JP2002512781A

JP2002512781A - Ｇタンパク質共役型７ｔｍ受容体（ａｘｏｒ−１）

Info

Publication number: JP2002512781A
Application number: JP2000545892A
Authority: JP
Inventors: バーグスマ，デルク; エルスアワーバジー，ナビル; シャボン，ウスマン
Original assignee: スミスクラインビーチャムコーポレーション
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2002-05-08
Also published as: EP1104440A4; US6071722A; WO1999055734A1; EP1104440A1

Abstract

(57)【要約】 AXOR1ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術により生産する方法が開示されている。さらに、AXOR1ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを治療に用いる方法、およびそのための診断アッセイも開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、1998年4月24日に出願された米国仮出願第60/082,981号、および199
8年6月17日に出願された米国仮出願第60/089,639号の優先権の利益を主張するも
のであり、参照により両方の該仮出願の内容はその全体が本明細書中に組み込ま
れる。

【０００２】発明の分野本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターであ
る化合物を同定する際の使用、並びに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
生産方法に関する。

【０００３】発明の背景薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「ゲノム機能学」(functional genomics)、すなわちハイスループット（高効率
）のゲノムまたは遺伝子ベースの生物学に及んでいるからである。このアプロー
チは「ポジショナルクローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急速に
取って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定され
、続いてその遺伝子地図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められてき
た。

【０００４】ゲノム機能学は、現在入手できる多くの分子生物学データベースから興味のも
てそうな遺伝子配列を同定するための生物情報科学(bioinformatics)の様々なツ
ールに大きく依存している。依然として、未解明の遺伝子およびその関連ポリペ
プチド／タンパク質を薬物探索の標的として同定し特性づける必要性がまだ存在
している。

【０００５】数多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Gタンパク質および/またはcAMP
等の二次メッセンジャーを伴うシグナル伝達経路に関与するタンパク質によって
媒介されることは十分に実証されている（Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-3
54）。本明細書においては、これらのタンパク質を、Gタンパク質を伴う経路に
関与するタンパク質、すなわちPPGタンパク質と称する。これらのタンパク質の
いくつかの例には、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するもの等の
GPC受容体（Kobilka, B.K.,ら、Proc. Natl Acad. Sci., USA, 1987, 84:46-50;
Kobilka, B.K.,ら、Science, 1987, 238:650-656;Bunzow, J.R.ら、Nature, 198
8, 336:783-787）、Gタンパク質自体、例えばホスホリパーゼC、アデニルシクラ
ーゼ、およびホスホジエステラーゼなどのエフェクタータンパク質、ならびに例
えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼCなどのアクチュエータータ
ンパク質が含まれる(Simon, M.I.ら、Science, 1991, 252;802-8)。

【０００６】例えば、シグナル伝達の1つの型においては、ホルモン結合の効果は酵素アデ
ニル酸シクラーゼの細胞内での活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌク
レオチドGTPの存在に依存する。GTPもまたホルモン結合に影響を及ぼす。Gタン
パク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結び付ける。Gタンパク質は
、ホルモン受容体によって活性化された場合にGTPと結合されたGDPとを交換する
ことが示されている。続いてGTP担持形態は活性化されたアデニル酸シクラーゼ
に結合する。Gタンパク質それ自体によって触媒されるGTPのGDPへの加水分解に
よって、Gタンパク質はその不活性な基底形態へ戻る。このように、Gタンパク質
は、受容体からエフェクターへシグナルをリレーする仲介体としての、およびシ
グナルの持続時間を制御する時計としての二重の役割を果たす。

【０００７】 Gタンパク質共役型受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、推定
上の膜貫通ドメインを７つ有するものとして特徴づけられている。このドメイン
は、細胞外ループまたは細胞質ループによって連結された膜貫通α-ヘリックス
を提示すると考えられている。Gタンパク質共役型受容体には、生物学的に活性
な幅広い範囲の受容体（ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経受容体等）が
含まれる。

【０００８】 Gタンパク質共役型受容体 (別名7TM受容体として知られている)は、少なくと
も8つの分岐した疎水性ループと接続している、これら7つの保存された疎水性の
約20〜30アミノ酸ストレッチを含むことによって、特徴づけられている。共役型
受容体であるGタンパク質ファミリーには、ドーパミン受容体（精神病および神
経系障害の治療に使用される神経弛緩薬に結合する）を含む。このファミリーの
メンバーの他の例には、以下に限定されるものではないが、カルシトニン、アド
レナリン様作用薬、エンドセリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン様作用薬、ア
セチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモ
ン、オプシン、内皮分化遺伝子-1、ロドプシン、臭気物質およびサイトメガロウ
イルスの受容体が含まれる。

