ES2281355T3 - Adn que codifica una subunidad humana 5-ht3-c del receptor de serotonina 5-ht3. - Google Patents

Adn que codifica una subunidad humana 5-ht3-c del receptor de serotonina 5-ht3. Download PDF

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Abstract

Una proteína 5-HT3-C humana compuesta por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 9.

Description

ADN que codifica una subunidad humana 5-HT3-C del receptor de serotonina 5-HT3.
Antecedentes de la invención
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) es un transmisor químico multifuncional que aún así señaliza receptores de la superficie celular. Se han definido farmacológicamente al menos catorce subtipos de receptores de serotonina (Julius, 1996). Trece de los catorce receptores conocidos son receptores acoplados a la proteína G y el único receptor de 5-HT ionotrópico, el receptor 5-HT3 de tipo 3, es un canal catiónico no selectivo regulado por ligando, de activación rápida, único entre los receptores de monoaminas conocidos (Derkach et al., 1989). El receptor 5-HT3 se localiza exclusivamente en neuronas en los sistemas nerviosos central (Waeber et al., 1989; Yakel et al., 1991) y periférico (Fozard, 1984). La activación del receptor 5-HT3 conduce a la despolarización de la membrana y a un aumento del Ca^{2+} intracelular. El receptor 5-HT3 es la diana de antagonistas (granisetrón y ondansetrón) selectivos contra la náusea inducida por quimioterapia citotóxica y anestesia general (Gralla, 1998). Hay algunas pruebas de que los receptores 5-HT3 de serotonina son importantes en la recepción del dolor, ansiedad, cognición, actividad de las neuronas motoras craneales, procesos sensoriales, modulación del afecto y las consecuencias comportamentales del abuso de drogas (Greenshaw y Silverstone, 1997; Lambert et al., 1995; Passani y Corradetti, 1996).
Existen dos subunidades conocidas para el receptor 5-HT3 humano. 5-HT3-A (Bellli et al., 1995; Miyake et al., 1995) y 5-HT3-B (Davies et al., 1999). Estas tienen similitudes estructurales y funcionales con el nicotínico, el GABA-érgico y otros canales iónicos regulados por ligando (Barnard, 1996; Gurley y Lanthorn, 1998; Maricq et al., 1991). La subunidad modificante 5-HT3-B para el receptor 5-HT3 de serotonina puede explicar ciertas observaciones de que los receptores 5-HT3 de diversas preparaciones tienen diferentes propiedades farmacológicas, cinéticas, de permeabilización y dependientes de voltaje (Peters et al., 1992) (Dubin et al., manuscrito presentado a JBC). Sin embargo, las pruebas bioquímicas sugieren que los receptores 5-HT3 pueden existir como heteromultímeros compuestos por más de 2 subunidades. Los receptores purificados a partir de diversas fuentes mediante cromatografía de afinidad normalmente muestran al menos 2 bandas de proteína principales con masas moleculares en el orden de 54 y 38 kDa (Lambert et al., 1995). El receptor 5-HT3-A corresponde a la original (Turton et al., 1993). El receptor 5-HT3 purificado por afinidad a partir de córtex cerebral de cerdo está compuesto por al menos 3 componentes separables, en base a la tinción con plata de proteínas en geles desnaturalizantes (Fletcher y Barnes, 1997). Varias de estas bandas de proteína no las reconocen anticuerpos específicos dirigidos contra la subunidad 5-HT3-A recombinante (Fletcher y Barnes, 1997), y sus tamaños son demasiado grandes (52-71 kDa) para considerarlos fragmentos de 5-HT3-A degradados (Fletcher y Barnes, 1998).
El ensamblaje heteromérico de subunidades a menudo produce canales con función alterada en comparación con canales homoméricos. Se ha informado que una cantidad en aumento de subunidades son eléctricamente silenciosas cuando se expresan en solitario pero inhiben profundamente la función de clases específicas de canales en estudios de co-expresión (Kv8, Kv9, Kir1.3) (Hugnot et al., 1996; Salinas et al., 1997; Salinas et al., 1997; Shuck et al., 1997; Stocker et al., 1999). Como los receptores 5-HT3, los canales de potasio regulados por voltaje son heterómeros de subunidades similares (Jan y Jan, 1997). Kv8.1 y los miembros de la familia Kv9 tienen la capacidad de suprimir la expresión funcional de miembros de la familia de canales de potasio específicos cuando se co-expresan a niveles altos (Hugnol et al., 1996; Salinas et al., 1997; Salinas et al., 1997; Stocker et al., 1999). Los experimentos de inmunoprecipitación revelan co-ensamblaje de Kv8.1 con Kv2 (Hugnot et al., 1996). Kv8.1 no parece alcanzar la membrana plasmática cuando se expresa en solitario (Salinas et al., 1997) y no se produce el ensamblaje homomérico de subunidades de Kv9 (Stocker et al., 1999).
La expresión funcional del canal de potasio de entrada Kir1.3 en oocitos de Xenopus no fue detectable, sin embargo, la co-expresión de Kir1.3 con Kir1.1 o Kir1.2 redujo las corrientes resultantes de la expresión de estas subunidades rectificadoras de entrada en solitario, coherente con una influencia negativa de la expresión de Kir1.1 y Kir1.2 (Shuck et al., 1997).
Existen varios canales mutantes de origen natural que reducen la función de canalización. En una forma de ataxia episódica, las mutaciones en el gen que codifica Kv1.1 suprimen la función de las subunidades de Kv1.1 de tipo silvestre (Mathur et al., 1999; Zerr et al., 1998). En la forma LQT1 de mutaciones A177P o T311I de KvLQT1 del síndrome de QT largo, tienen un efecto dominante negativo de corrientes producidas por KvLQT1 con o sin minK cuando se expresan combinaciones de subunidades del canal en oocitos de Xenopus (Shalaby et al., 1997). La expresión de estos mutantes de KvLQT1 individualmente o en combinación, produjo canales inactivos cuando se expresaban individualmente e inhibió las corrientes de KvLQT1 de tipo silvestre de manera negativa dominante.
Un mutante de HERG de origen natural G601 es una mutación hipomórfica (es decir, una forma mutante específica de un gen que muestra una función cualitativamente similar a la del estado normal, pero con cuantitativamente menos función), dando como resultado una amplitud de corriente reducida y representa un nuevo mecanismo que refuerza LQT2 (Furutani et al., 1999).
Se ha presentado un amplio intervalo de conductancias de canales individuales para la subunidad receptora 5-HT3-A y receptores 5-HT3 endógenos en células nativas. Esta variación es atribuible en parte a la formación heteromérica de 5-HT3-A con subunidades 5-HT3-B (Davies et al., 1999). Los receptores homoméricos mostraron una conductancia sub-pS mientras que los receptores heteroméricos mostraron gran conductancia del canal individual (16 pS) (Davies et al., 1999). Se ha informado de la modulación de la conductancia de los receptores 5-HT3. Van Hooft y colaboradores han demostrado que la conductancia de receptores 5-HT3 en células N1E-115 depende de las condiciones de fosforilación (Van Hooft y Vijverberg, 1995).
Una necesidad insatisfecha en este campo, es la capacidad de reconstruir un sistema de expresión recombinante que imita completamente el complejo del receptor 5-HT3 en tejido natural, debido probablemente a complejos receptores incompletos situados en la superficie celular. Creando un modelo más relevante fisiológicamente del complejo receptor 5-HT3 usando sistemas in vitro, será más fácil desarrollar y ensayar nuevos compuestos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con el receptor de serotonina 5-HT3. Esta necesidad insatisfecha se ha satisfecho mediante el aislamiento y caracterización de una nueva molécula de ADNc de la subunidad del receptor 5-HT3, denominada en lo sucesivo en este documento 5-HT3-C. Usando un sistema de expresión recombinante, se han aislado moléculas de ADN funcionales que codifican la subunidad. Se describen las propiedades biológicas y estructurales de esta proteína, así como la secuencia de aminoácidos y nucleótidos. La proteína recombinante es útil para identificar moduladores del complejo receptor de serotonina 5-HT3, y para reconstituir una respuesta fisiológica al receptor 5-HT3 más realista en sistemas recombinantes. La co-expresión del 5-HT3-A con la subunidad 5-HT3-C reduce la función biológica del receptor 5-HT3-A para algunos moduladores conocidos de receptores 5-HT3. Los modulados identificados en el ensayo descrito en este documento son útiles como agentes terapéuticos. Las moléculas de ADN recombinantes, y porciones de las mismas, son útiles para aislar homólogos de las moléculas de ADN, identificar y aislar equiva-
lentes genómicos de las moléculas de ADN, e identificar, detectar o aislar formas mutantes de las moléculas de ADN.
Sumario de la invención
Se ha clonado una molécula de ADN que codifica una subunidad humana con homología con el receptor de serotonina 5-HT3-A. Se describen las propiedades biológicas y estructurales de la proteína codificada, así como la secuencia de aminoácidos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 [SEC ID Nº 9] se muestra la secuencia de aminoácidos de 5-HT3-C humana (447 aminoácidos).
Figura de Referencia 1 - [SEC ID Nº 5] Secuencia de ácidos nucleicos de la 5-HT3-C humana (secuencia completa incluyendo regiones traducidas); 1745 bases. (34 bases de 5' RNT; 367 bases de 3' RNT).
Figura de Referencia 2 - [SEC ID Nº 6] Se muestra la secuencia de nucleótidos para la región codificante de 5-HT3-C; 1341 bases.
Figura de Referencia 3 - Expresión funcional de 5-HT3-C humana junto con el receptor 5-HT3-A en oocitos de Xenopus: 5-HT3-C disminuye la magnitud de las corrientes de 5-HT3-A provocadas por el agonista 5-HT, pero no la magnitud de las corrientes inducidas por epibatidina en oocitos co-inyectados con el receptor ACh nicotínico \alpha3\beta4. (a.) Se inyectó a lo oocitos con 0,33 ng de 5-HT3-A junto con 0,025 ng de un mutante Shaker de deleción N-terminal y agua o 0,67 ng de ARNc de 5-HT3-C. Parte superior: corrientes provocadas por 5-HT 10 \muM. Fondo: las corrientes activadas por una familia de etapas de voltaje despolarizantes (-40 a +50 mV en aumentos de 30 mV desde un potencial de retención de -70 mV) indican que la expresión del canal de potasio es similar en los dos conjuntos de oocitos. Los oocitos se ensayaron 6 días después de la inyección. (b.) Se inyectó a los oocitos las subunidades del receptor ACh nicotínico 0,30 ng \alpha3 y 0,25 de \beta4 junto con agua o 0,067 ng de ARNc de 5-HT3-C. Se ensayó la sensibilidad de los oocitos a epibatidina 10 \muM 6 días después de la inyección. 5-HT3-C no tuvo efecto sobre las corrientes mediadas por \alpha3\beta4. Los potenciales inversos de corrientes inducidas por 5-HT en oocitos que expresaban 5-HT3-A y 5-HT3-C (proporción 1:5) eran similares a los receptores 5-HT3-A, lo que indicaba que la disminución de la corriente inducida por 5-HT no se debe a un desplazamiento en la permeabilidad iónica.
