JP2001517441A - Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ｈｇ３８ - Google Patents

Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ｈｇ３８

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なＧタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ＨＧ３８、受容体の突然変異形態及び多形性形態、それらをコードする核酸、核酸を含む発現ベクター、核酸で形質転換された宿主細胞、受容体が欠失したトランスジェニックノックアウト動物、非天然型受容体遺伝子を発現するトランスジェニック動物、受容体及びそのポリペプチドに対する抗体、並びに、受容体のモジュレーター、アゴニスト及びアンタゴニストのアッセイを提供する。本発明の受容体タンパク質及びポリペプチド、核酸、細胞、動物並びにアッセイは、薬剤のスクリーニング及び開発並びに診断的及び治療的使用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、実質的に精製された形態及び突然変異形態または多形性形態の新規
なＧタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体、該受容体をコードする組換え
核酸、該核酸で形質転換された組換え宿主細胞、該受容体の欠損したトランスジ
ェニックノックアウト動物、非天然型の受容体遺伝子を発現するトランスジェニ
ック動物、受容体及びそのポリペプチドに対する抗体、並びに、薬剤のスクリー
ニング及び開発、診断的及び治療的用途における受容体、組換え核酸、組換え宿
主細胞及びトランスジェニック動物の使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 本発明のＧタンパク質共役受容体は糖タンパク質ホルモン受容体ファミリーに
属する。Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体としてはこれまでに３種
類だけが報告されている：卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体（Ｍｉｎｅｇｉｓ
ｈら，１９９１，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７５：
１１２５−１１３０；Ｓｐｒｅｎｇｅｌら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌ．４：５２５−５３０）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（Ｆｒａ
ｚｉｅｒら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：１２６４−１２７
６；Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１６２０−
１６２２）及び黄体形成ホルモン／胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン（ＬＨ／ｈＣＧ
）受容体（Ｌｏｏｓｆｅｌｔら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：５２５−
５２８）。
【０００３】 既知の糖タンパク質ホルモン受容体の構造及び機能は文献にまとめられている
（Ｐｅａｒｃｅら，１９９５，Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．８８：３−８；Ｒｅｉｃｈｅｒ
ｔら，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：２
１９−２０３）。このグループの糖タンパク質ホルモン受容体は、ロドプシンフ
ァミリーのＧタンパク質共役受容体の構造を示す。このクラスの受容体は、３つ
の細胞外ループと３つの細胞内ループとをもつ７つの膜貫通ドメインを含む。
【０００４】 糖タンパク質ホルモンのような大きいリガンドはＮ末端ドメインに結合し、よ
り小さいペプチド、アミン及び他のリガンドは細胞外ループによって形成された
ポケットに結合し得る。活性リガンドが結合すると、コンホメーション変化が生
じて、同伴するＧタンパク質が活性化されると考えられている。この活性化中に
、受容体の細胞質ループ、特に第三ループ及びＣ末端ドメインがＧタンパク質と
相互作用すると考えられている。
【０００５】 受容体に共役したＧタンパク質は複数の細胞性シグナル伝達経路に関与し得る
。最もよく知られた経路は、アデニル酸シクラーゼ／ｃＡＭＰ経路、ホスホリパ
ーゼＣ−ｂ／ホスホイノシトール経路及び細胞内Ｃａ2+の増加である。これらの
第二メッセンジャー経路は細胞内部の受容体リガンドの作用を媒介する。これら
はまた、受容体の活性を評価するアッセイで有利に使用できる。
【０００６】 受容体活性は細胞レベルで調節され得る。アゴニストによる受容体の拡大的な
活性化により、Ｃ末端及び細胞質ループがリン酸化され、受容体が急速に減感作
される。更に、受容体は受容体遺伝子上の転写活性モジュレーターによって調節
され得る。ｃＡＭＰ反応要素が幾つかのＧタンパク質共役受容体遺伝子のプロモ
ーター領域の内部で証明された。細胞生化学のこれらの様相もアッセイで受容体
活性をモニターし評価するために有利に使用でき、例えば、受容体のリン酸化を
受容体のアゴニストの存在の指標としてモニターしてもよく、または、転写活性
を受容体遺伝子発現のモジュレーターの存在の指標としてモニターしてもよい。
【０００７】 既知のＧタンパク質共役糖タンパク質受容体の突然変異は疾病状態に導くこと
もありまたは疾病状態の指標となることもある（Ｐｅａｒｃｅら，１９９５）。
内分泌系で糖タンパク質ホルモン受容体の重要性が認められるので、ＨＧ３８は
骨格筋、脊髄及び胎盤の発生及び機能並びにより少ない程度に大脳の発生及び機
能に重要な役割を果たすと予測されている。
【０００８】 （発明の概要） 本発明の好ましい態様は、図１Ａ−１Ｃ及び配列１に開示されたＧタンパク質
共役糖タンパク質ホルモン受容体タンパク質ＨＧ３８をコードするヒトｃＤＮＡ
である。
【０００９】 本発明の態様は、新規な生物活性ヒト受容体を発現するｍＲＮＡをコードする
Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ＨＧ３８（配列１）の単離された
核酸フラグメントである。このような核酸フラグメントはいずれも、少なくとも
１つの細胞内Ｇタンパク質結合ドメイン及び／または細胞外リガンド結合ドメイ
ンを含むタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードしており、これらの
ドメインは、ＨＧ３８のアミノ酸配列（配列２）中に存在するＧタンパク質共役
糖タンパク質ホルモン受容体ファミリーの全部で保存されている。このようなポ
リヌクレオチドはいずれも、必ずしも限定されないがヌクレオチドの置換、欠失
、付加、アミノ末端欠損及びカルボキシル末端欠損を含んでおり、その結果とし
てこれらの突然変異は、診断、治療または予防の目的で使用できるタンパク質も
しくはタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードしているか、または
、ＨＧ３８機能の発現モジュレーター、アゴニスト及び／またはアンタゴニスト
をスクリーニングするために有用であろう。
【００１０】 特定の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡ及び相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のような一本鎖（コーディング鎖または非コーディング鎖
）または二重鎖のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）でもよく、または、合成され
た一本鎖ポリヌクレオチドのような合成ＤＮＡでもよい。本発明の単離された核
酸分子はまたリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。特定実施態様では、核酸が、配
列１の全配列、配列１の読み取り枠をコードする配列、または、ＨＧ３８タンパ
ク質のペプチドもしくはポリペプチドの発現に有用なもっと短い配列のいずれで
もよい。特定実施態様では、核酸は、天然、非天然または修飾されたヌクレオチ
ドまたはヌクレオチド間結合またはこれらの混合物を有し得る。
【００１１】 本発明の態様は、図１Ａ−１Ｃ、図２、図３Ａ−３Ｅ及び図４並びに配列１及
び配列２として本文中に開示されたヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に由
来のヌクレオチドプローブ及びプライマーである。本発明の特定実施態様におい
ては、プローブ及びプライマーは、図２のＨＧ３８をコードするポリヌクレオチ
ドまたはＨＧ３８受容体タンパク質もしくは遺伝子の突然変異形態もしくは多形
性形態を同定または単離するために使用される。プローブ及びプライマーはＨＧ
３８ヌクレオチド配列に高度に特異的であり得る。
【００１２】 本発明の１つの態様は、実質的に精製された形態の新規なＧタンパク質共役糖
タンパク質ホルモン受容体タンパク質ＨＧ３８である。このタンパク質は図２に
開示されており配列２で表される。
【００１３】 本発明の態様は、配列２として示すＨＧ３８タンパク質の生物活性フラグメン
ト及び／または突然変異体を包含する。突然変異の非限定例としては、アミノ酸
の置換、欠失、付加、アミノ末端欠損及びカルボキシ末端欠損などがあり、これ
らの突然変異が診断、治療または予防の目的で使用できるタンパク質またはタン
パク質フラグメントを提供し、ＨＧ３８機能のモジュレーター、アゴニスト及び
／またはアンタゴニストをスクリーニングするために有用であろう。好ましい実
施態様では、フラグメントは、受容体リガンドに対して受容体と競合できる可溶
性のＮ末端フラグメントである。
【００１４】 本発明の態様は、本明細書に開示された核酸分子を含む組換えベクター及び組
換え宿主を包含する。特定実施態様において、ベクター及び宿主は原核細胞でも
よく真核細胞でもよい。特定実施態様において、宿主はＨＧ３８ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質または融合タンパク質を発現する。別の実施態様において
、宿主細胞は発現産物のソースとして使用される。
【００１５】 本発明の態様は、本文中に開示された完全形態のヒトＨＧ３８またはその単な
るフラグメントまたはその単一エピトープに対して増産されるポリクローナル抗
体及びモノクローナル抗体である。好ましい実施態様において、抗体はＨＧ３８
のＮＨ2−末端ドメイン内部のエピトープに対して増産される。別の好ましい実 施態様において、抗体はＨＧ３８受容体に特有のエピトープに対して増産される
。
【００１６】 本発明の１つの態様は、ヒトＨＧ３８のレベルをスクリーニング及び測定する
ための本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体の使用であ
る。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体はヒトＨＧ３８の検出
及びタイピングに好適なキットの製造に使用できる。
【００１７】 本発明の態様は、ＨＧ３８受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト並びにＨＧ
３８の発現モジュレーターを検出するアッセイである。この目的の特定実施態様
においては、黒色素胞系、哺乳類のアデニル酸シラーゼを発現する酵母、酵母フ
ェロモンタンパク質代用物によるスクリーニング、ホスホリパーゼ第二シグナル
スクリーニング及び酵母二ハイブリッド系などのスクリーニングアッセイでＨＧ
３８を含む細胞を使用する。これらのアッセイはいずれも当業者に公知であり、
当業者が容易に応用できる。
【００１８】 本発明の１つの態様は、本発明のプローブまたは抗体を使用する組織タイピン
グである。特定実施態様では、ＨＧ３８ ＲＮＡを発現する組織を同定するため
にポリヌクレオチドプローブを使用する。別の実施態様では、１つまたは複数の
細胞の表面におけるＨＧ３８発現またはＨＧ３８受容体の提示に基づいて組織の
タイプを同定するためにプローブまたは抗体を使用できる。
【００１９】 本発明の１つの態様は、野生型ヒトＨＧ３８活性のモジュレーター、アゴニス
トまたはアンタゴニストである化合物を同定するアッセイに有用な融合タンパク
質を発現する融合構築物から成る単離核酸分子である。本発明のこの態様の好ま
しい実施態様は非限定的に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＧＳＴ−ＨＧ
３８機能構築物を含む。これらの機能構築物の非限定例としては、ＧＳＴ遺伝子
のカルボキシ末端のインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合のようなＨＧ３８の
リガンド結合ドメインの全部または一部がある。融合タンパク質はＨＧ３８受容
体のリガンドを単離または同定するために有用である。平均的な当業者は配列１
−配列２の開示に基づいてＧＳＴ−Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容
体の融合タンパク質をコードするこのような任意の核酸分子を構築し得る。可溶
性の組換えＧＳＴ−Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体の融合タンパ
ク質は、バキュロウイルス発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供の
Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡまたはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ提供のｐＡｃＧ２Ｔ
）を用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような種々の発現系中で発現できる。
【００２０】 本発明の１つの態様は、ＨＧ３８タンパク質、そのフラグメント、ＨＧ３８も
しくはＨＧ３８ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストもしくはモジュレー
ターを含む医薬組成物である。
【００２１】 本発明の１つの態様は、遺伝子治療方法、例えばＨＧ３８遺伝子の突然変異関
連の疾病状態を予防または（全面的または部分的に）治療する目的で本発明のポ
リヌクレオチドを個体の治療に使用することである。これは疾病の１つまたは複
数の症状を軽減するであろう。遺伝子治療用ベクター及び方法を用いて核酸をｉ
ｎ ｖｉｖｏ導入する。
【００２２】 本発明の１つの態様は、ヒト以外の動物の体内のＨＧ３８受容体の組織及び時
間に特異的な発現または活性の研究に有用なトランスジェニック動物である。動
物は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞または培養もしくはアッセイ用のｉｎ ｖｉｔｒｏ細
胞を提供することによって、ＨＧ３８受容体の活性または発現のモジュレーター
として作用する種々の化合物の能力を研究するために役立つ。この目的の本発明
の１つの実施態様においては、動物が機能性内在ＨＧ３８遺伝子の欠失した別の
動物の作製方法に使用される。別の実施態様においては、この目的の動物が内在
遺伝子の発現の非存在下で非天然型ＨＧ３８遺伝子を発現する動物を作製する方
法に使用される。特定実施態様において、ヒト以外の動物はマウスである。別の
実施態様において、非天然型ＨＧ３８遺伝子は野生型ヒト遺伝子または突然変異
型ヒトＨＧ３８遺伝子である。
【００２３】 （詳細な説明） 本発明は、本文中でＨＧ３８と呼ぶヒトＧ共役糖タンパク質ホルモン受容体の
ポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。ポリヌクレオチド及びポリペプ
チドは更に、発現ベクター、ベクターを含む宿主細胞、ポリヌクレオチドにトラ
ンスジェニックなヒト以外の動物、ノックアウト動物、プローブ及びプライマー
、受容体及びそのポリペプチドに対する抗体、ＨＧ３８の存在または発現を検出
するアッセイ、並びに、ＨＧ３８受容体のモジュレーター、アゴニスト及びアン
タゴニストの同定アッセイに使用される。
【００２４】 ＨＧ３８遺伝子、受容体並びにそのアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレ
ーターは筋退行変性疾患、例えば、筋減少症の治療に有効である。その他の用途
としては、骨格筋の増殖または再生の促進、筋代謝の増減、及び、肥満症及びＩ
Ｉ型糖尿病の治療がある。
【００２５】 本明細書に引用した文献はいずれも参照によってその記載内容全部が本発明に
含まれるものとする。
【００２６】 本文中に使用された“化合物”または“分子”なる用語は、有機または無機の
任意のサイズの原子の集合体を意味しており、ペプチド、ポリペプチド、全タン
パク質及びポリヌクレオチドなどの巨大分子を包含する。本明細書では２つの用
語を互換的に使用する。
【００２７】 本文中に使用された“候補”なる用語は、ＨＧ３８受容体のモジュレーター、
アゴニストまたはアンタゴニストであると予測される分子または化合物を意味す
る。
【００２８】 本文中に使用された“アゴニスト”なる用語は、ＨＧ３８受容体のポリペプチ
ドと相互作用するかまたは該ポリペプチドを活性化する化合物または分子を意味
する。活性化されたＨＧ３８受容体ポリペプチドは、Ｇタンパク質によるＧＴＰ
の開裂を刺激し、アデニル酸シクラーゼ経路を活性化するかまたはホスホリパー
ゼｂ経路を活性化し得る。
【００２９】 本文中に使用された“アンタゴニスト”なる用語は、ＨＧ３８受容体のポリペ
