JP2004511202A - ５−ｈｔ３セロトニン受容体のヒトサブユニットをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡをクローン化し、特性化した。組換えタンパク質は、生物学的に活性のあるヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を形成することができる。活性のある組換えタンパク質を生産する組換え宿主細胞においてｃＤＮＡを発現させた。さらに、受容体活性のモジュレーターを同定する方法を確立するために組換え宿主細胞を利用し、受容体モジュレーターを同定する。

Description

【０００１】
発明の背景
セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、細胞表面受容体を介してシグナルを送る多機能化学伝達物質である。少なくとも１４のサブタイプのセロトニン受容体が薬理学的に特定されている（Ｊｕｌｉｕｓ， １９９６； Ｔｅｃｏｔｔ ａｎｄ Ｊｕｌｉｕｓ， １９９３）。１４の既知である受容体のうち１３はＧタンパク質共役受容体であり、そして唯一の既知であるイオンチャンネル型５−ＨＴ受容体、タイプ３ ５−ＨＴ３受容体は、既知のモノアミン受容体の間で特有の速く活性化するリガンド依存性非選択的陽イオンチャンネルである（Ｄｅｒｋａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。５−ＨＴ３受容体は中枢（Ｗａｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｙａｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１）及び末梢（Ｆｏｚａｒｄ， １９８４）神経系のニューロンに専ら局在している。５−ＨＴ３受容体の活性化は、膜脱分極及び細胞内Ｃａ^２＋の増加を導く。５−ＨＴ３受容体は、細胞傷害性化学療法及び全身麻酔により引き起こされる悪心に対して選択的なアンタゴニスト（グラニセトロン及びオンダンセトロン）の標的である（Ｇｒａｌｌａ， １９９８）。セロトニン５−ＨＴ３受容体は痛みの受容、不安、認識、脳運動ニューロン活性、感覚プロセシング、情動の調節及び薬物乱用の行動結果において重要であるという証拠が蓄積している（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｐａｓｓａｎｉ ａｎｄ Ｃｏｒｒａｄｅｔｔｉ， １９９６）。
【０００２】
５−ＨＴ３受容体は、複数のアゴニスト及びアロステリックリガンド結合部位を有するホモペンチマー（ｈｏｍｏｐｅｎｔｉｍｅｒｉｃ）タンパク質であると考えられる（Ｂｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｂｏｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｅｇｌｅｎ ａｎｄ Ｂｏｎｈａｕｓ， １９９６； Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。５−ＨＴ３受容体の全コーディング配列は、マウス（Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｒｉｃｑ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、ラット（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、モルモット（Ｌａｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， １９９８）及びヒト（Ｂｅｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； ＡＪ００３０７９ Ｂｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， 未発表）からクローン化されている。それはニコチン、ＧＡＢＡ作動性及び他のリガンド依存性イオンチャンネルと構造及び機能の類似性を有する（Ｂａｒｎａｒｄ， １９９６； Ｇｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｔｈｏｒｎ， １９９８； Ｍａｒｉｃｑ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。同じリガンド依存性陽イオンチャンネルスーパーファミリーの他の受容体のように（Ｃｈａｎｇｅｕｘ ａｎｄ Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ， １９９８； Ｌｅｎａ ａｎｄ Ｃｈａｎｇｅｕｘ， １９９３）、５−ＨＴ３受容体は素早く脱感作する（Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｌａｍｂｅｒｔ， １９８９； Ｙａｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。このスーパーファミリーのメンバーの薬理学及び運動学的プロフィールはサブユニット組成により決まる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｌｕｅｔｊｅ ａｎｄ Ｐａｔｒｉｃｋ， １９９１； Ｏｌｓｅｎ， １９９８）。
【０００３】
５−ＨＴ３受容体をコードする１個の遺伝子のみが存在すると考えられるが（５−ＨＴ３−Ａ受容体）、いくつかの系統の証拠は、５−ＨＴ３受容体がヘテロマルチマーとして存在する可能性があることを示す。第一に、アフィニティークロマトグラフィーにより様々な起源から精製された受容体は、通常、５４及び３８ｋＤａの順の分子質量を有する少なくとも２本の主要なタンパク質バンドを示す（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。５−ＨＴ３−Ａ受容体は前者に相当する（Ｔｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。ブタ大脳皮質から可溶化したアフィニティー精製した５−ＨＴ３受容体は、変性ゲル上のタンパク質の銀染色に基づき、少なくとも３つの分離可能な成分からなる（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９７）。多数のこれらのタンパク質バンドは、組換え５−ＨＴ３−Ａサブユニットに対して導かれる特定の抗体により認識されず（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９７）、そしてそれらの大きさは分解した５−ＨＴ３−Ａフラグメントとみなすには大きすぎる（５２−７１ｋＤａ）（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９８）。
【０００４】
第二に、ゼノプス卵母細胞または哺乳動物細胞系における組換え受容体の発現は、多くの場合、天然の受容体の電気生理学的及び薬理学的性質の全てを示すわけではない（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。脱感作速度論、シングルチャンネルコンダクタンス及びアゴニスト効能の違いが認められており、そして組換え細胞系または卵母細胞系に存在しない内因性サブユニットの欠如のためである可能性がある。約９８％の同一性を有する受容体サブユニットの２つの形態が、マウス、ラット、モルモット及びヒトにおいて認められている。これらの２つの形態は６〜３２の連続したアミノ酸の挿入により異なり、単一遺伝子の選択的スプライシングにより生産される可能性がある（Ｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。組換えマウスアイソフォームの薬理学的及び電気生理学的性質の大部分は類似しているが（Ｄｏｗｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｌｕｍｍｉｓ， １９９８； Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、２−メチル−５−ＨＴ及び／またはｍ−クロロフェニルビグアニド（ｍＣＰＢＧ）の効能は異なる（Ｄｏｗｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｌｕｍｍｉｓ， １９９８； Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。これら２つの異型は同じ細胞系に共存する可能性があり、そして両方の形態を含有するヘテロマルチマーは、組換えサブユニットのホモマルチマーと天然の細胞間で認められた違いの全てではないがいくつかを説明することができる。
【０００５】
