JP2002536989A

JP2002536989A - ガラニン受容体と類似したｇタンパク質共役受容体

Info

Publication number: JP2002536989A
Application number: JP2000601127A
Authority: JP
Inventors: ハワード，アンドリユー・デイー; オニール，ギヤリー・ピー; オダウド，ブライアン; ジヨージ，スーザン
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2002-11-05
Also published as: EP1157097A4; EP1157097A2; WO2000050563A9; WO2000050563A3; WO2000050563A2; CA2364988A1

Abstract

(57)【要約】新規なＧタンパク質共役受容体ＧＰＲ５４をコードするヒト及びラットのＤＮＡ、並びに該ＤＮＡによりコードされるタンパク質が提供される。ＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の領域本発明は、ガラニン（ｇａｌａｎｉｎ）受容体と関連したＧタンパク質共役受
容体（ＧＰＣＲ）ＧＰＲ５４をコードする新規なヒト及びラットのＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡによりコードされるタンパク質、並びに該ＤＮＡによりコードされるタンパ
ク質の選択的なアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法に関する。

【０００２】発明の背景Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞の外側から内側へと情報を中継
する、膜受容体の極めて大きいクラスである。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質として
知られている異種三量体タンパク質のクラスと相互作用することにより機能する
。大部分のＧＰＣＲが、類似したメカニズムにより機能する。アゴニストと結合
すると、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質のαサブユニットからのグアノシン二リン酸
（ＧＤＰ）の解離を触媒する。これにより、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がα
サブユニットに結合できるようになり、その結果、β及びγサブユニットからα
サブユニットが解離する。次いで、遊離したαサブユニットが、他の細胞成分と
相互作用し、その過程で、アゴニストの存在により表された細胞外シグナルを伝
達する。遊離したβ及びγサブユニットが、アゴニストシグナルを伝達する場合
もある。

【０００３】ＧＰＣＲは、共通の構造的特徴を有する。それらは、様々な長さの親水性アミ
ノ酸配列により連結された、それぞれ約２０〜３０アミノ酸長の７個の疎水性ド
メインを有する。これらの７個の疎水性ドメインは、原形質膜に挿入されており
、タンパク質は、７個の膜貫通ドメイン、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキ
シ末端を有することとなる（Ｓｔｒａｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：１０１−１３２；Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６２：７７０−７７２ｌ；Ｄｏｈｌｍａ
ｎｅｔａｌ．，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６５３
−６８８）。

【０００４】ＧＰＣＲは、極めて多様な組織型において発現されており、広範囲のリガンド
、例えばタンパク質ホルモン、生体アミン、ペプチド、脂質由来メッセンジャー
等に対して応答する。発現及びリガンドが広範囲であることから、ＧＰＣＲが多
くの病理学的状態に関与していることは驚くべきことではない。このため、薬理
学的に使用されうるＧＰＣＲ活性の調節因子を開発することに、大きな関心が寄
せられている。例えば、Ｓｔａｄｅｌｅｔａｌ．，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４３０−４３７の表１には、ＧＰＣＲに
作用する異なる市販薬が３７種列挙されている。従って、ＧＰＣＲ機能を理解し
、ＧＰＣＲ活性を調節するために使用されうる薬剤を開発することが、非常に必
要とされている。

【０００５】ガラニンは、中枢及び末梢の神経系に広範に分布している。大部分の種のガラ
ニンは、カルボキシ末端がアミド化された２９アミノ酸からなるペプチドである
。ヒトガラニンは、それよりも長く３０アミノ酸であり、アミド化されていない
という特色を有する。ガラニン配列の強い保存が存在し、アミノ末端の１５残基
は全ての種で完全に保存されている。ガラニンの免疫反応性及び結合は、視床下
部、青斑、海馬及び下垂体前葉、並びに脊髄部、膵臓及び胃腸管に多く存在する
。視床下部の室傍核（ＰＶＮ）へガラニンを注射すると、飽和ラットにおける摂食
が用量依存的に増加する。ガラニンは炭水化物摂取を増強しうるが、研究は、ガ
ラニンが脂質摂取を大きく増加させることを示している。ガラニンは、多量栄養
素の好みを炭水化物から脂質へとシフトさせることが示唆されている。摂食を増
加させる同様のガラニン注射が、エネルギー消費を減少させ、インスリン分泌を
阻害する。遺伝的肥満ラットの視床下部においては、痩せている同腹ラットと比
較してガラニン発現が増強されている。ペプチドガラニン受容体アンタゴニスト
をＰＶＮへと注射すると、ガラニン特異的な脂質摂取増加の誘導が遮断される。
特異的ガラニンアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＶＮへと注射すると、脂質
摂取及び総カロリー摂取の減少を伴ってガラニン発現が特異的に減少するが、タ
ンパク質又は炭水化物の摂取にはほとんど影響がない。従って、ガラニンは、脂
質摂取行動に関する神経化学的マーカーとなりうると考えられ、ガラニン受容体
は、肥満及びその他の摂食障害を治療するための薬物を開発するための魅力的な
標的である。

【０００６】ガラニンは、ラットにおいて、コリン作用性機能を阻害し、作業記憶に障害を
与える。コリン作用性ニューロンを破壊する傷害は、空間的学習過程の欠陥をも
たらす。局所投与されたアセチルコリン（ＡＣｈ）はこの欠陥の一部を回復させ
るが、ガラニンは、このＡＣｈにより媒介される改善を遮断する。アルツハイマ
ー病に罹患した脳の生検試料からの証拠は、基底核のガラニン作用性（ｇａｌｉ
ｎｅｒｇｉｃ）神経支配が増加していることを示唆している。このように、ガラ
ニン作用の過剰活性がアルツハイマー病における認識能力の衰退に寄与している
のであれば、ガラニンアンタゴニストは、認識障害の緩解において治療的に有用
であるかもしれない。

【０００７】ガラニンが関与しているその他の生理学的過程には、痛覚伝達（Ｖｅｒｇｅ
ｅｔａｌ．，１９９３，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４９：１９３−１９
７）及び性的行動（Ｂｅｎｅｌｌｉｅｔａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．２６０：２７９−２８２）が含まれる。ラットにおいて、脳室内、皮下又は静脈内へガラニンを投与すると、血漿成長
ホルモンが増加する。ヒトガラニンの健常者への注入も、血漿成長ホルモンを増
加させ、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）に対する成長ホルモンの応答を
強く増強する。

【０００８】ガラニンレベルは、脊髄神経節において特に高い。座骨神経切除は、ガラニン
のペプチド及びｍＲＮＡのレベルを劇的にアップレギュレートする。軸索切断後
にガラニン受容体アンタゴニスト（Ｍ３５、Ｍ１５）を慢性的に投与すると、疼
痛に対する応答であると一般的に考えられている、ラットの自己断節行動が顕著
に増加する。横断された座骨神経の近心側端部へ、ガラニンに特異的なアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを適用すると、ガラニンペプチドレベルの増加が抑制さ
れ、平行して自切が増加した。くも膜下注射されたガラニンは、モルヒネと共同
作用し、無痛を生じるが、このモルヒネの抗痛覚伝達効果はガラニン受容体アン
タゴニストにより遮断される。このように、ガラニンアゴニストは、神経痛の軽
減において、ある程度有用であるかもしれない。

【０００９】アデニル酸シクラーゼ活性の阻害、Ｌ型Ｃａ^＋＋チャネルの閉口及びＡＴＰ感
受性Ｋ^＋チャネルの開口に対するガラニンの作用は、百日咳毒素感受性Ｇ_ｉ／Ｇ _ｏタンパク質と共役した少なくとも３種の高親和性ガラニン受容体により媒介さ
れる（Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，，ＵＳＡ９１：９７８０−９７８３；Ｈｏｗａ
ｒｄｅｔａｌ．，１９９７，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４０５：２８５−２９０
；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１
９４９−３１９５２；Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ７１：２２３９−２２５１）。^１２５Ｉ−ガラニンの特異的
結合（およそ１ｎＭのＫｄ）が、ガラニン免疫反応の局在部位と平行した区域、
即ち海馬、腹側海馬、基底前脳、脊髄、膵臓及び下垂体において証明されている
。大部分の組織において、アミノ末端（ＧＡＬ１〜１５）が、抗親和性受容体結
合及びアゴニスト活性にとって十分である。

【００１０】ガラニン受容体ｃＤＮＡは、ヒトボーズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色種細胞系からの発
現クローニングにより単離された（Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉ，ｅｔａｌ．
，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，，ＵＳＡ９１：９７８
０−９７８３）。この受容体ＧＡＬＲ１は、ヒトの胎児脳及び小腸に発現してい
るが、それ以外の分布についてはほとんど不明である。Ｇａｌ（１〜１６）は、 ^１２５Ｉ−ブタガラニンとＣＯＳ細胞において一過性発現されたこの受容体との
結合の阻害剤として、ｐＧＡＬ（３〜２９）よりも少なくとも１，０００倍活性
が高い。この受容体サブタイプが、ガラニン特異的摂食行動を媒介する視床下部
受容体を表しているか否かは、未だ決定されていない。ガラニン受容体は、いくつかの国際特許公報（ＷＯ９８／０３５４８；ＷＯ９７
／４６６８１；ＷＯ９７／２６８５３；ＷＯ９８／２９４３９；ＷＯ９８／２９
４４０；ＷＯ９８／２９４４１；ＷＯ９５／２２６０８）に記載されている。欧
州特許出願ＥＰ７１１８３０も、ガラニン受容体について記載している。

【００１１】この生物学的系をさらに特徴決定し、ガラニン受容体サブタイプに選択的なア
ゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用することができるよう、さら
なるガラニン受容体を同定することが望ましいであろう。

【００１２】発明の概要本発明は、Ｇタンパク質共役受容体ＧＰＲ５４をコードする新規なヒト及びラ
ットのＤＮＡに関する。ＧＰＲ５４をコードするＤＮＡは、他の核酸を実質的に
含まず、かつ配列番号：１（ヒトＧＰＲ５４）及び配列番号：２（ラットＧＰＲ
５４）として示されたヌクレオチド配列を有する。該新規ＤＮＡ配列によりコー
ドされるＧＰＲ５４タンパク質も提供される。ＧＰＲ５４タンパク質は、他のタ
ンパク質を実質的に含まず、かつ配列番号：３（ヒトＧＰＲ５４）及び配列番号
：４（ラットＧＰＲ５４）として示されたアミノ酸配列を有する。組換え系にお
いてＧＰＲ５４を発現させる方法、並びにＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴ
ニストを同定する方法が、提供される。

【００１３】図面の簡単な説明図１Ａ〜Ｂは、ヒトＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す
図である。示されたＤＮＡ配列は配列番号：１である。示されたアミノ酸配列は
配列番号：３である。

【００１４】図２Ａ〜Ｂは、ラットＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を示
す図である。

【００１５】図３は、ヒトＧＰＲ５４の完全なアミノ酸配列（配列番号：３）を示す図であ
る。

【００１６】図４は、ラットＧＰＲ５４の完全なアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図で
ある。

【００１７】図５Ａ〜Ｂは、ラットＧＰＲ５４のオープンリーディングフレームの位置を示
す図である。示されたヌクレオチド配列は（配列番号：２）である。示されたア
ミノ酸配列は（配列番号：４）である。

【００１８】図６は、ラット脳におけるラットＧＰＲ５４ｍＲＮＡのノーザンブロットの
結果を示す図である。各レーンは、様々な組織から単離されたポリ（Ａ）^＋ＲＮ
Ａ５μｇを含有していた。

