JP2003265188A - チンパンジープロスタグランジンｅ２受容体ｅｐ４サブタイプをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 骨におけるプロスタグランジンの分子的お
よび生化学的作用をさらに理解すると共に、プロスタグ
ランジン受容体に関連するｃＡＭＰの理解を拡大する。 【解決手段】 本発明は、チンパンジーＥＰ４活性を
有する単離タンパク質性分子であって、特定のアミノ酸
配列、または１以上の保存的置換を含む特定のアミノ酸
配列を含む、前記単離タンパク質性分子、前記タンパク
質を分子をコードするＤＮＡ分子、前記ＤＮＡ分子を所
有するベクターおよび細胞、該タンパク質の特異的結合
パートナー、並びにチンパンジーＥＰ４のリガンドを決
定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、チンパンジー（ｃ
ｈｉｍｐａｎｚｅｅ）（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅ
ｓ）組織に見られるものに対応する、チンパンジープロ
スタグランジンＥ ₂受容体ＥＰ４サブタイプ（本明細書
において、チンパンジーＥＰ４またはｃｈＥＰ４）に関
する。他の側面において、本発明は、とりわけ、ｃｈＥ
Ｐ４の構造変異体、ｃｈＥＰ４およびその構造変異体を
コードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含
む発現ベクター、並びに該発現ベクターに形質転換され
た細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロスタグランジンＥ₂（ＰＧＥ₂）は、
多くの組織において、多様な生物学的機能の重要な仲介
因子である。ＰＧＥ₂は、Ｇタンパク質共役受容体のス
ーパーファミリーのメンバーである、４つの細胞表面受
容体（ＥＰ１−ＥＰ４）に、高い親和性で結合する。Ｅ
Ｐ４受容体をコードするｃＤＮＡのいくつかの種からの
クローニングは、７つの潜在的な膜貫通ドメインおよび
長い細胞内カルボキシ末端領域を持つ、非常に保存され
た分子を明らかにした。報告されたＥＰ２受容体でのよ
うに、ＥＰ４受容体は、アデニル酸シクラーゼに機能的
に共役し、活性化に際して、上昇した細胞内環状アデノ
シン５’一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを生じる。ヒトＥ
Ｐ４受容体相補的ＤＮＡは、およそ５３ｋＤａの予測さ
れる分子量を持つ、４８８アミノ酸ポリペプチドをコー
ドする（Ｂａｓｔｉｅｎら、 Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， ２６９：１１８７３−７７（１９９４））。こ
の受容体が、一般的にＥＰ２受容体と称されていた、１
９９５年より前の文献を再検討する際には、注意を払わ
なければならない（Ｎｉｓｈｉｇａｋｉら、 ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．， ３６４：３３９−４１（１９９
５））。ヒト受容体に加え、マウス、ラット、ウサギ、
およびイヌのＥＰ４受容体がクローニングされてきてい
る（Ｂｏｉｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．， ３４０：２２７−４１（１９９７）；Ｂｒｅｙ
ｅｒら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７
０：Ｆ４８５−９３（１９９６）；Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ
ら， ＦＥＢＳＬｅｔｔ．， ３６４：３３９−４１
（１９９５）；Ｂａｓｔｉｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６９：１１８７３−７７（１９９
４）；Ａｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９７：２６３−７０（１
９９３）；Ｈｏｎｄａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， ２６８：７７５９−６２（１９９３）；Ｃａｓ
ｔｌｅｂｅｒｒｙら， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ
ｓ， ６５：１６７−１８７（２００１））。ＥＰ４受
容体は、ＥＰ１およびＥＰ３受容体とは、サルプロスト
ン（ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ）に対する非感受性によっ
て、そしてＥＰ２受容体とは、ブタプロスト（ｂｕｔａ
ｐｒｏｓｔ）に対する非感受性によって（Ｋｉｒｉｙａ
ｍａら， Ｂｒ．Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １２
２：２１７−２４（１９９７）；Ｂｏｉｅら， Ｅｕ
ｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ３４０：２２７
−４１（１９９７））、そしてプロスタグランジンＥ₁
−ＯＨ（ｌｄ）による比較的選択的な活性化によって、
薬理学的に区別することが可能である。

【０００３】プロスタグランジンは、大部分の哺乳動物
組織において、非常に多様な生理学的効果を発揮する、
広く分布する脂肪酸代謝産物の群である。これらの分子
は、化学的に不安定であるか、または非常に迅速に代謝
されるかいずれかであり、そしてしたがって、主に、そ
の合成部位に近い、局所生理学的事象に影響を及ぼすと
考えられる。プロスタグランジンＥ₂（ＰＧＥ₂）は、シ
クロオキシゲナーゼおよびＰＧＥシンターゼの作用を通
じて、アラキドン酸から形成される。骨を含む多様な組
織に対するＰＧＥ₂の生物学的作用は、アゴニストおよ
びアンタゴニストへの反応に基づいて、ＥＰ１、ＥＰ
２、ＥＰ３、およびＥＰ４と称される、少なくとも４つ
の薬理学的に別個のＧタンパク質共役細胞表面受容体を
通じて、仲介される。ＥＰ１受容体の活性化は、ホスホ
リパーゼＣを介して増加した細胞内カルシウムレベルを
生じ、一方、ＥＰ３活性化は、アデニル酸シクラーゼの
阻害のため、減少した細胞内ｃＡＭＰを生じる。ＥＰ２
およびＥＰ４受容体は、アデニル酸シクラーゼを刺激
し、上昇したレベルの細胞内ｃＡＭＰを導く。過去数年
に渡る、多様なヒト、マウス、ラット、イヌ、およびウ
サギＥＰ受容体サブタイプのクローニングは、ＰＧＥ₂
作用機構のよりよい理解を導いてきた。

【０００４】プロスタグランジンは、骨形成および骨吸
収両方を制御することによって、骨代謝に役割を果た
す。器官培養中の骨形成の刺激は、骨芽細胞前駆体の複
製および分化両方の増加によるようである（Ｇｒｏｎｏ
ｗｉｃｚら， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２１
２：３１４−２０（１９９４）、ＲａｉｓｚおよびＦａ
ｌｌ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １２６：１６
５４−５９（１９９０））。骨におけるＰＧＥ₂の同化
作用は、機械的な力、サイトカイン、増殖因子、合成ホ
ルモン、およびプロスタグランジン自体に反応した、Ｐ
ＧＥ₂の局所オートクリンまたはパラクリン産生の結果
として生じると考えられ（Ｒａｉｓｚ，Ｊ． Ｎｕｔ
ｒ．， １２５：２０２４Ｓ−２０２７Ｓ（１９９
５））、そしてＥＰ２またはＥＰ４受容体サブタイプい
ずれかに関係する、ｃＡＭＰの増加したレベルに関連付
けられている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】骨におけるプロスタグ
ランジンの分子的および生化学的作用をさらに理解する
と共に、プロスタグランジン受容体に関連するｃＡＭＰ
の理解を拡大するため、我々は、チンパンジーＥＰ４受
容体をクローニングし、発現させ、そして性質決定し
た。このチンパンジーＥＰ４受容体は、リガンド結合お
よび活性化に関して、ヒト、マウス、ウサギ、イヌ、お
よびラット由来の先に報告されたＥＰ４受容体と共通の
機能的特性を有する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の発明者による研
究以前には、チンパンジーからｃｈＥＰ４活性を有する
因子を単離することに関する研究は報告されていなかっ
た。本発明の発明者が本発明を達成するのに成功するま
でに、いくつかの潜在的な困難を乗り越える必要があっ
た。第一に、上述のように、５つの他の種からＥＰ４タ
ンパク質が単離されてきたが、既知のＥＰ４物質とチン
パンジー由来のものの間に、どの程度の相同性があるの
か、不明確であった。したがって、他の種に関連するＥ
Ｐ４タンパク質に基づくプライマーが、チンパンジーか
ら物質を単離する際に有用であるかどうか、不明確であ
った。第二に、チンパンジー組織が、チンパンジーＥＰ
４のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を十分な量、産
生するかどうか、不明確であった。