第三に、同じ種からの異なる調製物中の５−ＨＴ−３受容体は、電気生理学的及び薬理学的性質の変動を示す（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９８； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ， １９８６）。特に、細胞を越えて、そして同じ細胞タイプ内でさえ脱感作速度論の不均質性があるようである（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。脱感作速度論の違いは、様々な分化状態下のＮＧ１０８−１５細胞において認められている（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。この違いはサブユニットの不均質性のためである可能性があるが、受容体の異なる翻訳後状態の結果である可能性もある。例えば、ニコチン性アセチルコリン及びＧＡＢＡ_Ａ受容体の脱感作の速度はリン酸化により高められる（Ｒａｙｍｏｎｄ， １９９８； Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｓｗｏｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。多種多様なシングルチャンネルコンダクタンス値が５−ＨＴ３受容体に報告されており（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９８）、しかしながら、この違いは、異なる細胞における受容体のリン酸化状態のためである可能性がある。Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ等は、リン酸化がＮ１Ｅ−１１５細胞における５−ＨＴ−３受容体のコンダクタンスを制御することを示している（Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ａｎｄ Ｖｉｊｖｅｒｂｅｒｇ， １９９５）。さらに、チャンネルの整流（ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）特性の著しい違いが異なる細胞タイプにおいて報告されている（Ｈｕｓｓｙ ｅｔ ａｌ， １９９４）。
【０００６】
第四に、分化したマウスＮ１Ｅ−１１５細胞は、卵母細胞において別個にまたは一緒に発現されるいずれかのマウス組換え５−ＨＴ３−Ａアイソフォームで認められたものより高い２−メチル−５−ＨＴの効能を有する天然の５−ＨＴ−３受容体を発現する。しかしながら、分化したマウスＮ１Ｅ−１１５細胞から単離したｍＲＮＡと卵母細胞における組換え５−ＨＴ３−Ａ受容体の共発現により、分化した細胞上で発現される天然の受容体の機能特性が再構成される（Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００７】
５−ＨＴ３受容体はゼノプス卵母細胞発現研究においてニコチン性α４サブユニットと共に会合できることが報告されているが（Ｖａｎ Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、ニコチン性ＡＣｈ受容体サブユニットは天然のブタ脳５−ＨＴ３受容体と会合しなかった（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ｅｌ．， １９９８）。
【０００８】
第五に、Ｚｎ^２＋による受容体のアロステリック調節は、これらの研究に使用する５−ＨＴ３−Ａ受容体をクローン化した細胞系、ＮＣＢ２０細胞において５−ＨＴ受容体によりもたらされる電流に対するその作用（遮断；（Ｌｏｖｉｎｇｅｒ， １９９１）に比較して卵母細胞において発現される組換えマウス５−ＨＴ３−Ａ受容体に対して異なる作用を有する（増大）。亜鉛イオンによる遮断に対するリガンド依存性受容体のこのスーパーファミリーの別のメンバー、ＧＡＢＡ_Ａ受容体の感受性はサブユニット組成により決まることが既知である（Ｓｍａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【０００９】
最近、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの配列が開示され、そして５−ＨＴ３−Ａの機能特性を改変することが示された（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ １９９９）。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） により５−ＨＴ３−Ｂに関して記述された機能特性には、ｍＣＰＢＧを包含する他のアゴニストの親和性に対するいかなる影響もない５−ＨＴの減少した親和性が含まれた。この技術は、５−ＨＴ３受容体機能の親和性及び共同性が５−ＨＴ３−Ｂによりそれぞれ増加及び減少されることを見出さず、また電流速度論に対するいかなる影響も報告しなかった。
【００１０】
セロトニン５−ＨＴ３受容体の調節因子サブユニットをコードするヒトｃＤＮＡの単離及び機能の特性化は、様々な調製物からの５−ＨＴ３受容体が異なる薬理学的、運動学的及び電位依存性性質を有する結果（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２）を説明する。５−ＨＴ３−Ｂと称するこのヒト５−ＨＴ３サブユニットの発現はさらにセロトニン機能の発見を促進し、そして５−ＨＴ３−Ｂ受容体が関与するヘテロマー受容体複合体の機能を調節する化合物をスクリーニングするために用いることができる。
発明の要約
セロトニン５−ＨＴ３−Ａ受容体の短い形態と共発現すると５−ＨＴ３受容体の機能及び薬理学的性質を改変する、５−ＨＴ３−Ａセロトニン受容体に相同性を有するヒトサブユニットをコードするＤＮＡ分子をクローン化し、特性化した。組換え発現系を用いて、ヒトセロトニン５−ＨＴ３受容体調節因子タンパク質（以前は５−ＨＴ３−Ｂと呼ばれる）をコードする機能性ＤＮＡ分子を単離した。これらのタンパク質の生物学的及び構造特性が、アミノ酸及びヌクレオチド配列と同様に開示される。組換えタンパク質は、５−ＨＴ３受容体及び調節因子サブユニット（５−ＨＴ３−Ｂ）の両方からなるヒト５−ＨＴ３受容体のモジュレーターを同定するために有用である。本明細書に開示するアッセイにおいて同定されるモジュレーターは、悪心、鬱病、不安、精神病（例えば精神分裂病）、尿節制、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、肥満症、高血圧症、偏頭痛、ジルドゥラトゥーレット症候群、性的機能不全、薬物嗜癖、薬物乱用、認識障害、学習、アルツハイマー病、大脳昏睡、老年痴呆、強迫神経症、恐慌発作、痛み、赤面恐怖、食行動異常及び食欲不振、心臓血管及び脳血管障害、インシュリン非依存型糖尿病、高血糖症、便秘症、不整脈、神経内分泌系の疾患、ストレス及び痙縮、並びに酸性セクレチン、潰瘍、気道狭窄症、喘息、アレルギー、炎症及び前立腺機能不全を包含するがこれらに限定されるものではない治療薬及び診断薬として有用である。組換えＤＮＡ分子及びその一部は、ＤＮＡ分子の相同物を単離するため、ＤＮＡ分子のゲノム同等物を同定及び単離するため、並びにＤＮＡ分子の突然変異体形態を同定、検出または単離するために有用である。
詳細な記述
本発明は、ヒト小腸からのｃＤＮＡライブラリーより単離された、ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡに関する。ヒト５−ＨＴ３−Ｂは、本明細書において用いる場合、５−ＨＴ３−Ａ受容体との複合体において特に受容体の機能を果たすことができるタンパク質をさす。
【００１１】
本発明のクローニング及び機能決定の前に、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの完全なアミノ酸配列は既知ではなく、またヒト５−ＨＴ３−Ｂをコードする完全なヌクレオチド配列も既知ではなかった。しかしながら、最近、ヒト５−ＨＴ３−Ｂをコードする全長ＤＮＡ分子のクローニング及びこの分子によりコードされるタンパク質の機能のいくらかの特徴が報告された（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００１２】
本発明は、以前に記述されたものより非常に天然の応答に似ている、異なる薬理学的、運動学的及び電位依存性性質を有するヒト５−ＨＴセロトニン受容体複合体を提供する。従って、本明細書に記述する本発明は、５−ＨＴ３−Ｂが５−ＨＴ３−Ａ受容体に異なる薬理学的、運動学的及び電位依存性性質を与えることを示す。本発明は、５−ＨＴ３−Ｂが５−ＨＴ３−Ａと特異的に相互作用し、ニコチン性ＡＣｈ受容体α３β４、α２β２、α４β２及びα７とはそうではないことを示す。さらに、本明細書に記述する本発明をコードするｍＲＮＡはサル扁桃及びヒト大脳皮質におけるニューロン内に共局在している（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）。本発明はさらに、５−ＨＴ３−Ｂ及び５−ＨＴ３−Ａ ｍＲＮＡが脾臓及び小腸を包含する末梢器官のリンパ球及び上皮細胞において発現されることを示す。本明細書に報告する新規な結果の生理学的重要性には、５−ＨＴ３−Ｂ及び５−ＨＴ３−Ａを共発現する細胞が単一の受容体を発現する細胞より５−ＨＴに感受性である能力及びアゴニストに対する改変された応答期間を有する能力が包含される。受容体によりもたらされる電流のこれらの改変は、ニューロン興奮性の５−ＨＴ活性化に大きい影響を有するはずである。多種多様な細胞及び細胞タイプがヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有すると予測される。ヒト５−ＨＴ３−Ｂを生産することができる脊椎動物細胞には、セロトニンに感受性を示すかまたは結合する細胞から単離されたヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１３】
