ES2264267T3 - Nuevas proteinas de receptores copulados a proteina g. - Google Patents

Abstract

Una proteína de receptor copulado a proteína G que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 4.

Description

Nuevas proteínas de receptores copulados a proteína G.

Campo técnico

Esta invención pertenece al campo de la ingeniería genética y se relaciona con nuevas proteínas de receptores copulados a proteína G, con un ADN codificante de estas proteínas de receptores copulados a proteína G, con métodos para producir estas proteínas de receptores copulados a proteína G, con métodos de rastreo que usan estas proteínas de receptores copulados a proteína G, con anticuerpos para estas proteínas de receptores copulados a proteína G y con métodos de rastreo que emplean estos anticuerpos.

Técnica anterior

Generalmente se hace referencia a los receptores de la membrana celular que transmiten señales a la región intracelular por activación de proteína de unión a GTP heterotrimérica como "receptor copulado a proteína G". Se hace a veces referencia a todos los miembros del receptor copulado a proteína G conocidos hasta la fecha, en general, como "receptor de siete transmembranas", ya que forman una superfamilia que tiene una estructura común que tiene el extremo amino extracelular y el extremo carboxilo intracelular y que pasa a través de la membrana celular siete veces. El receptor copulado a proteína G transmite información sobre diversas substancias fisiológicamente activas desde las membranas celulares hasta la región intracelular por activación de proteína de unión a GTP heterotrimérica y cambios posteriores en los segundos mensajeros intracelulares inducidos. Como segundos mensajeros intracelulares controlados por la proteína de unión a GTP heterotrimérica, el AMPc a través de la adenilato ciclasa, el Ca^{++} a través de la fosfolipasa C y similares son bien conocidos y se ha revelado recientemente que muchas proteínas celulares son sus blancos, tal como el control de canales y la activación de proteína kinasas a través de la proteína de unión a GTP heterotrimérica (Gudermann, T. y col. (1997), Annu. Rev. Neurosci., 20, 399-427). Las substancias fisiológicamente activas que transmiten información a través del receptor copulado a proteína G incluyen diversas substancias conocidas fisiológicamente activas, tales como neurotransmisores, hormonas, quimiokina, transductores de señal originados por lípidos, iones divalentes y proteasas. La información mediante estas substancias fisiológicamente activas es transmitida a la región intracelular a través de su receptor copulado a proteína G específico, respectivamente.

Se han clonado hasta la fecha varios centenares de tipos de receptor copulado a proteína G a partir de eucariotas. En cuanto a humanos, se han clonado cien o más tipos de receptor copulado a proteína G para ligandos endógenos correspondientes y se les considera como blancos de fármacos para enfermedades. Existen varias enfermedades en las que el receptor copulado a proteína G es el blanco y existen fármacos efectivos que actúan sobre el receptor copulado a proteína G, en los campos respectivos del sistema nervioso central, del sistema de órganos circulatorios, del sistema inmune inflamatorio, del sistema de órganos digestivos, del sistema de órganos motores y del sistema de órganos urinarios/órganos reproductores (Stadel, J. y col. (1997), Trends Pharmacol. Sci., 18, 430-437). Esto indica que los agonistas o antagonistas del receptor copulado a proteína G tienen una alta posibilidad de convertirse en un agente terapéutico de enfermedades, de tal forma que se están llevando a cabo activamente estudios sobre el descubrimiento y la identificación de nuevos receptores copulados a proteína G.

La clonación de genes de receptores copulados a proteína G tiende a iniciarse en base a su homología estructural en la superfamilia en muchos casos y se hace referencia a un receptor que no tenga correspondencia con ligandos endógenos como "el receptor copulado a proteína G huérfano". En general, no se ha descubierto un ligando específico para el receptor copulado a proteína G huérfano, de tal forma que es difícil desarrollar su agonista o antagonista. En los últimos años, sin embargo, se ha propuesto crear un abordaje de fármacos para el receptor copulado a proteína G huérfano combinando las librerías de compuestos substanciadas y un rastreo de alta producción y de alto rendimiento (Stadel, J. y col. (1997), Trends Pharmacol. Sci., 18, 430-437).

Es decir, que es posible rastrear un agonista para un receptor copulado a proteína G huérfano a partir de una librería de compuestos por un sistema efectivo de alto rendimiento de la medición de AMPc y Ca^{++}, que son segundos mensajeros de muchos receptores copulados a proteína G, o de la medición de la actividad GTPasa y de la unión a proteína G de GTP\gammaS, que son índices de la activación de la proteína de unión a GTP heterotrimérica, de tal forma que es posible encontrar agonistas y antagonistas específicos haciendo uso de dichos compuestos y, más aún, desarrollar fármacos terapéuticos para determinadas enfermedades. En tales condiciones, se considera el descubrimiento de un nuevo receptor copulado a proteína G capaz de convertirse en un nuevo blanco terapéutico de enfermedades como la etapa más importante en la creación de un medicamento que actúe sobre los receptores copulados a proteína G.

Entre los receptores copulados a proteína G, existe un caso en el que está presente una pluralidad de receptores para un ligando endógeno. Se hace referencia a dichos receptores como familia de receptores y se llama a cada receptor subtipo. Como todos los receptores copulados a proteína G tienen una estructura común que pasa a través de la membrana celular siete veces, están conservados de un 20 a un 25% de los aminoácidos principalmente en la región de transmembrana, incluso en los receptores copulados a proteína G mutuamente independientes, pero, cuando forman una familia de receptores, la razón de los aminoácidos conservados entre sus subtipos aumenta significativamente al 35% o más, particularmente a un 60 a un 80% entre subtipos que tienen una alta relevancia (Strader, C.D. y col. (1994), Annu. Rev. Biochem., 63, 101-132).

Cuando se planea el desarrollo de un fármaco terapéutico para enfermedades para dirigirse a un ligando endógeno en donde está presente una familia de receptores, la especificidad de sus subtipos se vuelve importante en muchos casos. Esto es debido a que las acciones sobre otro subtipo, más que las acciones sobre un subtipo que media en la acción principal de un fármaco, conducen a efectos colaterales en muchos casos. En consecuencia, es deseable crear un agonista o antagonista específico de subtipo, pero es necesario encontrar un medio para detectar la especificidad de subtipo con ese fin. Actualmente, se usa generalmente un método para construir un sistema en el que se clona un gen de un subtipo y se detecta su especificidad usando una línea celular cultivada o similar que expresa el gen.

Cuando se usa un nuevo receptor copulado a proteína G como el blanco del tratamiento de una enfermedad, es muy posible que la especificidad de subtipo sea importante, de tal forma que es importante el descubrimiento de una familia de receptores también en el caso del nuevo receptor copulado a proteína G. La homología de secuencias de aminoácidos entre receptores copulados a proteína G independientes es del 20 al 25% en conjunto, pero, cuando forman una familia de receptores, la homología aumenta significativamente en general en la familia, de tal forma que es posible suponer si forman una familia o no comparando la homología entre dos receptores copulados a proteína G. Es posible hallar nuevos receptores copulados a proteína G que formen una familia usando dicho medio y, cuando se descubre una nueva familia de receptores copulados a proteína G, abrirá una vía para desarrollar un fármaco para la terapia de la enfermedad debido a la posibilidad de crear un agonista o antagonista específico de
subtipo.

El sistema nervioso central transmite y controla diversos tipos de información usando substancias fisiológicamente activas representadas por los neurotransmisores. El receptor copulado a proteína G está adoptando un papel importante en la transducción y el control de la señal. Como muchos tipos de receptor copulado a proteína G están presentes en el sistema nervioso central, se usan como blancos terapéuticos importantes para enfermedades del sistema nervioso central. Por ejemplo, se considera que el receptor copulado a proteína G de un neurotransmisor, la dopamina, es un blanco terapéutico de la esquizofrenia (Seeman, P. y col. (1997), Neuropsychopharmacology, 16, 93-110), que el receptor copulado a proteína G de la serotonina es el de la depresión (Cowen, P.J. (1991), Br. J. Psychiatry, 159 (Supl. 12), 7-14) y que el receptor copulado a proteína G del neuropéptido Y es el del trastorno de la alimentación (Blomqvist, A.G. y Herzog, H. (1997), Trends Neurosci. 20, 294-298).

Se considera que un nuevo receptor copulado a proteína G que se expresa en el sistema nervioso central, preferiblemente un receptor humano, conducirá a un candidato para un nuevo blanco terapéutico de enfermedades del sistema nervioso central o a la elucidación de las funciones del sistema nervioso central. Además, con fines de desarrollar un fármaco específico de subtipo, es deseable también encontrar una familia en el caso del nuevo receptor copulado a proteína G que se expresa en el sistema nervioso central. Aunque se han descrito el gen de un receptor GPR27 obtenido de un ratón, que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácidos de SREB1, que es uno de los receptores copulados a proteína G de la invención, y una secuencia de aminoácidos basada en su secuencia génica (O'Dowd, B.F. y col. (1998), Genomics, 47, 310-313), no se dispone de información hasta la fecha concerniente a la secuencia génica y a la secuencia de aminoácidos de un receptor humano.

Descripción de la invención

La presente invención tiene por objeto proporcionar una nueva proteína de receptor copulado a proteína G expresada en el sistema nervioso central como blanco de agentes terapéuticos para enfermedades del sistema nervioso central.

Con el fin de conseguir el objeto anterior, los presentes inventores hemos realizado estudios intensivos y, como resultado de ellos, consiguieron aislar genes (SREB1, SREB2, SREB3, rSREB1, rSREB2 y rSREB3) que también codifican para la nueva proteína de la familia de los receptores copulados a proteína G expresada en el sistema nervioso central, a saber, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº 4.

