gammaRI (macrófago) y Fc\gammaIII (células NK y neutrófilos).

La producción de los polipéptidos solubles descritos en la presente memoria, incluyendo aquellos que son útiles en esta invención, se obtienen mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser obtenidos de moléculas NgR transmembrana intactas mediante proteolisis utilizando endopeptidasas específicas combinadas con exopeptidasas, degradación de Edman, o ambas. La molécula de NgR intacta, a su vez, puede ser purificada de su fuente natural utilizando métodos convencionales. Alternativamente, el NgR intacto puede ser producido mediante técnicas de ADN recombinante conocidas utilizando ADNc, vectores de expresión y técnicas bien conocidas para la expresión de genes recombinantes.

Preferiblemente, los polipéptidos solubles descritos en la presente memoria, incluyendo aquellos que son útiles en la presente invención, se producen directamente, eliminado de ese modo la necesidad de un NgR completo como sustancia de partida. Esto se puede lograr mediante técnicas de síntesis química convencionales o mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en las que solamente aquellas secuencias de ADN que codifican los péptidos deseados son expresadas en los anfitriones transformados. Por ejemplo, se puede sintetizar un gen que codifica el polipéptido NgR soluble deseado mediante métodos químicos utilizando un sintetizador de oligonucleótidos. Tales oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido NgR soluble deseado. Las secuencias de ADN específicas que codifican el péptido deseado también pueden ser obtenidas de la secuencia de ADN completa aislando los fragmentos de las endonucleasas de restricción específicas o mediante síntesis por PCR de la región especificada del ADN.

Una molécula de ácido nucleico de la presente descripción, p. ej., una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 o un complemento de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos, puede ser aislada utilizando las técnicas de la biología molecular convencional y la información de la secuencia proporcionada en la presente memoria. Utilizando todas o una porción de las secuencias de ácido nucleico de los SEQ ID NO: 1 o 3 como sonda de hibridación, se pueden aislar secuencias de ácido nucleico de NgR empleando las técnicas de hibridación y clonación convencionales (p. ej., como describen Sambrook et al., eds. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel, et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1993).

Un ácido nucleico de esta descripción, p. ej., un ácido nucleico de la invención, puede ser amplificado utilizando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación mediante PCR convencionales. El ácido nucleico amplificado de este modo se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de la secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de nucleótidos de NgR pueden ser preparados mediante técnicas de síntesis convencionales, p. ej., utilizando un sintetizador de ADN automático.

Según se utilizan en la presente memoria, los términos "modula" o "modifica" representan un incremento o disminución en la cantidad, calidad, o efecto de una actividad o proteína concretas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" hace referencia a una serie de residuos nucleotídicos unidos que tiene un número suficiente de bases para ser utilizado en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta secuencia corta se basa (o se diseña a partir de) una secuencia genómica o de ADNc y se utiliza para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un ADN o ARN idéntico, similar o complementario en una célula o tejido concretos. Los oligonucleótidos comprenden porciones de una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos y tantos como aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. Estos son sintetizados químicamente y pueden ser utilizados como sondas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sonda" hace referencia a secuencias de ácido nucleico de longitud variable, preferiblemente entre al menos aproximadamente 10 y tantos como aproximadamente 6.000 nucleótidos, dependiendo de su uso. Se utilizan en la detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticas, similares o complementarias. Las sondas de mayor longitud se obtienen normalmente de una fuente natural o recombinante, son altamente específicas e hibridan mucho más lentamente que los oligómeros. Pueden ser de hebra sencilla o doble y se diseñan cuidadosamente para que tengan especificidad en las tecnologías de PCR, basadas en hibridación en membrana, o de tipo ELISA.

El término "prevenir" hace referencia a la disminución de la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una afección anómala.

El término "tratar" hace referencia a tener un efecto terapéutico y aliviar o abrogar al menos parcialmente una afección anómala en el organismo.

El término "efecto terapéutico" hace referencia a los factores de inhibición o activación que causan o contribuyen a la afección anómala. Un efecto terapéutico alivia hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la afección anómala. En referencia al tratamiento de las afecciones anómalas, un efecto terapéutico puede hacer referencia a uno o más de los siguientes: (a) un aumento de la proliferación, crecimiento, y/o diferenciación de las células; (b) inhibición (esto es, ralentización o detención) de la muerte celular; (c) inhibición de la degeneración; (d) alivio hasta cierto punto de uno o más de los síntomas asociados con la afección anómala; y (e) intensificación de la función de la población de células afectada. Los compuestos que demuestran eficacia contra las afecciones anómalas pueden ser identificados como se describe en la presente memoria.

El término "afección anómala" hace referencia a una función de las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en ese organismo. Una afección anómala puede hacer referencia a la proliferación celular, la diferenciación celular, la señalización celular, o la supervivencia celular. Una afección anómala también puede incluir obesidad, complicaciones diabéticas tales como degeneración de la retina, e irregularidades en la absorción y el metabolismo de la glucosa, y la absorción y el metabolismo de los ácidos grasos.

Las condiciones proliferativas celulares anómalas incluyen, por ejemplo, cánceres tales como trastornos fibróticos y mesangiales, angiogénesis y vasculogénesis anómalas, curación de heridas, psoriasis, diabetes mellitus e inflamación.

Las afecciones de diferenciación anómalas incluyen, por ejemplo, trastornos neurodegenerativos, tasas de curación heridas lentas y tasas de curación de injertos de tejidos lentas.

Las afecciones de señalización celular anómala incluyen, por ejemplo, trastornos psiquiátricos que implican un exceso de actividad neurotransmisora.

Las afecciones de supervivencia celular anómala también pueden hacer referencia a afecciones en las cuales se activan o abrogan las rutas de muerte celular programada (apoptosis). Numerosas proteína quinasas están asociadas con las rutas de la apoptosis. Las aberraciones en la función de una cualquiera de las proteína quinasas podrían conducir a una inmortalidad celular o a una muerte celular prematura.

El término "administrar" hace referencia a un método de incorporación de un compuesto a células o tejidos de un organismo. La afección anómala puede ser evitada o tratada cuando las células o tejidos del organismo existen dentro del organismo o fuera del organismo. Las células existentes fuera del organismo pueden ser mantenidas o desarrolladas en placas para el cultivo de tejidos. Para las células albergadas dentro del organismo, existen muchos mecanismos en la técnica para administrar compuestos, incluyendo (pero no limitados a) aplicaciones orales, parenterales, dérmicas, inyectables, y en aerosol. Para las células fuera del organismo, existen múltiples mecanismos en la técnica para administrar los compuestos, incluyendo (pero no limitados a) mecanismos de microinyección celular, mecanismos de transformación y mecanismos portadores.

La afección anómalas también puede ser evitada o tratada administrando un compuesto a un grupo de células que tienen una aberración en una ruta de transducción de la señal a un organismo. Después se puede controlar el efecto de la administración de un compuesto sobre una función de un organismo. El organismo es preferiblemente un ratón, rata, conejo, cobaya o cabra, más preferiblemente un mono o simio, y muy preferiblemente un ser humano.

Por "amplificación" se quiere significar un aumento del número de ADN o ARN en una célula en comparación con las células normales. "Amplificación" referido al ARN puede ser la presencia detectable de ARN en las células, puesto que en algunas células normales no hay expresión basal de ARN. En otras células normales, existe un nivel basal de expresión, por lo tanto en estos casos la amplificación es la detección de al menos 1-2 veces, y preferiblemente más, en comparación con el nivel basal.

Las secuencias de aminoácidos se presentan en la dirección amino a carboxi, de izquierda a derecha. Los grupos amino y carboxi no se presentan en la secuencia. Las secuencias de nucleótidos se presentan mediante una única hebra, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha. Los nucleótidos y aminoácidos se representan de la manera recomendada por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission o (para los aminoácidos) mediante el código de tres letras.

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Ácidos Nucleicos

El ADN genómico de esta descripción comprende la región codificante de la proteína para un polipéptido de esta descripción y también se pretende incluir sus variantes alélicas. Se entiende generalmente que, para muchos genes, el ADN genómico es transcrito a transcritos de ARN que experimentan uno o más eventos de empalme en los que se eliminan intrones (esto es, regiones no codificantes) de los transcritos, o se "empalman". Los transcritos de ARN que pueden ser empalmados mediante mecanismos alternativos, y por lo tanto sometidos a la eliminación de diferentes secuencias de ARN pero todavía codifican un polipéptido NgR, son referidos en la técnica como variantes de empalme que están incluidas en esta descripción. Las variantes de empale comprendidas por la descripción están codificadas por lo tanto por las mismas secuencias de ADN genómico originales pero proceden de transcritos de ARNm distintos. Las variantes alélicas son formas modificadas de una secuencia génica de tipo salvaje, siendo la modificación el resultado de la recombinación durante la segregación cromosómica o la exposición a condiciones que dan lugar a mutaciones genéticas. Las variantes alélicas, como los genes de tipo salvaje, son secuencias de origen natural (en oposición a las variantes de origen no natural que surgen de una manipulación in vitro).

La descripción también comprende ADNc que es obtenido por medio de la transcripción inversa de un polinucleótido de ARN que codifica NgR (seguido convencionalmente de la síntesis de la segunda hebra de una hebra complementaria para proporcionar un ADN de doble hebra).

Las secuencias de ADN preferidas que codifican un polipéptido NgR humano se exponen en los SEQ ID NO: 1 y 13. Un ADN preferido de esta invención comprende una molécula de doble hebra que comprende la molécula codificante (esto es, la "hebra codificante") junto con la molécula complementaria (la "hebra no codificante" o "complemento") que tiene una secuencia inequívocamente deducible de la hebra codificante de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick para el ADN. También se prefieren otros polinucleótidos que codifican polipéptidos de NgR, como se muestra en el SEQ ID NO: 3, que comprenden el homólogo de NgR murino, NgR3.

Asimismo se prefieren las secuencias de nucleótidos que codifican al menos una porción de un polipéptido de NgR que tiene al menos una función biológica de un NgR. Son más preferidas las secuencias de nucleótidos que codifican una porción de NgR que codifica al menos el NgR maduro sin la señal GPI C terminal hidrófoba. También se prefieren las secuencias de nucleótidos que codifican la porción de NgR que codifica al menos una región de unión al ligando de NgR.

Esta descripción incluye adicionalmente otras especies, preferiblemente mamíferos, homólogas del ADN de NgR humano. Las especies homólogas, a veces referidas como "ortólogos", en general, comparten una homología de al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% con el ADN humano de esta descripción. Generalmente, el porcentaje de "homología" de la secuencia con respecto a los polinucleótidos de esta descripción se puede calcular como el porcentaje de bases nucleotídicas de la secuencia candidato que son idénticas a los nucleótidos de las secuencias de NgR mostradas en los SEQ ID NO: 1, 3 o 13, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia.

La información de la secuencia de polinucleótidos proporcionada por esta descripción hace posible la expresión a gran escala del polipéptido codificado mediante mecanismos bien conocidos y llevados a la práctica rutinariamente en la técnica. Los polinucleótidos de esta descripción también permiten la identificación y aislamiento de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de NgR relacionados, tales como las variantes alélicas humanas y los homólogos de especie, mediante mecanismos bien conocidos incluyendo la hibridación Southern y/o Northern, y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ejemplos de los polinucleótidos relacionados incluyen secuencias genómicas humanas y no humanas, incluyendo variantes alélicas, así como polinucleótidos que codifican los polipéptidos homólogos a NgR y los polipéptidos estructuralmente relacionados que comparten una o más propiedades biológicas, inmunológicas, y/o físicas de NgR. Los genes de las especies no humanas que codifican las proteínas homólogas a NgR también pueden ser identificados mediante análisis Southern y/o PCR y son útiles en modelos animales para trastornos de NgR. El conocimiento de la secuencia de un ADN de NgR humano también hace posible, por medio del uso de hibridación Southern o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la identificación de secuencias de ADN genómico que codifican las secuencias reguladoras del control de la expresión de NgR tales como promotores, operadores, intensificadores, represores, y similares. Los polinucleótidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, son útiles en análisis de hibridación para detectar la capacidad de las células para expresar NgR. Los polinucleótidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, también pueden proporcionar una base para métodos diagnósticos útiles para identificar una o varias alteraciones genéticas en un locus de NgR que subyacen a una o varias enfermedades, cuya información es útil tanto para la diagnosis como para la selección de estrategias terapéuticas.

La descripción en la presente memoria de un polinucleótido completo que codifica un polipéptido de NgR hace fácilmente asequible al trabajador experto en la técnica cada posible fragmento del polinucleótido completo. Esta descripción, por lo tanto, proporciona fragmentos de polinucleótidos que codifican NgR que comprenden al menos 6, y preferiblemente al menos 14, 16, 18, 20, 25, 50, o 75 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que codifica NgR. Preferiblemente, los fragmentos de polinucleótidos de esta descripción comprenden secuencias únicas para la secuencia de polinucleótidos que codifica NgR, y por lo tanto hibridan en condiciones muy restrictivas o moderadamente restrictivas solamente (esto es, "específicamente") con polinucleótidos que codifican NgR (o sus fragmentos). Los fragmentos de polinucleótidos o las secuencias genómicas de esta descripción comprenden no solamente secuencias únicas para la región codificante, si no que también incluyen fragmentos de la secuencia completa derivada de intrones, regiones reguladoras, y/o otras secuencias no traducidas. Las secuencias únicas para los polinucleótidos de esta descripción son reconocibles por medio de la comparación de secuencias con otros polinucleótidos conocidos, y pueden ser identificadas por medio del uso de programas de alineamiento utilizados rutinariamente en la técnica, p. ej., aquellos que se encuentran disponibles en las bases de datos de secuencias públicas. Tales secuencias también son reconocibles a partir de análisis de hibridación Southern para determinar el número de fragmentos de ADN genómico con los cuales hibridará un polinucleótido. Los polinucleótidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, pueden ser marcados de una manera que permita su detección, incluyendo el marcaje radiactivo, fluorescente y enzimático.

Los fragmentos de polinucleótidos son particularmente útiles como sondas para la detección de polinucleótidos completos o fragmentos de NgR. Se pueden incluir uno o más polinucleótidos en kits que se utilizan para detectar la presencia de un polinucleótido que codifica NgR, o se utilizan para detectar variaciones en una secuencia de polinucleótidos que codifica NgR.

Esta descripción también abarca los ADN que codifican polipéptidos de NgR que hibridan en condiciones moderadamente restrictivas o altamente restrictivas con la hebra no codificante, o complemento, del polinucleótido en cualquiera de los SEQ ID NO: 1 o 3.

Las condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias homólogas al menos en 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% entre sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en tampón con elevado contenido de sal que comprende 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 65ºC. Esta hibridación está seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, BSA al 0,01% a 50ºC. Una molécula de ácido nucleico aislada de esta descripción que hibrida en condiciones restrictivas con la secuencia de los SEQ ID NO: 1 o 3 corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Según se utiliza en la presente memoria, un molécula de ácido nucleico "de origen natural" hace referencia a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (p. ej., codifica una proteína natural). Según se utiliza en la presente memoria, "condiciones de hibridación restrictivas" significa: 42ºC en una solución de hibridación que comprende formamida al 50%, SDS al 1%, NaCl 1 M, sulfato de dextrano al 10% (p/v), y lavado dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución de lavado que comprende 0,1 X SSC y SDS al 1%.

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Vectores

Otro aspecto de la presente descripción está dirigido a vectores, o vectores de expresión recombinantes, que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas antes, p. ej., vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención. Los vectores se utilizan en la presente memoria para amplificar ADN o ARN que codifica NgR y/o para expresar ADN que codifica NgR. Según se utiliza en la presente memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual se han ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son susceptibles de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se han introducido (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) son integrados en el genoma de una célula anfitriona tras la introducción en la célula anfitriona, y de ese modo replican junto con el genoma del anfitrión. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se han unido operativamente. Tales vectores son referidos en la presente memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen a menudo forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. No obstante, se pretende que esta descripción y la invención incluyan otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus carentes replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven para funciones equivalentes.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo muy a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión y de no fusión. Los vectores de fusión añaden numerosos aminoácidos a una proteína codificada allí, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven típicamente para tres fines: (1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y (3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del radical de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del radical de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67, 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutation-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante
diana.

Los ejemplos de los vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69, 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZIMOLOGY 185, Academic Press, san Diego, CA. (1990) 60-89).

Una estrategia para maximizar la expresión de la proteína recombinante en E. coli consiste en expresar la proteína en bacterias anfitrionas con un deterioro de la capacidad para escindir proteolíticamente la proteína recombinante. Véase, Gottesmann, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZIMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990) 119-128. Otra estrategia consiste en alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión de manera que los codones individuales de cada aminoácido sean aquellos utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118). Semejante alteración de las secuencias de ácido nucleico de esta descripción se puede llevar a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otros casos, el vector de expresión de NgR es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de los vectores para su expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecI (Baldari, et al., (1987) EMBO J, 6, 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30, 933-943), pIRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54, 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativamente, NgR puede ser expresado en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus asequibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170, 31-39).

En otros casos, un ácido nucleico de esta descripción, p. ej., un ácido nucleico de la invención, es expresado en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de los vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329, 840) y pMT2PC (Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6, 187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control de los vectores de expresión son proporcionadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores utilizados comúnmente derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simios 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procarióticas y eucarióticas véanse, p. ej., los Capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., (Eds.) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

En otros casos, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo concreto de célula (p. ej., se utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejidos son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de los promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor de la albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1, 268-277), los promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235-275), en particular los promotores de los receptores de las células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) y las inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33, 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33, 741-748), los promotores específicos de neuronas (p. ej., el promotor del neurofilamento, Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230, 912-916), y promotores específicos de la glándula mamaria (p. ej., promotor del suero de la leche, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.873.316 y Publicación de la Solicitud Europea Núm. 264.166). También están incluidos los promotores regulados evolutivamente, p. ej., los promotores Hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249, 374-379) y el promotor de la \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3, 537-546).

La descripción proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de esta descripción clonado en el vector de expresión en orientación antisentido. Esto es, la molécula de ADN está unida operativamente a una secuencia reguladora de manera que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es ARNm de NgR antisentido. Se pueden elegir secuencias reguladoras unidas operativamente a un ácido nucleico clonado en orientación antisentido que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo promotores y/o intensificadores virales, o se pueden elegir secuencias reguladoras que dirijan constitutivamente la expresión específica del tejido o específica del tipo de célula del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en los cuales se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de elevada eficacia, cuya actividad puede estar determinada por el tipo de célula en la cual se introduce el vector. Para un estudio de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, REVIEWS-TRENDS IN GENETICS, Vol. 1(1) 1986.

Los vectores preferidos incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, fagos, cósmidos, episomas, partículas virales o virus y fragmentos de ADN integrables (esto es, fragmentos integrables en el genoma del anfitrión mediante recombinación homóloga). Las partículas virales preferidas incluyen, pero no están limitadas a, adenovirus, baculovirus, parvovirus, herpesvirus, poxvirus, virus adeno-asociados, virus de Semliki-Forest, virus vaccinia y retrovirus. Los vectores de expresión preferidos incluyen, pero no están limitados a, pcDNA3 (Invitrogen) y pSVL (Pharmacia Biotech). Otros vectores de expresión incluyen, pero no están limitados a, vectores pSPORT®, vectores pGEM® (Promega), vectores pPROEX® (LTI, Bethesda, MD), vectores Bluescript® (Stratagene), vectores pQE® (Qiagen), pSE420® (Invitrogen) y pYES2® (Invitrogen).

Los vectores de expresión preferidos son constructos de ADN replicables en los cuales una secuencia de ADN que codifica NgR está unida o conectada operablemente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión del NgR en un anfitrión adecuado. Las regiones de ADN están unidas o conectadas operablemente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, un promotor está unido o conectado operablemente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia. Los vectores de amplificación no requieren dominios de control de la expresión, en vez de ello necesitan solamente la capacidad de replicar en un anfitrión, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. La necesidad de secuencias de control en el vector de expresión variará dependiendo del anfitrión seleccionado y del método de transformación elegido. Generalmente, las secuencias de control incluyen, pero no están limitadas a un promotor transcripcional, intensificadores, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, señales de poliadenilación, una secuencia que codifique la unión ribosomal al ARN adecuada y secuencias que controlen la terminación de la transcripción y la traducción. Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, por Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY. METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula anfitriona y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células anfitrionas (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejidos). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de esta descripción pueden ser introducidos en las células anfitrionas para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos descritos en la presente memoria (p. ej., proteínas NgR, formas mutantes de NgR, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores preferidos contienen preferiblemente un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión. Las secuencias promotoras pueden ser procarióticas, eucarióticas o virales. Los ejemplos de las secuencias procarióticas adecuadas incluyen los promotores PR y PL del bacteriófago lambda (THE BACTERIOPHAGE LAMBDA, Hershey, A.D. (Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1973), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad, LAMBDA II, Hendrix, R.W. (Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad); los promotores trp, recA, de choque térmico, y lacZ de E. coli y el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., (1981) Nature 290, 304-310). Otros promotores incluyen, pero no están limitados a, virus de tumor mamario de ratón, larga repetición terminal del virus de la inmunodeficiencia humana, virus de Maloney, promotor temprano inmediato de citomegalovirus, virus Epstein Barr, virus de sarcoma de Rous, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y metalotioneína humana.

También se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales en los vectores preferidos. Los ejemplos preferidos de las secuencias reguladoras adecuadas están representados por la secuencia de Shine-Dalgarno del gen de la replicasa del fago MS-2 y del gen cII del bacteriófago lambda. La secuencia de Shine-Dalgarno puede estar seguida directamente por el ADN que codifica NgR y dar como resultado la expresión de la proteína NgR madura.

Por otra parte, los vectores de expresión adecuados pueden incluir un marcador apropiado que permita el escrutinio de las células anfitrionas transformadas. La transformación del anfitrión seleccionado se lleva a cabo utilizando uno cualquiera de los diferentes mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica y descritos por Sambrook et al., supra.

También se puede proporcionar un origen de replicación mediante la construcción de un vector que incluye un origen exógeno o se puede proporcionar mediante un mecanismo de replicación cromosómica de la célula anfitriona. Si el vector es integrado en el cromosoma de la célula anfitriona, puede ser suficiente lo último. Alternativamente, en lugar de utilizar vectores que contienen orígenes de replicación virales, un experto en la técnica puede transformar células de mamífero mediante el método de co-transformación con un marcador seleccionable y ADN de NgR. Un ejemplo de un marcador adecuado es la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.399.216).

Las secuencias de nucleótidos que codifican NgR pueden ser recombinadas con el ADN vector de acuerdo con las técnicas convencionales, incluyendo la formación de extremos romos o de extremos en bisel para la ligación, la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el rellenado de los extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar el empalme y la ligación no deseados con ligasas apropiadas. Los mecanismos para semejante manipulación son descritos por Sambrook et al., supra y son bien conocidos en la técnica. Los métodos para la construcción de vectores de expresión de mamífero son descritos, por ejemplo, por Okayama et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:280, Cosman et al. (1986) Mol. Immunol. 23:935, Cosman et al., (1984) Nature 312:768, documento EP-A-0367566, y documento WO 91/18982.

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Células Anfitrionas y Células Anfitrionas Transformadas

De acuerdo con otro aspecto de esta descripción y de la invención, se proporcionan células anfitrionas, incluyendo células procarióticas y eucarióticas, que comprenden un polinucleótido o un vector de esta descripción, p. ej. un polinucleótido de la invención o un vector de la invención de una manera que permita la expresión del polipéptido de NgR codificado. Preferiblemente, la célula produce poco o ningún polipéptido de NgR endógeno. Los polinucleótidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, pueden ser introducidos en la célula anfitriona como parte de un plásmido circular, o en forma de un ADN lineal que comprende una región codificante de una proteína aislada o un vector viral. Los métodos para introducir ADN en la célula anfitriona que son bien conocidos y puestos en práctica rutinariamente en la técnica incluyen la transformación, la transfección, la electroporación, la inyección nuclear, o la fusión con portadores tales como liposomas, micelas, células fantasma y protoplastos. Los sistemas de expresión de esta descripción, incluyendo los de la invención, incluyen sistemas de células bacterianas, de levadura, fúngicas, vegetales, de insectos, de invertebrados, de vertebrados y de mamíferos.

Las células anfitrionas de esta descripción, incluyendo las de la invención, son una fuente valiosa de inmunógeno para el desarrollo de anticuerpos específicamente inmunorreactivos con NgR. Las células anfitrionas de esta descripción, incluyendo las de la invención, también son útiles en métodos para la producción a gran escala de polipéptidos de NgR donde las células se desarrollan en un medio de cultivo adecuado y los productos polipeptídicos deseados se aíslan de las células, o del medio de cultivo en el que se desarrollan las células, mediante métodos de purificación conocidos en la técnica. p. ej., métodos cromatográficos convencionales incluyendo la cromatografía por inmunoafinidad, la cromatografía de afinidad de receptores, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de afinidad con lectina, la filtración de exclusión por tamaños, la cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC), la HPLC en fase reversa, y similares. Otros métodos similares de purificación incluyen aquellos métodos en los que la proteína deseada se expresa y purifica como proteína de fusión que tiene una etiqueta, marca o radical quelante especifico que es reconocido por un compañero de unión o agente específico. La proteína purificada puede ser escindida para producir la proteína deseada, o se puede dejar como una proteína de fusión intacta. La escisión del componente de fusión puede producir una forma de la proteína deseada que tiene residuos aminoácido adicionales como resultado del procedimiento de escisión.

El conocimiento de las secuencias de ADN de NgR permite la modificación de células para permitir, o incrementar, la expresión de NgR endógeno. Las células pueden ser modificadas (p. ej., mediante recombinación homóloga) para proporcionar un aumento de la expresión remplazando, en su totalidad o en parte, el promotor de NgR de origen natural con todo o parte de un promotor heterólogo de manera que las células expresen NgR a niveles superiores. El promotor heterólogo es insertado de tal manera que está unido operativamente a secuencias que codifican NgR endógeno. (Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT Núm. WO 94/12650, la Publicación Internacional PCT Núm. WO 92/20808, y la Publicación Internacional PCT Núm. WO 91/09955). También se contempla que, además del ADN del promotor heterólogo, se pueda insertar ADN marcador amplificable (p. ej., ada, dhfr, y el gen CA multifuncional que codifica la carbamoil-fosfato sintasa, la aspartato transcarbamilasa, y la dihidroorotasa) y/o ADN intrónico junto con el ADN del promotor heterólogo. Si se une a la secuencia codificante de NgR, la amplificación del ADN marcador mediante métodos de selección convencionales da como resultado la co-amplificación de las secuencias que codifican NgR en las células.

La información de la secuencia de ADN proporcionada por la presente descripción también hace posible el desarrollo (p. ej., mediante recombinación homóloga o estrategias de "desactivación génica"; véase Capecci, Science 244:1288-1292 (1989)) de animales que no logran expresar el NgR funcional o que expresan una variante de NgR. Tales animales (especialmente animales pequeños de laboratorio tales como ratas, conejos y ratones) son útiles como modelos para estudiar las actividades in vivo de NgR y de los moduladores de NgR.

Las células anfitrionas adecuadas para la expresión de los polipéptidos de esta descripción, incluyendo los polipéptidos de la invención, incluyen, pero no están limitados a, procariotas, levaduras, y eucariotas. Si se emplea un vector de expresión procariótico, la célula anfitriona apropiada puede ser cualquier célula procariótica capaz de expresar las secuencias clonadas. Las células procarióticas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

Si se emplea un vector de expresión eucariótico, la célula anfitriona apropiada sería una célula eucariótica capaz de expresar la secuencia clonada. Preferiblemente, las células eucarióticas son células de eucariotas superiores. Las células eucarióticas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células de cultivos de tejidos de mamíferos no humanos y células de cultivos de tejidos humanos. Las células anfitrionas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, células de insecto, células HeLa, células de ovario de hámster Chino (células CHO), células de riñón de mono verde Africano (células COS), células 293 humanas, y fibroblastos 3T3 murinos. La propagación de tales células en cultivo celular se ha vuelto un procedimiento rutinario (véase, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, Eds. (1973).

Además, se puede emplear una célula de levadura como célula anfitriona. Las células de levadura preferidas incluyen, pero no están limitadas a, los géneros Saccharomyces, Pichia y Kluiveromyces. Los anfitriones de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris. Los vectores de levadura preferidos pueden contener una secuencia de un origen de replicación de un plásmido de levadura 2T, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Los vectores lanzadera para la replicación tanto en levadura como en E. coli también están incluidos en la presente memoria.

Alternativamente, se pueden utilizar células de insecto como células anfitrionas. En un caso preferido, los polipéptidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, se expresan utilizando un sistema de expresión de baculovirus (véase, Luckow et al., Bio/Technology, 1988, 6, 47; BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, O'Rielly et al. (Eds.), W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1992; y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.879.236. Además, se puede utilizar el sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC® (Invitrogen), por ejemplo, para la producción en células de insecto.

Las células anfitrionas adecuadas son comentadas adicionalmente por Goeddel en GENE EXPRESISION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotoras de T7 y la polimerasa de T7.

El ADN vector puede ser introducido en células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Según se utilizan en la presente memoria, se pretende que los términos "transformación" y "transfección" hagan referencia a una variedad de mecanismos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (p. ej., ADN) en una célula anfitriona, incluyendo la co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección, o la electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a antibióticos) en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Los diferentes marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, dihidrofolato reductasa (DHFR) y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula anfitriona del mismo vector que codifica NgR o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas mediante selección con fármacos (p. ej., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras la otras células morirán).

En un caso preferido, los polipéptidos de esta descripción, incluyendo las formas de NgR2 y NgR3, las formas solubles de NgR, los polipéptidos de NgR quiméricos, las fusiones NgR/Ig y los fragmentos y variaciones de cada uno de los anteriores se expresan en células de ovario de hámster Chino (CHO).

Con el fin de introducir el fragmento de ADN que codifica la proteína o el polipéptido de NgR en células CHO para expresar la proteína o polipéptido de NgR recombinante, es necesario construir el vector de expresión.