【０００９】大部分のGタンパク質共役型受容体は、最初の2つの細胞外ループ（機能的なタ
ンパク質構造を安定化していると考えれられているジスルフィド結合を形成して
いる）のそれぞれにおいて単一の保存されたシステイン残基を有している。7つ
の膜貫通領域はTM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と称される。TM3はシグ
ナル伝達に密接に関連している。

【００１０】システイン残基のリン酸化と脂質化（パルミトイル化またはファルネシル化）
は、いくつかのGタンパク質共役型受容体のシグナル伝達に影響を及ぼし得る。
大部分のGタンパク質共役型受容体は潜在的リン酸化部位を３つ目の細胞質ルー
プ内および/またはカルボキシ末端内に有している。いくつかのGタンパク質共役
型受容体（β-アドレナリン受容体等）においては、プロテインキナーゼAおよび
/または特定の受容体キナーゼが受容体の脱感作を媒介する。

【００１１】いくつかの受容体に関しては、Gタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位
は、いくつかのGタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインによって形成される疎
水性ソケットを含み、該ソケットは、Gタンパク質共役型受容体の疎水性残基に
よって囲まれている、と考えられている。各々のGタンパク質共役型受容体膜貫
通ヘリックスの疎水性側は内側を向き、極性リガンド結合部位を形成すると仮定
される。TM3は、いくつかのGタンパク質共役型受容体において、TM3アスパルテ
ート残基等のリガンド結合部位を有するものとして関連している。TM5セリン、T
M6アスパラギンおよびTM6またはTM7フェニルアラニンまたはチロシンもまた、リ
ガンド結合に関連している。

【００１２】 Gタンパク質共役型受容体は細胞内で、ヘテロ三量体であるGタンパク質によっ
て、様々な細胞内酵素、イオンチャネルおよびトランスポーターと共役させられ
得る(Johnsonら、Endoc. Rev., 1989, 10:317-331を参照されたい)。異なるGタ
ンパク質α-サブユニットが、特定のエフェクターを選択的に刺激し、細胞にお
ける多様な生物学的機能をモジュレートする。Gタンパク質共役型受容体の細胞
質側の残基のリン酸化は、いくつかのGタンパク質共役型受容体の、Gタンパク質
共役の制御のための重要な機構として同定されている。Gタンパク質共役型受容
体は、哺乳動物宿主中の数多くの部位で見られる。これまでの15年間にわたって、7回膜貫通型(7TM)受容体を標的とする約350も
の治療薬が市場に供給されている。

【００１３】発明の概要本発明は、AXOR1、特にAXOR1ポリペプチドおよびAXOR1ポリヌクレオチド、組
換え物質、並びにその生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は、
感染症（細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染症等、特にHIV-1またはHIV-2
によって引き起こされる感染）、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食症、
喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭
心症、心筋梗塞、発作、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、偏頭痛、嘔吐、精
神病および神経系障害（不安、精神分裂症、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重
度精神遅滞を含む）および運動異常（ハンチントン病またはジル・ド・ラ・ツレッ
ト症候群等）-以後まとめて「前記疾患」という-の治療をはじめとする、前記ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。他の態様では、本発明
は、本発明により提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト／イ
ンヒビターを同定する方法、並びに同定された化合物を用いてAXOR1不均衡と関
連した症状を治療することに関する。さらに他の態様において、本発明は不適当
なAXOR1活性またはAXOR1レベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに
関する。

【００１４】発明の説明一つの態様において、本発明はAXOR1ポリペプチドに関する。この種のペプチ
ドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくと
も70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも
90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少
なくとも97-99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプ
チドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２のアミノ酸配列を含
むものがある。

【００１５】本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたる配
列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくと
も80%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは
少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97-99%の同一性を有する単
離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２の
アミノ酸配列からなるポリペプチドがある。本発明の更なるペプチドには、配列番号１に含まれる配列を含んでなるポリヌ
クレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。

【００１６】本発明のポリペプチドはGタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであ
ると考えられる。それゆえ、それらは興味深い。なぜなら、AXOR1の単離によっ
て、多くの生物学的発現および疾病発現に関わる7回膜貫通型受容体（Gタンパク
質共役型受容体）遺伝子ファミリーに、更なるメンバーが加えられるからである
。これらの特性を以後「AXOR1活性」または「AXOR1ポリペプチド活性」または「
AXOR1の生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記AXOR1ポリペプチド
の抗原性および免疫原性活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原性および免
疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドはAXOR1の少なくとも１つの生物
学的活性を示すことが好ましい。

【００１７】本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌す
なわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列
、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。

【００１８】また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち同類アミノ酸置換（ある残基が性
質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違してい
るポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間；
塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、
数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が任意
の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好適である。

【００１９】本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。

【００２０】本発明の更なる態様において、本発明は、AXOR1ポリヌクレオチドに関する。
このようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、
より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の
同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離さ
れたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の同一性を
有するポリペプチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一性を有す
るものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドが
最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号２のポリペ
プチドをコードする配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌ
クレオチドが挙げられる。