【００１９】図７Ａ〜Ｄは、ＧＰＲ５４受容体ｍＲＮＡの局在を示す、ラット脳の矢状断面
及び冠状断面の暗視野（ｄａｒｋｆｉｅｌｄ）オートラジオグラフである。図７
Ａは、０．９ｍｍにおける代表的側面を示している。ブレグマとの相対レベルで
−３．３ｍｍ（図７Ｂ）、−３．８ｍｍ（図７Ｃ）及び−６．３ｍｍ（図７Ｄ）
の代表的な断面も示されている。Ａｃｏ＝扁桃皮質核（ｃｏｒｔｉｃａｌｎｕ
ｃｌｅｕｓｏｆｔｈｅａｍｙｇｄａｌａ）；Ａｈｙ＝視床下部前野（ａｎ
ｔｅｒｉｏｒｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃａｒｅａ）；Ａｒｃ＝視床下部弓状
核（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃａｒｃｕａｔｅｎｕｃｌｅｕｓ）；ＩＣ＝下
丘（ｉｎｆｅｒｉｏｒｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）；ＣＡ，アンモン角野（ｆｉｅ
ｌｄｏｆＡｍｍｏｎ’ｓｈｏｒｎ）；ＤＧ，歯状回（ｄｅｎｔａｔｅｇ
ｙｒｕｓ）；ＤＭ，視床下部背内側核（ｄｏｒｓｏｍｅｄｉａｌｈｙｐｏｔｈ
ａｌａｍｉｃｎｕｃｌｅｕｓ）；ＬＣ，青斑（ｌｏｃｕｓｃｏｅｒｕｌｅｕ
ｓ）；ＬＨ，視床下部外側部（ｌａｔｅｒａｌｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃａ
ｒｅａ）；ＬＨｂ，外側手綱核（ｌａｔｅｒａｌｈａｂｅｎｕｌａｒｎｕｃ
ｌｅｕｓ）；ＭｅＡ，扁桃内側核（ｍｅｄｉａｌｎｕｃｌｅｕｓｏｆｔｈ
ｅａｍｙｇｄａｌａ）；ＭＰＯ，内側視索前野（ｍｅｄｉａｌｐｒｅｏｐｔ
ｉｃａｒｅａ）；ＭＲＮ，中脳網様核（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃｒｅｔ
ｉｃｕｌａｒｎｕｃｌｅｕｓ）；ＰＡＧ，水道周囲灰白質（ｐｅｒｉａｑｕｅ
ｄｕｃｔａｌｇｒａｙ）；ＰＢ，傍小脳脚核（ｐａｒａｂｒａｃｈｉａｌｎ
ｕｃｌｅｕｓ）；ＰＦ，傍繊維束視床核（ｐａｒａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｔｈ
ａｌａｍｉｃｎｕｃｌｅｕｓ）；ＰＨ，視床下部後核（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ
ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃｎｕｃｌｅｕｓ）；ＰＭＶ，腹側乳頭前核（ｖｅｎ
ｔｒａｌｐｒｅｍａｍｍｉｌｌａｒｙｎｕｃｌｅｕｓ）；ＰＯ，一次嗅覚皮
質（ｐｒｉｍａｒｙｏｌｆａｃｔｏｒｙｃｏｒｔｅｘ）；ＲＳｐ１，板状筋
後皮質（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌｃｏｒｔｅｘ）；ＳＣ，上丘（ｓｕｐｅ
ｒｉｏｒｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）；ＳＨｙ，視床下部中隔核（ｓｅｐｔｏｈｙ
ｐｏｔｈａｌａｍｉｃｎｕｃｌｅｕｓ）；ＶＴＡ，腹側被蓋野（ｖｅｎｔｒａ
ｌｔｅｇｍｅｎｔａｌａｒｅａ）；ＺＩ，不確帯（ｚｏｎａｉｎｃｅｒｔ
ａ）。

【００２０】図８は、ＧＰＲ５４（配列番号：４）のアミノ酸配列と、ラットＧＡＬＲ１（
配列番号：５）、ラットＧＡＬＲ２（配列番号：６）、ラットＧＡＬＲ３（配列
番号：７）及びラットオピオイド受容体ＤＯＲ（配列番号：８）のアミノ酸配列
とのアラインメントを示す図である。

【００２１】図９は、ラットＧＰＲ５４（配列番号：４）のアミノ酸配列とヒトＧＰＲ５４
（配列番号：３）のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。

【００２２】発明の詳細な説明以下は、本発明の目的のための記載である。

【００２３】「他のタンパク質を実質的に含まない」とは、他のタンパク質を少なくとも９
０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．９％
含まないことを意味する。従って、他のタンパク質を実質的に含まないＧＰＲ５
４タンパク質調製物は、その全タンパク質中の割合として、１０％以下、好まし
くは５％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の非Ｇ
ＰＲ５４タンパク質を含有する。あるＧＰＲ５４タンパク質調製物が他のタンパ
ク質を実質的に含まないか否かは、例えば適切な検出法、例えば銀染色又はイム
ノブロッティングと併用されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のような、従来のタンパク質純度査定技術により
決定されうる。

【００２４】「他の核酸を実質的に含まない」とは、他の核酸を少なくとも９０％、好まし
くは９５％、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．９％含まないこと
を意味する。従って、他の核酸を実質的に含まないＧＰＲ５４ＤＮＡ調製物は
、その全核酸中の割合として、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましく
は１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の非ＧＰＲ５４核酸を含有する。あ
るＧＰＲ５４ＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないか否かは、例えば適
切な検出法、例えば臭化エチジウム染色と併用されたアガロースゲル電気泳動の
ような従来の核酸純度査定技術により、又は配列決定により、決定されうる。

【００２５】「機能的等価物」とは、選択的スプライシング、置換、欠失、突然変異又は付
加のため天然に存在するＧＰＲ５４と正確に同一のアミノ酸配列を有してはいな
いが、ＧＰＲ５４と実質的に同一の生物学的活性を保持している受容体を意味す
る。そのような機能的等価物は、天然に存在するＧＰＲ５４との有意なアミノ酸
配列同一性を有するであろう。そのような機能的等価物をコードする遺伝子及び
ＤＮＡは、天然に存在するＧＰＲ５４をコードするＤＮＡ配列を用いた低ストリ
ンジェンシーハイブリダイゼーションにより検出されうる。本発明の目的のため
、天然に存在するＧＰＲ５４とは、配列番号：３又は配列番号：４として示され
たアミノ酸を有する。機能的等価物をコードする核酸は、ヌクレオチド配列レベ
ルで、少なくとも約５０％の配列番号：１又は配列番号：２との同一性を有する
。

【００２６】あるポリペプチドが、配列番号：３又は配列番号：４を有するＧＰＲ５４のＫ _ｄよりも最大５倍大きいリガンドに対するＫ_ｄを有する場合、そのポリペプチド
は、ＧＰＲ５４と「実質的に同一の生物学的活性」を有している。あるポリペプ
チドが、天然に存在するＧＰＲ５４と同一のリガンドに曝された際、天然に存在
するＧＰＲ５４と同一の機能的応答を媒介することができる場合にも、そのポリ
ペプチドは、ＧＰＲ５４と「実質的に同一の生物学的活性」を有している。機能
的応答の例には、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞における色素凝集、ゼノ
パス卵母細胞における膜電流の変化、ｃＡＭＰレベルの調節、カルシウム濃度の
変化、イノシトールリン酸レベルの変化及び内側に整流するカリウムチャネルと
の共役である。当業者であれば、他のＧタンパク質共役受容体の機能的応答を測
定する多様な方法に精通しているであろうし、これらの方法をＧＰＲ５４に適用
することができるであろう（例えば、Ｌｅｒｎｅｒ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１４６［黒色素細胞における色素分布の変化
］；Ｙｏｋｏｍｉｚｏｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３８７：６２
０−６２４［ｃＡＭＰ又はカルシウムの濃度、走化性の変化］；Ｈｏｗａｒｄ
ｅｔａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：９７４−９７７［ゼノパス
卵母細胞における膜電流の変化］；ＭｃＫｅｅｅｔａｌ．，１９９７，Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：４１５−４２３［エクオリンアッセイを使用
して測定されたカルシウム濃度の変化］；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，
１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０；１５１７５，１５１８０［イノシ
トールリン酸レベルの変化］を参照のこと）。Ｚｌｏｋａｒｎｉｋｅｔａｌ
．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：８４−８８及び米国特許第５，７４１
，６５７号は、ＧＰＲ５４機能的応答を測定するために適合させることができる
レポーター遺伝子アッセイを記載している。そのアッセイは、蛍光基質を切断す
る、誘導可能プロモーターにより駆動されるβ−ラクタマーゼを利用する。基質
の切断は、β−ラクタマーゼの誘導の大きさと比例する、基質の異なる位置間の
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の変化をもたらす。従って、誘導可能プロ
モーターの活性化レベルにより、測定されたＦＲＥＴの量が決定される。次に、
このプロモーターの誘導レベルは、プロモーターを誘導する物質（例えば、ｃＡ
ＭＰ）のレベルにより決定される。リガンドとＧＰＲ５４との相互作用から生じ
る機能的応答（例えば、ｃＡＭＰレベルの変化）により誘導されるプロモーター
を選択することにより、このアッセイを、ＧＰＲ５４機能的応答を測定するため
に使用することが可能である。

【００２７】ＧＰＲ５４を発現させる細胞によって、従ってＧＰＲ５４が共役するＧタンパ
ク質によって、前記のような方法のいくつかは、ＧＰＲ５４の機能的応答を測定
するために適切なものとなろう。ある実験系にとって適切な機能的応答測定法を
選択することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

【００２８】「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基と、別の化学的に類似したア
ミノ酸残基との交換をさす。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イ
ソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）と別の疎水性残基との置換；あ
る極性残基と、同一の電荷を有する他の極性残基との置換（例えば、アルギニン
とリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸）である。

【００２９】「単離されたＧＰＲ５４タンパク質」又は「単離されたＧＰＲ５４ＤＮＡ」
とは、天然起源から単離された、ＧＰＲ５４タンパク質又はＧＰＲ５４をコード
するＤＮＡを意味する。「単離された」という用語の使用は、ＧＰＲ５４のタン
パク質又はＤＮＡが、その通常の細胞環境から取り出されていることを示す。従
って、単離されたＧＰＲ５４タンパク質は、無細胞溶液中に存在するか、又は天
然に存在する環境とは異なる細胞環境に置かれている。単離されたという用語は
、単離されたＧＰＲ５４タンパク質が、存在している唯一のタンパク質であるこ
とを意味するのではなく、単離されたＧＰＲ５４タンパク質が、ＧＰＲ５４タン
パク質と天然に関連している非アミノ酸材料（例えば、核酸、脂質、炭水化物）
を少なくとも９５％含まないことを意味する。従って、ＧＰＲ５４タンパク質を
天然に（即ち、ヒトの介入なしに）は発現しない細菌又はさらには真核細胞にお
いて、組換え手段により発現されたＧＰＲ５４タンパク質は、「単離されたＧＰ
Ｒ５４タンパク質」である。同様に、ＧＰＲ５４をコードするＤＮＡを天然に（
即ち、ヒトの介入なしに）は含有していない細菌又はさらには真核細胞に、組換
え手段により存在するようになったＧＰＲ５４をコードするＤＮＡは、「単離さ
れた、ＧＰＲ５４をコードするＤＮＡ」である。