【０００７】上述の不明確性および他の困難にもかかわ
らず、本発明の発明者は、チンパンジーにおいて、ｃｈ
ＥＰ４活性を有するタンパク質に対応する全長ｃＤＮＡ
配列を単離するのに成功した。この発見は、本発明の基
礎を確立した。

【０００８】チンパンジーＥＰ４のタンパク質コード領
域は、１４７０ｂｐのオープンリーディングフレーム内
に含まれ、そして予測される分子量５３．４ｋＤの、４
９０アミノ酸のタンパク質をコードする。このオープン
リーディングフレームの配列解析によって、ヌクレオチ
ドおよびタンパク質配列を両方比較すると、ヒトＥＰ４
ｃＤＮＡタンパク質コード領域に、＞９９％同一であ
ることが明らかになる。チンパンジーＥＰ４をＣＨＯ−
Ｋ１細胞に一過性にトランスフェクションした後、リガ
ンドとして³Ｈ−ＰＧＥ₂を用いた競合的結合研究によっ
て、ＰＧＥ₂および７−［２−（３−ヒドロキシ−４−
フェニル−ブチル）−５−オキソ−ピロリジン−１−イ
ル］−ヘプタン酸（ＥＰ４特異的リガンド、以後、ＥＰ
４ＳＬと称される）による特異的置換が立証され、それ
ぞれのＩＣ５０値は、２．５ｎＭおよび３００ｎＭであ
った。ＰＧＥ₂またはＥＰ４ＳＬでの処理はまた、ＥＰ
４トランスフェクション細胞において、それぞれ、８．
９ｎＭおよび５６０ｎＭのＥＣ５０値で、増加したレベ
ルのｃＡＭＰも生じたが、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞では生じ
なかった。対照的に、ＥＰ２選択的リガンド、ブタプロ
スト、およびＥＰ１／ＥＰ３選択的リガンド、サルプロ
ストンは、この受容体に結合しなかった。

【０００９】このように、報告されたヒトＰＧＥ₂受容
体ＥＰ４サブタイプに非常に相同なＤＮＡおよび予測さ
れるタンパク質配列を持つ、オープンリーディングフレ
ームをコードする、チンパンジーｃＤＮＡが単離され
た。チンパンジーＥＰ４ ｃＤＮＡをＣＨＯ−Ｋ１細胞
において発現させると、コードされるタンパク質は、Ｅ
Ｐ４サブタイプに特徴的なリガンド結合特性を示し、そ
して適切なリガンドによって活性化されると、この受容
体は、細胞内ｃＡＭＰの集積を引き起こす。

【００１０】本発明はいくつかの側面を有する。第一の
側面において、本発明は、ｃｈＥＰ４の活性を有し、そ
して配列番号２に対応するアミノ酸配列を含む、単離タ
ンパク質性分子に関する。

【００１１】別の側面において、本発明は、上述のタン
パク質性分子をコードする単離ＤＮＡ分子に関する（例
えば配列番号１を参照されたい）。本発明の他の側面
は、列挙されるポリヌクレオチド分子を、適切な宿主細
胞に移すことが可能な組換え発現ベクター、およびこれ
らの発現ベクターに形質転換された細胞に関する。

【００１２】別の側面において、本発明は、組換え手段
によって、列挙されるタンパク質性分子を産生する方法
に関する。本発明のさらなる側面において、本発明は、
列挙されるタンパク質性分子を含む、薬剤組成物に関す
る。

【００１３】さらに別の側面において、本発明は、列挙
されるタンパク質性分子に対する特異的結合パートナー
に関する。さらに別の側面において、本発明は、チンパ
ンジーＥＰ４のリガンドを決定する方法に関する。

【００１４】本発明の上述の側面は、チンパンジーＥＰ
４活性を有するタンパク質性分子の大量産生を可能にす
る。本明細書において、以下により詳細に記載されるよ
うに、こうした分子を用いて、例えば、獣医学的目的の
ため、チンパンジーを処置することが可能であることが
意図される。

【００１５】

【発明の実施の形態】逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）戦略を用いて、チンパンジー末梢血
ＲＮＡからｃｈＥＰ４をクローニングした。この戦略
は、逆転写に、ランダム六量体およびオリゴ−ｄＴプラ
イマー両方を使用し、そしてＰＣＲ期に、ヒト、ラッ
ト、マウス、イヌ、およびウサギＥＰ４受容体タンパク
質コード領域をコードするＤＮＡ配列に基づいて設計さ
れた縮重プライマーを使用した。この結果、予測される
分子量５３，４６３ダルトンで、４９０アミノ酸のタン
パク質をコードすることが可能な、１４７０ｂｐのオー
プンリーディングフレームをクローニングした（配列番
号２を参照されたい）。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔ
ｌｅの方法（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−３２
（１９８３））による、予測されるタンパク質の解析
は、７つの疎水性配列の存在を示し、これは、Ｇタンパ
ク質共役受容体のこのファミリーに典型的な７つの膜貫
通ドメインの存在と一致した。

【００１６】チンパンジーＥＰ４オープンリーディング
フレームのｃＤＮＡおよび予測されるタンパク質配列
の、ヒトＥＰ４に関して報告されたものとの比較によ
り、ＤＮＡレベルで＞９７％の同一性が（図３）、そし
てタンパク質レベルで＞９９％の同一性が明らかになっ
た（図２）。全ＥＰ４配列がチンパンジーおよびヒトＥ
Ｐ４間で非常に保存されており、一方、７つの推定上の
膜貫通ドメインは、２種間で同一である。細胞膜に埋め
られていると予測される、保存されたアミノ酸は、プロ
スタグランジン受容体および他のＧタンパク質共役受容
体両方に関し、小分子量リガンドとのリガンド結合に重
要な役割を有すると示されてきている。Ｎ末端細胞外ド
メイン中のＡｓｎ７、および第二の細胞外ループ中のＡ
ｓｎ１７７の２つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位
が、予測されるチンパンジーＥＰ４配列に存在し、そし
て報告されたヒトＥＰ４配列で保存されている。マウス
ＥＰ３受容体のＮ末端ドメインおよび第二の細胞外ルー
プ中の残基のＮ結合グリコシル化は、リガンド結合の親
和性および特異性に影響を及ぼすことが示されてきてい
る（ＨｕａｎｇおよびＴａｉ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎ
ｄｉｎｓ， Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ， ａｎｄ Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ， ５９：
２６５−７１（１９９８））。ＥＰ４受容体は、糖タン
パク質であるとまだ立証されてはいないが、β２−アド
レナリン作動性受容体のＮ末端ドメインのグリコシル化
は、細胞表面への受容体の標的化に影響を及ぼすことが
示されてきている（Ｓａｖａｒｅｓｅら， Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｊ．， ２８３：１−１９（１９９２））。

【００１７】チンパンジーＥＰ４の細胞外ループ２にお
ける７アミノ酸配列（ＰＧ／ＤＴＷＣＦＩ）は、ヒト、
マウス、ラット、イヌ、およびウサギの報告されたＰＧ
Ｅ₂受容体（ＥＰ１−ＥＰ４）すべてに存在する。これ
は、リガンド認識における配列ＰＧ／ＤＴＷＣＦＩの基
本的な役割を示唆する。例えば、ウサギＥＰ３受容体の
この領域の突然変異解析は、この配列におけるプロリ
ン、トリプトファン、またはスレオニン残基の置換が、
劇的に改変されたリガンド特異性を生じることを示す
（ＡｕｄｏｌｙおよびＢｒｅｙｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，２７２：１３４７５−７８（１９９
７））。また、非常に保存されているわけではないが、
ＥＰ２およびＥＰ４プロスタグランジン受容体のＮ末端
ドメインの残基が、リガンド特異性の決定において、同
様の機能的役割を有することが示されている（Ｓｔｉｌ
ｌｍａｎら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ．， ５６：５４
５−５１（１９９９））。