【００２１】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列に対して、その全コード領域にわたって、少なくとも70%の
同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくと
も９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも９８
〜９９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性
を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。

【００２２】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたる配列番号１
のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%
の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少な
くとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌク
レオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌ
クレオチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものが
より一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も
好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号１のポリヌクレ
オチドを含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号１のポリヌクレオチドが挙
げられる。本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオ
チドを提供する。

【００２３】配列番号１のヌクレオチド配列は、マウスGPR27[B.F.O'Dowdら、Genomics 47(
2), 310-313]に対して相同性を示す。配列番号１のヌクレオチド配列はcDNA配列
であり、370個のアミノ酸のポリペプチドである配列番号２のポリペプチドをコ
ードするポリペプチドコード配列（ヌクレオチド1〜1113）を含んでいる。この
配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含ま
れているポリペプチドコード配列と同一であってもよく、または配列番号１に含
まれているもの以外の配列であって、遺伝コードの重複性（縮重）の結果として
、配列番号２のポリペプチドを同じくコードする配列であってもよい。配列番号
２のポリペプチドは、ヒトGPR27[B.F.O'Dowdら、Genomics 47(2), 310-313(1998
)]に対して相同性および/または構造的類似性を有する、Gタンパク質共役型受容
体ファミリーの他のタンパク質と、構造的に関連している。

【００２４】本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのAXOR1活性を有する。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニングに
より、ヒト精巣の細胞中のmRNAから誘導されたcDNAライブラリーから、発現配列
タグ(EST)解析(Adams, M.D.ら、Science(1991)252:1651-1656;Adams, M.D.ら、N
ature, (1992)355:632-634;Adams, M.D.ら、Nature (1995) 377 Supp:3-174)を
用いて得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムDNAライブ
ラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用
いて合成することもできる。

【００２６】本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、pQEベクター(
Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (198
9) 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡ
タグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例えば、
転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル
、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列を含んでいてもよい。

【００２７】本発明の更なる具体例としては、数個、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３
個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付
加されている、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドがある。

【００２８】配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一性を有する
ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする完全長cDNAおよびゲノ
ムクローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有す
る他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体(homolog)およびオーソログ体(or
tholog)をコードする遺伝子を含む）のcDNAおよびゲノムクローンを単離するた
めに、cDNAおよびゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして、また
は核酸増幅（PCR）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、
これらのヌクレオチド配列は基準のヌクレオチド配列と７０％、好ましくは８０
％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたは
プライマーはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上
を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブ
は３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００２９】本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体を
含む）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列または
その断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配
列を含む完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる方法に
より得られる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。
好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミド
、５×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム
(pH7.6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪
断したサケ精子DNAを含有する溶液中42℃で一夜インキュベートし、次いでフィ
ルターを 0.1×SSC 中約65℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列
番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリー
ニングすることにより得られるポリヌクレオチドをも包含する。

【００３０】当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域が
そのcDNAの5'末端で短く切断されることから、単離されたcDNA配列は不完全であ
るだろう。それは逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロセシビテ
ィ」（processivity：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の能力の尺
度）が低く、第一鎖cDNA合成の間にmRNA鋳型のDNAコピーを完成させることがで
きない。

【００３１】完全長cDNAを得るための、または短鎖cDNAを伸長させるための、当業者に公知
で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、cDNA末端高速増幅法（RACE）に基づ
いた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988を参照の
こと）。例えばMarathon^TM技術(Clontech Laboratories Inc.)により示されるよ
うな、上記技法の最近の改良により、より長いcDNAの検索が大いに簡便化された
。Marathon^TM技術では、所定の組織より抽出されたmRNAからcDNAを作製し、各末
端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝子特異的およびアダプター特
異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて核酸増幅（PCR）を行い
、cDNAの「欠失」5'末端を増幅する。次に、「nested」プライマー、すなわち増
幅産物の内部にアニールするように設計されたプライマー（典型的には、アダプ
ター配列のさらに3'側にアニールするアダプター特異的プライマーおよび既知遺
伝子配列のさらに5'側にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いてPCR反
応を繰り返す。その後、この反応の産物をDNA塩基配列決定により解析し、この
産物を既存のcDNAに直接結合するか、または5'プライマー設計用の新たな配列情
報を用いて別の全長PCRを行うことにより、完全長cDNAを構築することができる
。

【００３２】本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、該
発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプ
チドの生産に関する。本発明のDNA構築物から誘導されたRNAを用いてこの種のタ
ンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。

【００３３】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチドの
導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986) および Sambro
okら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989）などの多くの標準的な
実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適なこうした方
法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラ
ン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロイ
ンジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレー
ション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(balli
stic introduction)または感染などがある。