【００３０】本発明は、ガラニン受容体様タンパク質をコードするＤＮＡの発見に関する。
それぞれ膜貫通セグメント３（ＴＭ３）及び膜貫通セグメント７（ＴＭ７）内の
ＧＰＣＲ保存配列に基づく２つの縮重プライマー（Ｐ１及びＰ２、実施例１参照
）を使用して、プルーフリーディングＰｆｕポリメラーゼを用いて、ラット脳ｃ
ＤＮＡライブラリーの一部を増幅した。増幅されたＤＮＡを切り出し、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングした。得られたラットクローンの一
つが、ガラニン／オピオイド様受容体を部分的にコードしているようであった。
部分的ｃＤＮＡを^３２ＰｄＣＴＰ−αで標識し、それを使用して、縮重ＰＣＲ
において使用されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。２つの陽性プ
ラークを精製し、それらの挿入配列を、Ｐｆｕポリメラーゼ及びλｇｔ１１ベク
ターのクローニング部位に隣接するプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した
。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、配列決定した。
配列の分析により、各プラークが、互いに同一の、そして最初のプローブと同一
のＴＭ３からカルボキシ末端までの推定ＧＰＣＲの領域をコードしていることが
明らかとなった。同ライブラリーから新たに接種された１×１０^６個のプラーク
の第２スクリーニングにより、さらに３個の陽性プラークが得られた。それぞれ
内部プライマーと対にされたλｇｔ１１隣接プライマーを用いたこれらの陽性プ
ラークのＰＣＲ増幅は、これらの陽性プラークのうちの１個のみが完全なオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有していることを明らかにした。このプ
ラークを精製し、挿入配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、完
全長オープンリーディングフレームの５’末を含有していることを確認した。最
後に、ＯＲＦの５’末及び３’末からの２つの特異的プライマーを使用して、完
全長ラットｃＤＮＡの１．２Ｋｂクローンをｐｆｕポリメラーゼで増幅し、それ
をＧＰＲ５４と名付けた。配列分析により、クローニングされたＧＰＲ５４Ｏ
ＲＦが、以前のファージクローン及び最初のプローブと同一であることが明らか
となった。

【００３１】ＧＰＲ５４は、３９５アミノ酸からなるタンパク質をコードする１，１８５ｂ
ｐのＯＲＦを含有していた。

【００３２】ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ２５：３３８９−３４０２）においてＧＰＲ５４を使用したところ、
ガラニン及びオピオイド受容体ファミリーとの最も高い同一性が観察された。特
に、ＧＰＲ５４は、ＴＭ領域において、ラットガラニン受容体ＧａｌＲ１（４５
％）、ＧａｌＲ３（４５％）、ＧａｌＲ２（４４％）及びラットオピオイド受容
体ＤＯＲ（３７％）とのアミノ酸同一性を有していた（図８）。ＧＰＲ５４に存
在する、ＧＰＣＲのロドプシンスーパーファミリーの保存残基及びコンセンサス
配列には、ＴＭ１内のアスパラギン、ＴＭ２内のアスパラギン酸、ＴＭ４〜７内
のプロリン、アミノ末端内のＮ結合型グリコシル化のための３個のコンセンサス
配列、第１及び第２細胞外ループ内のシステイン、第２細胞内ループ内のＰＫＡ
／ＰＫＣコンセンサス配列、第３細胞内ループ内のＰＫＣコンセンサス配列、並
びにカルボキシテール内の３個の可能性のあるパルミトイル化システイン部位が
含まれていた。重要なこととして、高親和性ガラニン結合にとって重要であるこ
とが示されているヒトＧａｌＲ１受容体の様々な残基（ラットＧａｌＲ１のＨｉ
ｓ２６２、Ｈｉｓ２６５、Ｇｌｕ２６９及びＰｈｅ２８０に相当）（Ｋａｓｋ
ｅｔａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯＪ．１５：２３６−２４４（Ｋａｓｋ）；
Ｂｅｒｔｈｏｌｄｅｔａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
４９：６０１−６０６（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ））は、ＧＰＲ５４において保存され
ていなかった。しかし、これらのうち、Ｈｉｓ２６２のみが、３種のガラニン受
容体間で保存されている。さらに、ＧａｌＲ１のＰｈｅ２８０の代わりのＧＰＲ
５４、ＧａｌＲ２及びＧａｌＲ３において見出されるチロシン残基の置換は、Ｇ
ａｌＲ１においてＰｈｅ２８０がアラニンに交換した以前の研究（Ｂｅｒｔｈｏ
ｌｄ）とは反対に、ガラニン結合に対して有意な効果を及ぼさないことが示され
た（Ｋａｓｋ）。

【００３３】ＧＰＲ５４のノーザンブロット分析及びｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ン分析の両方を、高ストリンジェンシーで、ＧＰＲ５４のＴＭ３からＴＭ７をコ
ードするＤＮＡプローブを用いて、そしてガラニン受容体及び関連受容体をコー
ドする遺伝子との低い同一性を用いて実施した。ＧＰＲ５４の組織分布は、様々
なラット組織から単離されたポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを使用したノーザンブロット分
析により得られた（図６）。脳においては、複雑なパターンの複数のＲＮＡ転写
物が、橋延髄（ｍｅｄｕｌｌａｐｏｎｓ）、中脳、海馬、皮質、前頭皮質及び
線条に検出された。大部分の強力バンドがおよそ３．７Ｋｂ長であり、単一の比
較的大きいおよそ１２Ｋｂ長の転写物が肝臓及び腸にのみ検出された。小脳又は
腎臓組織には転写物が認められなかった。

【００３４】ラット脳切片のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ＧＰＲ５
４ｍＲＮＡの分布が、多くの野に別々に局在していることが見出された（図７
）。最高レベルの発現は、視床下部及び扁桃の核に見られた。ＧＰＲ５４ｍＲ
ＮＡは、不確帯、腹側被蓋野、歯状回、視床下部弓状核、視床下部背内側核、一
次嗅覚皮質、外側手綱核、視床下部後核、青斑、扁桃の皮質核及び内側核におい
て高度に発現していた。ＧＰＲ５４ｍＲＮＡは、上丘、内側視索前野、視床下
部前野、視床下部後核、水道周囲灰白質、傍繊維束視床核、傍小脳脚核及び腹側
乳頭前核にも濃縮されていた。視床下部中隔核、下丘、扁桃内側核、中脳網様核
及び板状筋後皮質において検出されたシグナルは、散在性であり、比較的少量で
あった。

【００３５】ＧＰＲ５４のＣＮＳ発現パターンは、ガラニン受容体のパターンと類似してい
ることが見出された。特に、ラットＧａｌＲ１ｍＲＮＡ発現は、視床下部、扁
桃、海馬及び青斑を含むいくつかの脳領域に多く存在している（Ｐａｒｋｅｒ
ｅｔａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．３４：１７９−１８９
）。ラットＧａｌＲ２ｍＲＮＡ発現は、乳頭核、歯状回、視床下部後核及び弓
状核に見出される（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．７１，２２３９−２２５１）。ラットＧａｌＲ３は、アンモン
角のＣＡ野及び歯状回に多く発現していることが見出されており、転写物も視床
核、視床下部核、乳頭核及び扁桃核に検出されている（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ
ｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１，２２３９−２２５１
）。

【００３６】ＧＰＲ５４とガラニン受容体との同一性及び重複する発現パターンは、コード
された受容体がガラニンとの結合を示すかもしれないことを示唆した。発現及び
結合の研究のための準備として、ＧＰＲ５４のＯＲＦをコードする１．２ｋｂの
ｃＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターのマルチプルクローニング部位にサ
ブクローニングし、ＣＯＳ−７細胞へと一過性トランスフェクトした。^１２５Ｉ
−ヒトガラニンとの特異的結合は観察されなかった。対照的に、ヒトＧａｌＲ１
によりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から調製された膜においては、類似の
条件下で、^１２５Ｉ−ヒトガラニンとの特異的かつ高親和性の結合が観察され、
それはＧａｌＲ２及びＧａｌＲ３に関する以前の報告と一致していた（Ｋｏｌａ
ｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１，２２
３９−２２５１）。

【００３７】ラットＧＰＲ５４配列を用いたＢＬＡＳＴ検索は、セリンプロテアーゼ遺伝子
クラスターを含有する第１９染色体ｐ１３．３に位置するヒト３．５Ｍｂコンテ
ィグ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００５３７９）との高い同一性を明らかにし
た。配列分析は、３９８アミノ酸長のタンパク質をコードし、かつラットＧＰＲ
５４との翻訳アミノ酸同一性が８１％（ＴＭ領域は１００％同一）である、以前
には認識されていなかったＧＰＲ５４の３．３ｋｂイントロン含有ヒトオルソロ
グを明らかにした。ゲノミック配列は、ＴＭ２（およそ８００ｂｐ、翻訳ＦＹＩ
．．ＡＮＬ配列の間）、ＴＭ３（およそ８００ｂｐ、ＩＱＱ．．ＶＳＶの間）、
ＴＭ４（およそ２５０ｂｐ、ＷＶＧ．．ＳＡＡの間）及び第３細胞内ループ（お
よそ１８０ｂｐ、ＡＬＱ．．ＧＱＶの間）に位置する４個のイントロンを明らか
にした。

【００３８】本発明の一つの態様は、配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む、単離されたＤＮＡである。こ
の単離されたＤＮＡは、他の核酸を実質的に含まなくともよく、一本鎖であって
もよいし、又は二本鎖であっても、即ちその相補配列と対を形成していてもよい
。本発明には、このＤＮＡに対応する単離されたＲＮＡも含まれる。

【００３９】本発明のもう一つの態様は、Ｇタンパク質共役受容体ＧＰＲ５４をコードする
ｃＤＮＡの同定及びクローニングである。このｃＤＮＡは、他の核酸を実質的に
含まないかもしれず、一本鎖であってもよいし、又は二本鎖であってもよい。本
発明は、図１に配列番号：１として、又は図２に配列番号：２として示されたヌ
クレオチド配列を有する、他の核酸を実質的に含まないｃＤＮＡ分子を提供する
。配列番号：１は、３９８アミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリ
ーディングフレーム（配列番号：１の１〜１，１９４位）を含有する。配列番号
：２は、３９５アミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディング
フレーム（配列番号：２の６１〜１，２４５位）を含有する（図５Ａ〜Ｂ参照）
。

【００４０】従って、本発明は、配列番号：１の１〜１，１９４位のヌクレオチド配列を含
む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子、及び配列番号：２の６１〜１，２
４５位のヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子も提
供する。本発明は、配列番号：１の１〜１，１９４位又は配列番号：２の６１〜
１，２４５位のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子も提供する。

【００４１】推定アミノ酸配列に基づき、ヒト及びラットのＧＰＲ５４タンパク質は、例え
ば（ａ）７個の膜貫通ドメイン、（ｂ）３個の細胞内ループ、（ｃ）３個の細胞外ループ、及び（ｄ）ＧＰＣＲトリプレットシグナチャー（ｔｒｉｐｌｅｔｓｉｇｎａｔｕｒ
ｅ）配列のようなＧＰＣＲに特徴的な特徴の多くを有しているため、新規なＧタンパク質
共役受容体（ＧＰＣＲ）である可能性が極めて高い。

【００４２】図６及び図７のようなノーザンブロット分析及びｉｎｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション分析は、ＧＰＲ５４ＲＮＡがラット脳野（橋、中脳、視床、視床下
部、海馬、扁桃、皮質、前頭皮質及び線条）及び末梢野（肝臓及び腸）に広く発
現していることを示した。