Los vectores para la expresión en CHO incluyen, pero no están limitados a, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV y pcDNAINeo. El promotor no está específicamente limitado siempre que promueva eficazmente la expresión en células CHO. Los ejemplos de los promotores adecuados son: SR\alpha, SV40, LTR, CMV, y HSV-TK. De estos, se prefieren los promotores CMV y Sr\alpha.

Además de los promotores mencionados antes, los vectores de expresión pueden contener intensificadores, señales de empalme, señales de poliadenilación, marcadores seleccionables y un origen de replicación de SV40. Los marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no están limitados al gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) que proporciona resistencia al metotrexato (MTX), el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la neomicina.

Los ejemplos de los vectores de expresión que contienen cada uno el ADN que codifica NgR, sus porciones, fragmentos y constructos solubles, incluyen el vector (tal como el descrito antes), en el cual el promotor está unido operablemente (preferiblemente aguas arriba) a la secuencia de nucleótidos que codifica el constructo de NgR deseado; una señal de poliadenilación aguas abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el constructo de NgR; y, preferiblemente, el vector incluye un gen DHFR operable. Preferiblemente, el gen de resistencia a la ampicilina también está contenido operablemente en el vector.

Las células CHO que carecen del gen DHFR (Urlaub, G. et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220) y CHO-K1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1275 (1968)) son adecuadas para su uso.

Los vectores de expresión de NgR preparados como antes son introducidos en células CHO mediante cualquier método conocido, incluyendo, pero no limitado al método con fosfato de calcio (Graham y van der Eb (1973) Virol. 52, 456-467) y la electroporación (Nuemann et al., (1982) EMBO J. 1, 841-845).

Los transformantes que portan los vectores de expresión se seleccionan basándose en los marcadores seleccionables mencionados antes. La selección clónica repetida de los transformantes utilizando los marcadores seleccionables permite la selección de líneas celulares estables que tienen una elevada expresión de los constructos de NgR. El aumento de las concentraciones de MTX en el medio de selección permite la amplificación génica y una mayor expresión de la proteína deseada. Las células CHO que contienen NgR recombinante pueden ser producidas cultivando células CHO que contienen los vectores de expresión NR que expresan constitutivamente los constructos de NgR.

Los medios utilizados en el cultivo de células CHO incluyen medio DMEM con un suplemento de aproximadamente 0,5 a 20% de suero de ternera fetal, medio DMEM y medio RPMI1640. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6 a 8. El cultivo se realiza aproximadamente a 30-40ºC durante aproximadamente 15 a 72 horas con aireación.

Se puede utilizar una célula anfitriona de esta descripción, p. ej., una célula anfitriona de la invención, tal como una célula anfitriona procariótica o eucariótica en cultivo, para producir (esto es expresar) la proteína de NgR. Por consiguiente, la descripción proporciona adicionalmente métodos para producir proteína de NgR utilizando las células anfitrionas de esta descripción. En un caso, el método comprende cultivar la célula anfitriona de esta descripción (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica NgR), p. ej., una célula anfitriona de la invención, en un medio adecuado de manera que se produzca la proteína de NgR. En otro caso, el método comprende adicionalmente aislar NgR del medio o de la célula anfitriona.

En situaciones en las que el polipéptido de NgR se encuentra principalmente intracelularmente, se puede extraer el material intracelular (incluyendo los cuerpos de inclusión para las bacterias Gram-negativas) de la célula anfitriona utilizando cualquier mecanismo convencional conocido por un experto normal en la técnica. Tales métodos abarcarían, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, la lisis de las células anfitrionas para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma mediante prensa French, homogeneización y/o sonicación seguido de centrifugación.

Si el polipéptido de NgR ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, tales cuerpos de inclusión se pueden unir frecuentemente a las membranas celulares internas y/o externas. Tras la centrifugación, los cuerpos de inclusión se encontrarán principalmente en el sedimento. El sedimento se puede tratar después a pH extremos o con uno o más agentes caotrópicos tales como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. Una vez solubilizado, el polipéptido de NgR puede ser analizado utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similar. Los diversos métodos de aislamiento del polipéptido de NgR serán evidentes para un experto en la técnica, por ejemplo, el aislamiento se puede completar utilizando métodos convencionales tales como aquellos mostrados más abajo y por Marston et al (1990) Meth. Enzymol. 182, 264-275.

Si el polipéptido de NgR aislado no es biológicamente activo después del procedimiento de aislamiento empleado, se pueden utilizar diferentes métodos para "replegar" o convertir el polipéptido en su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro, para restaurar la actividad biológica. Los métodos conocidos por un experto en la técnica incluyen ajustar el pH del polipéptido solubilizado a un pH normalmente por encima de 7 y en presencia de una concentración concreta de un caotropo. La selección del caotropo es muy similar a las selecciones utilizadas para la solubilización el cuerpo de inclusión pero normalmente a una concentración más baja y no es necesariamente el mismo caotropo utilizado para la solubilización. Se puede requerir el empleo de un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada a una razón específica, para generar un potencial redox concreto que permita que se produzca el barajado del disulfuro en la formación de los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox comúnmente utilizados incluyen cisteína/cistamina, glutation (GSH/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME/ditio-b(ME). Para incrementar la eficacia del replegamiento, puede ser necesario emplear un co-disolvente, tal como glicerol, polietilenglicol de diferentes pesos moleculares y arginina.

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Animales Transgénicos

Las células anfitrionas de esta descripción, incluyendo las de la invención, se pueden utilizar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en un caso, una célula anfitriona de esta descripción es un oocito fertilizado o una célula troncal embrionaria en la cual se han introducido secuencias codificantes de NgR. Tales células anfitrionas se pueden utilizar después para crear animales transgénicos no humanos en los cuales se han introducido secuencias de NgR exógenas en su genoma o animales recombinantes homólogos en los cuales han sido alteradas las secuencias de NgR endógenas. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de NgR y para identificar y/o evaluar los moduladores de la actividad de NgR. Según se utiliza en la presente memoria, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el cual una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es un ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Según se utiliza en la presente memoria, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que un gen de NgR endógeno ha sido alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógeno introducida en una célula del animal, p. ej., una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Se puede crear un animal transgénico de esta descripción introduciendo el ácido nucleico que codifica NgR en los pronúcleos macho de un oocito fertilizado, p. ej., mediante microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal hembra adoptivo pseudopreñado. La secuencia de ADN de NgR humano de los SEQ ID NO: 1 o 3 se puede introducir como transgén en el genoma de un animal no humano. Alternativamente, se puede aislar un homólogo no humano del gen NgR humano, tal como un gen NgR de ratón, basándose en la hibridación con el ADNc de NgR humano (descrito adicionalmente más arriba) y utilizarlo como transgén. Las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación también se pueden incluir en el transgén para incrementar la eficacia de la expresión del transgén. Se pueden unir operablemente una o varias secuencias reguladoras específicas del tejido al transgén de NgR para dirigir la expresión de la proteína de NgR a células concretas. Los métodos para generar animales transgénicos por medio de la manipulación del embrión y la microinyección, concretamente animales tales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.736.866; 4.870.009; y 4.873.191; y Hogan 1986, en MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Se utilizan métodos similares para la producción de otros animales transgénicos. Se puede identificar un animal transgénico fundador basándose en la presencia del transgén de NgR en su genoma y/o en la expresión del ARNm de NgR en los tejidos o células de los animales. Después se puede utilizar un animal transgénico fundador para engendrar más animales que porten el transgén. Por otra parte, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica NgR pueden ser engendrados con otros animales transgénicos que portan otros transgenes.

Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen NgR en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar de ese modo, p. ej., desorganizar funcionalmente, el gen NgR. El gen NgR puede ser un gen humano (p. ej., SEQ ID NO: 1 o 13), pero más preferiblemente, es un homólogo no humano de un gen NgR humano. Por ejemplo, se puede utilizar un homólogo de ratón del gen NgR humano de los SEQ ID NO: 1 o 13 para construir un vector de recombinación homólogo adecuado para alterar un gen NgR endógeno en el genoma de ratón. En un caso, el vector es diseñado de manera que, tras la recombinación homóloga, el gen NgR endógeno es desorganizado funcionalmente (esto es, ya no codifica una proteína funcional; también referido como vector "desactivado").

Alternativamente el vector puede ser diseñado de manera que, tras la recombinación homóloga, el gen NgR endógeno muta o se altera de otro modo pero todavía codifica una proteína funcional (p. ej., la región reguladora aguas arriba puede ser alterada para alterar de ese modo la expresión de la proteína de NgR endógena). En el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen NgR está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por más ácido nucleico del gen NgR para permitir que se produzca la recombinación homóloga entre el gen NgR exógeno portado por el vector y un gen NgR endógeno en la célula troncal embrionaria. El ácido nucleico de NgR colindante adicional tiene una longitud suficiente para una recombinación homóloga satisfactoria con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN colindante (en los extremos tanto 5' como 3'). Véase p. ej., Thomas et al. (1987) Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homólogos. El vector es introducido en una línea de células troncales embrionarias (p. ej., mediante electroporación) y las células en las cuales el gen NgR introducido se ha recombinado homólogamente con el gen NgR endógeno se seleccionan (véase p. ej., Li et al., (1992) Cell 69:915).

Las células seleccionadas son inyectadas después en un blastocisto de un animal (p. ej., un ratón) para formar quimeras de agregación. Véase p. ej., Bradley 1987, En: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A Practical Approach, Robertson, ed. IRL, Oxford, págs. 113-152. Después se puede implantar un embrión quimérico en un animal adoptivo hembra pseudopreñado adecuado y llevar el embrión a término. La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede utilizar para engendrar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente por transmisión de la línea germinal del transgén. Los métodos para construir vectores de recombinación homóloga y animales recombinantes homólogos son descritos adicionalmente por Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-829; Publicaciones Internacionales PCT Núms.: WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968; y WO 93/04169.

En otro caso, se pueden producir animales transgénicos no humanos que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de semejante sistema es el sistema cre/loxP recombinasa del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema cre/loxP recombinasa véase, p. ej., Lakso et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Otro ejemplo de sistema recombinasa es el sistema FLP recombinasa de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355. Si se utiliza un sistema cre/loxO recombinasa para regular la expresión del transgén, se requieren animales que contengan transgenes que codifiquen tanto la Cre recombinasa como la proteína seleccionada. Tales animales pueden ser proporcionados por medio de la construcción de animales transgénicos "dobles", p. ej., apareando dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que codifica una proteína seleccionada y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa.

Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en la presente memoria también pueden ser producidos de acuerdo con los métodos descritos por Wilmut et al., (1997) Nature 385:810-813. En resumen, se puede aislar una célula, p. ej., una célula somática del animal transgénico e inducirla a salir del ciclo de crecimiento y entrar en la fase G_{0}. La célula quiescente se puede fusionar después, p. ej., por medio del uso de pulsos eléctricos, con un oocito enucleado de un animal de la misma especie de la que se ha aislado la célula quiescente. El oocito reconstruido se cultiva después de manera que se desarrolla hasta una mórula o blastocito y después se transfiere a un animal adoptivo hembra pseudopreñado. El vástago nacido de este animal adoptivo hembra será un clon del animal del cual se aísla la célula, p. ej., la célula somática.

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Antisentido

Esta descripción también proporciona polinucleótidos antisentido que reconocen e hibridan con los polinucleótidos de NgR. Se proporcionan polinucleótidos antisentido completos y fragmentos. Las moléculas antisentido en fragmentos de esta descripción incluyen (i) aquellas que reconocen e hibridan específicamente con ARN de NgR (como se determina mediante comparación de la secuencia del ADN que codifica NgR con el ADN que codifica otras moléculas conocidas). La identificación de secuencias únicas de polinucleótidos que codifican NgR puede ser deducida por medio del uso de cualquiera de las bases de datos disponibles al público, y/o por medio del uso de programas de comparación de secuencias asequibles comercialmente. Tras la identificación de las secuencias deseadas, se puede realizar el aislamiento a través de la digestión con enzimas de restricción o la amplificación utilizando cualquiera de los diferentes mecanismos de reacción en cadena de la polimerasa bien conocidos en la técnica. Los polinucleótidos antisentido son particularmente relevantes para regular la expresión de NgR por aquellas células que expresan el ARNm de NgR.

Los oligonucleótidos antisentido, o los fragmentos de una secuencia de nucleótidos mostrada en los SEQ ID NO: 1, 3, 13 o secuencias complementarias u homólogas a estas, derivados de las secuencias de nucleótidos de la presente descripción que codifican NgR son útiles como herramientas de diagnóstico para sondear la expresión génica en diferentes tejidos. Por ejemplo, se puede sondear un tejido in situ con sondas oligonucleotídicas que portan grupos detectables mediante técnicas de autorradiografía convencionales para investigar la expresión nativa de esta enzima o de condiciones patológicas relacionadas con ella. En aspectos específicos, se proporcionan moléculas de ácido nucleico antisentido que comprenden una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 10, 25, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos o una hebra codificante de NgR completa, o solamente a una de sus porciones. Adicionalmente se proporcionan las moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos, homólogos, derivados y análogos de una proteína de NgR de los SEQ ID NO: 2, 4 o 14 o ácidos nucleicos antisentido complementarios a una secuencia de ácido nucleico de NgR de los SEQ ID NO: 1, 3 o 13.

En un caso, una molécula de ácido nucleico antisentido, es antisentido con respecto a una "región codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica NgR. El término "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucléotidos que comprende los codones que se traducen a residuos aminoácido (p. ej., la región codificante de la proteína de NgR humano corresponde a las regiones codificantes de los SEQ ID NO: 1, 3 o 13). En otro caso, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica NgR. El término "región no codificante" hace referencia a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no son traducidas a aminoácidos (esto es, también referidas como regiones no traducidas 5' y 3').

Los oligonucleótidos antisentido están dirigidos preferiblemente a regiones reguladoras de una secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 o 13 o el ARNm correspondiente a estas, incluyendo, pero no limitadas a, el codón de iniciación, la caja TATA, las secuencias intensificadoras, y similares. Dadas las secuencias de la hebra codificante que codifican el NgR descrito en la presente memoria (p. ej., los SEQ ID NO: 1, 3 o 13), se pueden diseñar ácidos nucleicos antisentido de esta descripción de acuerdo con las normas del emparejamiento de bases de Watson y Crick o Hoogsteen. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante completa del ARNm de NgR, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido solamente con respecto a una porción de la región codificante o no codificante del ARNm de NgR. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región circundante del sitio de inicio de la traducción del ARNm de NgR. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucléotidos de longitud. Se puede construir un ácido nucleico antisentido de esta descripción utilizando la síntesis química o reacciones de ligación enzimática empleando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (p. ej., un oligonucleótido antisentido) utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos diferentemente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y efector, p. ej., se pueden utilizar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina.

Los ejemplos de los nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen: 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (esto es, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado estará en orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de esta descripción (preferiblemente oligonucleótidos de 10 a 20 nucleótidos de longitud) se administran típicamente a un sujeto o se generan in situ de manera que hibriden con o se unan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína de NgR para inhibir de ese modo la expresión de la proteína, p. ej., inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La supresión de la expresión de NgR a nivel transcripcional o traduccional es útil para generar modelos celulares o animales para enfermedades/afecciones caracterizadas por la expresión aberrante de NgR. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se una a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice.

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Se contemplan específicamente los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato y metilfosfonato para su uso terapéutico. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser modificados adicionalmente añadiendo poli-L-lisina, transferrin-polilisina o radicales colesterol en su extremo 5'.

Un ejemplo de una ruta de administración de las moléculas de ácido nucleico antisentido de la descripción incluye la inyección directa en un sitio de un tejido. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ser modificadas para dirigirlas a las células seleccionadas y después administradas sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, se pueden modificar moléculas antisentido de manera que se unan específicamente a los receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, p. ej., conectando las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también se pueden liberar en las células utilizando los vectores descritos antes. Para lograr concentraciones intracelulares de moléculas antisentido suficientes, se prefieren constructos de vectores en los cuales se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte.

En otro caso más, la molécula de ácido nucleico antisentido de esta descripción es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos de doble hebra específicos con el ARN complementario en el que, al contrario que en la unidades \beta habituales, las hebras corren paralelas entre sí (Gaultier et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15, 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

Las secuencias de NgR ilustradas en la presente descripción, incluyendo las de la invención, facilitan el diseño de factores de transcripción novedosos para modular la expresión de NgR en células nativas y animales, y células transformadas o transfectadas con los polinucleótidos de NgR. Por ejemplo, se ha demostrado que las proteínas en dedo de zinc Cys_{2}-His_{2}, que se unen al ADN a través de sus dominios en dedo de zinc, son susceptibles de cambios estructurales que conducen al reconocimiento de diferentes secuencias diana. Estas proteínas en dedo de zinc artificiales reconocen sitios diana específicos con una elevada afinidad y constantes de disociación bajas, y son capaces de actuar como interruptores génicos para modular la expresión génica. El conocimiento de la secuencia diana de NgR concreta de la presente descripción facilita el diseño de proteínas en dedo de zinc específicas para la secuencia diana utilizando métodos conocidos tales como una combinación de modelado basado en la estructura y escrutinio de genotecas de presentación en fagos (Segal et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 2758-2763; Liu et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530; Greisman et al. (1997) Science 275, 657-661; Choo et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 525-532). Cada dominio en dedo de zinc reconoce normalmente tres o más pares de bases. Puesto que un sitio de reconocimiento de 18 pares de bases tiene generalmente una longitud suficiente para hacerlo único en cualquier genoma conocido, cabría esperar que una proteína en dedo de zinc que consiste en 6 repeticiones en tándem de dedos de zinc aseguraría una especificidad por una secuencia concreta (Segal et al., (1999), más arriba). Las repeticiones en dedos de zinc artificiales, diseñadas basándose en el promotor de las secuencias de NgR, se fusionan a los dominios de activación o represión para promover o suprimir la expresión de NgR (Liu et al., (1997), más arriba). El promotor de NgR se puede obtener mediante métodos convencionales conocidos por un experto en la técnica con la descripción contenida en la presente memoria y el conocimiento de la secuencia de NgR. Alternativamente, los dominios en dedo de zinc se pueden fusionar a la caja TATA-factor de unión (TBP) con longitudes variables de la región conectora entre el péptido en dedo de zinc y el TBP para crear activadores o represores transcripcionales (Kim et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3616-3620. Tales proteínas y los polinucleótidos que las codifican, tienen utilidad para modular la expresión de NgR in vivo en células nativas, animales y humanas; y/o en células transfectadas con secuencias codificantes de NgR. El factor de transcripción novedoso puede ser liberado en las células diana transfectando los constructos que expresan el factor de transcripción (terapia génica), o introduciendo la proteína. Las proteínas en dedo de zinc diseñadas también pueden ser estructuradas para unirse a secuencias de ARN para su uso en agentes terapéuticos como alternativa a los métodos con ARN antisentido o catalítico (McColl et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9521-9526); Wu et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344-348). La presente descripción contempla métodos de diseño de tales factores de transcripción basados en la secuencia génica de la descripción, así como de proteínas en dedo de zinc a la medida, que son útiles para modular la expresión de NgR en las células (nativas o transformadas) cuyo complemento genético incluye estas secuencias.

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Ribozimas y Radicales PNA

En otro caso más, el ácido nucleico antisentido de esta descripción es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de hebra sencilla, tal como un ARNm, para el cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (p. ej., las ribozimas cabeza de martillo, descritas por Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden ser utilizadas para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm de NgR para inhibir de ese modo la traducción del ARNm de NgR. Se puede diseñar una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica NgR basándose en la secuencia de nucleótidos de un ADN de NgR descrito en la presente memoria (esto es, SEQ ID NO: 1, 3 o 13). Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de Tetrahymena L-19 IVS en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se va a escindir en un ARNm que codifica NgR. Véase, p. ej., Cech et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 4.987.071; y Cech et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5.116.742. Alternativamente, se puede utilizar ARNm de NgR para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad ribo-
nucleasa específica de una reserva de moléculas de ARN. Véase, p. ej., Bartel et al., (1993) Science 261, 1411-1418.

Alternativamente, la expresión del gen NgR puede ser inhibida dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora del NgR (p. ej., el promotor y/o los intensificadores de NgR) para formar estructuras de triple hélice que eviten la transcripción del gen NgR en las células diana. Véase en general, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6: 569-584; Helene et al., (1992) Am. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) BioEssays 14,
807-815.

En diferentes casos, los ácidos nucleicos de NgR pueden ser modificados en el radical de la base, el radical azúcar o el esqueleto de fosfato para mejorar, p. ej., la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de desoxirribosa fosfato de los ácidos nucleicos puede ser modificado para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup et al., (1996) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 5-23). Según se utilizan en la presente memoria, los términos "ácidos péptidonucleicos" o "PNA" hacen referencia a miméticos de ácido nucleico, p. ej., miméticos de ADN, en los cuales el esqueleto de la desoxirribosa fosfato es remplazado por un esqueleto pseudopeptídico y solamente se conservan las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutro de los PNA permite la hibridación específica con el ADN y el ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de los oligómeros de PNA se puede realizar utilizando protocolos de síntesis peptídica en fase sólida convencionales como describen Hyrup et al., (1996) más arriba; Perry-O'Keefe et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 14670-14675.

Se pueden utilizar PNA de NgR en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, se pueden utilizar PNA como agentes antisentido o antigénicos para la modulación específica de la secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o la traducción o la inhibición de la replicación. Los PNA de NgR también pueden ser utilizados, p. ej., en el análisis de mutaciones de pares de bases individuales en un gen, p. ej., mediante fijación de PCR dirigida por PNA, como enzimas de restricción artificiales cuando se utilizan combinados con otras enzimas, p. ej., nucleasas S1 (Hyrup (1996), más arriba); o como sondas o cebadores para la secuencia e hibridación de ADN (Hyrup et al., (1996), más arriba; Perry-O'Keefe 81996), más arriba).

En otro caso, los PNA de NgR pueden ser modificados, p. ej., para intensificar su estabilidad o absorción celular, anclando grupos coadyuvantes lipofílicos u otros a PNA, mediante la formación de quimeras de PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otros mecanismos de liberación de fármacos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar quimeras de PNA-ADN de NgR que pueden combinar las propiedades ventajosas de los PNA y los ADN. Tales quimeras permiten que las enzimas de reconocimiento del ADN, p. ej., la ARNasa H y las ADN polimerasas, interaccionen con la porción de ADN mientras la porción del PNA proporcionaría una elevada afinidad y especificidad de unión. Las quimeras de PNA-ADN pueden ser conectadas utilizando conectores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de bases, número de enlaces entre las nucleobases, y la orientación (Hyrup (1996), más arriba). La síntesis de quimeras de PNA-ADN se puede realizar como describe Hyrup (1996), más arriba y Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 3357-3363. Por ejemplo, se puede sintetizar una cadena de ADN sobre un soporte sólido utilizando la química de acoplamiento de la fosforamidita convencional, y se pueden utilizar análogos nucleosídicos modificados, p. ej., 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidino-fosforamidita entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 973-988). Los monómeros de PNA se acoplan después por etapas para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' (Finn et al. (1996), más arriba). Alternativamente, se pueden sintetizar moléculas quiméricas con un segmento de ADN 5' y un segmento de PNA 3'. Véase, Peterson et al. (1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:
1119-1124.

En otros casos, los oligonucleótidos pueden incluir otros grupos agregados tales como péptidos (p. ej., para dirigir los receptores de la célula anfitriona in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; Lemaitre et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652; Publicación PCT Núm. WO 88/09810) o la barrera hemato-encefálica (véase, p. ej., la Publicación PCT Núm. WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con sitios de escisión provocados por la hibridación (véase, p. ej., Krol et al., (1988) Biotechniques 6, 958-976) o agentes intercaladores (véase, p. ej., Zon (1988) Pharm. Res. 5, 539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede ser conjugado con otra molécula, p. ej., un péptido, un agente de entrecruzamiento provocado por la hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión provocado por la hibridación.

Se pueden utilizar métodos de secuenciación automatizados para obtener o verificar la secuencia de nucleótidos de NgR. Se cree que las secuencias de los nucleótidos de NgR de esta descripción, incluyendo los de la presente invención, son 100% exactas. No obstante, como es sabido en la técnica, la secuencia de nucleótidos obtenida mediante métodos automatizados puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas con automatización son típicamente idénticas al menos aproximadamente en 90%, más típicamente al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% a la secuencia de nucleótidos real de una molécula de ácido nucleico dada. La secuencia real puede ser determinada más precisamente utilizando métodos de secuenciación manual, que son bien conocidos en la técnica. Un error en una secuencia que da como resultado una inserción o deleción de uno o más nucleótidos puede producir un desplazamiento del marco en la traducción de manera que la secuencia de aminoácidos pronosticada diferirá de la que cabría pronosticar a partir de la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ácido nucleico, empezando en el punto de la mutación.

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Polipéptidos

Esta descripción también proporciona polipéptidos de NgR de mamífero purificados y aislados codificados por un polinucleótido de esta descripción. En la actualidad se prefiere un polipéptido de NgR humano que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 o el SEQ ID NO: 14. Otro caso preferido es un polipéptido de NgR de ratón que comprende la secuencia de aminoácidos de NgR3, como se muestra en el SEQ ID NO: 4.

Los polipéptidos de esta descripción que proporcionan los polipéptidos de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de esta descripción está relacionado con proteínas de NgR aisladas, y sus porciones biológicamente activas, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos. También se proporcionan fragmentos polipeptídicos adecuados para su uso como inmunógenos para originar anticuerpos anti-NgR. Preferiblemente, los fragmentos de las proteínas de NgR comprenden al menos una actividad biológica de NgR. En un caso, se pueden aislar proteínas de NgR nativas de fuentes de células o tejidos mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otro caso, se producen proteínas de NgR mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente una proteína o polipéptido de NgR utilizando técnicas de síntesis peptídica convencionales.

La descripción también incluye polipéptidos que tienen una identidad y/o homología de al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, al menos 50% o al menos 45% con el polipéptido preferido de la descripción. Además, la descripción incluye polipéptidos que tienen la secuencia consenso mostrada en el SEQ ID NO: 6, mostrado en la Tabla 5) excluyendo el NgR caracterizado previamente ("NgR1"), y polipéptidos que comprenden al menos aproximadamente 90% de la secuencia consenso.

El término "porcentaje de identidad de la secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de esa región de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales existe una base del ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U, o I, en el caso de los ácidos nucleicos) en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posición de la región de comparación (esto es, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia. El término "identidad sustancial" según se utiliza en la presente memoria indica una característica de una secuencia de polinucleótidos, donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 85 por ciento y a menudo una identidad de secuencia de 90 a 95 por ciento, más normalmente una identidad de secuencia de al menos 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de la región de comparación.

En un aspecto, el porcentaje de homología se calcula como el porcentaje de residuos aminoácido en la más pequeña de las dos secuencias que se alinean con residuos aminoácido idénticos en la secuencia que se está comparando, cuando se pueden introducir cuatro espacios en una longitud de 100 aminoácidos para maximizar el alineamiento (Dayhoff, en ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, Vol. 5, pág. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972).

Típicamente se realiza una determinación de la homología o identidad por medio de un programa de homología computarizado conocido en la técnica. Un programa ilustrativo es el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) utilizando los ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). Empleando el soporte lógico GAP proporcionado en el paquete de programas GCG, (véase Neddelman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453) se pueden utilizar los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de ácido nucleico: penalización de la creación GAP de 5,0 y penalización de la extensión GAP de 0,3, la región codificante de las secuencias de ácido nucleico análogas referidas antes muestra preferiblemente un grado de identidad de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99%, con la porción CDS (codificante) de la secuencia de ADN mostrada en los SEQ ID NO: 1, 3 o 13. BestFit fue redactado originalmente para la Versión 1.0 por Paul Haeberli a partir de una lectura cuidadosa de las publicaciones de Needleman y Wunsch (1970), más arriba, y Smith y Waterman (1981), más arriba. Se pueden utilizar los siguientes ajustes Bestfit para la comparación de las secuencias de ácido nucleico: penalización de la creación de GAP de 8,0 y penalización de la extensión del GAP de 2, la región codificante de las secuencias de ácido nucleico análogas referida antes muestra preferiblemente un grado de identidad de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la porción CDS (codificante) de la secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NO: 2, 4 o 14.

Alternativamente, la homología se puede determinar mediante análisis de hibridación en el que la secuencia de ácido nucleico es hibridada con el complemento de una secuencia que codifica las proteínas mencionadas antes en condiciones restrictivas, moderadamente restrictivas, o poco restrictivas. Véase, p. ej., Ausubel, et al., (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1993, y más abajo.

Los polipéptidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, pueden ser aislados de fuentes de células naturales o pueden ser sintetizados químicamente, pero preferiblemente se producen mediante procedimientos recombinantes que implican a las células anfitrionas de esta descripción, p. ej., células anfitrionas de la invención.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una de sus porciones biológicamente activas se encuentra esencialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejidos de la cual deriva la proteína de NgR, o esencialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína de NgR en las cuales la proteína está separada de los componentes celulares de las células de las cuales ésta se aísla o se produce recombinantemente. En un caso, la expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína de NgR que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína distinta de NgR (también referida en la presente memoria como "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de proteína distinta de NgR, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de proteína distinta de NgR, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% de proteína distinta de NgR. Cuando la proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas se produce recombinantemente, también se encuentra preferiblemente esencialmente libre de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos" incluye las preparaciones de proteína de NgR en las cuales la proteína se separa de los precursores químicos u otros agentes químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En un caso, la expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos" incluye preparaciones de proteína de NgR que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o agentes químicos distintos de NgR, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o agentes químicos distintos de NgR, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o agentes químicos distintos de NgR, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o agentes químicos distintos de NgR.

Las porciones biológicamente activas de una proteína de NgR incluyen péptidos que comprende secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína de NgR, p. ej., las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 2, 4 o 14 que incluyen menos aminoácidos que las proteínas de NgR completas, y muestran al menos una actividad de una proteína de NgR. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína de NgR. Una porción biológicamente activa de un proteína de NgR puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud.