他の細胞及び細胞系もまた、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡを単離するための使用に適当であることができる。適当な細胞の選択は、１−フェニルビグアニド（１−ＰＢＧ）またはｍＣＰＢＧに対する応答、低マイクロモル濃度の１−ＰＢＧもしくはｍＣＰＢＧでの応答の大きさ、または１−ＰＢＧ、ｍＣＰＢＧもしくはセロトニンにより引き出される細胞応答の減衰の速度のいずれかに関するスクリーニングにより行うことができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性は、５−ＨＴ３−Ａ受容体の存在下で^３Ｈ−［ｍＣＰＢＧ］結合アッセイを行うことにより（Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、Ｃａ^＋２感受性色素を用いるＣａ^＋２流入の直接測定により（Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、または電位固定技術を用いる正味のイオンの流れにより（Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８１）モニターすることができる。このアッセイにおいて分離されたヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を有する細胞は、分離されたヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡまたはｍＲＮＡの単離のために適当であることができる。
【００１４】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡを分子的にクローン化するために当該技術分野において既知である様々な方法のいずれかを用いることができる。これらの方法には、適切な発現ベクター系におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子の直接機能発現が包含されるがこれに限定されるものではない。別の方法は、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するｃＤＮＡライブラリーをヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニットのアミノ酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。さらなる方法は、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するｃＤＮＡライブラリーをヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡでスクリーニングすることからなる。この部分ｃＤＮＡは、精製されたヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅で得られる。
【００１５】
別の方法は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ産生細胞からＲＮＡを単離し、そのＲＮＡをインビトロまたはインビボ翻訳系によってタンパク質に翻訳することである。ペプチド、タンパク質へのＲＮＡの翻訳は、例えば抗−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体との免疫学的反応性によりまたはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の生物学的活性により同定することができるヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の少なくとも一部の生産をもたらす。この方法において、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを、ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在に関して分析することができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＲＮＡを非−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＲＮＡから精製するためにＲＮＡプールのさらなる分別を行うことができる。この方法により生成せしめるペプチドまたはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供することができ、次にこれを用いてヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡの製造のためのプライマーを提供し、または翻訳に使用したＲＮＡを分析してヒト５−ＨＴ３−Ｂをコードするヌクレオチド配列を提供し、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡのこの製造のためのプローブを作製することができる。この方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． １９８９に見出すことができる。
【００１６】
他のタイプのライブラリー並びに他の細胞もしくは細胞タイプから構築されたライブラリーがヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡを単離するために有用であり得ることは当業者に容易に明らかである。他のタイプのライブラリーには、他の細胞から、ヒト以外の生物体から得られるｃＤＮＡライブラリー、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）及びコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１７】
適当なｃＤＮＡライブラリーは、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を有する細胞または細胞系から調製できることは当業者に容易に明らかである。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製に使用する細胞または細胞系の選択は、最初にヒト５−ＨＴ３−Ｂに関連する生物学的活性の測定またはヒト５−ＨＴ３−Ｂ−５−ＨＴ３−Ａ受容体リガンド結合アッセイ［^３Ｈ−ｍＣＰＢＧ］（Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３）を用いて細胞に付随するヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を測定することにより行うことができる。
【００１８】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野において周知の標準的な技術により行うことができる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）に見出すことができる
ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡはまた、適当なゲノムＤＮＡライブラリーからも単離できることも当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知の標準的な技術により行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）に見出すことができる。
【００１９】
上記の方法によりヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子をクローン化するためには、ヒト５−ＨＴ３−Ｂのアミノ酸配列が必要であり得る。これを成し遂げるために、ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を精製し、部分アミノ酸配列を自動シーケンサーにより決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用プライマーを作製するためにタンパク質からの６〜８アミノ酸の２領域の線状配列を決定する。
【００２０】
いったん適当なアミノ酸配列が同定されると、それらをコードすることができるＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１より多くのコドンを用いることができ、それ故、アミノ酸配列は、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードすることができる。この組の一つのメンバーのみがヒト５−ＨＴ３−Ｂ配列と同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドはなおヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡに十分にハイブリダイズすることができ、ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にする。これらの方法により単離されたＤＮＡは、様々な細胞タイプ、無脊椎動物及び脊椎動物起源からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため及び相同遺伝子を単離するために用いることができる。
