JP2005519584A - Nogoレセプターホモログおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
第一の態様では、本発明は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含み、ヒトNgRH1 cDNAと呼ばれるヒト起源の単離DNAを提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号24で示されるラットNgRH1 cDNAに関する。さらなる態様では、本発明はラットおよび/またはヒト型NgRH1ポリペプチドに関する。
(a)配列番号1または配列番号24の配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド;
(b)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド;
(c)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド;
(d)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する単離ポリペプチド;
(e)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列;
(f)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と比較して0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、または0.99の同一率を有するポリペプチド配列を有する、または含んでなる単離ポリペプチド;および
(g)(a)〜(f)のポリペプチドの断片および変異体
が挙げられる。
本明細書に挙げられている全ての特許出願、特許および参照文献は出典明示によりそれらの全開示内容を本明細書の一部とする。
(a)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号1または配列番号24のヌクレオチド配列、またはその断片もしくはRNA転写物;
(b)(a)のものに相補的なヌクレオチド配列;
(c)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号2または配列番号25のポリペプチド、またはその断片;あるいは
(d)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号2のポリペプチドに対する抗体
を含んでなる診断キットに関する。
(a)化合物とNgRH1レセプター、好ましくはヒトNgRH1、最も好ましくは配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を含んでなるレセプターを合し;
(b)そのレセプターに対する化合物の効果を測定する
ことを含んでなる。
実施例1 ヒトNgRH1 cDNAの単離
ヒトNgRH1の同定および配列解析−クエリーとして公開されているNgRアミノ酸配列(受託番号:AF283463)を用いて、tblastn検索により、Celeraデータベースから2つの配列、hCT31020およびGA_53256868が提示され、それらの転写産物は、公開されているNgR配列とおおよそ50%の類似性(blastの結果)を示した。Wisconsin Package Version 10.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.からのGAPまたはBESTFIT解析のいずれかを用いてアラインメントを行った。多重配列解析をClustalWにより行った。NgRおよびそのホモログのシグナルペプチド予測を、Spscanを用いて行った。ロイシンリッチリピート(LRR)を、プロテインファミリーデータベースPfamに存在する種々のコンセンサスセグメントと配列を比較することにより同定した。LRRのさらなる同定および確認は、IMPALAソフトウエアを用いるBLOCKS+アラインメントにより行われた。可能性のあるGPI切断部位の予測は、スイス・インスティチュート・オブ・バイオインフォマティクス(SIB)のサーバーに存在するExPaSyプログラムパッケージからの、DGPIを用いて行われた。
NgRホモログ−1のcDNAを、ヒト脳cDNA(Marathon-ReadyTM cDNA, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7400-1)からPCRにより取得した。該遺伝子の5'および3'末端を、別々に増幅した(下記参照)。配列特異的プライマーを、Celeraデータベース(受託番号:hCT31020)由来の予測転写配列および公開DNAデータベース由来の2つのEST配列(受託番号:AI929019およびBE410139)から集めた連続配列に基づいてデザインした。4%DMSOおよびHerculaseTM Enhanced DNAポリメラーゼ(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いて、PCRをPerkinElmer GeneAmp 9600サイクラーで行った。5'末端(798bp)を、5'−RACEにより全脳Marathon−ReadyTM cDNA(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7400-1)から増幅した。
ヒトNgRおよびNgRH1の発現およびそれらの生化学的特性決定