Una porción biológicamente activa de una proteína de NgR de esta descripción, p. ej., una proteína de NgR de la presente invención, puede contener al menos una de las características que se conservan entre las proteínas de NgR (p. ej., una cisteína conservada como extremo N de la proteína madura, cuatro cisteínas conservadas en el extremo N antes de la región rica en leucina, cuatro cisteínas C terminales conservadas con respecto a una región de repeticiones de leucina, ocho repeticiones ricas en leucina, y un extremo C hidrófobo). Una porción biológicamente activa alternativa de una proteína de NgR puede contener al menos dos de los dominios identificados antes. Otra porción biológicamente activa de una proteína de NgR puede contener al menos tres de los dominios identificados antes. Otra porción más biológicamente activa de una proteína de NgR de esta descripción, p. ej., de una proteína de NgR de la presente invención, puede contener al menos cuatro de los dominios identificados antes.

Por otra parte, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las que están suprimidas otras regiones de la proteína, mediante técnicas recombinantes y evaluarlas en busca de una o más de las actividades funcionales de una proteína de NgR nativa.

En un caso, la proteína de NgR tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NO: 2, 4 o 14. En otros casos, la proteína de NgR es esencialmente homóloga a los SEQ ID NO: 2, 4 o 14 y conserva la actividad funcional de la proteína de los SEQ ID NO: 2, 4 y 14, aunque difiere en la secuencia de aminoácidos debido a una variación alélica natural o mutagénesis, como se describe con detalle más abajo.

Por consiguiente, en otro caso, la proteína de NgR es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos homóloga al menos en aproximadamente 45% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o el SEQ ID NO: 4 o el SEQ ID NO: 14 y conserva la actividad funcional de las proteínas de NgR de los SEQ ID NO: 2, 4 o 14.

Se espera que el uso de células anfitrionas de mamífero proporcione tantas modificaciones post-traduccionales (p. ej., glicosilación, truncamiento, lipidación y fosforilación) como sean necesarias para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinantes de esta descripción, incluyendo los de la invención. Las formas glicosiladas y no glicosiladas de los polipéptidos de NgR están incluidos en esta descripción y en la invención.

La descripción también incluye polipéptidos de NgR variantes (o análogos). En un ejemplo, se proporciona variantes de inserción en las que uno o más residuos aminoácido suplementan una secuencia de aminoácidos de NgR. Las inserciones pueden estar localizadas en cualquiera o en ambos extremos de la proteína, o pueden estar situados en regiones internas de la secuencia de aminoácidos de NgR. Las variantes insercionales con residuos adicionales en cualquiera o en ambos extremos pueden incluir, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas o marcas de aminoácidos.

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Las variantes de inserción incluyen polipéptidos de NgR en los que se añaden uno o más residuos aminoácido a una secuencia de aminoácidos de NgR o a uno de sus fragmentos biológicamente activos.

Los productos variantes de esta descripción también incluyen productos de NgR maduros, esto es, productos de NgR en los que se eliminan las secuencias líder o señal, con residuos amino terminales adicionales. Los residuos amino terminales adicionales pueden derivar de otra proteína, o pueden incluir uno o más residuos que no son identificables al estar derivados de proteínas específicas. Se consideran los productos de NgR con un residuo metionina adicional en la posición -1 ((Met^{-1}-NgR), ya que son variantes con un residuo metionina y lisina adicional en las posiciones -2 y -1 (Met^{-2}-Lys^{-1}-NgR). Las variantes de NgR con residuos Met, Met-Lys, Lys adicionales (uno o más residuos alcalinos en general) son particularmente útiles para aumentar la producción de proteína recombinante en células anfitrionas bacterianas.

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Variantes Polipeptídicas

La descripción también incluye variantes de NgR que tienen residuos aminoácido adicionales que resultan del uso de sistemas de expresión específicos.

Según se utiliza en la presente memoria, una "proteína quimérica" o una "proteína de fusión" de NgR comprende un polipéptido de NgR unido operativamente a un polipéptido distinto de NgR. Esas proteínas de fusión de NgR de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Un "polipéptido de NgR" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a NgR, mientras un "polipéptido no de NgR" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es homóloga a la proteína de NgR, p. ej., una proteína que es diferente de la proteína de NgR y que deriva del mismo o diferente organismo. En una proteína de fusión de NgR el polipéptido de NgR puede corresponder a toda o una porción de una proteína de NgR. En un caso, una proteína de fusión de NgR comprende al menos una porción biológicamente activa de una proteína de NgR. En otro caso, una proteína de fusión de NgR comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína de NgR. En otro caso, una proteína de fusión de NgR comprende al menos tres porciones biológicamente activas de una proteína de NgR. En la proteína de fusión, se pretende que el término "unido operativamente" indique que el polipéptido de NgR y el polipéptido distinto de NgR están fusionados en marco entre sí. El polipéptido distinto de NgR se puede fusionar al extremo N o al extremo C del polipéptido de NgR.

Por ejemplo, en un caso, una proteína de fusión de NgR comprende un dominio NgR unido operablemente al dominio extracelular de una segunda proteína. Semejantes proteínas de fusión se pueden utilizar adicionalmente en análisis de escrutinio en busca de compuestos que modulan la actividad de NgR (tales análisis se describen con detalle más abajo).

Por ejemplo, el uso de vectores asequibles comercialmente que expresan un polipéptido deseado como parte de un producto de fusión con glutation-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo glicina adicional en la posición -1 después de la escisión del componente GST del polipéptido deseado.

En otro caso, la proteína de fusión es una proteína de NgR que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. Por ejemplo, la secuencia señal de NgR nativa (esto es, los aminoácidos 1-30 del SEQ ID NO: 2 y los aminoácidos 1-40 del SEQ ID NO: 4) se puede separar y remplazar por una secuencia señal de otra proteína. En ciertas células anfitrionas (p. ej., células anfitrionas de mamífero), se puede incrementar la expresión y/o secreción de NgR por medio del uso de una secuencia señal heteróloga.

En otro caso más, la proteína de fusión es una proteína de fusión de NgR-inmunoglobulina en la que las secuencias de NgR que comprenden uno o más dominios están fusionadas con las secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de NgR-inmunoglobulina de esta descripción, incluyendo las de la invención, pueden ser incorporadas a composiciones farmacéuticas y administradas a un sujeto para inhibir una interacción entre el ligando de NgR y una proteína de NgR sobre la superficie de una célula, para suprimir de ese modo la transducción de la señal mediada por NgR in vivo. Las proteínas de fusión de NgR-inmunoglobulina se pueden utilizar para afectar a la biodisponibilidad de un ligando cognado de NgR. La inhibición de la interacción del ligando de NgR/NgR puede ser útil terapéuticamente tanto para el tratamiento de trastornos proliferativos y diferenciadores, así como para modular (p. ej., promover o inhibir) la supervivencia celular. Por otra parte, las proteínas de fusión de NgR-inmunoglobulina de esta descripción, incluyendo las de la invención, se pueden utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-NgR en un sujeto, para purificar ligandos de NgR, y en análisis de escrutinio para identificar moléculas que inhiben la interacción de NgR con el ligando de NgR.

Se puede producir una proteína quimérica o de fusión de NgR de esta descripción, p. ej. una proteína de fusión de NgR de la invención mediante técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se ligan entre si en marco de acuerdo con las técnicas convencionales, p. ej., empleando la formación de extremos romos y en bisel para la ligación, la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión y una ligación enzimática no deseables. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación mediante PCR de fragmentos génicos utilizando cebadores ancla que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden ser recocidos y reamplificados con posterioridad para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, 1992). Por otra parte, se encuentran disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un radical de fusión (p. ej., un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica NgR en un vector de expresión de manera que el radical de fusión está unido en marco a la proteína de NgR.

También se consideran las variantes resultantes de la expresión en otros sistemas vectores.

Las variantes insercionales también incluyen proteínas de fusión en las que el extremo amino y/o el extremo carboxi de NgR está/están fusionados a otro polipéptido.

En otro aspecto, la descripción proporciona variantes por deleción en las que se eliminan uno o más residuos aminoácido de un polipéptido de NgR. Las deleciones se pueden efectuar en uno o ambos extremos del polipéptido de NgR, o con eliminación de uno o más residuos aminoácido no terminales. Las variantes por deleción, por lo tanto, incluyen todos los fragmentos de un polipéptido de NgR.

La descripción también abarca fragmentos polipeptídicos de la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 2, 4 o 14 donde los fragmentos conservan las propiedades inmunológicas biológicas (p. ej., unión al ligando y/o señalización intracelular) de un polipéptido de NgR. En esta descripción se consideran los fragmentos que comprenden al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos consecutivos de los SEQ ID NO: 2, 4 o 14. Los fragmentos polipeptídicos preferidos presentan propiedades antigénicas únicas, o específicas, para NgR humano y sus homólogos alélicos y de especie. Los fragmentos de los polipéptidos de esta descripción que tienen las propiedades biológicas e inmunológicas deseadas se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos y puestos en práctica rutinariamente en la técnica.

En otro aspecto más, la descripción proporciona variantes por sustitución de polipéptidos de NgR. Las variantes por sustitución incluyen aquellos polipéptidos en los que uno o más residuos aminoácido de un polipéptido de NgR se eliminan y se remplazan por residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son de naturaleza conservativa; no obstante, la descripción abarca las sustituciones que también son no conservativas. Las sustituciones conservativas para este fin pueden ser definidas como se muestra en las Tablas 2, 3, o 4 de más abajo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Las variantes polipeptídicas incluyen aquellas en las que se han introducido mutaciones conservativas mediante modificación de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. Los aminoácidos se pueden clasificar de acuerdo con las propiedades físicas y la contribución a la estructura secundaria y terciaria de las proteínas. Una sustitución conservativa es reconocida en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservativas ilustrativas se exponen en la Tabla 2 (del documento WO 97/09433, página 10, publicado el 13 de Marzo, 1997 (PCT/GB96/02197, presentada el 9/6/96), inmediatamente más abajo.

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TABLA 2 Sustituciones Conservativas I

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Alternativamente, los aminoácidos conservativos se pueden agrupar como describe Lehninger, [BIOCHEMISTRY, Segunda Edición, Worth Publishers, Inc. NY, NY (1975), págs. 71-77] como se expone en la Tabla 3, inmediatamente más abajo.

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TABLA 3 Sustituciones Conservativas II

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Como otra alternativa más, las sustituciones conservativas ilustrativas se exponen en la Tabla 4, más abajo.

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TABLA 4 Sustituciones Conservativas III

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Además, también se prevé que los residuos aminoácido se conserven entre miembros de la familia de las proteínas de NgR de la presente descripción, como se indica mediante el alineamiento presentado en la presente memoria, sean particularmente poco susceptibles de alteración. Por ejemplo, las proteínas de NgR de la presente descripción pueden contener al menos un dominio que es una región típicamente conservada en los NgR. Los ejemplos de estos dominios conservados incluyen, p. ej., dominios de repetición ricos en leucina. Los residuos aminoácido que no son conservados o son solamente semi-conservados entre los miembros de las proteínas de NgR pueden ser fácilmente susceptibles de alteración.

Los NgR completos tienen una región LRR caracterizada por la secuencia consenso de aminoácidos del SEQ ID NO: 19. Al menos algunos de los NgR completos también incluyen un dominio de señalización CT (CTS) y un dominio GPI.

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Las designaciones de los dominios NgR utilizados en la presente memoria se definen como sigue:

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En algunos casos, los dominios anteriores están modificados. La modificación puede ser de manera que se conserve la funcionalidad del dominio. La modificación puede incluir la adición, deleción o sustitución de ciertos aminoácidos. Las modificaciones ilustrativas incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas. Preferiblemente tales sustituciones representan 20 o menos por 100 residuos. Más preferiblemente, tales sustituciones representan 10 o menos por 100 residuos. Las modificaciones ilustrativas adicionales incluyen la adición de secuencias colindantes de hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de uno o más de los dominios.

En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido homólogo en al menos aproximadamente en 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, y muy preferiblemente en al menos aproximadamente 99% a los SEQ ID NO: 2, 4 o 14.

Se pueden introducir mutaciones en los SEQ ID NO: 1, 3 o 13 mediante técnicas convencionales, p. ej., mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se pueden realizar en uno o más residuos aminoácido que se pronostica que no son esenciales. Alternativamente, las mutaciones se pueden introducir al azar a lo largo de una secuencia codificante de NgR. Esto se puede lograr, p. ej., mediante mutagénesis por saturación. Los mutantes resultantes se pueden escrutar en busca de actividad biológica de NgR. Las actividades biológicas de NgR pueden incluir pero no están limitadas a: (1) interacciones proteína:proteína, p. ej., con otros NgR u otras proteínas de la superficie celular implicadas en la señalización relacionada con Nogo; (2) formación de complejos con un ligando de NgR; (3) unión a un anticuerpo anti-NgR.

Se debe entender que se pretende que la definición de los polipéptidos de la descripción incluya polipéptidos que porten modificaciones distintas de inserciones, deleciones, o sustituciones de residuos aminoácido. A modo de ejemplo, las modificaciones pueden ser de naturaleza covalente, e incluyen por ejemplo, el enlace químico con polímeros, lípidos, otros radicales orgánicos e inorgánicos. Tales derivados se pueden preparar para incrementar la vida media en circulación de un polipéptido, o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de redireccionamiento del polipéptido a las células, tejidos u órganos deseados. De un modo similar, la descripción abarca además los polipéptidos de NgR que han sido modificados covalentemente para incluir uno o más anclajes a polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Las variantes que presentan propiedades de unión a ligandos del NgR nativo y son expresadas a niveles superiores, así como las variantes que proporcionan receptores constitutivamente activos, son particularmente útiles en los análisis de la descripción; las variantes también son útiles al proporcionar modelos celulares, tisulares y animales de enfermedades/afecciones caracterizadas por una actividad aberrante de NgR.

Las composiciones de polipéptido de NgR modificado químicamente en las cuales el polipéptido de NgR está unido a un polímero están incluidas en el alcance de la presente descripción y de la invención. El polímero puede ser soluble en agua para evitar la precipitación de la proteína en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Los polímeros solubles en agua adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste, por ejemplo, en polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros con una base carbohidratada, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, un copolímero de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol) y poli(alcohol vinílico). El polímero seleccionado se modifica normalmente para que tenga un único grupo reactivo, tal como un éster activo para su acilación o un aldehído para su alquilación, de manera que se pueda controlar el grado de polimerización. Los polímeros pueden tener cualquier peso molecular, y pueden ser ramificados o no ramificados, y también se pueden utilizar mezclas de tales polímeros. Cuando el polímero de NgR modificado químicamente está destinado a uso terapéutico, se seleccionarán polímeros farmacéuticamente aceptables para su uso.

Cuando el polímero va a ser modificado mediante una reacción de acilación, el polímero debe tener un único grupo éster reactivo. Alternativamente, si el polímero va a ser modificado mediante alquilación reductiva, el polímero debe tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído reactivo preferido es polietilenglicol-propionaldehído, que es estable en agua, o sus derivados mono CI-CIO alcoxilados o ariloxilados (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.252.714).

La pegilación de los polipéptidos de NgR se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas con la técnica, como se describe, por ejemplo, en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3, 4-10 (1992); documento EP 0 154 316; y documento EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Un polímero soluble en agua preferido para la pegilación de polipéptidos tales como NgR es el polietilenglicol (PEG). Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que "polietilenglicol" abarque cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tales como mono (CI-CIO)alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol.

La derivatización química de polipéptidos de NgR se puede realizar en cualquiera de las condiciones adecuadas utilizadas para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar polipéptidos de NgR pegilados comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol, tal como un éster reactivo o un derivado aldehído de PEG, en condiciones en las cuales el polipéptido de NgR queda anclado a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. Resultará evidente para un experto normal en la técnica la selección de las condiciones de reacción óptimas o las reacciones de acilación basadas en parámetros conocidos y en el resultado deseado.

Los polímeros:polipéptidos de NgR pegilados y otros se pueden utilizar generalmente para tratar las afecciones que pueden ser aliviadas o moduladas mediante la administración de los polipéptidos de NgR descritos en la presente memoria. No obstante, las moléculas de polímero:polipéptido de NgR derivatizadas químicamente descritas en la presente memoria pueden tener actividades adicionales, una actividad biológica intensificada o reducida, u otras características, tales como una vida media incrementada o disminuida, en comparación con las moléculas no derivatizadas. Los polipéptidos de NgR, sus fragmentos, variantes y derivados, se pueden emplear solos, junto con, o combinados con otras composiciones farmacéuticas. Las citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios y/o agentes quimioterapéuticos son apropiados para la indicación que esté siendo tratada.

La presente descripción proporciona composiciones que comprenden polipéptidos purificados de esta descripción, p. ej., los polipéptidos purificados de la invención. Las composiciones preferidas comprenden, además del polipéptido de esta descripción, un diluyente líquido, semisólido, o sólido farmacéuticamente aceptable (esto es, estéril y no tóxico) que sirve como vehículo, excipiente o medio. Se puede utilizar cualquier diluyente conocido en la técnica. Los diluyentes ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas, monolaurato de polioxietilensorbitán, estearato de magnesio, hidroxibenzoato de metilo y propilo, talco, alginatos, almidones, lactosa, sacarosa, dextrosa, sorbitol, manitol, glicerol, fosfato de calcio, aceite mineral y manteca de cacao.

Las variantes que presentan las propiedades de unión al ligando del NgR nativo y son expresadas a niveles superiores, así como las variantes que proporcionan receptores activos constitutivamente, son particularmente útiles en los análisis de esta descripción; las variantes también son útiles en los análisis de la descripción y al proporcionar modelos celulares, tisulares y animales de enfermedades/afecciones caracterizadas por una actividad aberrante de NgR.

Con el conocimiento de la información de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria, un experto en la técnica puede identificar y obtener secuencias de nucleótidos que codifican NgR de diferentes fuentes (esto es, diferentes tejidos o diferentes organismos) por medio de una variedad de métodos bien conocidos por los expertos y descritos, por ejemplo, por Sambrook et al., en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Por ejemplo, el ADN que codifica NgR se puede obtener escrutando ARNm, ADNc, o ADN genómico con sondas oligonucleotídicas generadas a partir de la información de la secuencia génica de NgR proporcionada en la presente memoria. Las sondas pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como un grupo fluorescente, un átomo radiactivo o un grupo quimioluminiscente de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos y utilizados en análisis de hibridación convencionales, como describen, por ejemplo, Sambrook et al. (1998) más arriba.

Una molécula de ácido nucleico que comprende cualquiera de las secuencias de nucléotidos de NgR descritas antes puede ser sintetizada alternativamente mediante el uso del procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con los cebadores oligonucleotídicos para PCR producidos a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria. Véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 de Mullis et al y 4.683.202 de Mullis. La reacción de PCR proporciona un método para incrementar selectivamente la concentración de una secuencia de ácido nucleico concreta incluso cuando la secuencia no haya sido purificada previamente y esté presente solamente en una única copia en una muestra concreta. El método se puede utilizar para amplificar ADN de hebra sencilla o doble. La esencia del método implica el uso de dos sondas oligonucleotídicas que sirven como cebadores para la replicación mediada por polimerasa, dependiente del molde de una molécula de ácido nucleico deseada.

Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de metodologías de clonación y amplificación in vitro alternativas. Los ejemplos de estas técnica se encuentran, por ejemplo, en Berger et al., Guide to Molecular Cloning Techniques, METHODS IN ENZYMOLOGY 152 Academic Press, San Diego, CA.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción, incluyendo las de la presente invención, y los fragmentos derivados de allí, son útiles para escrutar los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) asociados con ciertos trastornos, así como para el mapeo genético.

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Anticuerpos

También están comprendido en la presente descripción los anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bifuncionales/biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, y anticuerpos injertados con regiones determinantes de la complementariedad (CDR), incluyendo compuestos que incluyen secuencias de CDR que reconocen específicamente un polipéptido de esta descripción) específicos para NgR o sus fragmentos. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que proporcionan un aspecto de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Los anticuerpos preferidos de esta descripción y de la invención son los anticuerpos humanos que son producidos e identificados de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO93/11236, publicado el 20 de Junio, 1993. Los fragmentos de anticuerpos, incluyendo Fab, Fab', F(ab')_{2}, y F_{v}, también son proporcionados por esta descripción, y por la invención. El término "específico para", cuando se utiliza para describir los anticuerpos de esta descripción, incluyendo los anticuerpos de la invención, indica que las regiones variables de los anticuerpos reconocen y se unen a los polipéptidos de NgR exclusivamente (esto es, son capaces de distinguir los polipéptidos de NgR de otros polipéptidos de NgR conocidos en virtud de diferencias medibles en la afinidad de unión, a pesar de la posible existencia de una identidad, homología, o similitud de secuencia localizada entre NgR y tales polipéptidos).

El péptido antigénico de NgR comprende al menos 8 residuos aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NO: 2, 4 o 14 y abarca un epítopo de NgR de manera que un anticuerpo originado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con NgR. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos aminoácido, más preferiblemente al menos 15 residuos aminoácido, incluso más preferiblemente al menos 20 residuos aminoácido, y muy preferiblemente al menos 30 residuos aminoácido. Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son las regiones de NgR que están localizadas sobre la superficie de la proteína, p. ej., regiones hidrófilas.

Se entenderá que los anticuerpos específicos también pueden interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, proteínas A de S. aureus u otros anticuerpos en técnicas ELISA) a través de interacciones con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos, y, en particular, en la región constante de la molécula. Los análisis de escrutinio para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo de esta descripción, p. ej., un anticuerpo de la invención son bien conocidos y puestos en práctica rutinariamente en la técnica. Para un estudio exhaustivo de tales análisis, véase Harlow et al. en ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. También se consideran los anticuerpos que reconocen y se unen a fragmentos de los polipéptidos de NgR de esta descripción, p. ej., los polipéptidos de NgR de la invención, siempre que los anticuerpos sean específicos para los polipéptidos de NgR. Los anticuerpos de esta descripción, incluyendo los anticuerpos de la invención, pueden ser producidos utilizando cualquier método bien conocido y puesto en práctica rutinariamente en la técnica.

Para la producción de anticuerpos policlonales, se pueden inmunizar diferentes animales anfitriones adecuados (p. ej., conejo, ratón u otro mamífero) mediante inyección con la proteína nativa, o una de sus variantes sintéticas, o un derivado de las anteriores. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, una proteína de NgR expresada recombinantemente o un polipéptido de NgR sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un coadyuvante. Los diferentes coadyuvantes utilizados para incrementar la respuesta inmunológica incluyen, pero no están limitados a, coadyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales (p. ej., hidróxido de aluminio), sustancias tensioactivas (p. ej., lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, dinitrofenol, etc.), coadyuvantes humanos tales como Bacillus Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum o agentes inmunoestimuladores similares. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra NgR pueden ser aisladas de los mamíferos (p. ej., de la sangre) y purificadas adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como la cromatografía con proteína A para obtener la fracción de IgG.

El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo concreto de NgR. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta de este modo típicamente una única afinidad de unión para una proteína de NgR concreta con la cual inmunorreacciona. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos a una proteína de NgR concreta, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante cultivo continuo de líneas celulares. Tales técnicas incluyen, pero no están limitadas a, la técnica del hibridoma (véase Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497); la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (véase Kozbor et al., (1983) Immunol. Today 4, 72) y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole et al., (1985) en MONOCLONAL ANTIBOIDES AND CANCER THERPAY, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos en la práctica de esta descripción, incluyendo la práctica de la presente invención y se pueden producir utilizando hibridomas humanos (véase Cote et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030) o transformando células B humanas con virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole et al., (1985), más arriba).

De acuerdo con esta descripción, se pueden adaptar las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para una proteína de NgR (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778). Además, se pueden adaptar los métodos para la construcción de genotecas de expresión de Fab (véase p. ej., Huse et al., (1989) Science 246, 1275-1281) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos F_{ab} monoclonales con la especificidad deseada para una proteína de NgR o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos. Los anticuerpos no humanos pueden ser "humanizados" mediante mecanismos bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539. En un método, se insertan las CDR no humanas en una secuencia marco de un anticuerpo humano o un anticuerpo consenso. Después se pueden introducir más cambios en el marco del anticuerpo para modular la afinidad o la inmunogenicidad. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos para una proteína de NgR pueden ser producidos mediante mecanismos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a: (i) un fragmento F(ab')_{2} producido mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')_{2}; (iii) un fragmento Fab generado mediante tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos F_{v}.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-NgR recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que se pueden elaborar utilizando mecanismos de ADN recombinante convencionales, se encuentran dentro del alcance de esta descripción y de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos mediante mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la Solicitud Internacional PCT Núm. PCT/US86/02269; la Solicitud de Patente Europea Núm. 184.187; la Solicitud de Patente Europea Núm. 171.496; la Solicitud de Patente Europea Núm. 173.494; la Publicación Internacional PCT Núm. WO 86/01533; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; la Solicitud de Patente Europea Núm. 125.023; Better et al., (1988) Science 240, 1041-1043; Liu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439-3443; Liu et al., (1987) J. Immunol. 139, 3521-3526; Sun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 214-218; Nishimura et al., (1987) Cancer Res. 47, 999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314, 446-449; Shaw et al., (1988) J, Natl. Cancer Inst. 80, 1553-1559); Morrison (1985) Science 229, 1202-1207; Oi et al., (1986) BioTechniques 4, 214; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; Jones et al., (1986) Nature 321, 552-525; Verhoeyan et al., (1988) Science 239, 1534; y Beidler et al., (1988) J. Immunol. 141, 4053-4060.

De acuerdo con una parte preferida de esta descripción, se une una porción de NgR a una porción de Fc de un anticuerpo para formar una proteína de fusión de NgR/Fc. Preferiblemente, la proteína de fusión de Ig es soluble. La proteína de fusión de NgR/Fc puede estar formada mediante las técnicas recombinantes descritas antes. En un caso, se fusiona una porción de NgR que incluye la secuencia de aminoácidos completa de NgR excepto la región hidrófoba C-terminal con una porción Fc de un anticuerpo. Más preferiblemente, la porción de Fc humana deriva de un anticuerpo. En casos preferidos, el NgR es un NgR humano y el Fc también es humano. Más preferiblemente la porción Fc humana deriva de un anticuerpo IgG. En otros casos, se omite la secuencia señal N-terminal. Tales anticuerpos son útiles en la unión a Nogo para evitar la señalización de Nogo a través de NgR.

En un caso, los métodos para el escrutinio de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no están limitados a, análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) y otros mecanismos mediados inmunológicamente conocidos en la técnica. En un caso específico, la selección de anticuerpos que son específicos para un dominio concreto de una proteína de NgR se facilita mediante la generación de hibridomas que se unen al fragmento de una proteína de NgR que posee semejante dominio. También se proporcionan en la presente memoria los anticuerpos que son específicos para uno o más dominios de la proteína de NgR, p. ej., los dominios que abarcan las regiones de NgR conservadas identificadas antes, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos.

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Se pueden utilizar los anticuerpos anti-NgR en los métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y/o cuantificación de una proteína de NgR (p. ej., para su uso en la medición de los niveles de la proteína de NgR en muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en métodos de diagnóstico, para su uso en la formación de imágenes de la proteína, y similares. En un caso dado, los anticuerpos para las proteínas de NgR, o sus derivados, fragmentos análogos u homólogos, que contienen el dominio de unión derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos [en adelante "Agentes terapéuticos"].

Se puede utilizar un anticuerpo anti-NgR (p. ej., anticuerpo monoclonal) para aislar NgR mediante técnicas convencionales, tales como la cromatografía de afinidad o la inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-NgR puede facilitar la purificación de NgR natural de las células y del NgR producido recombinantemente expresado en células anfitrionas. Por otra parte, se puede utilizar un anticuerpo anti-NgR para detectar la proteína de NgR (p. ej., en un producto lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína de NgR. Los anticuerpos anti-NgR se pueden utilizar con fines diagnósticos para controlar los niveles de proteína en un tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, p. ej., para determinar, a modo de ilustración, la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar acoplando (esto es, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, sustancias bioluminiscentes y sustancias radiactivas. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos con grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de las sustancias fluorescentes adecuadas incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de sustancia luminiscente incluye luminol; los ejemplos de las sustancias bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de las sustancias radiactivas adecuadas incluyen I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.

Otro aspecto de la presente descripción está dirigido a métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero contra un polipéptido de esta descripción administrando al mamífero una cantidad del polipéptido suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. La cantidad dependerá de la especie del animal, del tamaño del animal, y similares pero puede ser determinada por los expertos en la técnica.

Otro aspecto de esta descripción está dirigido a anticuerpos anti-idiotípicos y anticuerpos anti-anti-idiotípicos. Un anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes de otro anticuerpo (un anticuerpo diana). Generalmente, el anticuerpo anti-idiotípico reconoce determinantes del sitio de unión al antígeno del anticuerpo diana. Típicamente, el anticuerpo diana es un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo anti-idiotípico se prepara generalmente inmunizando un animal (concretamente, ratones) de la misma especie y tipo genético que la fuente del anticuerpo monoclonal diana, con el anticuerpo monoclonal diana. El animal inmunizado monta una respuesta inmunitaria a los determinantes idiotípicos del anticuerpo monoclonal diana y produce anticuerpos contra los determinantes idiotípicos del anticuerpo monoclonal diana. Las células productoras de anticuerpo, tales como las células esplénicas, del animal inmunizado pueden ser utilizadas para generar anticuerpos monoclonales anti-idiotípicos. Además, también se puede utilizar un anticuerpo anti-idiotípico para inmunizar animales para que produzcan anticuerpos anti-anti-idiotípicos. Estos animales inmunizados se pueden utilizar para generar anticuerpos monoclonales anti-anti-idiotípicos empleando las técnicas convencionales. Los anticuerpos anti-anti-idiotípicos se pueden unir al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal diana original utilizado para preparar el anticuerpo anti-idiotípico. Los anticuerpos anti-anti-idiotípicos representan otros anticuerpos monoclonales con la misma especificidad por el antígeno que el anticuerpo monoclonal diana original.