【００２１】
精製された生物学的に活性のあるヒト５−ＨＴ３−Ｂは、いくつかの異なる物理形態を有することができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂは、全長の発生期もしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全長発生期ヒト５−ＨＴ３−Ｂポリペプチドは、全長発生期ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特定のタンパク質分解切断事象により翻訳後に修飾することができる。フラグメントまたはフラグメントの物理的会合は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂと関連する完全な生物学的活性を有する可能性があるが、しかしながら、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性の程度は、個々のヒト５−ＨＴ３−Ｂフラグメント及び物理的に会合したヒト５−ＨＴ３−Ｂポリペプチドフラグメント間で異なる可能性がある。
【００２２】
本明細書に記述する方法によって得られるクローン化ヒト５−ＨＴ３−ＢＤＮＡは、適当なプロモーター及び他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現させ、そして原核または真核宿主細胞中に導入して組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を製造することができる。そのような操作の技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ， ｅｔ ａｌ．， 上記に完全に記述されており、そして当該技術分野において周知である。
【００２３】
発現ベクターは、本明細書において適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として定義する。そのようなベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞及び動物細胞のような様々な宿主において真核生物遺伝子を発現させるために用いることができる。
【００２４】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞または細菌−真菌細胞または細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を容認する。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力及び活性のあるプロモーターを含有するはずである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列として定義する。強いプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２５】
哺乳動物細胞において組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現させるために様々な哺乳動物発現ベクターを用いることができる。組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現のために適当である可能性がある市販されている哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２６】
細菌細胞において組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現させるために様々な細菌発現ベクターを用いることができる。組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現のために適当である可能性がある市販されている細菌発現ベクターには、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２７】
酵母のような真菌細胞において組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現させるために様々な真菌細胞発現ベクターを用いることができる。組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現のために適当である可能性がある市販されている真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２８】
昆虫細胞において組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現させるために様々な昆虫細胞発現ベクターを用いることができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂの組換え発現のために適当である可能性がある市販されている昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）が包含されるがこれに限定されるものではない。
【００２９】
ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞における発現のために発現ベクター中にクローン化することができる。組換え宿主細胞は、エシェリキア・コリのような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類起源の細胞系を包含するがこれらに限定されるものではない哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系を包含するがこれらに限定されるものではない昆虫細胞を包含するがこれらに限定されるものではない原核生物または真核生物であることができる。適当である可能性があり且つ市販されている哺乳動物種由来の細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ　１５７３）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション及び電気穿孔を包含するがこれらに限定されるものではない多数の技術のいずれか一つにより宿主細胞中に導入することができる。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増やし、そしてそれらがヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を生産するかどうかを決定するために個々に分析する。ヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現する宿主細胞クローンの同定は、抗−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体との免疫学的反応性及び宿主細胞に付随するヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性の存在を包含するがこれらに限定されるものではないいくつかの手段により行うことができる。
【００３１】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡの発現はまた、インビトロで生成せしめた合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡまたはヒト５−ＨＴ３−Ｂ産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を包含するがこれらに限定されるものではない様々な無細胞系において効率よく翻訳することができ、同様にカエル卵母細胞への微量注入を包含するがこれに限定されるものではない細胞に基づく系において効率よく翻訳することができ、カエル卵母細胞への微量注入が一般に好ましい。
【００３２】
最適レベルのヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性及び／またはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をもたらすヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ配列（１または複数）を決定するために、以下のものを包含するがこれらに限定されるものではないヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ分子を構築することができる：約塩基１４２〜約塩基１４６５（これらの番号は最初のメチオニンの１番目のヌクレオチド及び最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）の４７．９ｋＤａタンパク質をコードするヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム及びヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡの一部を含有するいくつかの構築物。全ての構築物は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡの５’または３’非翻訳領域のいずれも含有しないように、全てまたは一部を含有するように設計することができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性及びタンパク質発現のレベルは、適切な宿主細胞中にこれらの構築物を５−ＨＴ３−Ａと組み合わせてまたは単独での両方で導入した後に決定することができる。一過性アッセイにおいて最適発現をもたらすヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡカセットを決定した後に、このヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞、エシェリキア・コリ及び酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を包含するがこれらに限定されるものではない宿主細胞における発現のために様々な発現ベクターに導入する。