【００４３】ＧＰＲ５４の全部又は一部をコードする本発明の新規ＤＮＡ配列は、他のＤＮ
Ａ配列、即ちＧＰＲ５４が天然には連結してないＤＮＡ配列と連結し、ＧＰＲ５
４配列を含有する「組換えＤＮＡ分子」を形成していてもよい。本発明の新規Ｄ
ＮＡ配列は、ＧＰＲ５４の組換え発現を指示するためベクターへ挿入されうる。
そのようなベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡから構成されうるが、大部分の目的に
は、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターには、プラスミド、修飾ウイ
ルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及びＧＰＲ５４をコード
しうるエピソーム型又は組み込み型のその他のＤＮＡが含まれる。当業者であれ
ば、特定の使用にとって適切なベクターを容易に決定することができる。

【００４４】本発明には、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１又は配列番号：２と
ハイブリダイズするＤＮＡ配列が含まれる。例えば、これらに限定されないが、
高ストリンジェンシー条件を使用した手順は、以下の通りである。ＤＮＡを含有
するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト
溶液及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で、６５℃で、
２時間から一夜、実施する。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ及び５〜２０×１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ−標識プローブを含有するプレハイブリ
ダイゼーション混合物中で、６５℃で、１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。
フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で、３７℃
で、１時間、実施する。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、５０℃
で、４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーを行う。

【００４５】高ストリンジェンシー条件を使用した他の手順は、５×ＳＳＣ、５×デンハル
ト溶液、５０％ホルムアミド中で、４２℃で、１２〜４８時間実施されるハイブ
リダイゼーション工程、又は０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、６５℃で
、３０〜６０分間実施される洗浄工程のいずれかを含むであろう。

【００４６】高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを実施するための前記手順にお
いて言及された試薬は、当分野において周知である。これらの試薬の組成の詳細
は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，
１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓに見出される。前記の条件以外に使用されうる高ストリン
ジェンシー条件は、当分野において周知である。

【００４７】遺伝暗号の縮重とは、２個のアミノ酸を除く全てのアミノ酸について、複数の
コドンが、ある特定のアミノ酸をコードするというものである。このため、配列
番号：１又は配列番号：２のヌクレオチド配列と有意に異なっているが、それで
も配列番号：１又は配列番号：２と同一のＧＰＲ５４タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列を有する、ＧＰＲ５４タンパク質をコードする合成ＤＮＡを構築
することが可能である。そのような合成ＤＮＡは、本発明の範囲に含まれるもの
とする。そのような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞又は生物において発現させるこ
とが望まれる場合には、そのような合成ＤＮＡのコドン使用頻度を、その特定の
宿主細胞又は生物のコドン使用頻度を反映するよう調整し、宿主におけるＧＰＲ
５４タンパク質の発現レベルを増加させることが可能である。

【００４８】本発明のもう一つの態様は、ＧＰＲ５４をコードするＤＮＡ配列を含有し、か
つ／又は発現するよう操作された宿主細胞を含む。そのような組換え宿主細胞は
、ＧＰＲ５４を産生するために適当な条件下で培養されうる。ＧＰＲ５４をコー
ドするＤＮＡを含有する発現ベクターが、組換え宿主細胞におけるＧＰＲ５４の
発現のため使用されうる。組換え宿主細胞は、原核細胞であっても、真核細胞で
あってもよく、これらに限定されないが、大腸菌のような細菌、酵母のような真
菌細胞、これらに限定されないがヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類が起源の細
胞系を含む哺乳動物細胞、並びにこれらに限定されないが、ショウジョウバエ（
Ｄｏｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコに由来する細胞系を含む昆虫細胞を含む。
ＧＰＲ５４の組換え発現にとって適当な、哺乳動物種に由来する市販されている
細胞系には、これらに限定されないが、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１５７３）、ラジ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬ
ａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−
Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）、ゼ
ノパス黒色素胞及びゼノパス卵母細胞が含まれる。

【００４９】ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞は、多数のＧタンパク質を発現しているため、ＧＰＲ５４タンパク質の発
現にとって特に適当である。従って、これらＧタンパク質のうちの少なくとも１
種が、ＧＰＲ５４とそのリガンドとの相互作用により生成したシグナルと機能的
に共役し、このシグナルを下流エフェクターに伝達し、最終的に、いくつかのア
ッセイ可能な成分、例えばｃＡＭＰレベル、レポーター遺伝子の発現、イノシト
ール脂質の加水分解又は細胞内Ｃａ^２＋レベルの測定可能な変化をもたらすこと
ができる、という可能性が高い。

【００５０】ＧＰＲ５４タンパク質の発現にとって特に適当なその他の細胞は、アフリカツ
メガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）由来の不死化された色素細胞、黒色
素胞である。そのような色素細胞、黒色素胞は、他の組換えＧＰＣＲの機能アッ
セイのためのそのような色素細胞、黒色素胞の使用（Ｇｒａｍｉｎｓｋｉｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５９５７−５９６４；
Ｌｅｒｎｅｒ，１９９４，ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１
４６；Ｐｏｔｅｎｚａ＆Ｌｅｒｎｅｒ，１９９２，ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌ
Ｒｅｓ．５：３７２−３７８）と同様にして、ＧＰＲ５４の組換え発現を使用し
た機能アッセイに使用されうる。

【００５１】多様な哺乳動物発現ベクターが、哺乳動物細胞及びその他の細胞において組換
えＧＰＲ５４を発現させるために使用されうる。適当な市販されている哺乳動物
発現ベクターには、これらに限定されないが、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩ及びｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３
．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ａ
ＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢ
ＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ
（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）及びｐＳＶ２
−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）が含まれる。非哺乳動物細胞における発現の
ため、様々な適当な発現ベクターが当分野において既知である。ベクターの選択
は、使用される細胞型、所望の発現レベル等により異なるであろう。組換え細胞
における発現に続き、ＧＰＲ５４を、従来の技術、例えば塩分画、イオン交換ク
ロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロ
マトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ及び調製用ゲル電気泳動により
、他のタンパク質を実質的に含まないレベルにまで精製することができる。

【００５２】本発明には、他のタンパク質を実質的に含まないＧＰＲ５４タンパク質が含ま
れる。完全長ヒトＧＰＲ５４タンパク質のアミノ酸配列が、図３に配列番号：３
として示されている。完全長ラットＧＰＲ５４タンパク質のアミノ酸配列が、図
４に配列番号：４として示されている。従って、本発明には、配列番号：３又は
配列番号：４のアミノ酸配列を有する、他のタンパク質を実質的に含まないＧＰ
Ｒ５４タンパク質が含まれる。

【００５３】多くの受容体タンパク質と同様に、元の受容体と実質的に同一の生物学的活性
を保持しつつ、ＧＰＲ５４のアミノ酸、特にリガンド結合ドメインに見出されな
いアミノ酸の多くを修飾することが可能である。従って、本発明には、アミノ酸
の欠失、付加又は置換を有するが、それでも天然に存在するＧＰＲ５４と実質的
に同一の生物学的活性を保持している修飾型ＧＰＲ５４ポリペプチドが含まれる
。単一のアミノ酸置換が、タンパク質の生物学的活性を改変することは通常ない
ということが、一般的に認められている（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．，１９８７，
第４版，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，２２６頁；及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ，１９
８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５を参照のこと）。従って、
本発明には、配列番号：３又は配列番号：４中に１個のアミノ酸の置換がなされ
ているが、それでも天然に存在するＧＰＲ５４と実質的に同一の生物学的活性を
保持しているポリペプチドが含まれる。本発明には、配列番号：３又は配列番号
：４中に２個以上のアミノ酸の置換がなされているが、それでも天然に存在する
ＧＰＲ５４と実質的に同一の生物学的活性を保持しているポリペプチドも含まれ
る。特に、本発明には、前記の置換が保存的置換である実施態様が含まれる。特
に、本発明には、前記の置換がＧＰＲ５４のリガンド結合ドメインには起こらな
い実施態様が含まれる。

【００５４】ＧＰＲ５４の機能的等価物であるポリペプチドを生成させるため、ＧＰＲ５４
のいずれのアミノ酸残基が置換されうるかを決定する際、当業者は、ＧＰＲ５４
のアミノ酸配列と、関連タンパク質、例えば、ヒト、マウス又はラットのＧＡＬ
Ｒ１、ＧＡＬＲ２又はＧＡＬＲ３受容体、並びにラットオピオイド受容体ＤＯＲ
のアミノ酸配列との比較により案内されよう（例えば図８参照）。そのような比
較は、当業者が、ＧＰＲ５４と関連タンパク質との間で高度に保存されている領
域に作成されるアミノ酸置換の数を最小限に抑えることを可能にするであろう。
従って、本発明には、配列番号：３又は配列番号：４中に２個以上のアミノ酸の
置換（保存的なものであり、かつＧＰＲ５４と、ヒト、マウス又はラットのＧＡ
ＬＲ１、ＧＡＬＲ２もしくはＧＡＬＲ３受容体のアミノ酸が同一である位置、又
はＧＰＲ５４とラットオピオイドＤＯＲ受容体とのアミノ酸が同一である位置に
は起こらない（図８参照））が作成されているが、それでも天然に存在するＧＰ
Ｒ５４と実質的に同一の生物学的活性を保持しているポリペプチドが含まれる。
特定の実施態様において、置換は、ＧＰＲ５４と、ラットのＧＡＬＲ１、ＧＡＬ
Ｒ２又はＧＡＬＲ３受容体とのアミノ酸が同一である位置には起こらない（図８
参照）。

【００５５】当業者であれば、同指針に従うことにより、即ち、ＧＰＲ５４と関連タンパク
質とのアミノ酸配列の差違を最小限に抑えることにより、ＧＰＲ５４の機能的等
価物であり、かつアミノ酸の小さい欠失又は挿入であるＧＰＲ５４アミノ酸配列
からの変化を有するポリペプチドを作製することも可能であることも認識するで
あろう。小さい欠失又は挿入とは、一般的には、約１〜５アミノ酸の範囲内であ
る。そのような小さい欠失又は挿入の、修飾型ＧＰＲ５４ポリペプチドの生物学
的活性に対する効果は、ポリペプチドを合成的に作製するか、又はＧＰＲ５４を
コードするＤＮＡにおいて必要な変化を作成し、次いでＤＮＡを組換え発現させ
、そして合成的に又はそのような組換え発現により作製されたタンパク質をアッ
セイすることにより、容易にアッセイされうる。使用されうるアッセイには、修
飾型ＧＰＲ５４ポリペプチドが天然に存在するＧＰＲ５４タンパク質とほぼ同一
の親和性で同リガンドと結合することができるか否かを決定するための単純な結
合アッセイが含まれる。又は、本明細書に記載されたアッセイのような機能アッ
セイを使用することもできる。

【００５６】本発明には、Ｃ末端短縮型ＧＰＲ５４、特に、受容体の細胞外部分を内含する
が、受容体の細胞内シグナル伝達部分は欠如しているようなＣ末端短縮型ＧＰＲ
５４も含まれる。そのような短縮型受容体は、結晶化研究及び構造活性相関研究
のための、本発明に記載された様々な結合アッセイにおいて有用である。

【００５７】本発明には、キメラＧＰＲ５４タンパク質も含まれる。キメラＧＰＲ５４タン
パク質は、非ＧＰＲ５４タンパク質のポリペプチド配列とインフレームで融合し
たＧＰＲ５４の連続ポリペプチド配列からなる。例えば、Ｃ末端でＧタンパク質
とインフレームで融合したＧＰＲ５４のＮ末端ドメイン及び７個の膜貫通ドメイ
ンは、キメラＧＰＲ５４タンパク質であろう。

【００５８】本発明には、多量体構造、例えば二量体の形態であるＧＰＲ５４タンパク質も
含まれる。他のＧタンパク質共役受容体のそのような多量体は、既知である（Ｈ
ｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１６
３８４−１６３９２；Ｎｇｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２７，２００−２０４；Ｒｏｍａｎｏｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８６１２−２８６１６
）。二量体は、２個のＧＰＲ５４タンパク質を含有する同種二量体であってもよ
いし、又はＧＰＲ５４と他のタンパク質とを含有する異種二量体であってもよい
。