Figura de Referencia 4. Se muestra la cuantificación y especificación del efecto modulador de 5-HT3-C humana en oocitos. (a.) Respuesta máxima provocada por exposición de 5-HT 10 \muM a oocitos que expresan 5-HT3-A (corto) (0,33 ng) con (transparente n = 5) y sin (rayado; n = 4) 5-HT3-C (0,67 ng). (b.) Respuesta máxima a exposición de epibatidina 10 \muM a oocitos que expresan el receptor ACh nicotínico \alpha3\beta4 (0,25 ng cada) con (transparente; n = 8) y sin (rayado; n = 9) 5-HT3-C (3,35 ng).
Figura de Referencia 5. PANEL A [Figura de Referencia 5A]. Se muestra la distribución tisular basada en PCR de la 5-HT3-C humana. Las pistas se marcan como se indica: 1, Amígdala; 2, Médula ósea; 3, Cerebro; 4, Cerebelo; 5 Corazón; 6, Hipocampo; 7, Riñón; 8, Hígado; 9, Pulmón; 10, Páncreas; 11, Placenta; 12, Próstata; 13, Músculo esquelético; 14, intestino delgado; 15, bazo; 16, médula espinal; 17, estómago; 18, Tálamo; 19, Testículos; 20, Timo; 21, Útero; 22, Glándula adrenal; 23, Caudado; 24, Ganglio linfático; 25, Glándula Mamaria; 26, Glándula salival; 27, Sustancia negra; 28, Tiroides; 29, Tráquea; 30, Control negativo; 31, Biblioteca esplénica; 32, Biblioteca del tálamo; 33, Biblioteca de la placenta; 34, Biblioteca del corazón; 35, Biblioteca del hígado; 36, Biblioteca del pulmón; 37, Biblioteca del útero; 38, Biblioteca de la pituitaria; 39, Biblioteca de la médula espinal; 40, Biblioteca de la médula ósea; 41, Biblioteca del hipocampo; 42, Biblioteca del ganglio de la raíz dorsal; 43, Biblioteca del intestino delgado; 44, Biblioteca del hipotálamo; 45, Biblioteca del córtex cerebral; 46, Biblioteca del cerebelo; 47 y 48, controles negativos (sin plantilla de ADN).
PANEL B [Figura de Referencia 5B]. Los análisis de Microseries de ARNm de 5-HT3-C y 5-HT3-A se expresan en células B, fibroblastos, ganglios de la raíz dorsal, glándulas mamaria y salivar, médula ósea, bazo, próstata, Músculo esquelético, timo, Placenta, tiroides, útero, testículos, hipotálamo, hipocampo, amígdala, tráquea e intestino delgado. Se detectaron ARNm de 5-HT3-C y 5-HT3-A coherentes con el patrón de marcado que se muestra en la Figura 6a, en bazo, intestino delgado y grueso y monocitos CD14+ usando técnicas de hibridación de microseries.
Descripción detallada
La serotonina es un transmisor de aminas biogénico que funciona con alguna capacidad en muchas condiciones fisiológicas y patofisiológicas. La serotonina actúa como neurotransmisor y neuromodulador en el sistema nervioso central y periférico, media respuestas inflamatorias y alérgicas, regula la función de las vías respiratorias, controla la secreción de ácido en el estómago, regula la función cardiovascular así como las respuestas arterial y venosas y es probable que esté implicada en procedimientos todavía por determinar. Los receptores de serotonina que median estos incluyen el receptor 5-HT3 regulado por ligando. El solapamiento de la expresión del receptor 5-HT3-A y 5-HT3-C sugiere que el supuesto heterodímero está implicado en la función del sistema nervioso central y periférico [DRG] así como la del intestino delgado, timo, próstata y uterina.
La secuencia de aminoácidos completa de la 5-HT3-C humana no se conocía antes de la presente invención.
El significado fisiológico de los descubrimientos que se presentan en este documento incluyen la capacidad de las células que co-expresan 5-HT3-C y 5-HT3-A para ser menos sensibles a 5-HT que las células que expresan receptores 5-HT3-A (corto) homoméricos o 5-HT3-A (corto)/ 5-HT3-C heterodiméricos. Estas alteraciones de las corrientes mediadas por receptor tienen profundos efectos sobre la activación por 5-HT de la excitabilidad neuronal. Se prevé que diversas células y tipos celulares contendrán la 5-HT3-C humana. Las células de vertebrados capaces de producir 5-HT3-C humana incluyen aunque sin limitación, pulmón, próstata, intestino delgado, estómago, células B, fibroblastos, ganglios de la raíz dorsal, glándula mamaria, glándula salivar, médula ósea, ganglio linfático, timo, placenta, tiroides, útero, testículos, hígado, hipotálamo, amígdala, y tráquea, así como células del músculo liso bronquial, vesícula biliar, células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas y bulbo olfatorio (Figura de Referencia 5).
Otras células y líneas celulares también pueden ser adecuadas para el uso de ADNc de 5-HT3-C humana. La selección de células adecuadas puede realizarse seleccionando ARNm que codifica la subunidad 5-HT3-C usando RT-PCR y tecnología de microseries. La actividad de la 5-HT3-C humana puede controlarse antes y después de la incubación de células con secuencias antisentido para 5-HT3-C realizando un ensayo de unión a ^{3}H-[mCPGB] o ^{3}H-[Y25130 o MDL 72222] en presencia de receptor 5-HT3-A (Steward et al., 1993), mediante la medición directa de un flujo de entrada de Ca^{2+} usando los tintes sensibles a Ca^{2+} (Kuntzweiler et al., 1998), o mediante flujo iónico en red usando técnicas de fijación de voltaje (Hamill et al., 1981). Después del tratamiento antisentido, la respuesta a 5-HT se potenciará en células que expresan 5-HT3-A y 5-HT3-C. Las células que poseen actividad de 5-HT3-C humana en este ensayo, pueden ser adecuadas para el aislamiento de ADN o ARNm de 5-HT3-C humana. La selección de células adecuadas puede realizarse seleccionando por unión de anticuerpo a la superficie celular, un anticuerpo específicamente reactivo para 5-HT3-C: Las células que poseen dicha unión a anticuerpo pueden ser adecuadas para el aislamiento de de ADN o ARNm de 5-HT3-C humana.
Puede usarse cualquiera de diversos procedimientos conocidos en la técnica para clonar molecularmente ADN de 5-HT3-C humana. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación, expresión funcional directa de los genes de 5-HT3-C humana después de la construcción de una biblioteca de ADNc que contiene 5-HT3-C humana en un sistema de vector de expresión apropiado. Otro método es explorar una biblioteca de ADNc que contiene 5-HT3-C humana construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido con una sonda de oligonucleótidos marcada, diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de las subunidades 5-HT3-C humanas. Un método adicional consiste en explorar una biblioteca de ADNc que contiene 5-HT3-C humana construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido con un ADNc parcial que codifica la proteína 5-HT3-C humana. Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación por PCR específica de fragmentos de ADN de 5-HT3-C humana a través del diseño de cebadores de oligonucleótidos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína 5-HT3-C humana purificada.
Otro método es aislar ARN de células que producen 5-HT3-C humana y se traduce el ARN a proteína mediante un sistema de traducción in vitro e in vivo. La traducción del ARN en un péptido o proteína dará como resultado la producción de al menos una porción de la proteína 5-HT3-C humana que puede identificarse mediante, por ejemplo, reactividad inmunológica con un anticuerpo anti-5-HT3-C humana o mediante actividad biológica de proteína 5-HT3-C humana. En este método, pueden analizarse reservas de ARN aisladas a partir de células que producen 5-HT3-C humana, para la presencia de un ARN que codifica al menos una porción de la proteína 5-HT3-C humana. Puede realizarse el fraccionamiento adicional de la reserva de ARN para purificar el ARN de 5-HT3-C humana de ARN de 5-HT3-C no humana. El péptido o proteína producido mediante este método puede analizarse para proporcionar secuencias de aminoácidos que a su vez se usan para proporcionar cebadores para la producción de ADNc de 5-HT3-C humana, o puede analizarse el ARN usado para traducción para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican 5-HT3-C humana, y producir sondas para esta producción de ADNc de 5-HT3-C humana. Este método se conoce en la técnica y puede encontrarse en, por ejemplo, Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
1989.
Es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otras células o tipos celulares, pueden ser útiles para aislar ADN que codifica 5-HT3-C humana. Otros tipos de bibliotecas incluyen, aunque sin limitación, bibliotecas de ADNc obtenidas de otras células, de organismos diferentes del ser humano, y bibliotecas de ADN genómico que incluyen YAC (cromosoma artificial de levadura) y bibliotecas de cósmidos.
Es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que pueden preparase bibliotecas de ADNc adecuadas a partir de células o líneas celulares que tienen actividad de 5-HT3-C humana.
La selección de células o líneas celulares para su uso para preparar un biblioteca de ADNc para aislar ADNc de 5-HT3-C humana puede realizarse midiendo en primer lugar la actividad de 5-HT3-C humana asociada a células usando la medición de la actividad biológica asociada a 5-HT3-C humana o un ensayo de unión ligando receptor 5-HT3-C-5-HT3-A humano [^{3}H-mCPBG] (Steward et al., 1993) o unión ^{3}H-[Y25130 o MDL 72222].
La preparación de bibliotecas de ADNc puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Pueden encontrase técnicas de construcción de biblioteca de ADNc por ejemplo, en el documento Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989).