【００３３】
以下の方法によりヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性のレベル及びヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質のレベルの両方をアッセイするために宿主細胞トランスフェクション体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）及び微量注入した卵母細胞を用いることができる。組換え宿主細胞の場合、これは、１またはそれ以上のフラグメントまたはサブユニットをコードするヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ及び５−ＨＴ３−Ａ受容体を含有する１またはおそらく２もしくはそれ以上のプラスミドの共トランスフェクションあるいは５−ＨＴ３−Ａ受容体を発現するヒト細胞系へのヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質のトランスフェクションを伴う。卵母細胞の場合、これは、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ及び５−ＨＴ３−Ａ受容体タンパク質の合成ＲＮＡの共注入を伴う。発現を見込む適切な期間の後に、細胞のタンパク質を例えば^３５Ｓ−メチオニンで代謝的に２４時間標識し、その後に細胞ライセート及び細胞培養上清を採取し、ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質に対して導かれるポリクローナル抗体での免疫沈降に供する。
【００３４】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を検出する他の方法には、５−ＨＴ３−Ｂ ｃＤＮＡともしくはそれなしにヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体でトランスフェクションした全細胞またはヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体及び５−ＨＴ３−Ｂ ｍＲＮＡを注入した卵母細胞におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性の直接測定が含まれる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡを発現する宿主細胞の特定のリガンド結合及び生物学的特性により測定する。ヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体及びヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現する組換え宿主細胞の場合、受容体活性を測定し、ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を定量するためにパッチ電位固定技術を用いることができる。卵母細胞の場合、アゴニスト誘導電流またはアゴニスト用量応答の減衰速度を測定するためにパッチクランプ並びに２電極電位固定技術を用いることができる。
【００３５】
宿主細胞におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質のレベルは、免疫親和性により定量する。ｈ５−ＨＴ５−Ｂを発現する細胞は、細胞膜への放射性ｍＣＰＢＧ結合の量を測定することにより発現した細胞表面受容体分子の数をアッセイすることができる。例えば^３５Ｓ−メチオニンで標識されたまたは標識されていないヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を単離するためにヒト５−ＨＴ３−Ｂ特異的アフィニティービーズまたはヒト５−ＨＴ３−Ｂ特異的抗体を用いる。標識されたヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識されていないヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ特異的抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイにより検出する。
【００３６】
遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１より多くのコドンを用いることができ、それ故、アミノ酸配列は、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードすることができる。この組の一つのメンバーのみがヒト５−ＨＴ３−Ｂ配列と同一であるが、適切な条件下でミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。別の条件下で、ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドはなおヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡにハイブリダイズすることができ、ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にする。
【００３７】
特定の生物体からのヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡは、他の生物体からのヒト５−ＨＴ３−Ｂの相同物を単離し、精製するために用いることができる。これを成し遂げるために、第一のヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡを適切なハイブリダイゼーション条件下でヒト５−ＨＴ３−Ｂの相同物をコードするＤＮＡを含有するサンプルと混合することができる。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離することができ、それから相同なＤＮＡをコードするＤＮＡを精製することができる。
【００３８】
特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにはかなりの量の重複があることが既知である。従って、本発明は、同一アミノ酸の最終翻訳をコードする別のコドンを含有するＤＮＡ配列にも関する。この明確化の目的のために、１またはそれ以上の置換されたコドンを有する配列は、縮重変異として定義する。同様に本発明の範囲内に含まれるのは、発現されるタンパク質の最終的な物理的性質を実質的に改変しないＤＮＡ配列または翻訳されるタンパク質のいずれかにおける突然変異である。例えば、ロイシンの代わりのバリン、リシンの代わりのアルギニン、またはグルタミンの代わりのアスパラギンの置換は、ポリペプチドの機能性の変化を引き起こさない可能性がある。
【００３９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に存在するペプチドのものと異なる性質を有するペプチドをコードするように改変できることが既知である。ＤＮＡ配列を改変する方法には部位特異的突然変異誘発が包含されるがこれに限定されるものではない。改変される性質の例には、基質に対する酵素またはリガンドに対する受容体の親和性の変化が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書において用いる場合、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの「機能性誘導体」は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの生物学的活性と実質的に同様である生物学的活性（機能または構造のいずれか）を有する化合物である。「機能性誘導体」という用語には、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「相同物」または「化学誘導体」が包含されるものとする。「フラグメント」という用語は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂのあらゆるポリペプチドサブセットをさすものとする。「変異体」という用語は、全ヒト５−ＨＴ３−Ｂ分子またはそのフラグメントのいずれかに構造及び機能が実質的に同様である分子をさすものとする。両方の分子が実質的に同様の構造を有する場合または両方の分子が同様の生物学的活性を有する場合に分子はヒト５−ＨＴ３−Ｂに「実質的に同様である」。従って、２つの分子が実質的に同様の活性を有する場合、たとえそれらの分子の一方の構造がもう一方に存在しない場合でさえまたはたとえ２つのアミノ酸配列が同一ではない場合でさえそれらは変異体であるとみなす。「類似体」という用語は、全ヒト５−ＨＴ３−Ｂ分子分子またはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に同様である分子をさす。