【００１８】予測されるチンパンジーおよびヒトＥＰ４
タンパク質配列間で、やはり保存されるのは、位４５
（細胞内ループ１）、２６１（細胞内ループ３）および
３５６、３６６、４３２、４６２、および４８８（Ｃ末
端細胞内ドメイン）のセリン残基である。さらに、Ｃ末
端細胞内ドメインの位４３５のスレオニン残基は、チン
パンジーおよびヒトＥＰ４両方で保存されている。これ
らのセリンおよびスレオニン残基は、プロテインキナー
ゼＣによるリン酸化の潜在的な部位であり、そしてま
た、チンパンジーおよびヒトＥＰ４受容体間でも保存さ
れている。β２−アドレナリン作動性受容体のＣ末端ド
メインのセリンおよびスレオニン残基のリン酸化は、受
容体脱感作の調節に関与していると考えられるため、こ
れらの６つの残基は、チンパンジーＥＰ４受容体に見ら
れる脱感作に関与している可能性がある（Ｉｎｇｌｅｓ
ｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８：２
３７３５−３８（１９９３））。

【００１９】この推定上のチンパンジーＥＰ４受容体の
結合およびシグナル伝達特性を試験するため、全オープ
ンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を、ＣＨＯ−
Ｋ１細胞に一過性にトランスフェクションした。この受
容体のリガンド結合特異性を図４に例示する。³Ｈ−Ｐ
ＧＥ₂結合は、ＰＧＥ₂（ＩＣ₅₀ ２．５ｎＭ）およびＥ
Ｐ４ＳＬ（ＩＣ₅₀ ３００ｎＭ）に置換された。対照的
に、関連するプロスタノイド受容体ＥＰ１／ＥＰ３（サ
ルプロストン）およびＥＰ２（ブタプロスト）に選択的
なリガンドは、このＥＰ４受容体に結合しなかった。非
トランスフェクション細胞への特異的結合はなかった。

【００２０】ｃＡＭＰ集積によって、チンパンジーＥＰ
４を発現しているＣＨＯ細胞における二次シグナル伝達
を測定した。チンパンジーＥＰ４で一過性にトランスフ
ェクションしたＣＨＯ細胞を、２ｍＭ ＩＢＭＸの存在
下、多様な濃度のＰＧＥ₂で１２分間処理した。細胞内
ｃＡＭＰの集積は、商業的に入手可能なシンチレーショ
ン近接アッセイ（ＳＰＡ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、
イリノイ州アーリントンハイツ）の使用によって、処理
期間の終了時に測定した。ＰＧＥ₂処理後のｃＡＭＰ集
積のＥＣ₅₀は、８．９ｎＭであり、そしてＥＰ４選択的
リガンドＥＰ４ＳＬでの処理後のＥＣ₅₀は、５６０ｎＭ
であった（図５）。

【００２１】定義 「タンパク質性分子」は、一般的に、複数のアミノ酸で
構成されたいかなる分子も含む。この用語は十分に広
く、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含
む。典型的には、タンパク質性物質中のアミノ酸は、２
０の天然存在アミノ酸から選択されるであろう。しか
し、アミノ酸類似体および誘導体もまた、タンパク質性
分子に含まれる可能性がある。タンパク質性分子は、通
常、天然存在ｃｈＥＰ４に含まれるのとほぼ同数のアミ
ノ酸（すなわち約４９０アミノ酸）で構成されるであろ
う。しかし、さらに、タンパク質性分子は、該分子がｃ
ｈＥＰ４の活性を保持する限り、より多いかまたはより
少ない数のアミノ酸を有する可能性がある。この活性
は、天然タンパク質の活性と量的に同一である必要はな
く、そしてｃｈＥＰ４活性のアッセイ（以下を参照され
たい）によって測定可能である限り、その活性より高い
かまたは低くてもよい。好ましくは、こうした分子は、
天然存在ｃｈＥＰ４の活性の少なくとも約５０％を所持
するであろう。ある宿主では、組換えｃｈＥＰ４の発現
は、Ｎ末端メチオニン残基を有するタンパク質を生じる
であろう。Ｎ末端にこうした残基を含むアミノ酸配列も
また、本発明の範囲内である。

【００２２】「保存的置換」によって、活性または発現
にほとんどまたはまったく影響を持たないと期待され
る、タンパク質性分子中のアミノ酸の置換、付加、また
は欠失を意味する。例えば、タンパク質性分子の膜貫通
領域における、１つの疎水性アミノ酸の別のものでの置
換は、その活性にいかなる有意な影響も持つことはまれ
であろう。他の保存的置換が、本開示に照らし、当業者
に公知であろう。

【００２３】「ｃｈＥＰ４の活性」によって、ｉｎ ｖ
ｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのｃｈＥＰ４アッセイに
より測定可能ないかなる活性も意味する。定性的には、
この活性は、一般的に、天然存在ｃｈＥＰ４タンパク質
が所持するものであろう。ｃｈＥＰ４タンパク質を発現
するかまたは発現すると考えられる細胞は、ｃｈＥＰ４
受容体活性レベルおよびｃｈＥＰ４タンパク質レベル両
方に関してアッセイすることが可能である。ｃｈＥＰ４
受容体活性の評価は、好ましくは、標識したリガンドを
細胞に直接導入し、そしてｃｈＥＰ４発現細胞へのリガ
ンドの特異的結合の量を測定することを伴う。受容体活
性に関する結合アッセイが、当該技術分野に知られる
（Ｓａｎｄｏら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， ２００：１３２９−１
３３３（１９９４））。宿主細胞におけるｃｈＥＰ４タ
ンパク質のレベルは、限定されるわけではないが、免疫
アフィニティーおよび／またはリガンドアフィニティー
技術を含む、多様な技術によって、定量化することが可
能である。ｃｈＥＰ４特異的アフィニティービーズまた
はｃｈＥＰ４特異的抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニン標
識または非標識ｃｈＥＰ４タンパク質を単離することが
可能である。標識ｃｈＥＰ４タンパク質は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって解析可能である。非標識ｃｈＥＰ４タン
パク質は、ｃｈＥＰ４特異的抗体を使用した、ウェスタ
ンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡアッセイ
によって、検出可能である。

【００２４】「単離」によって、物質がその天然存在環
境から除去されていることを意味する。好ましい形で、
「単離」は、物質が、通常存在する不純物または他の分
子、特に他のタンパク質性分子、塩、他の細胞構成要
素、およびそれらに匹敵するものを、実質的に含まない
ことを意味する。単離は、典型的には、ヌクレオチド、
ペプチド、および／またはタンパク質精製または合成の
技術分野で標準的な方法によって、行うことが可能であ
る。宿主細胞におけるｃｈＥＰ４の発現後、ｃｈＥＰ４
タンパク質を回収し、ｃｈＥＰ４特異的リガンドに結合
可能な、活性型のｃｈＥＰ４を提供することが可能であ
る。いくつかのｃｈＥＰ４精製法が利用可能であり、そ
して使用に適している。組換えｃｈＥＰ４は、細胞溶解
物および抽出物から、または馴化培地から、塩分画、イ
オン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィ
ー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの多様な
組み合わせ、または個々の適用によって、精製すること
が可能である。さらに、組換えｃｈＥＰ４は、全長新生
ｃｈＥＰ４またはｃｈＥＰ４のポリペプチド断片に特異
的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体で作成さ
れた免疫アフィニティーカラムの使用によって、他の細
胞タンパク質から分離することが可能である。

【００２５】「ポリヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ含有分子両方を含む。ＤＮＡ分子は、好ましく
は、イントロン不含配列（すなわちｃＤＮＡ）であろう
が、特定の宿主での発現を促進するかまたは増加させる
ため、エンハンサー配列、終結配列、およびそれらに匹
敵するものを含んでもよい。

【００２６】「組換え発現ベクター」によって、移され
た配列の発現のため、該ベクターに含まれるポリヌクレ
オチド配列を、宿主生物の細胞内に移すことが可能なベ
クター（例えばプラスミドまたはλファージ）を意味す
る。配列は、その発現を達成するかまたは調節すること
が可能な他の配列に、機能可能であるように連結され
る。こうした発現ベクターは、好ましくは、宿主生物中
で複製可能である。例えば、そこに配置された明記され
るＤＮＡ配列の発現を達成することが可能ないかなるＤ
ＮＡ配列も、該配列が明記される配列に適用される際、
この用語に含まれる。

【００２７】上述のベクターによって形質転換すること
が可能な「細胞」は、ベクターによって移されているポ
リヌクレオチド配列を発現することが可能なものであ
る。こうした細胞の培養条件は、組換えタンパク質産生
の技術分野で標準的なものであってもよい。