【００５９】本発明には、単離された型のＧＰＲ５４タンパク質も含まれる。

【００６０】本発明には、ＧＰＲ５４タンパク質と特異的に結合する化合物を同定する方法
、及びそのような方法により同定された化合物も含まれる。ＧＰＲ５４との親和
性を有する化合物の結合特異性は、クローニングされた受容体を発現する組換え
細胞、又はそのような細胞由来の膜に対する化合物の親和性を測定することによ
り示される。クローニングされた受容体の発現、及びＧＰＲ５４と結合するか、
又は既知のＧＰＲ５４リガンドとそのような細胞との結合を阻害する化合物のス
クリーニングは、ＧＰＲ５４に対する高親和性を有する化合物の迅速な選択のた
めの効率的な方法を提供する。そのようなリガンド又は化合物は、放射性標識さ
れていてもよいが、結合した放射性標識リガンドと交換するために使用されうる
か、又は機能アッセイにおける活性化剤もしくは阻害剤として使用されうる非放
射性化合物であってもよい。前記方法により同定された化合物は、ＧＰＲ５４の
アゴニスト又はアンタゴニストである可能性が高く、ペプチド、タンパク質又は
非タンパク質性有機分子でありうる。そのような化合物は、ＧＰＲ５４活性の薬
理学的に有用な調節因子である可能性が高い。

【００６１】従って、本発明には、ＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する
アッセイも含まれる。他の受容体のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するた
めの方法が、当分野において周知であり、それらをＧＰＲ５４のアゴニスト及び
アンタゴニストを同定するために適合させることができる。従って、本発明には
、（ａ）ＧＰＲ５４をコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトすること
、（ｂ）ＧＰＲ５４を発現させるために十分な時間、トランスフェクトされた細胞
を増殖させること、（ｃ）物質の存在下及び非存在下で、ＧＰＲ５４の標識リガンドに細胞を曝すこ
と、（ｄ）標識ＧＰＲ５４リガンドの結合を測定すること、ここにおいて、前記標識
リガンドの結合量が、前記物質の存在下において前記物質の非存在下におけるよ
りも少ない場合、前記物質がＧＰＲ５４の可能性あるアゴニスト又はアンタゴニ
ストである、を含む、物質がＧＰＲ５４の可能性あるアゴニスト又はアンタゴニ
ストであるか否かを決定するための方法が含まれる。

【００６２】この方法の工程（ｃ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガンド相互作用
の研究のために当分野において典型的に使用される条件、例えば生理学的ｐＨ、
ＰＢＳのような一般的に使用される緩衝液又は組織培養培地の塩条件のような塩
条件、約４〜５５℃の温度である。

【００６３】本発明には、（ａ）細胞内でＧＰＲ５４の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）前記試験細胞を物質に曝すこと、（ｃ）前記物質と前記試験細胞中のＧＰＲ５４との結合量を測定すること、（ｄ）前記物質と前記試験細胞中のＧＰＲ５４リガンドとの結合量と、物質とＧ
ＰＲ５４でトランスフェクトされていない対照細胞との結合量とを比較すること
、ここにおいて、前記物質の結合量が、前記試験細胞の方が対照細胞と比較して
多い場合、前記物質はＧＰＲ５４との結合能を有する、を含む、物質がＧＰＲ５
４との結合能を有するか否か、即ち物質がＧＰＲ５４の可能性あるアゴニスト又
はアンタゴニストである可能性があるか否かを決定するための方法も含まれる。
次いで、物質がアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かの決定が、例えば下
記のプロミスカスＧタンパク質の使用を含むアッセイのような、機能アッセイの
使用によりアッセイされうる。

【００６４】この方法の工程（ｂ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガンド相互作用
の研究のため当分野において典型的に使用される条件、例えば生理学的ｐＨ、Ｐ
ＢＳのような一般的に使用される緩衝液又は組織培養培地の塩条件のような塩条
件、約４〜５５℃の温度である。

【００６５】前記方法の特定の実施態様において、細胞は真核細胞である。もう一つの実施
態様において、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施態様において、細胞は、Ｌ
細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、ラジ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（
ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（
ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（
ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）又はＭＲ
Ｃ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）である。

【００６６】前記アッセイは、ＧＰＲ５４により一過性又は安定的にトランスフェクトされ
た細胞を用いて実施されうる。トランスフェクションとは、ＧＰＲ５４を試験細
胞へと導入するための当分野において既知の任意の方法を含むものとする。例え
ば、トランスフェクションには、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムにより媒
介されるトランスフェクション、リポフェクション、ＧＰＲ５４を含有するレト
ロウイルス構築物による感染及び電気穿孔が含まれる。

【００６７】物質又はリガンドとＧＰＲ５４との結合を測定する場合、そのような結合は、
標識された物質又はリガンドを使用することにより測定されうる。物質又はリガ
ンドは、当分野において既知の便利な方法で、例えば放射性、蛍光、酵素で標識
されうる。

【００６８】前記方法の特定の実施態様において、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号
：４のアミノ酸配列を有する。

【００６９】前記方法を修飾し、試験細胞を物質に曝すのではなく、試験細胞から膜を調製
し、これらの膜を物質に曝すようにすることもできる。細胞ではなく膜を利用す
るそのような修飾は、当分野において周知であり、例えばＨｅｓｓｅｔａｌ
．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８４：
２６０−２６８に記載されている。

【００７０】従って、本発明は、（ａ）細胞内でＧＰＲ５４の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）前記試験細胞からＧＰＲ５４を含有する膜を調製し、リガンドが膜中のＧ
ＰＲ５４と結合するような条件下で、その膜をＧＰＲ５４リガンドに曝すこと、
（ｃ）工程（ｂ）に続いて、又はそれと同時に、前記試験細胞由来の膜を物質に
曝すこと、（ｄ）前記物質の存在下及び非存在下でのリガンドと膜中のＧＰＲ５４との結合
量を測定すること、（ｅ）前記物質の存在下及び非存在下での前記リガンドの膜中のＧＰＲ５４への
結合量とを比較すること、ここにおいて、物質の存在下でのリガンドと膜中のＧ
ＰＲ５４との結合量の減少は、物質がＧＰＲ５４との結合能を有していることを
示す、を含む、物質がＧＰＲ５４との結合能を有するか否かを決定するための方
法を提供する。

【００７１】特定の実施態様において、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号：４のアミ
ノ酸配列を有する。

【００７２】本発明は、（ａ）細胞におけるＧＰＲ５４の発現を指図する発現ベクターを細胞にトランス
フェクトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）前記試験細胞からＧＰＲ５４を含有する膜を調製し、前記試験細胞由来の
前記膜を物質に曝すこと、（ｃ）前記物質と前記試験細胞由来の前記膜中のＧＰＲ５４との結合量を測定す
ること、（ｄ）前記物質と前記試験細胞由来の前記膜中のＧＰＲ５４との結合量と、前記
物質とＧＰＲ５４をトランスフェクトされていない対照細胞由来の膜との結合量
とを比較すること、ここにおいて、前記物質と前記試験細胞由来の膜中のＧＰＲ
５４との結合量が、前記物質と前記対照細胞由来の前記膜との結合量よりも大き
い場合、物質がＧＰＲ５４との結合能を有する、を含む、物質がＧＰＲ５４との
結合能を有するか否かを決定するための方法を提供する。

【００７３】特定の実施態様において、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号：４のアミ
ノ酸配列を有する。

【００７４】前記の方法のさらなる修飾として、ＧＰＲ５４をコードするＲＮＡを、例えば
バクテリオファージＴ７プロモーターの調節下でＧＰＲ５４を含有するプラスミ
ドを使用したｉｎｖｉｔｒｏ転写により調製し、そのＲＮＡをゼノパス卵母細
胞へと微量注射し、卵母細胞におけるＧＰＲ５４の発現を引き起こすことができ
る。次いで、卵母細胞において発現されたＧＰＲ５４との結合について、物質を
試験する。又は、結合を検出するのではなく、卵母細胞の電気生理学的特性に対
する物質の効果を測定してもよい。

【００７５】本発明には、ＧＰＲ５４により媒介される機能性応答を刺激するか、又はそれ
に対し拮抗作用する能力により、ＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストを
同定することができるアッセイが含まれる。当業者は、Ｇタンパク質共役受容体
の機能的応答を測定する多様な方法に精通しているであろう（例えば、Ｌｅｒｎ
ｅｒ，１９９４，ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１４６［黒
色素細胞における色素分布の変化］；Ｙｏｋｏｍｉｚｏｅｔａｌ．，１９９
７，Ｎａｔｕｒｅ３８７：６２０−６２４［ｃＡＭＰ又はカルシウムの濃度、
走化性の変化］；Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
７３：９７４−９７７［ゼノパス卵母細胞における膜電流の変化］；ＭｃＫｅｅ
ｅｔａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：４１５−４
２３［エクオリンアッセイを使用して測定されたカルシウム濃度の変化］；Ｏｆ
ｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０；
１５１７５，１５１８０［イノシトールリン酸レベルの変化］を参照のこと）。

【００７６】従って、本発明は、（ａ）細胞におけるＧＰＲ５４の発現を指図する発現ベクターを細胞にトランス
フェクトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）試験細胞を、ＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストであると推測さ
れる物質に曝すこと、（ｃ）前記物質に曝された前記試験細胞の機能的応答の量を測定すること、（ｄ）前記試験細胞により示された機能的応答の量と、対照細胞により示された
機能的応答の量とを比較すること、ここにおいて、試験細胞により示された機能
的応答の量が、対照細胞により示された機能的応答の量と異なっている場合に、
物質がＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストである、を含む、ＧＰＲ５４
のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法を提供する。

【００７７】ここで、対照細胞とは、ＧＰＲ５４によりトランスフェクトされていないが、
物質に曝された細胞であるか、又は物質に曝されていない試験細胞である。

【００７８】特定の実施態様において、ＧＰＲ５４は、配列番号：３又は配列番号：４のア
ミノ酸配列を有する。

【００７９】特定の実施態様において、機能的応答は、黒色素細胞における色素分布の変化
、ｃＡＭＰ又はカルシウムの濃度の変化、ゼノパス卵母細胞における膜電流の変
化及びイノシトールリン酸レベルの変化からなる群より選択される。

【００８０】ＧＰＲ５４は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として知られるタンパク
質のクラスに属する。ＧＰＣＲは、リガンドが結合すると、細胞膜を介してシグ
ナルを伝達する。リガンドが結合したＧＰＣＲは異種三量体Ｇタンパク質と相互
作用し、Ｇタンパク質のＧαサブユニットのＧβ及びＧγサブユニットからの解
離を引き起こす。次いで、Ｇαサブユニットは、多様な第二メッセンジャー系を
活性化することができる。

【００８１】一般に、ある特定のＧＰＣＲは、ある特定の型のＧタンパク質とのみ共役して
いる。従って、ＧＰＣＲからの機能的応答を観察するためには、妥当なＧタンパ
ク質が、ＧＰＣＲを含有する系中に存在することを保証する必要がある。しかし
、プロミスカスＧタンパク質がいくつか存在することが見出されている。これら
のプロミスカスＧタンパク質は、事実上いずれのＧＰＣＲとも共役し、従って事
実上いずれものＧＰＣＲからの機能的シグナルを伝達するであろう。例えば、Ｏ
ｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０
；１５１７５，１５１８０（オファーマンス）を参照のこと。オファーマンスは
、多数のＧＰＣＲのうちの１つの発現、及びプロミスカスＧタンパク質Ｇα１５
又はＧα１６のうちの１つの発現をもたらす発現ベクターを、細胞にトランスフ
ェクトする系を記載した。ＧＰＣＲのアゴニストを、トランスフェクトされた細
胞へ添加すると、ＧＰＣＲが活性化され、Ｇα１５又はＧα１６を介してホスホ
リパーゼＣのβ同位体を活性化することができるようになり、それにより細胞に
おけるイノシトールリン酸レベルが増加した。