【００３４】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス(Strepto
cocci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミ
セス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス(Aspergillus)）、昆虫細胞（例：ショウジョウバエ(Drosophila)S
2、スポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127
、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。

【００３５】多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、SV40のような
パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂
犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに由来
するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリ
オファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿主内
でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現する
ことができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いられる
公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入すること
ができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞
外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み
込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ
っても、異種シグナルであってもよい。

【００３６】スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させよう
とする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。
該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。

【００３７】組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは、
タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーシ
ョンを復元することが可能である。

【００３８】本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した発現により生
ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を
下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然変異がある個体を、さ
まざまな技法によりDNAレベルで見つけ出すことができる。

【００３９】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムDNAを直接使用し
てもよいし、分析前にPCRまたは他の増幅法を使ってゲノムDNAを酵素的に増幅し
てもよい。同様の方法でRNAまたはcDNAを使用することもできる。欠失および挿
入突然変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により
検出できる。点突然変異は増幅DNAを標識AXOR1ヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲ
Ｎアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、DNA配列
の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのDNA断片の電気泳動の移動度
の変化により、または直接DNA塩基配列決定によっても検出できる（例えば、Mye
rsら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌク
レアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクショ
ン）または化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、例えば、遺
伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、AXOR1ヌクレオチド配列また
はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array)を構築すること
ができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝
的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすた
めに用いられている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, pp.610-613 (199
6) を参照のこと）。

【００４０】診断アッセイは、前記の方法によりAXOR1遺伝子の変異を検出することで、前
記疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、被験者か
ら得られたサンプルからポリペプチドまたはmRNAのレベルの異常な低下または増
加を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低下また
は増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例：PC
R、RT-PCR）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッティング、その他の
ハイブリダイゼーション法のいずれかによりRNAレベルで測定することができる
。宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドのようなタンパク質のレベ
ルを測定するアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法とし
て、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELIS
Aアッセイなどがある。

【００４１】かくして、もう一つの態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列
）もしくはその断片、 (b) (a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしく
はその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、を含んでなる診断用キットに関する。

【００４２】このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分
であることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさを、
特に、感染症（細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染症等、特にHIV-1また
はHIV-2によって引き起こされる感染）、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、
過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょ
う症、狭心症、心筋梗塞、発作、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、偏頭痛、
嘔吐、精神病および神経系障害（不安、精神分裂症、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆
および重度精神遅滞を含む）および運動異常（ハンチントン病またはジル・ド・ラ
・ツレット症候群等）について診断するうえで有用である。

【００４３】また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の位置同定にも有用である。この配
列は個々のヒト染色体上の特定の位置をターゲッティングし、その特定位置とハ
イブリダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成す
ることは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一段階
である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップされたら、その染色体上のそ
の配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデー
タは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins U
niversity Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見いだせる
。その後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解析（
物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。

【００４４】罹患個体と非罹患個体とのcDNAまたはゲノム配列の差異も調べることができる
。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも観察
されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。

【００４５】本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。

【００４６】本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（
好ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製に
は、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる
。例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C., Nature (
1975) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら,
Immunology Today (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリドーマ法 (Coleら, Monoc
lonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)
などがある。

【００４７】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。

【００４８】前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。

【００４９】本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。

【００５０】本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ
鎖の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製された可溶性融
合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にIgG1のＨ鎖の定
常部が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定例では、血液凝固
因子Xaで開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Fc部分を簡単に除去できる。
さらに、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、並びに薬物
スクリーニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。また、本発明
の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関す
る。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914に見
いだせる。

【００５１】本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。

【００５２】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または
増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量
容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供すること
ができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのア
ジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュバ
ント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが、ルー
チンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５３】本発明のポリペプチドは、多くの病的状態、特に前記疾患を含めて、さまざま
な生物学的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激また
は抑制する化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。した
がって、更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または
抑制する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的
には、前記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニスト
が使用される。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラ
リーおよび天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同
定されたアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポ
リペプチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであっ
てよく、また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliga
nら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと
）。

【００５４】スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの不在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べる
ことによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的に
活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は、
候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり
、この混合物中のAXOR1活性を測定し、そしてこの混合物のAXOR1活性をスタンダ
ードと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチドのアン
タゴニストを同定するハイスループットスクリーニングアッセイでは、上記のよ
うなＦｃ部分とAXOR1ポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用
することができる(D. Bennettら, J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995) およ
びK. Johansonら, J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (1995)を参照のこと）
。