【００２８】「特異的結合パートナー」は、分子レベル
で、本明細書に記載されるタンパク質性またはポリヌク
レオチド分子を認識し、そして該分子と相互作用するこ
とが可能な分子である。この用語に含まれるのは、ハイ
ブリドーマまたはｒＤＮＡ技術によって産生されたので
あれ、抗体分子、抗体の抗原結合断片（例えばＦａｂお
よびＦ（ａｂ’）₂断片）、一本鎖抗原結合分子、およ
びそれらに匹敵するものなどの、免疫学的結合パートナ
ーである。他のタンパク質性または非タンパク質性結合
パートナーもまた、この広い用語に含まれる。

【００２９】タンパク質性分子 本発明のタンパク質性分子は、ここで、より詳細に記載
されるであろう。配列番号２は、４９０アミノ酸を有す
る、天然存在チンパンジーペプチドに対応する。

【００３０】本明細書に提供されるｃｈＥＰ４タンパク
質のファミリーはまた、上に列挙されるアミノ酸配列中
の１以上のアミノ酸が、欠失するか、修飾されるか、ま
たは別のアミノ酸に変えられている、タンパク質性分子
も含む。部位特異的突然変異誘発は、１つのアミノ酸の
別のものへの変換を可能にする、好ましい技術である。
例えば、１以上のシステイン残基を、セリンなどの別の
アミノ酸に変えることが可能である。こうした変化の１
つのありうる理由は、１以上の望ましくないジスルフィ
ド結合を除去することであろう。例えば米国特許第４，
５１８，５８４号を参照されたい。

【００３１】天然アミノ酸配列における他の意図される
特定の変化は、アスパラギングリコシル化部位の修飾を
伴う。連続する２つのアミノ酸（配列番号２におけるア
スパラギンおよびセリン）の１つまたは両方のアスパラ
ギンの修飾は、修飾部位でのグリコシル化を除去するこ
とが可能である。したがって、例えば、アスパラギンを
グルタミンに変化させ、それにより、その部位でのグリ
コシル化を除去することが可能である。例えばＭｉｙａ
ｊｉｍａら， ＥＭＢＯ Ｊ．， ５（６）：１９９３
（１９８６）を参照されたい。

【００３２】最適レベルの受容体活性および／またはｃ
ｈＥＰ４タンパク質を生じるｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡ配列
（類）を決定するため、限定されるわけではないが、以
下を含むｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡ分子を構築してもよい：
ｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレ
ームおよび受容体タンパク質の特定のドメインのみまた
は該タンパク質の再編成ドメインをコードするｃＤＮＡ
の部分を含む多様な構築物。すべての構築物は、ｃｈＥ
Ｐ４ ｃＤＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を
まったく含まないか、すべて含むか、または一部含むよ
う、設計することが可能である。ｃｈＥＰ４活性および
タンパク質発現レベルは、適切な宿主細胞へのこれらの
構築物の単一のまたは組み合わせた導入後に、測定する
ことが可能である。一過性アッセイで、最適発現を生じ
るｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡカセットの決定を行った後、こ
のｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡ構築物を、限定されるわけでは
ないが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細
胞、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、および酵母細胞用のも
のを含む、多様な発現ベクター（組換えウイルスを含
む）に移す。

【００３３】本発明の一部を形成する、上述のアミノ酸
配列の修飾は、チンパンジーＥＰ４の活性を有するタン
パク質性分子を生じるものである。こうした活性は、本
明細書に記載されるアッセイ、あるいは現在知られるか
またはこれから開発される同等のアッセイを用いて決定
することが可能である。本発明のタンパク質性分子のフ
ァミリーはまた、一般的に、配列番号２に非常に相同で
あろうし、これは、各配列中のいくつかのアミノ酸が欠
失されるか、修飾されるか、または変えられている可能
性があることを意味する（生じたタンパク質性物質が、
チンパンジーＥＰ４と共通の活性を少なくともある程度
保持すると仮定する）。

【００３４】本発明のタンパク質性分子は、さらに、検
出可能マーカー物質への付着によって標識（例えば¹²⁵
Ｉで放射標識）し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉ
ｖｏで有用な試薬を提供することが可能である。

【００３５】ポリヌクレオチド配列 本発明はまた、ポリヌクレオチド配列にも関する。好ま
しいポリヌクレオチド配列は、上述の、本発明のタンパ
ク質性分子をコードするＤＮＡ分子である。好ましいＤ
ＮＡ配列（配列番号１）は、本明細書の図１に示される
ものである。図１のｃＤＮＡは、本明細書に、より詳細
に記載される。

【００３６】１より多いＤＮＡ配列が、遺伝暗号の縮重
のため、同一のアミノ酸配列をコードすることが可能で
あることが、認識されるものとする。すべてのこうした
配列は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列に
含まれる。

【００３７】図１のｃＤＮＡを得るのに現在好ましい方
法は、以下の実施例項に記載される。しかし、多様な代
替法のいずれを用いて、ｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡをクロー
ニングしてもよい。これらの方法には、限定されるわけ
ではないが、適切な発現ベクター系におけるｃｈＥＰ４
含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後のｃｈＥＰ４ ｃＤ
ＮＡの直接機能的発現が含まれる。別の方法は、ｃｈＥ
Ｐ４タンパク質のアミノ酸配列から設計される標識オリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージ
またはプラスミドシャトルベクター内に構築されたｃｈ
ＥＰ４含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことである。好ましい方法は、ｃｈＥＰ４タンパク質を
コードする部分的ｃＤＮＡを用いて、バクテリオファー
ジまたはプラスミドシャトルベクター内に構築されたｃ
ｈＥＰ４含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることからなる。この部分的ｃＤＮＡは、プロスタグラ
ンジンｃｈＥＰ４受容体に関連する、他のＧタンパク質
共役受容体に関して知られるアミノ酸配列由来の縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーの設計を通じて、ｃｈＥＰ
４ ＤＮＡ断片を特異的にＰＣＲ増幅することによっ
て、得られる。

【００３８】本開示に照らし、当業者には、他の種類の
ライブラリーと共に、他の細胞または細胞種から構築さ
れたライブラリーが、ｃｈＥＰ４をコードするＤＮＡを
単離するのに有用である可能性があることが、容易に明
らかであろう。他の種類のライブラリーには、限定され
るわけではないが、チンパンジー腎臓細胞以外の他の細
胞または細胞株由来のｃＤＮＡライブラリー、およびゲ
ノムＤＮＡライブラリーが含まれる。

【００３９】本開示に照らし、当業者には、ｃｈＥＰ４
活性を有する細胞または細胞株から、適切なｃＤＮＡラ
イブラリーを調製可能であることが、容易に明らかであ
ろう。ｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡを単離するｃＤＮＡライブ
ラリーを調製する際に使用するための細胞または細胞株
の選択は、まず、本明細書に引用される標識リガンド結
合アッセイを用いて、細胞関連ｃｈＥＰ４活性を測定す
ることによって、行うことが可能である。

【００４０】ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術
分野に公知の標準的な技術によって、行うことが可能で
ある。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、１９８２）に見出すことが可能である。

【００４１】また、本開示に照らし、当業者には、ｃｈ
ＥＰ４をコードするＤＮＡを、適切なゲノムＤＮＡライ
ブラリーから単離することもまた可能であることも、容
易に明らかであろう。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
は、当該技術分野に公知の標準的技術によって、行うこ
とが可能である。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築
技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、１９８２）に見出すことが可能である。

【００４２】好ましい方法の１つによって、ｃｈＥＰ４
遺伝子をクローニングするためには、ｃｈＥＰ４または
相同タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列が必要
である。これを達成するため、ｃｈＥＰ４タンパク質ま
たは相同タンパク質を精製し、そして自動化配列決定装
置によって、部分的アミノ酸配列を決定してもよい。全
アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的ｃｈＥＰ
４ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のため、６から８アミノ酸
の２つの領域の直線配列を決定してもよい。