【００４１】
組換え宿主細胞におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現の後に、活性形態のヒト５−ＨＴ３−Ｂを与えるためにヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を回収することができる。いくつかのセロトニン５−ＨＴ３−Ａ受容体精製方法が利用でき、使用に適している（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ， １９９７； Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｌｕｍｍｉｓ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， １９９２； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。天然の起源からのヒト５−ＨＴ３−Ｂの精製に関する上記のように、組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂは、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせまたは個々の適用により、細胞ライセート及び抽出物から、またはならし培養培地から精製することができる。
【００４２】
さらに、組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂは、全長発生期ヒト５−ＨＴ３−Ｂ、ヒト５−ＨＴ３−Ｂのポリペプチドフラグメントまたはヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニットに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体で作製した免疫親和性カラムの使用により他の細胞タンパク質から分離することができる。
【００４３】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂに対する単一特異性抗体は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂに対して反応する抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、またはＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７ （１９７５）の技術を用いてヒト５−ＨＴ３−Ｂと反応するモノクローナル抗体として調製する。単一特異性抗体は、本明細書において用いる場合、ヒト５−ＨＴ３−Ｂに対する均質な結合特性を有する単一の抗体種または複数の抗体種として定義する。均質な結合は、本明細書において用いる場合、上記のように、ヒト５−ＨＴ３−Ｂと結合するもののような、特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力をさす。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫アジュバントとまたはそれなしに、適切な濃度のヒト５−ＨＴ３−Ｂで免疫することにより作製し、ウサギが好ましい。
【００４４】
免疫前血清を最初の免疫前に集める。各動物に許容しうる免疫アジュバントと会合したヒト５−ＨＴ３−Ｂのフラグメントをコードする約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの間のペプチドを与える。そのような許容しうるアジュバントには、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿物、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を含有する油中水滴型エマルジョン及びｔＲＮＡが包含されるがこれらに限定されるものではない。最初の免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）または両方のいずれかで複数の部位で好ましくはフロイント完全アジュバント中のヒト５−ＨＴ３−Ｂペプチドからなる。抗体力価を決定するために、各動物から一定の間隔で、好ましくは週に一度瀉血する。最初の免疫の後に動物にブースター注射を与えても与えなくてもよい。ブースター注射を与える動物には、一般に、同じ経路によりフロイント不完全アジュバント中の等量の抗原を与える。ブースター注射は最大力価が得られるまで約３週間隔で与える。各ブースター免疫後約７日でまたは一回の免疫後ほぼ毎週、動物から瀉血し、血清を集め、アリコートを約−２０℃で保存する。
【００４５】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをヒト５−ＨＴ３−Ｂペプチドで免疫することにより調製する。上記に説明したように、等容量の許容しうるアジュバントに含まれる約０．５ｍｌのバッファーまたは食塩水中約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのヒト５−ＨＴ３−ＢペプチドでマウスをＩＰまたはＳＣ経路により免疫する。フロイント完全アジュバントが好ましい。マウスに０日に最初の免疫を与え、そして約３〜約３０週間休ませる。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）経路によりリン酸緩衝食塩水のようなバッファー溶液中の約０．１〜約１０ｍｇのヒト５−ＨＴ３−Ｂポリペプチドの１またはそれ以上のブースター免疫を与える。免疫したマウスから当該技術分野において既知である標準的な方法により脾臓を取り除くことによって抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球が得られる。安定なハイブリドーマを形成させる条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を生成せしめる。融合相手には：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４及びＳｐ２／０を包含することができるがこれらに限定されるものではなく、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を約３０％〜約５０％の濃度でポリエチレングリコール、約１０００ｍｏｌ．ｗｔ中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当該技術分野において既知である方法によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補足したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）における増殖によって選択する。増殖陽性ウェルから上清液を約１４、１８及び２１日に集め、ヒト５−ＨＴ３−Ｂペプチドを抗原として用いて固相免疫放射線検定法（ＳＰＩＲＡ）のような免疫検定法により抗体生産に関してスクリーニングする。培養液はまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオクタロニー沈降アッセイにおいても試験する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞は、軟寒天技術ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７３のような技術によりクローン化する。
【００４６】
モノクローナル抗体は、プリスタンプライミング（ｐｒｉｓｔａｎｅ ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにプライミングの約４日後に約２ｘ１０^６〜約６ｘ１０^６のハイブリドーマ細胞をマウス当たり約０．５ｍｌ注射することによりインビボで製造する。腹水液を細胞導入後約８−１２日で集め、モノクローナル抗体を当該技術分野において既知の技術により精製する。
【００４７】
抗−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ｍＡｂのインビトロ製造は、十分な量の特定のｍＡｂを得るために約２％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増やすことにより実施する。ｍＡｂを当該技術分野において既知の技術により精製する。
【００４８】
腹水またはバイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈降、受身凝集反応、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）技術及び放射線免疫検定法（ＲＩＡ）技術を包含するがこれらに限定されるものではない様々な血清学的または免疫学的アッセイにより決定する。同様のアッセイを体液または組織及び細胞抽出物中のヒト５−ＨＴ３−Ｂの存在を検定するために用いる。