【００８２】従って、オファーマンスと同様にして、これらのプロミスカスＧタンパク質を
使用することにより、ＧＰＲ５４がｉｎｖｉｖｏで共役しているＧタンパク質
が不明であっても、ＧＰＲ５４に関する機能アッセイを企画することが可能であ
る。１つの可能性は、プロミスカスＧタンパク質と融合したＧＰＲ５４の細胞外
部分及び膜貫通部分から構成された融合タンパク質又はキメラタンパク質を作出
することである。そのような融合タンパク質は、リガンドと融合タンパク質のＧ
ＰＲ５４部分との結合に続き、シグナルを伝達することが予想されよう。従って
、本発明は、（ａ）プロミスカスＧタンパク質とＣ末端で融合したキメラＧＰＲ５４タンパク
質を発現する細胞を準備すること、（ｂ）前記細胞を、ＧＰＲ５４のアゴニストに曝すこと、（ｃ）工程（ｂ）に続いて、又はそれと同時に、前記細胞を、ＧＰＲ５４のアン
タゴニストであると推測される物質に曝すこと、（ｄ）前記細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、ここにお
いて、物質の非存在下での細胞におけるイノシトールリン酸のレベルと比較した
場合の、物質の存在下での細胞におけるイノシトールリン酸のレベルの増加は、
物質がＧＰＲ５４のアンタゴニストであることを示す、を含む、ＧＰＲのアンタゴニストを同定する方法を提供する。ＧＰＲ５４と関連してプロミスカスＧタンパク質を利用するためのもう一つの可
能性には、（ａ）ＧＰＲ５４及びプロミスカスＧタンパク質の両方を発現する細胞を準備す
ること、（ｂ）前記細胞を、ＧＰＲ５４のアゴニストであると推測される物質に曝すこと
、（ｃ）前記細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、ここにお
いて、推測アゴニストの非存在下での細胞におけるイノシトールリン酸のレベル
と比較した場合の、前記細胞におけるイノシトールリン酸のレベルの増加は、物
質がＧＰＲ５４のアゴニストであることを示す、を含む、ＧＰＲ５４のアゴニス
トを同定する方法が含まれる。

【００８３】イノシトールリン酸のレベルは、カルシウム動員をモニターすることにより測
定されうる。細胞内カルシウム動向は、典型的には、蛍光色素を使用した顕微鏡
下で完全細胞において、又はエクオリンアッセイを使用した発光により細胞懸濁
液においてアッセイされる。

【００８４】前記方法の特定の実施態様において、細胞は真核細胞である。もう一つの実施
態様において、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施態様において、細胞はＬ細
胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、ラジ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−
５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）、ゼノパス卵母細胞又はゼノパス黒色素胞である
。

【００８５】前記方法の特定の実施態様において、細胞は、細胞におけるＧＰＲ５４及びプ
ロミスカスＧタンパク質の発現を指図する発現ベクターによりトランスフェクト
される。

【００８６】この方法の工程（ｂ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガンド相互作用
の研究のために当分野において典型的に使用される条件、例えば生理学的ｐＨ、
ＰＢＳのような一般的に使用される緩衝液又は組織培養培地の塩条件のような塩
条件、約４〜５５℃の温度である。

【００８７】前記方法の特定の実施態様において、プロミスカスＧタンパク質は、Ｇα１５
又はＧα１６からなる群より選択される。Ｇα１５又はＧα１６を含有する発現
ベクターは、当分野において既知である。例えば、Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ、Ｂｕ
ｈｌｅｔａｌ，１９９３，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３２３：１３２−１３４；
Ａｍａｔｒｕｄａｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８
：１０１３９−１０１４４を参照のこと。

【００８８】前記アッセイは、ＧＰＲ５４のアンタゴニストを同定するための方法を形成す
るように修飾することができる。そのような方法も、本発明の一部であり、（ａ）ＧＰＲ５４及びプロミスカスＧタンパク質の両方を発現する細胞を準備す
ること、（ｂ）前記細胞を、ＧＰＲ５４のアゴニストであると推測される物質に曝すこと
、（ｃ）工程（ｂ）に続いて、又はそれと同時に、前記細胞を、ＧＰＲ５４のアン
タゴニストであると推測される物質に曝すこと、（ｄ）前記細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、ここにお
いて、推測アンタゴニストの非存在下での細胞におけるイノシトールリン酸のレ
ベルと比較した場合の、推測アンタゴニストの存在下での前記細胞におけるイノ
シトールリン酸のレベルの減少は、物質がＧＰＲ５４のアンタゴニストであるこ
とを示す、を含む。

【００８９】前記方法の特定の実施態様において、細胞は真核細胞である。もう一つの実施
態様において、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施態様において、細胞はＬ細
胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、ラジ（ＡＴＣＣＣＣＬ
８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ１７１）、ゼノパス卵母細胞又はゼノパス黒色素胞である。

【００９０】この方法の工程（ｂ）及び（ｃ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガン
ド相互作用の研究のために当分野において典型的に使用される条件、例えば生理
学的ｐＨ、ＰＢＳのような一般的に使用される緩衝液又は組織培養培地の塩条件
のような塩条件、約４〜５５℃の温度である。

【００９１】前記方法の特定の実施態様において、細胞は、細胞におけるＧＰＲ５４及びプ
ロミスカスＧタンパク質の発現を指図する発現ベクターによりトランスフェクト
される。

【００９２】前記方法の特定の実施態様において、プロミスカスＧタンパク質は、Ｇα１５
又はＧα１６からなる群より選択される。

【００９３】前記方法の特定の実施態様において、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号
：４のアミノ酸配列を有する。

【００９４】前記方法は、「１つ」の物質がＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストで
あるか否かの試験に関することが明示されているが、物質の集合物、例えばコン
ビナトリアルライブラリーを試験し、そのような集合物のメンバーがＧＰＲ５４
の活性化剤又は阻害剤であるか否かを決定するために、そのような方法を適合さ
せうることは、当業者には明らかであろう。従って、物質の集合物、又はそのよ
うな集合物の個々のメンバーの、前記方法における物質としての使用は、本発明
の範囲内である。

【００９５】前記方法により同定されるＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストは、Ｇ
ＰＲ５４の不適切な発現が関与している疾患の治療において有用であると予想さ
れる。特に、ＧＰＲ５４とガラニン受容体は類似しているため、ＧＰＲ５４のア
ゴニスト及びアンタゴニストは、薬理学的活性を有しており、ガラニン受容体の
アゴニスト及びアンタゴニストが有用であるのと同様に有用であることが予想さ
れる。従って、ＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストは、摂食障害及び肥
満、アルツハイマー病及びその他の記憶に影響を与える障害、疼痛、性的障害、
並びに成長ホルモンのバランス異常の治療において有用であると予想される。

【００９６】本発明には、ＧＰＲ５４のアゴニスト及びアンタゴニストを含む薬学的組成物
が含まれる。アゴニスト及びアンタゴニストは、一般に、薬学的に許容される担
体と併せられ、薬学的組成物を形成する。そのような担体、並びにアゴニスト及
びアンタゴニストと担体とを含有する薬学的組成物の製剤化法の例は、レミント
ンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌＳｃｉｅ
ｎｃｅｓ）に見出される。有効な投与にとって適当な薬学的に許容される組成物
を形成させるため、そのような組成物は、治療に有効な量のアゴニスト及びアン
タゴニストを含有しているであろう。

【００９７】治療用又は予防用の組成物は、ＧＰＲ５４活性が異常である状態を治療又は予
防するために十分な量で、個体へ投与される。有効量は、個体の状態、体重、性
別及び年齢のような多様な要因によって変化しうる。その他の要因には、投与様
式が含まれる。適切な量は、熟練した医師により決定されうる。

【００９８】組成物は、適切な投薬量で単独で使用されうる。又は、他の薬剤との同時投与
又は連続投与が望ましい場合もある。

【００９９】組成物は、投与のための従来の媒体に含まれて、極めて多様な治療的投薬形態
で投与されうる。例えば、組成物は、錠剤、カプセル（それぞれ、放出時間制御
（ｔｉｍｅｄｒｅｌｅａｓｅ）製剤及び徐放性製剤を含む）、丸剤、粉末、顆
粒、エリキシル、チンキ、溶液、懸濁液、シロップ及び乳剤のような経口投薬形
態で、又は注射により、投与されうる。同様に、薬学分野の当業者に周知の形態
を使用して、静脈内（ボーラス及び点滴の両方）、腹腔内、皮下、閉塞があって
もなくてもよい局所、又は筋肉内の形態でも投与することができる。

【０１００】有利には、組成物は、１日１回の用量で投与されうるか、又は１日の総投薬量
が、１日２回、３回もしくは４回の分割された用量で投与されうる。さらに、組
成物は、適当な鼻腔内媒体の局所的使用により鼻腔内形態で、又は当業者に周知
の経皮的皮膚貼付剤の形態を使用した経皮経路により、投与されうる。経皮輸送
系の形態で投与するには、投薬は、当然、投薬計画を通して、断続的ではなく継
続的なものとなるであろう。

【０１０１】組成物を利用する投薬計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別及び医学的状
態；治療すべき状態の重度；投与経路；患者の腎臓、肝臓及び心臓血管の機能；
並びに使用される特定の組成物を含む、多様な要因に従い選択される。通常の技
術を有する医師であれば、状態の進展を予防し、対抗し、又は阻止するために必
要とされる組成物の有効量を容易に決定し、処方することができよう。毒性なし
に効力を生じる範囲内の組成物の濃度を達成する際の最適な精度は、標的部位へ
の組成物の到達可能性の動態に基づく計画を必要とする。これには、組成物の分
布、平衡及び排除の考慮が含まれる。

【０１０２】本発明には、組換え系においてＧＰＲ５４を発現させ、次いで組換え発現され
たＧＰＲ５４受容体タンパク質をカウンタースクリーニングに利用する方法も含
まれる。標的受容体と特異的に相互作用する可能性がある医薬品を同定するため
、化合物をスクリーニングする場合には、同定された化合物が標的受容体に対し
て可能な限り特異的であることを保証する必要がある。このためには、標的受容
体に類似している受容体の可能な限り広いアレイに対して化合物をスクリーニン
グすることが必要である。従って、受容体Ａと相互作用する医薬品である可能性
がある化合物を見出すためには、化合物が受容体Ａ（「プラス標的」）と相互作
用し、受容体Ａを介して所望の薬理学的効果を生じることを保証することが必要
なだけでなく、化合物が受容体Ｂ、Ｃ、Ｄ等（「マイナス標的」）とは相互作用
しないことを決定することも必要である。一般に、スクリーニングプログラムの
一部として、可能な限り多くのマイナス標的を有することが重要である（Ｈｕｄ
ｇｓｏｎ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：９７３−９８０の
９８０頁参照）。従って、ＧＰＲ５４タンパク質及びＧＰＲ５４タンパク質をコ
ードするＤＮＡは、カウンタースクリーニングにおいて有用である。即ち、それ
らは、他のＧタンパク質共役受容体と特異的に相互作用する化合物を同定するた
めに設計されたスクリーニングプロジェクトに関する、カウンタースクリーニン
グにおける「マイナス標的」として使用されうる。