材料−培地:MEM-α-プラス培地およびGlutamaxを含むOptiMEM I(Invitrogen, Basel, Switzerland)。一次抗体:モノクローナル抗V5抗体(Invitrogen, Basel, Switzerland);モノクローナル抗HA抗体クローンHA−7(SIGMA, Buchs, Switzerland)。二次抗体:POD結合抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体(SIGMA, Buchs, Switzerland);抗マウスIgG、FITC結合抗体(SIGMA, Buchs, Switzerland)。CompleteTM(Roche Applied Science (Rotkreuz, Switzerland)。
a)ノーザンブロット:hNgRおよびhNgRH1の発現の組織分布を調べるため、マルチプル・ティッシュ・ノーザンブロット(MTN, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)およびマルチプル・ティッシュ・エクスプレション・アレイ(MTEアレイ, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)をα−32P−dCTPおよびα−32P−dATP−放射性標識ヒトNgRおよびNgRHプローブとハイブリダイズさせた。それぞれのcDNAに対するプローブを以下のように作製した。NgRプローブはEcoRI/Xho−I切断によりpcDNA−Sport6−NgRの切り出しによって作製した。このクローンはヒト背根神経節(DRG)cDNAライブラリー(Life Technologies Inc., Rockville, Maryland)から得たものである。これはクエリーとしてヒトNgR cDNAを用い、ライブラリーのクローン配列に対してblast検索を行って同定した。pcDNA−Sport6−NgRのcDNAインサートは公開されているNgRの配列(受託番号:AF283463)と比べて5'末端および3'末端でそれぞれ24および292bp長い。NgRH1プローブは、EcoRI切断によるhNgRH2−flの切り出しにより作製した。NgRおよびNgRH1に対してそれぞれ得られた1.8kbおよび1.43kb cDNAインサートをゲル精製し(QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAGEN AG, Basel, Switzerland)、各100ngを、High Prime DNAラベリングキット(Roche Biochemicals, Rothkreuz, Switzerland)を用いて3種の異なる標識反応で放射性標識した。組み込まれなかったヌクレオチドはNucTrapプローブ精製カラム(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いて除去した。MTNまたはMTE膜をExpressHyb solution(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)中で、製造業者の説明書にしたがい(ただし、Cot−1 DNAは除外した)、NgRまたはNgRH1プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。ヒトNgRおよびヒトNgRH1に関して、2.4kbに一本のバンドが検出された。
1.)NgR−V5タグクローニング手順:
V5−タグをコードする2つの相補的、合成オリゴヌクレオチド(Microsynth, Balgach, Switzerland)、5'−CCG GTA AGC CTA TCC CTA ACC CTC TCC TCG GTC TCG ATT CTA CGT CTA GAT ATC CTC GAG−3'(配列番号10)および5'−GAG CTC CTA TAG ATC TGC ATC TTA GCT CTG GCT CCT CTC CCA ATC CCT ATC CGA ATG GCC CGA−3'(配列番号11)と制限切断部位XbaI/EcoRV/XhoIをアニーリングし、pSecTag2Bベクター(INVITROGEN, Basel, Switzerland)のSfiI−PmeI部位に連結してpSecTag2−V5を得た。その後、シグナルペプチドを含まないヒトNgRをコードするcDNA配列を、フォワードプライマー5'−GCA GCA TCT AGA CCA GGT GCC TGC GTA TGC TAC AAT GAG CCC−3'(配列番号12)およびリバースプライマー5'−GCA GCA CTC GAG TCA GCA GGG CCC AAG CAC TGT CCA CAG CAC−3'(配列番号13)を用いてpcDNA−Sport6−NgR(上記参照)からPCRにより増幅し、XbaIおよびXhoIで切断し、pSecTag2−V5のそれぞれの切断部位に連結した。
1.)抗体および免疫学的検出
NgRおよびNgRH1タンパク質の検出のため、市販のモノクローナル抗タグ抗体またはウサギで作製したポリクローナル抗血清のいずれかを用いた。ポリクローナル抗血清の作製:ウサギ抗NgR抗血清は、ヒトNgR(EQLDLSDNAQLRSVDPA(配列番号18)、EVPCSLPQRLAGRDLKR(配列番号19)およびGPRRRPGCSRKNRTRS(配列番号20))からの3つの合成ペプチドに対して作製したものをM.Schwab, University of Zurichから入手し、Research Genetics(Invitrogen, Corporation)によりアフィニティー精製した。ウサギNgRH1抗血清は、ヒトNgRH1配列由来の合成ペプチド(CPPAAPTRPGSRARGN(配列番号21)、DLPAEDSRGRQGGDAP(配列番号22)およびTEDDYWGGYGGEDQR(配列番号23))に対して作製し、EUROGENTECS(Seraing, Belgium)によりアフィニティー精製した。