También es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que también puede aislarse ADN que codifica 5-HT3-C humana a partir de una biblioteca de ADN genómico adecuada. La construcción de bibliotecas de ADN genómico puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Pueden encontrarse técnicas bien conocidas de construcción de bibliotecas de ADN genómico en el documento Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989).
Para clonar el gen de 5-HT3-C humana mediante los métodos anteriores, la secuencia de aminoácidos de 5-HT3-C humana puede ser necesaria. Para conseguir esto, puede purificarse la proteína 5-HT3-C human y determinarse la secuencia de aminoácidos parcial por secuenciadores automatizados. No es necesario determinar toda la secuencia de aminoácidos, pero se determina la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína, para la producción de cebadores para amplificación por PCR de un fragmento parcial de ADN de 5-HT3-C humana.
Una vez que se han identificado las secuencias de aminoácidos adecuadas, se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Puesto que el código genético es degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del conjunto será idéntico a la secuencia de 5-HT3-C humana, pero será capaz de hibridar con ADN de 5-HT3-C humana incluso en presencia de oligonucleótidos con emparejamientos erróneos. Los oligonucleótidos de ADN mal emparejados todavía pueden hibridar de forma suficiente con el ADN de 5-HT3-C humana para permitir la identificación y aislamiento de ADN que codifica 5-HT3-C humana. El ADN aislado mediante estos métodos puede usarse para explorar bibliotecas de ADN de diversos tipos celulares, de fuentes de invertebrados y vertebrados, para aislar genes homólogos.
La 5-HT3-C humana biológicamente activa purificada puede tener varias formas físicas diferentes. La 5-HT3-C humana puede existir como un polipéptido naciente o no procesado de longitud completa, o como polipéptidos parcialmente procesados o combinaciones de polipéptidos procesados. El polipéptido de 5-HT3-C humana naciente de longitud completa puede modificarse de forma posterior a la traducción mediante sucesos de escisión proteolítica específica que dan como resultado la formación de fragmentos del polipéptido naciente de longitud completa. Un fragmento o asociación de fragmentos puede tener la actividad biológica completa asociada con 5-HT3-C humana, sin embargo, el grado de actividad de 5-HT3-C humana puede variar entre fragmentos de 5-HT3-C humana individuales y fragmentos del polipéptido de 5-HT3-C humana físicamente asociados.
El ADN de 5-HT3-C humana clonado, obtenido a través de los métodos descritos en este documento, puede expresarse de forma recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y transferirse a células hospedadoras procariotas o eucariotas para producir proteína 5-HT3-C humana recombinante. Las técnicas para dicha manipulación se describen completamente en el documento Maniatis, T et al., supra, y se conocen bien en la técnica.
Los vectores de expresión se definen en este documento como secuencias de ADN que se requieren para la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un hospedador apropiado. Dichos vectores pueden usarse para expresar genes eucariotas en diversos hospedadores tales como bacterias incluyendo E. coli, algas verdeazuladas, células vegetales, células de insecto, células de hongos, incluyendo células de levadura, y células animales.
Los vectores diseñados de forma específica permiten el trasbordo de ADN entre hospedadores tales como bacterias-levadura o bacterias-células animales o bacterias-células de hongos o bacterias-células de invertebrados. Un vector de expresión construido de forma apropiada debe contener: un origen de replicación para replicación autónoma en células hospedadoras, marcadores seleccionables, una cantidad limitada de sitios de enzima de restricción útiles, un potencial para gran cantidad de copias, y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige ARN polimerasa para unirse a ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que causa que los ARNm se inicien a alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, aunque sin limitación, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados específicamente o virus.
Pueden usarse diversos vectores de expresión de mamíferos para expresar 5-HT3-C humana recombinante en células de mamífero. Los vectores de expresión de mamíferos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para expresión de 5-HT3-C humana recombinante, incluyen aunque sin limitación, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (In Vitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565).
Pueden usarse diversos vectores de expresión bacterianos para expresar 5-HT3-C humana recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión de 5-HT3-C humana recombinante incluyen, aunque sin limitación, vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen).
Pueden usarse diversos vectores de expresión de hongos para expresar 5-HT3-C humana recombinante en células de hongos tales como levadura. Los vectores de expresión en hongos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión de 5-HT3-C humana recombinante, incluyen aunque sin limitación pYES2 (InVitrogen) y vector de expresión de Pichia (InVitrogen).
Pueden usarse diversos vectores de expresión de células de insecto para expresar 5-HT3-C humana recombinante en células de insecto. Los vectores de expresión de células de insecto disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de 5-HT3-C humana, incluyen aunque sin limitación pBlueBacII (InVitrogen).
El ADN que codifica 5-HT3-C humana puede clonarse en un vector de expresión para la expresión en una célula hospedadora recombinante. Las células hospedadoras recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo aunque sin limitación líneas celulares de origen bovino, porcino, de mono y de roedor, y células de insecto incluyendo aunque sin limitación líneas celulares obtenidas de drosophila y gusano de seda. Las líneas celulares obtenidas de especies de mamífero que pueden ser adecuadas y que están disponibles en el mercado, incluyen aunque sin limitación CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células-L, y HEK-293 (ATCC CRL1573).
El vector de expresión puede introducirse en células hospedadoras mediante una cualquiera de varias técnicas incluyendo aunque sin limitación transformación, transfección, fusión del protoplasto, lipofección, electroporación. Las células que contienen vector de expresión se propagan mediante clonación y se analizan de forma individual para determinar si producen proteína 5-HT3-C humana. La identificación de clones de células hospedadoras que expresan 5-HT3-C humana puede realizarse por varios medios, incluyendo aunque sin limitación, reactividad inmunológica con anticuerpos anti 5-HT3-C humana, y la presencia de actividad de 5-HT3-C humana asociada con célula hospedadora.
La expresión de ADN de 5-HT3-C humana también puede realizarse usando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético o el ARNm aislado a partir de células que producen 5-HT3-C humana, puede traducirse de forma eficaz en diversos sistemas sin células, incluyendo aunque sin limitación, extractos de germen de levadura y extractos de reticulocito, así como traducirse de forma eficaz en sistemas basados en células, incluyendo aunque sin limitación, microinyección en oocitos de rana, prefiriéndose generalmente la microinyección en oocitos de rana.
Para determinar la(s) secuencia(s) de ADN de 5-HT3-C humana que produce(n) niveles óptimos de actividad de 5-HT3-C humana y/o proteína 5-HT3-C humana, pueden construirse moléculas de ADN de 5-HT3-C humana, incluyendo aunque sin limitación, las siguientes: el marco de lectura abierta de longitud completa del ADNc de 5-HT3-C humana que codifica la proteína de 50,2 kDa desde aproximadamente la base 35 a aproximadamente la base 1376 (estas cifras corresponden al primer nucleótido de la primera metionina y el último nucleótido del primer codón de terminación) y varias construcciones que contienen porciones del ADNc que codifica proteína de 5-HT3-C humana. Todas las construcciones pueden diseñarse para no contener nada, o contener toda o porciones de la región 5' o 3' no traducida de ADNc de 5-HT3-C humana. Los niveles de expresión de proteína pueden determinarse después de la introducción, de forma aislada o en combinación, de estas construcciones en células hospedadoras apropiadas. Después de la determinación de la casete de ADN de 5-HT3-C humana que produce expresión óptima en ensayos transitorios, esta construcción de ADN de 5-HT3-C humana se transfiere a diversos vectores de expresión, para la expresión en células hospedadoras, incluyendo aunque sin limitación, células de mamífero, células de insecto infectadas con baculovirus, E. coli, y la levadura S. cerevisiae.
Pueden usarse transfectantes de células hospedadoras y oocitos microinyectados para ensayar los niveles de actividad de 5-HT3-C humana y los niveles de proteína 5-HT3-C humana mediante los siguientes métodos. En el caso de células hospedadoras recombinantes, esto implica la co-transfección de uno o posiblemente dos o más plásmidos, que contienen el ADN de 5-HT3-C humana que codifica uno o más fragmentos o subunidades y el receptor 5-HT3-A, o la transfección de la proteína 5-HT3-C humana en líneas celulares humanas que expresan el receptor 5-HT3-A. En el caso de oocitos, esto implica la co-inyección de ARN sistémicos para proteínas receptoras 5-HT3-C y 5-HT3-A humanas. Después de un periodo de tiempo apropiado para permitir la expresión, la proteína celular se marca metabólicamente con, por ejemplo ^{35}S-metionina durante 24 horas, después de las cuales se recogen los lisados celulares y los sobrenadantes del cultivo celular y se someten a inmunoprecipitado con anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína 5-HT3-C humana.
Otros métodos para detectar actividad de 5-HT3-C humana implican la medición directa de la actividad de 5-HT3-C humana en células completas transfectadas con receptor 5-HT3-A humano con o sin ADNc de 5-HT3-C u oocitos inyectados con receptor 5-HT3-A humano y ARNm de 5-HT3-C. La actividad de 5-HT3-C humana se mide mediante unión específica a ligando y características biológicas de las células hospedadoras que expresan ADN de 5-HT3-C humana. En el caso de células hospedadoras recombinantes que expresan receptor 5-HT3-A humano y 5-HT3-C humana, pueden usarse técnicas de parches de fijación del voltaje para medir la actividad del receptor y cuantificar la proteína 5-HT3-C humana. En el caso de oocitos pueden usarse técnicas de fijación con parche así como de fijación de voltaje con dos electrodos, para medir la tasa de desintegración de corrientes inducidas por agonista o respuesta a dosis de agonista.
Los niveles de proteína 5-HT3-C humana en células hospedadoras se cuantifican mediante inmunoafinidad. Las células que expresan 5-HT3-C humana pueden ensayarse para la cantidad de moléculas receptoras de superficie celular expresada midiendo la cantidad de unión de mCPGB o Y25130 o MDL72222 radiactivo o anticuerpos marcados, que son específicos para la subunidad 5-HT3-C, a las membranas celulares. Se usan perlas de afinidad específica pare 5-HT3-C humana o anticuerpos específicos para 5-HT3-C humana para aislar por ejemplo proteína 5-HT3-C humana marcada con ^{35}S-metionina o no marcada. La proteína 5-HT3-C humana marcada se analiza mediante SDS-PAGE. La proteína 5-HT3-C humana no marcada se detecta mediante transferencia de Western, ensayos ELISA o RIA empleando anticuerpos específicos para 5-HT3-C humana.