Además, hemos establecido vectores que contienen estos genes, células huésped que contienen estos vectores y métodos para producir estas proteínas de receptores copulados a proteína G usando dichas células huésped, y hemos hecho posible el rastreo de estas proteínas de receptores copulados a proteína G y compuestos, péptidos y anticuerpos capaces de modificar las actividades de las proteínas de los receptores copulados a proteína G.

De forma ilustrativa, la presente invención se relaciona con:

(1) una proteína de receptor copulado a proteína G que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4, preferiblemente una proteína de receptores copulados a proteína G de origen humano que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4;

(2) un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína de receptor copulado a proteína G descrita en el punto (1);

(3) un vector que contiene el ADN descrito en el punto (3);

(4) una célula huésped que contiene el vector descrito en el punto (3);

(5) un método para producir la proteína de receptor copulado a proteína G descrita en el punto (1), que consiste en usar la célula huésped descrita en el punto (4);

(6) un método para rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar la actividad del receptor copulado a proteína G en el punto (1), que consiste en dejar que dicha proteína de receptor copulado a proteína G contacte con un compuesto, péptido o anticuerpo que ha de ser estudiado y en medir el índice de modificación de la proteína de receptor copulado a proteína G en respuesta a una característica fisiológica del receptor copulado a proteína G;

o

(7) un anticuerpo o fragmento activo de anticuerpo para la proteína del receptor copulado a proteína G descrita en el punto (1) o un péptido parcial de la misma.

Lo que sigue explica los términos que se han de usar aquí.

El término "origen humano" u "origen de rata" significa una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una proteína de receptor copulado a proteína G que se expresa en humano o en rata.

La proteína de receptor copulado a proteína G de la presente invención es una proteína de receptor copulado a proteína G que se expresa en el sistema nervioso central y tiene la actividad de cualquiera de las proteínas de receptor copulado a proteína G representadas por las secuencias de aminoácidos descritas en la Secuencia Nº 4.

En este sentido, el receptor copulado a proteína G y la proteína de receptor copulado a proteína G tienen el mismo significado.

La nueva proteína de receptor copulado a proteína G de la presente invención está representada por las secuencias de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4. De un modo ilustrativo, todas las proteínas de receptores copulados a proteína G están incluidas en la invención en la medida en que tengan la secuencia de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4. Preferiblemente, es una proteína de receptor copulado a proteína G de origen humano o de rata que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4.

Además, el ADN que tiene una secuencia nucleotídica codificante de la nueva proteína de receptor copulado a proteína G de la invención puede ser cualquier ADN, siempre que tenga una secuencia nucleotídica codificante de la proteína de receptor copulado a proteína G representada por la secuencia de aminoácidos descrita en la Secuencia Nº 4. Más preferiblemente, es un ADN que tiene una secuencia de 1 a 1.110 posiciones de la secuencia nucleotídica descrita en la Secuencia Nº 3, o de 1 a 1.110 posiciones de la secuencia nucleotídica descrita en la Secuencia Nº 23.

El gen que codifica para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención puede ser obtenido por los métodos siguientes.

1) Métodos de producción del nuevo gen de la proteína de receptor copulado a proteína G a) Primer método de producción

Se extrae una muestra de ARNm de células o tejido humanos que tienen la capacidad de producir la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención. A continuación, usando este ARNm como plantilla, se preparan dos cebadores que interponen el ARNm de la proteína de receptor copulado a proteína G o una parte de la región del ARNm. Se puede obtener el ADNc de la proteína de receptor copulado a proteína G o una parte del mismo llevando a cabo una reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (a la que se hará referencia a continuación como RT-PCR) adecuada para SREB1, SREB2 o SREB3 modificando las condiciones de la temperatura de desnaturalización, la adición de agentes desnaturalizantes y similares. A continuación, se puede producir la proteína del receptor integrando el ADNc del receptor copulado a proteína G así obtenido o una parte del mismo en un vector de expresión apropiado y expresándolo en una célula huésped.

En primer lugar, se extraen moléculas de ARN, incluyendo las codificantes de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención, por un método conocido a partir de células o tejido, tal como de cerebro humano o cerebro de rata, que tienen la capacidad de producir la proteína. En cuanto al método de extracción, se pueden poner como ejemplo un método de fenol en caliente con tiocianato de guanidina, un método de tiocianato de guanidina-clorhidrato de guanidina y similares y se puede citar un método de tiocianato de guanidina y cloruro de cesio como método preferido. Se pueden identificar las células o el tejido que tienen la capacidad de producir la proteína por el método de Northern blotting usando un gen que tiene una secuencia nucleotídica codificante de la proteína o una parte de la misma o por el método de Western blotting usando un anticuerpo específico para la proteína.

Se puede llevar a cabo la purificación del ARNm según el método convencional, por ejemplo adhiriendo el ARNm a una columna de oligo(dT)celulosa y eluyéndolo luego de la misma. Además, el ARNm puede ser también fraccionado, por ejemplo por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Alternativamente, se puede usar una preparación de ARNm ya extraído comercial sin llevar a cabo la extracción de ARNm.

A continuación, se sintetiza un ADNc de una sola hebra a partir del ARNm así purificado llevando a cabo una reacción de transcriptasa inversa en presencia de un cebador aleatorio o de un cebador oligo-dT. Esta síntesis puede ser realizada de forma convencional. El nuevo ADN del receptor copulado a proteína G de interés es amplificado sometiendo el ADNc de una sola hebra así obtenido a PCR usando dos cebadores que interponen una región del gen de interés. El ADN así obtenido es fraccionado, por ejemplo, por electroforesis en gel de agarosa. Según lo requiera la ocasión, se puede obtener un fragmento de ADN de interés digiriendo el ADN con enzimas de restricción y conectando luego los digestos.

b) Segundo método de producción

Además del método anterior, el gen de la invención puede ser también producido usando técnicas de ingeniería genética convencionales. En primer lugar, se sintetiza ADNc de una sola hebra usando el ARNm obtenido por el método anterior como plantilla y una transcriptasa inversa y se sintetiza luego ADNc de doble hebra a partir del ADNc de una sola hebra. Como ejemplos del método, se incluyen el método de la nucleasa S1 (Efstratiadis, A. y col., (1976), Cell, 7, 279-288), el método de Land (Land, H. y col. (1981), Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266), el método de O. Joon Yoo (Yoo, O.J. y col. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053) y el método de Okayama-Berg (Okayama, H. y Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161-170).

A continuación, se introduce el plásmido recombinante obtenido por el método anterior en una cepa de Escherichia coli, tal como DH5\alpha, para efectuar su transformación y se puede seleccionar un transformante haciendo uso de la resistencia a la tetraciclina o de la resistencia a la ampicilina como marcador. Por ejemplo, cuando la célula huésped es Escherichia coli, la transformación de la célula huésped puede ser llevada a cabo por el método de Hanahan (Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580), a saber, un método en el que se añade ADN recombinante a células competentes preparadas en presencia de CaCl_{2} y MgCl_{2} o RbCl. En este caso, también se puede usar como vector no sólo un plásmido, sino también un vector fágico lambda o similar.

Se puede seleccionar una cepa que tenga ADN codificante de la nueva proteína de receptor copulado a proteína G de interés a partir de los transformantes así obtenidos, por ejemplo por los siguientes métodos diversos.

(1) Un método de rastreo que utiliza una sonda oligonucleotídica sintética

Se sintetiza un oligonucleótido correspondiente a la porción completa o a una parte de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención (en este caso, puede ser una secuencia nucleotídica derivada usando la utilización de codones o una combinación de varias secuencias nucleotídicas posibles, y, en este último caso, se pueden reducir sus tipos incluyendo inosina) y se utiliza éste como sonda (marcada con ^{32}P o con ^{33}P) y se deja que se hibride con muestras de ADN de transformantes, que se desnaturalizan y fijan sobre un filtro de nitrocelulosa, y se rastrea y selecciona después una cepa positiva.

(2) Un método de rastreo que utiliza una sonda preparada por reacción en cadena de polimerasa

Se sintetizan oligonucleótidos cebadores sentido y cebadores antisentido correspondientes a una parte de la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención y se lleva a cabo una reacción en cadena de polimerasa (Saiki, R.K. y col. (1988), Science 239, 487-491) usando una combinación de ellos para efectuar la amplificación de un fragmento de ADN de interés codificante de la porción completa o de una parte de la proteína del receptor copulado a proteína G. Como ADN plantilla para uso aquí, se puede usar ADNc sintetizado por reacción de transcripción inversa a partir de ARNm de células capaces de producir la proteína del receptor copulado a proteína G o ADN genómico. El fragmento de ADN así preparado es marcado con ^{32}P o con ^{33}P y se utiliza como sonda para seleccionar un clon de interés llevando a cabo hibridación de colonias o hibridación de placas.

(3) Un método de rastreo en el que se produce proteína de receptor copulado a proteína G en otras células animales

Se cultiva un transformante para amplificar el gen de interés, se transfecta el gen en una célula animal (en este caso, se puede usar un plásmido que puede realizar la replicación autónoma y que contiene una región promotora de la transcripción o un plásmido que puede integrarse en el cromosoma de la célula animal) y se produce una proteína codificada por el gen en la superficie celular. Detectando la proteína mediante el uso de un anticuerpo específico para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención, se selecciona una cepa de interés que tiene ADNc codificante de la proteína de receptor copulado a proteína G a partir de los transformantes originales.