【００５５】 1つのスクリーニング技術では、本発明の受容体を発現する細胞（例えばトラ
ンスフェクトしたCHO細胞等）を、受容体の活性化によって引き起こされる細胞
内カルシウム変化または細胞外pH変化を測定するシステムにおいて使用すること
を含む。この技術においては、化合物を、本発明の受容体ポリペプチドを発現し
ている細胞と接触させてもよい。次いで、二次メッセンジャー応答（例えばシグ
ナル伝達、pH変化またはカルシウムレベルの変化等）を測定し、候補化合物が受
容体を活性化するかまたは阻害するかを決定する。

【００５６】他の方法は、受容体が媒介するcAMPおよび/またはアデニル酸シクラーゼ蓄積
の阻害または刺激を測定することにより、受容体インヒビターをスクリーニング
することを含む。そのような方法は、真核生物細胞を本発明の受容体でトランス
フェクトし該受容体を細胞表面上で発現させることを含む。次いで該細胞を、本
発明の受容体の存在下で候補アンタゴニストに曝露する。続いてcAMP蓄積量を測
定する。候補アンタゴニストが受容体に結合し、それ故に受容体結合を阻害した
場合には、受容体が媒介するcAMPのレベルまたはアデニル酸シクラーゼ活性のレ
ベルが減少または増加するであろう。

【００５７】本発明の受容体に関するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するための他
の方法は、米国特許第5,482,835号に記載されたような酵母に基づく方法である
。

【００５８】また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのmRNAまたはポリペプチドの産生に及ぼす添加化合物
の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例えば、
当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用い
て、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳ
Ａアッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織から
のポリペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまた
はアゴニストともいう）の探索に用いることができる。

【００５９】膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：¹²⁵I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合さ
せ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など
）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分
光学のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペプ
チドまたは（存在するのであれば）その受容体への結合と競合する該ポリペプチ
ドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。ス
クリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている
。

【００６０】本発明のポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場
合には、該ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があ
るオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、
酵素などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
（それゆえ該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。

【００６１】かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、 (a) 本発明のポリペプチド、 (b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 (c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または (d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、を含んでなり、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである
。

【００６２】このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分
であることが理解されよう。

【００６３】当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 (a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 (b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの確実と思われる反応部
位または結合部位の三次元構造を想定し、 (c) 想定された反応部位または結合部位と結合または反応すると予想される候
補化合物を合成し、そして (d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター
であるか否かを調べる、ことを含んでなる。これは通常反復プロセスであることがさらに理解されよう。

【００６４】更なる態様において、本発明は、AXOR1ポリペプチド活性の過剰または過少発
現のいずれかに関係した、例えば、感染症（細菌、真菌、原生動物およびウイル
ス感染症等、特にHIV-1またはHIV-2によって引き起こされる感染）、疼痛、癌、
糖尿病、肥満、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧
、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、発作、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大、偏頭痛、嘔吐、精神病および神経系障害（不安、精神分裂症、
躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重度精神遅滞を含む）および運動異常（ハンチ
ントン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群等）などの異常な状態の治療法を提
供する。

【００６５】該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに
患者に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内因性のポリペ
プチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力がまだ
ある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このような競合物質の
典型的な例はAXOR1ポリペプチドの断片である。

【００６６】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性AXOR1ポリペプチドを
コードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で
産生されるか外部から投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（例えば
、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (遺伝
子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド), CRC
Press, Boca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560を
参照のこと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせん(トリプレックス)を
形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる（例えば、Leeら, Nucleic
Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Sci
ence (1991) 251:1360 を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与
することもできるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させることもできる。

【００６７】 AXOR1およびその活性の過少発現に関連した異常な状態を治療するためにも、
いくつかのアプローチを利用し得る。1つのアプローチは、被験者に対して、本
発明のポリペプチドを活性化する化合物（即ち上記のアゴニスト）を治療に有効
な量で、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて投与し、それによって異常な状
態を緩和することを含む。他には、被験者の体内の関連細胞においてAXOR1の内
因性生産をもたらすために、遺伝子治療が用いられ得る。例えば、本発明のポリ
ヌクレオチドを、複製欠損レトロウイルスベクターにおいて発現させるために、
上記のように遺伝子操作し得る。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、
パッケージング細胞に導入し得る。該パッケージング細胞は、本発明のポリペプ
チドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入され
、目的の遺伝子を含む感染性のウイルス粒子を、パッケージング細胞が産生する
ようになる。これらのプロデューサー細胞は、in vivoでの細胞の遺伝子操作お
よびin vivoでのポリペプチドの発現のために被験者に投与され得る。遺伝子治
療について総覧するには、Human Molecular Genetics, T StrachanおよびA.P Re
ad, BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)の第20章 Gene Therapy and other
Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches（およびそこにおいて参照さ
れた文献）を参照されたい。別のアプローチは、本発明のポリペプチドを治療に
有効な量で、好適な医薬用担体と組み合わせて投与するものである。