プチドと相互作用し、該受容体の活性化を阻害または阻止する化合物または分子
を意味する。
【００３０】 本文中に使用された“モジュレーター”なる用語は、細胞の表面上または周囲
の血清中もしくは媒体中に存在するＨＧ３８受容体のポリペプチドの量を増減す
るために細胞生化学の１つの様相と相互作用する化合物または分子を意味する。
受容体ポリペプチドの量の変化を媒介できるのは、受容体の発現例えば受容体の
転写、翻訳、翻訳後プロセシング、トランスロケーションもしくは折り畳みなど
に対するモジュレーターの作用、または、受容体の発現に直接もしくは間接に関
与する細胞生化学の（１つまたは複数の）成分の作用である。あるいは、モジュ
レーターの作用が、受容体との直接相互作用によって受容体のターンオーバーを
加速または減速させることでもよく、または、直接もしくは間接に変化に関与す
る細胞生化学の（１つまたは複数の）別の成分と相互作用することでもよい。
【００３１】 ポリヌクレオチド 本発明の１つの好ましい目的は、図１及び配列１に開示されている以下のよう
なＧタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ＨＧ３８をコードするヒトｃＤ
ＮＡである。
【００３２】
【化１】
【００３３】
【化２】
【００３４】
【化３】
【００３５】 本発明の単離された核酸分子としては、ゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）のような一本鎖（コーディング鎖または非コーディング鎖）または二重鎖
のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）並びに合成された一本鎖ポリヌクレオチドの
ような合成ＤＮＡがある。本発明の単離された核酸分子としてはまた、リボ核酸
分子（ＲＮＡ）がある。
【００３６】 本発明はまた、本明細書に開示された実質的に精製された核酸分子を含有する
組換えベクター並びに原核性及び真核性の組換え宿主に関する。
【００３７】 本文中で使用された“ポリヌクレオチド”なる用語は、２つ以上のヌクレオチ
ドから成る核酸を意味する。１つのポリヌクレオチドは、単位と呼ばれる多数の
ポリヌクレオチド単位から構成され得る。例えば、１つのポリヌクレオチドはそ
の両端の間に、（１つまたは複数の）コーディング配列を有する（１つまたは複
数の）ポリヌクレオチドと、（１つまたは複数の）調節領域となる（１つまたは
複数の）ポリヌクレオチド及び／または当業界で常用の他のポリヌクレオチド単
位とを含み得る。
【００３８】 “発現ベクター”は、宿主細胞に導入されたベクターがコーディング配列の発
現を指令できるようにコーディング領域に作動的に連結された調節領域をもつポ
リヌクレオチドである。発現ベクターの使用は当業界で公知である。発現ベクタ
ーは多様な宿主細胞に使用でき、従って、個々の宿主細胞に応じた好ましい調節
領域が適宜選択される。
【００３９】 “調節領域”は、コーディング配列の転写または翻訳の開始または終結を促進
または強化し得るポリヌクレオチドである。調節領域は、宿主細胞のＲＮＡポリ
メラーゼ、リボソーム、または、連合形態の転写もしくは翻訳を開始もしくは終
結させる因子によって認識される配列を含む。転写または翻訳の開始を指令する
調節領域はコーディング配列の構成性または誘導性の発現を指令し得る。
【００４０】 本発明のポリヌクレオチドは哺乳類ＨＧ３８受容体遺伝子の全配列または部分
配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖でも二重鎖でもよい。一本鎖の
場合、ポリヌクレオチドは、コーディング“センス”鎖でもよくまたは相補的“
アンチセンス”鎖でもよい。アンチセンス鎖は、受容体をコードするＲＮＡと相
互作用することによって受容体のモジュレーターとして有効である。アンチセン
ス鎖は好ましくは、全長よりも短く、非反復配列を有するかまたは受容体をコー
ドするＲＮＡに高度に特異的である。
【００４１】 ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは両者
の混合物から成る。ポリヌクレオチドは、細胞によって産生されてもよく、無細
胞生化学反応または化学合成によって産生されてもよい。イノシン、メチル−シ
トシン、デアザ−グアノシンなどのような非天然または修飾ヌクレオチドが存在
してもよい。天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合も適当である。しかし
ながら、ポリヌクレオチドがヌクレオチド間に非天然結合を有することもできる
。非天然結合は当業界で公知であり、その非限定例としては、メチルホスホネー
ト結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオネート結合、ホスホロアミダ
イト結合及びホスフェートエステル結合がある。デホスホ結合もヌクレオチド間
のブリッジとして知られている。これらの例としては、シロキサンブリッジ、カ
ーボネートブリッジ、カルボキシメチルエステルブリッジ、アセトアミデートブ
リッジ、カーバメートブリッジ及びチオエーテルブリッジがある。例えば、Ｎ−
ビニル、メタクリルオキシエチル、メタクリルアミドまたエチレンイミンのヌク
レオチド間結合を有する“プラスチックＤＮＡ”を使用し得る。“ペプチド核酸
”（ＰＮＡ）も有用であり、ヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。これらの
結合は１つのポリヌクレオチド中に混在し得る。
【００４２】 本文中に使用された“精製された”及び“単離された”なる用語は、該当ポリ
ヌクレオチド、タンパク質及びポリペプチドまたはそれぞれのフラグメントがｉ
ｎ ｖｉｖｏ環境から取り出された状態を表すために互換的に使用されており、
これらは、当業者によって非限定的に配列決定、制限消化、部位特異的突然変異
誘発などによって操作され、核酸フラグメントを発現ベクターにサブクローニン
グでき、また、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、アミノ酸の
配列決定、ペプチド消化などの機会を与える十分な量のタンパク質もしくはタン
パク質フラグメントを産生できる。従って、本発明の特許請求の範囲に記載の核
酸は全細胞中に存在してもよく、細胞溶解液中に存在してもよく、または、部分
的に精製された形態で存在してもよく、実質的に精製された形態で存在してもよ
い。周囲の夾雑物質から分離して精製されたときにポリヌクレオチドが精製され
たと考える。従って、細胞から精製及び単離されたポリヌクレオチドは、標準方
法によって細胞成分から精製されたときに実質的に精製されたと考えられ、化学
合成された核酸配列は、その化学的前駆体から精製されたときに実質的に精製さ
れたと考えられる。
【００４３】 ポリペプチド 本発明はまた、実質的に精製された形態の新規なＧタンパク質共役糖タンパク
質ホルモン受容体タンパク質ＨＧ３８、即ち、一文字コードで図２に配列２とし
て開示されている以下の配列のタンパク質に関する。
【００４４】
【化４】
【００４５】 本発明はまた、配列２で示されたようなＨＧ３８の生物活性フラグメント及び
突然変異形態または多形性形態に関する。これらの突然変異形態は、必ずしも限
定されないが、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端欠損及びカルボキシル
末端欠損を含み、その結果としてこれらの突然変異は、診断、治療または予防の
目的で使用されるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントを提供するか、ま
たは、ＨＧ３８機能のモジュレーター、アゴニスト及び／またはアンタゴニスト
をスクリーニングするために有用であろう。
【００４６】 好ましい実施態様において、生物活性ＨＧ３８フラグメントは、受容体のリガ
ンドに対して完全受容体ＨＧ３８と競合し得る可溶性Ｎ末端フラグメントである
。このような可溶性形態の受容体は当業界で公知であり、本文中に開示したポリ
ペプチドから誘導され得る。可溶性Ｎ末端フラグメントではシグナル配列が欠失
しているのが好ましい。これは、配列２の最初の約２２個のアミノ酸の欠失に相
当する。“約”という用語は、フラグメントの欠失アミノ酸が正確に２２個でな
く、より少数またはより多数のアミノ酸の欠失または除去も許容されることを意
味する。重要な点は、欠失の量ではなく、Ｎ末端フラグメントがリガンド結合活
性を維持することである。本文中に記載のアンタゴニストアッセイを使用して任
意のＨＧ３８フラグメントとＨＧ３８受容体との競合を容易に試験し得る。該フ
ラグメントはまた種々の長さを有し得る。配列２の７個未満の疎水性ドメインま
での配列をもつ可溶性Ｎ末端フラグメントが好ましい。例えば、可溶性Ｎ末端フ
ラグメントが配列２のアミノ酸約５５７までの範囲であるのが好ましい。これも
また正確な終点である必要はない。例えば野生型に比較した結合活性の簡単な試
験によって他の適当な終点を決定できる。
【００４７】 天然に生じる形態のＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドを単離するために
本文中に開示されたポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を使用し、この
ような天然に生じる形態がＨＧ３８の突然変異形態であるかまたは多形性形態で
あるかを当業者は配列比較によって判断できる。更に、コードされたタンパク質
または任意のＨＧ３８タンパク質のフラグメントが生物学的に活性であるか否か
を判断するためには、ＨＧ３８受容体の生物活性のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏアッセイで定型的手順によってフラグメントのタンパク質を試験すれ
ばよい。例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端の欠損または内部的な付加もしくは欠失
を宿主細胞中で発現させ、Ｇタンパク質によるＧＴＰの開裂刺激、アデニル酸シ
クラーゼ経路の活性化またはホスホリパーゼｂ経路の活性化などに関する能力を
試験し得る。
【００４８】 特定アミノ酸をコードする種々のコドンにはかなりの重複性があることは公知
である。従って、以下に示すような最終的に同一のアミノ酸の翻訳をコードする
択一的コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も本発明の目的である：
【００４９】 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ，ＧＡＧ Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵ
Ｕ Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＧＡＡ，ＣＡＧ Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，Ｃ
ＧＵ Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００５０】 従って、本発明は、同一タンパク質を発現する異なるＤＮＡ分子を生じ得るコ
ドン重複性を開示している。本明細書の目的では、１つまたは複数の置換された
コドンを含む配列を縮重変異と定義する。ＤＮＡ配列中であるか翻訳されたタン
パク質中であるかに関わりなく、発現されたタンパク質の最終の物理的特性を実
質的に変化させない突然変異は本発明の範囲に包含される。例えば、ロイシンに
代わるバリン、リシンに代わるアルギニン、またはグルタミンに代わるアスパラ
ギン、などの置換はポリペプチドの機能変化を生じさせない。
【００５１】 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に生じるペプチドの特性とは異なる
特性をもつペプチドをコードするように改変できることも公知である。ＤＮＡ配
列を改変する方法の非限定例は、部位特異的突然変異誘発である。改変された特
性の非限定例は、基質に対する酵素またはリガンドに対する受容体の親和性の変
化である。
【００５２】 本文中に使用された野生型ヒトＨＧ３８の“生物活性等価物”または“機能性
誘導体”は、野生型ヒトＨＧ３８の生物活性に実質的に同様の生物活性を有して
いる。“機能性誘導体”なる用語は、野生型ヒトＨＧ３８タンパク質の“フラグ
メント”、“突然変異体”、“変異体”、“縮重変異体”、“類似体”及び“相
同体”または“化学的誘導体”を包含する。“フラグメント”なる用語は、野生
型ヒトＨＧ３８の任意のポリペプチドサブセットを意味する。“突然変異体”な
る用語は、野生型の形態に実質的に同様であるが識別できる生物学的特徴を有し
ている分子を意味する。このような改変された特徴の非限定例としては、改変さ
れた基質結合性、改変された基質親和性及びヒトＨＧ３８もしくはヒトＨＧ３８
機能性誘導体の生物活性に影響を与える化学的化合物に対する改変された感受性
がある。“変異体”なる用語は、野生型完全タンパク質またはそのフラグメント
に実質的に同様の構造及び機能をもつ分子を意味する。分子が野生型ヒトＨＧ３
８様タンパク質に“実質的に同様”であるというとき、双方の分子は実質的に同
様の構造を有しているかまたは双方の分子は同様の生物活性を有している。従っ
て、２つの分子が実質的に同様の活性を有しているならば、これらの分子は、た
とえ一方の分子の構造が他方の分子中に見出されない場合にも、または、２つの
アミノ酸配列が同一でない場合であっても変異体であると考えられる。“類似体
”なる用語は、全長ヒトＨＧ３８タンパク質またはその生物活性フラグメントに
実質的に同様の機能をもつ分子を意味する。
【００５３】 ヒトＨＧ３８遺伝子またはコードされたタンパク質に関して本文中で使用され
た“多形性”ＨＧ３８は、不特定の集団中に対立遺伝子として天然に見出される
ＨＧ３８である。ＨＧ３８の多形性形態は本文中に開示された特定のヒトＨＧ３
８対立遺伝子とは異なるヌクレオチド配列を有し得る。しかしながら沈黙突然変
異があるので、多形性ＨＧ３８遺伝子は本文中に開示されたアミノ酸配列と同じ
アミノ酸配列または異なるアミノ酸配列をコードし得る。更に、ＨＧ３８の幾つ
かの多形性形態は、この形態を野生型受容体活性から識別する生物学的特徴を示
すであろう。この場合には、多形性形態は同時に突然変異体である。
【００５４】 タンパク質またはそのフラグメントが天然に見出される濃度の少なくとも約５
倍から１０倍の濃度で得られるとき、精製または単離されたと考える。タンパク
またはそのフラグメントが天然に見出される濃度の少なくとも約１００倍の濃度
で得られるとき、実質的に純粋であると考える。タンパクまたはそのフラグメン
トが天然に見出される濃度の少なくとも約１０００倍の濃度で得られるとき、本
質的に純粋であると考える。
【００５５】 プローブ及びプライマー 本文中に開示されたＨＧ３８受容体は組織特異的発現パターンを示す。従って
、本発明のポリヌクレオチドは組織タイピング用プローブとして使用できる。配
列１の全長配列または部分配列から成るポリヌクレオチドプローブはＨＧ３８
ＲＮＡを発現する組織を判定するために使用できる。１つの動物全体のＨＧ３８
ＲＮＡの時間及び組織に特異的な発現もポリヌクレオチドプローブを用いて研
究できる。ＨＧ３８受容体遺伝子の転写に対するモジュレーターの作用はこれら
のプローブの使用を介して研究できる。好ましいプローブは、ＨＧ３８のコーデ
ィング配列の少なくとも全長を有する一本鎖アンチセンスプローブである。また
、全長配列よりも短いがＨＧ３８のＤＮＡまたはＲＮＡに高度に特異的な配列を
含むプローブを使用するのが好ましい。
【００５６】 当業者がハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を決定するために標準技術を
使用でき、この技術を使用して、（平均サイズ約４０００ヌクレオチドまで制限
酵素で消化した）全ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロットからＨＧ３８をコードす
るＤＮＡを検出でき、しかも目視で検出可能な非特異的バックグラウンドハイブ
リダイゼーションが生じないならば、ヌクレオチドプローブはＨＧ３８のＤＮＡ
またはＲＮＡに“高度に特異的”である。目視で検出可能な非特異的バックグラ
ウンドハイブリダイゼーションが存在してもＨＧ３８ ＤＮＡの検出が可能であ
るならばプローブは特異的である。特異的プローブとして使用できる（１つまた
は複数の）配列の同定は、当業者に公知であり、ターゲット配列に特有であるか
またはターゲット配列に特異的もしくは高度に特異的な（１つまたは複数の）配
列の選択を含む。プローブとなるポリヌクレオチドが少なくとも約２５個のヌク
レオチド、より好ましくは約３０−３５個のヌクレオチドを有しているのが好ま
しい。プローブが長いほど、ＨＧ３８の遺伝子及びＲＮＡに対してより高度に特
異的であり、より緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で使用できると考えら
れる。プローブが長いほど、使用し易いが合成が難しく、合成収率は低下する。
プローブまたプライマーとして有用な配列１の内部の配列の例は、実施例１に示
したＨＧ３８プライマーシリーズである。しかしながら当業者は、これらが配列
１に由来するプローブまたはプライマーとして有用な配列のうちの少数の例でし
かないことを理解されるであろう。
【００５７】 ＨＧ３８に特有の配列または高度に特異的な配列を有するポリヌクレオチドは
増幅反応アッセイのプライマーとして使用できる。これらのアッセイは本文中に
記載のような組織タイピングに使用できる。更に、ＨＧ３８配列に由来のプライ
マーを使用する増幅反応は、細胞のＨＧ３８ ＤＮＡを出発鋳型として使用して
増幅ＨＧ３８ ＤＮＡを得るために使用できる。このようにして得られたＨＧ３
８ ＤＮＡは、ＨＧ３８の読み取り枠（ＯＲＦ）またはそのフランキング配列の