Si la unión del anticuerpo anti-idiotípico con el anticuerpo diana es inhibida por el antígeno relevante del anticuerpo diana, y si el anticuerpo anti-idiotípico induce una respuesta de anticuerpos con la misma especificidad que el anticuerpo diana, éste imita al antígeno del anticuerpo diana. Semejante anticuerpo anti-idiotípico es un "anti-idiotipo de imagen interna" y es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos como si fuera el antígeno original. (Bona y Kohler 81984) ANTI-IDIOTIPIC ANTIBODIES AND INTERNAL IMAGE, IN MONOCLONAL AND ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES: PROBES FOR RECEPTOR STRUCTURE AND FUNCTION, Venter J.C. et al., (Eds.), Alan R. Liss, Nueva York, NY, págs. 141-149, 1984). Se ha demostrado que las vacunas que incorporan anticuerpos anti-idiotipo de imagen interna inducen respuestas protectoras contra virus, bacterias, y parásitos (Kennedy et al., (1986) 232, 220-223; 1047; McNamara et al., (1985) Science 226, 1325-1326). También se ha demostrado que los anticuerpos anti-idiotípicos de imagen interna inducen la inmunidad para antígenos relacionados con tumores (Raychauhuri et al., (1986) J. Immunol. 137, 1743-1749; Raychauhuri et al., (1987) J. Immunol. 139, 3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee et al., (1987) J. Immunol. 139, 1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee et al., (1988) J. Immunol. 141, 1398-1403; Herlyn et al., (1989) Intern. Rev. Immunol. 4, 347-357; Chen et al., (1990) Cell Imm. Immunother. Cancer 351-359; Herlyn et al., (1991) in vivo 5, 615-624; Furuya et al. (1992) AntiCancer res. 12, 27-32; Mittelman, A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 466-470; Durrant et al., (1994) Cancer Res. 54, 4837-4840; Mittelman et al. (1994) Cancer Res. 54, 415-421; Schmitt. et al (1994) Hybridoma 13, 389-396; Chakrobarty. et al. (1995) J. Immunother. 18, 95-103; Chakrobarty. et al. (1995) Cancer Res. 55, 1525-1530; Foon, K.A. et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1, 1205-1294; Herlyn et al. (1995) Hybridoma 14, 159-166; Sclebusch et al. (1995) Hybridoma 14, 167-174; Herlyn et al. (1996) Cancer Immunol. Immunother. 43, 65-76).

Los anticuerpos anti-idiotípicos para NgR se pueden preparar, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un ratón, con una cantidad inmunogénica de una composición que comprende NgR2 (SEQ ID NO: 2), NgR3 (SEQ ID NO: 4 o 14), o una de sus porciones inmunogénicas, que contiene al menos un epítopo antigénico de NgR. La composición también puede contener un coadyuvante adecuado, y cualquier portador necesario para proporcionar inmunogenicidad. Los anticuerpos monoclonales que reconocen NgR pueden ser preparados a partir de células del animal inmunizado como se ha descrito antes. Después se selecciona en anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo de NgR y se utiliza para preparar una composición que comprende una cantidad inmunogénica del anticuerpo monoclonal anti-NgR. Típicamente, una dosis de 25 a 200 \mug de anticuerpo monoclonal anti-NgR purificado sería suficiente en un coadyuvante adecuado.

Los animales pueden ser inmunizados 2-6 veces a intervalos de 14 a 30 días entre las dosis. Típicamente, los animales son inmunizados mediante cualquier ruta de administración adecuada, tal como intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o una combinación de estas. La producción de anticuerpos anti-idiotípicos puede ser controlada durante el período de inmunización utilizando métodos de inmunoanálisis convencionales. Los animales con títulos de anticuerpos adecuados reactivos con los anticuerpos monoclonales diana pueden ser inmunizados de nuevo con el anticuerpo monoclonal utilizado como inmunógeno tres días antes de la recogida de las células productoras de anticuerpos. Preferiblemente, se utilizan células de bazo, aunque se pueden seleccionar otras células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpo se cosechan y se fusionan con células de mieloma para producir Hibridomas, como se ha descrito antes, y se seleccionan las células productoras de los anticuerpos anti-idiotípicos adecuados.

Los anticuerpos anti-anti-idiotípicos se producen mediante otra ronda de inmunización y producción de Hibridoma utilizando el anticuerpo monoclonal anti-idiotípico como inmunógeno.

Los anticuerpos de esta descripción, incluyendo los anticuerpos de la invención, son útiles, p. ej., para fines terapéuticos (modulando la actividad de NgR), fines diagnósticos para detectar o cuantificar NgR, y para la purificación de NgR. Por lo tanto, también están comprendidos los kits que comprenden un anticuerpo de esta descripción, p. ej. un anticuerpo de la invención, para cualquiera de los fines descritos en la presente memoria.

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Kits

La presente descripción también está dirigida a kits, incluyendo kits farmacéuticos. Los kits pueden comprender cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas antes, cualquiera de los polipéptidos descritos antes, o cualquier anticuerpo que se una a un polipéptido de la descripción como se ha descrito antes, así como controles apropiados, tales como controles positivos y/o negativos. El kit comprende preferiblemente componentes adicionales, tales como, por ejemplo, instrucciones, soporte sólido, reactivos útiles para la cuantificación, y similares. Por ejemplo, el kit puede comprender: un compuesto marcado o un agente capaz de detectar la proteína o el ARNm de NgR en una muestra biológica; los medios para determinar la cantidad de NgR de la muestra; y los medios para comparar la cantidad de NgR de la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar envasado en un recipiente adecuado.

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Análisis de Escrutinio

La información de la secuencia de ADN y de aminoácidos proporcionada por la presente descripción también hace posible la identificación de los compuestos compañeros de unión con los cuales interaccionará un polipéptido o polinucleótido de NgR. Los métodos para identificar los compuestos compañeros de unión incluyen análisis en solución, análisis in vitro en los que los polipéptidos de NgR están inmovilizados y análisis basados en células. La identificación de los compuestos compañeros de unión de los polipéptidos de NgR proporciona candidatos para la intervención terapéutica o profiláctica en patologías asociadas con la actividad biológica normal y aberrante de NgR.

La descripción también proporciona un método (también referido en la presente memoria como "análisis de escrutinio") para identificar moduladores, esto es, compuestos o agentes de ensayo o candidato (p. ej., péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas (p. ej., moléculas de menos de 1.000 Daltons) u otros fármacos) que se unen a proteínas de NgR o tienen efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión de NgR o la actividad de NgR.

En un caso, la descripción proporciona análisis para escrutar compuestos de ensayo o candidato que se unen a o modulan la actividad de una proteína o polipéptido de NgR o una de sus porciones biológicamente activas. Los compuestos de ensayo de la presente descripción se pueden obtener utilizando cualquiera de los numerosos enfoques de los métodos de genotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: genotecas biológicas; genotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas dirigibles espacialmente; métodos de genotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de la genoteca de "una cuenta-un compuesto"; y los métodos de genotecas sintéticas que utilizan la selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de la genoteca biológica está limitado a las genotecas peptídicas, mientras los otros cuatro enfoques son aplicables a péptidos, oligómeros no peptídicos o genotecas de compuestos de molécula pequeña (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12, 145).

Los ejemplos de los métodos para la síntesis de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678; Cho et al., (1993) Science 261, 1303; Carrel et al., (1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059; Carell et al., (1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; y Gallop et al., (1994) J. Med. Chem. 37, 1233.

Las genotecas de compuestos pueden presentarse en solución (p. ej., Houghten (1992) BioTechniques 13, 412-421), o sobre cuentas (Lam (1991) Nature 354, 82-84), sobre chips (Fodor (1993) Nature 364, 555-556), bacterias (Ladner, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409), esporas (Ladner, más arriba), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990) Science 249, 386-390; Devlin (1990) Science 249, 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310; Ladner, más arriba).

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1. Análisis Basados en Células

La descripción también proporciona análisis basados en células para identificar los compuestos compañeros de unión de un polipéptido de NgR. En un caso, la descripción proporciona un método que comprende las etapas de poner en contacto un polipéptido de NgR expresado sobre la superficie de una célula con un compuesto compañero de unión candidato y detectar la unión del compuesto compañero de unión candidato al polipéptido de NgR. En otro caso, el análisis es un análisis basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una forma de proteína de NgR unida a membrana, o una de sus porciones biológicamente activas, sobre la superficie celular con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad de la proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas.

En un caso, el análisis es un análisis basado en células en el cual una célula que expresa una forma de proteína de NgR unida a membrana, o una de sus porciones biológicamente activas, sobre la superficie celular se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a una proteína de NgR determinada. La célula, por ejemplo, puede ser de origen mamífero o una célula de levadura. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la proteína de NgR se puede lograr, por ejemplo, acoplando el compuesto de ensayo a un radiosótopo o una marca enzimática de manera que la unión del compuesto de ensayo a la proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas pueda ser determinada detectando el compuesto marcado en el complejo. Por ejemplo, los compuestos de ensayo se pueden marcar con I^{125}, S^{35}, C^{14} o H^{3}, ya sea directamente o indirectamente, y el radioisótopo puede ser detectado mediante recuento directo de la radioemisión o mediante recuento del centelleo. Alternativamente, los compuestos de ensayo pueden ser marcados enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca enzimática puede ser detectada mediante determinación de la conversión de un sustrato adecuado en producto. En un caso, el análisis comprende poner en contacto una célula que expresa una forma unida a la membrana de proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas, sobre la superficie celular con un compuesto conocido que se une a NgR para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a NgR o a una de sus porciones biológicamente activas en comparación con el compuesto conocido.

La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de NgR o una de sus porciones biológicamente activas puede lograrse, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína de NgR para unirse a o interaccionar con una molécula diana de NgR. Según se utiliza en la presente memoria, una "molécula diana" es una molécula con la cual se une o interacciona una proteína de NgR en la naturaleza por ejemplo, una molécula sobre la superficie de la célula que expresa una proteína de NgR, una molécula sobre la superficie de una segunda célula, una molécula en el entorno extracelular, una molécula asociada con la superficie interna de una membrana celular o una molécula citoplásmica. Una molécula diana de NgR puede ser una molécula distinta de NgR o una proteína o polipéptido de NgR de la presente descripción, p. ej., de la presente invención. En un caso, la molécula diana de NgR es un componente de una ruta de transducción de la señal que facilita la transducción de una señal extracelular (p. ej., una señal generada uniendo un compuesto a una molécula de NgR unida a la membrana) a través de la membrana celular y en el interior de la célula. La diana, por ejemplo, puede ser una segunda proteína intercelular que tiene actividad catalítica o una proteína que facilita la asociación de moléculas de señalización aguas abajo con NgR. En un caso preferido, la detección comprende descubrir un flujo de calcio u otro evento fisiológico en la célula causado por la unión de la molécula.

Las moléculas de unión específica, incluyendo los ligandos naturales y los compuestos sintéticos, pueden ser identificadas o desarrolladas utilizando productos de NgR aislados o recombinantes, variantes de NgR, o preferiblemente, células que expresan tales productos. Los compañeros de unión son útiles para purificar productos de NgR y para la detección o cuantificación de productos de NgR en fluidos y muestras tisulares utilizando procedimientos inmunológicos conocidos. Las moléculas de unión también son manifiestamente útiles en la modulación (es decir, bloqueo, inhibición o estimulación) de las actividades biológicas de NgR, especialmente aquellas actividades implicadas en la transducción de la señal.

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2. Análisis sin Células (a) Unión directa

La descripción incluye numerosos sistemas de análisis para identificar los compañeros de unión de NgR. En los análisis en solución, los métodos de la descripción comprenden las etapas de (a) poner en contacto un polipéptido de NgR con uno o más compuestos compañeros de unión candidato y (b) identificar los compuestos que se unen al polipéptido de NgR. La identificación de los compuestos que se unen al polipéptido de NgR se puede lograr aislando el complejo de polipéptido de NgR/compañero de unión y separando el compuesto compañero de unión del polipéptido de NgR. Una etapa adicional de caracterización de las propiedades físicas, biológicas y/o bioquímicas del compuesto compañero de unión también está incluida en otra parte de la descripción. En un aspecto, el complejo de polipéptido de NgR/compañero de unión es aislado utilizando un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido de NgR o el compuesto compañero de unión candidato.

En otros casos más, el polipéptido de NgR o el compuesto compañero de unión candidato comprende una marca o etiqueta que facilita su aislamiento, y los métodos de esta descripción para identificar los compuestos compañeros de unión incluyen una etapa de aislamiento del complejo de polipéptido de NgR/compañero de unión por medio de la interacción con la marca o etiqueta. Una etiqueta ilustrativa de este tipo es una secuencia de poli-histidina, generalmente en torno a seis residuos histidina, que permite el aislamiento de un compuesto marcado de este modo utilizando la quelación con níquel. Otras marcas y etiquetas, tales como la etiqueta FLA® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bien conocidas y utilizadas rutinariamente en la técnica, están incluidas en la descripción.

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(b) NgR Inmovilizado

En una variación de un análisis in vitro, la descripción proporciona un método que comprende las etapas de (a) poner en contacto un polipéptido de NgR inmovilizado, o uno de sus fragmentos biológicamente activos con un compuesto compañero de unión candidato y (b) detectar la unión del compuesto candidato al polipéptido de NgR. En una variación alternativa, el compuesto compañero de unión candidato se inmoviliza y se detecta la unión de NgR. La inmovilización se logra utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la unión covalente a un soporte, una cuenta o una resina cromatográfica, así como interacciones de alta afinidad, no covalentes tales como la unión a anticuerpos, o el uso de la unión de estreptavidina/biotina donde el compuesto inmovilizado incluye un radical biotina. La unión de un compuesto de ensayo a NgR, o la interacción de NgR con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reaccionantes. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En un caso, se puede proporcionar una proteína de fusión que añada un dominio que permita que una o ambas proteínas se unan a la matriz. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las proteínas de fusión de GST-NgR o las proteínas de fusión de GST-diana se pueden adsorber sobre cuentas de glutation-sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutation, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o la proteína de NgR, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de un complejo (p. ej., en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las cuentas o los pocillos de la placa de microtitulación se lavan para separar cualquier componente no unido, la matriz se inmoviliza en el caso de las cuentas, y se determinan los complejos directamente o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito antes. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, y el nivel de unión o actividad de NgR puede ser determinado utilizando técnicas
convencionales.

También se pueden utilizar otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los análisis de escrutinio de la descripción. Por ejemplo, se puede inmovilizar NgR o su molécula diana utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. El NgR o las moléculas diana biotiniladas pueden ser preparados a partir de biotin-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica (p. ej., kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizados en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con NgR o moléculas diana, pero que no interfieren en la unión de la proteína de NgR a su molécula diana, pueden ser derivatizados a los pocillos de la placa, y la diana o el NgR no unidos pueden ser atrapados en los pocillos mediante conjugación con anticuerpos. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos antes para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con el NgR o la molécula diana, así como los análisis con enzima ligada que cuentan con la detección de una actividad enzimática asociada con el NgR o la molécula diana.

La detección de la unión se puede lograr (i) utilizando una marca radiactiva sobre el compuesto que no está inmovilizado, (ii) utilizando una marca fluorescente sobre el compuesto no inmovilizado, (iii) utilizando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) utilizando una marca sobre el compuesto no inmovilizado que excita un soporte fluorescente al cual está anclado el compuesto inmovilizado, (v) determinando la actividad de NgR, así como otros mecanismos bien conocidos y puestos en práctica rutinariamente en la técnica.

La determinación de la actividad de la molécula diana, por ejemplo, se puede lograr detectando la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (esto es, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP_{3}, etc.), detectando la actividad catalítica/enzimática de la diana sobre un sustrato apropiado, detectando la inducción de un gen informador (que comprende un elemento regulador sensible a NgR conectado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, p. ej., luciferasa), o detectando una respuesta celular, por ejemplo, supervivencia celular, diferenciación celular, o proliferación celular.

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(c) Experimentos de competición

En otro caso más, el análisis comprende poner en contacto la proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas con un compuesto conocido que se une a NgR para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a NgR o una de sus porciones biológicamente activas en comparación con el compuesto conocido.

En otro caso más, el análisis sin células comprende poner en contacto la proteína de NgR o una de sus porciones biológicamente activas con un compuesto conocido que se une a NgR para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de NgR comprende determinar la capacidad de la proteína de NgR para modular la actividad de un molécula diana de NgR.

Los análisis sin células de la presente descripción son susceptibles de utilizar tanto la forma soluble como la forma unida a membrana de NgR. En el caso de los análisis sin células que comprenden la forma unida a membrana de NgR, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante de manera que la forma unida a membrana de NgR se mantenga en solución. Los ejemplos de los agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Tritón® X-114, Thesit®, Isotridecipoli(éter de etilenglicol)_{n}, 3-(3-colamidopropil)dimetilaminiol-1-propanosulfonato (CHAPS), 3-(3-colamidopropil)dimetilaminiol-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), o N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato.

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Moduladores

Los agentes que modulan (esto es, aumentan, disminuyen, o bloquean) la actividad o la expresión de NgR pueden ser identificados incubando un supuesto modulador con una célula que contiene un polipéptido o polinucleótido de NgR y determinando el efecto del supuesto modulador sobre la actividad o la expresión de NgR. La selectividad de un compuesto que modula la actividad de NgR puede ser evaluada comparando sus efectos sobre NgR con su efecto sobre otros compuestos de NgR. Los moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos y otras proteínas, péptidos o moléculas orgánicas que se unen específicamente a un polipéptido de NgR o a un ácido nucleico que codifica NgR. Los moduladores de la actividad de NgR serán terapéuticamente útiles en el tratamiento de enfermedades y afecciones fisiológicas en las cuales está implicada la actividad normal o aberrante de NgR. Se pueden utilizar polinucleótidos, polipéptidos y moduladores de NgR, en el tratamiento de tales enfermedades y afecciones asociadas con la desmielinización. Los polinucléotidos y polipéptidos de NgR, así como los moduladores de NgR, también se pueden utilizar en análisis diagnósticos para tales enfermedades o afecciones.

Los métodos de la descripción para identificar moduladores incluyen variaciones de cualquiera de los métodos descritos antes para identificar compuestos compañeros de unión, incluyendo las variaciones, técnicas en las que se ha identificado un compuesto compañero de unión y el análisis de unión se lleva a cabo en presencia o ausencia de un modulador candidato. Un modulador se identifica en aquellos casos en los que la unión entre el polipéptido de NgR y el compuesto compañero de unión cambia en presencia del modulador candidato en comparación con la unión en ausencia del compuesto modulador candidato. Un modulador que incrementa la unión entre el polipéptido de NgR y el compuesto compañero de unión se describe como un intensificador o activador, y el modulador que disminuye la unión entre el polipéptido de NgR y el compuesto compañero de unión se describe como un inhibidor.

En otro caso, los moduladores de la expresión de NgR se pueden identificar en un método en el que se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm o la proteína de NgR. El nivel de expresión del ARNm o la proteína de NgR en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm o la proteína de NgR en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato se puede identificar después como modulador de la expresión de NgR basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o la proteína de NgR es mayor (estadísticamente significativamente mayor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión del ARNm o la proteína de NgR. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o la proteína de NgR es menor (estadísticamente significativamente menor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión del ARNm o la proteína de NgR. El nivel de expresión de ARNm o proteína de NgR en las células se puede determinar mediante los métodos descritos en la presente memoria para detectar ARNm o proteína de NgR.

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Escrutinio de Alto Rendimiento

La descripción también comprende análisis de escrutinio de alto rendimiento (HTS) para identificar compuestos que interaccionan con o inhiben la actividad biológica (esto es, afectan a la actividad enzimática, la actividad de unión, etc.) de un polipéptido de NgR. Los análisis HTS permiten el escrutinio de un gran número de compuestos de una manera eficaz. Los sistemas HTS basados en células se contemplan para investigar la interacción receptor NgR-ligando. Los análisis HTS se diseñan para identificar los "éxitos" o "compuestos cabeza de serie" que tienen la propiedad deseada, a partir de los cuales se pueden diseñar modificaciones para mejorar la propiedad deseada. La modificación química del "éxito" o "compuesto cabeza de serie" se basa a menudo en una relación estructura/actividad identificable entre el "éxito" y el polipéptido de NgR.

Otro aspecto de la presente descripción está dirigido a métodos de identificación de compuestos que se unen a NgR o a moléculas de ácido nucleico que codifican NgR, que comprenden poner en contacto NgR, o una molécula de ácido nucleico que lo codifica, con un compuesto, y determinar si el compuesto se une a NgR o a una molécula de ácido nucleico que lo codifica. La unión se puede determinar mediante análisis de unión que son bien conocidos por los expertos, incluyendo, pero no limitados a, análisis de desplazamiento en gel, transferencias Western, análisis de competición radiomarcados, clonación de la expresión basada en fagos, co-fraccionamiento mediante cromatografía, co-precipitación, entrecruzamiento, análisis de trampa de interacción/dos híbridos, análisis Southwestern, ELISA, y similares, que describen, por ejemplo, Ausubel et al., (Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1999, John Wiley and Sons, NY. Las proteínas de NgR, por ejemplo, se pueden utilizar como "proteínas cebo" en un análisis de dos híbridos (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.283.317; Zervos et al., (1993) Cell 72, 223-232; Madura et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 12046-12054; Bartel et al., (1993) BioTechniques 14, 920-924; Iwabuchi et al., (1993) Oncogene 8, 1693-1696; y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas que se unen a o interaccionan con NgR ("proteínas de unión a NgR" o "NgR-bp") y modulan la actividad de NgR. También es probable que tales proteínas de unión a NgR estén implicadas en la propagación de señales por las proteínas NgR como, por ejemplo, los elementos aguas arriba o aguas abajo de la ruta de NgR.

Se pueden utilizar otros análisis para identificar ligandos específicos de un receptor NgR, incluyendo análisis que identifican ligandos de la proteína diana a través de la medida directa de la unión de los ligandos de ensayo a la proteína diana, así como análisis que identifican los ligandos de las proteínas diana a través de ultrafiltración por afinidad con métodos de espectroscopía de masas con pulverización de iones/HPLC u otros métodos físicos y analíticos. Alternativamente, semejantes interacciones se evalúan indirectamente utilizando el sistema de dos híbridos de levadura descrito por Fields et al, (1989) Nature 340, 245-246, y Fields et al., (1994) Trends Genet. 10, 286-292. El sistema de dos híbridos es un análisis genético basado en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción utilizados para detectar interacciones entre dos proteínas o polipéptidos. Se puede utilizar para identificar proteínas que se unen a una proteína de interés conocida, o para delinear dominios o residuos críticos para una interacción. Se han desarrollado variaciones de esta metodología para clonar genes que codifican proteínas de unión a ADN, para identificar péptidos que se unen a una proteína, y para escrutar fármacos. El sistema de dos híbridos explota la capacidad de un par de proteínas interaccionantes para llevar un dominio de activación de la transcripción muy cerca de un dominio de unión a ADN que se une a una secuencia de activación aguas arriba (UAS) de un gen informador, y se realiza generalmente en levaduras. El análisis requiere la construcción de dos genes híbridos que codifican (1) un dominio de unión a ADN que está fusionado a una primera proteína y (2) un dominio de activación fusionado a una segunda proteína. El dominio de unión a ADN dirige la primera proteína híbrida a la UAS del gen informador; no obstante, debido a que la mayoría de las proteínas carecen de un dominio de activación, esta proteína híbrida de unión a ADN no activa la transcripción del gen informador. La segunda proteína híbrida, que contiene el dominio de activación, no puede activar por sí misma la expresión del gen informador debido a que no se une a la UAS. No obstante, cuando ambas proteínas están presentes, la interacción no covalente de la primera y la segunda proteína traba el dominio de activación a la UAS, activando la transcripción del gen informador. Por ejemplo, cuando la primera proteína es un producto génico de NgR, o uno de sus fragmentos, que se sabe que interacciona con otra proteína o ácido nucleico, se puede utilizar este análisis para detectar agentes que interfieren en la interacción de unión. La expresión del gen informador se controla a medida que se añaden al sistema diferentes agentes de ensayo. La presencia de un agente inhibidor da como resultado la carencia de una señal informadora. Los compuestos que se van a escrutar (que pueden incluir compuestos que se sospecha que se unen a NgR, o una molécula de ácido nucleico que los codifica) incluyen, pero no están limitados a, los de origen extracelular, intracelular, biológico o químico.

La función del producto génico de NgR no está clara y todavía no se han descubierto ligandos que se unan al producto génico. El análisis de dos híbridos en levadura es útil para identificar proteínas que se unen al producto génico. En un análisis para identificar proteínas que se unen a un receptor NgR, o uno de sus fragmentos, se puede utilizar un polinucleótido de fusión que codifica tanto un receptor NgR (o fragmento) como un dominio de unión a UAS (esto es, una primera proteína). Además, se producen y se escrutan en el análisis un gran número de genes híbridos que codifican cada uno una segunda proteína diferente fusionada a un dominio de activación. Típicamente, la segunda proteína es codificada por uno o más miembros de un ADNc total o una genoteca de fusión con ADN genómico, estando fusionada cada región codificante de la segunda proteína al dominio de activación. Este sistema es aplicable a una amplia variedad de proteínas, y ni siquiera es necesario conocer la identidad o función de la segunda proteína de unión. El sistema es muy sensible y puede detectar interacciones no reveladas por otros métodos; incluso las interacciones transitorias pueden provocar la transcripción para producir un ARNm estable que puede ser traducido repetidamente para producir la proteína informadora.

Se pueden utilizar otros análisis para buscar agentes que se unan a la proteína diana. Uno de tales métodos de escrutinio para identificar la unión directa de los ligandos de ensayo a una proteína diana se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.277. Este método cuenta con el principio de que las proteínas existen generalmente en forma de una mezcla de estados plegados y desplegados, y se alternan continuamente entre estos dos estados. Cuando un ligando de ensayo se une a la forma plegada de una proteína diana (esto es, cuando el ligando de ensayo es un ligando de la proteína diana), la molécula de proteína diana unida por el ligando se conserva en su estado plegado. De este modo, la proteína diana plegada está presente en mayor grado en presencia de un ligando de ensayo que se une a la proteína diana, que en ausencia de un ligando. La unión del ligando a la proteína diana se puede determinar mediante cualquier método que distinga entre los estados plegado y desplegado de la proteína diana. Para realizar este análisis no es necesario conocer la función de la proteína diana. Mediante este método se puede evaluar virtualmente cualquier agente como ligando de ensayo, incluyendo, pero no limitados a, metales, polipéptidos, proteínas, lípidos, polisacáridos, polinucleótidos y moléculas orgánicas pequeñas.

Otro método para identificar los ligandos de una proteína diana es descrito por Wieboldt et al., (1997) Anal. Chem. 69:1683-1691. Esta técnica escruta genotecas combinatorias de 20-30 agentes de una vez en fase de disolución en busca de la proteína diana. Los agentes que se unen a la proteína diana se separan de los demás componentes de la genoteca mediante simple lavado de la membrana. Las moléculas seleccionadas específicamente que son retenidas en el filtro se liberan con posterioridad de la proteína diana y se analizan mediante HPLC y espectroscopía de masas de ionización por electropulverización asistida neumáticamente. Este procedimiento selecciona los componentes de la genoteca con mayor afinidad por la proteína diana, y es particularmente útil para genotecas de moléculas
pequeñas.

Los métodos de esta descripción también incluyen ligandos, especialmente neuropéptidos, que están anclados a una marca, tal como una radiomarca (p. ej., I^{125}, S^{35}, P^{32}, P^{33}, H^{3}), una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca enzimática y una marca inmunogénica. Los moduladores que se encuentran dentro del alcance de la descripción incluyen, pero no están limitados a, moléculas no peptídicas tales como miméticos no peptídicos, efectores alostéricos no peptídicos, y péptidos. El polipéptido o polinucleótido de NgR empleado en semejante ensayo puede estar libre en disolución, anclado a un soporte sólido, portado por una superficie celular o localizado intracelularmente o asociado con una porción de una célula. Un experto en la técnica puede, por ejemplo, medir la formación de complejos entre NgR y el compuesto que está siendo sometido a ensayo. Alternativamente, un experto en la técnica puede examinar la disminución de la formación de complejo entre NgR y su sustrato causada por el compuesto que está siendo sometido a ensayo.

Otro aspecto de la presente descripción está dirigido a métodos para identificar compuestos que modulan (esto es, aumentan o disminuyen) la actividad de NgR que comprenden poner en contacto NgR con un compuesto, y determinar si el compuesto modifica la actividad de NgR. La actividad en presencia del compuesto de ensayo se compara con la actividad en ausencia de compuesto de ensayo. Cuando la actividad de la muestra que contiene el compuesto de ensayo es mayor que la actividad de la muestra que carece de compuesto de ensayo, el compuesto tendrá una actividad incrementada. De un modo similar, cuando la actividad de la muestra que contiene el compuesto de ensayo es menor que la actividad de la muestra que carece de compuesto de ensayo, el compuesto tendrá una actividad
inhibida.

La presente descripción es particularmente útil para escrutar compuestos utilizando NgR en cualquiera de una variedad de técnicas de escrutinio de fármacos. Los compuestos a escrutar (que pueden incluir compuestos que se sospecha que modulan la actividad de NgR) incluyen, pero no están limitados a, los de origen extracelular, intracelular, biológico o químico. El polipéptido de NgR empleado en semejante ensayo puede estar en cualquier forma, preferiblemente libre en disolución, anclado a un soporte sólido, portado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Un experto en la técnica puede, por ejemplo, medir la formación de complejos entre NgR y el compuesto que está siendo sometido a ensayo. Alternativamente, un experto en la técnica puede examinar la disminución de formación de complejo entre Nogo-R y su sustrato causada por el compuesto que está siendo sometido
a ensayo.