(4) Un método de selección que utiliza un anticuerpo específico para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención

Se integra con anterioridad ADNc en un vector de expresión y se produce proteína sobre la superficie de cepas transformantes y se detectan entonces las cepas capaces de producir la proteína de receptor copulado a proteína G usando un anticuerpo específico para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención y un segundo anticuerpo para el primer anticuerpo, seleccionando así una cepa de interés.

(5) Un método que utiliza un sistema de traducción de hibridación selectiva

Se depositan muestras de ADNc obtenido de transformantes sobre, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa y se hibridan con ARNm preparado a partir de células capaces de producir la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención y se disocia y recupera luego el ARNm unido al ADNc. Se traduce entonces el ARNm así recuperado en proteína usando un sistema de traducción de proteínas, por ejemplo inyectando en mocitos de Xenopus o en un sistema libre de células, tal como un lisado de reticulocitos de conejo, germen de trigo o similar. Se selecciona una cepa de interés detectándola usando un anticuerpo para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención.

La recogida del ADN que codifica para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención a partir del transformante de interés así obtenido puede ser realizada según un método conocido (Maniatis, T. y col. (1982): "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Por ejemplo, se puede llevar a cabo separando una fracción correspondiente a un ADN plasmídico de células y cortando una región de ADNc del ADN plasmídico.

c) Tercer método de producción

También se puede producir el gen que tiene una secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos representada por la Secuencia Nº 2, 4, 6, 22 ó 26 uniendo fragmentos de ADN producidos por un método de síntesis química. Se puede sintetizar cada ADN usando un sintetizador de ADN (v.g., Sintetizador de ADN Oligo 1000M (Beckman), Sintetizador de ADN/ARN 394 (Applied Biosystems) o similar).

d) Cuarto método de producción

Con el fin de efectuar la expresión de la función de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención por la substancia así obtenida por técnicas de ingeniería genética usando el gen de la invención, no siempre es necesario tener toda la secuencia de aminoácidos representada por la Secuencia Nº 4. Como es sabido por el gen de interferon y similares, se considera que los genes de eucariontes muestran generalmente polimorfismo (v.g., véase Nishi, T. y col. (1985), J. Biochem., 97, 153-159) y existe un caso en el que uno o una pluralidad de aminoácidos están substituidos por este polimorfismo, o un caso en el que la secuencia nucleotídica está cambiada, pero los aminoácidos están completamente inalterados. Además, un receptor copulado a proteína G que tiene la secuencia de aminoácidos original de rata mostrada por la Secuencia Nº 22 tiene la misma actividad del primer receptor.

La determinación de la secuencia de ADN obtenida por los anteriores métodos a) a d) puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por el método de modificación química de Maxam-Gilbert (Maxam, A.M. y Gilbert, E. (1980): "Methods in Enzymology", 65, 499-559) o el método de finalización de cadena nucleotídica didesoxi (Messing, J. y Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269-276), que utiliza M13.

Además, el vector de la invención, la célula huésped de la invención y la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención pueden ser obtenidos por los siguientes métodos.

2) Método de producción de proteína recombinante del receptor copulado a proteína G de la invención

Un fragmento aislado que contiene un gen codificante de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención puede transformar otra célula huésped eucarionte integrándose de nuevo en un ADN vector apropiado. Además, es posible expresar el gen en células huésped respectivas introduciendo un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión génica en estos vectores.

Se incluyen células de vertebrados, insectos, levaduras y similares en las células huésped eucariontes y, aunque no está particularmente limitado, como ejemplos de células de vertebrados comúnmente utilizadas se incluyen células COS, que son células de simios (Gluzman, Y. (1981), |Cell, 23, 175-182), una cepa deficiente en dihidrofolato reductasa de células de ovario de hámster Chino (CHO) (Urlaub, G. y Chasin, L.A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220), células HEK293 de riñón fetal humano y células 293-EBNA (Invitrogen) preparadas introduciendo el gen EBNA-1 del virus Epstein Barr en la célula humana.

Como vector de expresión para células de vertebrados, se pueden usar, en general, un vector que contenga un promotor situado secuencia arriba del gen que se ha de expresar, un sitio de ayuntamiento de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia de finalización de la transcripción y similares y puede contener además un origen de replicación según lo requiera la ocasión. Como ejemplos del vector de expresión, se incluyen pSV2dhfr, que tiene el promotor precoz SV40 (Subramani, S. y col. (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854-864); pEF-BOS, que tiene el promotor del factor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990), Nucleic Acids Res., 18, 5322); pCEP4, que tiene el promotor de citomegalovirus (Invitrogen) y similares, aunque no está limitado.

En un caso en el que se usan células COS como células huésped, se puede usar un vector de expresión que tenga un origen de replicación SV40 puede llevar a cabo un crecimiento autónomo en las células COS y tiene un promotor de transcripción, una señal de finalización de la transcripción y un sito de ayuntamiento de ARN y como ejemplos del mismo se incluyen pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y. (1990), Med. Immunol., 20, 27-32), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990), Nucleic Acids Res., 18, 5322), pCDM8 (Seed, B. (1987), Nature, 329, 840-842) y similares. El vector de expresión puede ser incorporado a las células COS, por ejemplo, por el método de DEAE-dextrano (Luthman, H. y Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308), el método de coprecipitación de fosfato de calcio-ADN (Graham, F.L. y van der Ed., A.J. (1973), Virology, 52, 456-457), un método que utiliza FuGENE6 (Boehringer Mannheim) o el método de electroporación (Neumann, E. y col. (1982), EMBO J., 1, 841-845) y se puede obtener de este modo una célula transformante deseada.

Además, cuando se usan células COS como células huésped, se puede obtener una célula transformante capaz de producir de forma estable la nueva proteína de receptor copulado a proteína G llevando a cabo la co-transfección de un vector de expresión junto con un vector capaz de expresar el gen neo, que funciona como marcador de resistencia a G418, tal como pRSVneo (Sambrook, J. y col. (1989): "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY) o pSV2-neo (Southern, P.J. y Berg, P. (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341) y seleccionando una colonia resistente a G418. Además, cuando se usan células 293-EBNA como células huésped, se puede obtener una célula transformante deseada usando un vector de expresión que tenga el origen de replicación del virus Epstein Barr y que pueda realizar un crecimiento autónomo en las células 293-EBNA, tal como pCEP4 (Invitrogen).

El transformante deseado así obtenido puede ser cultivado de un modo convencional y la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención se produce dentro de las células o sobre la superficie celular mediante este cultivo. En cuanto al medio que se ha de usar en este cultivo, puede ser eventualmente seleccionado entre diversos medios comúnmente utilizados, dependiendo de cada célula huésped empleada; por ejemplo, en el caso de las células COS, se pueden usar medio RPMI-1640, medio esencial mínimo de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o similar añadiendo componentes del suero, tales como suero bovino fetal (FBS) y similares, según lo requiera la ocasión. Además, en el caso de las células 293-EBNA, se pueden usar medio esencial mínimo de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o un medio similar suplementado con componentes del suero, tales como suero bovino fetal (FBS) y similares añadiendo además G418.

La proteína de receptor copulado a proteína G de la invención así producida dentro de la célula o sobre la superficie celular del transformante puede ser separada y purificada por diversas técnicas conocidas de separación haciendo uso de las propiedades físicas, de las propiedades químicas y similares de la proteína del receptor. Como ejemplos ilustrativos de dichas técnicas, llevadas a cabo tras la solubilización de la fracción de membrana que contiene la proteína del receptor, se incluyen el tratamiento habitual con un precipitador de proteínas, ultrafiltración, diversos medios de cromatografía líquida, tales como cromatografía de cribas moleculares (filtración por gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y similares, diálisis y sus combinaciones. En este sentido, la fracción de membrana puede ser obtenida de la forma habitual. Por ejemplo, puede ser obtenida cultivando las células que expresaban la proteína de receptor copulado a proteína G sobre la superficie, suspendiéndolas en un tampón y homogeneizándolas y centrifugándolas después. Además, cuando se solubiliza la proteína de receptor copulado a proteína G usando un agente solubilizante lo más suave posible (CHAPS, Tritón X-100, digitonina o similares), se pueden mantener las características del receptor tras la solubilización.

Efectuando la expresión de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención a través de su fusión en marco con una secuencia marcadora, resultan posibles la confirmación de la expresión de la proteína de receptor copulado a proteína G, la confirmación de su localización intracelular, su purificación y similares. Como ejemplos de la secuencia marcadora, se incluyen el epitopo FLAG, el marcaje con hexahistidina, el marcaje con hemaglutinina, el epitopo myc y similares. Además, cuando se inserta una secuencia específica reconocible por una proteasa, tal como la enterokinasa, el factor Xa o la trombina, entre una secuencia marcadora y la proteína de receptor copulado a proteína G, la secuencia marcadora puede ser cortada y separada por dicha proteasa. Por ejemplo, existe una publicación en la que el receptor muscarínico de acetilcolina y el marcaje con hexahistidina se conectan con una secuencia reconocedora de trombina (Hayashi, M.K. y Haga, T. (1996), J. Biochem., 120, 1232-1238).