１つまたは複数のヌクレオチドが配列１とは違っているＨＧ３８の突然変異形態
また多形性形態である。この差異は、ＨＧ３８の無欠陥の天然発生対立遺伝子ま
たは欠陥形態に関連し得る。従って、本発明のポリヌクレオチドは、種々のＨＧ
３８遺伝子の対立遺伝子の同定または欠陥ＨＧ３８遺伝子の検出に使用できる。
【００５８】 当業界で公知の幾つかの任意の方法、特に、同位体、酵素、基質、化学発光、
電気化学発光、ビオチン−フレット対などの方法でプローブを標識し得る。この
ように標識されたプローブは、検出可能なシグナルを、直接に（例えば同位体）
もしくはハイブリダーゼーションで（フレット対）に発生するかまたは間接に化
学反応後（例えば化学発光）もしくは生化学反応後（例えば酵素−基質）に発生
するか、あるいは、検出可能なシグナルを直接もしくは間接に発生し得るストレ
プタビジン結合部分の結合後に発生し得る。プローブの標識及び検出可能なシグ
ナルの発生は当業界で公知である。
【００５９】 ＨＧ３８配列に対応する優勢な増幅産物を産生する増幅反応条件を決定するた
めに当業者が標準技術を使用できるならば、プライマーはＨＧ３８の増幅に特異
的である。バックグラウンド増幅産物が目視で検出可能でないならばプライマー
は高度に特異的である。
【００６０】 多くの種類の増幅反応が当業界で公知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅ
ｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，（１９９５），Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、鎖移
動増幅、独立配列反応及びプライマーを使用する当業者に公知の他の任意の増幅
反応がある。これらの反応または同様の反応はいずれも配列１に由来のプライマ
ーを使用し得る。
【００６１】 ポリヌクレオチドクローニング 本文中に提示したＨＧ３８ヌクレオチド及びアミノ酸の配列はＨＧ３８ポリヌ
クレオチドを単離及び／またはクローニングするために使用できる。ＨＧ３８を
クローニングするために種々の手順を任意に使用できる。これらの方法の非限定
例としては、（１）ＲＡＣＥ ＰＣＲクローニング技術（Ｆｒｏｈｍａｎら，１
９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８９９８−９００２）
。５′及び／または３′のＲＡＣＥを行って全長ｃＤＮＡ配列を作製できる。こ
の戦術では、ＨＧ３８ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用する。これらの遺伝子特異的プライマーは、任意の数の公的
利用可能な核酸及びタンパク質のデータベースを調査することによって同定した
発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定を介して設計される；（２）
適正な発現ベクター系中でＨＧ３８含有ｃＤＮＡライブラリーを構築した後でＨ
Ｇ３８ ｃＤＮＡを直接機能性発現させる方法；（３）バクテリオファージまた
はプラスミドシャトルベクター中で構築したＨＧ３８含有ｃＤＮＡライブラリー
をＨＧ３８タンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチド
プローブでスクリーニングする方法；（４）バクテリオファージまたはプラスミ
ドシャトルベクター中で構築したＨＧ３８含有ｃＤＮＡライブラリーをＨＧ３８
タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡでスクリーニングする方法。この部分的
ｃＤＮＡは、ＨＧ３８タンパク質に近縁の他の受容体（例えば、黄体形成ホルモ
ン、卵胞刺激ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンなどの受容体）の既知のアミノ酸
配列から縮重オリゴヌクレオチドプラスミドを設計することによってＨＧ３８
ＤＮＡフラグメントを特異的ＰＣＲ増幅させることによって得られる；（５）バ
クテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中で構築したＨＧ３８含有
ｃＤＮＡライブラリーをＨＧ３８タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡでスク
リーニングする方法。この戦術も、本文中に記載のＥＳＴとして同定されたＨＧ
３８ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを
使用する；または、（６）５′及び３′遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを配列
１を鋳型として設計し、公知のＰＣＲ技術で全長ｃＤＮＡを作製するかまたは同
じく公知のＰＣＲ技術でコーディング領域の一部分を作製してコーディング領域
の一部分を作製及び単離し、これらをプローブとして使用して多くの種類のｃＤ
ＮＡ及び／またはゲノムライブラリーをスクリーニングして、ＨＧ３８をコード
するヌクレオチド配列の全長形態を単離する。
【００６２】 他の種類のライブラリー及び他の種類の細胞または種から構築したライブラリ
ーがヒトＨＧ３８コーディングＤＮＡ、哺乳類ＨＧ３８同族体、または、ＨＧ３
８受容体ＤＮＡもしくはＲＮＡの突然変異形態もしくは多形性形態を単離するた
めに有用であることは当業者に容易に理解されよう。他の種類のライブラリーの
非限定例としては、ヒトの細胞または組織以外の、霊長類、ネズミ、齧歯類、ブ
タ及びウシの細胞またはＨＧ３８コーディングＤＮＡを含むその他の任意の脊椎
動物宿主などの細胞または細胞系に由来のｃＤＮＡライブラリーがある。更に、
霊長類、ネズミ、齧歯類、ブタ及びウシのゲノムライブラリーを非限定例とする
脊椎動物のゲノムライブラリー並びに随伴的ヒトゲノムＤＮＡライブラリーのオ
リゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーションスク
リーニングによってＨＧ３８遺伝子を単離できる。
【００６３】 ＨＧ３８受容体を発現する細胞または細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリー
を作製できることは当業者に容易に理解されよう。ＨＧ３８ ｃＤＮＡを単離す
るためのｃＤＮＡライブラリーの作製に使用する細胞または細胞系を選択するた
めには、先ずＨＧ３８用アッセイ、例えば本文中に記載の抗体を用いるアッセイ
またはＨＧ３８特異的プライマーを用いるＰＣＲアッセイを使用して細胞関連の
ＨＧ３８受容体を検出する。
【００６４】 ｃＤＮＡライブラリーの作製は当業界で公知の標準技術で行う。公知のｃＤＮ
Ａライブラリー構築技術は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。相補的ＤＮＡライブ
ラリーも多数の市販ソースから得られる。その非限定例としては、Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡがあ
る。
【００６５】 また、ＨＧ３８をコードするＤＮＡが適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単
離できることも当業者には容易に理解されよう。ゲノムＤＮＡライブラリーの構
築は当業界で公知の標準技術によって実施できる。公知のゲノムＤＮＡライブラ
リー構築技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，前出、に記載されている。
【００６６】 好ましい方法の１つによってＨＧ３８遺伝子をクローニングするためには、Ｈ
Ｇ３８または相同タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列が必要であろう。
これを得るためには、例えば本文中に教示した抗ＨＧ３８抗体及び全自動シーク
エネーターによって決定された（１つまたは複数の）部分的アミノ酸配列との交
差反応によってＨＧ３８または相同タンパク質を精製する。全アミノ酸配列を決
定する必要はなく、ＨＧ３８ ＤＮＡの部分的フラグメントをＰＣＲ増幅するた
めに６−８個のアミノ酸から成る２つの領域の直鎖状配列を決定すればよい。適
正アミノ酸配列の同定後、これらをコードし得るＤＮＡ配列を合成する。遺伝コ
ードが縮重性なので、１つのアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンを使
用でき、従って、アミノ酸配列は類似の縮重ＤＮＡオリゴヌクレオチドの任意の
セットによってコードされ得る。縮重セットの１つの配列だけはＨＧ３８配列に
一致するであろうがセットのその他の配列はミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌク
レオチドの存在下であってもＨＧ３８ ＤＮＡにハイブリダイズし得るであろう
。ミスマッチしたＤＮＡオリゴヌクレオチドはＨＧ３８をコードするＤＮＡを同
定及び単離できる程度には十分にＡＯＭＦ５ ＤＮＡにハイブリダイズできる。
あるいは、１つまたは複数の利用可能なゲノムデータベースを検索することによ
って発現配列の１つの領域のヌクレオチド配列を同定することもできる。ｃＤＮ
ＡライブラリーまたはｃＤＮＡ集団から得られた所望のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を
行うために遺伝子特異的プライマーを使用できる。本文中で指摘したように、Ｐ
ＣＲに基づく方法に使用する適正なヌクレオチド配列を配列１から得ることがで
き、これは、５′及び３′のオーバーラップＰＣＲ産物を単離してＨＧ３８をコ
ードする全長配列を作製する目的で使用でき、または、ＨＧ３８をコードするヌ
クレオチド配列の一部分を単離して１つまたは複数のｃＤＮＡもしくゲノムに基
づくライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用でき、ＨＧ３８タン
パク質もしくはＨＧ３８様タンパク質をコードする全長配列を単離し得る。
【００６７】 実施例１に使用した方法では、本発明のＨＧ３８全長ｃＤＮＡを、Ｒｅｄｕｃ
ｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＣＣＡ）と呼ば
れるｃＤＮＡスクリーニングの方法で作製した。簡単に説明すると、常用の２つ
の方法、即ち、標識プローブとのハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブ
ラリーのフィルタースクリーニング法、及び、ＰＣＲによる全細胞ｍＲＮＡとの
５′−及び３′−ＲＡＣＥ法の一方または双方を使用し、部分的ｃＤＮＡ配列の
伸長を従来の手順で行った。前者の方法は効率は高いが手間暇がかかり、後者の
方法は速いが効率が低い。このＲＡＣＥプロトコルは、全細胞ｍＲＮＡ集団を単
一反応に使用するので伸長の長さが限定されるという欠点がある。ＰＣＲでは同
じ反応中に小フラグメントのほうが大フラグメントよりもはるかに効率的に増幅
されるので、第二の方法を使用して得られるＰＣＲ産物はしばしば極めて小さい
。
【００６８】 ＲＣＣＡ法は、ｃＤＮＡライブラリーを先ず構築して二次分割し、次いでＰＣ
Ｒによって５′−及び３′−フランキングフラグメントを単離することによって
公知のｃＤＮＡライブラリースクリーニングを改良する方法である。各プールは
低度から中程度に発現されている所与の遺伝子の２つ以上のクローンを含む可能
性が少ないので、１つのプール中で大きいＰＣＲ産物と小さいＰＣＲ産物との競
合が存在せず、このため、異なるサイズのフラグメントを単離することが可能で
ある。本文中に記載の方法の１つの明白な利点は、オルタナティブスプライシン
グしたｃＤＮＡ形態を単離するための効率、スループット及び能力である。
【００６９】 ＲＣＣＡ法は、一次ｃＤＮＡライブラリーの二次分割及びポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅に基づいて部分的ｃＤＮＡ配列を高速で伸長させ
る。ランダムプライマー、オリゴ−ｄＴプライマーまたは両者の組合せによって
プライムしたｃＤＮＡによってｃＤＮＡライブラリーを構築し、次いでプールあ
たり約１０，０００−２０，０００のクローン（“スーパープール”）に二次分
割する。各スーパープールを個別に増幅するので、各スーパープールは出発ｍＲ
ＮＡソースから得られるｃＤＮＡ分子の独立部分を表す。全部のスーパープール
のサンプルを集めて、９６ウェルのプレートに移す。配列１のような部分的ｃＤ
ＮＡ配列を伸長させるためには、先ずｃＤＮＡ配列に相補的なプライマー対を使
用するＰＣＲによって、部分的ｃＤＮＡ配列を含む陽性プールを同定する。ライ
ブラリー中の陽性プールの各々は、ｃＤＮＡ配列の独立クローンを含んでおり、
部分的ｃＤＮＡ配列とそのフランキングフラグメントとが各クローンの内部に包
埋されている。既知のベクター及びｃＤＮＡ配列に相補的なプライマーを使用す
るＰＣＲによってフランキングフラグメントを単離し、次いで直接に配列決定す
る。これらのフラグメントから得られたＤＮＡ配列と出発部分的ｃＤＮＡ配列と
を連続フラグメントとして集成すると部分的ｃＤＮＡ配列が伸長され、完全読み
取り枠が得られるまで必要に応じて方法を繰り返すことによって最終的にはその
全長遺伝子配列を決定できる。
【００７０】 この方法の基本原理は、複雑なライブラリーを約１０，０００−約２０，００
０クローンのスーパープールに二次分割することである。組織中で発現されるｍ
ＲＮＡ転写物を殆ど網羅する十分に多い数である２００万の一次クローンのライ
ブラリーを１８８プールに二次分割し、２つの９６ウェルプレートに保存できる
。大抵の遺伝子の転写物の数は全細胞ｍＲＮＡ中の１０，０００以下の転写物あ
たり１コピーよりも少ないので、各プールが所与のｃＤＮＡ配列のクローンを２
つ以上含む可能性は少ない。このように複雑さが解消されるので、公知の方法に
よって得られるものよりも大きい部分的ｃＤＮＡ配列のフランキングフラグメン
トを単離することが可能になる。
【００７１】 当業者は本明細書の教示から、本文中に開示された遠大なｃＤＮＡクローニン
グ方法を理解されるであろう。ＥＳＴまたは他の部分的ｃＤＮＡ配列から得られ
た多数のプライマーの組合せは、フランキングベクタープライマーオリゴヌクレ
オチドと共に、内部遺伝子特異的配列及びそれぞれのプライマーを両方向で容易
に“ウォーキング”するために使用でき、その結果として全長ｃＤＮＡを表すｃ
ｏｎｔｉｇを構築できる。この手順は、全ｃＤＮＡライブラリーの代表的部分を
構成する多数プールをスクリーニングする能力に依存する。この手順は、指向性
クローニングされたインサートをもつｃＤＮＡライブラリーの使用に依存しない
。逆に、５′及び３′にベクタープライマー及び遺伝子特異的プライマーの双方
を付加し、ベクタープライマー及び遺伝子特異的プライマーの双方を使用した陽
性プールの追加のスクリーニングによってｃｏｎｔｉｇマップを構築する。勿論
、これらの遺伝子特異的プライマーは最初は発現配列ｔａｇのような既知の核酸
フラグメントから構築する。しかしながら、ウォーキングの継続に伴って、ｃＤ
ＮＡの新しく同定された領域の５′及び３′の境界から遺伝子特異的プライマー
が利用される。ウォーキングの継続に伴って、未同定フラグメントのベクターの
配向を知る必要がない。その代わりに、陽性プールにすべての組合せを試験し、
幾つかのベクタープライマー／遺伝子特異的プライマーが示した予測ＰＣＲフラ
グメント産生能力によってベクターの実際の配向を決定する。次に、公知のサブ
クローニング手順によって全長ｃＤＮＡを容易に構築できる。
【００７２】 別の種のＨＧ３８遺伝子の同族体の単離 ヒトＨＧ３８配列から設計したＰＣＲプライマーを使用し、所望の種のｃＤＮ
Ａから得られた遺伝子の部分でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
によって、マウス、ラット、イヌのような別の種のＨＧ３８遺伝子を単離する。
Ｍｅｔ及びＴｒｐのようなコドン縮重性の低いアミノ酸をコードする領域を選択
して３２−１２８倍の縮重性をもつ１７−２０ヌクレオチドのプライマーを設計
することによって縮重性ＰＣＲを行う。これらのプライマーを選択するときは、
タンパク質の保存領域が好ましい。ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列解析によって分析し
てヒトＨＧ３８に対する類似性を確認する。正しい産物を使用した高緊縮性のコ
ロニーまたはプラークハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングする。あるいは、ヒトＨＧ３８遺伝子に直接由来するプローブを
利用し、低緊縮性ハイブリダイゼーションによって異なる複数の種からＨＧ３８
のｃＤＮＡ配列を単離する。ｃＤＮＡライブラリーは当業界で公知の手順でまた
は本文中に記載の手順で作製できる。
【００７３】 トランスジェニック動物 本発明で使用されたトランスジェニック動物なる用語は、トランスジーン及び
遺伝子も意味する。本文中に使用された“トランスジーン”は遺伝子を含む遺伝
的構築物である。当業界で公知の方法でトランスジーンを動物またはその先代の
細胞の１つ以上の染色体に組込む。いったん組込まれたトランスジーンはトラン
スジェニック動物の染色体の少なくとも１つの場所に維持される。遺伝子はタン
パク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び／またはトランスジー
ンは更に、当業界で公知の遺伝調節要素及び／または構造要素を含む。
【００７４】 本文中に使用された“動物”なる用語は、ヒト以外のすべての哺乳動物を包含
する。この用語はまた、個々の動物の胚胎期及び胎内期を含む発生のすべての時
期を包含する。好ましくは動物は齧歯類であり、最も好ましくはマウスまたはラ
ットである。“トランスジェニック動物”は、マイクロインジェクションまたは
組換えウイルスの感染のような細胞下レベルの計画的な遺伝子操作によって直接