La actividad de los polipéptidos de NgR de la invención se puede determinar, por ejemplo, examinando la capacidad para unirse o ser activado por los ligandos peptídicos sintetizados químicamente. Alternativamente, la actividad del NgR puede ser analizada examinando su capacidad para unirse a iones calcio, hormonas, quimioquinas, neuropéptidos, neurotransmisores, nucleótidos, lípidos, odorantes y fotones. Alternativamente, se puede determinar la actividad de NgR examinando la actividad de las moléculas efectoras incluyendo, pero no limitadas a, adenilato ciclasa, fosfolipasas y canales iónicos. De este modo, los moduladores de la actividad de NgR pueden alterar una función del receptor NgR, tal como una propiedad de unión de un receptor o una actividad. En diferentes realizaciones del método, el análisis puede adoptar la forma de un análisis de flujo de iones, un análisis de crecimiento de levadura, un análisis con GTP no hidrolizable tal como un análisis con GTP S-[S^{35}], un análisis con AMPc, un análisis con trifosfato de inositol, un análisis con diacilglicerol, un análisis con Aequorina, un análisis con Luciferasa, un análisis con FLIPR para la concentración de Ca^{2+} intracelular, un análisis de mitogénesis, un análisis de actividad quinasa MAP, un análisis de liberación de ácido araquidónico (p. ej., utilizando ácido araquidónico-[H]^{3}) y un análisis para velocidades de acidulación extracelular, así como otros análisis de unión o basados en la función de la actividad de NgR que son conocidos generalmente en la técnica. La actividad de NgR se puede determinar mediante metodologías que se utilizan para analizar la actividad de FaRP, que es bien conocida por los expertos en la técnica. Las actividades biológicas de los receptores NgR de acuerdo con la invención incluyen, pero no están limitadas a, la unión de un ligando natural o no natural, así como una cualquiera de las actividades funcionales de NgR conocidas en la técnica. Los ejemplos no limitantes de las actividades de NgR incluyen la señalización transmembrana de diferentes formas, que pueden implicar la asociación con fosfatidilinositol (PI) y/o el ejercicio de influencia sobre PI; otra actividad ilustrativa de los NgR es la unión de proteínas accesorias o polipéptidos que difieren de las proteínas de GPI conocidas.

Los moduladores de la descripción muestran una variedad de estructuras químicas, que pueden ser agrupadas generalmente en miméticos no peptídicos de los ligandos del receptor NgR naturales, efectores alostéricos peptídicos y no peptídicos de los receptores NgR, y péptidos que pueden funcionar como activadores o inhibidores (competitivos, acompetitivos y no competitivos) (p. ej., productos de anticuerpos) de los receptores NgR. La descripción no restringe las fuentes de moduladores adecuados, que se pueden obtener a partir de fuentes naturales tales como extractos de plantas, animales o minerales, o fuentes no naturales tales como genotecas de moléculas pequeñas, incluyendo los productos de los enfoques químicos combinatorios para la construcción de genotecas, y genotecas peptídicas.

Se pueden utilizar otros análisis para examinar la actividad enzimática incluyendo, pero no limitados a, fotométricos, radiométricos, HPLC, electroquímicos, y similares, que se describen, por ejemplo, en ENZYME ASSAYS: A PRACTICAL APPROACH, Eisenthal and Danson (Eds.), 1992, Oxford University Press.

El uso de ADNc en los programas de descubrimiento de fármacos es bien conocido; los análisis capaces de someter a ensayo miles de compuestos conocidos por día en escrutinios de alto rendimiento (HTS) están perfectamente documentados. La literatura está repleta de ejemplos del uso de ligandos radiomarcados en los análisis de unión HTS para el descubrimiento de fármacos (véase Williams (1991) Med. Res. Rev., 11, 147-184; Sweetnam et al., (1993) J. Nat. Prod. 56, 441-455 para una revisión). Se prefieren los receptores recombinantes para el análisis de unión HST debido a que permiten una mayor especificidad (pureza relativamente superior), proporcionan la capacidad de generar grandes cantidades de material receptor, y pueden ser utilizados en una amplia variedad de formatos (véase Hodgson (1992) Bio/Technology 10, 973-980.

Se encuentra disponible una variedad de sistemas heterólogos para la expresión funcional de receptores recombinantes que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales sistemas incluyen bacterias (Strosberg et al., (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13, 95-98), levadura (Pausch (1997) Trends Biotechnol. 15, 487-494), varias clases de células de insecto (Vanden Broeck (1996) Int. Rev. Cytol. 164, 189-268), células de anfibio (Jayawickreme et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 629-634) y diversas líneas de células de mamífero (CHO, HEK293, COS, etc: véase Gerhardt et al. (1997) Eur. J. Pharmacol. 334, 1-23). Estos ejemplos no excluyen el uso de otros posibles sistemas de expresión celular, incluyendo líneas celulares obtenidas de nematodos (solicitud PCT WO 98/37177).

En los casos preferidos, los métodos de escrutinio de compuestos que modulan la actividad de NgR comprenden poner en contacto los compuestos de ensayo con NgR y analizar la presencia de un complejo entre el compuesto y NgR. En tales análisis, el ligando está marcado típicamente. Después de una incubación adecuada, se separa el ligando libre del presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o que no forma complejo es una medida de la capacidad de un compuesto concreto para unirse a NgR.

En otro caso, se emplea el escrutinio de alto rendimiento de compuestos que tienen una afinidad de unión a NgR adecuada. En resumen, se sintetizan un gran número de compuestos de ensayo peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido. Los compuestos de ensayo peptídicos se ponen en contacto con NgR y se lavan. El NgR unido se detecta después mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos de esta descripción, p. ej. los polipéptidos purificados de la invención, también se pueden aplicar como recubrimiento directamente sobre placas para su uso en las técnicas de escrutinio de fármacos anteriormente mencionadas. Además, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizadores para capturar la proteína e inmovilizarla sobre un soporte sólido.

Generalmente, se puede utilizar el NgR expresado para los análisis de unión HTS junto con su ligando definido. El péptido identificado se marca con un radiosótopo adecuado, incluyendo, pero no limitado a, I^{125}, H^{3}, S^{35} o P^{32}, mediante métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, los péptidos se pueden marcar mediante métodos bien conocidos con un derivado fluorescente adecuado (Baindur et al. (1994) Drug Dev. Res. 33, 373-398; Rogers (1997) Drug Discov. Today 2, 156-160). El ligando radiactivo unido específicamente al receptor en las preparaciones de membrana elaboradas a partir de la línea celular que expresa la proteína recombinante puede ser detectado en los análisis HTS en una de las numerosas maneras, incluyendo la filtración del complejo receptor-ligando para separar el ligando unido del ligando no unido (Williams (1991) Med. Res. Rev. 11, 147-184; Sweetnam et al. (1993) J. Nat. Prod. 56, 441-455). Los métodos alternativos incluyen un análisis de proximidad de centelleo (SPA) o un formato FlashPlate en el cual no es necesaria la separación (Nakayama (1998) Curr. Opin. Drug. Disc. Dev. 1, 85-91, Bossé et al. (1998) J. Biomol. Screening 3, 285-292). La unión de ligandos fluorescentes se puede detectar de diferentes maneras, incluyendo la transferencia de energía de fluorescencia (FRET), el análisis espectrofotofluorométrico directo del ligando unido, o la polarización de la fluorescencia (Rogers (1997) Drug Discov. Today 2, 156-160; Hill (1998) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 1, 92-97).

Los ejemplos de tales respuestas biológicas incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: la capacidad para sobrevivir en ausencia de un nutriente limitante en células de levadura diseñadas específicamente (Pausch (1997) Trend in Biotechnol. 15, 487-494); cambios en la concentración de Ca^{2+} intracelular medidos mediante colorantes fluorescentes (Murphy et al. (1998) Cur. Opin. Drug Disc. Dev. 1, 192-199). Los cambios de fluorescencia también se pueden utilizar para controlar los cambios inducidos por el ligando en el potencial de membrana o el pH intracelular; se ha descrito un sistema automatizado adecuado para HTS con este fin (Schroeder et al. (1996) J. Biomol. Screening. 1, 75-80). Los melanóforos preparados a partir de Xenopus laevis muestran un cambio dependiente del ligando en la orientación del pigmento en respuesta a la activación de NgR heterólogo; esta respuesta es adaptable a los formatos HTS (Jayawickreme et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 629-634). También se encuentran disponibles análisis para la medida de segundos mensajeros comunes, incluyendo AMPc, fosfoinosítidos y ácido araquidónico, pero estos no son generalmente preferidos para HTS.

Los métodos de HTS preferidos que emplean estos receptores incluyen células CHO transfectadas permanentemente, en los cuales se pueden identificar agonistas y antagonistas mediante la capacidad para transducir la señal para la unión de Nogo en membranas preparadas a partir de estas células a través de la supuesta ancla de GPI. En otro caso se podrían utilizar células CHO transfectadas permanentemente para la preparación de membranas que contienen cantidades significativas de las proteínas receptoras recombinantes; estas preparaciones de membrana se utilizarían después en análisis de unión al receptor, empleando el ligando radiomarcado específico para el receptor concreto. Alternativamente, se preferiría para el HTS un análisis funcional, tal como el control mediante fluorescencia de los cambios inducidos por el ligando en la concentración interna de Ca^{2+} o el potencial de membrana en células CHO transfectadas permanentemente que contienen cada uno de estos receptores individualmente o combinados. Igualmente preferido sería un tipo alternativo de célula de mamífero, tales como las células HEK293 o COS, en formatos similares. Serían más preferidas las líneas de células de insecto transfectadas permanentemente, tales como las células S2 de Drosophila. Serían aún más preferidas las células de levadura recombinantes que expresan los receptores de Drosophila melanogaster en formatos HTS bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., Pausch (1997), más arriba).

La descripción contempla una multitud de análisis para escrutar e identificar los inhibidores de la unión del ligando a los receptores NgR. En un ejemplo, el receptor NgR es inmovilizado y la interacción con un compañero de unión es evaluada en presencia y ausencia de un modulador candidato tal como un compuesto inhibidor. En otro ejemplo, la interacción entre el receptor NgR y su compañero de unión se evalúa en un análisis en solución, tanto en presencia como en ausencia de un compuesto inhibidor candidato. En cualquier análisis, un inhibidor se identifica como un compuesto que disminuye la unión entre el receptor NgR y su compañero de unión. Otro análisis contemplado implica una variación del análisis de dos híbridos donde se identifica un inhibidor de las interacciones proteína/proteína mediante la detección de una señal positiva en una célula anfitriona transformada o transfectada, como se describe en la publicación PCT número WO 95/20652, publicada el 3 de Agosto de 1995.

Los moduladores candidato contemplados por la descripción incluyen compuestos seleccionados de genotecas de activadores potenciales o inhibidores potenciales. Existen numerosas genotecas diferentes utilizadas para la identificación de moduladores de molécula pequeña, incluyendo: (1) genotecas químicas, (2) genotecas de productos naturales, y (3) genotecas combinatorias de péptidos al azar constituidas por péptidos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas al azar. Las genotecas químicas consisten en estructuras químicas al azar, algunas de las cuales son análogos de compuestos conocidos o análogos de compuestos que han sido identificados como "éxitos" o "cabezas de serie" en otros escrutinios para el descubrimiento de fármacos, algunos de los cuales derivan de productos naturales, y algunos de los cuales surgen de la química orgánica sintética no dirigida. Las genotecas de productos naturales son colecciones de microorganismos, animales, plantas, u organismos marinos que se utilizan para crear mezclas para el escrutinio mediante: (1) fermentación y extracción de caldos de microorganismos de suelo, vegetales o marinos o (2) extracción de organismos vegetales o marinos. Las genotecas de productos naturales incluyen policétidos, péptidos no ribosomales, y variantes (de origen no natural) de los mismos. Para una revisión, véase Cane et al., Science (1998) 282, 63-68. Las genotecas combinatorias están compuestas por un gran número de péptidos, oligonucleótidos, o compuestos orgánicos en forma de mezcla. Estas genotecas son relativamente fáciles de preparar mediante métodos de síntesis automatizada tradicionales, PCR, clonación, o métodos sintéticos apropiados. Tienen un particular interés las genotecas combinatorias no peptídicas. Otras genotecas de interés incluyen genotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticos, colecciones sintéticas multiparalelas, recombinatorias, y de polipéptidos. Para una revisión de la química combinatoria y las genotecas creadas a partir de allí, véase Meyers (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 701-701. La identificación de moduladores a través del uso de las diferentes genotecas descritas en la presente memoria permite la modificación del "éxito" (o "cabeza de serie") candidato para optimizar la capacidad del "éxito" para modular la actividad.

Se pueden diseñar otros inhibidores candidato más contemplados por la descripción e incluyen formas solubles de compañeros de unión, así como compañeros de unión tales como proteínas quiméricas o de fusión. Un "compañero de unión" según se utiliza en la presente memoria incluye en sentido amplio moduladores no peptídicos, así como moduladores peptídicos tales como neuropéptidos distintos de ligandos naturales, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y compuestos modificados que comprenden dominios de anticuerpos que son inmunoespecíficos para el producto de expresión del gen NgR identificado.

Otros casos comprenden la utilización de análisis de escrutinio competitivos en los cuales compiten específicamente anticuerpos neutralizadores capaces de unirse a un polipéptido de esta descripción, p. ej., un polipéptido de la invención, con un compuesto de ensayo por la unión al polipéptido. De esta manera, se pueden utilizar los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con NgR. Los estudios de unión competitiva radiomarcados son descritos por Lin et al., (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41, 2127-2131.

En otros casos, se emplean los polipéptidos de esta descripción, incluyendo los de la invención, como herramienta de búsqueda para la identificación, caracterización y purificación de proteínas reguladoras, interaccionantes. Se incorporan marcas apropiadas a los polipéptidos de la descripción mediante diferentes métodos conocidos en la técnica y se utilizan los polipéptidos para capturar moléculas interaccionantes. Por ejemplo, se incuban las moléculas con los polipéptidos marcados, se lavan para separar los polipéptidos no unidos, y se cuantifica el complejo polipeptídico. Los datos obtenidos utilizando diferentes concentraciones de polipéptido se utilizan para calcular valores para el número, afinidad, y asociación de polipéptido con el complejo de proteína.

Los polipéptidos marcados también son útiles como reactivos para la purificación de moléculas con las cuales interacciona el compuesto, incluyendo, pero no limitados a, inhibidores. En un caso de purificación por afinidad, se acopla covalentemente un polipéptido a una columna de cromatografía. Las células y sus membranas se extraen, y los diferentes subcomponentes celulares se hacen pasar a través de la columna. Las moléculas se unen a la columna en virtud de su afinidad hacia el polipéptido. El complejo de polipéptido se recupera de la columna, se disocia y la molécula recuperada se somete a secuenciación de la proteína. Esta secuencia de aminoácidos se utiliza después para identificar la molécula capturada o para diseñar oligonucleótidos degenerados para la clonación del gen correspondiente a partir de una genoteca de ADNc apropiada.

Alternativamente, se pueden identificar compuestos que muestran propiedades similares al ligando para el NgR de esta descripción, pero que son más pequeños y muestran una vida media más prolongada que el ligando endógeno en un organismo humano o animal. Cuando se diseña un compuesto orgánico, se utiliza una molécula de acuerdo con la invención como compuesto "cabeza de serie". El diseño de miméticos de compuestos farmacéuticamente activos conocidos es un enfoque bien conocido en el desarrollo de fármacos basado en tales compuestos "cabeza de serie". El diseño, la síntesis y la probatura de los miméticos se utilizan generalmente para evitar el escrutinio al azar de un gran número de moléculas para una propiedad diana. Además, los datos estructurales que derivan del análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por los ADN de la presente descripción son útiles para diseñar nuevos fármacos, más específicos y por lo tanto con una mayor potencia farmacológica.

La comparación de la secuencia de proteínas de la presente descripción con las secuencias presentes en todas las bases de datos disponibles mostró una homología significativa con la porción transmembrana de los receptores acoplados a la proteína G. Por consiguiente, se puede utilizar el modelado por ordenador para desarrollar una supuesta estructura terciaria de las proteínas de la invención basándose en la información disponible del dominio transmembrana de otras proteínas. De este modo, se pueden diseñar ligandos novedosos basados en la estructura pronosticada de NgR.

Esta descripción está relacionada con agentes novedosos identificados mediante los análisis de escrutinio descritos antes y con sus usos para los tratamientos descritos en la presente memoria.

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Composiciones y Composiciones Farmacéuticas

En un caso concreto, las moléculas novedosas identificadas mediante los métodos de escrutinio de acuerdo con esta descripción son moléculas orgánicas de bajo peso molecular, en cuyo caso se puede preparar una composición o una composición farmacéutica de la misma para la administración oral o parenteral. Las composiciones, o las composiciones farmacéuticas, que comprenden las moléculas de ácido nucleico, vectores, polipéptidos, anticuerpos y compuestos identificados mediante los métodos de escrutinio descritos en la presente memoria, comprenden típicamente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que "portador farmacéuticamente aceptable" incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. La naturaleza del portador u otros ingredientes dependerá de la ruta de administración específica y de la molécula concreta que se vaya a administrar. Los ejemplos de las técnicas y protocolos que son útiles en este contexto se encuentran, entre otros, en Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16^{a} ed., (1980) Osol, A (Ed.). Los ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, pero no están limitados a, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También se pueden utilizar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios.

La composición farmacéutica de esta descripción se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los ejemplos de las rutas de administración incluyen oral y parenteral (p. ej., la administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, por inhalación, transdérmica (tópica), transmucosal y rectal). Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyectables, solución salina, aceites fijados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico y metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético, tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o álcalis, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar incluida en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en inyectables incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes anti-bacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede propiciar incluyendo en las composiciones un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (p. ej., una proteína de NgR o un anticuerpo anti-NgR) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados antes. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado a vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo esterilizada por filtración previamente.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden estar incluidas en cápsulas de gelatina o comprimidas en comprimidos. Para el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado a excipientes y utilizado en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar utilizando un portador líquido para su uso como colutorio, donde el compuesto del líquido portador se aplica oralmente y se hacen buches y se expectora o se traga. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o los materiales coadyuvantes pueden estar incluidos como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotex; un antiapelmazante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos se liberan en forma de una pulverización en aerosol de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, p. ej., un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a atravesar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmuscosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr por medio del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como es sabido generalmente en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (p. ej., con bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la liberación rectal.

En un caso, los compuestos activos se preparan con portadores que protejan el compuesto de la rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.522.811. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria utilizada en la presente memoria hace referencia a unidades físicamente discretas ajustadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se vaya a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitarias de esta descripción están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se vaya a conseguir.

Las moléculas de ácido nucleico de esta descripción, incluyendo las de la invención, pueden ser insertadas en vectores y utilizadas como vectores para la terapia génica. Los vectores para la terapia génica pueden ser liberados en un sujeto mediante cualquiera de las varias rutas de administración, p. ej., como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm.5.703.055. La liberación también puede incluir de este modo, p. ej., la inyección intravenosa, la administración local (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.328.470) o la inyección estereotáctica (véase, p. ej., Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector para la terapia génica puede incluir el vector para la terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual está embebido el vehículo de liberación génica. Alternativamente, cuando el vector de liberación génica completo puede ser producido intacto a partir de células recombinantes, p. ej., vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de liberación génica.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones para su administración.

La dosificación de estos compuestos de bajo peso molecular dependerá de la enfermedad o afección que se va a tratar y de otros factores clínicos tales como el peso y el estado del ser humano o animal y la ruta de administración del compuesto. Para tratar seres humanos o animales, se pueden administrar entre aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal del compuesto. La terapia se administra típicamente a dosis inferiores y se continúa hasta que se observa el resultado terapéutico deseado.

Otro aspecto de la presente descripción es el uso de las secuencias de nucleótidos de NgR descritas en la presente memoria para identificar homólogos del Nogo-R, en otros animales, incluyendo pero no limitados a seres humanos y otros mamíferos e invertebrados. Se puede utilizar cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria, o cualquiera de sus porciones, por ejemplo, como sondas para escrutar bases de datos o genotecas de ácido nucleico, tales como, por ejemplo, genotecas genómicas o de ADNc, para identificar homólogos utilizando procedimientos de escrutinio bien conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pueden identificar los homólogos que tienen una homología de al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y muy preferiblemente al menos 100% con las secuencias de NgR.

Los presentes compuestos y métodos, incluyendo las moléculas de ácido nucleico, los polipéptidos, los anticuerpos, los compuestos identificados mediante métodos de escrutinio descritos en la presente memoria, tienen una variedad de aplicaciones farmacéuticas y se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar o prevenir el crecimiento celular desregulado, tal como el crecimiento canceroso y el crecimiento tumoral. En un caso concreto, las presentes moléculas se utilizan en la terapia génica. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase, p. ej., Anderson Science (1992) 256, 808-813.

La presente descripción ilustra un método para suscitar agonismo (estimular) o antagonismo sobre la actividad asociada con el compañero de unión natural de NgR en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero un agonista o antagonista de uno de los polipéptidos descritos antes en una cantidad suficiente para suscitar agonismo o antagonismo. Un caso de la presente descripción es, en ese caso, un método de tratamiento de enfermedades en un mamífero con un agonista o antagonista de la proteína de la presente descripción que comprende administrar el agonista o antagonista a un mamífero en una cantidad suficiente para suscitar agonismo o antagonismo sobre las funciones asociadas a NgR.

Los métodos de determinación de las dosificaciones de los compuestos que se van a administrar a un paciente y los modos de administración a un organismo se describen en la Solicitud de los Estados Unidos Núm. de Serie 08/702.282, presentada el 23 de Agosto de 1996, y la Publicación de Patente Internacional número WO 96/22976, publicada el 1 de Agosto de 1996, ambas las cuales se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad, incluyendo todos los dibujos, figuras o tablas. Los expertos en la técnica apreciarán que tales descripciones son aplicables a la presente descripción y pueden ser fácilmente adaptadas a ella.

La dosificación apropiada depende de diferentes factores tales como el tipo de enfermedad que está siendo tratada, la composición concreta que está siendo utilizada y la talla y el estado fisiológico del paciente. Las dosis terapéuticamente eficaces para los compuestos descritos en la presente memoria pueden ser estimadas inicialmente a partir de cultivos celulares y modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que tenga en cuenta inicialmente la CI_{50} determinada en análisis con cultivos celulares. Los datos de los modelos animales se pueden utilizar para determinar más exactamente las dosis útiles en seres humanos.

También se pueden determinar la vida media en plasma y la biodistribución del fármaco y los metabolitos en el plasma, los tumores y los órganos principales para facilitar la selección de fármacos más apropiada para inhibir un trastorno. Tales medidas se pueden llevar a cabo. Por ejemplo, se puede realizar un análisis de HPLC en el plasma de los animales tratados con el fármaco y se puede determinar la localización de los compuestos radiomarcados utilizando métodos de detección tales como rayos X, barrido CAT y MRI. Los compuestos que muestran una actividad inhibidora potente en los análisis de escrutinio, pero tienen unas características farmacodinámicas malas, pueden ser optimizados alterando la estructura química y volviendo a someterlos a ensayo. Con respecto a esto, se pueden utilizar como modelo compuestos que presentan buenas características farmacodinámicas.

También se pueden llevar a cabo estudios de toxicidad midiendo la composición de las células de la sangre. Por ejemplo, los estudios de toxicidad se pueden llevar a cabo en un modelo animal adecuado como sigue: (1) se administra el compuesto a ratones (también se debe utilizar un ratón de control no tratado); (2) se obtienen periódicamente muestras de sangre a través de la vena de la cola de un ratón en cada grupo de tratamiento; y (3) se analizan las muestras en cuanto a los recuentos de glóbulos rojos y blancos, la composición de las células de la sangre y el porcentaje de linfocitos frente a células polimorfonucleares. Una comparación de los resultados para cada régimen de dosificación con los controles indica si se encuentra presente toxicidad.

Al terminar cada estudio de toxicidad, se pueden llevar a cabo estudios adicionales sacrificando los animales (preferiblemente, de acuerdo con las pautas de la American Veterinary Medical Association, Report of the American Veterinary Medical Assoc. Panel on Euthanasia, (1993) J. Am. Vet. Med. Assoc. 202:29-249). Los animales representativos de cada grupo de tratamiento se pueden examinar después mediante necropsia grosera en busca de evidencia inmediata de metástasis, enfermedad o toxicidad inusuales. Se observan las anomalías groseras en los tejidos y se examinan histológicamente los tejidos. Los compuestos que ocasionan una reducción del peso corporal o los componentes de la sangre son menos preferidos, ya que son compuestos que tienen un efecto adverso sobre los órganos principales. En general, cuanto mayor es el efecto adverso menos preferido es el compuesto.

Para el tratamiento de los cánceres la dosis diaria esperada de un agente farmacéutico hidrófobo es de 1 a 500 mg/día, preferiblemente de 1 a 250 mg/día, y muy preferiblemente de 1 a 50 mg/día. Los fármacos pueden ser liberados menos frecuentemente siempre que los niveles en plasma del radical activo sean suficientes para mantener la eficacia terapéutica. Los niveles en plasma deben reflejar la potencia del fármaco. Generalmente, cuanto más potente es el compuesto menores son los niveles en plasma necesarios para lograr la eficacia.

Se han descubierto transcritos de ARNm de NgR en el cerebro y el corazón. Los SEQ ID NO: 1 y/o 3, permitirán, como se ha detallado antes, el escrutinio de neurotransmisores/hormonas/ligandos endógenos que activan, suscitan agonismo, o antagonismo sobre NgR y los compuestos con utilidad potencial en el tratamiento de trastornos incluyendo trastornos del SNC (p. ej., ictus) y trastornos degenerativos tales como los asociados con la desmielinización.

Por ejemplo, la activación del receptor NgR puede mediar la prevención del sobrecrecimiento de las neuritas. La inhibición sería beneficiosa tanto en la lesión cerebral crónica como aguda. Véase, p. ej., Donovan et al. (1997) J. Neurosci. 17, 5316-5326; Turgeon et al., (1998) J. Neurosci. 18, 6882-6891; Smith-Swintosky et al., (1997) J. Neurochem. 69, 1890-1896; Gill et al., (1998) Brain Res. 797, 321-327; Suidan et al., (1996) Semin. Thromb. Hemost. 22, 125-133.

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Farmacogenómica

Los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulador o inhibidor de la actividad de NgR (p. ej., expresión génica de NgR), identificados mediante un análisis de escrutinio descrito en la presente memoria se pueden administrar a individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) los trastornos (p. ej., enfermedades tales como trastornos por desmielinización) asociados con la actividad aberrante de NgR. Junto con semejante tratamiento, se puede considerar la farmacogenómica (esto es, el estudio de la relación entre el genotipo del individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto foráneo o fármaco) del individuo. Las diferencias en el metabolismo de los agentes terapéuticos pueden conducir a una toxicidad grave o a un fracaso terapéutico al alterar la relación entre la dosis y la concentración en sangre del fármaco farmacológicamente activo. De este modo, la farmacogenómica del individuo permite la selección de agentes eficaces (p. ej., fármacos) para tratamientos profilácticos o terapéuticos basados en la consideración del genotipo del individuo. Tal farmacogenómica se puede utilizar adicionalmente para determinar las dosificaciones y los regímenes terapéuticos apropiados. Por consiguiente, se pueden determinar la actividad de la proteína de NgR, la expresión del ácido nucleico de NgR o el contenido de mutaciones de los genes de NgR en un individuo para seleccionar de ese modo uno o varios agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo.

La farmacogenómica se ocupa de las variaciones hereditarias clínicamente significativas en respuesta a los fármacos debido a una disposición alterada y una acción anómala del fármaco en personas afectadas. Véase p. ej., Eichelbaum (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 983-985 y Linder (1997) Clin. Chem. 43, 254-266. En general, se pueden diferenciar dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un factor único que altera el modo en el que los fármacos actúan en el organismo (acción alterada del fármaco) o las condiciones genéticas transmitidas como factores únicos que alteran el modo en el que el organismo actúa sobre los fármacos (metabolismo alterado del fármaco). Estas condiciones farmacogenéticas se pueden producir como defectos raros o como polimorfismos. Por ejemplo, la carencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía heredada común en la cual la principal complicación clínica es la hemolisis después de la ingestión de fármacos oxidantes (anti-maláricos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y el consumo de habas.

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Como caso ilustrativo, la actividad de enzimas metabolizadoras de fármacos es uno de los determinantes principales tanto de la intensidad como de la duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de enzimas metabolizadoras de fármacos (p. ej., N-acetiltransferasa 2 (NAT-2) y las enzimas de citocromo P450 CYP2D6 y CYp2C19) ha proporcionado una explicación en cuanto a por qué algunos pacientes no obtienen los efectos esperados de los fármacos o muestran una respuesta exagerada y una grave toxicidad después de ingerir la dosis convencional y segura de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en la población en dos fenotipos, el metabolizador extensivo (EM) y el metabolizador pobre (PM). La prevalencia de PM es diferente entre las diferentes poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es altamente polimórfico y se han identificado varias mutaciones en PM, que conducen todas a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores pobres de CYP2D6 y CYP2C19 experimentan bastante frecuentemente una respuesta y unos efectos secundarios para el fármaco exagerados cuando reciben dosis convencionales. Si un metabolito es el radical terapéutico activo, PM no muestra respuesta terapéutica, como se demuestra mediante el efecto analgésico de la codeína mediado por su metabolito formado con CYP2D6 morfina. En el otro extremo están los denominados metabilizadores ultrarrápidos que no responden a las dosis convencionales. Recientemente, se ha identificado que la base molecular del metabolismo ultrarrápido se debe a la amplificación del gen CYP2D6.

De este modo, se puede determinar la actividad de la proteína de NgR, la expresión del ácido nucleico de NgR, o el contenido de mutaciones de los genes de NgR en un individuo para seleccionar de ese modo uno o varios agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Además, se pueden utilizar los estudios farmacogenéticos para aplicar la genotipificación de alelos polimórficos que codifican las enzimas metabolizadoras de fármacos a la identificación del fenotipo de sensibilidad al fármaco de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la selección de la dosificación o el fármaco, puede evitar reacciones adversas o el fracaso terapéutico y de este modo potencia la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata a un sujeto con un modulador de NgR, tal como un modulador identificado por uno de los análisis de escrutinio ilustrativos descritos en la presente memoria.