Puesto que el código genético es degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del conjunto será idéntico a la secuencia de 5-HT3-C humana, pero será capaz de hibridar con ADN de 5-HT3-C humana incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos en condiciones apropiadas. En condiciones alternativas, los oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos aún pueden hibridar con el ADN de 5-HT3-C humana para permitir la identificación y aislamiento de ADN que codifica 5-HT3-C humana.
Puede usarse ADN que codifica 5-HT3-C humana de un organismo particular para aislar y purificar homólogos de 5-HT3-C humana de otros organismos. Para conseguir esto, el primer ADN de 5-HT3-C humana puede mezclarse con una muestra que contenga ADN que codifica homólogos de 5-HT3-C humana en condiciones de hibridación apropiadas. El complejo de ADN hibridado puede aislarse y el ADN que codifica el ADN homólogo puede aislarse a partir del mismo.
Se sabe que hay una cantidad sustancial de redundancia en los diversos codones que codifican aminoácidos específicos. Por lo tanto, pueden existir secuencias de ADN que contengan codones alternativos que codifiquen la traducción eventual del mismo aminoácido. Para los fines de esta memoria descriptiva, una secuencia que lleva uno o más codones sustituidos se definirá como una variación degenerada. Pueden existir mutaciones en la secuencia de ADN o la proteína traducida, que no alteren sustancialmente las propiedades físicas definitivas de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de leucina por valina, lisina por arginina, o glutamina por asparagina puede no causar un cambio en la funcionalidad del polipéptido.
Se sabe que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden alterarse para que codifiquen un péptido que tenga propiedades que sean diferentes a las del péptido de origen natural. Los métodos para alterar las secuencias de ADN incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis sitio-dirigida. Los ejemplos de propiedades alteradas incluyen, aunque sin limitación, cambios en la afinidad de una enzima por una sustancia o de un receptor por un ligando.
Como se usa en este documento, un "derivado funcional" de 5-HT3-C humana es un compuesto que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la actividad biológica de 5-HT3-C humana. La expresión "derivados funcionales" pretende incluir los "fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o "derivados químicos" de 5-HT3-C humana. El término "fragmento" pretende referirse a cualquier subconjunto de polipéptidos de 5-HT3-C humana. El término "variante" pretende referirse a una molécula sustancialmente similar en estructura y función a toda la molécula de 5-HT3-C humana o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" a 5-HT3-C humana si las dos moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si las dos moléculas poseen actividad biológica similar. Por lo tanto, si las dos moléculas poseen actividad sustancialmente similar, se considera que son variantes incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a una molécula de función sustancialmente similar a toda la molécula de 5-HT3-C humana o a un fragmento de la misma.
Después de la expresión de 5-HT3-C humana en una célula hospedadora recombinante, pude recuperarse proteína 5-HT3-C humana para proporcionar 5-HT3-C humana en forma activa. Diversos procedimientos de purificación del receptor 5-HT3-A de serotonina están disponibles y son adecuados para su uso (Fletcher y Barnes, 1997; Fletcher et al., 1998; Lummis y Martin, 1992; Miller et al., 1992). Como se ha descrito anteriormente para la purificación de 5-HT3-C humana a partir de fuentes naturales, puede purificarse 5-HT3-C humana recombinante a partir de lisados y extractos celulares, o a partir de medio de cultivo acondicionado, mediante diversas combinaciones de, o aplicación individual de fraccionamiento de sales, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción a hidroxiapatita y cromatografía de interacción hidrófoba.
Además, la 5-HT3-C humana recombinante puede separarse de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para 5-HT3-C humana naciente de longitud completa, fragmentos polipeptídicos de 5-HT3-C humana o subunidades de 5-HT3-C humana.
Los anticuerpos monoespecíficos para 5-HT3-C humana se purifican a partir de antisueros de mamífero que contienen anticuerpos reactivos contra 5-HT3-C humana o se preparan en forma de anticuerpos monoclonales reactivos con 5-HT3-C humana usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Anticuerpo monoespecífico, como se usa en este documento, se define como una única especie de anticuerpos o múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogénea para 5-HT3-C humana. Unión homogénea, como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de las especies de anticuerpos para unirse a un antígeno o epítopo específico, tal como los asociados con la 5-HT3-C humana, como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos específicos para 5-HT3-C humana se producen inmunizando animales tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, prefiriéndose los conejos, con una concentración apropiada de 5-HT3-C humana con o sin un adyuvante inmune.
Se recoge suero preinmune antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 100 mg de péptido que codifica un fragmento de 5-HT3-C humana asociado con un adyuvante inmune aceptable. Dichos adyuvantes aceptables incluyen, aunque sin limitación, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial está compuesta por péptido de 5-HT3-C humana en, preferiblemente, adyuvante completo de Freund en múltiples sitios ya sea por vía subcutánea (SC), intraperitoneal (IP) o las dos. A cada animal se le extrae sangre a intervalos regulares, preferiblemente cada semana, para determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden recibir o no inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. A los animales que reciben inyecciones de refuerzo se les da generalmente una cantidad igual del antígeno en adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. Las inyecciones de refuerzo se dan a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen títulos máximos. A aproximadamente 7 días después de cada inmunización de refuerzo o aproximadamente cada semana después de una única inmunización, se extrae sangre a los animales, se recogen el cuero, y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con 5-HT3-C humana se preparan inmunizando ratones de la misma estirpe, preferiblemente Balb/c, con péptido de 5-HT3-C humana. Los ratones se inmunizan por la vía IP o SC con de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1,0 mg, preferiblemente aproximadamente 1 mg, de péptido de 5-HT3-C humana en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución salina incorporada en un volumen igual de un adyuvante aceptable, como se ha descrito anteriormente. Se prefiere adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial el día 0 y se dejan descansar durante de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 semanas. A los ratones inmunizados se les da una o más inmunizaciones de refuerzo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 mg de polipéptido de 5-HT3-C humana en una solución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato, mediante la vía intravenosa (IV). Los linfocitos, de ratones positivos para el anticuerpo, preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtienen retirando bazos de ratones inmunizados, mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Las células de hibridoma se producen mezclando los linfocitos esplénicos con un compañero de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los compañeros de fusión pueden incluir, aunque sin limitación: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose generalmente Sp 2/0. Las células que producen anticuerpos y las células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, aproximadamente 1000 mol. de peso molecular, a concentraciones de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan mediante crecimiento en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se recogen los líquidos sobrenadantes de pocillos positivos para el crecimiento en aproximadamente los días 14, 18 y 21 y se seleccionan para la producción de anticuerpo mediante un inmunoensayo tal como un inmunoradioensayo de fase sólida (SPIRA) usando péptido de 5-HT3-C humana como el antígeno. Los líquidos del cultivo también se ensayan en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo de mAb. Las células de hibridoma de pocillos positivos para anticuerpo se clonan mediante técnicas tales como la técnica de agar blando MacPherson, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson Eds., Academic Press, 1973.
Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo mediante inyección de ratones Balb/c sensibilizados con pristano, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con de aproximadamente 2 x 10^{6} a aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma, aproximadamente 4 días después de la sensibilización. El líquido ascítico se recoge aproximadamente a los 8-12 días después de la transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.
La producción in vitro de mAb anti 5-HT3-C humana se realiza cultivando el hibridoma en DMEM que contiene suero fetal de ternero a aproximadamente el 2% para obtener suficientes cantidades del mAb específico. Los mAb se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.
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Los títulos de anticuerpo del líquido ascítico o del cultivo de hibridoma se determina mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, aunque sin limitación, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de anticuerpos inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Se usan ensayos similares para detectar la presencia de 5-HT3-C humana en los fluidos o tejidos corporales y extractos celulares.
El fácilmente evidente par los especialistas en la técnica que los métodos descritos anteriormente para producir anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos polipeptídicos de 5-HT3-C humana, o polipéptido de 5-HT3-C humana naciente de longitud completa, o las subunidades de 5-HT3-C humana individuales. Específicamente, es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica, que pueden generarse anticuerpos monoespecíficos que son específicos solamente para la subunidad de 5-HT3-C humana o el receptor completamente funcional.
Pueden preparase columnas de afinidad al anticuerpo para 5-HT3-C humana, añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Bio-Rad), un soporte de gel que se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de lecho de gel de agarosa. Después se acoplan los anticuerpos al gel mediante enlaces amida con el brazo espaciador. Los restantes ésteres activos se inactivan después con etanoalmina HCl (pH 8). La columna se lava con agua seguido de glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para retirar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) y los sobrenadantes del cultivo celular o extractos celulares que contienen subunidades de 5-HT3-C humana se pasan lentamente a través de la columna. La columna se lava después con solución salina tamponada con fosfato hasta que la densidad óptica (A_{280}) cae hasta la del trasfondo, después se eluye la proteína con glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6. La proteína 5-HT3-C humana purificada se dializa después contra solución salina tamponada con fosfato.
Se han identificado clones de ADN, denominados p5HT3CR, que codifican proteínas que, cuando se expresan en cualquier hospedador recombinante, incluyendo aunque sin limitación, células de mamífero o células de insecto o bacterias, forman un receptor que se vuelve insensible a serotonina cuando se co-expresa con subunidades del receptor 5-HT3-A (corto). La expresión de ADN de 5-HT3-C humana da como resultado la reconstitución de las propiedades observadas en oocitos inyectados con ARN poli (A)^{+} que codifica 5-HT3-C humana junto con subunidades del receptor 5-HT3-A. Estas incluyen: reducción de las respuestas inducidas por 5-HT, mCPGB y 1-PGB en comparación con las observadas para homomultímeros de 5-HT3-A.
Una manera de entender qué receptores de serotonina están implicados en estos procesos es desarrollar moduladores químicos de los receptores como herramientas de investigación y entidades terapéuticas. Pueden usarse células hospedadoras recombinantes que expresan los receptores 5-HT3-C humana y 5-HT3-A de serotonina humanas para proporcionar materiales para un método de selección para identificar dichos agonistas y antagonistas. Como tal, esta invención de la subunidad 5-HT3-C de serotonina humana muestra directamente una manera de identificar nuevos agonistas y antagonistas que pueden demostrar se útiles como herramientas de investigación o pueden usarse como agentes terapéuticos para tratar trastornos que implican directa o indirectamente receptores de serotonina.