【００６８】更なる態様においては、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば可
溶性形態の本発明のポリペプチド）、アゴニストペプチド/アンタゴニストペプ
チド、または低分子化合物を、薬学的に許容し得る担体または賦形剤と組み合わ
せて含む医薬組成物を提供する。そのような担体には、生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せ
が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明はさらに、前述の本発
明の組成物の1種以上の成分を充填した容器を1以上含んでなる医薬用パックおよ
びキットに関するものである。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独
で用いてもよく、または治療用化合物等の他の化合物と組み合わせて用いてもよ
い。

【００６９】医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入（注射）、典型的には静注である。
皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の
手段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経
粘膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を
腸溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である
。これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ
／または局在化させてもよい。

【００７０】必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与
量は患者の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が多様
であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は
広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与よりも高
い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当業界
でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整すること
ができる。

【００７１】治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのようなポリヌクレオチドにより、例え
ばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工学的に操作
する。その後、これらの細胞を患者に導入する。

【００７２】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてＧＣＧのような
公知の検索ツールにより配列データベースを検索することで最大限促進される。
したがって、更なる態様において、本発明は、配列番号１の配列を含んでなるポ
リヌクレオチドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドを保存した
コンピュータ読み取り可能媒体を提供する。以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。

【００７３】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン
発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。

【００７４】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないRNAもしくはDNA、また
は修飾されたRNAもしくはDNAであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限する
ものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合
ったDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったRNA
、DNAとRNAを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより典型的には二本鎖
でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。
加えて、「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方からなる三
重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾
塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された
骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化
された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。DNAおよびRNAに対してさ
まざまな修飾を行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾され
た形態、並びにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される
比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００７５】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）
の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ
酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸
配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究
文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカル
ボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの
修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる
程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含ん
でいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のあ
る又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリ
ペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって
製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル
化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合
、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形
成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒド
ロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロ
セシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニ
ル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが
ある（例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.
E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Pe
rspectives and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis for protein m
odifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646;
および Rattanら, “Protein Synthesis: Post-translational Modifications
and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。

【００７６】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および
末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体
は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプ
チドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一とな
るような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以
上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または付加
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくて
もよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように
天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であって
もよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突
然変異誘発法または直接合成により作製することができる。

【００７７】当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関連性
の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算出
することができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular Biolo
gy, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press, New Yor
k, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and G
riffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Mo
lecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis
Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New York, 1
991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するため
の好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計され
る。さらに、同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュー
タプログラムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定する好適
なコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devereux
, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳ
ＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990
)) があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他
のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM
NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990
))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる
。

【００７８】ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)；比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter
) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。

【００７９】ポリヌクレオチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む
：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)；比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらのパラメ
ーターは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。

【００８０】例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号１の基準配列と同一、す
なわち100％同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのヌクレオ
チド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失
、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または付加よりなる
群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置
、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオ
チドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介在す
ることができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に
、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け、その積を配列番号１のヌクレ
オチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式：ｎ_n≦ｘ_n −（ｘ_n・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_nはヌクレオチド変異の数であり、ｘ_nは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％に
ついては0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.95
などであり、ｘ_nとｙの非整数の積は、その積をｘ_nから引く前に、最も近似する
整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の改変は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突
然変異を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチドによりコ
ードされたポリペプチドを改変させることができる。

【００８１】同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわち
100％の同一性であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸変
異を含んで同一性％が100％未満であってもよい。前記変異は少なくとも１個の
アミノ酸の欠失、置換（同類および非同類アミノ酸置換を含む）または付加より
なる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカ
ルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、基
準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグルー
プとして介在することができる。所定の同一性％についてのアミノ酸変異の数は
、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛
け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわち、
次式：ｎ_a ≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、ｘ_aとｙの非整数の積は、その積をｘ_a から引く前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００８２】「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンFc領
域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が向上する
（例えば、EP-A- 0232 262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとっては、
その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でFc部分を除去することが
望ましいだろう。

【００８３】本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。

【００８４】実施例実施例1：哺乳動物細胞発現本発明の受容体をヒト胚腎臓293(HEK293)細胞または付着dhfr CHO細胞のいず
れかにおいて発現させた。受容体の発現を最大化するために、典型的には、pCDN
ベクターまたはpCDNA3ベクターに挿入する前に、全ての5'および3'非翻訳領域(U
TR)を受容体cDNAから除去した。細胞を個々の受容体cDNAでリポフェクションに
よってトランスフェクトし、400mg/ml G418の存在下で選択した。選択の3週間後
、個々のクローンをピックアップし、さらに分析を行った。ベクター単独でトラ
ンスフェクトしたHEK293またはCHO細胞を陰性対照とした。個々の受容体を安定
して発現する細胞系を単離するために、約24個のクローンを典型的には選択し、
ノーザンブロット解析により分析した。受容体mRNAは、全体としては、分析され
たG418耐性クローンの約50%に検出することができる。