Se incluye en la invención un método para la búsqueda y selección de compuestos, péptidos y anticuerpos capaces de modificar la actividad de la proteína de receptor copulado a proteína G. Este método de rastreo consiste en añadir un agente que ha de ser estudiado a un sistema en el que se mide el índice de la modificación de la proteína de receptor copulado a proteína G en respuesta a una característica fisiológica de la proteína de receptor copulado a proteína G usando la proteína de receptor copulado a proteína G así construida y midiendo el índice. Se pueden citar los siguientes métodos de rastreo como ejemplos ilustrativos de este sistema de medición. Además, como ejemplos de fármacos útiles para su estudio, se incluyen compuestos o péptidos que se sabe convencionalmente que tienen actividad de ligando del receptor copulado a proteína G, pero cuya capacidad para modificar selectivamente la actividad de la nueva proteína de receptor copulado a proteína G no está clara, compuestos y péptidos conocidos registrados en archivos químicos, pero cuyas diversas actividades de ligando del receptor copulado a proteína G son desconocidas, compuestos obtenidos por un método tal como técnicas de química combinatoria (Terrett, N.K. y col. (1995), Tetrahedron, 51, 8135-8137) y péptidos aleatorios preparados empleando una exhibición de fagos (Felici, F. y col. (1991), J. Mol. Biol., 222, 301-310) o similares. Además, sobrenadantes de cultivo de microorganismos, componentes naturales originados de plantas y organismos marinos, extractos de tejidos animales y similares son también objetos del rastreo. También son útiles compuestos o péptidos obtenidos modificando química o biológicamente un compuesto o péptido seleccionado por el método de rastreo de la invención.

3) Métodos de rastreo de ligandos de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención, a saber, compuestos, péptidos y anticuerpos que modifican la actividad de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención a) Un método de rastreo que utiliza un método de ensayo de unión a ligandos

Se pueden rastrear compuestos, péptidos y anticuerpos que se unen a la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención (a los que se hace generalmente referencia como ligando) por un método de ensayo de unión de ligandos. Se prepara una muestra de membranas celulares obtenidas tras expresión de la proteína del receptor o una muestra purificada de la proteína del receptor y se marca por radiación un ligando purificado para uso en el ensayo de unión de ligandos (50 a 2.000 Ci/mmol). Se optimizan la solución tampón, los iones, el pH y condiciones de ensayo similares y se incuba la muestra de membranas celulares que expresan la proteína del receptor o la muestra de proteína del receptor purificada en el tampón así optimizado durante un período de tiempo predeterminado junto con el ligando marcado por radiación. Después de la reacción, se filtra a través, v.g., de un filtro de vidrio y se lava con una cantidad apropiada del tampón y se mide entonces la radiactividad que queda en el filtro (cantidad de unión total) usando, v.g., un contador de centelleo líquido. Se mide la cantidad de unión inespecífica añadiendo el ligando no marcado en un gran exceso en la solución de reacción y se obtiene la cantidad de unión específica restando la cantidad de unión inespecífica de la cantidad de unión total. Se puede seleccionar un ligando que muestre unión específica a las membranas celulares que expresan la proteína del receptor o a la proteína del receptor purificada como ligando de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención. Además, se puede rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo que tenga actividad agonista, o un compuesto, péptido o anticuerpo que tenga actividad antagonista de la proteína de receptor copulado a proteína G usando la inhibición de la unión del ligando radiactivo así obtenido como índice.

b) Un método de rastreo que utiliza un método de unión a GTP\gammaS

Los compuestos, péptidos y anticuerpos capaces de modificar la actividad de la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención pueden ser rastreados por un método de unión a GTP\gammaS (Lazareno, S. y Birdsall, N.J.M. (1993), Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127). Se mezclan membranas celulares obtenidas tras la expresión de la proteína del receptor con 400 pM de GTP\gammaS marcado con ^{35}S en una solución de HEPES 20 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y GDP 50 mM. Después de incubar en presencia o ausencia de un agente de ensayo, se filtra a través de, v.g., un filtro de vidrio y se mide entonces la radiactividad del GTP\gammaS unido usando, v.g., un contador de centelleo líquido. Se puede rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo que tiene actividad agonista de la proteína del receptor copulado a proteína G usando, como índice, una mayor unión especifica del GTP\gammaS en presencia del fármaco de ensayo. Además, se puede rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo que tiene actividad antagonista de la proteína del receptor copulado a proteína G usando, como índice, la supresión del aumento en la unión de GTP\gammaS mediante el compuesto, péptido o anticuerpo así obtenido que tiene actividad agonista.

c) Un método de rastreo que utiliza cambios en las concentraciones intracelulares de Ca^{++} y AMPc

Muchas proteínas de receptor copulado a proteína G inducen un aumento en la concentración de Ca^{++} y/o un aumento o disminución en la de AMPc en las células causados por un estímulo agonista. Por consiguiente, los compuestos, péptidos y anticuerpos capaces de modificar la actividad de la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención pueden ser rastreados usando los cambios en la concentración intracelular de Ca^{++} o de AMPc. Se mide la concentración de Ca^{++} usando fura2 y similares y se mide la concentración de AMPc usando un kit de ensayo de AMPc comercial (de Amersham, etc.). Alternativamente, es posible medir las concentraciones de Ca^{++} y de AMPC indirectamente detectando la actividad de transcripción de un gen cuya cantidad de transcripción es controlada dependiendo de las concentraciones de Ca^{++} y de AMPc.

Se deja que una muestra, tal como un compuesto, un péptido, un extracto de tejido o similar, reaccione durante un período predeterminado de tiempo con células en las que se expresa la proteína del receptor o con células huésped en las que no se expresa la proteína del receptor (células control) y se miden las concentraciones de Ca^{++} y de AMPc directa o indirectamente. Se puede rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo que tiene actividad agonista usando, como índice, el aumento en la concentración de Ca^{++} y/o el aumento o disminución en la de AMPc en las células que expresan la proteína del receptor comparando con las células control. Además, se puede rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo que tiene actividad antagonista de la proteína del receptor copulado a proteína G usando, como índice, el aumento en la concentración de Ca^{++} y/o el aumento o disminución en la de AMPc causados por el compuesto, péptido o anticuerpo así obtenidos que tienen actividad agonista.

d) Un método de rastreo que utiliza microfisiómetro

Por diversas respuestas de señal de las células, se detectan cantidades traza de flujo hacia el exterior de iones hidrógeno hacia el resto extracelular. La mayor parte de este flujo hacia fuera de iones hidrógeno se produce cuando aumentan los metabolitos formados por el consumo de combustible de las células para obtener energía para dar sus respuestas o cuando se transmiten señales de las células directamente a la bomba de iones hidrógeno. Como la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención requiere energía para su transmisión de señal, el flujo hacia fuera de iones hidrógeno se produce cuando se activa el receptor. Como los cambios en el pH causados por dicho flujo traza hacia fuera de iones hidrógeno en un medio que circunda las células pueden ser detectados por un microfisiómetro CYTOSENSOR (Molecular Devices), éstos pueden ser usados para la detección de los receptores que consumen energía de activación.

Se deja que un compuesto, un péptido, un extracto de tejido o similar reaccione durante un período predeterminado de tiempo con células en las que se expresa la proteína del receptor o en células huésped en las que no se expresa la proteína del receptor (células control) y se miden los cambios en el pH debidos al flujo hacia fuera de iones hidrógeno. Se puede rastrear un compuesto, un péptido o un anticuerpo que tiene actividad agonista usando, como índice, los cambios en el pH causados por el flujo hacia fuera de iones hidrógeno desde las células que expresan la proteína del receptor comparando con las células control. Además, se puede rastrear un compuesto, un péptido o un anticuerpo que tiene actividad antagonista de la proteína del receptor copulado a proteína G usando, como índice, los cambios de pH debidos al flujo hacia fuera de iones hidrógeno causados por el compuesto, péptido o anticuerpo así obtenido que tiene actividad agonista.

Se incluye en la invención un medicamento que contiene como principio activo un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar significativamente la actividad de la proteína del receptor copulado a proteína G o de una proteína de receptor copulado a proteína G seleccionada por el método de rastreo.

El anticuerpo, tal como un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, que reacciona con la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención puede ser obtenido administrando directamente la nueva proteína de receptor copulado a proteína G o un fragmento de la proteína de receptor copulado a proteína G a diversos animales. También puede ser obtenido por un método de vacuna de ADN (Raz, E. y col. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523; Donnelly, J.J. y col. (1996), J. Infect. Dis., 173, 314-320) usando un plásmido en el que se introduce un gen que codifica para la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención.

El anticuerpo policlonal es producido a partir de sueros o de huevos de un animal (v.g., conejo, rata, cabra, aves o similar) inmunizado y sensibilizado emulsionando la proteína del receptor copulado a proteína G o un fragmento de la misma en un adyuvante apropiado, tal como adyuvante completo de Freund, y administrándola por inyección intraperitoneal, subcutánea o intravenosa. El anticuerpo policlonal así producido a partir de sueros o de huevos puede ser separado y purificado por los métodos habituales de aislamiento y purificación de proteínas. Como ejemplos de tales métodos, se incluyen centrifugación, diálisis, salificación con sulfato de amonio y técnicas cromatográficas usando soportes, tales como DEAE-celulosa, hidroxiapatito, proteína A-agarosa y similares.

Se puede obtener un fragmento activo de anticuerpo que contenga una parte del anticuerpo, tal como F(ab')2, Fab, Fab' o Fv, digiriendo el anticuerpo así separado y purificado con una enzima proteolítica, tal como pepsina, papaína o similar, de la forma habitual y separándolo y purificándolo a continuación por los métodos habituales de aislamiento y purificación de proteínas.

Es posible para los expertos en la técnica producir fácilmente un anticuerpo monoclonal por el método de fusión celular de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. (1975), Nature, 256, 495-497).