Pueden preparase kits que contienen ADN o ARN de 5-HT3-C humana, anticuerpos para 5-HT3-C humana, o proteína 5-HT3-C humana. Dichos kits se usan para detectar ADN que hibrida con ADN de 5-HT3-C humana o para detectar la presencia de fragmentos de péptido o proteína 5-HT3-C humana en una muestra. Dicha caracterización es útil para diversos fines incluyendo aunque sin limitación análisis forenses, aplicaciones de diagnóstico, y estudios epidemiológicos.
Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteínas recombinantes y anticuerpos de la presente invención pueden usarse para seleccionar y medir niveles de ADN de 5-HT3-C humana, ARN de 5-HT3-C humana o proteína 5-HT3-C humana. Las propias proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y anticuerpos, permiten la formulación de kits adecuados para la detección y tipificado de 5-HT3-C humana. Dicho kit comprendería un vehículo compartimentalizado adecuado para alojar bien sujeto al menos un recipiente. El vehículo comprendería además reactivos tales como proteína 5-HT3-C humana recombinante o anticuerpos anti-5-HT3-C humana adecuados para detectar 5-HT3-C humana. El vehículo también puede contener un medio de detección tal como sustratos antigénicos o enzimáticos marcados, o similares.
Pueden sintetizarse secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia de ADN que codifica 5-HT3-C humana, para terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales como 2'-O-alquilARN, u otros oligonucleótidos antisentido imitadores de 5-HT3-C humana. Las moléculas antisentido de 5-HT3-C humana pueden introducirse en las células mediante microinyección, encapsulación en liposomas o mediante expresión desde vectores que alojan la secuencia antisentido. La terapia antisentido de 5-HT3-C humana puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades donde es beneficioso reducir la actividad de 5-HT3-C humana.
La terapia génica de 5-HT3-C humana puede usarse para introducir 5-HT3-C humana en las células de organismos diana. El gen de 5-HT3-C humana puede ligarse en vectores virales que median la transferencia del ADN de 5-HT3-C humana mediante infección de células hospedadoras del receptor. Los vectores virales adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, virus vaccinia, poliovirus y similares. Como alternativa, puede transferirse ADN de 5-HT3-C humana a células para terapia génica mediante técnicas no virales, incluyendo transferencia de ADN dirigida mediada por receptor usando conjugados de ligando-ADN o conjugados de adenovirus-ligando-ADN, lipofección, fusión a la membrana o microinyección directa. Estos procedimientos y variaciones de los mismos son adecuados para terapia génica de 5-HT3-C humana ex vivo así como in vivo. La terapia génica de 5-HT3-C humana puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades donde es beneficioso elevar la actividad de 5-HT3-C humana. Dos ejemplos de estrategias terapéuticas podrían ser de la siguiente manera: (A) introducción de 5-HT3-C en un tejido que no expresa de forma natural la subunidad con el fin de disminuir la respuesta al receptor 5-HT3 en asma, inflamación y terminales del nervio vagal para bloquear los efectos de 5-HT; o (B) Estrategias antisentido para disminuir los niveles de 5-HT3-C en tejido que expresa de forma natural la subunidad, con el fin de elevar la sensibilidad del complejo receptor 5-HT3.
Pueden formularse composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden ADN de 5-HT3-C humana, ARN de 5-HT3-C humana, o proteína 5-HT3-C humana, o moduladores de la actividad del receptor 5-HT3-C humano, de acuerdo con métodos conocidos tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dichos vehículos y métodos de formulación pueden encontrarse en el documento Remington's Pharmaceuticals Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz, dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína, ADN, ARN, o modulador.
La expresión "derivado químico" describe una molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la molécula base. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, vida media, absorción, etc. de la molécula base. Como alternativa, los restos pueden atenuar efectos secundarios no deseables de la molécula base o disminuir la toxicidad de la molécula base. Los ejemplos de dichos restos se describen en diversos textos, tales como el documento Remington's Pharmaceuticals Sciences.
Los compuestos identificados de acuerdo con los métodos descritos en este documento pueden usarse en solitario a dosificaciones apropiadas definidas mediante ensayo rutinario para obtener inhibición óptima del receptor 5-HT3-C humano o su actividad, mientras se minimiza cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la co-administración o administración secuencial de otros agentes.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin, sin embargo, limitarla a los mismos.
Ejemplo de referencia 1
Clonación de p5HT3CR método de Amplificación Rápida de los Extremos de ADNc (RACE) de ADNc de 5-HT3-C humana
El método RACE de clonación de ADNc se realizó usando un kit de amplificación de ADNc Marathon^{TM} (Clonetech, Palo Alto, CA) esencialmente como se describe según las instrucciones del fabricante. La reacción principal de PCR se realizó usando un ADNc de pulmón humano (ADNc sintetizado usando 2 \mug de ARNm de pulmón humano (Clontech) y hexámeros aleatorios (kit de síntesis de ADNc Superscript - Life Technologies), que se amplifica usando un cebador AP1 (Clontech) y dos únicos cebadores internos). Los dos cebadores para RACE se identificaron como un fragmento de nucleótido con identidad parcial con el receptor 5-HT3-A, lo que indicaba un nuevo subtipo o subunidad del receptor punitivo. Los cebadores se sintetizaron y tenían las siguientes secuencias:
CHNL 86-6 
\hskip0,2cm
(SEC ID Nº 1) 
\hskip0,4cm
5' GTAGAAGCTGAGGGCATCAATGGCAAC 3', y
CHNL 86-4 
\hskip0,27cm
(SEC ID Nº 2) 
\hskip0,4cm
5' CTGGTCACCCTCATTGGCTTATCATAC 3'.
Después de la PCR principal, se realizó una reacción de PCR secundaria usando un cebador de PCR anidado y el cebador AP1 para amplificar el producto de PCR de la reacción principal. El cebador de PCR anidado se sintetizó y tenía la siguiente secuencia:
CHNL 86-2 
\hskip0,2cm
(SEC ID Nº 3) 
\hskip0,4cm
5' ACTGACAGTGAGGCAGAGGAGGGCA 3'.
El producto de PCR de la segunda reacción se hibridó con un oligonucleótido ^{32}P y se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% para asegurar que el método RACE producía un producto de ADNc específico. El oligonucleótido marcado tenía la siguiente secuencia:
CHNL 86-1 
\hskip0,2cm
(SEC ID Nº 4) 
\hskip0,4cm
5' CCTGGTGAATCCCCAGAGAAGAGTC 3'.
El producto de PCR se clonó en vectores pGemHE y pCDNA3.1/Zeo y se secuencio para identificar la secuencia de ADNc completa de la subunidad.
Ejemplo de referencia 2
Clonación de ADNc de 5-HT3-C en un Vector de Expresión de Mamífero
Los ADNc de 5-HT3-C (denominados colectivamente p5HT3CR) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1zeo(+) (InVitrogen). El clon de ADNC de 5-HT3-C se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de pulmón humano. El ADNc de longitud completa se usó como plantilla para PCR usando cebadores específicos con sitios de clonación BamHI (5' ACC GTT GAA TTC GCC ACC ATG TTG TCA AGT GTA ATG GCT CCC CTG TGG GCC 3') [SEC ID Nº 7] y HindIII (5' AAC GTT AAG CTT TCT TAA GTG CCA GCA CAA TTA CTT GAA G 3') [SEC ID Nº 8]. El producto de PCR se purificó en una columna (kit de purificación de ADN de PCR Wizard de Promega) y se digirió con Nhel y Notl (NEB) para crear extremos cohesivos. El producto se purificó mediante una electroforesis en gel de agarosa de fusión baja. El vector pcDNA3.1zeo(+) se digirió con enzimas Nhel y Notl y posteriormente se purificó en un gel de agarosa de fusión baja. El vector lineal se usó para ligar los insertos de ADNc de 5-HT3-C. Los recombinantes se aislaron y designaron 5-HT3-C. Se transfectaron líneas celulares (en HEK293) para expresar de forma estable 5-HT3-C (5-HT3-C/HEK). Estas líneas celulares recombinantes pueden usarse para transfectar de forma transitoria otros receptores tales como 5-HT3-A así como para transfectar el receptor 5-HT3-A humano en un vector pCIneo (usando sitios de clonación EcoRI y XbaI) (5-HT3-A/células HEK293) mediante electroporación para expresar de forma estable 5-HT3-A humano u otra subunidad del receptor junto con 5-HT3-C. Se seleccionaron clones de 5-HT3-C/célula HEK estables mediante crecimiento en presencia de zeocina; se seleccionan transfectantes dobles mediante crecimiento en presencia de G418 y zeocina. Los clones sencillos resistentes a G418/zeocina se aíslan y demuestran contener el gen 5-HT3-C intacto. Los clones que contenían los ADNc de 5-HT3-C humana se analizaron para la expresión de p5HT3CR midiendo cambios de potencial de membrana usando Fluo-4 y DiBAC_{4}(3) en respuesta a serotonina, y aproximadamente 300 ligandos diferentes (véase Ejemplo de Referencia 5). Las respuestas se compararon con las obtenidas a partir de células HEK293 no transfectadas.
Las células que expresan de forma estable 5-HT3-C humana junto con 5-HT3-A humano se usan para ensayar la expresión de 5-HT3-C humana y actividad funcional. Estas células se usan para identificar y examinar otros compuestos para su capacidad para modular, inhibir o activar la 5-HT3-C humana. Otras células que expresan subunidades 5-HT3-A y 5-HT3-C pueden usarse para identificar y examinar otros compuestos para su capacidad para modular, inhibir o activar la 5-HT3-C humana.
Las casetes que contienen el ADNc de 5-HT3-C humana en orientación positiva con respecto al promotor se ligan en los sitios de restricción apropiados 3' del promotor y se identifican mediante mapeado y/o secuenciación del sitio de restricción. Estos vectores de expresión de ADNc se introducen en células hospedadoras fibroblásticas por ejemplo HEK293 mediante métodos convencionales incluyendo aunque sin limitación electroporación, o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrano, fosfato cálcico).
Todos los vectores usados para expresión transitoria en mamíferos pueden usarse para establecer líneas celulares estables que expresan la 5-HT3-C humana. Se espera que las construcciones de 5-HT3-C humana sin alterar clonadas en vectores de expresión programen células hospedadoras para fabricar proteína 5-HT3-C humana. Las células hospedadoras transfectadas incluyen, aunque sin limitación, HEK293, CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wigler, et al. Cell 11: 223 (1977)], NS/0, y dHFr-CHO [Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].