【００８５】実施例2：結合および機能アッセイのためのリガンドバンク 200を超える推定上受容体リガンドを、スクリーニングのためにバンクとして
集めた。該バンクは、ヒト7回膜貫通型(7TM)受容体を介して作用することが知ら
れているケモカイン、伝達物質(transmitter)およびホルモン、ヒト7TM受容体の
推定上アゴニストであり得る天然化合物、対応する哺乳類ペプチドが未だ同定さ
れていない非哺乳類の生物活性ペプチド；並びに天然には見出されないが未知の
天然リガンドとともに7TM受容体を活性化する化合物を含むものである。このバ
ンクは最初に、機能アッセイ(すなわちカルシウム、cAMP、マイクロフィジオメ
ーター、卵母細胞の電気生理学等、下記参照)および結合アッセイの両方を用い
て既知のリガンドの受容体をスクリーニングするために使用した。

【００８６】実施例3：リガンド結合アッセイリガンド結合アッセイは、受容体の薬理作用を確かめるための直接的な方法を
提供し、またハイスループットな方式へ応用できるものである。結合についての
研究のために、受容体に対する精製リガンドを高比活性(50-2000Ci/mmol)にて放
射性標識した。次いで、放射性標識の過程が、リガンドのその受容体に対する活
性を減少させないことを確認した。バッファー、イオン、pHおよびその他のモジ
ュレーター（ヌクレオチド等）についてのアッセイ条件を最適化し、受容体供給
源となる膜および全体細胞の両方に関して、機能し得るシグナル対ノイズ比を確
立した。これらのアッセイに関して、特異的な受容体結合を、（全結合放射活性
）−（過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定された放射活性）と定義した。
可能な場合には、2つ以上の競合リガンドを、残存非特異的結合を規定するため
に使用した。

【００８７】実施例4：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ本発明の受容体cDNAをコードする線状化プラスミド鋳型に由来する、キャップ
構造化RNA転写物を、標準的な手順に従い、in vivoでRNAポリメラーゼを用いて
合成した。in vitroで、転写物を水中に最終濃度0.2mg/mlで懸濁した。卵巣ロー
ブを成体メスカエルから採取した。ステージVの卵胞除去(defolliculated)卵母
細胞を得て、RNA転写物(10ng/卵母細胞)を50nl ボーラスにてマイクロインジェ
クション装置を使用して注入した。2つの電極電位クランプを使用して、アゴニ
ストへの曝露に応答した個々のアフリカツメガエル卵母細胞から電流を測定した
。Ca²⁺を含まないBarth's培地中で室温にて記録した。アフリカツメガエル系は
既知のリガンドおよび組織/細胞抽出物を、リガンドの活性化に関してスクリー
ニングするために使用できる。

【００８８】実施例5：マイクロフィジオメトリーアッセイ非常に様々な二次メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が放出
される。生成された酸はその大部分が、細胞内シグナル伝達過程を活性化するた
めに必要とされる代謝活性の増加の結果である。細胞を取り巻く培地中のpH変化
は非常に微小であるが、CYTOSENSOR マイクロフィジオメーター(Molecular Devi
ces Ltd., Menlo Park, CA)によって検出し得る。このように、このCYTOSENSOR
は、エネルギーを消費する細胞内シグナル伝達経路と共役した受容体（本発明の
Gタンパク質共役型受容体等）の活性化を検出することができる。

【００８９】実施例6：抽出物/細胞上清のスクリーニング多数の哺乳動物受容体は、それに対する同種の活性化リガンド（アゴニスト）
がまだ見出されていないままである。このように、これらの受容体に対する活性
化リガンドは、これまでに同定されたリガンドバンク内に含まれていないことが
あり得る。従って、本発明の7TM受容体はまた、カルシウム、cAMP、マイクロフ
ィジオメーター、卵母細胞電気生理学などの機能的スクリーニングを用い、組織
抽出物に対して天然リガンドを同定するために機能スクリーニングされた。陽性
機能応答を引き起こす抽出物を、活性化リガンドが単離、同定されるまで逐次的
にさらに分画することができる。

【００９０】実施例8：カルシウムおよびcAMP機能アッセイ HEK293細胞で発現された7TM受容体は、PLCの活性化およびカルシウムモビリゼ
ーションおよび/またはcAMP刺激もしくは阻害と機能的に共役することが示され
た。受容体でトランスフェクトされたかまたはベクターで制御されたHEK293細胞
における基本カルシウムレベルは、通常は100nM〜200nMの範囲であることが観察
された。組換え受容体を発現するHEK293細胞を、fura2とともにロードし、一日
に150を超える選択されたリガンドまたは組織/細胞抽出物を、カルシウムモビリ
ゼーションを誘導したアゴニストに関して評価した。同様に、組換え受容体を発
現するHEK293細胞を、cAMP産生の刺激または阻害に関して、通常のcAMP定量アッ
セイを使用して評価した。カルシウムの一過性変動またはcAMP変動を提示したア
ゴニストをベクター制御細胞中で試験し、受容体を発現しているトランスフェク
ト細胞に対して応答が特異的であるかを決定した。