NuPAGEプレキャスト4〜12% Bis−Trisゲル(INVITROGEN, Basel, Switzerland)を用いてSDSゲル電気泳動を行った。通常、分離にはMOPSランニングを用いた。ゲルの電気ブロットはSemiphor Transphor Unit(Amersham Biosciences D bendorff, Switzerland)を用い、24Vで1時間行った。免疫検出のため、このPVDFメンブランをTBST中5%のスキムミルクで45分間ブロッキングした後、それぞれブロッキング液で希釈した一次抗体および二次抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体とともに1時間インキュベートした。各抗体インキュベーション後に、10mM Tris pH7.5、140mM NaClおよび0.2% Tween 20を含むTBSTで3回メンブランを洗浄し、その後TBSで1回洗浄した。シグナルはECLTM ウエスタンブロッティング検出試薬(Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland)およびHyperfilmTM ECLTM(Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland)を用い、製造業者の説明書にしたがって現像した。
コンフルエント状態の細胞を4℃で30分間、1mg/mlのビオチン3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンアミドエステル(スルホ−NHS−ビオチン)を含むPBSでインキュベートし、50mMのグリシンを含むPBSで3回すすぎ、M−PER中で溶解させた。清澄化した溶解液を室温で2時間、アガロースビーズに結合させた20μg/mlのストレプトアビジンとともにインキュベートし、その後ビーズを、SDS−PAGE分析の前に、10mM Tris−HCl pH7.8、1%(w/v)N−ラウロイルサルコシン、100mM NaClで連続的に洗浄した。NgRおよびNgRH1は安定的CHO−K1トランスフェクト体の細胞表面上で容易にビオチニル化されるが、対照タンパク質(GAPDH)はビオチニル化されない。
次の実験対で、我々はインビトロ翻訳後修飾に関して確認を行った。NgRH1のGPI結合はそれらの一次構造から推定されたので、我々は、まず、このことをPI−PLCを用いて実験的に確認した。まず、全細胞抽出液を細菌のホスファチジル−イノシトール−ホスホリパーゼ−C(PI−PLC)の存在下または不存在下でインキュベートした。GPIリンカーを除去すると、SDS−PAGEにおいてタンパク質の移動度が変化する(Cardoso de Almeida et al., (1983) Nature 302, 349-52; Stahl, N. et al, (1987) Cell 51, 229-40; Littlewood, G.M. et al., (1989) Biochem. J. 257, 361-7)。GPIリンカーを有するタンパク質は、一般に、GPIリンカーの脂質鎖との疎水性相互作用のために、SDS分子があると負荷が大きくなる。したがって、正味の電荷は、GPIリンカーが酵素的に除去されたタンパク質に比べると若干負の方向へ傾く。このようにGPIを除去すると、SDS−PAGEにおいて平行レーンに流した非処理対照タンパク質に比べ、個々のタンパク質の特徴的な上方シフトが見られることになる。
1.)ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)処理:
i)インタクト細胞の処理:コンフルエント状態の細胞をOptiMEM中で2回洗浄した後、37℃で4時間、0.2U/ml PI−PLC(GLYKO Inc., Novato, CA)を含む4mlのOptiMEM中でインキュベートした。3000rpmで5分間遠心分離した後、Centricon YM−10(Millipore, Volketswil, Switzerland)で細胞培地を6倍濃縮した。残った細胞をPBSで2回洗浄し、細胞スクレーパーで回収し、5000rpmで1分間遠心分離した。細胞の溶解:細胞ペレットを室温で20分間、CompleteTM(ROCHE Applied Science, Rothkreuz, Switzerland)を補ったM−PER中に溶解させた(100μ/25mg細胞ペレット)。その後、溶解物を14000rpmで10分間遠心分離し、上清に4℃で同バッファーを加えた。同量の溶解液と濃縮培地に対してSDS−PAGE(Invitrogen 4-12% Bistris Gels, MOPSバッファー)を行い、PVDFメンブランにブロットした。PI−PLC処理の後、PI−PLCは、トランスフェクトされたCHO−K1および293T細胞から濃縮培地中へNgRおよびNgRH1を容易に放出するが、このことはそれらがGPI−アンカーを持っていることを示す。
リガンド結合アッセイは受容体の薬理学を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット形式の適用ができる。レセプターhNgRH1の対する精製リガンド(推定されるものとしてはNogoA、NogoB、NogoC、Nogo−66、MAGまたはOMgp)は結合実験のために高い比活性(50〜2000 Ci/mmol)まで放射性標識することができる(あるいは、アルカリホスファターゼ、GST、Myc、His、V5など)のような、リガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)に対する好適な検出タグを用いる)。次に、放射性標識(またはその他のシグナル)のプロセスがそのレセプターに対するリガンドの活性を消失させないかどうかの判定を行ない得る。バッファー、イオン、pHおよびヌクレオチドなどのその他のモジュレーターのアッセイ条件は、膜のソースおよび全細胞レセプターのソース双方に対して働き得るシグナル/ノイズ比を確立し得る。これらのアッセイでは、特異的なレセプター結合は、(全会合放射活性)−(過剰量の非標識競合リガンドの存在下、またはGPIアンカーを欠く過剰量の可溶性NgRH1エクトドメインの存在下で測定した放射活性)で定義できる(Domeniconi et al. (2002) Neuron 35, 283-290 (published online Jun 28), Liu et al. (2002) Science Jun 27 (epub ahead of print)。可能であれば、1またはそれ以上の競合リガンドを用いて残りの非特異的結合を定義してもよい。