La co-transfección de cualquier vector que contiene el ADNc de 5-HT3-C humana con un plásmido de selección de fármaco incluyendo, aunque sin limitación G418, zeocina, aminoglicósido fosforiltransferasa; higromicina, higromicin-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforribosiltransferasa, permitirá la selección de clones transfectados de forma estable. Los niveles de la 5-HT3-C humana se cuantifican mediante los ensayos descritos en este documento.
Las construcciones de ADNc de 5-HT3-C humana también se ligan en vectores que contienen marcadores de resistencia a fármacos amplificables, para la producción de clones de células e mamífero que sintetizan los niveles más altos posibles de la 5-HT3-C humana. Después de la introducción de estas construcciones en las células, se seleccionan los clones que contienen el plásmido con el agente apropiado, y el aislamiento de un clon que se sobre-expresa con una alta cantidad de copias de plásmidos se consigue mediante selección en dosis en aumento del agente.
La expresión de 5-HT3-C humana recombinante se consigue mediante transfección de ADNc de 5-HT3-C humana de longitud completa en la célula hospedadora de mamífero.
Ejemplo 1 Estructura primaria de la Proteína 5-HT3-C Humana
Las secuencias de nucleótidos de p5HT3BR mostraron un único gran marco de lectura abierto de aproximadamente 1341 pares de bases como se muestra en la Figura 2. Los ADNc tienen extensiones no traducidas 5' y 3, de aproximadamente 34 y aproximadamente 367 nucleótidos para p5HT3CR. La primera metionina en marco se designó como el codón de iniciación para un marco de lectura abierto que predice una proteína 5-HT3-C humana con una masa molecular (M_{r}) estimada de aproximadamente 50,2 kDa. La proteína contenía restos amino terminales hidrófobos con secuencias altamente predictivas de sitios de escisión de señales que podrían dar como resultado proteína que se iniciaban en el aminoácido 28 (Signal P analysis; Henrik Nielsen, Jacob Engelbretch, Søren Brunak y Gunnar von Heijne: identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10, 1-6 (1997)).
La proteína 5-HT3-C humana predicha se alineó con bases de datos de nucleótidos y proteínas y se relaciona con receptores 5-HT3-A conocidos. Aproximadamente el 66% de los aminoácidos en 5-HT3-C estaban altamente conservados, mostrando al menos el 39% de identidad de aminoácidos con el receptor de serotonina 5-HT3-A humano. Los motivos conservados descubiertos en esta familia de receptores, tales como los 4 supuestos dominios transmembrana con separación similar, también se encontraron en la secuencia 5-HT3-C humana. La identidad del receptor 5-HT3-C con el receptor 5-HT3-A a nivel de nucleótidos era sólo de aproximadamente el 50%. La homología más fuerte esta en los 4 supuestos dominios transmembrana, en particular TM2 y TM3 que son el 65 y el 62% idénticos a 5-HT3-A, respectivamente. La proteína 5-HT3-C humana contenía los restos de cisteína conservados descubiertos en el bucle cisteína-cisteína conservado, que pueden formar el sitio de unión al agonista de canales iónicos regulados por ligando (Lambert et al., 1995). Existe fuerte homología con el sitio de reconocimiento del ligando propuesto en el primer bucle N-terminal en la 5-HT3-A de ratón y el AChR \alpha7 nicotínico [xIWxPDILxxExxD]; solamente 2 diferencias en el "consenso" que se muestra en la proteína 5-HT3-C son cambios conservados. El E106 en el 5-HT3-A (de ratón) es crítico para unión a 5-HT de alta afinidad (Boes et al., 1997); E 129 está en la posición homóloga de la proteína 5-HT3-C.
Se localizaron cuatro sitios potenciales de glicosilación (Marshall, 1972) en el extremo amino extracelular. Curiosamente, no había sitios potenciales para proteína quinasa A o C (Woodgett et al., 1986), caseína quinasa II (Pinna, 1990), o caseína quinasa de la glándula mamaria en los supuestos bucles citoplásmicos.
Ejemplo de referencia 3
Distribución de ARNm de 5-HT3-C
La distribución tisular de los ARNm de 5-HT3-C se determinó mediante PCR semicuantitativa. Se usó un primer conjunto específico para 5-HT3-C, cebador 5' CGTGGAATCCATGGATGTGG [SEC ID Nº 10]; cebador 3' TGG
CAGGGAGCAAGTCATTC [SEC ID Nº 11] para la amplificación completa de una porción del ARNm de 5-HT3-C mediante PCR usando plantillas de ADNc sintetizadas a partir de ARN poli(A) (Clontech, Palo Alto, CA) que se extrajo de diversos tejidos humanos (los tipos de tejido se muestran en la Figura 6a). Para obtener especificidad y sensibilidad aumentadas, se fosforiló un oligonucleótido GTGGGAGATCACAGACACGTCTCGCAAAGT [SEC ID Nº 12] usando \gamma-^{32}P-ATP con polinucleótido quinasa según lo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) y se hibridó con productos de PCR desnaturalizados y se resolvió usando electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%. El gel posterior se secó después y se expuso a una película de rayos-X.
Como se muestra en la figura de referencia 5a, el análisis de distribución tisular basado en PCR muestra que el ARNm de 5-HT3-C se expresa en pulmón humano, próstata, médula ósea, intestino delgado, estómago, útero, testículos, glándula mamaria, tiroides y de forma menos abundante en amígdala, cerebelo, corazón, hígado, páncreas, placenta, médula espinal, timo, glándula adrenal, ganglio linfático, glándula salival, sustancia negra y tráquea. No se observó transcrito detectable en hipocampo, riñón, músculo esquelético, bazo, tálamo, y caudata, se exploraron bibliotecas de ADNc y se observó la expresión en bibliotecas de DRG, intestino delgado, hipotálamo, córtex, cerebelo y pulmón. No había expresión detectable en bibliotecas del bazo, tálamo, placenta, corazón, hígado, útero, pituitaria, médula espinal, médula ósea, hipocampo.
Los análisis de microseries de la expresión de 5-HT3-C y 5-HT3-A mostraron algún solapamiento de las distribuciones del receptor 5-HT3-B y 5-HT3-A y corroboran los resultados que se muestran en la Figura de Referencia 5a. La distribución de ARNm de 5-HT3-C se determinó usando análisis de microseries de ADNc de ARNc amplificado a partir de ARNm extraídos de diversos tejidos y tipos celulares. Los métodos son como se describen en Luo et al., 1999 Nature Medicine 5(1): 117. Como se ve en la Figura de Referencia 5b, el ARNm de 5-HT3-C, y la proteína presumiblemente funcional, se expresa en muchos tejidos de acuerdo con lo indicado por un análisis de inspección del análisis del tejido mieloide y sólido.
Ejemplo de referencia 4
Caracterización de la Función de proteína codificada por p5HT3CR en oocitos de Xenopus
Se prepararon oocitos de Xenopus laevis y se inyectaron usando métodos convencionales descritos anteriormente y conocidos en la técnica (Fraser et al., 1993). Los lóbulos ováricos de Xenopus laevis adultos hembra (Nasco, Fort Atkinson, WI) se separaron, se aclararon varias veces en solución salina nominalmente libre de Ca (en mM): NaCl 82,5, KCl 2,5 MgCl_{2} 1, HEPES 5, ajustada a pH 7,0 con NaOH (OR-2), y se agitaron suavemente en OR-2 que contenía colagenasa de Tipo 1 al 0,2% (ICN Biomedicals, Aurora, Ohio) durante 2-5 horas. Cuando aproximadamente el 50% de las capas foliculares se habían retirado, se seleccionaron oocitos de la Etapa V y VI y se aclararon en medios compuestos por OR-2 al 75% y ND-96 al 25%. El ND-96 contenía (en mM): NaCl 100, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 5, piruvato sódico 2,5, gentamicina (50 \mug/ml), ajustada a pH 7,0, con NaOH. El Ca^{2+} extracelular aumento gradualmente y las células se mantuvieron en ND-96 durante 2-24 horas antes de la inyección. Para la transcripción in vitro, se linealizó pGEM HE (Liman et al., 1992) que contenía 5-HT3-A humana (Genbank D493394) o ADNc de 5-HT3-C, con Nhel y se transcribió con ARN polimerasa T7 (Stratagene) en presencia de la capucha análoga m7G (5')ppp(5')G. El ARNc sintetizado se purificó con una columna de centrifugado G-50 de Sephadex. Se inyectó a los oocitos 50 nl del receptor de serotonina 5-HT3-A humano con o sin el ARN de 5-HT3-C (0,002 y 0,002-0,2 ng cada) u otro canal o subunidad receptora. A los oocitos de control se les inyectó 50 nl de agua. Se incubaron los oocitos durante 2-14 días en ND-96 antes del análisis de la expresión de la 5-HT3-C humana. Se realizaron incubaciones y digestión en colagenasa a temperatura ambiente. Los oocitos inyectados se mantuvieron en grupos de cultivo de 48 pocillos (Costar, Cambridge, MA) a 18ºC. Se midieron las corrientes inducidas por agonistas de la célula completa 1-14 días después de la inyección, con una técnica de fijación de voltaje con dos electrodos convencional (GeneClamp500, Axon Instruments, Foster City, CA) usando métodos convencionales descritos anteriormente y conocidos en la técnica (Dascal, 1987). Los microelectrodos se llenaron con KCl 3 M, que tenía resistencias de 1 y 2 M\Omega. Las células se perfundieron de forma continua con ND96 a 10ml/min. a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa. El voltaje de la membrana se fijó a -70 mV a menos que se indique otra cosa.
No se detectó respuesta a agonistas ensayados (véase a continuación) cuando se inyectaba a los oocitos con subunidades \beta1, \beta2 y \beta3 de ACh nicotínico o con \alpha6 de ACh nicotínico.