【００４９】
単一特異性抗体を製造する上記の方法は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂポリペプチドフラグメント、または全長発生期ヒト５−ＨＴ３−Ｂポリペプチド、または個々のヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニットに特異的な抗体を製造するために利用できることは当業者に容易に明らかである。特に、ヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニットのみまたは完全に機能性の受容体に特異的な単一特異性抗体を作製できることは当業者に容易に明らかである。
【００５０】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体アフィニティーカラムは、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されるゲル支持体、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に抗体を加えることにより製造することができる。次に抗体をスペーサーアームとのアミド結合を介してゲルに連結させる。次に、残存する活性化エステルをエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄してあらゆる結合していない抗体または関係のないタンパク質を除く。次にカラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）に平衡化し、ヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニットを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。次にカラムを光学密度（Ａ_２８０）がバックグラウンドに落ちるまでリン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いでタンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。精製されたヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を次にリン酸緩衝食塩水に対して透析する。
【００５１】
哺乳動物細胞または昆虫細胞または細菌を包含するがこれらに限定されるものではないあらゆる組換え宿主において発現させた場合に５−ＨＴ３−Ａ受容体サブユニットと共発現させるとセロトニンに感受性のヒト５−ＨＴ３−Ｂを形成するタンパク質をコードするｐ５ＨＴ３ＢＲと称するＤＮＡクローンが同定される。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡの発現は、５−ＨＴ３−Ａ受容体サブユニットと一緒にヒト５−ＨＴ３−Ｂをコードするポリ（Ａ）^＋ ＲＮＡを注入した卵母細胞において認められる性質の再構成をもたらす。これらには：５−ＨＴ３−Ａホモマルチマーで認められるものに比較して５−ＨＴ−、ｍＣＰＢＧ及び１−ＰＢＧにより誘導される応答の改変が包含される。
【００５２】
セロトニンは、多くの生理学的及び病理生理学的状態においてある容量で機能を果たす生体アミン伝達物質である。セロトニンは中枢及び末梢神経系における神経伝達物質及び神経モジュレーターとして働き、炎症及びアレルギー反応をもたらし、気道機能を調節し、胃における酸分泌を制御し、心臓血管機能並びに動脈及び静脈応答を調節し、そしてこれまでに決定されていないプロセスに関与していると思われる。これらをもたらすセロトニン受容体にはリガンド依存性５−ＨＴ３受容体が包含される。５−ＨＴ３−Ａ及び５−ＨＴ３−Ｂ受容体発現の重複は、推定のヘテロマルチマーが中枢及び末梢神経系並びに小腸、胸腺、前立腺及び子宮機能に関与していることを示唆する。どのセロトニン受容体がこれらのプロセスに関与しているかを理解する一つの方法は、研究手段及び治療に役立つ存在として受容体の化学モジュレーターを開発することである。ヒトセロトニン５−ＨＴ３−Ａ及びヒト５−ＨＴ３−Ｂ受容体を発現する組換え宿主細胞は、そのようなアゴニスト及びアンタゴニストを同定するスクリーニング方法の材料を提供するために用いることができる。そのようなものとして、ヒトセロトニン５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの本発明は、研究手段として有用であると示すことができるまたはセロトニン受容体に直接的もしくは間接的に影響を与える疾患を処置するために治療法として用いることができる新規なアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法を直接教示する。
【００５３】
本発明はまた、ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現並びにヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の機能をインビボで調節する化合物をスクリーニングする方法にも関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または非タンパク様有機分子であることができる。化合物は、ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の機能を増加するかまたは減少することにより調節することができる。ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の機能を調節する化合物は、様々なアッセイにより検出することができる。アッセイは、発現または機能の変化があるかどうかを決定する簡単な「イエス／ノー」アッセイであることができる。アッセイは、試験サンプルの発現または機能を基準サンプルにおける発現または機能のレベルと比較することにより定量的にすることができる。この方法において同定されるモジュレーターは、治療薬、研究手段及び診断薬として有用である。
【００５４】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒト５−ＨＴ３−Ｂに対する抗体またはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を含有するキットを製造することができる。そのようなキットは、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するためまたはサンプル中のヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するために用いる。そのような特性化は、法廷分析、診断用途及び疫学研究を包含するがこれらに限定されるものではない様々な目的のために有用である。
【００５５】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＲＮＡまたはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をスクリーニングし、そのレベルを測定するために用いることができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂの検出及びタイピングに適当なキットの調合に役だつ。そのようなキットは、少なくとも一つの容器を閉じ込めて入れるために適当な区分したキャリヤー（ｃａｒｒｉｅｒ）を含んでなる。キャリヤーはさらに組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質またはヒト５−ＨＴ３−Ｂを検出するために適当な抗−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体のような試薬を含んでなる。キャリヤーはまた標識した抗原または酵素基質等のような検出の手段も含有することができる。
【００５６】
ヒト５−ＨＴ３−ＢをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をアンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体または他のヒト５−ＨＴ３−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であることができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂアンチセンス分子は、微量注入、リポソーム包膜化によりまたはアンチセンス配列を保有するベクターからの発現により細胞中に導入することができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂアンチセンス治療は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を下げることが有益である疾患の処置に特に有用であることができる。