Se inmunizan ratones por inoculación intraperitoneal, subcutánea o intravenosa de una emulsión preparada emulsionando la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención o un fragmento de la misma en un adyuvante apropiado, tal como adyuvante completo de Freund, varias veces repetidamente a intervalos de varias semanas. Después de la inmunización final, se recogen las células esplénicas y se fusionan con células de mieloma para preparar un hibridoma.

Se usaron células de mieloma que tenían deficiencia en hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, deficiencia en timidina kinasa o un marcador similar, tal como la cepa de células de mieloma de ratón P3X63Ag8.U1, como células de mieloma para obtener el hibridoma. Además, se usa polietilenglicol como agente de fusión. Además, se suplementa eventualmente medio esencial mínimo de Eagle, medio esencial mínimo modificado de Dulbecco, RPMI-1640 o un medio similar generalmente usado con un 10 a un 30% de suero bovino fetal y se usa como medio para la preparación del hibridoma. Se seleccionan las cepas fusionadas por el método de selección de HAT. Se lleva a cabo el rastreo del hibridoma usando un método convencional, tal como el sobrenadante de cultivo por ELISA, la tinción inmunohistológica o similar, o por el método de rastreo descrito en lo que antecede, y se selecciona un clon de hibridoma que segrega el anticuerpo de interés. Además, la naturaleza monoclonal del hibridoma se confirma repitiendo la subclonación por medio de análisis de dilución limitante. Cuando se cultiva el hibridoma así obtenido durante 2 a 4 días en un medio o durante 10 a 20 días en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c pretratado con pristano, se produce el anticuerpo en una cantidad suficiente para la purificación.

El anticuerpo monoclonal así producido puede ser separado y purificado del sobrenadante de cultivo o de la ascitis por los métodos habituales de aislamiento y purificación de proteínas. Como ejemplos de tales métodos, se incluyen centrifugación, diálisis, salificación con sulfato de amonio y técnicas cromatográficas usando soportes tales como DEAE-celulosa, hidroxiapatito, proteína A-agarosa y similares. Además, el anticuerpo monoclonal o un fragmento que contiene parte del mismo pueden también ser producidos integrando toda la porción o una parte de un gen codificante del anticuerpo en un vector de expresión e introduciendo en células de Escherichia coli, de levaduras o de animales. Se puede obtener un fragmento de anticuerpo activo que contenga una parte del anticuerpo, tal como F(ab')2, Fab, Fab' o Fv, por digestión del anticuerpo así separado y purificado con una enzima proteolítica, tal como pepsina, papaína o similares, de la forma habitual y separándolo y purificándolo a continuación por los métodos habituales de aislamiento y purificación de proteínas.

Además, es posible obtener un anticuerpo capaz de reaccionar con la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención como Fv o Fab de una sola cadena por el método de Clackson y col. o de Zebedee y col. (Clackson, T. y col. (1991), Nature, 352, 624-628; Zebedee, S. y col. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179). Es también posible obtener un anticuerpo humano para inmunizar un ratón transgénico, en donde se substituye un gen de anticuerpo de ratón por un gen de anticuerpo humano (Lonberg, N. y col. (1994), Nature, 368, 856-859).

El medicamento de la invención se caracteriza por tener una nueva acción farmacológica para controlar selectivamente la actividad del receptor copulado a proteína G y, como ejemplos de la utilización del medicamento, se incluyen enfermedades del sistema nervioso central que son inducidas por anormalidades de la actividad del receptor copulado a proteína G (aceleración, reducción, desnaturalización y similares) o que expresan las anormalidades como complicaciones.

La preparación farmacéutica que contiene un compuesto, péptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de modificar la actividad de la proteína de receptor copulado a proteína G de la invención como principio activo puede ser preparada usando soportes, rellenantes y otros aditivos generalmente empleados en la preparación de medicamentos en respuesta a cada tipo de principio activo.

Como ejemplos de su administración, se incluye la administración oral en forma de tabletas, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos, soluciones orales y similares y la administración parenteral en forma de inyecciones intravenosas, intramusculares y similares, supositorios, preparaciones percutáneas, preparaciones de absorción transmucosal y similares. En particular, en el caso de péptidos que se digieren en el estómago, es deseable la inyección intravenosa o una administración parenteral similar.

En la composición sólida para uso en la administración oral según la presente invención, se mezclan una o más substancias activas con al menos un diluyente inerte, tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona o metasilicato de aluminio y magnesio. Normalmente, la composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte, por ejemplo un lubricante, un agente desintegrante, un agente estabilizador y un agente solubilizante o para ayuda de la solubilización. De ser necesario, las tabletas o píldoras pueden ir revestidas de un revestimiento de azúcar o de una película de una substancia gástrica o entérica.

La composición líquida para administración oral incluye emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires y contiene un diluyente inerte generalmente utilizado, tal como agua purificada o etanol. Además del diluyente inerte, esta composición puede contener también otros aditivos, tales como agentes humectantes, agentes suspensores, edulcorantes, saborizantes y antisépticos.

Las inyecciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Como ejemplos del diluyente para uso en las soluciones y suspensiones acuosas, se incluyen agua destilada para uso en inyección y solución salina fisiológica. Como ejemplos del diluyente para uso en las soluciones y suspensiones no acuosas, se incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (v.g., aceite de oliva), alcoholes (v.g., etanol), polisorbato 80 y similares. Dicha composición puede contener también un agente humectante, un agente emulsionante, un agente dispersante, un agente estabilizador, un agente solubilizante o de ayuda a la solubilización, un antiséptico y similares. Estas composiciones son esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de filtros de retención de bacterias, mezcla de un germicida o irradiación. Alternativamente, pueden ser usadas convirtiéndolas primeramente en composiciones sólidas estériles y disolviéndolas en agua estéril u otro solvente estéril para uso en inyección antes de su utilización.

La dosis es eventualmente decidida considerando la fuerza de cada principio activo seleccionado por el método de rastreo descrito en lo que antecede y los síntomas, la edad, el sexo y factores similares de cada paciente a quien se debe administrar.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de SREB1, SREB2 y SREB3.

La Fig. 2 muestra el resultado del análisis Northern de SREB1 en órganos humanos.

La Fig. 3 muestra el resultado del análisis Northern de SREB1 en cada región del cerebro humano.

La Fig. 4 muestra el resultado del análisis Northern de SREB2 en órganos humanos.

La Fig. 5 muestra el resultado del análisis Northern de SREB2 en cada región del cerebro humano.

La Fig. 6 muestra el resultado del análisis Northern de SREB3 en órganos humanos.

La Fig. 7 muestra el resultado del análisis Northern de SREB3 en cada región del cerebro humano.

La Fig. 8 muestra el resultado que confirma la expresión de proteína SREB1, SREB2 o SREB3.

La Fig. 9 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-3LO para SREB1, SREB2 o SREB3.

La Fig. 10 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-C24 para SREB1.

La Fig. 11 muestra la actividad luciferasa derivada de pCRE-Luc en células en las que se introdujo SREB1, SREB2 o SREB3.

La Fig. 12 muestra la actividad luciferasa derivada de pSRE-Luc en células en las que se introdujo SREB1, SREB2 o SREB3.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Con objeto de dar una mayor descripción de la invención de forma ilustrativa, se describen Ejemplos a continuación, pero la invención no se limita a estos Ejemplos. En este sentido, a menos que se indique en contrario, pueden ser llevados a cabo según métodos conocidos (Maniatis, T. y col. (1982): "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Ejemplo 1 Aislamiento de genes codificantes de la nueva proteína de la familia de los receptores copulados a proteína G

Se obtuvo ADNc de longitud completa codificante de la proteína de la familia de receptores copulados a proteína G (SREB1, SREB2 o SREB3) por RT-PCR usando ARN poli A^{+} de origen de cerebro humano (Clontech) como plantilla.

En la amplificación de la SREB1 humana del receptor copulado a proteína G, se usó 5'-AAAATCTAGA CGC
GATGGCGAACGCGAGCGA-3' (Secuencia Nº 7) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA GTCTATGTG
GCGGGGCCTCCC-3' (Secuencia Nº 8) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). Se llevó a cabo la RT-PCR usando ADN polimerasa Pfu (Stratagene) y repitiendo un ciclo de 98ºC (20 segundos)/64ºC (30 segundos)/74ºC (3 minutos) 34 veces en presencia de formamida al 5%. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kpb. Se digirió este fragmento con XbaI y se clonó después usando el plásmido pCEP4 (Invitrogen). Como el plásmido pCEP4 contiene el promotor CMV, que muestra una fuerte actividad promotora en células animales, se puede usar en la expresión de proteínas recombinantes en células animales. Se analizó la secuencia nucleotídica del clon así obtenido por el método finalizador didesoxi usando el Secuenciador de ADN ABI377 (Applied Biosystems). La secuencia así revelada es mostrada en la Secuencia Nº 1 de la Lista de Secuen-
cias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.125 bases (desde la 1ª posición hasta la 1.125ª posición de la Secuencia Nº 1). En la Secuencia Nº 2 de la Lista de Secuencias se muestra una secuencia de aminoácidos (375 aminoácidos) deducida del marco abierto de lectura. Como la secuencia deducida de aminoácidos contiene siete regiones hidrofóbicas consideradas como los dominios de transmembrana, lo que constituye una característica del receptor copulado a proteína G, se vio que este gen codifica para el receptor copulado a proteína G.