5-HT (\geq 100 \muM) no tenía efecto sobre los oocitos inyectados con la supuesta subunidad 5-HT3-C en solitario (n = 11 (33,5 ng ARNc/oocito) y n = 2 (3,35 ng)). El agonista del receptor 5-HT3, 1-PGB, no tenía efecto a 100 \muM (n = 4) y 500 \muM (n = 3) (se inyectó a los oocitos con 33,5 ng de 5-HT3-C). No se observó ningún efecto para ACh 10 \muM (n = 5) y 500 \muM (n = 3), ni para 5-HT (10 \muM) y ACh (500 \muM) aplicados conjuntamente, DA 100 \muM (n = 11), histamina 10 \muM (n = 4), GABA > 30 \muM (n = 6), Glicina 100 \muM (n = 4) (todos los oocitos inyectados con 33,5 ng de ARNc de 5-HT3-C). Se obtuvieron resultados similares para oocitos inyectados con 33,5 ng de ARNc de
5-HT3-C.
Los oocitos inyectados solamente con ARNc de 5-HT3-C (33,5 ng) o 5-HT3-C junto con subunidades \beta1, \beta2 y \beta3 del receptor ACh nicotínico (0,2-0,25 ng) eran insensibles a 30 compuestos neuroactivos a > 100 \muM incluyendo 5-HT, ACh, histamina, tiramina, triptamina, triptafanamida, triptófano, norepinefrina, octopamina, DA, glutamato, L- y D-aspartato, glicina, GABA, \beta-alanina, taurina, \beta-feniletilamina, ácido 5-hidroxiindolacético, 6-hidroximelatonina, gamma hidroxibutirato, ácido cis-4 aminocrotónico, agmatina, d-cicloserina, N-acetil-L-cisteina, ácido acetil-aspartil-L-glutámico, melatonina, ácido 5-hidroxiindol-2-carboxílico, N-acetil serotonina, y 5-hidroxiindol 3-acetamida
(n = 5).
Ocho días después de la inyección con 5-HT3-C (0,67 ng/oocito) junto con subunidad \alpha6 del receptor ACh nicotínico (1 ng/oocito), los oocitos no eran sensibles a epibatidina 10 \muM, ACh 500 \muM, 5-HT 10 \muM, o ACh y 5-HT conjuntamente (n = 5).
La expresión funcional de la subunidad modificadora del receptor 5-HT3 de serotonina human, 5-HT3-C, junto con la forma corta humana del receptor 5-HT3-A (Genbank Nº de acceso D49394) en oocitos de Xenopus se muestra en las Figuras 4 y 5. La corriente de entrada a través de los receptores homoméricos 5-HT3-A durante la presencia continua de 5-HT 10 \muM, se muestra en la Figura de Referencia 3 (panel superior derecho). El agonista se aplicó durante el periodo indicado mediante la barra horizontal por encima del registro. En oocitos co-inyectados con 2 veces más ARNc de 5-HT3-C (0,67 ng) la respuesta máxima a 5-HT, disminuyó de forma drástica (a aproximadamente el 10% del control). Como control positivo para la traducción y la expresión, se co-inyectaron todos los oocitos con un mutante de deleción N-terminal del canal de potasio Shaker, que carece de inactivación rápida. En los mismos oocitos que mostraban respuestas a 5-HT disminuidas, las familias de corrientes activadas por voltaje mediadas por un mutante de deleción N-terminal Shaker no se vieron afectadas por la co-infección con 5-HT3-C (panel superior, señales del fondo). Los oocitos se perfundieron de forma continua con ND96 que contenía Ba^{2+} a una tasa de 10 ml/min. a temperatura ambiente. Barra de escala temporal: 25 segundos. Se obtuvieron resultados similares en experimentos en los cuales lo oocitos se bañaban en ND 96 que contenía Ca^{2+}.
La especificidad del efecto de 5-HT3-C se investigó adicionalmente mediante co-inyección con los receptores nicotínicos \alpha3\beta4 y \alpha4\beta2 en oocitos. La co-inyección del ARNc de 5-HT3-C (3,35 ng) no tuvo efectos sobre las corrientes máximas a través de receptores ACh nicotínicos \alpha3\beta4 activados mediante 10 \muM de epibatidina (Figura de Referencia 3, panel inferior y Figura de Referencia 4). Las corrientes máximas fueron -6,93 +/- 1,45 Na (n = 11) y -6,49 +/- 0,69 nA (n = 7) para receptores ACh \alpha3\beta4 y receptores \alpha3\beta4 junto con 5-HT3-C, respectivamente. Estos resultados se obtuvieron de 3 experimentos diferentes. 5-HT3-C no tenía efecto sobre el tiempo entre 80% del aumento hasta el máximo y el 20% de descenso desde el máximo (t80), el tiempo hasta el máximo, y el grado de insensibilización a un segundo estímulo de epibatidina. Por tanto, la co-infección de 5-HT3-C tenía un efecto específico sobre la función del receptor 5-HT3-A (corto) y no tenía un efecto perjudicial general sobre la traducción, puesto que las corrientes de potasio Shaker activadas por voltaje y las respuestas del receptor ACh nicotínico \alpha3\beta4 y \alpha4\beta2 no eran diferentes en presencia de 5-HT3-C.
La co-expresión de 5-HT3-C disminuía de forma dependiente de la dosis la sensibilidad de oocitos que expresan 5-HT3-A (corto). Los oocitos inyectados con ARNC de 5-HT3-A (0,33 ng) y 5-HT3-C (3,35 ng) eran esencialmente insensibles a 5-HT3 (5-HT3-C).
5-HT3-A (corto) era 10:1). Las respuestas a 5-HT 10 \muM fueron -3,89 +/- 0,76 nA (n = 6) en oocitos inyectados con 5-HT3-A (corto) y -0,010 +/- 0,008 nA (n = 6) en oocitos inyectados con 5-HT3-A (corto) y 5-HT3-C (p < 0,005 test de t de Student). Los oocitos inyectados con 5-HT3-C y 5-HT3-A (corto) a una proporción de 2:1 (Figuras 4,5) mostraron corrientes máximas de -0,028 +/- 0,007 nA (n = 20) en comparación con -1,65 +/- 0,42 nA (n = 19) para oocitos que expresaban 5-HT3-A (corto) (p < 0,001). Curiosamente, a una concentración de 1,8 veces de ARNc de 5-HT3-C con respecto al de 5-HT3-A, la respuesta a 5-HT disminuía aproximadamente el 20% (n = 3), y los oocitos inyectados con una proporción de 1:1 mostraron poco efecto de 5-HT3-C (n = 6) sugiriendo que si se forman heterómeros de 5-HT3-A y 5-HT3-C, más de la mitad del complejo receptor debe estar compuesta por 5-HT3-C para disminuir la función del receptor.
El perfil farmacológico de los receptores 5-HT3-A se estudió en oocitos co-inyectados con 5-HT3-A y 5-HT3-C. Los agonistas del receptor 5-HT3, 1-PBG, DA, y N-\omega-metil. 5-HT (100 \muM), así como triptamina (100 \muM) se aplicaron en baño a los oocitos co-inyectados con 5-HT3-C y 5-HT3-A (proporción 5:1). La proporción de respuestas máximas a 1-PGB 10 y 100 \muM y DA 100 \muM y 1mM era similar a la observada para homómeros de 5-HT3-A, lo que indicaba que 5-HT3-C no tenía un efecto drástico sobre la respuesta a la dosis a estos agonistas. La cinética de las corrientes inducidas por todos los agonistas ensayados era similar con o sin 5-HT3-C.
La modulación por 5-HT3-C de las propiedades de los canales se observó en soluciones salinas agotadas en Ca^{2+}, y en potenciales de membrana cercanos al potencial de membrana del cloruro.
Los oocitos co-inyectados con 5-HT3-B (3,3 ng/oocito) y 5-HT3-C (3,5 ng/oocito) eran insensibles a 5-HT 10 \muM (n = 2 de 2), epibatidina 10 \muM (n = 4 de 4), N-\omega-metil-5-HT 100 \muM (n = 3 de 3), una mezcla de \gamma-hidroxibutirato (0,3 mM), \beta-feniletilamina (0,3 mM) y dopamina (0,5 mM) (n = 2 de 2), una mezcla de mCPGB 10 \muM, 1-PGB 100 \muM, triptamina 100 \muM, y tiramina 100 \muM (n = 3 de 3), IL-1\beta 10 \muM (n = 4 de 4), y gastrina 1 \muM (n = 3 de 3).
La co-inyección de 5-HT3-C (0,85 ng/oocito) con 5-HT3-A-corto (0,45 ng/oocito) junto con 5-HT3-B (3,3 ng/
oocito) no mostró efectos sobre la respuesta al agonista del receptor 5-HT3 y el desarrollo temporal.
Ejemplo de referencia 5
Caracterización de la 5-HT3-C humana en una línea celular de mamífero
Se construyeron células HEK293 humanas que expresaban de forma estable 5-HT3-C humana. Inicialmente, se intentaron transfecciones de 5-HT3-C en pCINeo (EcoRI/Xbal) con transfectamina (Promega) y Effectene (Stratagene) pero las células murieron rápidamente después de la transfección, incluso sin selección en G418 (500 \mug/ml). Para mantener las células transfectadas, se colocaron las células en placas en una capa de células alimentadoras. Puesto que la Zeoina elimina las células HEK293 no transfectadas de forma más rápida y eficaz que G418, se clonó 5-HT3-C en el vector pCDNA3.1/Zeo (sitios EcoRI/NotI).
Se irradiaron aproximadamente 5 x 10^{6} células HEK 293 no transfectadas en 10 ml de medios en máquina CS 126 durante 20 minutos. Se colocaron en placas un millón de células irradiadas con aproximadamente 1 millón de células transfectadas, y la selección con zeocina (200 \mug/ml) se inició un día después. Después de dos meses de divisiones 1:5, se obtuvo una reserva de células transfectadas de forma estable.
Se aisló ARNm poli(A)+ a partir de la reserva, se preparó ADNc por transcripción inversa, y se realizó PCR con cebadores específicos de genes para 5-HT3-C. Se uso una sonda interna marcada con 32P-\gamma-ATP para confirmar que la banda de PCR detectada contenía la secuencia de 5-HT3-C específica. Esto indicaba expresión de ARNm de 5-HT3-C en células contenidas en la reserva.