ヒトNgRH1を、HEK293細胞、CHO細胞またはCOS細胞などの組換え発現系で発現させ、細胞表面での発現を証明することができる(例えば実施例2d参照)。あるいは、hNgRH1を、上記のような組換え発現系で推定相互効果タンパク質(例えば、Nogo−66またはNogoA、NogoB、NogoC、MAGまたはOMgp)とともに発現させる。cDNA発現構築物の同時トランスフェクションは、例えばEffecteneトランスフェクション剤(Qiagen)を用いて行う。機能の読み取りには細胞接着、細胞萌芽、細胞内cAMPレベルおよび細胞内Ca2+レベルに変化をもたらすアゴニストの分析を含み得る(例えば、NgRH1を安定発現するCHO細胞へのNogo−A、B、C、MAGまたはOMgpの添加、または同時発現による)。
Claims (15)
- (a)配列番号2または配列番号25の配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド;
(b)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド;
(c)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列、および
(d)(a)〜(c)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。 - ポリペプチド配列が配列番号2または配列番号25である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- (a)配列番号1または配列番号24のポリヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド;
(b)配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド;
(d)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1もしくは配列番号24、または少なくとも15ヌクレオチドを有するそれらの断片の配列を有する標識プローブでライブラリーをスクリーニングすることにより得られた少なくとも100ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド;
(e)(a)〜(d)のポリヌクレオチドのRNA同等物であるポリヌクレオチド;または上記ポリヌクレオチドの変異体および断片であるか、もしくは上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的である、上記の単離ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群から選択される、単離ポリヌクレオチド。 - (a)配列番号1または配列番号24のポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチド;
(b)配列番号1または配列番号24の単離ポリヌクレオチド;
(c)配列番号2または配列番号25のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド;および
(d)配列番号2または配列番号25のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項3に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 発現ベクターが適合宿主細胞に存在する場合に請求項1に記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含んでなる発現系。
- 請求項5に記載の発現ベクターまたは請求項1のポリペプチドを発現する膜を含んでなる組換え宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項6に記載の宿主細胞を培養し、そして培養培地からポリペプチドを回収するステップを含んでなる方法。
- 免疫グロブリンFc領域および請求項1に記載のいずれか1種のポリペプチドからなる融合タンパク質。
- 請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
- NgRH1レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であって、
(a)化合物を請求項1に記載のポリペプチドを合し;
(b)レセプターに対する化合物の効果を測定する
ことを含んでなる方法。 - NgRH1レセプターが、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるヒトNgRH1レセプターである、請求項10に記載の方法。
- 配列番号2もしくは配列番号25で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または配列番号2もしくは配列番号25で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片と特異的に結合する精製抗体またはそのフラグメント。
- FabまたはF(ab')2フラグメントである、請求項12に記載の抗体フラグメント。
- ポリクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体。
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