または間接に組込まれた遺伝情報を担う１つまたは複数の細胞を含む動物である
。導入されたＤＮＡ分子は染色体の内部に組込まれるか、または、染色体外部で
ＤＮＡを複製し得る。特に注釈がないかまたは動物に関する記述の文脈から理解
されるのでない限り、本文中に使用された“トランスジェニック動物”は、遺伝
情報が生殖細胞系に導入され、これによって該情報を後代に伝達する能力が与え
られたトランスジェニック動物を意味する。実際、後代がこのような遺伝情報の
幾つかまたは全部を有しているならば、これらの後代もまたトランスジェニック
動物である。遺伝情報は典型的には、トランスジェニック動物が含むトランスジ
ーンの形態で提示される。
【００７５】 ヒト以外の動物に組込まれた遺伝情報は、レシピエントが属する動物の種に外
来の情報またはレシピエントの特定個体のみに外来の情報である。後者の場合、
情報が改変されたりまたは天然型遺伝子とは異なる発現を示したりすることもあ
り得る。あるいは、改変または導入された遺伝子が天然型遺伝子を非機能性にす
るときは“ノックアウト”動物が得られる。
【００７６】 本文中に使用された“ ターゲット化遺伝子”または“ノックアウト”（ＫＯ ）トランスジーンは、非限定的に本文中に記載の方法のようなヒトの介在によっ
てヒト以外の動物の生殖細胞系に導入されたＤＮＡ配列である。本発明のターゲ
ット化遺伝子は、ヒト以外の動物の同系の内在対立遺伝子を特異的に改変するよ
うに設計された核酸配列を包含する。
【００７７】 改変されたＨＧ３８受容体遺伝子は宿主動物と同じ内在性受容体を完全にコー
ドする必要はない。また、その発現産物が小さく改変されても大きく改変されて
もよくまたは全く存在しなくてもよい。内在性ＨＧ３８受容体の非存在下のトラ
ンスジェニック動物体内で非天然型ＨＧ３８受容体を発現させるために使用する
場合には、改変されたＨＧ３８遺伝子が動物体内でヌル型“ノックアウト”表現
型を誘発するのが好ましい。しかしながら、より軽度に修飾されたＨＧ３８遺伝
子も有用であり、このような遺伝子も本発明の範囲に包含される。
【００７８】 トランスジーン導入用ターゲット細胞の典型は胚幹（ＥＳ）細胞である。ＥＳ
細胞は、着床前の胚をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養し胚に融合させて得られる（Ｍ．Ｊ
．Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｂｒａ
ｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌ
ｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９
０６９（１９８６）；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４
５−４４８（１９８６））。トランスジーンは、ＤＮＡトランスフェクション、
マイクロインジェクションまたはレトロウイルス介在形質導入のような種々の標
準的技術によってＥＳ細胞に効率よく導入できる。得られた形質転換ＥＳ細胞を
次に、ヒト以外の動物の胚盤胞に結合させる。次いで、導入されたＥＳ細胞を胚
に移植し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に組込ませる（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃ
ｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４（１９８８））。生殖細胞系
の形質転換体を生じた動物をスクリーニングする。これらを交配してトランスジ
ーンがホモ接合の動物を産み出す。
【００７９】 ターゲット化組換えイベント及び得られたノックアウトマウスの評価方法は当
業界で公知であり容易に使用し得る。このような方法の非限定例としては、ター
ゲット化対立遺伝子を検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション
、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）、並びに、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するためのウェスタンブロ
ットがある。
【００８０】 これらは治療目的に使用し得る（遺伝子治療に関しては後述する）。生物の細
胞内部に突然変異配列、対立遺伝子配列または変異配列が、特に相同な内在配列
に置換して存在するとき、該生物は、ＨＧ３８遺伝子の作用またはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏのコードされたポリペプチド及び／またはプロモーターの活性を調節する物
質または治療能力をもつことが証明された他の物質を試験及び／または研究する
ためのモデルとして使用され得る。
【００８１】 ＨＧ３８の発現 本発明はまた、本明細書に開示された実質的に精製された核酸分子を含む組換
えベクター並びに原核性及び真核性の組換え宿主に関する。
【００８２】 従って、本発明はまた、本文中に開示されたＨＧ３８及び生物学的等価物を発
現させる方法、組換え発現されたこれらの遺伝子産物を使用するアッセイ、これ
らの遺伝子産物を発現する細胞、これらの組換え形態を利用するアッセイの使用
によってモジュレーター、アゴニスト及び／またはアンタゴニストとして同定さ
れた化合物に関する。その非限定例は、受容体特にリガンド結合ドメインに直接
接触して作用するか、または、受容体と相互作用するリガンドに直接もしくは間
接に接触して作用するか、または、ＨＧ３８の転写もしくは翻訳に作用し、これ
によってＨＧ３８発現を調節する１つまたは複数の化合物または分子である。
【００８３】 宿主細胞中で組換えＨＧ３８を発現するために多様な発現ベクターを使用でき
る。本文中で、発現ベクターは、クローン化されたＤＮＡの転写及び適正宿主体
内でのそれらのｍＲＮＡを翻訳するために必要なＤＮＡ配列であると定義される
。このようなベクターは、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のよ
うな多様な宿主体内で真核性ＤＮＡを発現するために使用できる。特異的に設計
されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間でＤＮＡを
往復運搬（ｓｈｕｔｔｌｅ）し得る。適正に構築された発現ベクターは、宿主細
胞中の自律複製の複製起点と、選択可能マーカーと、少数の有用な制限酵素部位
と、高コピー数能力と活性プロモーターとを含んでいなければならない。プロモ
ーターは、ＤＮＡに結合しＲＮＡ合成を開始させることをＲＮＡポリメラーゼに
指令するＤＮＡ配列であると定義される。ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモ
ーターを強力プロモーターと呼ぶ。発現ベクターの非限定例は、クローニングベ
クター、修飾されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまた
はウイルスである。
【００８４】 組換えヒトＨＧ３８発現に好適な市販の哺乳類発現ベクターの非限定例は、ｐ
ｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵ
Ｓ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８及びｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８
−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（
ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅ
ｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵ
ＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）である
。
【００８５】 細菌細胞中で組換えヒトＨＧ３８を発現させるために種々の細菌性発現ベクタ
ーを使用できる。組換えヒトＨＧ３８発現に適した市販の細菌性発現ベクターの
非限定例は、ｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｌａ
ｍｂｄａ ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）である。
【００８６】 菌類細胞中で組換えヒトＨＧ３８を発現させるために種々の菌類細胞発現ベク
ターを使用できる。組換えヒトＨＧ３８発現に適した市販の菌類細胞発現ベクタ
ーの非限定例は、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００８７】 昆虫細胞中で組換え受容体を発現させるために種々の昆虫細胞発現ベクターを
使用できる。組換えヒトＨＧ３８発現に適した市販の昆虫細胞発現ベクターの非
限定例は、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）及びｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
【００８８】 ヒトＨＧ３８様タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、組換え
宿主細胞中でヒトＨＧ３８を発現させるために使用できる。組換え宿主細胞は原
核細胞でも真核細胞でもよく、その非限定例は、大腸菌のような細菌、酵母のよ
うな菌類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起原の細胞系を非限定例とす
る哺乳類細胞、ショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系を非限定例とする昆虫
細胞である。市販の好適な哺乳動物種に由来の細胞系の非限定例は、Ｌ細胞Ｌ−
Ｍ（ＴＫ-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３
Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５
８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １７１）及びＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０９）である。
【００８９】 発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合及び
電気穿孔などを非限定例とする多くの技術のいずれかを介して宿主細胞に導入で
きる。発現ベクター含有細胞を個々に分析して、ヒトＨＧ３８タンパク質を産生
するか否かを判断する。ヒトＨＧ３８を発現している細胞の同定は、抗ヒトＨＧ
３８抗体との免疫反応性、標識リガンド結合及び宿主細胞関連のヒトＨＧ３８活
性の存在を非限定例とする幾つかの手段によって行うことができる。
【００９０】 本文中に記載の方法で得られたクローン化ヒトＨＧ３８ ｃＤＮＡを、適当な
プロモーターと別の適正な転写調節要素とを含む発現ベクター（例えばｐｃＤＮ
Ａ３．１、ｐＱＥ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２及びｐＬＩＴＭＵＳ２８など）に
分子クローニングすることによって組換え発現させ、原核性または真核性の宿主
細胞に導入して組換えヒトＨＧ３８を産生し得る。このような操作技術は、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されており、公知であり当業者が容易に利用し得る
。
【００９１】 また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生した合成ｍＲＮＡを使用してヒトＨＧ３８ ＤＮ
Ａを発現させることもできる。合成ｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球
抽出物を非限定例とする種々の無細胞系にも効率よく翻訳され、カエル卵母細胞
へのマイクロインジェクションを非限定例とする細胞ベース系にも効率よく翻訳
されるが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００９２】 ヒトＨＧ３８を最適レベルで産生する（１つまたは複数の）ヒトＨＧ３８ ｃ
ＤＮＡ配列を決定するために、非限定的に以下のようなｃＤＮＡ分子を構築でき
る：ヒトＨＧ３８の全長読み取り枠を含むｃＤＮＡフラグメントとタンパク質の
特異的ドメインもしくはタンパク質の転位ドメインだけをコードするｃＤＮＡの
部分とを含む種々の構築物。全ての構築物は、ヒトＨＧ３８ ｃＤＮＡの５′及
び／または３′非翻訳領域を全く含まないかまたはその全部または一部を含むよ
うに設計できる。ヒトＨＧ３８の発現レベル及び活性は、これらの構築物を単独
でまたは組合せて適当な宿主細胞に導入した後で測定できる。最適な発現を生じ
るヒトＨＧ３８ ｃＤＮＡカセットを一過性アッセイで決定した後、このＨＧ３
８ ｃＤＮＡ構築物を、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び
酵母細胞を非限定例とする種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入
する。
【００９３】 宿主細胞中でＨＧ３８を発現させた後、ＨＧ３８ポリペプチドを回収し得る。
利用可能な幾つかのＨＧ３８タンパク質精製手順を適宜使用できる。限外濾過、
酸抽出、アルコール沈殿、塩分画化、イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、レシチンクロマトグラフィー、アフィニティ（例
えば抗体またはＨｉｓ−Ｎｉ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性もしくは親水
性相互作用に基づくクロマトグラフィーなどの方法を種々の組合せで併用するか
または単独使用することによって、ＨＧ３８タンパク質及びポリペプチドを細胞
溶解液もしくは抽出物またはならし培地から精製できる。幾つかの場合には、タ
ンパク質の変性及び再生段階を使用できる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣも有用である。最終バッファ組成を調節するためには透
析を使用し得る。
【００９４】 抗ＨＧ３８抗体 本発明はまた、本文中に開示されたヒトのＨＧ３８形態またはその生物活性フ
ラグメントに応答して増産されるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体に
関する。ＨＧ３８のＮＨ2−末端ドメインまたは細胞外インターメンブランドメ インのエピトープに対する抗体を増産させるのが特に好ましい。また、他の公知
の糖タンパク質ホルモン受容体タンパク質に対する相同性が最も少ないエピトー
プに対する抗体を増産させるのが好ましい。
【００９５】 表面にＨＧ３８を示す宿主細胞から採取したサンプルのＨＧ３８をウェスタン
ブロット法で検出できる条件を当業者が標準的技術を使用して決定できるならば
、抗体はＨＧ３８エピトープに特異的である。エピトープ次第でブロットは生ゲ
ルでもよくまたは変性ゲルでもよい。非特異的バックグラウンド結合が目視で検
出できないならば、抗体はＨＧ３８エピトープに高度に特異的である。また、非
ＨＧ３８ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がＨＧ３８に対する抗体との
結合に競合できないときも、抗体がＨＧ３８に高度に特異的であると考えてよい
。
【００９６】 組換えＨＧ３８タンパク質は、全長ＨＧ３８タンパク質またはＨＧ３８タンパ
ク質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体で作製されたイムノアフィニティカラムの使用によって他の細胞性タ
ンパク質から分離できる。更に、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
は、配列２に開示したようなタンパク質の一部分から得られた合成ペプチド（通
常は約９−約２５アミノ酸の長さ）に応答して増産され得る。ヒトＨＧ３８に対
する単一特異性抗体は、ヒトＨＧ３８に反応性の抗体を含む哺乳類坑血清から精
製されるか、または、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）の方法を使用してヒトＨＧ３８に反応性のモ
ノクローナル抗体として調製される。本文中に使用された単一特異性抗体という
用語は、ヒトＨＧ３８に対して均一な結合特性をもつ単一抗体種または多数抗体
種であると定義される。本文中に使用された均一な結合という表現は、本文中に
記載のヒトＨＧ３８関連の抗原またはエピトープのような特定の抗原またはエピ
トープに結合する抗体種の能力を意味する。適正濃度のヒトＨＧ３８タンパク質
またはヒトＨＧ３８の一部分から作製した合成ペプチドでマウス、ラット、モル
モット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫アジュバント添加または不添加で
免疫感作することによってヒトＨＧ３８特異的抗体が増産される。
【００９７】 初回免疫感作に先立ってプレ免疫血清を採取する。各動物に約０．１ｍｇ−約
１０００ｍｇのヒトＨＧ３８タンパク質を適格な免疫アジュバントと共に投与す
る。このような適格な免疫アジュバントの非限定例としては、フロインド完全ア
ジュバント、フロインド不完全アジュバント、明礬沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ及びｔＲＮＡを含む油中水型エマルジョンがある。
初回免疫感作では、皮下（ＳＣ）または腹腔内（ＩＰ）またはその双方の経路に