Después se colocaron células de la reserva en placas de 96 pocillos (Biocoat, negra recubierta con Poli-D-lisina/placa transparente, Becton Dickinson Nº de parte 354640) y se cultivaron hasta confluencia durante tres días. En experimentos que medían los niveles de Ca2+ intracelular, se aclararon los pocillos con F12/DMEM, después se incubaron en Fluo-4 (2 \muM) con ácido Plurónico (20%, 40 \mul usados en 20 ml de volumen total) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se ensayaron usando el FLIPR (Molecular Devices, FL-101). Las células se estimularon con agonistas (a una concentración de 3 veces en 40 \mul añadidos a 80 \mul a una velocidad de 50 \mul/seg.). En experimentos que miden cambios en el potencial de membrana con el tinte sensible a voltaje bajo DiBAC_{4}(3), se lavaron las células tres veces con tampón 2K/2Ca [en mM: 2 de KCl, 128 de NACl, 2 de MgCl_{2}, 2 de Ca_{2}Cl, 15 de dextrosa, 20 de HEPES] que contenía DiBAC_{4}(3) 5 \muM. Se añadieron fármacos (20 \mul) a los pocillos que contenían 180 \mul de tampón 2K/2Ca que contenía DiBAC_{4}(3) 5 \muM. Se empaparon previamente puntas de pipeta durante 2 minutos en tampón 2K/2Ca que contenía DiBAC_{4}(3) 10 \muM antes de la adición de soluciones a las placas celulares. Las señales de DiBAC_{4}(3) se midieron en el FLIPR después de la adición de ligandos en solución de DiBAC_{4}(3) a una tasa
de 50 \mul/seg.
Se ensayó la sensibilidad de células transfectadas de forma estable (5-HT3-C/HEK) para aproximadamente 300 agonistas usando el sistema FLIPR usando los tintes sensibles a Ca^{2+} y voltaje Fluo-4 y DiBAC_{4}(3) (Molecular Probes, Eugene OR) para medir cambios en el potencial de membrana. No se observó respuesta cuando se mantenían las células en su potencial de descanso; como control para el DiBAC, las células que expresan de forma estable receptores 5-HT3-A respondían a 5-HT y otros ligandos específicos del receptor 5-HT3 con una despolarización transitoria rápida (aumento de la fluorescencia).
Ejemplo de referencia 6
Ensayo de unión en células de mamífero co-transfectadas con 5-HT3-C y 5-HT3-A humana
Pueden usarse células HEK293 que expresan de forma estable el receptor 5-HT3-C con o sin expresión transitoria de 5-HT3-A humana en ensayos de unión a ^{3}H-[mCPBG] o ^{3}H-[Y25130 ó MDL 72222]. Pueden realizarse ensayos de equilibrio de unión a ligando usando procedimientos convencionales (Lummis y Baker, 1997; Lummis et al., 1993). La unión específica a ^{3}H-[mCPBG] o ^{3}H-[Y25130 ó MDL 72222] se observa en preparaciones de membrana de células transfectadas con el receptor h5-HT3 y 5-HT3-C humana. Pueden usarse oocitos que expresan 5-HT3-A y 5-HT3-C humana para medir la afinidad de unión de otros compuestos y su capacidad para desplazar la unión a ^{3}H-[mCPBG] o ^{3}H-[Y25130 ó MDL 72222].
Ejemplo de referencia 7
Clonación de un ADNc de 5-HT3-C en Vectores de Expresión de E. coli
Se produce 5-HT3-C humana recombinante en E. coli después de la transferencia de la casete de expresión en vectores de expresión de E. coli, incluyendo aunque sin limitación, la serie pET (Novagen). Los vectores pET colocan la expresión de 5-HT3-C humana bajo el control del promotor del bacteriófago T7 fuertemente regulado. Después de la transferencia de esta construcción en un E. coli hospedador que contiene una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa T7 dirigida por el promotor lac inducible, se induce la expresión de 5-HT3-C humana cuando se añade un sustrato lac apropiado (IPTG) al cultivo. Los niveles de 5-HT3-C humana expresado se determinan mediante los ensayos descritos en este documento.
El ADNc que codifica todo el marco de lectura abierta para 5-HT3-C humana se inserta en el sitio Ndel de la cepa hospedadora BL21 de pET. Después se usan transformantes para inocular cultivos para la producción de proteína 5-HT3-C humana. Los cultivos pueden crecer en medios M9 o ZB, cuya formulación la conocen los especialistas en la técnica. Después de crecer a una DO_{600} de aproximadamente1,5, se induce la expresión de 5-HT3-C humana con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC.
Ejemplo de referencia 9
Clonación de ADNc de 5-HT3-C humana en un Vector de Expresión de Baculovirus para Expresión en células de Insecto
Los vectores de Baculovirus, que se obtienen del genoma del virus AcNPV, se diseñan para proporcionar alto nivel de expresión de ADNc en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRLNº 1711). Los Baculovirus recombinantes que expresan ADNc de 5-HT3-C humana se producen mediante los siguientes métodos convencionales (InVitrogen Maxbac Manual): las construcciones de ADNc de 5-HT3-C humana se ligan al gen de polihedrina en diversos vectores de transferencia de baculovirus, incluyendo el vector pAC360 y el BlueBac (InVitrogen). Los baculovirus recombinantes se generan mediante recombinación homóloga después de la cotransfección del vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico de AcNPV linealizado [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] en células Sf9. los virus pAC360 recombinantes se identifican mediante la ausencia de cuerpos de inclusión en células infectadas y los virus pBlueBac recombinantes se identifican en base a la expresión de \beta-galactosidasa (Summers, M.D. y Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nº 1555). Después de la purificación en placas, se mide la expresión de 5-HT3-C humana mediante los ensayos descritos en este documento.
El ADNc que codifican todo el marco de lectura abierta para 5-HT3-C humana se inserta en el sitio BamHI de pBlueBacII. Las construcciones de orientación positiva se identifican mediante análisis de secuencia y se usan para transfectar células Sf9 en presencia de ADN de AcNPV de tipo moderado.
La 5-HT3-C humana activa auténtica se encuentra en el citoplasma de células infectadas. La 5-HT3-C humana activa se extrae de células infectadas mediante lisis hipotónica o con detergente.
Ejemplo de referencia 9
Clonación de ADNc de 5-HT3-C humana en un vector de expresión de levadura
Se produce 5-HT3-C humana recombinante en la levadura S. cerevisiae después de la inserción del cistrón de ADNc de 5-HT3-C humana óptimo en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de la expresión intracelular, se ligan vectores tales como EmBLyex4 o similares al cistrón de 5-HT3-C humana [Rinas, U et al., Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989)]. Para la expresión molecular, el cistrón de 5-HT3-C humana se liga en vectores de expresión de levadura que se fusionan a una señal de secreción (un péptido de levadura o mamífero) al extremo NH_{2} de la proteína 5-HT3-C humana [Jacobson, M. A., Gene 85: 511-516 (1989); Riett L. y Bellon N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989)].
Estos vectores incluyen, aunque sin limitación, pA VE1>6, que fusiona la señal de albúmina en el suero con el ADNc expresado [Steep O. Biotechnology 8: 42-46 (1990)], y el vector pL8PL que fusiona la señal de lisozima humana al ADNc expresado [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728-2732)]. Además, la 5-HT3-C humana se expresa en levadura como una proteína de fusión conjugada con ubiquitina utilizando el vector pVEP [Ecker, D.J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705-709 (1989), McDonnell D.P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los niveles de 5-HT3-C humana expresada se determinan mediante los ensayos descritos en este
documento.
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Ejemplo de referencia 10
Purificación de 5-HT3-C humana Recombinante
Puede purificarse 5-HT3-C humana producida de forma recombinante mediante cromatografía de afinidad a anticuerpos.
Se preparan columnas de afinidad a anticuerpos para 5-HT3-C humana añadiendo los anticuerpos anti-5-HT3-C humana a Affigel 10 (Bio-Rad), un soporte de gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después con el gel mediante enlaces amida con el brazo espaciador. Los restantes ésteres activados se inactivan después con etanolamina-HCl (pH 8). La columna se lava con agua seguida de glicina-HCL 0,23 M (pH 2,6) para retirar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) junto con agentes solubilizantes de membrana apropiados tales como detergentes y los sobrenadantes del cultivo celular o extractos celulares, que contienen 5-HT3-C humana solubilizada se pasan lentamente a través de la columna. La columna se lava después con solución salina tamponada con fosfato junto con detergentes hasta que la densidad óptica (A280) cae hasta el transfondo, después la proteína se eluye con glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con detergentes. La proteína 5-HT3-C humana purificada se dializa después contra solución salina tamponada con fosfato.
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<120> ADN QUE CODIFICA UNA SUBUNIDAD 5-HT3-C DEL RECEPTOR DE SEROTONINA 5-HT3
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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gtagaagctg agggcatcaa tggcaac 
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 2
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ctggtcaccc tcattggctt atcatac 
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27 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR Anidado
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<400> 3
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actgacagtg aggcagagga gggca 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido
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<400> 4
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cctggtgaat ccccagagaa gagtc 
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25 
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<210> 5
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<211> 1745
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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1
2 
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<210> 6
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<211> 1344
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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3 
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<210> 7
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de clonación para vector de mamífero
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<400> 7
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51 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de clonación para vector de mamífero
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<400> 8
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de distribución de PCR
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de distribución de PCR
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de distribución de PCR
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gtgggagatc acagacacgt ctcgcaaagt 
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30

Claims (1)

1. Una proteína 5-HT3-C humana compuesta por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 9.
ES00959229T 1999-09-01 2000-08-14 Adn que codifica una subunidad humana 5-ht3-c del receptor de serotonina 5-ht3. Expired - Lifetime ES2281355T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US388349 1999-09-01
US09/388,349 US6365370B1 (en) 1999-09-01 1999-09-01 DNA encoding a human subunit 5-HT3-C of the 5-HT3 serotonin receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2281355T3 true ES2281355T3 (es) 2007-10-01

Family

ID=23533753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00959229T Expired - Lifetime ES2281355T3 (es) 1999-09-01 2000-08-14 Adn que codifica una subunidad humana 5-ht3-c del receptor de serotonina 5-ht3.

Country Status (11)

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EP (1) EP1218491B1 (es)
JP (1) JP2003508048A (es)
AT (1) ATE353359T1 (es)
AU (1) AU776347B2 (es)
CA (1) CA2384026A1 (es)
DE (1) DE60033297T2 (es)
DK (1) DK1218491T3 (es)
ES (1) ES2281355T3 (es)
HK (1) HK1047767B (es)
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EP1218491A1 (en) 2002-07-03
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HK1047767A1 (en) 2003-03-07
CA2384026A1 (en) 2001-03-08
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US6365370B1 (en) 2002-04-02
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