【００４３】適切なアミノ酸配列が同定されたら、それ
をコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝
暗号が縮重しているため、特定のアミノ酸をコードする
のに、１より多いコドンが用いられる可能性があり、そ
してしたがって、アミノ酸配列は、同様のＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの組のいずれによって、コードされること
も可能である。組の１つのメンバーのみが、ｃｈＥＰ４
配列に同一であろうが、組の他のものが、ミスマッチを
含んでいても、ｃｈＥＰ４ ＤＮＡにハイブリダイズ可
能である可能性がある。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレ
オチドは、それでも十分にｃｈＥＰ４ ＤＮＡにハイブ
リダイズし、ｃｈＥＰ４をコードするＤＮＡの同定およ
び単離を可能にする可能性がある。

【００４４】好ましい方法の１つを用いて、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術およびｃＤＮＡライ
ブラリースクリーニングを使用する２段階アプローチ
で、ｃｈＥＰ４をコードするｃＤＮＡクローンを単離す
る。第一の段階では、精製ｃｈＥＰ４または相同タンパ
ク質由来のＮＨ₂末端および内部アミノ酸配列情報を用
いて、ｃｈＥＰ４特異的ＤＮＡ断片の増幅用の縮重オリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計する。第二の段階で
は、これらの断片をクローニングし、チンパンジー腎臓
細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡを単
離するためのプローブとして利用する。

【００４５】本発明のポリヌクレオチド産物は、検出可
能マーカー（放射標識およびビオチンなどの非同位体標
識など）で標識し、そして例えばＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法で使用し、染色体マップにおけるチンパンジ
ー遺伝子位および／またはいずれかの関連遺伝子ファミ
リーの位を位置決定することが可能である。これらはま
た、ＤＮＡレベルでチンパンジー遺伝子障害を同定する
のに用い、そして隣接遺伝子およびそれらの障害を同定
する遺伝子マーカーとして用いることも可能である。

【００４６】発現ベクター、宿主、および組換え法 本明細書に記載される方法を通じて得られるクローニン
グしたｃｈＥＰ４ ｃＤＮＡは、適切なプロモーターお
よび他の適切な転写制御要素を含む発現ベクター内に分
子クローニングし、そして原核または真核宿主細胞に移
して、組換えｃｈＥＰ４を産生させることによって、組
換え的に発現させることが可能である。こうした操作の
ための技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記に記載される
のを見出すことが可能であり、そして本開示に照らし、
当該技術分野に公知である。

【００４７】発現ベクターは、本明細書において、適切
な宿主における、クローニングしたＤＮＡの転写および
そのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。
こうしたベクターを用いて、細菌、ラン藻類、植物細
胞、昆虫細胞、および動物細胞などの多様な宿主で、真
核ＤＮＡを発現させることが可能である。

【００４８】特別に設計されたベクターは、細菌−酵母
または細菌−動物細胞など、宿主間で、ＤＮＡの往復を
可能にする。適切に構築された発現ベクターは、好まし
くは：宿主細胞における自律複製のための複製起点、選
択可能マーカー、限定される数の有用な制限酵素部位、
高コピー数の可能性、および活性プロモーターを含む。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合さ
せ、そしてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義さ
れる。強いプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡの開始を
引き起こすものである。発現ベクターには、限定される
わけではないが、クローニングベクター、修飾クローニ
ングベクター、特別に設計されたプラスミド、またはウ
イルスが含まれる可能性がある。

【００４９】多様な哺乳動物発現ベクターを用いて、哺
乳動物細胞において、組換えｃｈＥＰ４を発現させるこ
とが可能である。組換えｃｈＥＰ４発現に適している可
能性がある、商業的にまたは別の方式で入手可能な哺乳
動物発現ベクターには、限定されるわけではないが、ｐ
ＭＣＩｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア
州ラホヤ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳ
Ｇ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤ
ＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア
州カールスバッド）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴ
ＣＣ ３７５９３、バージニア州マナサス）、ｐＢＰＶ
−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ
−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２
４）、ｐＲＳ−Ｖｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐ
ＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴ
ＣＣ ３７４６０）、およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３
７５６５）が含まれる。

【００５０】ｃｈＥＰ４をコードするＤＮＡはまた、宿
主細胞で発現させるため、発現ベクターにクローニング
してもよい。宿主細胞は、限定されるわけではないが、
細菌、酵母、限定されるわけではないが、ヒト、ウシ、
ブタ、サル、およびげっ歯類起源の細胞株を含む、哺乳
動物細胞、並びに限定されるわけではないが、ショウジ
ョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来細胞株を含む、
昆虫細胞を含む、原核または真核細胞であってもよい。
適切である可能性があり、そして商業的にまたは別の方
式で入手可能な、哺乳動物種由来の細胞株には、限定さ
れるわけではないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７
０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯ
Ｓ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−ＫＩ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ ９２）、ＮＩＨｉ３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７
Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １７１）が含まれる。

【００５１】発現ベクターは、限定されるわけではない
が、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト
融合、およびエレクトロポレーションを含む、いくつか
の技術のいずれか１つを介して、宿主細胞に導入するこ
とが可能である。発現ベクター含有細胞を個々に解析
し、これらがｃｈＥＰ４タンパク質を産生するかどうか
決定する。ｃｈＥＰ４発現細胞の同定は、限定されるわ
けではないが、抗ｃｈＥＰ４抗体との免疫学的反応性、
および宿主細胞関連ｃｈＥＰ４活性の存在を含む、いく
つかの手段によって、行うことが可能である。

【００５２】また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生された合成ｍ
ＲＮＡを用いても、ｃｈＥＰ４ ＤＮＡの発現を行うこ
とが可能である。合成ｍＲＮＡは、限定されるわけでは
ないが、コムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を含
む、多様な細胞不含系で効率的に翻訳させると共に、限
定されるわけではないが、カエル卵母細胞へのマイクロ
インジェクションを含む、細胞に基づく系で効率的に翻
訳させることが可能であり、カエル卵母細胞へのマイク
ロインジェクションが好ましい。

【００５３】一般の当業者に知られる多様な原核細胞を
利用することが可能である。いくつかの典型的な原核生
物には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）の多様な株が含まれる。

【００５４】細菌に加え、酵母などの真核微生物もま
た、宿主として用いることが可能である。サッカロミセ
ス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の実験室株が最も一般的に用いられ
る。

【００５５】多細胞生物由来の真核宿主細胞培養におい
て、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
もまた、可能である。有用な宿主細胞株には、Ｖｅｒ
ｏ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、およびチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。こうした細胞の発現ベ
クターは、通常、例えば、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉ
ａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）由来の一般的に
用いられる初期および後期プロモーター、あるいはポリ
オーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、
トリ肉腫ウイルス由来のものなどの他のウイルスプロモ
ーター、免疫グロブリンプロモーター、および熱ショッ
クプロモーターなどの、哺乳動物細胞に適合するプロモ
ーターおよび調節配列を含む。エンハンサー領域もま
た、望ましいように含んでもよい。

【００５６】宿主、ベクター、エンハンサー、プロモー
ターなどの他の例は、以下の典型的な米国特許第４，８
１０，６４３号；第４，７６６，０７５号；および第
４，８４７，２０１号に見出すことが可能であり、これ
らは各々、本明細書に援用される。

【００５７】特異的結合パートナー 本発明のタンパク質性分子およびポリヌクレオチドに向
けられる特異的結合パートナーは、当業者に知られるい
かなる標準的技術によって、生成することも可能であ
る。好ましい特異的結合パートナーは、損なわれていな
い（ｉｎｔａｃｔ）抗体およびその断片などの免疫学的
結合パートナーである。免疫学的結合パートナーは、好
ましくは、モノクローナル抗体産生の標準的技術によっ
て調製される、特定の抗原に向けられるモノクローナル
抗体である。

【００５８】これらの特異的結合パートナーは、例え
ば、本発明のタンパク質性物質またはポリヌクレオチド
を精製するのに利用することが可能である。標識型の特
異的結合パートナーを利用して、本発明のタンパク質性
分子またはポリヌクレオチドの存在を示すことが可能で
ある。１つの好ましい態様において、本発明のポリヌク
レオチドの特異的結合パートナーは、標識型で利用し、
染色体上の天然遺伝子を位置決定することが可能であ
る。