よって、好ましくはフロインド完全アジュバント中のヒトＨＧ３８タンパク質ま
たはそのペプチドフラグメントを多数部位に投与する。各動物から好ましくは毎
週一回の割合で定期的採血を行って、抗体価を測定する。初回免疫感作後の動物
に任意にブースター注射を投与し得る。ブースター注射する動物には通常、フロ
インド不完全アジュバント中の等量のヒトＨＧ３８を同じ経路で投与する。ブー
スター注射は最大抗体価が得られるまでほぼ３週おきに投与する。各ブースター
免疫感作の約７日後または一回の免疫感作後の週一回の割合で動物から採血し、
血清を集めて、アリコートを約−２０℃で保存する。
【００９８】 近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをヒトＨＧ３８タンパク質で免疫感作
することによってヒトＨＧ３８に反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生
させる。約０．５ｍｌのバッファまたは生理的食塩水中の約１ｍｇ−約１００ｍ
ｇ、好ましくは約１０ｍｇのヒトＨＧ３８タンパク質を本文中に記載したような
適格なアジュバントに混和してＩＰまたはＳＣ経路でマウスを免疫感作する。フ
ロインド完全アジュバントが好ましい。０日目にマウスを初回免疫感作し、約３
−約３０週間静置する。リン酸塩緩衝生理食塩水のようなバッファ溶液中の約１
−約１００ｍｇのヒトＨＧ３８を静脈内（ＩＶ）経路で１回または複数回投与し
て免疫マウスをブースター免疫感作する。当業界で公知の標準手順で免疫マウス
から脾臓を摘出し、抗体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を得る
。安定なハイブリドーマを形成し得る条件下で脾臓リンパ球胞を適当な融合相手
好ましくは骨髄腫細胞に混合し、ハイブリドーマ細胞を産生させる。融合相手の
非限定例は、マウスの骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１
９４及びＳｐ２／０であり、Ｓｐ２／０が好ましい。約３０％−約５０％濃度の
約１０００モル重量のポリエチレングリコール中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
を融合させる。当業界で公知の手順を使用しヒポキサンチン、チミジン及びアミ
ノプテリンを補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ
ることによって融合ハイブリドーマ細胞を選択する。約１４、１８及び２１日後
に増殖陽性ウェルから上清流体を収集し、ヒトＨＧ３８を抗原として使用する固
相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによって抗体産
生をスクリーニングする。また、ｍＡｂのアイソタイプを測定するために培養流
体をオクタロニー沈降アッセイで試験する。Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａ
ｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ所収のＭａｃＰｈｅｒ
ｓｏｎ，１９７３，Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載された軟
寒天法のような技術によって抗体陽性ウェルからハイブリドーマ細胞をクローニ
ングする。
【００９９】 プリスチンプライムしたＢａｌｂ／ｃマウスに、マウスあたり約０．５ｍｌの
量で約２×１０6−約６×１０6のハイブリドーマ細胞をプライミングの約４日後
に注入することによってモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏ産生させる。細胞
導入のほぼ８−１２日後に腹水を採集し、当業界で公知の技術によってモノクロ
ーナル抗体を精製する。
【０１００】 抗ヒトＨＧ３８ ｍＡｂをｉｎ ｖｉｔｒｏ産生するためには、約２％のウシ
胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させて十分な量の特異的
ｍＡｂを得る。当業界で公知の技術によってｍＡｂを精製する。
【０１０１】 腹水またはハイブリドーマ培養流体の抗体価を種々の血清学的または免疫学的
アッセイによって測定する。アッセイの非限定例は、沈降、受動凝集、エンザイ
ムリンクトイムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）法である。体液中または組織及び細胞の抽出物中のヒトＨＧ３８の存在
を検出するためにも同様のアッセイを使用できる。
【０１０２】 本文中に記載の単一特異性抗体の産生方法がヒトＨＧ３８ペプチドフラグメン
トまたは全長ヒトＨＧ３８の産生に利用できることは当業者に容易に理解されよ
う。
【０１０３】 例えば、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を添加することによっ
てヒトＨＧ３８抗体アフィニティカラムを作製できる。Ａｆｆｉｇｅｌ−１０は
、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体である。抗体はスペーサ
ーアームとのアミド結合を介してゲルに結合する。残留する活性化エステルを１
ＭのエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で反応停止させる。カラムを水及び０．
２３ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で順次洗浄して未結合の抗体または夾雑
タンパク質を完全に除去する。次に、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中
でカラムを平衡させ、全長ヒトＨＧ３８またはヒトＨＧ３８タンパク質フラグメ
ントを含む細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。次に、光
学密度（Ａ280）がバックグラウンドに低下するまでカラムをリン酸塩緩衝生理 食塩水で洗浄し、次いで０．２３Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）でタンパ
ク質を溶出させる。精製したヒトＨＧ３８タンパク質を次にリン酸塩緩衝生理食
塩水に透析する。
【０１０４】 宿主細胞中のヒトＨＧ３８のレベルを、イムノアフィニティ法及び／またはリ
ガンドアフィニティ法などを非限定例とする種々の技術によって定量する。ＨＧ
３８特異的アティニティビーズまたはＨＧ３８特異的抗体を使用して35Ｓ−メチ
オニン標識するかまたは未標識のＨＧ３８を単離する。標識したＨＧ３８タンパ
ク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。未標識のＨＧ３８タンパク質はウェスタン
ブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＲＩＡアッセイでＨＧ３８タンパク質特
異的抗体及び／または抗ホスホチロシン抗体を用いて検出する。
【０１０５】 ＨＧ３８のモジュレーター、アゴニスト及びアンタゴニスト。
【０１０６】 本発明はまた、ヒトＨＧ３８タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発
現を調節する化合物または分子のスクリーニング方法を目的とする。これらの活
性を調節する化合物または分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質また
は非タンパク質性有機分子でよい。これらは、ヒトＨＧ３８をコードするＤＮＡ
またはＲＮＡの発現を増進または減衰によって調節し得る。ヒトＨＧ３８をコー
ドするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現を調節する化合物またはその生物機能のアゴ
ニストもしくはアンタゴニストである化合物は多くのアッセイによって検出でき
る。アッセイは発現または機能の変化の有無を判定する単純な“イエス／ノー”
アッセイでよい。試験サンプル中の発現または機能のレベルと標準サンプル中の
発現または機能のレベルとを比較することによってアッセイを定量的にすること
ができる。ヒトＨＧ３８、ヒトＨＧ３８に対する抗体または修飾されたヒトＨＧ
３８を含むキットを公知のキット作製方法によって作製できる。
【０１０７】 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体はヒトＨＧ３８
のレベルをスクリーニング及び測定するために使用できる。組換えタンパク質、
ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体はヒトＨＧ３８の検出及びタイピングに好適な
キットの作製に適している。このようなキットは、少なくとも１つの容器を密閉
状態で保持するために好適な区画型キャリヤから成る。キャリヤは更に、組換え
ＨＧ３８または抗ＨＧ３８抗体のようなヒトＨＧ３８の検出に好適な試薬を収容
している。キャリヤはまた、標識抗原または酵素基質などのような検出手段を収
容している。
【０１０８】 医薬組成物 医薬として許容される担体との混合などの公知の方法に従って、ヒトＨＧ３８
のアゴニスト、アンタゴニストまたはモジュレーターを含む医薬的に有効な組成
物を調製できる。このような担体及び製剤方法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。医薬とし
て許容される組成物が有効な投与に適するように形成されたとき、このような組
成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ヒトＨＧ３８を含有するか
またはＨＧ３８のモジュレーター、アゴニストもしくはアンタゴニストを含有す
るであろう。
【０１０９】 本発明の治療用または診断用の組成物は障害を治療または診断するために十分
な量で個体に投与される。有効量は、個体の容態、体重、性別及び年齢などの種
々の要因に応じて変化し得る。他の要因としては投与形態がある。
【０１１０】 医薬組成物は、皮下、外用、経口及び筋肉内などの種々の経路によって個体に
供給できる。
【０１１１】 “化学誘導体”なる用語は、正規には基底分子の一部ではない追加の化学部分
を含む分子を意味する。このような部分は基底分子の溶解度、半減期、吸収など
を改善し得る。あるいは、このような部分は基底分子の望ましくない副作用を減
衰させたりまたは基底分子の毒性を低下させたりする。このような部分の例はＲ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなど
の種々の文献に記載されている。
【０１１２】 本文中に開示された方法に従って同定された化合物は適正な薬用量で単独使用
できる。あるいは、他の薬剤との同時投与または順次投与も所望し得る。
【０１１３】 本発明はまた、本発明の治療方法で使用するための適当な外用、経口、全身性
及び非経口の製剤を得る手段を提供する。本発明に従って同定された化合物また
は分子を有効成分として含む組成物は投与に好適な慣用のビヒクルを用いた多様
な治療用剤形で投与できる。例えば、化合物は、錠剤、カプセル剤（各々が、適
時放出製剤、持続放出製剤などを含む）、丸剤、散剤、粒剤、エリキシル剤、チ
ンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤及びエマルジョンのような経口剤形によ
ってまたは注射によって投与できる。同様に、静脈内（濃縮塊及び浸剤）、腹腔
内、皮下、任意に封鎖を伴う外用、または筋肉内形態で投与できる。いずれも製
薬業界の平均的な当業者に公知の形態である。
【０１１４】 有利にも、本発明の化合物は１日薬用量を一回で投与してもよく、または、１
日薬用量を２、３または４回に分割して投与してもよい。更に、本発明の化合物
は適当な鼻孔内ビヒクルの局所使用によって鼻孔内形態で投与してもよく、また
は平均的な当業者に公知の経皮貼布の形態を用いて経皮経路で投与することもで
きる。経皮的デリバリー系の形態で投与する場合には投薬計画期間を通じて投薬
が間欠的でなく連続的に行われる。
【０１１５】 ２種類以上の有効物質を用いる併用治療の場合、有効物質が個別に投与される
製剤であるときは、有効物質を同時に投与してもよくまた時間をずらせて各々を
個別に投与してもよい。
【０１１６】 本発明の化合物を使用する投薬計画は、患者の型（ｔｙｐｅ）、種（ｓｐｅｃ
ｉｅｓ）、年齢、体重、性別及び医学的障害、治療すべき障害の重篤度、投与経
路、患者の腎機能、肝機能または心血管機能、使用される特定化合物、などの種
々の要因に従って選択する。平均的な技量の医師または獣医師は、障害の予防も
しくは拮抗または障害の進行阻止に必要な薬剤の有効量を容易に決定かつ処方で
きる。毒性を伴うことなく薬効を発揮する範囲内の薬剤濃度を最適精度で与える
ためには、ターゲット部位による薬剤利用動態に基づく投薬計画が必要である。
これは、薬剤の配給、平衡及び排除に関する考慮も含む。
【０１１７】 以下の実施例は代表例であるが、他の種々の実施態様が当業者に明らかである
と考えられるので、本発明の範囲が以下の実施例によって限定されると解釈して
はならない。
【０１１８】 実施例１ ＨＧ３８受容体ｃＤＮＡの単離 ＨＧ３８受容体の部分的ｃＤＮＡの同定 ヒトＧタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体のポリペプチド配列をプ
ローブとして使用し、調査プログラムｔＦＡＳＴＡを使用してＮＣＢＩ（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ）のＥＳＴデータベースｄｂＥＳＴを調査した。選択した配列は、
既知のヒト受容体、即ち、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホ
ルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）の受容体のタンパク質配列であった。１つ
のＥＳＴ（登録番号＃ａａ４２４０９８）が、アミノ酸レベルでこれらの受容体
にほぼ３０％等しいポリペプチドをコードできることが知見された。４９３塩基
対の配列を含むこのＥＳＴを全ヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーから得られたクロ
ーン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．このクローンのＩＤ＝７５９９３６）の５′から配
列決定した。
【０１１９】 このＥＳＴのＤＮＡ配列情報を使用して出発ＥＳＴを含むｃＤＮＡフラグメン
トを単離した。次に、これらのフラグメントのＤＮＡ配列を決定し解析すると、
ＨＧ３８遺伝子の全長コーディング配列が同定された。次に、全長ｃＤＮＡ配列
を細菌ベクターにクローニングした。
【０１２０】 プライマー 以下のプライマーを使用して以下に記載の手順でＨＧ３８を単離した。便利で
判り易くするために、ここに配列番号を示す。以下の記載ではプライマーを数値
要素を含むそれぞれの指示記号で示す。
【０１２１】 ＨＧ３８．１７９Ｆ：ＴＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧ（配列３） ＨＧ３８．４３９Ｒ：ＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧ（配列４） ＨＧ３８．３７Ｆ：ＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧ（配列５
） ＨＧ３８．１１１Ｒ：ＣＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧ（配列
６） ＨＧ３８．７５５Ｆ：ＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＧＧＣ（配列
７） ＨＧ３８．１４４Ｆ：ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴ（配列
８） ＨＧ３８．３４１９：ＣＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＣ（配列
９） ＨＧ３８．９９ＦＳ：ＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣ（配列１０） ＰＢＳ．５４３Ｒ：ＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ（配列１１） ＰＢＳ．８７３Ｆ：ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ（
配列１２）。
【０１２２】 ＨＧ３８のクローニング及び配列決定 ＨＧ３８の全長配列を胎盤ｃＤＮＡライブラリーから多巡ＲＣＣＡ（本文中に
記載のＲｅｄｕｃｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）
によって単離した。各々が約４００万の一次クローンから成りオリゴｄＴでラン
ダムプライムした胎児脳、胎盤、精巣及び前立腺のｃＤＮＡライブラリーをプラ
スミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で構築した。各ライブラリーの一次クローンを、各プー
ルが約２０，０００のクローンを含む１８８のスーパープールに二次分割した。
各プールを個別に増幅し、得られたプラスミドプールを収集し、８個の９６ウェ
ルプレートに移した。９６ウェルプレートの各々を８個の“スーパープール”と
してプールし、４つのライブラリーを網羅した合計６４個のスーパープールを作
製した。
【０１２３】 ｃＤＮＡライブラリーのスーパープールの初期走査のために、ＨＧ３８ ＥＳ
Ｔ ａａ４２４０９８に特異的であると予測された５′及び３′のプライマー（
プライマー１７９Ｆ＋４３９Ｒ）及びベクターのポリリンカー配列の５′及び３
′のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーＰＢＳ．８７３Ｆ及びＰＢＳ．
５４３Ｒ）を使用した。標準ＰＣＲ条件下でＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒａｎｃｈｂｅｒｇ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ
）を酵素製造業者の指示通りに用いてＰＣＲ反応を行った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔプライマーとＨＧ３８ ＥＳＴ関連の５′及び３′プライマーとを用いて陽
性スーパープールをＰＣＲで再度走査した。
【０１２４】 スーパープールの走査後、同じプライマーセットを用いて胎盤ｃＤＮＡプラス
ミドライブラリーの組織特異的走査を実施した。陽性ウェルの同定後、陽性プー
ルから得られたベクターに以下のプライマー組合せを用いてインサート−ベクタ
ーＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した：１７９Ｆ＋ＰＢＳ．８７３Ｆ；
４３９Ｒ＋ＰＢＳ．５４３Ｒ。ＰＣＲで合成されたフラグメントを配列決定し連
続配列に集成した。
【０１２５】 新しい配列に基づいて、伸長反応のための３′及び５′ＨＧ３８プライマー７
５５Ｆ及び１４４Ｆを合成した。ＰＣＲ反応には以下のインサート−ベクタープ
ライマー組合せを使用した：７５５Ｆ＋ＰＢＳ．５４３Ｒ，７５５Ｆ＋ＰＢＳ．
８７３Ｆ；１４４Ｒ＋ＰＢＳ．５４３Ｒ，１４４Ｒ＋ＰＢＳ．８７３Ｆ。次に、
ＰＣＲ産物を配列決定し、先の配列と集成して連続配列を構築した。新しい配列
に基づいて、２つの新しいプライマー３７Ｆ及び１１１Ｒを設計し合成した。
【０１２６】 遺伝子の５′端に関する新しいプールを同定するために、これらの新しいプラ
イマーを使用して胎盤ｃＤＮＡプラスミドライブラリーを走査した。陽性プール
の同定後、インサート−ベクターＰＣＲを以下のプライマー組合せを用いて実施
した：１１１Ｒ＋ＰＢＳ．５４３Ｒ，１１１Ｒ＋ＰＢＳ．８７３Ｆ。ＰＣＲで合
成されたフラグメントを配列決定し連続配列に集成した。
【０１２７】 これらのすべての“ｒａｃｅ”ＰＣＲ及び配列決定反応から得られた結果とし
て４５５９塩基対の連続フラグメントの集合体が得られた。この配列は、配列２
及び図２に示す９０７アミノ酸のポリペプチドをコードする２８２４塩基対の読
み取り枠を含んでいた。２つのプライマー、ＨＧ３８−３４１９及びＨＧ３８−
９９ＦＳを設計し合成した。これらの２つのプライマーを使用してＨＧ３８の全
長コーディング領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングによってｐＣＲ
２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし
た。
【０１２８】 実施例２ ＤＮＡ分析 全長ＨＧ３８ ｃＤＮＡの配列を図１Ａ−１Ｃ（配列１）に示す。この受容体
のアミノ酸配列を図２（配列２）に示す。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）プログ
ラムを使用してＦＡＳＴＡ調査及び系統分類分析を実施した。分析は、ＨＧ３８
がＧタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ファミリーに属していることを
示した。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）のＰｅｐｐｌｏｔプログラムを使用して
ハイドロパシー分析を実施すると、ＨＧ３８がＧタンパク質共役受容体のロドプ
シンファミリーに典型的な７つのトランスメンブランドメインをもつことを示し
た。ドメインは配列２のアミノ酸約５５７で始まる。ＨＧ３８の推定されたポリ
ペプチド配列はタンパク質のＮ末端からシグナルペプチドを開裂する７つの部位
を含む（図４）。
【０１２９】 実施例３ ＨＧ３８の発現パターンの分析 多組織ノーザンブロット分析を以下のごとく実施した。既製のヒト多組織ノー
ザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）から購入した。合計６個のブロットを使用してヒト組織中のＨＧ３
８の発現を分析した。
【０１３０】 ランダムプライミング ＲＥＤＩＰＲＩＭＥ（登録商標）標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｉｎｃ．，
Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用したランダムプライミングによってＨＧ
３８ ｃＤＮＡのフラグメントを32Ｐで標識した。キットを製造業者のプロトコ
ルで使用して反応を惹起した。４５μｌのＨ2Ｏ中の約５０ｎｇのＤＮＡを３分 間煮沸し、次いで５分間で０℃まで速やかに冷却した。ＤＮＡ溶液をＲＥＤＩＰ
ＲＩＭＥ（登録商標）管に移し、管内の凍結試薬と混合した。次いで、５．０μ
ｌのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ（５０００Ｃｉ／ｍＭ以下）を添加し、管を３７℃で１
５分間インキュベートした。５．０μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を
添加することによって反応を停止させた。組込まれなかったヌクレオチドをスパ
ンカラムを用いたゲル濾過によって除去した。
【０１３１】 ノーザンハイブリダイゼーション ＨＧ３８ ＲＮＡのプローブとして標識フラグメントを使用した。膜の製造業
者Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従っ
てＣｌｏｎｔｅｃｈのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂバッファ中でハイブリダイゼーショ
ンを実施した。Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂバッファ中で穏やかに撹拌しながら膜を６
８℃で１時間プレハイブリダイズさせた。ＮａＯＨを最終濃度０．２Ｎまで添加
することによって32Ｐ標識プローブを変性し、次いでハイブリダイゼーション溶
液に添加した。ハイブリダイゼーションを６８℃で３分間行った。ハイブリダイ
ゼーションバッファから膜を取り出し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温で
１０分間の洗浄を一回行った。次に膜を０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０
℃で３０分間洗浄した。Ｐｈｏｓｐｈａｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ
ｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）でブロットを分析した。
【０１３２】 分析 ＨＧ３８転写物は、骨格筋、脊髄、胎盤及び脳の種々の領域で検出された（図
５）。ＨＧ３８の最高発現レベルは骨格筋、胎盤及び脊髄で観察された。脳の種
々の領域ではもう少し低い発現レベルが観察された。これらのすべての組織にお
いて、ＨＧ３８の多量転写物は５．０ｋｂ以下である。３．０ｋｂ以下の少量転
写物も多量転写物と共に検出された。
【０１３３】 実施例４ ＨＧ３８をコードするゲノムＤＮＡの単離 受容体をコードするヒトゲノムＤＮＡを単離するためにＨＧ３８ ｃＤＮＡを
プローブとして使用する。ｃＤＮＡは完全形態で使用してもよくまたは配列の一
部分を使用してもよい。１００ヌクレオチド未満の配列の一部分をプローブとし
て使用するときは、選択された配列がヒトＤＮＡ中で非反復であることを確認す
るためにヒト配列全般に対して選択プローブ配列の相同性分析を行う必要がある
。選択配列が多様なヒトＤＮＡ配列に高い相同性を示すならば、この配列はＨＧ
３８ゲノムＤＮＡに特異的なプローブとして十分に機能できない。例えば、Ｇタ
ンパク質共役受容体で高度に保存されているアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
の部分は使用できる。しかしながらこの場合、ＨＧ３８以外の複数の受容体遺伝
子が同定されると予想されるので、同定された多数のフラグメントを更に検査す
る必要があり、この検査後に、同定されたどのＤＮＡがＨＧ３８をコードしてい
るかを判断する必要があろう。これが、同定されたゲノムＤＮＡフラグメントを
配列決定し、その配列を本文中に提示されたＨＧ３８配列（配列１）に比較する
だけで遂行できるのである。
【０１３４】 プローブ配列の選択後、放射性同位体またはビオチンの組込みなどを非限定例
とする当業界で公知の任意の手段によってプローブを標識する。適正な緊縮性条
件下でプローブをヒトゲノムＤＮＡフラグメントのライブラリーにハイブリダイ
ズさせる。ターゲット配列に対するプローブの適正に特異的なハイブリダイゼー
ションを得るために、例えば塩濃度及び温度の変更のような当業界に公知の手段
によってハイブリダイゼーション反応の緊縮性を調節できる。プローブによって
同定されたフラグメントを配列決定するかまたは制限酵素消化で処理して、フラ
グメントがＨＧ３８ゲノムＤＮＡを含むことを確認する。
【０１３５】 同定されたフラグメントのいずれにも完全ゲノム遺伝子が含まれていないこと
もあり得る。この場合には完全遺伝子を単離するために、例えば同定されたフラ
グメントをプローブとして使用して染色体ウォーキングを行って染色体中でオー
バーラップする追加のフラグメントを単離する必要がある。オーバーラップする
フラグメントの単離が必要な場合には、公知のＤＮＡ操作方法を使用して完全Ｈ
Ｇ３８ゲノムＤＮＡをコードする連続形ＤＮＡフラグメントを構築するとよい。
【０１３６】 実施例５ トランスジェニック動物 ＨＧ３８をトランスジーンとして発現するトランスジェニック動物は以下のご
とく提供される。ＨＧ３８ヌクレオチド配列、例えば、全長ＨＧ３８受容体をコ
ードするｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチド、または、受容体の部分配列、コーディング配列のフランキング配列もし
くはその両方をコードするポリヌクレオチドを、動物のゲノムにポリヌクレオチ
ドを組込むベクターに結合させる。ＨＧ３８配列はヒトＨＧ３８に由来してもよ
くまたは動物のＨＧ３８に由来してもよい。
【０１３７】 この実施例で、トランスジーン導入用ターゲット細胞はマウス胚幹（ＥＳ）細
胞である。ＥＳ細胞は、着床前にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し胚に融合させた種々
のヒト以外の動物の胚から得られる（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２
９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ３０９：
２５５−２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９（１９８６）；及びＲｏｂｅｒ
ｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３２２：４４５−４４８（１９８６））。
【０１３８】 トランスジーンをマイクロインジェクションによってネズミＥＳ細胞に導入す
るが、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス介在形質導入のような
種々の標準的技術を使用し得る。注入されたＥＳ細胞を次に、ヒト以外の動物の
胚盤胞に結合させる。導入されたＥＳ細胞は胚に転移して増殖し、得られるキメ
ラ動物の生殖細胞系に組込まれる（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４０：１４６８−１４７４（１９８８））。生殖細胞系の形質転換が生じたキメ
ラマウスの個体をスクリーニングする。これらを交配してトランスジーンがホモ
接合の動物を産生させる。
【０１３９】 ターゲット化組換えイベント及びその結果得られるマウスを、ターゲット化対
立遺伝子を検出するＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、並びに、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するウェスタンブロットを非限定例とする当
業界で公知の技術によって評価する。
【０１４０】 トランスジーンベクターの構造次第で３つの基本型のトランスジェニック動物
が作製される。ベクターが全長ヒトＨＧ３８受容体をコードするヌクレオチド配
列を含み、動物の内在ＨＧ３８遺伝子以外の部位に組込まれるように設計されて
いるとき、得られるトランスジェニック動物は天然型ＨＧ３８受容体とヒトＨＧ
３８受容体との双方を発現するであろう。ベクターが同系ＨＧ３８遺伝子を含有
せず、動物の内在ＨＧ３８遺伝子の部位に組込まれるように設計されており、組
込み後の内在遺伝子が動物の機能性ＨＧ３８受容体を欠失させる程度まで改変さ
れている場合には、ノックアウト動物が作製される。最後に、ベクターが内在Ｈ
Ｇ３８遺伝子をヒト遺伝子によって置換するように設計されているかまたは内在
遺伝子の配列がヒト遺伝子のアミノ酸配列をコードするように変更されている場
合、即ちヒト化するように設計されている場合、得られる動物の天然型ＨＧ３８
受容体が欠失しヒトＨＧ３８受容体が発現される。ヒト遺伝子を有しており内在
遺伝子が欠失している動物はまた、第一の型の動物をノックアウト動物と交配し
、ノックアウトにホモ接合及び付加ヒトＨＧ３８遺伝子にホモ接合の動物を産生
させることによって得られる。ヒト遺伝子が内在ＨＧ３８遺伝子を含む染色体以
外の染色体に組込まれるならば、これは容易に得られるであろう。
【０１４１】 トランスジェニック動物は、ＨＧ３８の調節、活性化または阻害のアッセイに
使用される細胞及び組織のソースである。細胞を動物から採取し、細胞系として
樹立し、適宜培養維持する。
【０１４２】 実施例６ ＨＧ３８受容体のリガンドに関するアッセイ グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（“ＧＳＴ”）ＨＧ３８受容体融合構築
物。
【０１４３】 Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ＨＧ３８のＮ末端リガンド結合
ドメインの全部または一部分とＧＳＴ遺伝子のカルボキシ末端とのインフレーム
融合によってポリペプチド融合構築物を作製する。配列１−２の開示から、平均
的な当業者はＧＳＴ−ＨＧ３８融合タンパク質をコードする任意のこのような核
酸分子を構築し得る。特に、ＨＧ３８のＮ末端フラグメントの配列２のアミノ酸
約２２から約５５７までまたは約２２から終端までをコードするポリヌクレオチ
ドがＧＳＴのＣ末端に融合した融合物が構築される。
【０１４４】 可溶性の組換えＨＧ３８融合タンパク質は多様な発現系において発現し得る。
幾つかの発現系は本文中に記載されており、例えば、バキュロウイルス発現ベク
ター（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡまたはＰ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎのｐＡｃＧ２Ｔ）を使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞がある。
【０１４５】 次に、融合タンパク質をグルタチオンカラムに充填する。ＧＳＴのＣ末端ドメ
インはグルタチオンに結合し、ＨＧ３８のＮ末端領域がバッファ相に接触する。
カラムの洗浄後、ＨＧ３８受容体のリガンドを含み得るサンプルをカラムに通す
。サンプルは、精製または合成された細胞もしくは組織の抽出物、体液もしくは
体内の化合物もしくは分子でよい。サンプルをカラムに直接使用してもよくまた
は生理的条件に近いバッファに希釈または透析後に使用してもよい。受容体のリ
ガンドにＨＧ３８のＮ末端ドメインが結合する。カラムの洗浄後、リガンドを溶
出させる。このためには例えば、洗浄バッファ中のカラムにＮａＣｌの勾配を作
用させる。生物の抽出物または流体中に存在する未知のリガンドを化学的及び生
化学的な標準方法でキャラクタライズできる。この方法で同定されたリガンドを
ＨＧ３８受容体のアゴニストまたアンタゴニストのアッセイで候補として使用で
きる。
【０１４６】 また、ＨＧ３８のアゴニスト及びアンタゴニストに好適な後述のアッセイによ
ってリガンドアッセイを行うこともできる。アゴニストまたはアンタゴニストの
活性を示す候補化合物または分子は、ＨＧ３８のリガンドにもなり得る。
【０１４７】 実施例７ 受容体のアゴニスト及びアンタゴニストに関するアッセイ 組換え宿主細胞を使用するいかなるアッセイでも、本文中の他の箇所で記載し
たように最初に細胞を作製する必要がある。簡単に説明すると、本発明のポリヌ
クレオチドを使用して適当な細胞を形質転換もしくはトランスフェクトするか、
または、適当なトランスジェニック動物から細胞を採取して培養する。
【０１４８】 黒色素胞系 黒色素胞スクリーニング系は１９９２年２月６日公開の国際特許ＷＯ９２／０
１８１０に記載されている。簡単に説明すると、Ｇタンパク質受容体ＨＧ３８を
発現させるために黒色素胞にトランスフェクトする。アンタゴニストに関するア
ッセイでは、形質転換した黒色素胞を活性リガンド及び候補化合物の双方に接触
させる。リガンドによって発生されるシグナルの阻害は、候補化合物が受容体の
潜在的なアンタゴニストであることを示す指標となる。アゴニストに関するアッ
セイでは、細胞を複数の候補化合物と接触させ、どの化合物が受容体を活性化し
てシグナルを発生させるかを判定する。受容体の活性化は、候補化合物が受容体
の潜在的なアゴニストであることを示す指標となる。
【０１４９】 哺乳類アデニル酸シクラーゼを発現する酵母 哺乳類アデニル酸シクラーゼを発現する酵母を使用するスクリーニング方法は