En la amplificación de la nueva SREB2 humana del receptor copulado a proteína G, se usó 5'-AAAATCTA
GA TCTATGGCGAACTATAGCCATGCA-3' (Secuencia Nº 9) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA AAGGCTAAAGATTTACAGATGCTCC-3' (Secuencia Nº 10) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). Se llevó a cabo la RT-PCR usando ADN polimerasa Pfu (Stratagene) y repitiendo un ciclo de 96ºC (20 segundos)/54ºC (30 segundos)/74ºC (3 minutos) 34 veces. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kpb. Se digirió este fragmento con XbaI y se clonó después usando el plásmido pCEP4 (Invitrogen). Se analizó la secuencia nucleotídica del clon así obtenido por el método finalizador didesoxi usando el Secuenciador de ADN ABI377 (Applied Biosystems). Se muestra la secuencia así revelada en la Secuencia Nº 3 de la Lista de Secuencias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.110 bases (desde la 1ª posición hasta la 1.110ª posición de la Secuencia Nº 3). Se muestra una secuencia de aminoácidos (370 aminoácidos) deducida del marco abierto de lectura en la Secuencia Nº 4 de la Lista de Secuencias. Como la secuencia deducida de aminoácidos contiene siete regiones hidrofóbicas consideradas como los dominios de transmembrana, lo cual es una característica del receptor copulado a proteína G, se vio que este gen codifica para el receptor copulado a proteína G.

En la amplificación de la SREB3 humana del receptor copulado a proteína G, se usó 5'-AAAATCTAGA GTATGG
CCAACACTACCGGAGAG-3' (Secuencia Nº 11) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA CCTGTCTGCC
TACCAGCCTGC-3' (Secuencia Nº 12) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). Se llevó a cabo la RT-PCR usando ADN polimerasa Pfu (Stratagene) y repitiendo un ciclo de 98ºC (20 segundos)/62ºC (30 segundos)/74ºC (3 minutos) 34 veces en presencia de formamida al 5%. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kpb. Se digirió este fragmento con XbaI y se clonó después usando el plásmido pCEP4 (Invitrogen). Se analizó la secuencia nucleotídica así obtenida por el método finalizador didesoxi usando un Secuenciador de ADN ABI377 (Applied Biosystems). La secuencia así revelada es mostrada en la Secuencia Nº 5 de la Lista de Secuencias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.119 bases (desde la 1ª posición hasta la 1.119ª posición de la Secuencia Nº 5). Se muestra la secuencia de aminoácidos (373 aminoácidos) deducida a partir del marco abierto de lectura en la Secuencia Nº 6 de la Lista de Secuencias. Como la secuencia deducida de aminoácidos contiene siete regiones hidrofóbicas consideradas como los dominios de transmembrana, lo cual es una característica del receptor copulado a proteína G, se vio que este gen codifica para el receptor copulado a proteína G.

La homología de la familia SREB de receptores copulados a proteína G (SREB1, SREB2 o SREB3) con una familia conocida de receptores copulados a proteína G es del 25% o menos, respectivamente.

Por otra parte, la homología de SREB1 con SREB2 es del 52%, la homología de SREB1 co SREB3 es del 52% y la homología de SREB2 con SREB3 es del 63%, siendo significativamente superiores a la homología con receptores copulados a proteína G conocidos (Fig. 1). Este hecho muestra que los receptores copulados a proteína G SREB1, SREB2 y SREB3 de la invención forman una nueva familia de receptores copulados a proteína G independiente de los receptores copulados a proteína G conocidos.

Ejemplo 2 Distribución de expresión de los genes de la familia de los receptores copulados a proteína G humanos en tejidos

Se analizó la distribución de expresión de los genes de los receptores copulados a proteína G por el método de hibridación Northern blot. Se usó un fragmento de ADNc (de la 722ª posición a la 1.054ª posición en la Secuencia Nº 1) como sonda del SREB1 humano. Se depositó ARN poli A^{+} (2 \mug) originado de cada órgano humano sobre una membrana (Clontech) y se realizó su hibridación con la sonda a 42ºC (18 horas) en una solución que contenía un 50% de formamida, SSPE 5x, solución de Denhardt 10x, un 2% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se lavó finalmente la membrana dos veces (65ºC durante 30 minutos) con una solución que contenía SSC 0,2x y un 0,1% de SDS. Tal como se muestra en la Fig. 2, cuando se llevó a cabo el análisis Northern sobre cada órgano humano (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, intestino grueso y leucocitos periféricos), se detectaron 3 kb de ARNm en el cerebro, el ovario, el testículo, el corazón y la próstata y 3 kb y 2,3 kb de ARNm en los leucocitos periféricos. Se detectó también ligeramente una señal de 3 kb en el páncreas. Además, se llevó a cabo el análisis Northern sobre cada una de las regiones del cerebro humano (amígdala, núcleo caudado, cuerpo calloso, hipocampo, substancia negra, núcleo subtalámico, tálamo, cerebelo, córtex cerebral, médula, médula espinal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen). Como se detectó el ARNm de 3 kb del gen SREB1 humano del receptor copulado a proteína G en todas las regiones del cerebro humano examinadas, se vio que se expresa ampliamente en el cerebro humano (Fig. 3).

Se usó un fragmento de ADNc (de la 558ª posición a la 888ª posición en la Secuencia Nº 3) como sonda del SREB2 humano. Cuando se llevó a cabo el análisis Northern en las mismas condiciones, se detectó ARNm de 3,2 kb en el cerebro y ARNm de 2,4 kb, 3,5 kb y 6,3 kb en el testículo, según se muestra en la Figura 4. Además, se detectó la señal de 3,5 kb en la placenta y el bazo y la señal de 3,2 kb en el intestino delgado, todas ligeramente. Entre regiones del cerebro, se detectaba abundantemente el ARNm de 3,2 kb del gen SREB2 humano del receptor copulado a proteína G de la invención en la amígdala, el núcleo caudado, el hipocampo, la substancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo, el cerebelo, el córtex cerebral y el putamen, pero no tanto en el cuerpo calloso, la médula y la médula espinal. Además, se detectaba ligeramente una señal de 7,8 kb en cada una de las regiones granulares (Fig. 5).

Se usó un fragmento de ADNc (de la 1ª posición a la 652ª posición en la Secuencia Nº 5) como sonda del SREB3 humano. Cuando se llevó a cabo el análisis Northern en las mismas condiciones, se detectó ARNm de 4 kb y de 5,1 kb en el cerebro y ARNm de 4 kb, 5,1 kb y 9,7 kb en el ovario, como se muestra en la Figura 6. Se detectó el gen SREB3 humano del receptor copulado a proteína G en cada región del cerebro como señales principalmente de 4 kb, 5,1 kb y ligeramente 9,7 kb y se detectó el ARNm de 4 kb en la amígdala, el hipocampo, el núcleo subtalámico, el cerebelo y el córtex cerebral y el ARNm de 5,1 kb en la substancia negra, el núcleo subtalámico y la médula espinal, con abundancia relativa (Fig. 7).

Los resultados anteriores muestran que los genes de la familia de receptores copulados a proteína G SREB1, SREB2 y SREB3 se expresan principalmente en el sistema nervioso central y en el sistema de los órganos urinarios/órganos reproductores.

Ejemplo 3 Confirmación de la expresión de las proteínas de la familia de los receptores copulados a proteína G humanos

Se usó pCEP4 (Invitrogen) como vector de expresión para expresar SREB1, SREB2 o SREB3 humanos. En este caso, para fusionar un epitopo FLAG como secuencia marcadora con el extremo N de los SREB1, SREB2 o SREB3 humanos, se insertó ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGGATCCTG (Secuencia Nº 13) en el extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína de SREB1, SREB2 o SREB3. Los plásmidos así construidos fueron denominados pCEP4-FL-SREB1, pCEP4-FL-SREB2 y pCEP4-FL-SREB3, respectivamente. Usando estos plásmidos, se expresa un polipéptido en el que una secuencia Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ile Leu (Secuencia Nº 14) está fusionada con el extremo N del polipéptido de SREB1, SREB2 o SREB3.

Se inoculó una porción de 1 x 10^{6} células de 293-EBNA (Invitrogen) en una placa de Petri de 10 cm y se cultivó durante 1 día y se realizó entonces una transferencia génica de 8 \mug de pCEP-FL-SREB1, pCEP4-FL-SREB2, pCEP4-FL-SREB3 o pCEP4-FL (vector solo) usando FuGENE6 (Boehringer Mannheim). Después de la transferencia génica, las células fueron cultivadas durante 1 día, cosechadas, lavadas, suspendidas en 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/150 mM de NaCl/Complete™ (Boehringer Mannheim) y homogeneizadas después usando Polytron. Se mezcló el homogenado con Tritón X-100, Digitonina y colato de sodio a concentraciones finales del 0,2%, 0,1% y 0,2% y se solubilizó después incubando a 4ºC durante 2 horas. Se efectuó la inmunoprecipitación de la proteína de fusión del epitopo FLAG de la muestra así solubilizada usando M2-agarosa (Sigma). Se eluyó el precipitado inmune con 200 \muM de péptido FLAG/20 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/150 mM de NaCl. Se concentró la muestra eluida, se sometió a electroforesis usando SDS/gel de acrilamida al 10%-20% (Daiichi Pure Chemicals) y se transfirió después a una membrana PVDF usando un aparato de deposición. Se sometió la membrana PVDF después de la transferencia a bloqueo y se dejó luego que reaccionara con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG de ratón (M2, Sigma) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón (Zymed) en ese orden. Después de la reacción, se confirmó la expresión de proteína SREB1, SREB2 o SREB3 usando el Sistema de Detección por Western Blotting ECL (Amersham-Pharmacia) (Fig. 8).