【００５９】ｃｈＥＰ４に対する単一特異性抗体は、ｃ
ｈＥＰ４に対して反応性である抗体を含む哺乳動物抗血
清から精製するか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓ
ｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７
（１９７５）の技術を用いて、ｃｈＥＰ４と反応性であ
るモノクローナル抗体として調製する。本明細書におい
て、単一特異性抗体は、単一抗体種、またはｃｈＥＰ４
に関して、均質な結合特性を持つ、多数の抗体種と定義
される。本明細書において、均質な結合は、上述のよう
な、ｃｈＥＰ４と関連するものなど、抗体種が特定の抗
原またはエピトープに結合する能力を指す。ｃｈＥＰ４
特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、
ヤギ、ウマ、およびそれらに匹敵するものなどの動物
を、適切な濃度のｃｈＥＰ４で、免疫アジュバントを伴
い、または伴わず、免疫することによって、作成する。

【００６０】最初の免疫前に、免疫前血清を収集する。
各動物に、許容しうる免疫アジュバントと結合した約
０．１μｇおよび約１０００μｇの間のｃｈＥＰ４を投
与する。こうした許容しうるアジュバントには、限定さ
れるわけではないが、フロイントの完全アジュバント、
フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、
ざ瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を含む油中水エマルジョン、
およびｔＲＮＡが含まれる。初回免疫は、好ましくは、
フロイントの完全アジュバント中のタンパク質性分子
を、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、または両方で、多
数の部位に投与することからなる。各動物を、規則的な
間隔、好ましくは毎週、出血させ、抗体力価を決定す
る。動物は、初回免疫後、追加免疫注射を受けてもよい
しまたは受けなくてもよい。追加免疫注射を受ける動物
は、一般的に、同一経路によって、フロイントの不完全
アジュバント中の等量のｃｈＥＰ４を投与される。追加
免疫注射は、最大力価が得られるまで、約３週間間隔
で、投与する。各追加免疫の約７日後、または単回免疫
後、ほぼ毎週、動物を出血させ、血清を収集し、そして
アリコットを約−２０℃で保存する。

【００６１】近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを
ｃｈＥＰ４で免疫することによって、ｃｈＥＰ４と反応
性であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製する。上
に論じられるように、等体積の許容しうるアジュバント
に取り込んだ、約０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水
中の約１μｇから約１００μｇ、好ましくは約１０μｇ
のｃｈＥＰ４を用いて、ＩＰまたはＳＣ経路によって、
マウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好
ましい。マウスに、第０日に初回免疫を与え、そして約
３から約３０週間休ませる。免疫マウスに、静脈内（Ｉ
Ｖ）経路によって、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶
液中の約１から約１００μｇのｃｈＥＰ４の１以上の追
加免疫を与える。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ま
しくは脾臓リンパ球を、当該技術分野に知られる標準法
により、免疫マウスから脾臓を除去することによって得
る。安定なハイブリドーマの形成を可能にするであろう
条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合パートナー、好ま
しくは骨髄腫細胞と、混合することによって、ハイブリ
ドーマ細胞を産生する。融合パートナーには、限定され
るわけではないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４
−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４、およびＳｐ２／０が
含まれる可能性があり、Ｓｐ２／０が好ましい（すべ
て、ＡＴＣＣ、バージニア州マナサスより入手可能）。
抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、約３０％から約５０
％の濃度の、分子量約１０００のポリエチレングリコー
ル中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当
該技術分野に知られる方法により、ヒポキサンチン、チ
ミジン、およびアミノプテリンを補足したダルベッコの
修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）における増殖によって、
選択する。ほぼ第１４日、第１８日、および第２１日
に、増殖陽性ウェルから上清液を収集し、そして抗原と
してｃｈＥＰ４を用いた固相イムノラジオアッセイ（Ｓ
ＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによって、抗体産生に
関してスクリーニングする。培養液はまた、オクタロニ
ー沈降アッセイでも試験し、ｍＡｂのアイソタイプを決
定する。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｓｏｆｔ
Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ中， ＩＱ−ｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅ
ｒｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １
９７３）などの技術によって、抗体陽性ウェル由来のハ
イブリドーマ細胞をクローニングする。

【００６２】モノクローナル抗体は、プリスタン（ｐｒ
ｉｓｔｉｎｅ）準備刺激の約４日後、準備刺激したＢａ
ｌｂ／ｃマウスに、約２ｘ１０⁶から約６ｘ１０⁶のハイ
ブリドーマ細胞を、マウスあたりおよそ０．５ｍｌ注射
することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで産生する。細胞移
入のおよそ８−１２日後に腹水を収集し、そして当該技
術分野に知られる技術によって、モノクローナル抗体を
精製する。

【００６３】抗ｃｈＥＰ４ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ
産生は、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイ
ブリドーマを増殖させ、十分な量の特異的ｍＡｂを得る
ことによって、行う。ｍＡｂは、当該技術分野に知られ
る技術によって精製する。

【００６４】腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力
価は、限定されるわけではないが、沈降、受動凝集、酵
素連結免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術、およびラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む、多様な血清学的
または免疫学的アッセイによって、決定する。同様のア
ッセイを用いて、体液または組織および細胞抽出物中の
ｃｈＥＰ４の存在を検出する。

【００６５】本開示に照らし、当業者には、単一特異性
抗体を産生するための上述の方法を利用して、ｃｈＥＰ
４ポリペプチド断片または全長ｃｈＥＰ４ポリペプチド
に特異的な抗体を産生することが可能であることが、容
易に明らかであろう。

【００６６】ｃｈＥＰ４抗体アフィニティーカラムは、
抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成す
るように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであ
らかじめ活性化されているゲル支持体、Ａｆｆｉｇｅｌ
−１０（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュル
ス）に抗体を添加することによって、作成する。その
後、スペーサーアームとのアミド結合を介して、抗体を
ゲルにカップリングする。その後、残った活性化エステ
ルは、１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失活さ
せる。カラムを水で、その後、０．２３ＭグリシンＨＣ
ｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、いかなる非コンジュゲート
化抗体または異質な（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）タンパク
質も除去する。その後、カラムをリン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．３）中で平衡化し、そしてｃｈＥＰ４または
ｃｈＥＰ４断片を含む細胞培養上清または細胞抽出物を
カラムにゆっくりと通過させる。その後、光学密度（Ａ
₂₈₀）がバックグラウンドに低下するまで、カラムをリ
ン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後、０．２３Ｍグリ
シンＨＣｌ（ｐＨ２．６）でタンパク質を溶出する。そ
の後、精製ｃｈＥＰ４タンパク質を、リン酸緩衝生理食
塩水に対して透析する。

【００６７】本発明の新規チンパンジープロスタグラン
ジン受容体は、受容体活性を調節する化合物の同定のた
めのアッセイ法で使用するのに適している。本明細書に
記載されるような、受容体活性の調節は、受容体活性化
の阻害または活性化を含み、そしてまた、受容体活性の
正常制御に直接または間接的に影響を及ぼすことも含
む。受容体活性を調節する化合物には、アゴニスト、ア
ンタゴニスト、および受容体活性の制御に直接または間
接的に影響を及ぼす化合物が含まれる。

【００６８】本発明のチンパンジープロスタグランジン
受容体は、受容体調節因子を同定するアッセイ法で使用
するため、天然および組換え供給源両方から得ることが
可能である。一般的に、チンパンジープロスタグランジ
ン受容体調節因子を同定するアッセイ法は、本発明のチ
ンパンジープロスタグランジン受容体、および推定上の
チンパンジープロスタグランジン受容体調節因子を含む
試験化合物または試料を含むであろう。試験化合物また
は試料は、例えば、天然または組換えいずれかの精製受
容体タンパク質、天然または組換えいずれかの受容体産
生細胞の細胞成分分画、および／または天然または組換
えいずれかの受容体を発現している全細胞に対して、直
接、試験することが可能である。試験化合物または試料
を、既知の標識または非標識受容体リガンドの存在下ま
たは非存在下で、受容体に添加することが可能である。
試験化合物または試料の調節活性は、例えば、試験化合
物または試料が、受容体に結合する能力、受容体を活性
化する能力、受容体活性を阻害する能力、受容体への他
の化合物の結合を阻害するかまたは増進する能力、受容
体制御を修飾する能力、あるいは細胞内活性を修飾する
能力を解析することによって、決定することが可能であ
る。