１９９５年１１月９日公開の国際特許ＷＯ９５／３００１２に記載されている。
これらの酵母は適正なＧタンパク質の存在下でＨＧ３８受容体を同時発現するよ
うに操作できる。アンタゴニストに関するアッセイでは、形質転換した酵母をＨ
Ｇ３８の活性リガンドと候補化合物との双方に接触させる。リガンドによって発
生されるシグナルの阻害は、候補化合物が受容体の潜在的なアンタゴニストであ
ることを示す指標となる。アゴニストに関するアッセイでは、細胞を複数の候補
化合物と接触させ、どの化合物が受容体を活性化してシグナルを発生させるかを
判定する。受容体の活性化は、候補化合物が受容体の潜在的なアゴニストである
ことを示す指標となる。
【０１５０】 酵母フェロモンタンパク質代用物のスクリーニング １９９４年１０月１３日公開の国際特許ＷＯ９４／２３０２５に記載されてい
るように、フェロモン系タンパク質代用物を産生するように操作された酵母は、
同系の酵母フェロモン受容体に代替し得る代用物の能力をスクリーニングするた
めに使用できる。この方法では一般に、Ｇタンパク質共役受容体ＨＧ３８をフェ
ロモン経路にリンクさせたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
中で該受容体を発現させる。この系では一般に酵母Ｇａサブユニットが欠失して
哺乳類Ｇａタンパク質で置換されており、その結果として哺乳類Ｇタンパク共役
受容体が酵母フェロモン経路に共役する。ランダム配列のペプチドを発現し得る
プラスミドライブラリーに属するプラスミドを適当な酵母菌株に導入する。ＨＧ
３８受容体のアゴニストリガンドをコードするクローンを、フェロモン経路の刺
激に基づいて選択する。ＨＧ３８受容体のアンタゴニストリガンドをコードする
クローンを、ＨＧ３８アゴニストの存在下のフェロモン経路の阻害に基づいて選
択する。あるいは、化学物質を直接試験することによって化学物質ライブラリー
をそのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に基づいてスクリーニングして
もよい。
【０１５１】 ホスホリパーゼ二次シグナルスクリーニング 別のスクリーニング方法では、ホスホリパーゼＣまたはＤに結合されているＨ
Ｇ３８受容体を発現させる。ＣＨＯ、内皮、胚性腎などの細胞及びその他の細胞
を使用できる。他のスクリーニングと同様に、ホスホリパーゼ二次シグナルの活
性化もしくは阻害または受容体の活性化を検出することによってリガンド及び候
補化合物をアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に基づいてスクリーニング
する。異種ホスホリパーゼを発現する酵母細胞を使用するこのような系の一例が
１９９６年１２月１９日公開の国際特許ＷＯ９６／４０９３９に記載されている
。
【０１５２】 酵母二ハイブリッド系 Ｇタンパク質共役受容体ＨＧ３８を発現する酵母二ハイブリッド系を受容体の
アゴニスト及びアンタゴニストに関するスクリーニングに使用できる（Ｆｉｅｌ
ｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）
。より特定的には、Ｇタンパク質共役受容体の細胞外ドメインの全体または部分
を転写因子Ｇａｌ４またはＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインに融合させ得る。これ
らの構築物を発現する酵母細胞を使用し、Ｇタンパク質共役受容体と相互作用す
る分子のスクリーニングを、前出の文献（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，１
９８９）に記載された二ハイブリッドスクリーニング法の標準プロトコルを使用
して行う。このような分子は受容体の潜在的なアゴニストまたアンタゴニストを
表す。
【０１５３】 実施例８ 受容体のモジュレーターに関するアッセイ 受容体のモジュレーターとなる化合物または分子を記載のアッセイまたは以下
の記載に従って検出し得る。受容体の細胞外ドメインに特異的な抗体を標準的技
術によって産生させる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。ア
ッセイを容易に行うためには、受容体の細胞外ドメインに対する抗体の親和性は
好ましくは少なくとも１０6、より好ましくは少なくとも１０8でなければならな
い。受容体を発現させる細胞培養物を準備する。細胞培養物は、受容体を天然に
発現するもの、受容体遺伝子を含む発現ベクターによって安定にまたは一過性に
トランスフェクトされた細胞系、または、受容体遺伝子を含むトランスジーンを
有するトランスジェニック動物に由来の細胞系でよい。
【０１５４】 培養物の２つのサンプルをアッセイに使用する。一方のサンプルを対照として
使用し、プラシーボ、即ち、アッセイで受容体の調節作用を全く生じないと判定
された化合物または分子で処理する。第二のサンプルはモジュレーター候補で処
理する。処理後または処理中の種々の時点で培養物を一部採取する。次に抗体を
使用して細胞の表面に存在する量の受容体を定性及び定量する。これは、125Ｉ 、金、酵素または他の公知のラベルで検出可能に標識した抗体を使用する当業界
で公知の多数の技術によって行うことができる。あるいは、第一抗体に特異的な
第二抗体を検出可能なラベルで標識してもよい。潜在的なモジュレーターで処理
した細胞に見出される受容体の量を、対照細胞に見出される受容体の量に定量的
及び定性的に比較する。処理細胞と対照細胞との差異が、被験化合物が受容体の
モジュレーターであるか否かを示す指標となる。
【０１５５】 代替形のアッセイでは、本文中に記載のように細胞を処理し、次いで処理細胞
及び対照細胞中に存在する受容体を単離する。受容体調製物を未精製の細胞抽出
物、細胞膜もしくは細胞内画分として調製するか、または、クロマトグラフィー
、沈殿または親和性に基づく単離段階のような精製段階後に調製する。未精製ま
たは部分的もしくは高度に精製された受容体の調製物の受容体含量を例えば受容
体特異的抗体を使用して分析する。
【０１５６】 いずれのアッセイにおいても、異なるシリーズのアッセイの結果を互いに比較
できるように内部対照を作製するのが有利であろう。アッセイに使用される細胞
中に比較的一定の量で存在し受容体に近縁でない細胞タンパク質を内部対照とし
て使用できる。
【０１５７】 実施例９ 化合物が受容体に結合できるか否かを判断するアッセイ 本発明は、ＨＧ３８タンパク質に特異的に結合する化合物の同定方法及びこの
ような方法によって同定される化合物を包含する。ＨＧ３８タンパク質に親和性
を有する化合物の結合特異性は、クローン化受容体を発現する組換え細胞または
これらの細胞から得られた膜に対する化合物の親和性を測定することによって示
される。クローン化受容体を発現させ、ＨＧ３８タンパク質に結合する化合物、
または、これらの細胞もしくはこれらの細胞から調製した膜に対するＨＧ３８の
既知の放射性標識リガンドの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法は
、ＨＧ３８タンパク質に高い親和性をもつ化合物の迅速な選択方法を提供する。
このようなリガンドは必ずしも放射性標識しなくてもよく、結合した放射性標識
化合物に置換するために使用できるかまたは機能アッセイでアクチベーターとし
て使用できる非放射能性化合物でもよい。本発明の方法によって同定される化合
物はＨＧ３８のアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が大きく、ペプチ
ド、タンパク質または非タンパク質性有機分子である。
【０１５８】 従って、本発明は、ＨＧ３８のアゴニスト及びアンタゴニストを同定し得るア
ッセイを包含する。他の受容体のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法
は当業界で公知であり、ＨＧ３８のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するた
めに応用できる。従って、本発明は、候補化合物がＨＧ３８の潜在的なアゴニス
トであるかアンタゴニストであるかを判断するために、 （ａ）ＨＧ３８タンパク質をコードする発現ベクターを細胞にトランスフェク
トする段階と、 （ｂ）トランスフェクトした細胞をＨＧ３８タンパクが発現するために十分な
時間増殖させる段階と、 （ｃ）候補化合物の存在下及び非存在下でＨＧ３８タンパク質の標識リガンド
に細胞を接触させる段階と、 （ｄ）ＨＧ３８タンパクに対する標識リガンドの結合を測定する段階と、から
成り、標識リガンドの結合量が候補化合物の存在下では候補化合物の非存在下よ
りも少ないならば候補化合物はＨＧ３８タンパク質の潜在的なアゴニストまたは
アンタゴニストであると判断する方法を提供する。
【０１５９】 方法の段階（ｃ）の実施条件は、タンパク質−リガンド相互作用を研究するた
めに当業界で典型的に使用される条件であり、例えば、生理的ｐＨ、ＰＢＳのよ
うな常用のバッファまたは組織培養培地によって示される塩条件；約４℃−約５
５℃の温度を用いる。
【０１６０】 本発明はまた、候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合できるか否か、即ち、
候補化合物がＨＧ３８タンパク質の潜在的なアゴニストであるかまたはアンタゴ
ニストであるかを判断する方法を含む。方法は： （ａ）細胞中でＨＧ３８タンパク質の発現を指令する発現ベクターを細胞にト
ランスフェクトすることによって試験細胞を準備する段階と、 （ｂ）試験細胞を候補化合物に接触させる段階と、 （ｃ）ＨＧ３８タンパク質に対する候補化合物の結合量を測定する段階と、 （ｄ）試験細胞中のＨＧ３８タンパク質に対する候補化合物の結合量をＨＧ３
８タンパク質をトランスフェクトしなかった対照細胞に対する候補化合物の結合
量に比較する段階と、 から成り、候補化合物の結合量が試験細胞中では対照細胞中よりも多いならば、
候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合できると判断する。候補化合物が実際に
アゴニストであるかアンタゴニストであるかを判断するためには、本文中に記載
の無差別のＧタンパク質の使用を含むアッセイのような機能アッセイを使用する
。
【０１６１】 方法の段階（ｂ）の実施条件は、タンパク質−リガンド相互作用を研究するた
めに当業界で典型的に使用される条件であり、例えば、生理的ｐＨ、ＰＢＳのよ
うな常用のバッファまたは組織培養培地によって示される塩条件；約４℃−約５
５℃の温度を用いる。
【０１６２】 本文中に記載の方法の特定実施態様においては、細胞は真核細胞である。別の
実施態様においては、細胞は哺乳類細胞である。他の実施態様においては、細胞
はＬ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３），Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴ ＣＣ ＣＣＬ １．２），２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３），Ｒａｊｉ（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６），ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０），ＣＯＳ−１
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０），ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）
，ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１），３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２
），ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８），ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ２），Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６），ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ ２６）またはＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）である。
【０１６３】 本文中に記載のアッセイは、ＨＧ３８タンパク質を一過性にまたは安定にトラ
ンスフェクトした細胞を用いて実施できる。トランスフェクションは、ＨＧ３８
タンパク質を試験細胞に導入するための当業界で公知の任意の方法を意味する。
例えば、トランスフェクションとしては、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシ
ウム介在トランスフェクション、リポフェクション、ＨＧ３８タンパク質含有レ
トロウイルス構築物の感染及び電気穿孔がある。
【０１６４】 ＨＧ３８に対する候補化合物即ちアゴニストの結合を測定する場合、標識候補
化合物即ちアゴニストを使用することによってこのような結合を測定できる。候
補化合物即ちアゴニストは当業界で公知の好都合な標識、例えば放射性標識、蛍
光標識、酵素標識できる。
【０１６５】 本文中に記載の方法の特定実施態様においては、ＨＧ３８タンパク質が配列２
のアミノ酸配列を有している。
【０１６６】 本文中に記載の方法を変形し、試験細胞を候補化合物に接触させるのでなく、
試験細胞から膜を調製し、これらの膜を候補化合物に接触させるようにしてもよ
い。細胞に代替して膜を使用するこのような変法は当業界で公知であり、例えば
Ｈｅｓｓら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
１８４：２６０−２６８に記載されている。
【０１６７】 従って、本発明は、候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得るか否かを判
断するために、 （ａ）細胞中でＨＧ３８タンパク質の発現を指令する発現ベクターを細胞にト
ランスフェクトすることによって試験細胞を準備する段階と、 （ｂ）試験細胞からＨＧ３８タンパク質を含む膜を調製し、膜をＨＧ３８タン
パク質のリガンドに、リガンドが膜中のＨＧ３８タンパク質に結合するような条
件下で接触させる段階と、 （ｃ）段階（ｂ）の後または段階（ｂ）と同時に試験細胞から調製した膜を候
補化合物に接触させる段階と、 （ｄ）候補化合物の存在下及び非存在下の膜中のＨＧ３８タンパク質に対する
リガンドの結合量を測定する段階と、 （ｅ）膜中のＨＧ３８タンパク質に対するリガンドの結合量を候補化合物の存
在下及び非存在下で比較する段階と、 から成り、候補化合物の存在下の膜中のＨＧ３８タンパク質に対するリガンドの
結合量の減少を、候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得る指標とする方法
を提供する。
【０１６８】 本発明は、候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得るか否かを判断するた
めに、 （ａ）細胞中でＨＧ３８タンパク質の発現を指令する発現ベクターを細胞にト
ランスフェクトすることによって試験細胞を準備する段階と、 （ｂ）試験細胞からＨＧ３８タンパク質を含む膜を調製し、試験細胞から調製
した膜を候補化合物に接触させる段階と、 （ｃ）試験細胞から調製した膜中のＨＧ３８タンパク質に対する候補化合物の
結合量を測定する段階と、 （ｄ）試験細胞から調製した膜中のＨＧ３８タンパク質に対する候補化合物の
結合量をＨＧ３８タンパク質をトランスフェクトしなかった対照細胞細胞から調
製した膜に対する候補化合物の結合量に比較する段階と、 から成り、試験細胞から調製した膜中のＨＧ３８タンパク質に対する候補化合物
の結合量が対照細胞細胞から調製した膜に対する候補化合物の結合量よりも多い
ならば候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得ると判断する方法を提供する
。
【０１６９】 実施例１０ 遺伝子治療用のＨＧ３８配列の使用 例えば生物活性ＨＧ３８ポリペプチド標品またはその機能性フラグメントをコ
ードする本発明の核酸は、活性ポリペプチドを合成できないかまたは正常レベル
には合成できない患者を治療するために遺伝子治療方法で使用でき、これによっ
て野生型によって与えられる効果を与え、１つまたは複数の別の疾病の１つ以上
の症状も治療及び／または予防する目的を果たす。
【０１７０】 異なる多様な種類のターゲット細胞に遺伝子を導入するためにウイルスベクタ
ーのようなベクターが使用されている。典型的には、ベクターをターゲット細胞
に接触させて、所望のポリペプチドの発現によって有効な治療効果または予防効
果を得るために十分な割合の細胞にトランスフェクションを生じさせる。トラン
スフェクトされた核酸は各ターゲット細胞のゲノムに永久的に組込まれ、長期持
続効果を与え得る。そうでなければ治療を定期的に反復しなければならない。
【０１７１】 ウイルスベクター及びプラスミドベクターも含めて種々のベクターが当業界で
公知である。例えば米国特許ＵＳ５，２５２，４７９及び国際特許ＷＯ９３／０
７２８２参照。特に、アデノウイルス、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワ
クシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶのようなヘルペスウイルス、テナガザル白
血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス、モロニー
ねずみ白血病ウイルス及びねずみ乳腫瘍ウイルスのようなレトロウイルス、など