【０１０３】本発明のＤＮＡ、又はそのＤＮＡに基づくハイブリダイゼーションプローブは
、ＧＰＲ５４遺伝子又はＧＰＲ５４と関連したタンパク質をコードする遺伝子の
正確な染色体位置を同定するための染色体マッピング研究において使用されうる
。本発明者らは、ヒトＧＰＲ５４遺伝子が第１９染色体ｐ１３．３に位置するこ
とを決定したが、ヒトＧＰＲ５４遺伝子の位置をさらに正確に決定するためのマ
ッピング研究を実施することが望ましいかもしれない。そのようなマッピング研
究は、例えば、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、又はｉｎｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションのような、周知の遺伝学的技術及び／又は染色体マッピン
グ技術を使用して実施されうる。例えば、Ｖｅｒｍａｅｔａｌ．，１９８８
，ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，
ＮＹ参照。ＧＰＲ５４遺伝子又はＧＰＲ５４関連タンパク質をコードする遺伝子
の正確な染色体位置を同定した後、この情報は、（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４，
２６５：１９８１−２１４４）のゲノム討論に見出されるデータのような）遺伝
子地図データに含まれる既知の疾患原因遺伝子の位置と比較されうる。このよう
にして、ＧＰＲ５４遺伝子又はＧＰＲ５４関連タンパク質をコードする遺伝子の
染色体位置を、既知の疾患原因遺伝子の位置と相関させ、それにより、そのよう
な疾患原因遺伝子を含有するＤＮＡの領域を制限することに役立つかもしれない
。これは、そのような疾患原因遺伝子をクローニングする過程を単純化するであ
ろう。また、ＧＰＲ５４遺伝子又はＧＰＲ５４関連タンパク質をコードする遺伝
子の正確な染色体位置と、既知の疾患原因遺伝子の位置との連鎖が確立されたな
ら、その連鎖を、ＧＰＲ５４遺伝子又はＧＰＲ５４関連タンパク質をコードする
遺伝子の近傍の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を同定するため、診断的に使用する
ことができる。そのようなＲＦＬＰは、疾患原因遺伝子と相関させられ、それに
より、疾患原因遺伝子を保持する個体を同定するために使用されうる。

【０１０４】本明細書に記載されたような染色体マッピング研究のため、本発明のＤＮＡに
加え、本発明のＤＮＡの逆相補鎖、又は本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡを使用
することが有利であるかもしれない。

【０１０５】本明細書に開示されたＧＰＲ５４配列と相補的なヌクレオチド配列を、アンチ
センス療法において使用するため合成することができる。そのようなアンチセン
ス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートのようなＤＮＡ
の安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘
導体、又はその他の形態のＧＰＲ５４アンチセンス分子でありうる。ＧＰＲ５４
アンチセンス分子は、多様な方法、例えば微量注入、リポソームカプセル化によ
り、又はアンチセンス配列を保持するベクターからの発現により、細胞へと導入
されうる。ＧＰＲ５４アンチセンス療法は、ＧＰＲ５４活性を減少させることが
有益である状態の治療において特に有用であると予想される。

【０１０６】本発明には、ＧＰＲ５４タンパク質に対する抗体も含まれる。そのような抗体
は、ポリクローナル抗体であっても、又はモノクローナル抗体であってもよく、
ＧＰＲ５４タンパク質の不適切な発現又は活性が関与している障害の治療におい
て有用である。本発明の抗体は、当分野において周知の方法により、完全なＧＰ
Ｒ５４タンパク質に対して、又は適当な担体、例えば血清アルブミンもしくはカ
サガイ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンとカップリングしたタン
パク質の適当な抗原性断片に対して、惹起される。タンパク質の適当な抗原性断
片を同定する方法は、当分野において既知である。例えば、Ｈｏｐｐ＆Ｗｏｏｄ
ｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：３８２
４−３８２８及びＪａｍｅｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ（Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
）４：１８１−１８６を参照のこと。

【０１０７】ポリクローナル抗体を作製するためには、ＧＰＲ５４タンパク質又は適当な担
体とカップリングした抗原性断片を、例えばウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マ
ウスのような適当なヒト以外の宿主動物に、定期的に注射する。動物から定期的
に採血し、得られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在について試験す
る。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下等であってよく、アジュバントが併用されて
いてもよい。

【０１０８】モノクローナル抗体を作製するためには、ＧＰＲ５４タンパク質又は適当な担
体とカップリングした抗原性断片を、前記のポリクローナル抗体の作製の場合と
同様の適当なヒト以外の宿主動物に、定期的に注射する。モノクローナル抗体の
場合には、動物は一般的にマウスである。次いで、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７に記載のようにして、
動物の脾細胞を不死化する。不死化は、骨髄腫細胞との融合により行われること
が多い。モノクローナル抗体作製のより詳細な説明については、Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ編
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨｏｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
，１９８８を参照のこと。

【０１０９】標的臓器の細胞へＧＰＲ５４ポリペプチドを導入するため、遺伝子治療が使用
されうる。ＧＰＲ５４ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、受容細胞の注
射によりヌクレオチドの移入を媒介するウイルスベクターへとライゲートされう
る。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びポリオウイルスに基づ
くベクターが含まれる。又は、ＧＰＲ５４ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ドは、リガンド−ヌクレオチド結合体を使用した受容体媒介ターゲティッド移入
、リポフェクション、膜融合又は直接微量注入を含む非ウイルス技術により、遺
伝子治療のため細胞へと移入されうる。これらの手順及びそれらの変法は、ｅｘ
ｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの遺伝子治療にとって適当である。ＧＰＲ５４ポ
リペプチドを用いた遺伝子治療は、ＧＰＲ５４活性を上昇させることが有益であ
る疾患の治療に特に有用である。

【０１１０】完全長ＧＰＲ５４をコードするｃＤＮＡ断片は、適当なプライマー対を使用し
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより、適切なヒトｃＤＮＡ
ライブラリーから単離されうる。そのようなプライマー対は、図１に配列番号：
１として示されたＧＰＲ５４のｃＤＮＡ配列に基づき選択されうる。適当なプラ
イマー対は、例えば５’―ＡＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣ―３’（配列
番号：１１）及び５’―ＴＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＴＣ―３’（配列
番号：１２）であろう。

【０１１１】前記プライマーは、適当なベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１への、増幅され
たｃＤＮＡのクローニングを容易にするための制限部位を５’末に含有していて
もよい。前記プライマーは、例示的なものである。当業者であれば、その他にも
多様な適当なプライマーが設計されうることを認識するであろう。

【０１１２】ＰＣＲ反応は、これらに限定されないが、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａ
ｑＧｏｌｄ又はＶｅｎｔポリメラーゼを含む、多様な熱安定酵素を用いて実施
されうる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合、反応は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８
．３、２．０ｍＭＭｇＣｌ_２、各２００μＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭＫＣｌ、
０．２μＭの各プライマー、ＤＮＡ鋳型１０ｎｇ、０．０５単位／μｌＡｍｐ
ｌｉＴａｑ中で実施されうる。反応物は、９５℃で３分間加熱され、次いで、９
５℃２０秒間、６２℃２０秒間、７２℃３分間のサイクリングパラメータを使用
して３５回繰り返す。これらの条件以外にも、多様な適当なＰＣＲプロトコルが
、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃ．Ｗ．
Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編，１９９５，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨｏｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ又はＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．編，１９９０，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓに見出される。

【０１１３】ＧＰＲ５４をコードするクローンが単離されうる適当なｃＤＮＡライブラリー
は、脳組織由来のＲＮＡから作成されたヒトｃＤＮＡライブラリーであろう。そ
のようなライブラリーは、当分野において周知の方法により調製されうる。又は
、いくつかの市販されているライブラリー、例えばストラタジーン社（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のヒト胎児脳（カ
タログ＃９３７２２７）、及びクロンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ
）のヒト脳視床下部（カタログ＃ＨＬ１１７２ａ）のようなｃＤＮＡライブラリ
ーが適当であろう。そのようなライブラリーの一次クローンは、およそ２０，０
００クローンを含有するプールへと分割され、各プールが別々に増幅されうる。

【０１１４】この方法により、３９８アミノ酸（配列番号：３）のオープンリーディングフ
レームをコードするｃＤＮＡ断片が得られた。このｃＤＮＡ断片は、適当なクロ
ーニングベクター又は発現ベクターへとクローニングされうる。例えば、断片は
、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤ
ｉｅｇｏ、Ｃａ）へとクローニングされうる。次いで、ＧＰＲ５４をコードする
発現ベクターを適当な宿主細胞へと移入し、適切な条件下で宿主細胞を増殖させ
ることによりＧＰＲ５４タンパク質が作製されうる。次いで、ＧＰＲ５４タンパ
ク質は、当分野において周知の方法により単離されうる。

【０１１５】前記ＰＣＲ法の代替法として、ＧＰＲ５４に特異的なオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして使用し、オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングするための当分野において周知の方法を使用して、ＧＰＲ５
４をコードするｃＤＮＡクローンを、ｃＤＮＡライブラリーから単離することが
できる。そのような方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９
，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．
編，１９８５，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒ
ｏａｃｈ，ＭＲＬＰｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，第Ｉ，Ｉ
Ｉ巻に記載されている。ＧＰＲ５４に特異的であり、ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするために使用されうるオリゴヌクレオチドは、図１に配列番号：
１として示されたＧＰＲ５４のｃＤＮＡ配列に基づき容易に設計され、当分野に
おいて周知の方法により合成されうる。

【０１１６】ＧＰＲ５４遺伝子を含有するゲノミッククローンは、例えば、Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから市販されている、ヒト
ＰＡＣ又はＢＡＣライブラリーから得ることができる。又は、本明細書に開示さ
れたＧＰＲ５４ヌクレオチド配列に基づくプローブを使用して、ＧＰＲ５４を含
有するゲノミッククローンが単離されうる、例えばＰ１人工染色体ベクター中の
ゲノミックライブラリーを調製してもよい。そのようなライブラリーを調製する
方法は、当分野において既知である（Ｉｏａｎｎｏｕｅｔａｌ．，１９９４
，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．６：８４−８９）。

【０１１７】以下、本発明を制限するものではない実施例を、本発明をさらに例示するため
に提示する。

【０１１８】実施例１ＰＣＲ増幅及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングラット脳５’ストレッチ（Ｓｔｒｅｔｃｈ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を、プルーフリーディングＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）及びＧＰＣＲの保存された膜貫通（ＴＭ）領域３Ｐ１：５’―ＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＢＤＥＴＦＧＡＤＣＧＨＴＡ―３’
（配列番号：９）及び膜貫通（ＴＭ）領域７Ｐ２：５’―ＧＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＦＢＡＩＪＧＧＫＴＴ―３’（配列番号：
１０）［ここで、Ｂ＝Ｃ又はＧ、Ｄ＝Ｃ又はＴ、Ｅ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｆ＝Ｃ又はＧ又
はＴ、Ｈ＝Ａ又はＣ、Ｉ＝Ａ又はＣ又はＧ又はＴ、Ｊ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｋ＝Ａ
又はＧ］をコードする配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により増幅した。