【００６９】ｃｈＥＰ４受容体活性の調節因子の同定
は、ｃｈＥＰ４受容体活性に関連する疾患状態を治療す
るのに有用である。潜在的に、これらの化合物はまた、
他の種由来の相同ＥＰ４受容体の調節因子でもあり、そ
してこれらの他の種でもまた、疾患状態を治療するのに
有用であろう。他の化合物が、受容体の活性を刺激する
かまたは阻害するのに有用である可能性がある。これら
の化合物は、抗炎症および解熱剤として、鎮痛剤とし
て、そして骨形成を刺激するかまたは阻害する手段とし
て、有用である可能性がある。こうした化合物は、ｃｈ
ＥＰ４受容体の活性化が、細胞増殖、細胞腫瘍性トラン
スフォーメーション、または転移性腫瘍増殖いずれかを
生じる疾患の治療に有用である可能性があり、そしてし
たがって、大腸癌などの癌の予防および／または治療に
用いることが可能である。ｃｈＥＰ４をコードするＤＮ
Ａ分子の単離および精製は、ｃｈＥＰ４受容体の組織分
布を確立すると共に、ｃｈＥＰ４受容体活性を調節する
化合物を同定する方法を確立するのに有用であろう。

【００７０】本発明はここで、一般的に記載されてきて
いるが、ある特定の実施例を参照することによってより
よく理解されるであろう。実施例は、例示目的のみのた
めに本明細書に含まれ、そしてそのように言及されてい
る場合を除き、本発明を限定することを意図しない。

【００７１】

【実施例】実施例１−ＰＣＲによるｃＤＮＡ同定 ＥＰ４受容体サブタイプの機能をさらに研究するため、
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）戦
略を用いて、チンパンジー末梢血ＲＮＡからｃｈＥＰ４
をクローニングした。Ａｄｖａｎｔａｇｅ一工程ＲＴ−
ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パ
ロアルト）を使用してｃＤＮＡを生成し、そして各チン
パンジー組織由来の１ｇの総ＲＮＡ、並びにランダム六
量体およびオリゴｄＴプライマー両方を、５０℃１時間
の反応中に用いた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で
使用するためであり、そしてヒト、ラット、マウス、イ
ヌ、およびウサギＥＰ４受容体タンパク質コード領域を
コードするＤＮＡ配列の始め（５’ＰＯ₄−ＣＧＭＳＲ
ＲＣＣＡＣＴＹＴＣＡＴＧＴＣＣ３’（配列番号３））
および終わり（５’ＧＴＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＣＴＴ
ＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＲＴＡＧ３’
（配列番号４））に対応する、縮重プライマーを合成し
た（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーラン
ド州ガイザーズバーグ）。以下の周期パラメーター：９
４℃５分間、３５周期の９４℃３０秒間、６５℃３０秒
間、および６８℃３分間、その後、６８℃７分間の最終
伸長を用いて、チンパンジー末梢血単核細胞ＲＮＡから
逆転写したｃＤＮＡに対して、２つの独立のＰＣＲ反応
を行った。

【００７２】５’プライマーは、５’端でリン酸化され
ているため、各チンパンジー組織のＰＣＲ反応産物は、
１５℃一晩の１０ｌ反応中で、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ
（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフ
ォルニア州カールスバッド）に連結した。このベクター
を使用することで、ベクター中のＣＭＶプロモーターに
関して、ＰＣＲ生成ＥＰ４タンパク質コード領域の方向
性クローニングを可能にした。連結後、各連結反応を５
０ｌに希釈し、そして各反応５ｌで、製造者の指示にし
たがって、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、以前のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）を形質転換し、そして形質転換した細胞を、１０
０ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上に蒔い
た。これらのアンピシリン耐性コロニーから３ｍｌ培養
を開始し、そしてＱｉａＱｕｉｋキット（Ｑｉａｇｅ
ｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。制限酵素解析を行い、予測される
挿入物サイズ（〜１５００ｂｐ）のクローンを同定し、
そして各組織由来の独立のＰＣＲ反応各々から４つのク
ローンを、全長ＤＮＡ配列決定に供した。Ｇｅｎｅｗｏ
ｒｋｓ^TM（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕ
ｐ， Ｉｎｃ、カリフォルニア州キャンベル）を用い
て、ＤＮＡおよびタンパク質配列比較を行った。

【００７３】製造者のプロトコルにしたがって、Ｂｉｇ
Ｄｙｅターミネーター（ＢＤＴ）Ｔａｑ ＦＳ化学反応
を用いた周期配列決定を用いて、ＡＢ３７００ ＤＮＡ
解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニ
ア州フォスターシティー）上で、精製ＤＮＡの配列決定
を行ったが、以下の修飾を含んだ：半反応ＢＤＴ反応
（５０％ＢＤＴ、５０％ＡＢＩ ５Ｘ緩衝液）は、５％
ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｃｈｅｒ、ニュージャージー州フェア
ローン）を含んだ；ホットスタートでの周期配列決定熱
プロフィール：１周期の９５℃１分間、１周期の９８℃
４５秒間、５０℃１０秒間、６０℃４分間、その後、総
数３０周期の９８℃１５秒間、５０℃１０秒間、６０℃
４分間（ＭＪ Ｔｅｔｒａｄ熱反復装置、ＭＪ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ウォータータウン）。
配列決定反応は、イソプロパノール（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋ
ｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）沈殿に
よって精製し、そして注射用に蒸留脱イオン水（ＶＷ
Ｒ、ペンシルバニア州ウェストチェスター）に再懸濁し
た。

【００７４】実施例２−ＣＨＯ−Ｋ１細胞における組換
えチンパンジーＥＰ４の発現 トランスフェクション前日、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州カラバサス）を補った
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）中、６ｘ１０⁴細胞／ｃｍ²で、１００ｍｍプレート
（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）に蒔い
た。翌日、各細胞プレートを、製造者のプロトコルにし
たがって、リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１５ｇのチンパ
ンジーＥＰ４−ｐＣＲ３．１−ＵｎｉプラスミドＤＮＡ
でトランスフェクションした。簡潔には、血清を含まな
い１．５ｍｌのＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２に４５ｌのリポフェ
クタミン２０００試薬を希釈し、そして室温で５分間イ
ンキュベーションした。この間に、血清を含まない０．
５ｍｌのＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２に１５ｇのチンパンジーＥ
Ｐ４−ｐＣＲ３．１−ＵｎｉプラスミドＤＮＡを希釈し
た。その後、希釈したリポフェクタミン２０００試薬お
よびＤＮＡを混合し、そして室温でさらに２０分間イン
キュベーションした。その後、血清を含まない８ｍｌの
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２を各反応に添加し、そして血清不含
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２であらかじめリンスしたＣＨＯ細胞
のプレートに、注意深く添加した。その後、これらの細
胞を、５％ＣＯ₂、３７℃で６時間インキュベーション
し、この時点で、プレートあたり１ｍｌのＦＣＳを添加
し、そして５％ＣＯ₂、３７℃で一晩、インキュベーシ
ョンを続けた。翌日、リガンド結合および／または二次
シグナル伝達解析に使用するため、細胞を２４ウェルま
たは９６ウェルプレートに分けた。

【００７５】実施例３−チンパンジーＥＰ４への結合の
解析 チンパンジーＥＰ４受容体で一過性にトランスフェクシ
ョンしたＣＨＯ細胞を、２４ウェル組織培養プレート
（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）中に６
０，０００細胞／ウェルで蒔き、そして４８時間増殖さ
せた。３ｎＭ ³Ｈ−ＰＧＥ₂に加え非標識競合剤（１０
^-5から１０^-10Ｍ）を含む全細胞結合反応（ウェルあた
り０．２ｍｌ）を、氷上で１時間行った。非結合放射リ
ガンドは、徹底的な洗浄によって除去し、１％ＳＤＳで
細胞を可溶化し、そして結合した³Ｈ−ＰＧＥ₂を、シン
チレーション計測によって、定量化した。