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Verificación de la Eficacia Clínica

La verificación de la influencia de los agentes (p. ej., fármacos, compuestos) sobre la expresión o actividad de NgR (p. ej., la capacidad para modular la proliferación y/o la diferenciación celular aberrante) se puede aplicar no solamente en el escrutinio de fármacos básico, si no también en pruebas clínicas. Por ejemplo, la eficacia de un agente determinada mediante un análisis de escrutinio como se ha descrito en la presente memoria para incrementar la expresión génica de NgR, los niveles de proteína o regular al alza la actividad de NgR, puede ser verificada en pruebas clínicas de sujetos que muestran una disminución de la expresión génica de NgR, los niveles de proteína, o la actividad de NgR regulada a la baja. Alternativamente, la eficacia de un agente determinada mediante análisis de escrutinio para disminuir la expresión génica de NgR, los niveles de proteína, o regular a la baja la actividad de NgR, puede ser verificada en pruebas clínicas de sujetos que muestran un incremento de expresión génica de NgR, los niveles de proteína, o la actividad de NgR regulada al alza. En tales pruebas clínicas, se puede utilizar la expresión o actividad de NgR y, preferiblemente, otros genes que han sido implicados, por ejemplo, en una enfermedad o trastorno como "lectura" o marcador de la sensibilidad inmunitaria de una célula concreta.

Por ejemplo, se pueden identificar los genes, incluyendo el de NgR, que son modulados en células mediante el tratamiento con un agente (p. ej., compuesto, fármaco o molécula pequeña) que modula la actividad de NgR (p. ej., identificada en un análisis de escrutinio como se ha descrito en la presente memoria). De este modo, para estudiar el efecto de los agentes sobre los trastornos por desmielinización, por ejemplo, en una prueba clínica, se pueden aislar las células y preparar el ARN y analizar los niveles de expresión de NgR y los otros genes implicados en el trastorno. Los niveles de expresión génica (esto es, un patrón de expresión génica) pueden ser cuantificados mediante análisis de transferencia Northern o RT-PCR, como se describe en la presente memoria, o alternativamente midiendo la cantidad de proteína producida por uno de los métodos descritos en la presente memoria o midiendo los niveles de actividad de NgR u otros genes. De este modo, el patrón de expresión génica puede servir como marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células al agente. Por consiguiente, este estado de respuesta puede ser determinado antes, y en diferentes puntos durante, el tratamiento del individuo con el agente.

En un caso, la descripción proporciona un método para controlar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (p. ej., un agonista, antagonista, proteína, péptido, peptidomimético, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato a fármaco identificado mediante los análisis de escrutinio descritos en la presente memoria) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra de pre-administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de una proteína de NgR, ARNm, o ADN genómico en la muestra de pre-administración; (iii) obtener una o más muestras de post-administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína de NgR, ARNm, o ADN genómico en las muestras post-administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína de NgR, ARNm o ADN genómico en la muestra de pre-administración con la proteína de NgR, ARNm o ADN genómico en la muestra o las muestras de post-administración; y (vi) en consecuencia, alterar la administración del agente al sujeto. Por ejemplo, puede ser deseable aumentar de administración del agente para incrementar la expresión o actividad de NgR a niveles mayores de los detectados, esto es, para incrementar la eficacia del agente. Alternativamente, puede ser deseable disminuir la expresión o actividad de NgR a niveles menores de los detectados, esto es, para disminuir la eficacia del agente.

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Métodos de Tratamiento

La presente descripción ilustra los métodos tanto profilácticos como terapéuticos de tratamiento de un sujeto con riesgo (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la expresión o actividad de NgR aberrante.

Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por un incremento (con respecto a un sujeto que no padece la enfermedad o trastorno) de los niveles o la actividad biológica se pueden tratar con agentes Terapéuticos que suscitan antagonismo (esto es, reducen o inhiben) la actividad. Los agentes terapéuticos que suscitan actividad antagónica pueden ser administrados de una manera terapéutica o profiláctica. Los agentes terapéuticos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a; (i) un polipéptido de NgR, o sus análogos, derivados, fragmentos u homólogos, (ii) anticuerpos para un péptido de NgR; (iii) ácidos nucleicos que codifican un péptido de NgR; (iv) administración de ácido nucleico antisentido y ácidos nucleicos que son "disfuncionales" (esto es, debido a una inserción heteróloga en las secuencias codificantes de un péptido de NgR) son utilizados para "desactivar" la función endógena de un péptido de NgR mediante recombinación homóloga (véase, p. ej., Capecchi (1989) Science 244, 1288-1292); o (v) moduladores (esto es, inhibidores, agonistas y antagonistas, incluyendo miméticos peptídicos adicionales de la descripción o anticuerpos específicos para un péptido de esta descripción) que alteran la interacción entre un péptido de NgR y su compañero de unión.

Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por disminuir (con respecto a un sujeto que no padece la enfermedad o trastorno) los niveles o la actividad biológica se pueden tratar con agentes Terapéuticos que incrementan (esto es, agonistas de) la actividad. Los agentes terapéuticos que regulan al alza la actividad se pueden administrar de una manera terapéutica o profiláctica. Los agentes terapéuticos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, un péptido de NgR, o sus análogos, derivados, fragmentos u homólogos; o un agonista que incrementa la biodisponibilidad.

El aumento o la disminución de los niveles se puede detectar fácilmente cuantificando el péptido y/o el ARNm, obteniendo una muestra de tejido del paciente (p. ej., de biopsia de tejido) y analizándola in vitro en busca de los niveles de ARN o péptido, la estructura y/o la actividad de los péptidos expresados (o ARNm de un péptido de NgR). Los métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, inmunoanálisis (p. ej., mediante análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS), inmunocitoquímica, etc.) y/o análisis de hibridación para detectar la expresión de los ARNm (p. ej., análisis Northern, transferencias puntuales, hibridación in situ, etc.).

La descripción ilustra un método para prevenir, en un sujeto, una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad de NgR aberrante, administrando al sujeto un agente que modula la expresión de NgR o al menos una actividad de NgR. Los sujetos con riesgo de enfermedad que esté causada o a la que contribuya la expresión o actividad aberrante de NgR pueden ser identificados, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de análisis diagnósticos o pronósticos como se describe en la presente memoria. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de NgR, de manera que se puede prevenir o, alternativamente, retrasar el progreso de la enfermedad o trastorno. Dependiendo del tipo de aberración de NgR, por ejemplo, se puede utilizar un agonista de NgR o un antagonista de NgR para tratar al sujeto. El agente apropiado se puede determinar basándose en los análisis de escrutinio descritos en la presente memoria.

La descripción también ilustra métodos de modulación de la expresión o actividad de NgR con fines terapéuticos. El método modulador de esta descripción implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la actividad de la proteína de NgR asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína de NgR puede ser un agente como se describe en la presente memoria, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado de origen natural de una proteína de NgR, un péptido, un peptidomimético de NgR, u otra molécula pequeña. En un caso, el agente estimula una o más actividades de la proteína de NgR. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la proteína de NgR activa y una molécula de ácido nucleico que codifica NgR que ha sido introducida en la célula. En otro caso, el agente inhibe una o más actividades de la proteína de NgR. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico de NgR antisentido y anticuerpos anti-NgR. Estos métodos moduladores se pueden realizar in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (p. ej., administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente descripción proporciona métodos de tratamiento de un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o la actividad aberrante de una proteína o una molécula de ácido nucleico de NgR. En un caso, el método implica administrar un agente (p. ej., un agente identificado mediante un análisis de escrutinio descrito en la presente memoria), o una combinación de agentes que modulan (p. ej., regulan al alza o regulan a la baja) la expresión o la actividad de NgR. En otro caso, el método implica administrar una proteína o molécula de ácido nucleico de NgR como terapia para compensar la expresión o actividad reducida o aberrante de NgR.

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Terapia Génica

Las mutaciones en el gen NgR que dan como resultado la pérdida de la función normal del producto génico de NgR subyacen en las enfermedades humanas de NgR. La descripción ilustra la terapia génica para restaurar la actividad de NgR para tratar esas enfermedades. La liberación de un gen de NgR funcional en las células apropiadas se efectúa ex vivo, in situ, o in vivo mediante el uso de vectores, y más concretamente vectores virales (p. ej., adenovirus, virus adenoasociados, o retrovirus), o ex vivo mediante el uso de métodos de transferencia física de ADN (p. ej., liposomas o tratamientos químicos). Véase, por ejemplo, Anderson (1998) Nature, suplemento para 392(6679):25-20. Para revisiones adicionales de la tecnología de terapia génica véase Friedmann (1989) Science 244, 1275-1281; Verma (1990) Sci. Am. 68-84; y Miller (1992) Nature 357, 455-460. Alternativamente, se contempla que en otras enfermedades humanas, resulte útil la prevención de la expresión de, o la inhibición de la actividad de, NgR. Se considera que se podrían aplicar la terapia antisentido o la terapia génica para regular negativamente la expresión de NgR.

La presente descripción ilustra métodos tanto profilácticos como terapéuticos de tratamiento de un sujeto con riesgo (o susceptible de) de trastorno o con un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de NgR.

Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por un incremento (con respecto a un sujeto que no padece la enfermedad o trastorno) de los niveles o la actividad biológica se pueden tratar con agentes Terapéuticos que suscitan un efecto antagónico (esto es, reducen o inhiben) sobre la actividad. Los agentes terapéuticos que suscitan un efecto antagónico sobre la actividad se pueden administrar de manera terapéutica o profiláctica. Los agentes terapéuticos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, (i) un polipéptido de NgR, o sus análogos, derivados, fragmentos u homólogos, (ii) anticuerpos para un péptido de NgR, (iii) ácidos nucleicos que codifican un péptido de NgR, (iv) administración de ácido nucleico antisentido y ácidos nucleicos que son "disfuncionales" (esto es, debido a una inserción heteróloga en las secuencias codificantes de un péptido de NgR) que son utilizados para "desactivar" la función endógena de un péptido de NgR mediante recombinación homóloga (véase, p. ej., Capecchi (1989), más arriba); o (v) moduladores (esto es inhibidores, agonistas y antagonistas, incluyendo peptidomiméticos adicionales de esta descripción o anticuerpos específicos para un péptido de esta descripción) que alteran la interacción entre un péptido de NgR y su compañero de unión.

Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por una disminución (con respecto a un sujeto que no padece la enfermedad o trastorno) de los niveles o la actividad biológica se pueden tratar con agentes terapéuticos que incrementan (esto es, son agonistas de) la actividad. Los agentes Terapéuticos que regulan al alza la actividad se pueden administrar de manera terapéutica o profiláctica. Los agentes Terapéuticos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, un péptido de NgR, o sus análogos, derivados, fragmentos u homólogos, o un agonista que incrementa la biodisponibilidad.

El aumento o la disminución de los niveles se puede detectar fácilmente cuantificando el péptido y/o ARN, obteniendo una muestra de tejido del paciente (p. ej., de una biopsia de tejido) y analizándola in vitro en busca de los niveles de ARN o péptidos, la estructura y/o actividad de los péptidos expresados (o los ARNm de un péptido de NgR). Los métodos que son bien conocidos en la técnica incluyen, pero no están limitados a, inmunoanálisis (p. ej., mediante análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS), inmunocitoquímica, etc.) y/o análisis de hibridación para detectar la expresión de los ARNm (p. ej., análisis Northern, transferencias puntuales, hibridación in situ, etc.).

La descripción ilustra un método para prevenir, en un sujeto, una enfermedad o afección asociada con la expresión o actividad aberrante de NgR, administrando al sujeto un agente que modula la expresión de NgR o al menos una actividad de NgR. Los sujetos con riesgo de una enfermedad que está causada o a la que contribuye la expresión o actividad aberrante de NgR pueden ser identificados, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de análisis diagnósticos o pronósticos descritos en la presente memoria. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de NgR, de manera que se evite una enfermedad o trastorno, o alternativamente, se retrase su progreso. Dependiendo del tipo de aberración de NgR, por ejemplo, se puede utilizar un agonista de NgR o un antagonista de NgR para tratar al sujeto. El agente apropiado puede ser determinado basándose en los análisis de escrutinio descritos en la presente memoria.

La descripción también ilustra métodos de modulación de la expresión o actividad de NgR con fines terapéuticos. El método modulador de la descripción implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la actividad de la proteína de NgR asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína de NgR puede ser un agente como se ha descrito aquí, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado de origen natural de una proteína de NgR, un péptido, una peptidomimético de NgR, u otra molécula pequeña. En un caso, el agente estimula una o más actividades de la proteína de NgR. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la proteína de NgR activa y una molécula de ácido nucleico que codifica NgR que ha sido introducida en la célula. En otro caso, el agente inhibe una o más actividades de la proteína de NgR. Los ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico de NgR antisentido y anticuerpos anti-NgR. Estos métodos moduladores se pueden llevar a cabo in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (p. ej., administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente descripción proporciona métodos de tratamiento de un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o actividad aberrante de una proteína de NgR o una molécula de ácido nucleico. En un caso, el método implica administrar un agente (p. ej., un agente identificado mediante un análisis de escrutinio descrito en la presente memora), o una combinación de agentes que modula (p. ej., regula al alza o regula a la baja) la expresión o actividad de NgR. En otro caso, el método implica administrar una proteína o una molécula de ácido nucleico de NgR como terapia para compensar la expresión o actividad reducida o aberrante de NgR.

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El alcance de la presente invención no está limitado por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. En efecto, diferentes modificaciones de la invención además de las descritas en la presente memoria serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción y la figura adjunta.

La siguiente Tabla 5 contiene las secuencias de los polinucléotidos y polipéptidos ilustrativos de la descripción.

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A menos que se indique de otro modo, X es cualquier aminoácido. Por ejemplo, donde se indica X puede no haber aminoácido. Las características adicionales de la invención serán evidentes a partir de los siguientes Ejemplos. Los Ejemplos 1-5 son reales, mientras los demás Ejemplos son predictivos.

Como se muestra mediante los siguientes Ejemplos, se ha identificado un gen que codifica NgR novedosos mediante análisis computacional de los datos de secuencias de ADN. Las proteínas codificadas por NgR2 y NgR3 tienen una supuesta secuencia señal, ocho dominios de repetición ricos en leucina en una región rica en leucina conservada (SEQ ID NO: 12), una región rica en cisteína conservada (SEQ ID NO: 10) N-terminal con respecto a la región rica en leucina, un segundo dominio rico en cisteína (SEQ ID NO: 11) C-terminal con respecto a la región rica en leucina, y un supuesto sitio de conexión con glucofosfatidilinositol (conexión GPI). NgR2 y NgR3 difieren de la secuencia de NgR identificada previamente. Los homólogos de NgR, cuando se comparan con NgR conocidos, muestran una secuencia consenso (SEQ ID NO: 6). Los supuestos NgR2 y NgR3 maduros se muestran en la Tabla 5 como SEQ ID NO: 8 y 9, respectivamente.

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Ejemplo 1 Consulta Tblastn de la base de datos HTG

Se utilizó la secuencia de proteína para NgR humano (NgR1) (SEQ ID NO: 5) para consultar la base genómica de alto rendimiento (HTG) cuyo uso es familiar para los expertos en la técnica. La base de datos HTG es una parte de GenBank, una base de datos de secuencias genéticas de NIH comprensiva, que incluye una colección comentada de todas las secuencias de ADN disponibles al público (Nucleic Acids Res. 2000) 28, 15-8). La base de datos de HTG incluye secuencias obtenidas de ADN genómico. En el ADN genómico, los genes están codificados típicamente por múltiples segmentos de ADN denominados exones. De este modo cuando se alinea una secuencia de ADNc (o una secuencia de proteínas codificada por una secuencia de ADNc) con una secuencia genómica, la secuencia se romperá en segmentos dependiendo del número de exones del gen.

El algoritmo BLAST, que significa Herramienta de Alineamiento Local Básica es adecuado para determinar la similitud de secuencia (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410). El soporte lógico para realizar los análisis BLAST se encuentra disponible al público a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). El algoritmo BLAST básico implica identificar primero pares de secuencias de puntuación elevada (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que se emparejan o satisfacen cierta puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos éxitos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsqueda para encontrar las HSP que las contienen. Los éxitos de palabras se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. La prolongación de los éxitos de palabra en cada dirección se detiene cuando: 1) la puntuación del alineamiento cumulativo decae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; 2) la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o 3) se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo Blast W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa Blast utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), alineamientos (B) de 50, una esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST (Karlin et al., (1993) Proc. natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787) y Gapped BLAST realizan un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produciría por casualidad un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a un gen o ADNc de NgR si la probabilidad de la suma más pequeña en la comparación del ácido nucleico de ensayo con un ácido nucleico de NgR es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Para consultar la base de datos HTG con la secuencia de proteína de NgR, los autores de la presente invención utilizaron una variación del algoritmo BLAST conocida como programa tblastn, que compara una secuencia de proteína de consulta con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura (J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-410: Nucleic Acids Res. (1997) 25, 3389-3402). Los resultados de la búsqueda blastn indicaron la presencia de genes en las bases de datos con una identidad significativa con NgR. Además de encontrar los éxitos para los clones genómicos que contienen los genes de NgR humanos y de ratón, los autores de la presente invención encontraron éxitos para los clones en los que la identidad no era tan alta, pero todavía era muy significativa. Se encontraron tres clones humanos (Números de Acceso: AC068514, AC016869, AC013606) con un valor e de 4e-43 y se encontró un clon de ratón (Número de Acceso AC021768) con un valor e de 1e-78. Los tres clones humanos parecían codificar todos el mismo gen, de manera que el análisis adicional se confinó a AC013606.

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Ejemplo 2 Predicción de la secuencia de proteína de NgR2 humano (AC013606)

La secuencia de la proteína de NgR humana se alineó con dos regiones se la secuencia traducida de la secuencia de nucleótidos AC013606, indicando que el nuevo gen era codificado por al menos dos exones. Con el fin de definir el gen completo, los autores de la presente invención utilizaron el programa de ordenador GENSCAN® (J. Mol. Biol. (1997) 268, 78-94) que puede identificar estructuras exónicas/intrónicas completas de los genes del ADN genómico. La predicción del gen por medio de GENESCAN® contenía siete exones. Comparando estos exones pronosticados con el NgR, se concluyó que el nuevo gen humano contiene dos de estos exones y una parte de otro (que contiene la metionina iniciadora). El ADNc pronosticado (ARNm) codificado por estos tres exones fue ensamblado a partir de AC013606 (HTG11; depositado en Marzo de 2000; longitud = 143899; publicado por GenBank 118,0; SEQ ID NO: 15) combinando los nucleótidos de los tres exones cuyas coordenadas son: 123292.1232322 (exón 1); 130035-130516 (exón 2); y 138589-139335 (exón 3). La secuencia de esta secuencia de ADNc es el SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos de NgR2 humano; AC013606). La traducción de este ADNc proporciona la secuencia de proteínas de NgR2 humano (SEQ ID NO: 2).

Los autores de la presente invención utilizaron la secuencia de proteína de NgR2 humano como secuencia de consulta frente a la base de datos de EST humanas. Se encontraron varios de estos éxitos de elevada significación indicando que el ARNm de NgR2 es expresado en numerosos tejidos incluyendo cerebro fetal. Además, dos de estas EST proporcionaron un apoyo para la estructura de exones que habían deducido los autores de la presente invención. Una EST (Núm. de Acceso: GB_EST19:AI346757) contiene 565 nucleótidos correspondientes a los aminoácidos 84-271 del NgR2 humano (SEQ ID NO: 4). Este abarca el segundo intrón localizado entre los aminoácidos 171 y 172, y proporciona una evidencia positiva para el empalme de los exones 2 y 3 a nivel de ARNm. Otra EST (GB_EST26:AI929019) contiene 545 nucleótidos, parte de los cuales corresponden a los aminoácidos 1-75 de NgR2 humano (SEQ ID NO: 2). Este abarca el primer intrón localizado entre los aminoácidos 10 y 11, y proporciona una evidencia positiva del empalme de los exones 1 y 2 al nivel de ARNm.

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Ejemplo 3 Predicción de la secuencia de proteína de NgR3 de ratón (AC021768)

La secuencia de la proteína de NgR humana se alineó solamente con una región de la secuencia traducida de la secuencia de nucleótidos AC021768, indicando que la mayor parte del nuevo gen de ratón estaba codificada por un exón grande. No obstante, tras la inspección, la proteína codificada por este exón había perdido una metionina iniciadora. Con el fin de definir el gen completo, los autores de la presente invención utilizaron el programa de ordenador GENSCAN descrito antes. La predicción del gen por GENSCAN contenía dos exones: el grande encontrado mediante inspección visual y uno corto en el extremo 5' que proporcionó una metionina iniciadora. El ADNc pronosticado (ARNm) codificado por estos dos exones fue ensamblado a partir de AC021768 (HTG14: depositado en Marzo de 2000; longitud = 215980; publicado por GenBank 118.0; SEQ ID NO: 16) combinando los nucleótidos de los dos exones cuyas coordenadas son: el complemento de 164265-164325 (exón 1); y el complemento de 155671-156992 (exón 2). La secuencia para esta secuencia de ADNc es el SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucléotidos de NgR3 de ratón; AC021768). La traducción de este ADNc proporciona la secuencia de proteínas de NgR3 de ratón (SEQ ID NO: 4).

Los autores de la presente invención utilizaron la secuencia de proteínas de NgR3 de ratón como secuencia de consulta frente a la base de datos de EST de ratón. Se encontró un éxito de elevada significación indicando que el ARNm de NgR2 es expresado en corazón. Esta EST (GB_EST20:AI428334) contiene 463 nucleótidos, parte de los cuales corresponden a los aminoácidos 45-193 de NgR3 de ratón (SEQ ID NO: 4).

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Ejemplo 4 Similitud entre los NgR

En la Fig. 1A-1B se muestra un alineamiento entre NgR1 y los dos nuevos receptores. Las similitudes entre estas proteínas incluyen:

(1) El programa SignalP, que localiza la posición de la escisión de la secuencia señal, pronostica una escisión antes de la primera cisteína conservada en todas las proteínas. De este modo la proteína madura tendrá en todos los casos una cisteína en el extremo N.

(2) Todas las proteínas contienen ocho Repeticiones Ricas en Leucina (LRR). Las LRR son motivos de secuencia corta presentes en numerosas proteínas con diversas funciones y localizaciones celulares. Estas repeticiones están implicadas normalmente en las interacciones proteína-proteína. Cada LRR está compuesta por una unidad beta-alfa.

(3) Las tres proteínas contienen un dominio N-terminal con repeticiones ricas en leucina (LRRNT), en el cual se conservan cuatro cisteínas. Las LRR están flanqueadas a menudo por dominios ricos en cisteína en ambos extremos N y C.

(4) Las tres proteínas contienen un dominio LRR C-terminal (LRRCT). Los LRRCT de las tres proteínas NgR pueden ser distinguidos de los de otras proteínas que contienen LRR, por el patrón de triptófanos y cisteínas que están completamente conservados en este dominio.

(5) Las tres proteínas contienen una cisteína conservada en el cuarto dominio LRR.

(6) Las tres proteínas contienen un sitio de glicosilación potencial conservado en el octavo dominio LRR.

(7) NgR2 y NgR3 tienen un extremo C hidrófobo, como NgR1, una indicación de que probablemente también experimentan una modificación similar a la de NgR1, donde un radical GPI está unido covalentemente a un aminoácido C-terminal. Esto permite que la proteína permanezca trabada a la célula.

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Ejemplo 5 Preparación de Proteínas Nogo

Se desarrolló un análisis de unión a Nogo que utiliza un método ampliamente utilizado en el examen de la función de la guía axonal de la semaforina y la efrina (Flanagan & Vanderhaeghen 81998) Annu. Rev. Neurosci. 21, 309-345; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69). Esto implica fusionar un radical de la fosfatasa alcalina (AP) placentaria secretada al ligando en cuestión para proporcionar un agente de unión al receptor biológicamente activo que puede ser detectado con un análisis colorimétrico extremadamente sensible. Para Nogo, se crea un vector de expresión que codifica un péptido señal, una etiqueta His6 para la purificación, AP, y el dominio activo de 66 aminoácidos de Nogo. La proteína de fusión se puede purificar del medio acondicionado de células transfectadas en cantidades de miligramos. Esta proteína es biológicamente activa como agente obstructor del cono de crecimiento con una CE_{50} de 1 nM.

Alternativamente, se puede preparar una proteína de fusión con glutation-S-transferasa Nogo (GST-Nogo). Para GST-Nogo, se crea un vector de expresión (p. ej., un vector pGEX) que codifica un péptido señal, GST, y el dominio activo de 66 aminoácidos de Nogo. GST-Nogo puede ser purificada del medio de cultivo y utilizada como proteína de fusión con GST, o se puede escindir la GST de la porción de Nogo de la proteína de fusión con una enzima que reconoce el sitio de escisión del aminoácido específico diseñado entre la porción GST y la porción Nogo de la proteína de fusión. Tales sitios son parte de los vectores de GST disponibles en el mercado. Los sitios de escisión específicos y las enzimas pueden ser utilizados de acuerdo con las especificaciones del Fabricante.

Se ha descubierto que AP-Nogo es en realidad ligeramente más potente que GST-Nogo, quizás debido a que la proteína es sintetizada en una célula eucariótica en lugar de procariótica.

La unión de Nogo a homólogos de NgR inmovilizados se puede realizar en un análisis de tipo ELISA en el que se permite que AP-Nogo reaccione con un homólogo del receptor inmovilizado. La especificidad de la unión se puede demostrar en un análisis de unión competitiva utilizando cantidades crecientes de GST-Nogo en el tipo de análisis para mostrar una cantidad decreciente de unión de AP-Nogo (a juzgar en el análisis colorimétrico).

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Ejemplo 6 Análisis de unión a Células COS Transfectadas

Los homólogos de la presente descripción se pueden utilizar en estudios de transfección en células COS para demostrar la unión de Nogo. Específicamente, las secuencias de nucleótidos que codifican NgR2 y NgR3 pueden ser transfectadas a células COS utilizando un vector adecuado. Las células COS-7 no transfectadas no se unen a AP-Nogo. Sin embargo, la transfección de células COS con secuencias de ácido nucleico que codifican NgR las harán capaces de unirse a Nogo. La AP sola no se une con una afinidad estable a estas células transfectadas, indicando que cualquier afinidad de Nogo por NgR2 o NgR3 se debería a los 66 aminoácidos derivados de Nogo. Además, la afinidad específica de Nogo por las proteínas NgR2 o NgR3 se puede someter a ensayo en el desplazamiento de análisis de AP-Nogo utilizando GST-Nogo. NgR2 y/o NgR3 también se pueden unir a homólogos de Nogo, que pueden ser sometidos a ensayo asimismo utilizando este análisis.

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Ejemplo 7 Expresión de NgR en Líneas Celulares Humanas utilizando Transferencia Northern y una Sonda cebada al Azar

Se adquiere una transferencia Northern de una fuente comercial, o se hacen correr muestras de ARN de las células de interés sobre un gel de agarosa y se transfieren a una membrana utilizando cualquiera de las técnicas bien conocidas para la transferencia Northern. La transferencia se sondea con un fragmento de NgR2 (SEQ ID NO: 1) o NgR3 (SEQ ID NO: 3). La sonda se prepara a partir de 50 ng de ADNc marcado por medio de un método de cebado al azar (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13). La hibridación se lleva a cabo a 68ºC durante 1 hora en solución ExpressHybTM (Clontech, Núm. de Catálogo 8015-1) seguido de lavado con 2X SSC/SDS al 0,5% a la temperatura ambiente y dos lavados con 0,1XSSC/SDS al 0,1% a 50ºC. La expresión de NgR2 y/o NgR3 puede ser evaluada por la presencia de una banda de tamaño apropiado en la transferencia.

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Ejemplo 8 Clonación de ADNc correspondiente a los NgR

Para obtener el clon completo correspondiente a NgR2 de una genoteca de ADNc, se puede utilizar el siguiente método. Se genera una genoteca de ADNc utilizando métodos convencionales a partir de un tejido que se sabe que contiene NgR2. Semejante tejido fue identificado en el Ejemplo 2. Se pueden escrutar 1 x 10^{6} unidades formadoras de placa de la genoteca de ADNc por duplicado sobre filtros OPTITRAN®. Los filtros se hibridan con oligonucleótidos marcados con P^{32} que se generan a partir de las EST correspondientes a porciones de NgR2. La reacción de hibridación puede consistir en 400 ml de tampón de escrutinio de placa (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 1 M, pirofosfato de sodio al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,2% y Ficoll al 0,2%) que contiene sulfato de dextrano al 10% y 100 \mug/ml de ARNt y 80 pmoles de cada oligonucleótido marcado con P^{32} a 65ºC durante la noche. Los filtros se lavan dos veces con 2X SSC/SDS al 1% y dos veces con 1X SSC/SDS al 1% y se exponen a la película. Los positivos por duplicado se purifican. El ADN de cada uno de estos clones se analiza mediante digestión con enzimas de restricción seguido de electroforesis en gel de agarosa y transferencia Southern. Los filtros se hibridan con los oligonucleótidos marcados con P^{32} utilizados para la hibridación original para confirmar que los insertos hibridan con la sonda. El inserto es secuenciado después para confirmar que representa el ADNc de NgR2. Se pueden utilizar métodos similares para generar un clon completo correspondiente a NgR3.

Alternativamente, un experto en la técnica puede obtener un clon completo de NgR2 o NgR3 empleando técnicas de PCR convencionales.

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Ejemplo 9 Análisis de Hibridación para demostrar la expresión de NgR en el cerebro

La expresión de NgR en mamíferos, tales como rata, puede ser investigada mediante histoquímica de hibridación in situ. Para investigar la expresión en el cerebro, por ejemplo, se preparan criosecciones de cerebro de rata coronal y sagital (20 \mum de grosor) utilizando un criostato Reichert-Jung. Las secciones individuales se montan congeladas sobre portas sin nucleasa, silanizados (CEL Associates, Inc., Houston, TX) y se almacenan a -80ºC. Las secciones se tratan empezando después de la fijación en paraformaldehído al 4% frío, se enjuagan con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), se acetilan utilizando anhídrido acético en tampón de trietanolamina, y se deshidratan a través de una serie de lavados en alcohol del 70%, 95%, y 100% a la temperatura ambiente. Con posterioridad, las secciones se deslipidan en cloroformo, seguido de rehidratación a través de la exposición sucesiva a alcohol del 100% y alcohol del 95% a la temperatura ambiente. Se deja que los portas del microscopio que contienen criosecciones tratadas se sequen al aire antes de la hibridación. Se pueden analizar otros tejidos de una manera similar.