La proteína capaz de reaccionar con el anticuerpo anti-FLAG no estaba presente en las células en las que se introdujo pCEP4-FL, pero se detectaba en células en las que se introdujo pCEP4-FL-SREB1, pCEP4-FL-SREB2 o pCEP4-FL-SREB3 como una banda de 35 a 45 kDa. Los pesos moleculares estimados del SREB1 humano, del SREB2 humano y del SREB3 humano eran 39,8 kDa, 42,0 kDa 41,5 kDa, respectivamente, y sus bandas fueron halladas en posiciones de pesos moleculares casi esperados. Además, se detectó una banda de 65 a 75 kDa considerada como un dímero en el caso del SREB1 humano.

Ejemplo 4 Aislamiento del gen codificante de la proteína SREB1 de rata (rSREB1), SREB2 de rata (rSREB2) o SREB3 de rata (rSBEB3)

Se obtuvo ADNc de longitud completa codificante de rSREB1, rSREB2 o rSREB3 por RT-PCR usando ARN poli A^{+} con origen en cerebro de rata (Clontech) como plantilla.

En la amplificación de rSREB1, se usó 5'-AAAATCTAGACGGCGATGGCGAACGCTAGTGA-3' (Secuencia Nº 15) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA CACTTTGAGAGTCTTGTGAAGGC-3' (Secuencia Nº 16) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). La amplificación, la clonación y la determinación de la secuencia nucleotídica del ADNc fueron llevadas a cabo por los mismos métodos del Ejemplo 1. Se muestra la secuencia así revelada en la Secuencia Nº 21 de la Lista de Secuencias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.131 bases (desde la 1ª posición hasta la 1.131ª posición de la Secuencia Nº 21). Se muestra una secuencia de aminoácidos (377 aminoácidos) deducida del marco abierto de lectura en la Secuencia Nº 22 de la Lista de Secuencias. Como la secuencia deducida de aminoácidos coincidía en un 97% de frecuencia con el SREB1 humano, se vio que este gen codifica para rSREB1.

En la amplificación de rSREB2, se usó 5'-AAAATCTAGATCTATGGCGAACTATAGCCATGC-3' (Secuencia Nº 17) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA AAGGCTAAAGATTTACAGATGCTCC-3' (Secuencia Nº 18) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). La amplificación, la clonación y la determinación de la secuencia nucleotídica del ADNc fueron llevadas a cabo por los mismos métodos que en el Ejemplo 1. Se muestra la secuencia así revelada en la Secuencia Nº 23 de la Lista de Secuencias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.110 bases (de la 1ª posición a la 1.110ª posición de la Secuencia Nº 23). Se muestra una secuencia de aminoácidos (370 aminoácidos) deducida del marco abierto de lectura en la Secuencia Nº 24 de la Lista de Secuencias. Como la secuencia deducida de aminoácidos coincidía en un 100% de frecuencia con el SREB2 humano, se vio que este gen codifica para rSREB2.

En la amplificación de rSREB3, se usó 5'-AAAATCTAGACAAATACTGAACTGGCCGATCCCC-3' (Secuencia Nº 19) como cebador hacia delante y 5'-AAAATCTAGA TGTTGGCCCCAGTATGGTGATCAT-3' (Secuencia Nº 20) como cebador inverso (se añade el sitio XbaI a cada extremo 5'). La amplificación, la clonación y la determinación de la secuencia nucleotídica del ADNc fueron llevadas a cabo mediante los mismos métodos que en el Ejemplo 1. Se muestra la secuencia así revelada en la Secuencia Nº 25 de la Lista de Secuencias.

Esta secuencia contiene un marco abierto de lectura de 1.119 bases (de la 1ª posición a la 1.119ª posición de la Secuencia Nº 25). Se muestra una secuencia de aminoácidos (373 aminoácidos) deducida del marco abierto de lectura en la Secuencia Nº 26 de la Lista de Secuencias. Como la secuencia deducida de aminoácidos coincidía en un 99% de frecuencia con el SREB3 humano, se vio que este gen codifica para rSREB3.

Ejemplo 5 Preparación de anticuerpo para SREB1 humano

Se fusionó una secuencia de aminoácidos parcial del SREB1 humano con glutatión-S-transferasa (GST) y se usó como antígeno de inmunización para la preparación de un anticuerpo para el SREB1 humano. De un modo ilustrativo, se amplificó un fragmento de ADNc correspondiente a una región de desde la 208ª posición hasta la 282ª posición (3LO) y una región de desde la 351ª posición hasta la 375ª posición (C24) de la secuencia de aminoácidos del SREB1 humano (Secuencia Nº 2) por PCR de forma que se unieran los sitios de escisión de las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se insertó entre los sitios BamHI y XhoI del Vector de Fusión del Gen GST (pGEX-5X-1, Amersham-Pharmacia). Se transformaron células competentes de la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen) con el plásmido así construido. Cultivando el transformante e induciendo la expresión del gen con IPTG 1 mM, se expresaron una proteína de fusión GST-3LO y una proteína de fusión GST-C24 en las células de E. coli. Se purificaron GST-3LO y GST-C24 a partir de células rotas de E. coli usando Glutatión Sepharose 4B (Amersham-Pharmacia) según las instrucciones adjuntas.

Se mezcló la proteína de fusión GST-3LO así purificada con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund (CalBiochem) y se emulsionó y se administró la emulsión a una hembra White Leghorn (140 días de edad) alrededor de la bolsa de Fabricio. La dosis inicial era de 1 mg y se administró a continuación en porciones de 0,5 mg 4 veces a intervalos de 2 semanas. Después de la inmunización final, se recogieron los huevos, se diluyó la yema de los huevos con solución salina fisiológica y se desengrasó usando sulfato de dextrano y se purificó luego la IgY usando DEAE-Sepharose (Amersham-Pharmacia) para obtener anticuerpo anti-3-LO. Se mezcló también la proteína de fusión GST-C24 purificada con la misma cantidad de TiterMax Gold (CytRX) y se emulsionó y se administró la emulsión bajo la piel dorsal de un conejo blanco Japonés (6 semanas de edad). Su dosis inicial era de 1 mg y se administró a continuación en porciones de 0,5 mg 2 veces a intervalos de 2 semanas. Después de la inmunización final, se recogió sangre y se purificó la IgG del suero usando Proteína G-Sepharose (Amersham-Pharmacia) según la instrucción adjunta, obteniéndose así anticuerpo anti-C24.

Como el anticuerpo anti-3LO usa una región de desde la 208ª posición hasta la 282ª posición de la secuencia de aminoácidos del SREB1 humano (Secuencia Nº 2) como antígeno y su secuencia parcial de aminoácidos contiene un gran número de secuencias comunes a SREB1, SREB2 y SREB3 (véase la Fig. 1), existe la posibilidad de que el anticuerpo anti-3LO reconozca comúnmente SREB1, SREB2 y SREB3. Además, como el anticuerpo anti-C24 usa una región de desde la 351ª posición hasta la 375ª posición de la secuencia de aminoácidos del SREB1 humano (Secuencia Nº 2) como antígeno y su secuencia parcial de aminoácidos es una secuencia en la que SREB2 y 3 no están presentes, pero está presente SREB1 solo (véase la Fig. 1), existe la posibilidad de que el anticuerpo anti-C24 reconozca sólo SREB1. Por consiguiente, para confirmar la especificidad del anticuerpo anti-3LO y del anticuerpo anti-C24, se realizó un Western blotting usando el precipitado inmune del anticuerpo anti-FLAG de 293-EBNA, en donde se expresaba SREB1, SREB2 o SREB3, preparado en el Ejemplo 3, y el anticuerpo anti-3LO y el anticuerpo anti-C24.

De forma ilustrativa, se sometió cada muestra a electroforesis usando SDS/gel de acrilamida al 10%-20% (Daiichi Pure Chemicals) y se transfirió después a una membrana PVDF usando un aparato de deposición. Se sometió la membrana PVDF, después de la transferencia, a bloqueo y se dejó entonces que reaccionara con 10 \mug/ml del anticuerpo anti-3LO y un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de pollo marcado con peroxidasa de rábano picante (Zymed) en ese orden, o con 10 \mug/ml del anticuerpo anti-C24 y un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (MBL) en ese orden. Después de la reacción, se realizó el revelado del color usando el Sistema de Detección de Western Blotting ECL (Amersham-Pharmacia). Se detectó una banda que reaccionaba con el anticuerpo anti-3LO en la misma posición del anticuerpo anti-FLAG del Ejemplo 3 en células en las que se introdujo pCEP4-FL-SREB1, pCEP4-FL-SREB2 o pCEP4-FL-SREB3 (Fig. 9). Además, se detectó una banda que reaccionaba con el anticuerpo anti-C24 en la posición del anticuerpo anti-FLAG del Ejemplo 3 sólo en las células en las que se introdujo pCEP4-FL-SREB1 (Fig. 10).

En base a los anteriores resultados, se confirmó que el anticuerpo anti-3LO es un anticuerpo que reconoce SREB1, SREB2 o SREB3 y que el anticuerpo anti-C24 es un anticuerpo que reconoce sólo SREB1. El uso de estos anticuerpos ha hecho posible la detección de SREB1, SREB2 o SREB3 naturales por un método tal como el Western blot-ting, la tinción inmunohistológica o similares.