【０１１９】ＰＣＲ条件は、以下の通りであった。９４℃における３０秒間の変性、５５、
４８、４５、４２又は４０℃における４０秒間のアニーリング、及び７２℃にお
ける３０秒間の伸長を３０サイクル、それに続く７２℃における７分間の伸長。
ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、低融
点アガロースゲルでの電気泳動にかけた。予想サイズ域内のＰＣＲ産物バンドを
ゲルから切り出し、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）のＥｃｏＲＶ部位へとライゲートし、配列決定した。１つの挿入配列が新規Ｇ
ＰＣＲをコードしているようであった。それを、ニックトランスレーション（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）により［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ−α（ＮＥＮ）で標識し、以前に記
載されたようにして（Ｍａｒｃｈｅｓｅｅｔａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｏｍ
ｉｃｓ２３：６０９−６１８）、前記と同じ増幅されたライブラリーをスクリ
ーニングするために使用した。陽性ファージクローンをプラーク精製し、それら
の挿入配列を、Ｐｆｕポリメラーゼ及びｌｇｔ１１ＥｃｏＲＩクローニング部位
に隣接するプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＢｌ
ｕｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位へと平
滑末端ライゲートし、両鎖を配列決定した。

【０１２０】実施例２ノーザンブロット分析いくつかのラット組織由来のラットｍＲＮＡを、以前に記載されたようにして
（Ｍａｒｃｈｅｓｅｅｔａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：６０
９−６１８）、抽出した。簡単に説明すると、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃ
ｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９の方法
により全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）セルローススピンカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを単
離した。ＲＮＡを変性させ、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上でサイズ分
画し、ナイロン膜へ転写し、ＵＶ照射により固定化した。ブロットに、ＧＰＲ５
４をコードする^３２Ｐ−標識ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせ、２×ＳＳＰＥ及
び０．１％ＳＤＳで５０℃で２０分間洗浄し、０．１×ＳＳＰＥ及び０．１％Ｓ
ＤＳで５０℃で２時間再び洗浄し、増感スクリーンの存在下で−７０℃でＸ線フ
ィルムへと感光した。

【０１２１】実施例３ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析ＧＰＲ５４をコードする^３５Ｓ−標識ＤＮＡ断片を、ｉｎｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーション用のプローブとして使用した。ラット脳切片の調製及びｉｎｓ
ｉｔｕハイブリダイゼーションの手順は、以前に記載されたようにして実施した
（Ｏ’Ｄｏｗｄｅｔａｌ．，１９９６，ＦＥＢＳＬｅｔｔ３９４：３２
５−３２９）。

【０１２２】実施例４ＣＯＳ−７哺乳動物細胞におけるＧＰＲ５４ｃＤＮＡの発現アメリカンタイプカルチャーコレクションから得られたアフリカングリーンモ
ンキー（ＡｆｒｉｃａｎＧｒｅｅｎＭｏｎｋｅｙ）ＳＶ４０で形質転換され
た腎細胞系（ＣＯＳ−７細胞）を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（Ｓｉｇｍａ）
、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｆｌｏ
ｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ）及び２ｍＭグルタミン（
ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が補足されたダルベッコ改変イーグル培
地中で、３７℃で、６％ＣＯ_２の雰囲気下で増殖させた。１７５ｃｍ^２培養フラ
スコ１個当たり５×１０^６個の細胞を、２０ｍｌの培地に播き、８０％コンフル
エンスで、２．７５、５．５又は１１．６５μｇのｐｃＤＮＡ３−ＧＰＲ５４又
はｐｃＩｎｅｏ−ｈＧＡＬＲ１プラスミド及び７０μｌのリポフェクト（Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔ）ＡＭＩＮＥ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）により、製造業者の推奨に従い、一過性トランスフェクトした。トランスフェ
クションの２日後、無酵素溶解溶液（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ、Ｌａｖ
ａｌｌｅｔｔｅ、ＮＪ）に溶解させた後、細胞を収集した。

【０１２３】実施例５膜調製及び放射性リガンド結合アッセイ氷冷膜緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１０ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフロリド、１０ｍＭホスホルアミドン）中での加圧窒素キャビテーションに
よる破壊により、トランスフェクトされた細胞から膜を調製した。低速（１１０
０×ｇ、１０分間、４℃）及び高速（３８，７００×ｇ、１５分間、４℃）の遠
心分離の後、膜を緩衝液に再懸濁させ、そのタンパク質濃度を決定した（Ｂｉｏ
−Ｒａｄアッセイキット）。膜中の^１２５Ｉ−ヒトガラニン（２２００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌの比活性、ＤｕＰｏｎｔＮＥＮ）の結合を、全量２５０ｍｌの２５ｍＭ
トリス、ｐＨ７．４、０．３％ＢＳＡ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、４ｍｇ／ｍｌホス
ホルアミドン（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）、及び１０ｍＭロイペプチンの
緩衝液を使用して測定した。２００ｐＭの^１２５Ｉ−ヒトガラニンを使用した。
膜の添加により反応を開始させ、室温で２時間インキュベーションを進行させた
。非特異的な結合を、１０ｍＭの未標識ヒトガラニンの存在下で結合し続ける放
射能の量と定義した。ＴＯＭＴＥＣ（ＯｒａｎｇｅＣＴ）細胞採取器を使用し
て、０．１％ポリエチルアミンに予備浸漬させたＣＦ／Ｃフィルターによる急速
濾過により、インキュベーションを停止させた。

【０１２４】本発明の範囲は、本明細書に記載された特定の実施態様により制限されるもの
ではない。実際、本明細書に記載されたものに加え、本発明の様々な修飾が、前
述の記載から当業者には明らかとなろう。そのような修飾は、添付の特許請求の
範囲の範囲に含まれるものとする。

【０１２５】様々な出版物が本明細書において引用されているが、それらの開示は参照によ
り完全に組み込まれるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ヒトＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。

【図１Ｂ】ヒトＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。

【図２Ａ】ラットＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す図である。

【図２Ｂ】ラットＧＰＲ５４の完全なｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す図である。

【図３】ヒトＧＰＲ５４の完全なアミノ酸配列（配列番号：３）を示す図である。

【図４】ラットＧＰＲ５４の完全なアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。

【図５Ａ】ラットＧＰＲ５４のオープンリーディングフレームの位置を示す図である。

【図５Ｂ】ラットＧＰＲ５４のオープンリーディングフレームの位置を示す図である。

【図６】ラット脳におけるラットＧＰＲ５４ｍＲＮＡのノーザンブロットの結果を示
す図である。

【図７Ａ】ＧＰＲ５４受容体ｍＲＮＡの局在を示す、ラット脳の矢状断面及び冠状断面の
暗視野（ｄａｒｋｆｉｅｌｄ）オートラジオグラフである。

【図７Ｂ−Ｃ】ＧＰＲ５４受容体ｍＲＮＡの局在を示す、ラット脳の矢状断面及び冠状断面の
暗視野（ｄａｒｋｆｉｅｌｄ）オートラジオグラフである。

【図７Ｄ】ＧＰＲ５４受容体ｍＲＮＡの局在を示す、ラット脳の矢状断面及び冠状断面の
暗視野（ｄａｒｋｆｉｅｌｄ）オートラジオグラフである。

【図８】ＧＰＲ５４（配列番号：４）のアミノ酸配列と、ラットＧＡＬＲ１（配列番号
：５）、ラットＧＡＬＲ２（配列番号：６）、ラットＧＡＬＲ３（配列番号：７
）及びラットオピオイド受容体ＤＯＲ（配列番号：８）のアミノ酸配列とのアラ
インメントを示す図である。

【図９】ラットＧＰＲ５４（配列番号：４）のアミノ酸配列とヒトＧＰＲ５４（配列番
号：３）のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ (71)出願人ユニバーシテイ・オブ・トロントカナダ国、オンタリオ・エム・１・イー・１・ビー・８、トロント、タドル・ロード・８、デパートメント・オブ・フアーマコロジー (72)発明者ハワード，アンドリユー・デイーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者オニール，ギヤリー・ピーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス−カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者オダウド，ブライアンカナダ国、オンタリオ・エム・１・イー・１・ビー・８、トロント、タドル・クリーク・ロード・８ (72)発明者ジヨージ，スーザンカナダ国、オンタリオ・エム・１・イー・１・ビー・８、トロント、タドル・クリーク・ロード・８Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA63 CA04 CA09 CA10 CA12 DA02 EA02 EA04 4B065 AA90X AB04 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 BA10 BA54 CA40 DA50 DA75 EA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするヌクレオチドを含む、単離されたＤＮＡ。
【請求項２】配列番号：１、配列番号：１の１〜１，１９４位、配列番号
：２、及び配列番号：２の６１〜１，２４５位からなる群より選択されるヌクレ
オチド配列を含む、請求項１のＤＮＡ分子。
【請求項３】請求項１のＤＮＡと高ストリンジェンシー条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ分子。
【請求項４】請求項１のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項５】請求項１のＤＮＡを含む組換え宿主細胞。
【請求項６】配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有するＧＰ
Ｒ５４タンパク質を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７】他のタンパク質を実質的に含まない、請求項６の単離された
ポリペプチド。
【請求項８】単一のアミノ酸置換を含有する、請求項６の単離されたポリ
ペプチド。
【請求項９】保存的であり、かつＧＰＲ５４とラットのＧＡＬＲ１、ＧＡ
ＬＲ２又はＧＡＬＲ３受容体とが同じアミノ酸を有している位置ではない位置で
のアミノ酸置換を２個以上含有する、請求項６の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】（ａ）ＧＰＲ５４をコードする発現ベクターを細胞にトラ
ンスフェクトすること、（ｂ）ＧＰＲ５４を発現させるために十分な時間、トランスフェクトされた細
胞を増殖させること、（ｃ）物質の存在下及び非存在下で、ＧＰＲ５４の標識リガンドに細胞を曝す
こと、（ｄ）前記標識リガンドとＧＰＲ５４との結合を測定すること、ここにおいて、前記物質の存在下の方が、前記物質の非存在下よりも前記標識
リガンドの結合量が少ない場合に、前記物質はＧＰＲ５４の可能性あるアゴニス
ト又はアンタゴニストであり、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号：４のア
ミノ酸配列を有する、を含む、物質がＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを決定
するための方法。
【請求項１１】（ａ）細胞内でＧＰＲ５４の発現を指示する発現ベクター
を細胞にトランスフェクトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）前記試験細胞を物質に曝すこと、（ｃ）前記物質と前記試験細胞中のＧＰＲ５４との結合量を測定すること、（ｄ）前記物質と前記試験細胞中のＧＰＲ５４との結合量と、前記物質とＧＰ
Ｒ５４でトランスフェクトされていない対照細胞との結合量とを比較すること、ここにおいて、前記対照細胞と比較して前記試験細胞の方が前記物質の結合量
が多い場合に、前記物質はＧＰＲ５４への結合能を有し、ＧＰＲ５４は配列番号
：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有する、を含む、ある物質がＧＰＲ５４との結合能を有するか否かを決定するための方法
。
【請求項１２】（ａ）細胞内でＧＰＲ５４の発現を指示する発現ベクター
を細胞にトランスフェクトすることにより、試験細胞を準備すること、（ｂ）前記試験細胞を、ＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストであると
推測される物質に曝すこと、（ｃ）前記物質に曝された前記試験細胞の機能的応答の量を測定すること、（ｄ）前記試験細胞により示された機能的応答の量と、前記対照細胞により示
された機能的応答の量とを比較すること、ここにおいて、前記試験細胞により示された機能的応答の量が、前記対照細胞
により示された機能的応答の量と異なっている場合に、前記物質がＧＰＲ５４の
アゴニスト又はアンタゴニストであり、前記対照細胞は、ＧＰＲ５４でトランスフェクトされていないが前記物質に曝
された細胞、又は前記物質に曝されていない前記試験細胞であり、ＧＰＲ５４は配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有する、を含む、ＧＰＲ５４のアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項１３】配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を有する、
を含む、ＧＰＲ５４と特異的に結合する抗体。