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Se puede generar una sonda específica de NgR utilizando la PCR. Tras la amplificación por PCR, el fragmento se digiere con las enzimas de restricción y se clona en pBluescript II escindido con las mismas enzimas. Para la producción de una sonda específica para la hebra efectora de NgR, se puede linealizar un fragmento del NgR clonado clonado en pBluescript II con una enzima de restricción adecuada, lo que proporciona un sustrato para los transcritos extraídos (esto es, ribosondas de ARNc) utilizando el promotor de T7 portado por el vector y la ARN polimerasa de T7 disponible en el mercado. También se puede preparar fácilmente una sonda específica para la hebra antisentido de NgR utilizando el clon de NgR en pBluescript escindiendo el plásmido recombinante con una enzima de restricción adecuada para generar un sustrato linealizado para la producción de transcritos de ARNc extraídos marcados utilizando el promotor de T3 y la polimerasa cognada. Las ribosondas pueden ser marcadas con UTP-[S^{35}] para proporcionar una actividad específica de aproximadamente 0,40 x 10^{6} cpm/pmol para las ribosondas antisentido y aproximadamente 0,65 x 10^{6} cpm/pmol para las ribosondas de la hebra efectora. Cada ribosonda se puede desnaturalizar con posterioridad y añadir (2 pmoles/ml) al tampón de hibridación que contiene formamida al 50%, dextrano al 10%, NaCl 0,3M, Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 1X Solución de Denhardt, y ditiotreitol 10 mM. Los portas del microscopio que contienen las criosecciones de cerebro secuenciales pueden ser expuestos independientemente a 45 \mul de solución de hibridación por porta y se pueden colocar cubres silanizados sobre las secciones que están siendo expuestas a la solución de hibridación. Las secciones se incuban durante la noche (15-18 horas) a 52ºC para permitir que se produzca la hibridación. Des-
pués se exponen series equivalentes de criosecciones a ribosondas de ARNc específicas de NgR efector o antisentido.

Tras el período de hibridación, los cubres se separan por lavado de los portas en 1X SSC, seguido de tratamiento con ARNasa A que implica la exposición de los portas a 20 \mug/ml de ARNasa A en un tampón que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,5 M, y NaCl 0,5 M durante 45 minutos a 37ºC. Las criosecciones se someten después a tres lavados altamente restrictivos en 0,1 X SSC a 52ºC durante 20 minutos cada uno. Después de la serie de lavados, las criosecciones se deshidratan mediante exposición consecutiva a acetato de amonio al 70%, 95% y 100% en alcohol, seguido de secado al aire y exposición a una película Kodak BioMax® MR-1. Después de 13 días de exposición, la película se revela, y se detecta cualquier señal de hibridación significativa. Basándose en estos resultados, los portas que contienen el tejido que hibridaba, como se muestra mediante los autorradiogramas de la película, se recubren con emulsión Kodak NTB-2 Nuclear Track y los portas se almacenan en la oscuridad durante 32 días. Después los portas se revelan y se contratiñen con hematoxilina. Las secciones recubiertas con emulsión se analizan microscópicamente para determinar la especificidad del marcaje. Se determina que la señal es específica si los granos de la autorradiografía (generados por la hibridación de la sonda antisentido) están claramente asociados con los cuerpos celulares teñidos con violeta de cresilo. Los granos autorradiográficos encontrados entre los cuerpos celulares indican la unión no específica de la sonda.

En algunos casos, tales como el uso de una sonda para detectar un homólogo de NgR en una especie heteróloga, con el fin de obtener una hibridación óptima, puede ser necesario disminuir las condiciones de restricción. Tales condiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica y los ejemplos se proporcionan más arriba.

La expresión de NgR en el cerebro proporciona una indicación de que los moduladores de la actividad de NgR tienen utilidad para tratar trastornos neurológicos. Algunas otras enfermedades para las cuales pueden tener utilidad los moduladores de NgR incluyen la depresión, la ansiedad, la enfermedad bipolar, epilepsia, neuritis, neurastenia, neuropatía, neurosis, y similares. Se pretende que el uso de los moduladores de NgR, incluyendo los ligandos de NgR y los anticuerpos anti-NgR, para tratar individuos que tienen tales enfermedades sea un aspecto de la descripción.

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Ejemplo 10 Análisis de Transferencia Northern de ARN de NgR con una Sonda generada mediante PCR

Se pueden realizar hibridaciones por transferencia Northern para examinar la expresión del ARNm de NgR. Se puede utilizar como sonda un clon que contiene al menos una porción de la secuencia del SEQ ID NO: 1. En la PCR se utilizan cebadores específicos del vector para generar un fragmento de la sonda de hibridación para el marcaje con P^{32}. La PCR se realiza como sigue:

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La PCR se realiza en un Termociclador utilizando el siguiente programa:

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El producto de la PCR se puede purificar utilizando un kit de Purificación de PCR QIAquick (núm. 28104) de Qiagen, y el marcaje radiactivo con dCTP-P^{32} (Núm. AA0005/250, Amersham Pharmacia Biotech) se puede realizar mediante cebado al azar utilizando "Ready-to-go DNA Labeling Beads" (Núm. 27-9240-01) de Amersham Pharmacia Biotech. La hibridación se lleva a cabo en una Transferencia Northern de Tejido Múltiple Humana de Clontech como se describe en el protocolo del fabricante, o en una Transferencia Northern preparada haciendo correr muestras de ARN de las células de interés sobre un gel de agarosa y transferencia a una membrana utilizando cualquiera de los protocolos de transferencia Northern conocidos. Tras la exposición durante la noche en una pantalla Molecular Dynamics Phosphor Imager (Núm. MD146-814) se visualizan bandas de un tamaño apropiado.

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Ejemplo 11 Expresión Recombinante de NgR en Células Anfitrionas Eucarióticas A. Expresión de NgR en Células de Mamífero

Para producir proteína de NgR, se expresa un polinucleótido que codifica NgR en una célula anfitriona adecuada utilizando un vector de expresión adecuado y técnicas de ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, una secuencia que codifica NgR descrita en la Tabla 4 se subclona en el vector de expresión comercial pzeoSV2 (Invitrogen, san Diego, CA) y se transfecta en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) utilizando el reactivo de transfección FuGENE6® (Boeheringer-Mannheim) y el protocolo de transfección proporcionado en el anexo del producto. También son adecuadas otras líneas celulares eucarióticas, incluyendo células de riñón embrionario humano (HEK 293) y COS. Se seleccionan las células que expresan establemente NgR mediante crecimiento en presencia de 100 \mug/ml de zeocina (Stratagene, LaJolla, CA). Como alternativa a FuGENE6®, el vector de expresión puede llevar el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) y la selección de los clones bajo presión con el fármaco metotrexato (MTX) permite la transformación estable de las células CHO. Opcionalmente, se puede purificar NgR de las células utilizando técnicas cromatográficas convencionales. Para facilitar la purificación, se origina antisuero contra una o más secuencias peptídicas sintéticas que corresponden a porciones de la secuencia de aminoácidos de NgR, y el antisuero se utiliza para purificar por afinidad Nogo-R. El NgR también se puede expresar en marco con una secuencia etiqueta (p. ej., polihistidina, hemaglutinina, FLAG) para facilitar la purificación. Por otra parte, se apreciará que muchos de los usos de los polipéptidos de NgR, tales como los análisis descritos más abajo, no requieren la purificación de NgR de la célula anfitriona.

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B. Expresión de NgR en Células CHO

Para la expresión de NgR en células de ovario de hámster Chino (CHO), se prepara un plásmido que porta la secuencia codificante de NgR relevante, utilizando un vector que también porta el marcador seleccionable dihidrofolato reductasa (DHFR). El plásmido se transfecta en células CHO. La selección bajo presión con el fármaco MTX permite la preparación de transformantes estables de un NgR (NgR2 o NgR3) en un plásmido de expresión que porta un marcador seleccionable tal como DHFR.

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C. Expresión de NgR en células 293

Para la expresión de NgR en células de mamífero 293 (células de riñón embrionario primarias, humanas transformadas), se prepara un plásmido que porta la secuencia codificante de NgR relevante, utilizando el vector pSecTag2A (Invitrogen). El vector pSecTag2A contiene la secuencia líder de la cadena IgK murina para la secreción, el epítopo c-myc para la detección de la proteína recombinante con el anticuerpo anti-myc, una polihistidina C-terminal para la purificación con cromatografía con quelato de níquel, y un gen resistente a Zeocina para la selección de los transformantes estables. El cebador directo para la amplificación de este ADNc de NgR se determina mediante procedimientos rutinarios y contiene preferiblemente una prolongación 5' de nucleótidos para introducir el sitio de clonación HindIII y los nucleósidos que corresponden a la secuencia de NgR. El cebador inverso también se determina mediante procedimientos rutinarios y contiene preferiblemente una prolongación 5' de nucleótidos para introducir un sitio de restricción XhoI para la clonación y los nucleótidos correspondientes al complemento inverso de la secuencia de NgR. Las condiciones de la PCR son 55ºC como temperatura de recocido. El producto de la PCR es purificado en gel y clonado en los sitios HindIII-XhoI del vector.

El ADN es purificado utilizando columnas de cromatografía Qiagen y transfectado en células 293 utilizando medio de transfección DOTAP® (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Las células transfectadas transitoriamente se someten a ensayo en busca de expresión después de 24 horas de transfección, utilizando transferencias western sondeadas con anticuerpos anti-His y anti-péptido NgR. Las células transfectadas permanentemente se seleccionan con Zeocina y se propagan. La producción de la proteína recombinante se detecta a partir de células y medio mediante transferencias Western sondeadas con anticuerpos anti-His, anti-Myc o anti-péptido NgR.

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D. Expresión Transitoria de Nogo-R en Células COS

Para la expresión de NgR en células COS7, se puede clonar una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, por ejemplo, en el vector p3-CI. Este vector es un plásmido derivado de pUC18 que contiene el intrón del promotor de HCMV (citomegalovirus humano) localizado aguas arriba de la secuencia de poliadenilación de bGH (hormona del crecimiento bovina) y un sitio de clonación múltiple.

El cebador directo se determina mediante procedimientos rutinarios y preferiblemente contiene una prolongación 5' que introduce un sitio de restricción XbaI para la clonación, seguido de nucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. El cebador inverso también se determina mediante procedimientos rutinarios y preferiblemente contiene una prolongación 5' de nucleótidos que introduce un sitio de clonación SalI seguido de nucleótidos que corresponden al complemento inverso de una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

La PCR consiste en una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 seg de desnaturalización a 95ºC, 30 seg de recocido a 58ºC y 30 seg de prolongación a 72ºC, seguido de 5 min de prolongación a 72ºC. El producto de la PCR se purifica en gel y se liga en los sitios XbaI y SalI del vector p3-CI. Este constructo se transforma en células de E. coli para la amplificación y la purificación del ADN. El ADN se purifica con columnas de cromatografía Qiagen y se transfecta en células COS 7 utilizando el reactivo Lipofectamina® de BRL, siguiendo los protocolos del fabricante. A las 48 y 72 horas de la transfección, el medio y las células se someten a ensayo en busca de expresión recombinante.

El NgR expresado a partir de un cultivo de células COS se puede purificar concentrando el medio de crecimiento a aproximadamente 10 mg de proteína/ml, y purificando la proteína, por ejemplo, mediante cromatografía. El NgR purificado se concentra a 0,5 mg/ml en un concentrador Amicon equipado con una membrana YM-10 y se almacena a -80ºC. El NgR3 también se puede expresar utilizando este método y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 13.

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E. Expresión de NgR en Células de Insecto

Para la expresión de NgR en un sistema de baculovirus, se puede amplificar una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 o 13 mediante PCR. El cebador directo se determina mediante procedimientos rutinarios y preferiblemente contiene una prolongación 5' que añade el sitio de clonación NdeI, seguido de nucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 13, respectivamente). El cebador inverso también se determina mediante procedimientos rutinarios y preferiblemente contiene una prolongación 5' que introduce un sitio de clonación KpnI, seguido de nucleótidos que corresponden al complemento inverso de una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 13, respectivamente).

El producto de la PCR se purifica en gel, se digiere con NdeI y KpnI, y se clona en los sitios correspondientes del vector pACHTL-A (Pharmingen, San Diego). El vector de expresión pAcHTL contiene el promotor fuerte de la polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV), y una etiqueta 6XHis aguas arriba del sitio de clonación múltiple. También se encuentran presentes un sitio para la proteína quinasa para la fosforilación y un sitio para la trombina para la escisión de la proteína recombinante que precede al sitio de clonación múltiple. Por supuesto, se podrían utilizar muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pAcHTL-A, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1. Se pueden utilizar otros vectores adecuados para la expresión de polipéptidos de NgR, siempre que el constructo vector incluya señales localizadas apropiadamente para la transcripción, la traducción, y el tráfico, tales como un AUG en marco y un péptido señal, según se requiera. Tales vectores son descritos por Luckow et al., Virology 170:31-39, entre otros.

El virus se hace crecer y se aísla utilizando métodos de expresión en baculovirus convencionales, tales como los descritos por Summers et al. (1987) A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Núm. 1555.

En un caso preferido, se introduce pAcHLT-A que contiene el gen NgR en baculovirus utilizando el kit de transfección "BaculoGold®" (Pharmingen, San Diego, CA) utilizando métodos establecidos por el fabricante. Se analizan los productos aislados de virus individuales en busca de producción de proteína radiomarcando las células infectadas con metionina-S^{35} a las 24 horas de la infección. Las células infectadas se cosechan a las 48 horas de la infección, y las proteínas marcadas se visualizan mediante SDS-PAGE. Los virus que muestran niveles de expresión elevados pueden ser aislados y utilizados para una expresión a escala creciente.

Para la expresión de un polipéptido de NgR en células Sf9, se puede amplificar una molécula de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 13) mediante PCR utilizando los cebadores y métodos descritos antes para la expresión en baculovirus. El ADNc de NgR es clonado en el vector pAcHLT-A (Pharmingen) para la expresión en insecto Sf9. El inserto es clonado en los sitios NdeI y KpnI, después de la eliminación de un sitio NdeI interno (utilizando los mismos cebadores descritos antes para la expresión en baculovirus). El ADN se purifica con columnas de cromatografía Qiagen y se expresa en células Sf9. Los experimentos de transferencia Western preliminares de placas no purificadas se someten a ensayo en busca de la presencia de la proteína recombinante del tamaño esperado que reaccionaba con el anticuerpo específico de NgR. Estos resultados se confirman tras la purificación adicional y la optimización de la expresión en células HiG5.

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F. Expresión de formas solubles de NgR2 y NgR3 como proteínas de fusión NgR-Ig

Para generar una proteína de fusión NgR2-Ig, se pueden utilizar métodos convencionales como se describe en la literatura (p. ej., Sanicola et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6238-6243). Por ejemplo, se puede ligar un fragmento de ADN que codifica NgR2 sin la secuencia que codifica el extremo C hidrófobo (señal ancla de GPI), y el fragmento quimérico se puede clonar en un vector de expresión para generar un plásmido. El plásmido se puede transfectar después en células de ovario de hámster Chino para generar una línea celular estable productora de la proteína de fusión. La proteína de fusión se purifica después del medio acondicionado utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, el medio acondicionado aclarado de la línea celular se puede cargar por gravedad directamente sobre Proteína A-Sefarosa. La columna se puede lavar después con cinco veces el volumen de la columna de PBS, PBS que contiene NaCl 0,5 M, y fosfato de sodio 25 mM, NaCl 100 mM (pH 5,0). La proteína unida se puede hacer eluir después con Na_{2}HPO_{4} 25 mM, NaCl 100 mM (pH 2,8) y neutralizar inmediatamente con una fracción de 1/10 del volumen de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M (pH 8,6).

Se pueden utilizar métodos similares para generar una proteína de fusión de NgR3-Ig.

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Ejemplo 12 Trampa de Interacción/Sistema de Dos Híbridos

Con el fin de analizar las proteínas que interaccionan con NgR, se puede utilizar un método de escrutinio de trampa de interacción/genoteca de dos híbridos. Este análisis fue descrito primero por Fields et al. (1989) Nature 340, 245, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. Se publica un protocolo en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1999, John Wiley and Sons, NY y Ausubel, F.M. et al. 1992, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, cuarta edición, Greene and Wiley-Interscience, NY. Los kits son asequibles de Clontech Palo Alto, CA (Matchmaker Two-Hybrid System 3).

Se construye una fusión de las secuencias de nucleótidos que codifican todo o parte de NgR y el dominio de unión a ADN del factor de transcripción de levadura GAL4 (DNA-BD) en un plásmido apropiado (esto es, pGBKT7) utilizando técnicas de subclonación convencionales. De un modo similar, se construye una genoteca de fusión del dominio activo GAL4 (AD) en un segundo plásmido esto es, pGADT7) de ADNc de proteínas de unión a NgR potenciales (para protocolos sobre la formación de genotecas de ADNc, véase Sambrook et al. 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El constructo de fusión DNA-BD/NgR se verifica mediante secuenciación, y se somete a ensayo en busca de la activación del gen informador autónomo y la toxicidad celular, ambos los cuales evitarían una análisis de dos híbridos satisfactorio. Se realizan controles similares con el constructo de fusión AD/genoteca para asegurar la expresión en células anfitrionas y la carencia de actividad transcripcional. Se transforman células de levadura (aprox. 105 transformantes/mg de ADN) con los plásmidos de fusión de NgR y la genoteca de acuerdo con el procedimiento convencional (Ausubel, et al., 1992, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, cuarta edición, Greene and Wiley interscience, NY. La unión in vivo de las proteínas DNA-BD/NgR con AD/genoteca da como resultado la transcripción específica de los genes informadores del plásmido de levadura (esto es, lacZ, HIS3, ADE2, LEU2). Las células de levadura se cultivan en placa sobre medio carente de nutrientes para escrutar en busca de la expresión de genes informadores. Las colonias son analizadas dualmente en busca de actividad \beta-galactosidasa sobre el crecimiento en medio con un suplemento de Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosido) (el análisis filtro para la actividad b-galactosidasa es descrito por Breeden et al., (1985) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 50, 643). Los plásmidos AD-genoteca positivos se rescatan entre los transformantes y se reintroducen en la cepa de levadura original así como otras cepas que contienen proteínas de fusión DNA-BD no relacionadas para confirmar las interacciones de proteínas NgR/genoteca específicas. El inserto de ADN se secuencia para verificar la presencia de un marco de lectura abierto fusionado a GAL4 AD y para determinar la identidad de la proteína de unión a NgR.

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Ejemplo 13 Anticuerpos para Nogo-R

Se emplean técnicas convencionales para generar anticuerpos policlonales o monoclonales para el receptor NgR, y para generar sus fragmentos de unión al antígeno o sus variantes útiles, incluyendo las variantes "humanizadas". Tales protocolos se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989), más arriba, y Harlow et al. (Eds.), ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988). En un caso, se utilizan polipéptidos de NgR recombinante (o células o membranas celulares que contienen tales polipéptidos) como antígeno para generar los anticuerpos. En otro caso, se utilizan como antígeno, uno o más péptidos que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a una porción inmunogénica de NgR (p. ej., 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos). Se prefieren los péptidos correspondientes a las porciones extracelulares de Nogo-R, especialmente porciones extracelulares hidrofílicas. El antígeno se puede mezclar con un coadyuvante o conectar a un hapteno para aumentar la producción de anticuerpo.

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A. Anticuerpos Policlonales o Monoclonales

Como protocolo ilustrativo, se utiliza NgR recombinante o uno de sus fragmentos sintéticos para inmunizar un ratón para la generación de anticuerpos monoclonales (o un mamífero más grande, tal como un conejo, para los anticuerpos policlonales). Para incrementar la antigenicidad, se conjugan los péptidos con Hemocianina de Lapa Ojo de Cerradura (Pierce), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para una inyección inicial, se emulsiona el antígeno con Coadyuvante Completo de Freund y se inyecta subcutáneamente. A intervalos de dos a tres semanas, se emulsionan alícuotas adicionales de antígeno NgR con Coadyuvante Incompleto de Freund y se inyectan subcutáneamente. Antes de la inyección de refuerzo final, se toma una muestra de suero de los ratones inmunizados y se analiza mediante transferencia western para confirmar la presencia de anticuerpos que inmunorreaccionan con NgR. Se puede utilizar el suero de los animales inmunizados como antisuero policlonal o se puede utilizar para aislar anticuerpos policlonales que reconocen NgR. Alternativamente, los animales se sacrifican y se separan sus bazos para la generación de anticuerpos monoclonales.

Para generar anticuerpos monoclonales, se colocan los bazos en 10 ml de RPMI-1640 sin suero, y se forman suspensiones de una única célula triturando los bazos en RPMI 1640 sin suero, con un suplemento de L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina de 100 unidades/ml, y estreptomicina de 100 \mug/ml (RPMI) (Gibco, Canadá). Las supensiones celulares se filtran y se lavan mediante centrifugación y se resuspenden en RPMI sin suero. Los timocitos tomados de ratones Balb/c no sometidos a tratamiento previo se preparan de una manera similar y se utilizan como Capa Alimentadora. Las células de mieloma NS-1, mantenidas en fase log en RPMI con suero bovino fetal al 10% (FBS)
(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) durante tres días antes de la fusión, se centrifugan y también se lavan.

Para producir fusiones de hibridoma, se combinan las células de bazo de los ratones inmunizados con células NS-1 y se centrifugan, y el sobrenadante se aspira. El sedimento celular se desprende golpeando el tubo, y se agitan 2 ml de PEG 1500 a 37ºC (50% en HEPES 75 mM, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) en el sedimento, seguido de la adición de RPMI sin suero. Después de eso, las células se centrifugan, se resuspenden en RPMI que contiene FBS al 15%, hipoxantina sódica 100 \muM, aminopterina 0,4 \muM, timidina 16 \muM (HAT) (Gibco), 25 unidades/ml de Il-6 (Boehringer-Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml, y se cultivan en placa en 10 placas para el cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo Corning (Corning, Corning, NY).

Los días 2, 4, y 6 después de la fusión, se separan 100 \mul de medio de los pocillos de las placas de fusión y se remplazan por medio de nueva aportación. El día 8, se escrutan las fusiones mediante ELISA, sometiendo a ensayo en busca de la presencia de IgG de ratón que se une a NgR. Los pocillos de fusión seleccionados se clonan adicionalmente mediante dilución hasta que se obtienen cultivos monoclonales productores de anticuerpos anti-NgR.

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B. Humanización de anticuerpos monoclonales anti-NgR

El patrón de expresión de NgR referido en la presente memoria y el potencial de los NgR como dianas para la intervención terapéutica sugieren indicaciones terapéuticas para los inhibidores de NgR (antagonistas). Los anticuerpos neutralizadores de NgR comprenden una clase de agentes terapéuticos útiles como antagonistas de NgR. Los siguientes son protocolos para mejorar la utilidad de los anticuerpos monoclonales anti-NgR como agentes terapéuticos en seres humanos "humanizando" los anticuerpos monoclonales para mejorar su vida media en suero y volverlos menos inmunogénicos en anfitriones humanos (esto es, para evitar la respuesta de anticuerpos humanos a anticuerpos anti-NgR no humanos).

Los principios de humanización se han descrito en la literatura y se facilitan mediante la disposición modular de las proteínas anticuerpo. Para minimizar la posibilidad de unión al complemento, se prefiere un anticuerpo humanizado del isotipo IgG4.

Por ejemplo, se logra un nivel de humanización generando anticuerpos quiméricos que comprenden los dominios variables de proteínas anticuerpo no humanas de interés con los dominios constantes de moléculas de anticuerpo humanas. (Véase, p. ej., Morrison et al., (1989) Adv. Immunol., 44, 65-92). Los dominios variables de los anticuerpos anti-NgR neutralizadores de NgR se clonan a partir del ADN genómico de un hibridoma de células B o de ADNc generado a partir de ARNm aislado del hibridoma de interés. Los fragmentos génicos de la región V se unen a exones que codifican los dominios constantes de los anticuerpos humanos, y el constructo resultante se expresa en células anfitrionas de mamífero adecuadas (p. ej., células de mieloma o CHO).

Para lograr un nivel de humanización aún mayor, se clonan en secuencias de anticuerpos humanos solamente aquellas porciones de los fragmentos génicos de la región variable que codifican regiones determinantes de la complementariedad de unión al antígeno ("CDR") de los genes de los anticuerpos monoclonales no humanos. (Véase, p. ej., Jones et al., (1986) Nature 321, 522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239, 1534-1536; y Tempest et al., (1991) Bio/Technology 9, 266-271). Si fuera necesario, también se modifica el marco en lámina \beta del anticuerpo humano que circunda las regiones CDR para reflejar más fielmente la estructura tridimensional del dominio de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal original. (Véase Kettleborough et al., (1991) Protein Engin. 4, 773-783; y Foote et al., (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499).

En un enfoque alternativo, la superficie de un anticuerpo monoclonal no humano de interés se humaniza alterando los residuos de la superficie seleccionados del anticuerpo no humano, p. ej., mediante mutagénesis dirigida al sitio, a la vez que conservan todos los residuos interiores y de contacto del anticuerpo no humano. Véase Padlan (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498.

Los enfoques anteriores se emplean utilizando anticuerpos monoclonales anti-NgR neutralizadores de NgR y los hibridomas que los producen para generar anticuerpos neutralizadores de NgR humanizados útiles como agentes terapéuticos para tratar o paliar las condiciones en las que resulta perjudicial la expresión de NgR o la señalización de NgR mediada por ligando.

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C. Anticuerpos Neutralizadores de NgR Humano de Presentación en Fagos

Los anticuerpos neutralizadores de NgR humano se generan mediante técnicas de presentación en fagos tales como las descritas por Aujame et al. (1997) Human Antibodies 8, 155-168; Hoogenboom (1997) TiBTECH 15, 62-70; y Rader et al. (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508. Por ejemplo, las regiones variables del anticuerpo en forma de fragmentos Fab o fragmentos Fv de cadena sencilla unidos se fusionan al extremo amino de la proteína de la envoltura menor de fagos filamentosos pIII. La expresión de la proteína de fusión y su incorporación a la envoltura del fago maduro da como resultado partículas de fago que presentan un anticuerpo sobre su superficie y contienen el material genético que codifica el anticuerpo. La genoteca de fagos que comprende tales constructos es expresada en bacterias, y la genoteca es escrutada en busca de anticuerpos de fagos específicos de NgR utilizando NgR marcado o inmovilizado como antígeno-sonda.

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D. Anticuerpos neutralizadores de NgR Humano de ratones transgénicos

Se generan anticuerpos neutralizadores de NgR humano en ratones transgénicos esencialmente como describen Bruggemann et al. (1996) Immunol. Today 17, 391-397 y Bruggemann et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 455-458. Los ratones transgénicos que portan segmentos génicos V en la configuración de la línea germinal y que expresan estos transgenes en su tejido linfoide se inmunizan con una composición de NgR utilizando protocolos de inmunización convencionales. Se generan hibridomas utilizando células B de los ratones inmunizados utilizando protocolos convencionales y se escrutan para identificar los hibridomas que secretan anticuerpos humanos anti-NgR (p. ej., como se ha descrito antes).

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Ejemplo 14 Análisis para Identificar Moduladores de la Actividad de NgR

Más abajo se exponen varios análisis no limitantes para identificar moduladores (agonistas y antagonistas) de la actividad de NgR. Entre los moduladores que pueden ser identificados por medio de estos análisis están los compuestos ligandos naturales del receptor; los análogos sintéticos y derivados de ligandos naturales; los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y/o compuestos de tipo anticuerpo derivados de anticuerpos naturales o de genotecas combinatorias de tipo anticuerpo; y/o los compuestos sintéticos identificados mediante el escrutinio de alto rendimiento de genotecas; y similares. Todos los moduladores que se unen a NgR son útiles para identificar NgR en muestras de tejido (p. ej., para fines diagnósticos, fines patológicos, y similares). Los moduladores agonistas y antagonistas son útiles para regular al alza y regular a la baja la actividad de NgR, respectivamente, para tratar enfermedades caracterizadas por niveles anormales de actividad de NgR. Los análisis se pueden realizar utilizando supuestos moduladores individuales, y/o se pueden realizar utilizando un agonista conocido combinado con antagonistas candidato (o viceversa).

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A. Análisis de AMPc

En un tipo de análisis, se miden los niveles de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) en células transfectadas con NgR que han sido expuestas a compuestos moduladores candidato. Los protocolos para los análisis de AMPc han sido descritos en la literatura (Véase, p. ej., Sutherland et al., (1986) Circulation 37, 279; Frandsen et al., (1976) Life Sciences 18, 529-541; Dooley et al., (1997) J. Pharmacol. Exp. Therap. 283, 735-41; y George et al., (1997) J. Biomol. Screening 2, 235-40). Un protocolo ilustrativo para semejante análisis, utilizando un Análisis Adenylyl Cyclase Activation FlashPlate® de NEN® Life Science Products, se expone más abajo.

Brevemente, la secuencia codificante de NgR (p. ej., un ADNc de un ADN genómico sin intrones) se subclona en un vector de expresión comercial, tal como pzeoSV2 (Invitrogen) y se transfecta transitoriamente en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) utilizando métodos conocidos, tales como el protocolo de transfección proporcionado por Boehringer-Mannheim cuando se suministra el reactivo de transfección FuGENE 6. Las células CHO transfectadas se siembran en microplacas de 96 pocillos del kit de análisis FlashPlate®, que son recubiertas con centelleante sólido al cual se ha unido antisuero para AMPc. Como control, se siembran algunos pocillos con células CHO de tipo salvaje (no transfectadas). Otros pocillos de la placa reciben diferentes cantidades de solución patrón de AMPc para su uso en la creación de una curva patrón.