【００７６】実施例４−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の測定 ｃＡＭＰ産生の刺激を測定するため、チンパンジーＥＰ
４受容体で一過性にトランスフェクションしたＣＨＯ細
胞を、ポリ−Ｄリジン被覆９６ウェル組織培養プレート
（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージ
ー州フランクリンレークス）中に２０，０００細胞／ウ
ェルで蒔き、そして７２時間増殖させた。その後、細胞
を１度、ＰＢＳでリンスし、そして適切な濃度の試験化
合物（アッセイ緩衝液：５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；３０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４；０．３ｍＭ ３−イソブチ
ル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ、カリフォルニア州ラホヤ）；１ｍｇ／ｍｌデキ
ストロースで希釈）を添加した。プレートを３７℃で１
２分間インキュベーションし、その後、１０μｌの溶解
緩衝液を各ウェルに添加し、反応を終結させた。製造者
のプロトコルにしたがって、ＳＰＡ試薬（ＲＰＡ５５
９、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウ
ェイ）を調製し、そして１２０μｌを各ウェルに添加し
た。その後、アッセイプレートを、Ｗａｌｌａｃ Ｔｒ
ｉｌｕｘ計測装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチ
ューセッツ州ボストン）で計測した。

【００７７】上記明細書に言及されるすべての刊行物お
よび特許は、本明細書に援用される。記載される発明の
多様な修飾および変動が、本開示に照らし、本発明の範
囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかで
あろう。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記載
されてきているが、請求されるような本発明は、こうし
た特定の態様に限定されないことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 チンパンジーＥＰ４のヌクレオチドおよび
予測されるタンパク質配列を示す。このヌクレオチド配
列は、１４７０ｂｐのオープンリーディングフレームを
有する。オープンリーディングフレームの予測されるア
ミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の下に、一文字形式で示す。

【図１Ｂ】 チンパンジーＥＰ４のヌクレオチドおよび
予測されるタンパク質配列を示す。このヌクレオチド配
列は、１４７０ｂｐのオープンリーディングフレームを
有する。オープンリーディングフレームの予測されるア
ミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の下に、一文字形式で示す。

【図２】 図２は、チンパンジーＥＰ４オープンリーデ
ィングフレームの予測されるタンパク質配列と、ヒトＥ
Ｐ４に関して報告されたものとの比較を示す。これらの
タンパク質配列の並列は、＞９９％同一性を明らかにし
た。２種間で同一である残基を囲み、そして並列のため
必要な箇所では、ギャップを導入した。

【図３Ａ】 チンパンジーＥＰ４オープンリーディング
フレームの予測されるポリヌクレオチド配列と、ヒトＥ
Ｐ４に関して報告されたものとの比較を示す。これらの
ポリヌクレオチド配列の並列は、＞９７％同一性を明ら
かにした。２種間で同一であるヌクレオチドを囲み、そ
して並列のため必要な箇所では、ギャップを導入した。

【図３Ｂ】 チンパンジーＥＰ４オープンリーディング
フレームの予測されるポリヌクレオチド配列と、ヒトＥ
Ｐ４に関して報告されたものとの比較を示す。これらの
ポリヌクレオチド配列の並列は、＞９７％同一性を明ら
かにした。２種間で同一であるヌクレオチドを囲み、そ
して並列のため必要な箇所では、ギャップを導入した。

【図４】 チンパンジープロスタグランジン受容体ＥＰ
４を発現しているＣＨＯ細胞に対するリガンド結合の性
質決定を示す。チンパンジーＥＰ４で一過性にトランス
フェクションしたＣＨＯ細胞に対する、ＥＰ１−ＥＰ４
の多様なプロスタノイドリガンドと³Ｈ−ＰＧＥ₂との競
合的結合。示される濃度の（■）ＰＧＥ₂、（●）サル
プロストン、（▲）ブタプロスト、または（◆）ＥＰ４
ＳＬ各々を、チンパンジーＥＰ４で一過性にトランスフ
ェクションしたＣＨＯ細胞の２４ウェルプレート３ウェ
ルと、３ｎＭ ³Ｈ−ＰＧＥ₂の存在下で、氷上で１時間
インキュベーションした。細胞を洗浄し、そして可溶化
した後、シンチレーション計測によって、特異的結合を
測定した。エラーバーは、１標準偏差に相当する。ブタ
プロストは、Ｈａｒｏｌｄ Ｋｌｕｅｎｄｅｒ博士（Ｂ
ａｙｅｒ， Ｉｎｃ．、コネチカット州ニューヘブン）
から得た。ＥＰ４ＳＬは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、コネ
チカット州グロトンで産生した。すべての他のプロスタ
ノイド化合物は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミ
シガン州アナーバー）から購入した。

【図５】 チンパンジープロスタグランジン受容体ＥＰ
４を発現しているＣＨＯ細胞における二次シグナル伝達
の性質決定を示す。チンパンジーＥＰ４で一過性にトラ
ンスフェクションしたＣＨＯ細胞を、（■）ＰＧＥ₂ま
たはＥＰ４特異的リガンド（●）ＥＰ４ＳＬいずれかで
１２分間処理した後、該細胞に対してＳＰＡアッセイを
行った。エラーバーは１標準偏差に相当する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/04 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｈ０４５ 43/00 １７１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 5/10 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 33/58 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ 33/58 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ビホン・ル アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント (72)発明者 トーマス・アレン・オーウェン アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント (72)発明者 スティーヴン・リー・スモック アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント Ｆターム(参考） 2G045 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB03 FB04 FB08 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA04 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA19 CA36 DA45 NA14 ZA961 ZA962 ZB111 ZB112 ZB261 ZB262 ZC611 ZC612 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チンパンジーＥＰ４活性を有する単離
   タンパク質性分子であって、配列番号２のアミノ酸配
   列、または１以上の保存的置換を含む配列番号２のアミ
   ノ酸配列を含む、前記単離タンパク質性分子。
2. 【請求項２】 前記アミノ酸配列が、０から３の保存
   的置換を有する、請求項１記載の単離タンパク質性分
   子。
3. 【請求項３】 前記アミノ酸配列が、配列番号２のア
   ミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離タンパク質性分
   子。
4. 【請求項４】 請求項１記載のタンパク質性分子をコ
   ードする、単離ＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 請求項３記載のタンパク質性分子をコ
   ードする、単離ＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 配列番号１に示される配列を有する、
   単離ＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項４記載のＤＮＡ分子を含む、組
   換え発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載の発現ベクターに形質転
   換された細胞。
9. 【請求項９】 前記細胞が真核生物のものである、請
   求項８記載の細胞。
10. 【請求項１０】 チンパンジーＥＰ４の活性を有する
    タンパク質性分子を産生する方法であって、請求項８記
    載の細胞を、前記タンパク質性分子を産生するのに十分
    な時間、培養することを含む、前記方法。
11. 【請求項１１】 請求項１記載のタンパク質性分子お
    よび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成
    物。
12. 【請求項１２】 請求項１記載のタンパク質性分子に
    選択的に結合する、特異的結合パートナー。
13. 【請求項１３】 試験物質がチンパンジーＥＰ４タン
    パク質のリガンドであるかどうかを決定する方法であっ
    て： ａ）前記試験物質を、請求項１記載のタンパク質性分子
    と合わせ； ｂ）前記試験物質および前記タンパク質性分子の間の特
    異的結合を測定し；そして ｃ）前記試験物質が前記タンパク質性分子に結合する場
    合、前記試験物質をリガンドとして分類する 工程を含む、前記方法。
14. 【請求項１４】 試験物質がチンパンジーＥＰ４タン
    パク質のリガンドであるかどうかを決定する方法であっ
    て： ａ）前記試験物質を、請求項１記載のタンパク質性分子
    と合わせ、ここで前記タンパク質性分子は、検出可能リ
    ガンドとあらかじめ組み合わされている； ｂ）前記試験物質によって、前記タンパク質性分子との
    結合から競合的に阻害される前記検出可能リガンドの量
    を測定し；そして ｃ）前記試験物質が前記タンパク質性分子と前記検出可
    能リガンドの結合を競合的に阻害する場合、前記試験物
    質をリガンドとして分類する工程を含む、前記方法。
15. 【請求項１５】 前記検出可能リガンドが、放射能標
    識されたＰＧＥ２である、請求項１４記載の方法。