【００９１】配列表フリーテキスト配列情報配列番号１

【００９２】配列番号２

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 9/02 3/10 9/04 9/02 9/12 9/04 11/06 9/12 13/02 11/06 13/08 13/02 17/02 13/08 19/10 17/02 25/00 19/10 25/06 25/00 25/16 25/06 25/28 25/16 29/00 25/28 31/00 29/00 35/00 31/00 37/08 35/00 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号０９／２５１，３７３ (32)優先日平成11年２月16日(1999．2．16) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者エルスアワーバジー，ナビルアメリカ合衆国 19380 ペンシルバニア州，ウェストチェスター，ボウツリードライブ 1648 (72)発明者シャボン，ウスマンアメリカ合衆国 19426 ペンシルバニア州，カレッジヴィル，ハミルトンロード 926

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(i)〜(iii) からなる群より選択される単離されたポ
リペプチド： (i) 配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも (a)70%の同一性、 (b)80%の同一性、 (c)90%の同一性、または (d)95%の同一性、を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、 (ii)配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または (iii)配列番号２のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】以下の(i)〜(vi) からなる群より選択される単離されたポリ
ヌクレオチド、または該単離されたポリヌクレオチドと相補的な配列を有するヌ
クレオチド配列： (i) 配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも (a)70%の同一性、 (b)80%の同一性、 (c)90%の同一性、または (d)95%の同一性、を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌク
レオチド、 (ii) 配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、そ
の全長にわたり少なくとも (a)70%の同一性、 (b)80%の同一性、 (c)90%の同一性、または (d)95%の同一性、を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iii) 配列番号１の全長にわたる配列番号１のヌクレオチド配列に対して少な
くとも (a)70%の同一性、 (b)80%の同一性、 (c)90%の同一性、または (d)95%の同一性、を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iv)配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離され
たポリヌクレオチド、 (v)配列番号１のポリヌクレオチドである単離されたポリヌクレオチド、また
は (vi)配列番号１またはその断片の配列を有する標識プローブを用い、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適なライブラリーをスクリーニ
ングして入手し得る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項１記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項４】被験者の治療方法であって下記の工程： (i)請求項１記載のポリペプチドの活性または発現の増加を要する場合には (a)被験者に、該ポリペプチドに対する治療に有効な量のアゴニストを投与
すること、および／または (b)被験者に、in vivoで前記ポリペプチド活性の産生をもたらす形態で前記
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
を投与することを含んでなるか、あるいは、 (ii)請求項１記載のポリペプチドの活性または発現の阻害を要する場合には (a)被験者に、該ポリペプチドに対する治療に有効な量のアンタゴニストを
投与すること、および／または (b)被験者に、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻
害する核酸分子を投与すること、および／または (c)被験者に、そのリガンド、基質もしくは受容体に関して該ポリペプチド
と競合するポリペプチドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記の治療方法。
【請求項５】被験者における請求項１記載のポリペプチドの発現または活
性に関連した疾病または該疾病への罹りやすさを診断する方法であって、 (a) 該被験者のゲノム内の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突
然変異があるか否かを調べること、および／または (b) 該被験者から得られたサンプルにおける該ポリペプチド発現の存在または
量を分析すること、を含んでなる方法。
【請求項６】請求項１記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制する化
合物を同定するためのスクリーニング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質と、の結合を、該候補化合物に直
接または間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識競合物質の存在
下で測定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグナルを
もたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適した検
出系を用いて調べること、 (d) 候補化合物と、請求項１記載のポリペプチドを含有する溶液とを一緒にし
て混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、該混合物の活
性をスタンダードと比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするmRNAの産生および
該ポリペプチドの産生に及ぼす効果をELISAアッセイ等により検出すること、よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法。
【請求項７】請求項１記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
スト。
【請求項８】発現系が適合性の宿主細胞内に存在する場合の、請求項１記
載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含有する該発現系。
【請求項９】宿主細胞が好適な培養条件下で、配列番号２の全長にわたる
配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配
列を含んでなるポリペプチドを産生するように、請求項８記載の発現系を用いて
、細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる組換え宿主細胞
の作製方法。
【請求項１０】請求項９記載の方法により生産された組換え宿主細胞。
【請求項１１】配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対
して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを
発現する請求項１０記載の組換え宿主細胞の膜。
【請求項１２】ポリペプチドを産生させるのに十分な条件下で請求項１０
記載の宿主細胞を培養し、この培養培地から該ポリペプチドを回収することを含
んでなる前記ポリペプチドの生産方法。