Ejemplo 6 Evaluación de la actividad de transcripción mediante un elemento de respuesta a AMPc (CRE) o un elemento de respuesta al suero (SRE) en células en las que se introducen SREB1, SREB2 o SREB3

El aumento en la actividad de transcripción mediada por CRE o SRE es inducido por la activación del sistema de transmisión de información intracelular de diversos receptores copulados a proteína G (Lolait, S.J. y col. (1992), Nature, 357, 336-339; Hoeltzel, W.L. y col. (1997), Am. J. Physiol., 273, C2037-C2045; An, S. y col. (1998), J. Biol. Chem., 273, 7906-7910). Además, es sabido que el sistema de transmisión de información intracelular de los receptores copulados a proteína G es parcialmente activado por medio de cierta conformación activa transicional incluso en ausencia de agonista (Kenakin, T. (1995), Trens. Pharmacol. Sci., 16, 188-192). En consecuencia, si se encuentran cambios en la actividad de transcripción mediada por CRE o SRE en células en las que se han introducido SREB1, SREB2 o SREB3 incluso en ausencia de agonista, puede confirmarse que el receptor copulado a proteína G es funcional y que la activación del sistema de transmisión de información intracelular de los receptores copulados a proteína G conduce a la actividad de transcripción mediada por CRE y SRE.

Utilizando pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990), Nucleic Acids Res., 18, 5322) como vector de expresión para expresar SREB1, SREB2 o SREB3 humanos, se prepararon pEF-BOS-SREB1, pEF-BOS-SREB2 y pEF-BOS-SREB3. Se inoculó una porción de 8 x 10^{4} células de 293-EBNA (Invitrogen) en una placa de 24 pocillos y se cultivó durante 1 día y se llevó a cabo entonces la transferencia génica de 250 ng de pEF-BOS-SREB1, pEF-BOS-SREB2, pEF-BOS-SREB3 o pEF-BOS (vector solo) junto con 25 ng de un plásmido informador de CRE pCRE-Luc (Stratagene) o un plásmido informador de SRE pSRE-Luc (Stratagene) usando FuGENE 6 (Boehringer Mannheim) (3 pocillos para cada uno). Después de la transferencia génica, se lisaron las células cada 12 horas usando Reactivo de Lisis de Cultivo Celular PicaGene Luc (Nippon Gene) y se midió la actividad de la luciferasa producida por cada plásmido informador usando el Kit de Luminiscencia PicaGene (Nippon Gene).

Se trató la actividad luciferasa en las células en las que se introdujeron SREB1, SREB2 o SREB3 después de 24 horas de la transferencia génica como una actividad relativa a la actividad luciferasa de las células en las que se había introducido el vector solo (control) (se definió el control como 1), con los resultados mostrados en la Fig. 11 (actividad luciferasa derivada de pCRE-Luc) y la Fig. 12 (actividad luciferasa derivada de pSRE-Luc). La actividad de transcripción mediada por CRE aumentó muy abruptamente en las células en las que se había introducido SREB1 y también aumentó significativamente en las células en las que se habían introducido SREB2 y SREB3 en comparación con el control. Por otra parte, la actividad de transcripción mediada por SRE aumentó muy abruptamente en las células en las que se había introducido SREB2 y también aumentó significativamente en las células en las que se había introducido SREB1 y SREB3 en comparación con el control.

Se reveló gracias a estos resultados que SREB1, SREB2 y SREB3 son receptores funcionales y la activación del sistema de transmisión de información intracelular de estos receptores copulados a proteína G conduce al aumento en la actividad de transcripción mediada por CRE o SRE.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporcionó una nueva proteína SREB2 de la familia de los receptores copulados a proteína G expresada en el sistema nervioso central, ADN codificante de esta proteína, un vector que contiene este ADN, células huésped que contienen este vector y métodos para producir la proteína de los receptores copulados a proteína G.

Además, se hizo posible rastrear nuevos medicamentos, particularmente nuevos agentes terapéuticos para enfermedades del sistema nervioso central, mediante el rastreo de compuestos, péptidos y anticuerpos capaces de modificar las actividades de la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención permitiendo el contacto del receptor copulado a proteína G con los fármacos en estudio.

En cuanto al medicamento de la invención que contiene, como principio activo, un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar significativamente la actividad de la proteína del receptor copulado a proteína G expresada en el sistema nervioso central, su utilidad como agentes terapéuticos y similares para enfermedades funcionales/orgánicas del sistema nervioso central. Además, como la proteína de la familia de los receptores copulados a proteína G de la invención se expresa no sólo en el sistema nervioso central, sino también en el sistema de los órganos urinarios/órganos reproductores, se puede esperar utilidad como fármacos terapéuticos y similares para enfermedades relacionadas con el sistema de órganos urinarios/órganos reproductores del medicamento que contiene, como principio activo, un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar específicamente sus actividades. Además, como un miembro de los receptores copulados a proteína G, tal como la proteína SREB1, se expresa no sólo en el sistema nervioso central y en el sistema de los órganos urinarios/órganos reproductores, sino también en el corazón y en los leucocitos periféricos, se puede esperar la utilidad de un medicamento que contenga, como principio activo, un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar específicamente la actividad de la proteína SREB1 como fármaco terapéutico y similares para enfermedades del sistema circulatorio y enfermedades del sistema inmune de la inflamación, además de enfermedades centrales y de enfermedades relacionadas con el sistema de órganos urinarios/órganos reproductores. Sin embargo, esto no está incluido en la presente invención.

La familia de los receptores copulados a proteína G SREB1, SREB2 o SREB3 tiene una marcada razón de conservación de aminoácidos en humano y rata. Esta razón de conservación es más alta entre las familias de receptores copulados a proteína G existentes, lo que parece mostrar que la familia de los receptores copulados a proteína G de SREB1, SREB2 y SREB3 está adoptando papeles importantes en el organismo vivo, particularmente un papel fisiológico en el sistema nervioso central. Además, como sus secuencias de aminoácidos tienen una razón de conservación del 97% o más en humano y rata, se considera que no hay casi presencia de diferencias interespecíficas en cuanto a las actividades de fármacos que actúan sobre la familia de los receptores copulados a proteína G SREB1, SREB2 o SREB3. Por consiguiente, cuando se desarrolla la propia proteína del receptor copulado a proteína G de la invención o un compuesto o proteína obtenidos por rastreo usando el receptor como medicamento, el receptor tiene la ventaja de poder llevar a cabo con anterioridad experimentos animales usando ratas, por ejemplo, antes de estudiar los efectos farmacológicos en humanos y es útil en términos de que se pueden predecir fácilmente datos clínicos en humanos a partir de los datos experimentales con animales.

Como la expresión de la proteína del receptor copulado a proteína G de la invención en órganos y sus cambios pueden ser detectados por un método tal como ELISA, radioinmunoensayo, Western blotting y similares, usando anticuerpos, estos anticuerpos para la nueva proteína del receptor copulado a proteína G son útiles como agentes de diagnóstico. Además, los anticuerpos capaces de modificar las actividades de la nueva proteína del receptor copulado a proteína G son útiles como fármacos terapéuticos para enfermedades en las que está implicada la nueva proteína del receptor copulado a proteína G y también como herramientas para la separación y purificación de la proteína del receptor.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Una nueva proteína de receptor copulado a proteína G

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<130> Y9905-PCT

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<150> JP P1998-060245

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<151> 12-03-1998

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<150> JP P1999-026774

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<151> 03-02-1999

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<160> 26

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1.128

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1125)

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<223> SREB1

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 1.113

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1110)

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<223> SREB2

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<400> 3

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6

7

8

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<210> 4

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<211> 370

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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9

10

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<210> 5

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<211> 1.122

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1119)

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<223> SREB3

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<400> 5

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11

12

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<210> 6

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<211> 373

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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13

14

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<210> 7

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga cgcgatggcg aacgcgagcg a

\hfill

31

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<210> 8

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga gtctatgtgg cggggcctcc c

\hfill

31

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<210> 9

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga tctatggcga actatagcca tgca

\hfill

34

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<210> 10

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga aaggctaaag atttacagat gctcc

\hfill

35

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<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga gtatggccaa cactaccgga gag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga cctgtctgcc taccagcctg c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Epitopo FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggactaca aggacgacga tgacaagggg atcctg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Epitopo FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga cggcgatggc gaacgctagt ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga cactttgaga gtcttgtgaa ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga tctatggcga actatagcca tgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador hacia delante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga aaggctaaag atttacagat gctcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga caaatactga actggccgat cccc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga tgttggcccc agtatggtga tcat

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1131)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SREB1 de rata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SREB2 de rata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coronavirus de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1119)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SREB3 de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coronavirus de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

Claims (7)

1. Una proteína de receptor copulado a proteína G que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 4.

2. Un ADN que tiene una secuencia nucleotídica codificante de la proteína del receptor copulado a proteína G descrito en la reivindicación 1.

3. Un vector que contiene el ADN descrito en la reivindicación 2.

4. Una célula huésped que contiene el vector descrito en la reivindicación 3.

5. Un método para producir la proteína del receptor copulado a proteína G descrita en la reivindicación 1, que consiste en utilizar la célula huésped descrita en la reivindicación 4.

6. Un método para rastrear un compuesto, péptido o anticuerpo capaz de modificar la actividad de la proteína del receptor copulado a proteína G descrita en la reivindicación 1, que consiste en dejar que dicha proteína del receptor copulado a proteína G contacte con un compuesto, péptido o anticuerpo de ensayo y en medir el índice de modificación de la proteína del receptor copulado a proteína G en respuesta a una característica fisiológica del receptor copulado a proteína G.

7. Un anticuerpo o un fragmento activo de anticuerpo para la proteína del receptor copulado a proteína G descrita en la reivindicación 1 o un péptido parcial de la misma.