Se añaden uno o más compuestos de ensayo (p. ej., moduladores candidato) a las células de cada pocillo, con agua y/o medio sin compuesto/diluyente que sirven como control o controles. Después del tratamiento, se permite que el AMPc se acumule en las células durante exactamente 15 minutos a la temperatura ambiente. El análisis se termina mediante la adición de tampón de lisis que contiene AMPc marcado con [I^{125}], y la placa se cuenta utilizando un contador de centelleo para microplaca de 96 pocillos Packard Topcount®. El AMPc no marcado de las células lisadas (o de los patrones) y cantidades fijadas de AMPc-[I^{125}] compiten por la unión del anticuerpo a la placa. Se construye una curva patrón, y se obtienen por interpolación los valores de AMPc para los desconocidos. Los cambios en los niveles de AMPc intracelular de las células en respuesta a la exposición a un compuesto de ensayo son indicativos de actividad moduladora de NgR. Los moduladores que actúan como agonistas de receptores que se acoplan al subtipo G_{S} de proteínas estimularán la producción de AMPc, conduciendo a un incremento de 3-10 veces medible en los niveles de AMPc. Los agonistas de los receptores que se acoplan al subtipo G_{i/o} de proteínas G inhibirán la producción de AMPc estimulada por forscolina, conduciendo a una disminución medible en los niveles de AMPc del 50-100%. Los moduladores que actúan como agonistas inversos revertirán estos efectos en los receptores que son constitutivamente activos o son activados por agonistas conocidos.

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B. Análisis con Aequorina

En otro análisis, las células (p. ej., células CHO) son co-transfectadas transitoriamente con un constructo de expresión de NgR y un constructo que codifica la fotoproteína apoaquorina. En presencia del cofactor coelenterazina, la apoaquorina emitirá una luminiscencia medible que es proporcional a la cantidad de calcio libre intracelular (citoplásmico). Véase generalmente, Cobbold, et al. "Aequorin measurements of cytoplasmic free calcium", En: McCormack J.G. y Cobbold P.H. eds., CELLULAR CALCIUM: A PRACTICAL APPROACH. Oxford: IRL Press (1991); Stables et al., (1997) Anal. Biochem. 252, 115-26; y Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS. Sexta edición. Molecular Probes, Eugene, OR (1996)).

En un análisis ilustrativo, se subclona NgR en el vector de expresión comercial pzeoSV2 (Invitrogen) y se co-transfecta transitoriamente junto con un constructo que codifica la fotoproteína apoaquorina (Molecular Probes, Eugene, OR) en células CHO utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Boehringer-Mannheim) y el protocolo de transfección proporcionado en el anexo del producto.

Las células se cultivan durante 24 horas a 37ºC en MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina de 10 U/ml y 10 \mug/ml de estreptomicina, en cuyo momento el medio se cambia por MEM sin suero que contiene coelenterazina 5 \muM (Molecular Probes, Eugene, OR). El cultivo continúa después durante dos horas más a 37ºC. Con posterioridad, las células se desprenden de la placa utilizando VERSEN (Gibco/BRL), se lavan, y se resuspenden a 200.000 células/ml en MEM sin suero.

Las diluciones de los compuestos moduladores de NgR candidato se preparan en MEM sin suero y se dispensan en los pocillos de una placa de análisis de 96 pocillos opaca a 50 \mul/pocillo. Después las placas se cargan sobre un luminómetro de placa de microtitulación MLX (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA). El aparato se programa para dispensar 50 \mul de suspensiones celulares a cada pocillo, un pocillo cada vez, y leer inmediatamente la luminiscencia durante 15 segundos. Las curvas dosis-respuesta para los moduladores candidato se construyen utilizando el área bajo la curva para cada pico de señal luminosa. Los datos se analizan con SlideWrite, utilizando la ecuación para un ligando con un sitio, y se obtienen los valores de CE_{50}. Los cambios en la luminiscencia causados por los compuestos se consideran indicativos de actividad moduladora. Los moduladores que actúan como agonistas en los receptores que se asocian con el subtipo Gq de proteínas G proporcionan un incremento de la luminiscencia de hasta 100 veces. Los moduladores que actúan como agonistas inversos revertirán este efecto en los receptores que son activos constitutivamente o activados por agonistas conocidos.

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C. Análisis del Gen Informador de Luciferasa

La fotoproteína luciferasa proporciona otra herramienta útil para analizar moduladores de la actividad de NgR. Las células (p. ej., células CHO o células COS 7) se co-transfectan transitoriamente con un constructo de expresión de NgR (p. ej., NgR en pzeoSV2) y un constructo informador que incluye un gen para la proteína luciferasa aguas abajo de un sitio de unión de un factor de transcripción, tal como el elemento de respuesta a AMPc (CRE), AP-1, o NF-kappa B. Los niveles de expresión de la luciferasa reflejan el estado de activación de los eventos de señalización. (Véase generalmente, George et al. (1997) J. Biomol. Screening 2, 235-240; y Stratowa et al. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 574-581). La actividad luciferasa se puede medir cuantitativamente utilizando, p. ej., reactivos de análisis de luciferasa que son asequibles comercialmente de Promega (Madison, WI).

En un análisis ilustrativo, se cultivan en placa células CHO en fuentes de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 100.000 células/pocillo un día antes de la transfección y se cultivan a 37ºC en MEM (Gibco/BRL) con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina de 10 U/ml y estreptomicina de 10 \mug/ml. Las células se co-transfectan transitoriamente con un constructo de expresión de NgR y un constructo informador que contiene el gen de la luciferasa. Los plásmidos informadores CRE-luciferasa, AP-1-luciferasa y NF-kappa B-luciferasa se pueden adquirir de Stratagene (Legally, CA). Las transfecciones se realizan utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Boehringer-Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células transfectadas solo con el constructo informador se utilizan como control. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lavan una vez con PBS pre-calentado a 37ºC. Después se añade MEM sin suero a las células ya sea solo (control) o con uno o más moduladores candidato y se incuban las células a 37ºC durante cinco horas. Después de eso, las células se lavan una vez con PBS enfriado con hielo y se lisan mediante la adición de 100 \mul de tampón de lisis por pocillo del kit de análisis de luciferasa suministrado por Promega. Tras una incubación durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se mezclan 15 \mul del producto lisado con 50 \mul de solución sustrato (Promega) en una placa de 96 pocillos, de color blanco opaco, y se lee la luminiscencia inmediatamente sobre un contador de centelleo y luminiscencia Microbeta modelo 1450 de Wallace (Wallace Instruments, Gaithersburg, MD).

Las diferencias en la luminiscencia en presencia frente a ausencia de un compuesto modulador candidato son indicativas de actividad moduladora. Los receptores que son constitutivamente activos o activados por agonistas proporcionan típicamente una estimulación de la luminiscencia de 3-20 veces en comparación con las células transfectadas con el gen informador solo. Los moduladores que actúan como agonistas inversos revertitrán este efecto.

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D. Medida del calcio intracelular utilizando FLIPR

Los cambios en los niveles de calcio intracelular son otro indicador reconocido de actividad receptora, y tales análisis se pueden emplear para escrutar en busca de moduladores de la actividad de NgR. Por ejemplo, se cultivan en placa células CHO transfectadas establemente con un vector de expresión de NgR a una densidad de 4 x 10^{4} células/pocillo en placas de 96 pocillos, con paredes negras Packard diseñados especialmente para discriminar las señales de fluorescencia que emanan de los diferentes pocillos de la placa. Las células se incuban durante 60 minutos a 37ºC en PBS modificado de Dulbecco (D-PBS) que contiene 36 mg/ml de piruvato y 1 g/l de glucosa con la adición de suero bovino fetal al 1% y uno de cuatro colorantes indicadores de calcio (Fluo-3® AM, Fluo-4® AM. Calcium Greene®-1 AM, u Oregon Green® 488 BAPTA-1 AM), cada uno a una concentración 4 \muM. Las placas se lavan una vez con D-PBS modificado sin suero bovino fetal al 1% y se incuban durante 10 minutos a 37ºC para separar el colorante residual de la membrana celular. Además, se realizan una serie de lavados con D-PBS modificado sin suero bovino fetal al 1% inmediatamente antes de la activación de la respuesta del calcio.

Una respuesta de calcio se inicia mediante la adición de uno o más compuestos agonistas del receptor candidato, ionóforo de calcio A23187 (10 \muM; control positivo), o ATP (4 \muM; control positivo). La fluorescencia se mide por medio de FLIPR de Molecular Device con un láser de argón (excitación a 488 nm). (Véase, p. ej., Kuntzweiler et al. (1998) Drug Dev. Res. 44, 14-20). La apertura del diafragma para la cámara detectora se ajusta a 2,5 y la longitud de la exposición es de 0,4 milisegundos. La fluorescencia basal de las células se mide durante 20 segundos antes de la adición del agonista candidato, ATP, o A23187, y el nivel de fluorescencia basal se resta de la señal de repuesta. La señal de calcio se mide durante aproximadamente 200 segundos, tomando lecturas cada dos segundos. El ionóforo de calcio A23187 y el ATP aumentan la señal de calcio 200% por encima de los niveles de la línea base. En general, los NgR activados aumentan la señal de calcio al menos aproximadamente 10-15% por encima de la señal de la línea base.

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E. Análisis de Unión GTP\gammaS[S^{35}]

También es posible evaluar si NgR se señaliza a través de una ruta mediada por proteína G. Debido a que los receptores acoplados a la proteína G señalizan a través de las proteínas G intracelulares cuya actividad implica la unión a GTP y la hidrólisis para producir GDP unido, la medida de la unión del análogo de GTP no hidrolizable GTP\gammaS-[S^{35}] en presencia o ausencia de moduladores candidato proporciona otro análisis para la actividad moduladora. (Véase, p. ej., Kowal et al., (1998) Neuropharmacology 37, 179-187).

En un análisis ilustrativo, se hacen crecer células transfectadas establemente con un vector de expresión de NgR en fuentes de cultivo de tejidos de 10 cm hasta la subconfluencia, se enjuagan una vez con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato sin Ca^{2+}/Mg^{2+} enfriada con hielo, y se raspan en 5 ml del mismo tampón. Las células se sedimentan mediante centrifugación (500 x g, 5 minutos), se resuspenden en tampón TEE (Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM), y se congelan en nitrógeno líquido. Después de descongelar, las células se homogeneizan utilizando un homogeneizador Dounce (1 ml de TEE por placa de células), y se centrifuga a 1.000 x g durante 5 minutos para separar los núcleos y las células intactas.

El sobrenadante del producto homogeneizado se centrifuga a 20.000 x g durante 20 minutos para aislar la fracción de membrana, y el sedimento de membrana se lava una vez con TEE y se resuspende en tampón de unión (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM). Las membranas resuspendidas se pueden congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -70ºC hasta su uso.

Las alícuotas de las membranas celulares preparadas como se ha descrito antes y almacenadas a -70ºC se descongelan, se homogeneizan, y se diluyen en tampón que contiene HEPES 20 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 120 mM, GDP 10 \muM, y ascorbato 0,2 mM, a una concentración de 10-50 \mug/ml. En un volumen final de 90 \mul, se incuban los productos homogeneizados con concentraciones variables de compuestos moduladores candidato o GTP 100 \muM durante 30 minutos a 30ºC y después se colocan sobre hielo. A cada muestra, se le añaden 10 \mul de 5'-O-(3-tio[S^{35}]trifosfato de guanosina (NEN, 1200 Ci/mmol; GTP\gamma[S^{35}]) a una concentración final de 100-200 pM. Las muestras se incuban a 30ºC durante 30 minutos más, se añade 1 ml de HEPES 10 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, a 4ºC y la reacción se detiene mediante filtración.

Las muestras se filtran sobre filtros GF/B Whatman y los filtros se lavan con 20 ml de HEPES 10 mM enfriado con hielo, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM. Los filtros se cuentan mediante espectroscopía de centelleo en líquido. La unión no específica de GTP\gammaS-[S^{35}] se mide en presencia de GTP 100 mM y se resta del total. Se seleccionan compuestos que modulan la cantidad de unión de GTP\gammaS-[S^{35}] en las células, en comparación con las células no transfectadas. La activación de los receptores por los agonistas proporciona un incremento de hasta cinco veces la unión de GTP\gammaS-[S^{35}]. Esta respuesta es bloqueada por los antagonistas.

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F. Liberación de Ácido Araquidónico[H^{3}]

La activación de los NgR también puede potenciar la liberación de ácido araquidónico en las células, proporcionando otro análisis útil más para los moduladores de la actividad de NgR. (Véase, p. ej., Kanterman et al., (1991) Mol. Pharmacol. 39, 364-369). Por ejemplo, se cultivan en placa células CHO que están transfectadas establemente con un vector de expresión de NgR a una densidad de 15.000 células/pocillo y se hacen crecer en un medio MEM con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina de 10 U/ml y estreptomicina de 10 \mug/ml durante 48 horas a 37ºC antes de su uso. Las células de cada pocillo se marcan mediante incubación con ácido araquidónico-[H^{3}] (Amersham Corp., 210 Ci/mmol) a 0,5 \muci/ml en 1 ml de MEM con un suplemento de HEPES 10 mM, pH 7,5, y albúmina de suero bovina sin ácido graso al 0,5% durante 2 horas a 37ºC. Después las células se lavan dos veces con 1 ml del mismo tampón.

Se añaden los compuestos moduladores candidato en 1 ml del mismo tampón, solo o con ATP 10 \muM y las células se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Se utilizan tampón solo y células transfectadas simuladamente como controles. Las muestras (0,5 ml) de cada pocillo se cuentan mediante espectroscopía de centelleo en líquido. Los agonistas que activan el receptor conducirán a la potenciación de la liberación de ácido araquidónico-[H^{3}] estimulada por ATP. Esta potenciación es bloqueada por los antagonistas.

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G. Tasa de Acidulación Extracelular

En otro análisis más, se analizan los efectos de los moduladores candidato de la actividad de NgR controlando los cambios extracelulares en el pH inducidos por los compuestos de ensayo (véase, p. ej., Dunlop et al. (1998) J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 40, 47-55). En un caso, se siembran células CHO transfectadas con un vector de expresión de NgR en copas con cápsulas de 12 mm (Molecular Devices Corp.) a 4 x 10^{5} células/copa en MEM con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina de 10 U/ml, y estreptomicina de 10 \mug/ml. Las células se incuban en este medio a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 24 horas.

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Se miden las tasas de acidulación extracelulares utilizando un microfisiómetro Cytosensor (Molecular Devices Corp.). Las copas de las cápsulas se cargan en las cámaras del sensor del microfisiómetro y las cámaras se perfunden con tampón circulante (MEM sin bicarbonato con un suplemento de L-glutamina 4 mM, penicilina de 10 unidades/ml, estreptomicina de 10 \mug/ml, NaCl 26 mM) a una velocidad de flujo de 100 \mul/minuto. Los agonistas candidato u otros agentes se diluyen en el tampón circulante y se perfunden a través de un segundo lecho fluido. Durante cada ciclo de la bomba de 60 segundos, la bomba se hace funcionar durante 38 segundos y se apaga durante los 22 segundos restantes. Se registra el pH del tampón circulante en la cámara del sensor durante el ciclo de 43-58 segundos, y la bomba se reinicia a los 60 segundos para iniciar el siguiente ciclo. La tasa de acidulación del tampón circulante durante el tiempo de registro se calcula mediante el programa Cytosoft. Los cambios en la tasa de acidulación se calculan restando el valor de la línea base (la media de 4 medidas de la tasa inmediatamente antes de la adición de un candidato a modulador) de la medida de la tasa más alta obtenida después de la adición de un candidato a modulador. El aparato seleccionado detecta 61 mV/unidad de pH. Los moduladores que actúan como agonistas del receptor dan como resultado un incremento de la tasa de acidulación extracelular en comparación con la tasa en ausencia de agonista. Esta respuesta es bloqueada por los moduladores que actúan como antagonistas del receptor.

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Ejemplo 15 mNgR3 no se une a hNogo-A(1055-1120)

Para someter a ensayo funcionalmente el NgR3 de ratón (en adelante, mNgR3) en busca de su capacidad para unirse a hNogo-A(1055-1120), se creó un vector de expresión de ADNc para una proteína mNgR3 etiquetada con el epítopo myc. El ADNc de NgR3 de ratón se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de cerebro adulto de ratón, desde la secuencia señal al codón de terminación, y se ligó en el vector pSecTag2 de manera que el vector codifique una secuencia señal seguida de una etiqueta myc seguida de una secuencia de mNgR3 madura. Este plásmido fue transfectado en células COS07, y se verificó la expresión de una proteína etiquetada con myc del tamaño pronosticado mediante análisis de inmunotransferencia. Los estudios de unión de fosfatasa alcalina-hNogo-A(1055-1120) y la inmunohistología de myc se llevaron a cabo como se ha descrito (Fournier et al., supra).

Las células que expresaban mNgR3 expresaron la proteína etiquetada con myc pero no se observó unión a AP-hNogo-A(1055-1120) en las condiciones empleadas (Fig. 8).

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Ejemplo 16 Identificación de ADNc y secuencias de proteína de NgR3 humano parcial

Se utilizó el programa tblastn para la búsqueda del homólogo humano de NgR3 de ratón. La secuencia de la proteína NgR3 de ratón (SEQ ID NO: 4) se utilizó para consultar una genoteca de etiquetas de secuencia expresada humanas (EST) del mismo propietario de Incyte que proporcionó un éxito muy significativo: Incyte Template ID 190989.1. Esta secuencia (937 nucleótidos) contiene un marco de lectura abierto de 312 aminoácidos en el segundo marco inverso que muestra una identidad de 88% con los residuos 66 a 381 de NgR3 de ratón (SEQ ID NO: 4), indicando fuertemente que es parte del homólogo de NgR3 humano.

Una consulta del SEQ ID NO: 4 frente a la base de datos de EST humanas públicas en Genbank también produjo un éxito con una EST de 465 pb (Número de acceso: R35699; Número de versión: R35699.1; GI: 792600). Existen numerosas deleciones e inserciones de nucleótidos individuales dentro de esta secuencia que ocasionan errores de desplazamiento del marco. Toda la secuencia fiable contenida en esta EST pública está presente en la EST de Incyte (Template ID 190989.1).

Para obtener más secuencia de nucleótidos que ampliara la secuencia de aminoácidos en el extremo carboxi terminal, se adquirió el clon Núm. 38319 de I.M.A.G.E. Consortium, que corresponde al Núm. de acceso Genbank R35699, de Incyte Genomics Inc. y se sometió a análisis adicional de la secuencia de ADN. Este clon consiste en un fragmento NotI/HindIII que contiene la secuencia de interés, clonado en los sitios NotI/HindIII del vector Lafmid BA (http://image.llnl.gov/image/html/libs/lafmidB.A.shtml). El clon fue recibido como un cultivo por picadura en agar, que se aplicó en estrías sobre placas de agar LB que contenían ampicilina de 50 \mug/ml para aislar las colonias individuales. Se hicieron crecer seis colonias en medio LB con antibiótico, y se preparó ADN plasmídico utilizando el Promega Wizard Plus Miniprep DNA Purificaton System (Promega Núm. A7500). Estos ADN fueron digeridos con posterioridad con las enzimas de restricción NotI y HindIII para confirmar que los clones contenían un inserto. El inserto de un producto aislado se secuenció utilizando una combinación de cebadores específicos del vector y específicos del gen que produjeron una secuencia de nucleótidos parcial de NgR3 humano de 1176 nucleótidos (SEQ ID NO: 13). Una traducción de esta secuencia proporciona una secuencia parcial para el NgR3 humano de 392 aminoácidos (SEQ ID NO: 14).

La secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 13 difiere de la secuencia de EST de Incyte en tres posiciones. Los nucleótidos de las posiciones 12-13 del SEQ ID NO: 13 son CG, mientras los correspondientes nucleótidos en Incyte Template ID 190989 son GT (esto es, las posiciones 12-13 del complemento de Incyte Template ID 190989.1). Además, la posición 641 del SEQ ID NO: 13 es una C, mientras el nucleótido correspondiente de Incyte Template ID 190989.1 es una A (esto es, la posición 641 del complemento de Incyte Template ID 190989.1). Esto da como resultado dos cambios en los aminoácidos cuando se compara el SEQ ID NO: 14 con el ORF codificado por Incyte Template 190989.1: el SEQ ID NO: 14 contiene una valina en la posición 5, mientras el ORF codificado por Incyte Template ID 190989.1 contiene una leucina, el SEQ ID NO: 14 contiene una alanina en la posición 214, mientras el ORF codificado por Incyte Template ID 190989.1 contiene un ácido glutámico.

La secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 13 difiere de la secuencia de EST pública (Número de Acceso: R35699; Número de versión: R35699.1; GI: 792600) en dos posiciones (dentro de los primeros 200 nucleótidos de la secuencia fiable). Los nucleótidos de las posiciones 12-13 del SEQ ID NO: 13 son CG, mientras los correspondientes nucleótidos de la EST pública son GT (esto es, las posiciones 12-13 de la EST pública; Núm. de acceso: R35699; Núm. de versión: R35699.1; GI: 792600). Esto conduce a un único cambio de aminoácido cuando se compara el SEQ ID NO: 14 con el ORF codificado por la EST pública: el SEQ ID NO: 14 contiene una valina en la posición 5, mientras el ORF codificado por la EST pública contiene una leucina.

Un análisis Bestfit de la secuencia de aminoácidos humana parcial con la secuencia de aminoácidos de ratón completa indica que la secuencia de aminoácidos de NgR3 humano es completa en el extremo carboxi terminal y que comparten una identidad del 89,54%. En la Figura 9 se muestra un alineamiento de todas las proteínas de NgR. Aunque la secuencia de aminoácidos de NgR3 humano ha perdido los primeros 25 aminoácidos, se puede determinar que la proteína NgR3 humana contiene las siguientes características en común con las otras secuencias de NgR: (1) ocho dominios con Repeticiones Ricas en Leucina (LRR); (2) un dominio LRR carboxi terminal (LRR-CT); (3) una cisteína conservada en el cuarto dominio LRR; (4) un sitio de glicosilación potencial conservado en el octavo dominio LRR; y (5) un extremo carboxilo hidrófobo.

Como apreciarán los expertos en la técnica, se pueden realizar numerosos cambios y modificaciones en las realizaciones preferidas de la invención sin apartarse del espíritu de la invención. Se pretende que todas estas variaciones estén dentro del alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Clave para el Listado de Secuencias

SEQ ID NO: 1

secuencia de ADNc de NgR2 humano derivada de la secuencia genómica AC013606

SEQ ID NO: 2

secuencia de aminoácidos de NgR2 humano

SEQ ID NO: 3

secuencia de ADNc de NgR3 de ratón derivada de AC021768

SEQ ID NO: 4

una secuencia de aminoácidos de NgR3 de ratón

SEQ ID NO: 5

una secuencia de aminoácidos de NgR1 humano

SEQ ID NO: 6

una secuencia de aminoácidos consenso de los NgR

SEQ ID NO: 7

residuos aminoácido núm. 1055-1120 de hNogoA (Nogo-66)

SEQ ID NO: 8

una secuencia de aminoácidos de NgR2 humano madura

SEQ ID NO: 9

una secuencia de aminoácidos de NgR3 de ratón madura

SEQ ID NO: 10

una secuencia de aminoácidos de LLRNT de NgR consenso

SEQ ID NO: 11

una secuencia de aminoácidos del dominio LRRCT de NgR consenso

SEQ ID NO: 12

una secuencia de aminoácidos de LRR de NgR consenso

SEQ ID NO: 13

una secuencia de nucleótidos de NgR3 humano parcial

SEQ ID NO: 14

una secuencia de aminoácidos de NgR3 humano parcial

SEQ ID NO: 15

una secuencia genómica que codifica una secuencia de NgR2 humano

SEQ ID NO: 16

una secuencia genómica (hebra complementaria) que codifica NgR3 de ratón

SEQ ID NO: 17

una secuencia de aminoácidos de NgR1 de ratón

SEQ ID NO: 18

una secuencia consenso para el dominio NTLRRCT de NgR

SEQ ID NO: 19

una secuencia de aminoácidos del dominio LRRCT de NgR consenso.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> BIOGEN, INC.

\hskip1cm

YALE UNIVERSITY

\hskip1cm

STRITTMATTER, STEPHEN M.

\hskip1cm

CATE, RICHARD L.

\hskip1cm

SAH, DINAH W.Y.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> NOGO RECEPTOR HOMOLOGS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> A116PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/238,361

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-10-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 461

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 440

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27).. (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (39)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52).. (59)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62)..(63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (66).. (69)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)..(74)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (76)..(80)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (83)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (87)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (90)..(91)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (94)..(96)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (104)..(105)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (107)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (111)..(112)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (116)..(117)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (119)..(122)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (124)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (127)..(128)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (136)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (138)..(141)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (193)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (146)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (148)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (151)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (154)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (162)..(170)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (175)..(176)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (184)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (186)..(189)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (192)..(193)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (196)..(197)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (199)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (202)..(203)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (205)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (208)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (210)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (212)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (215)..(218)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (223)..(224)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (226)..(227)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (234)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (236)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (238)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (243)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (246)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (248)..(251)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (253)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (257)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (259)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (261).. (262)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (264).. (267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (269)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (272)..(273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (275)..(277)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (279)..(281)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (283)..(287)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(290)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (292)..(328)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (330)..(341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (344)..(346)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (348)..(399)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (901)..(428)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (431)..(439)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

33

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 421

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9).. (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12).. (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(41)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47)..(49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5).. (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)..(46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)..(57)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (60)..(62)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (64)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (70)..(71)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (75)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (77).. (78)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (80)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (82)..(B3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85)..(88)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (90)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (93)..(94)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (102)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (104)..(107)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (117)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (120)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (128)..(136)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (141)..(142)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (150)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (152)..(155)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (158)..(159)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (162)..(163)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (165)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (168)..(169)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (171)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (176)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (178)..(179)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (181)..(184)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (187)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (189)..(190)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (192)..(193)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 143899

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2044)..(2144)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6609)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6625)..(6729)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14153)..(14252)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19512)..(19611)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22595)..(22694)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27825)..(27924)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34953)..(35052)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40783)..(40882)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49000)..(49099)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62884)..(62983)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (75528)..(75627)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (87944)..(88043)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t; c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (111030)..(111129)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 215980

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1001)..(1100)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2123)..(2222)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3728)..(3827)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5168)..(5267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7481)..(7580)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8849)..(8998)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10375)..(10474)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12270)..(12369)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13438) ..(13537)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15902)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15939)..(16038)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18223)..(18322)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20974)..(21073)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24403)..(24502)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27574)..(27673)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30892)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30901)..(31000)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34443)..(34542)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38205)..(38304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42373)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42386)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42393)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42461)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44809)..(44908)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (51380)..(51479)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56740)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56765)..(56864)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62818)..(62917)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (68518)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (68534)..(68633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (74552)..(74651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81446)..(81545)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (88519)..(88618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (93791)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (93794)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96565)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96570)..(96573)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96579)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96590)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96596)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96602)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96616)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96629)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96668)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96715)..(96814)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (104447)..(104546)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114521)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114527).. (114626)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (127063)..(127162)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (139133)..(139232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (151051)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (153242)..(153341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (164706)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (164708)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1164710)..(164809)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (182242)..(182341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (192158)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (192192)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (198842)..(198941)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (199437)..(199438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (208276)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (215974)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (215976)..(215977)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (215979)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

1220

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

145

Claims (19)

1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2;

(b)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2;

(c)

los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2;

(d)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

(e)

los aminoácidos 31 a 310 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido;

(f)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

(g)

los aminoácidos 31 a 395 del SEQ ID NO: 2 y hasta cinco aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C de dicho polipéptido; y

(h)

los aminoácidos 1 a 395 del SEQ ID NO: 2 excepto 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas por 100 residuos aminoácido;

donde dicho polipéptido disminuye la inhibición del crecimiento axonal en neuronas del SNC humano.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 70% a los aminoácidos 1 a 420 del SEQ ID NO: 2;

(b)

los aminoácidos 1 a 420 del SEQ ID NO: 2

(c)

una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 70% a los aminoácidos 31 a 420 del SEQ ID NO: 2; y

(d)

los aminoácidos 31 a 420 del SEQ ID NO: 2;

donde dicho polipéptido disminuye la inhibición del crecimiento axonal en neuronas del SNC humano.

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3. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende adicionalmente un polipéptido heterólogo.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, donde dicho polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en Fc, Glutation S-transferasa (GST), y una etiqueta de Histidina (etiqueta His).

5. Un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente uno o más elementos para el control de la expresión conectado operablemente a dicho ácido nucleico.

7. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-6.

8. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-6 o el vector de la reivindicación 7, donde la célula anfitriona excluye una célula capaz de formar un ser humano.

9. La célula anfitriona de la reivindicación 8, donde dicha célula anfitriona es una célula eucariótica.

10. Un polipéptido receptor de NOGO de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 expresado por la célula anfitriona de la reivindicación 8 o 9.

11. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 10.

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12. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de la reivindicación 11, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

13. Una composición que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, el vector de la reivindicación 7, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 10, o el anticuerpo de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, y un portador.

14. Un método in vitro de disminución de la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del SNC que comprende poner en contacto una neurona con el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 10 o el anticuerpo de la reivindicación 11 o la reivindicación 12.

15. El uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 10 o el anticuerpo de la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para la preparación de una composición farmacéutica para modular la inhibición del crecimiento axonal.

16. El uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 10 o el anticuerpo de la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (SNC) en un mamífero, donde dicha enfermedad, trastorno, o lesión del SNC se selecciona del grupo que consiste en lesión cerebral, lesión de la médula espinal, ictus, o una enfermedad desmielinizante.

17. El uso de la reivindicación 15 o 16, donde dicha composición farmacéutica comprende adicionalmente un portador.

18. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde dicha composición farmacéutica se formula para la administración por una ruta seleccionada del grupo que consiste en administración parenteral, administración subcutánea, administración intravenosa, administración transmucosal, administración intradérmica, y administración transdérmica.

19. El uso de la reivindicación 16, donde dicha enfermedad desmielinizante se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, desmielinización monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, degeneración Esponjiforme, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática, y enfermedad de Krabbe.