の多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されている。多くの遺伝子治
療プロトコルでは、ねずみの無力化レトロウイルスを使用している。
【０１７２】 無力化ウイルスベクターは感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子が発現さ
れるヘルパー細胞系で産生される。ヘルパー細胞系では一般に、ウイルスゲノム
をパッケージするメカニズムによって認識される配列が欠失しており、核酸非含
有ビリオンが産生される。完全形（ｉｎｔａｃｔ）パッケージングシグナルをデ
リバリー対象遺伝子またはその他の配列（例えば、ＨＧ３８ポリペプチドをコー
ドする配列またはそのフラグメント）と共に含むウイルスベクターをヘルパー細
胞中で感染性ビリオン粒子内にパッケージし、次いで、このビリオン粒子を遺伝
子デリバリーに使用し得る。
【０１７３】 核酸を細胞に導入する他の公知の方法としては、電気穿孔、リン酸カルシウム
共沈、並びに、マイクロインジェクション、リポソーム介在導入、ＤＮＡ直接吸
収、受容体介在ＤＮＡ導入のような機械的技術がある。リポソームは、細胞にデ
リバリーすべきＲＮＡ、ＤＮＡ及びビリオンを閉じ込める。ｐＨ、イオン強度及
び存在する二価カチオンのような要因次第で、リポソームの組成を特定の細胞ま
たは組織のターゲッティングに応じて調節できる。リポソームはリン脂質でもよ
く、脂質及びステロイドでもよく、このような各成分の組成を改変し得る。また
、リポソームをターゲッティングするために、抗体またはその結合フラグメント
、タンパク質、糖または糖脂質のような特異的結合対を使用してもよい。
【０１７４】 ポリペプチドまたはその活性部分をコードする核酸を使用する遺伝子治療の目
的は、野生型ポリペプチドが存在しないかまたは極めて低レベルでしか存在しな
い細胞中で核酸の発現産物の量を増加させることである。このような処置は、治
療的でも予防的でもよく、特に、疾病関連ＨＧ３８対立遺伝子の存在がスクリー
ニングまたは試験によって判明し従って疾病素因のあることが判明した個体の処
置に好適である。
【０１７５】 同様の技術を、遺伝子発現のアンチセンス調節のために使用できる。例えば、
突然変異形態の遺伝子が発現されている細胞にアンチセンス核酸をターゲッティ
ングして、突然変異遺伝子産物の産生を抑制する目的を果たす。遺伝子の特異的
ダウンレギュレーションを行う他の方法は当業界で公知であり、例えば、特異的
核酸配列を開裂するように設計されたリボザイムの使用がある。リボザイムは、
ｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを所定の配列で特異的に開裂しそれらの特異性を
操作できる核酸分子、実際にはＲＮＡである。ハンマーヘッド型リボザイムが好
ましい。何故ならこのリボザイムは、長さ約１１−１８塩基の塩基配列を認識で
きるので、長さ約４塩基の配列を認識するテトラヒメナ型リボザイムよりも大き
い特異性を有するからである。しかしながら、後者の型のリボザイムも当業者が
認めるような幾つかの状況では有用である。リボザイムの使用に関する参考文献
としては、Ｍａｒｓｃｈａｌｌら，１９９４，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４（５）：５２３；Ｈａｓｓｅ
ｌｈｏｆｆ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５及びＣｅｃｈ，１９８８
，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０がある。
【０１７６】 実施例１１ ＨＧ３８受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの構築 ＨＧ３８受容体タンパク質の全長アミノ酸配列を配列２に示す。ＨＧ３８のア
ミノ酸配列をコードする読み取り枠を含む天然型ヒトｃＤＮＡ配列を配列１に示
す。遺伝コードが縮重性をもつので、配列１の読み取り枠の配列は、ＨＧ３８の
のアミノ酸配列をコードできる多くのヌクレオチド配列の一例にすぎない。平均
的な当業者は遺伝コードに精通しており、分子生物学の標準的技術を使用して配
列２に示したアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする代替的なヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを作製できるであろう。
【０１７７】 代替的なヌクレオチド配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物でも
よく、または、本文中に記載のヌクレオチド間に代替的な結合を有していてもよ
い。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ＨＧ３８受容体をコードするｃＤＮＡポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列（配列１）を概略的に示す。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＨＧ３８受容体をコードするｃＤＮＡポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列（配列１）を概略的に示す。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、ＨＧ３８受容体をコードするｃＤＮＡポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列（配列１）を概略的に示す。
【図２】 ＨＧ３８受容体タンパク質の全長アミノ酸配列（配列２）を一文字コードで概
略的に示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、ＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列
１のヌクレオチド３−３３００）とＨＧ３８読み取り枠（配列２）の翻訳とを概
略的に示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列
１のヌクレオチド３−３３００）とＨＧ３８読み取り枠（配列２）の翻訳とを概
略的に示す。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、ＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列
１のヌクレオチド３−３３００）とＨＧ３８読み取り枠（配列２）の翻訳とを概
略的に示す。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、ＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列
１のヌクレオチド３−３３００）とＨＧ３８読み取り枠（配列２）の翻訳とを概
略的に示す。
【図３Ｅ】 図３Ｅは、ＨＧ３８をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列
１のヌクレオチド３−３３００）とＨＧ３８読み取り枠（配列２）の翻訳とを概
略的に示す。
【図４】 ＨＧ３８タンパク質の６個の予測シグナルペプチド開裂部位を示す。図示の６
個の配列はそれぞれ、一文字コードで表す配列２のアミノ酸９−５１，１２−５
４，２８−７０，１３−５５，１１−５３及び８−５０である。
【図５Ａ】 図５Ａは、ＨＧ３８受容体遺伝子の発現の多組織ノーザンブロット分析を表す
。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ＨＧ３８受容体遺伝子の発現の多組織ノーザンブロット分析を表す
。
【図５Ｃ】 図５Ｃは、ＨＧ３８受容体遺伝子の発現の多組織ノーザンブロット分析を表す
。
【図５Ｄ】 図５Ｄは、ＨＧ３８受容体遺伝子の発現の多組織ノーザンブロット分析を表す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 バリイ，ウエンデイー・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 マクドナルド，テレンス・ピー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 AA35 BB05 BB14 BB20 CB01 CB17 CB21 DA13 DA36 FB02 FB05 FB08 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 CA04 CA07 DA02 EA02 EA04 FA02 GA12 HA20 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR33 QR56 QR59 QR76 QR77 QR80 QS36 QX02 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA79X AA87X AA90X AA93Y AB01 BA02 BA04 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチドと、 （ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的なポリヌクレオチドと、 （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）の多形性形態を表すポリヌクレオチドと、 （ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の少なくとも２０個のヌ
    クレオチドから成り、前記２０個のヌクレオチドがＨＧ３８遺伝子に高度に特異
    的であるようなポリヌクレオチドと、 から成るグループから選択される単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、天然、非天然または修飾ヌクレオチド
    から成るグループから選択されたヌクレオチドから成る請求の範囲第１項に記載
    のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチド間結合が、天然結合及び非天然結合から成るグ
    ループから選択される請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列１の全ヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項に記載
    のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 配列１の読み取り枠のヌクレオチド配列を少なくとも含む請
    求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 ヒトゲノムＤＮＡの配列を有する請求の範囲第１項に記載の
    ポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 ヒトＲＮＡの配列を有する請求の範囲第５項に記載のポリヌ
    クレオチド。
  8. 【請求項８】 配列２のアミノ酸約２２から約５５７までのアミノ酸配列を
    もつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項に記載
    のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベク
    ター。
  10. 【請求項１０】 請求の範囲第９項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 （ａ）請求の範囲第９項に記載の発現ベクターを適当な宿
    主細胞に導入する段階と、 （ｂ）前記発現ベクターから前記ＨＧ３８タンパク質を発現させ得る条件下で
    段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階と、 から成る組換え宿主細胞内でＨＧ３８タンパク質を発現させる方法。
  12. 【請求項１２】 （ａ）配列２のアミノ酸配列をもつポリペプチドと、 （ｂ）配列２のアミノ酸約２２から約５５７までの少なくとも１つのアミノ酸
    配列をもつポリペプチドと、 （ｃ）配列２のアミノ酸約２２からほぼ終端までの少なくとも１つのアミノ酸
    配列をもつポリペプチドと、 （ｄ）ポリペプチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の多形性形態を表すポリペプ
    チドと、 から成るグループから選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリ
    ペプチド。
  13. 【請求項１３】 候補化合物または分子が請求の範囲第１２項に記載のポリ
    ペプチドのアゴニストであるか否かを判断する方法であって、 （ａ）請求の範囲第１２項に記載のポリペプチドをその表面に発現する細胞を
    準備し、前記ポリペプチドを、アゴニストがポリペプチドに結合するときに検出
    可能なシグナルを提供する第二成分に結合しておく段階と、 （ｂ）前記細胞を候補に結合し得る十分な条件下で化合物または分子に接触さ
    せる段階と、 （ｃ）前記第二成分によって発生されたシグナルを検出することによって候補
    がアゴニストであるか否かを判断する段階とから成る方法。
  14. 【請求項１４】 前記第二成分がＧタンパク質であり、前記検出可能シグナ
    ルが前記Ｇタンパク質によるＧＴＰの開裂であることを特徴とする請求の範囲第
    １３項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 候補化合物または分子が請求の範囲第１２項に記載のポリ
    ペプチドのアンタゴニストであるか否かを判断する方法であって、 （ａ）請求の範囲第１２項に記載のポリペプチドをその表面に発現する細胞を
    準備し、前記ポリペプチドを、アンタゴニストがポリペプチドに結合するときに
    検出可能なシグナルを提供する第二成分に結合しておく段階と、 （ｂ）前記細胞を候補に結合し得る十分な条件下で化合物または分子に接触さ
    せる段階と、 （ｃ）前記第二成分によって産生されたシグナルを検出することによって候補
    がアンタゴニストであるか否かを判断する段階とから成る方法。
  16. 【請求項１６】 前記第二成分がＧタンパク質であり、前記検出可能シグナ
    ルが前記Ｇタンパク質によるＧＴＰの開裂不能であることを特徴とする請求の範
    囲第１５項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ＨＧ３８受容体の突然変異形態または多形性形態をコード
    するポリヌクレオチドを単離する方法であって、 （ａ）ＨＧ３８ポリヌクレオチドに高度に特異的な検出可能プローブを準備す
    る段階と、 （ｂ）ヒト配列をもつポリヌクレオチドを含むサンプルを準備する段階と、 （ｃ）前記プローブと前記サンプルとを、ＨＧ３８受容体の突然変異形態また
    は多形性形態をコードするポリヌクレオチドと前記プローブとのハイブリダイゼ
    ーションに十分な条件下で接触させる段階と、 （ｄ）プローブ−ポリヌクレオチドハイブリッドを検出する段階と、 （ｅ）ＨＧ３８受容体の突然変異形態または多形性形態をコードするポリヌク
    レオチドを単離する段階と、 から成る方法。
  18. 【請求項１８】 請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチドを有するトラ
    ンスジーンを含むトランスジェニックマウス。
  19. 【請求項１９】 内在性ネズミＨＧ３８受容体遺伝子のノックアウトを更に
    含む請求の範囲第１８項に記載のマウス。
  20. 【請求項２０】 前記ネズミＨＧ３８受容体遺伝子がヒト化されていること
    を特徴とする請求の範囲第１９項に記載のマウス。
  21. 【請求項２１】 哺乳類ＨＧ３８に特異的な抗体。
  22. 【請求項２２】 候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得るか否かを判
    断する方法であって、 （ａ）ＨＧ３８タンパク質の細胞内発現を指令する発現ベクターを宿主細胞に
    トランスフェクトすることによって試験細胞を準備する段階と、 （ｂ）試験細胞を候補化合物に接触させる段階と、 （ｃ）ＨＧ３８タンパク質に結合した候補化合物の量を測定する段階と、 （ｄ）試験細胞内のＨＧ３８タンパク質に結合した候補化合物の量をＨＧ３８
    タンパク質でトランスフェクトしなかった対照細胞に結合した候補化合物の量に
    比較することによって候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得るか否かを判
    断する段階とから成る方法。
  23. 【請求項２３】 候補化合物がＨＧ３８タンパク質に結合し得るか否かを判
    断する方法であって、 （ａ）ＨＧ３８タンパク質の細胞内発現を指令する発現ベクターを宿主細胞に
    トランスフェクトすることによって試験細胞を準備する段階と、 （ｂ）試験細胞からＨＧ３８タンパク質を含む膜を調製し、試験細胞から調製
    した膜を候補化合物に接触させる段階と、 （ｃ）試験細胞から調製した膜中のＨＧ３８タンパク質に結合した候補化合物
    の量を測定する段階と、 （ｄ）試験細胞から調製した膜中のＨＧ３８タンパク質に結合した候補化合物
    の量をＨＧ３８タンパク質でトランスフェクトしなかった対照細胞から調製した
    膜に結合した候補化合物の量に比較することによって候補化合物がＨＧ３８タン
    パク質に結合し得るか否かを判断する段階とから成る方法。
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