【００５７】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子治療は、標的生物体の細胞中にヒト５−ＨＴ３−Ｂに導入するために用いることができる。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によりヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡの導入をもたらすウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が包含される。あるいはまた、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートもしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを用いる受容体によりもたらされる選択的ＤＮＡ導入、リポフェクション膜融合または直接微量注入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のために細胞中に導入することができる。これらの方法及びその変形は、エクスビボ並びにインビボヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子治療に適している。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子治療は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ活性を高めることが有益である疾患の処置に特に有用であることができる。
【００５８】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＤＮＡ、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ ＲＮＡもしくはヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質、またはヒト５−ＨＴ３−Ｂ受容体活性のモジュレーターを含んでなる製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容しうる担体と混合することによるような既知の方法に従って調合することができる。そのような担体の例及び調合の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与に適当な製薬学的に許容しうる組成物を生成せしめるために、そのような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはモジュレーターを含有する。
【００５９】
本発明の治療または診断組成物は、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ関連活性の調節の適応がある疾患を処置または診断するために十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のような様々な因子により異なることができる。他の因子には、投与の形態が包含される。製薬学的組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路により個体に与えることができる。
【００６０】
「化学誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部ではない付加的化学成分を含有する分子を示す。そのような成分は、基本分子の可溶性、半減期、吸収等を向上することができる。あるいはまた、それらの成分は、基本分子の望ましくない副作用を弱めるかまたは基本分子の毒性を減らすことができる。そのような分子の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような様々なテキストに記述されている。
【００６１】
本明細書に開示する方法に従って同定される化合物は、あらゆる潜在的な毒性を最小限度に抑えながらヒト５−ＨＴ３−Ｂ受容体またはその活性の最適な阻害を得るために慣例的試験により特定される適切な用量で単独で用いることができる。さらに、他の薬剤の共投与または順次投与が望ましい可能性がある。
【００６２】
本発明はまた、本発明の処置の新規な方法における使用のために適当な局所、経口、全身及び非経口製剤を提供するという目的も有する。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ受容体の調節における使用のために有効成分として本発明に従って同定される化合物またはモジュレーターを含有する組成物は、投与のための通常の賦形剤中で多種多様な治療剤形で投与することができる。例えば、化合物またはモジュレーターは、錠剤、カプセル剤（各々時限放出性及び徐放性製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤及び乳剤のような経口剤形で、または注射により投与することができる。同様に、それらを静脈内（ボーラス及び注入の両方）、腹腔内、皮下、閉鎖したもしくはしない局所、または筋肉内形態で投与することもでき、全て製薬学的分野の当業者に周知の形態を用いる。有効であるが無毒の量の所望の化合物をセロトニン５−ＨＴ３−Ａ／５−ＨＴ３−Ｂ受容体調節剤として用いることができる。
【００６３】
生成物の日量は、１日につき、患者当たり０．０１〜１，０００ｍｇの広い範囲にわたって変えることができる。経口投与では、組成物は、好ましくは、処置する患者に対する投薬量の症状調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミリグラムの有効成分を含有する刻み目をつけたまたは刻み目をつけていない錠剤の形態で与えられる。有効量の薬剤は、通常、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルで与えられる。この範囲はさらに特に１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。ヒト５−ＨＴ３−Ｂ受容体モジュレーターの投薬量は、所望の効果を得るために組み合わせる場合に調整される。一方、これらの様々な薬剤の投薬量は、いずれかの薬剤を単独で使用する場合より病状を減じる相乗作用結果を得るために独立して最適化して組み合わせることができる。
【００６４】
都合よく、本発明の化合物またはモジュレーターは、単一日量で投与することができ、または総日量を毎日２、３もしくは４回の分割用量で投与することができる。さらに、本発明の化合物またはモジュレーターは、適当な鼻内賦形剤の局所使用によって鼻内形態で、または当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を用いて経皮経路により投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、投薬量投与はもちろん投薬処方計画の間中断続的よりむしろ継続的である。
【００６５】
有効薬剤（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）が別個の投薬製剤である、１より多くの有効薬剤での併用処置では、有効薬剤を同時に投与することができ、またはそれらを各々別個にずらした時間で投与することができる。
【００６６】
本発明の化合物またはモジュレーターを利用する投薬処方計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医療状態；処置する症状の重さ；投与の経路；患者の腎及び肝機能；並びに用いるその特定の化合物を包含する様々な因子に従って選択する。通常の技量の医師または獣医は、症状の進行を防ぐか、阻止するかまたは抑えるために必要とされる薬剤の有効量を容易に決定して処方することができる。毒性なしに効能をもたらす範囲内の薬剤の濃度を得ることにおける最適精度は、標的部位への薬剤の利用能の速度論に基づく処方計画を必要とする。これは、薬剤の分配、平衡及び除去の考慮を含む。
【００６７】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述する化合物またはモジュレーターは有効成分であることができ、そして典型的には意図する投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等に関して適当に選択され且つ通常の製薬学的実践と一致する適当な製薬学的希釈剤、賦形剤または担体（総合して本明細書において「担体」材料と称する）と混合して投与する。
【００６８】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態の経口投与では、有効薬剤成分は、エタノール、グリセロール、水等のような経口の無毒の製薬学的に許容しうる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望または必要に応じて、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤もまた混合物中に含むことができる。適当な結合剤には、限定なしに、澱粉、ゼラチン、グルコースもしくはβ−ラクトースのような天然の糖、コーン人工甘味料、アラビアゴム、トラガカントゴムもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然及び合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋等が包含される。これらの剤形に用いる潤滑剤には、限定なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が包含される。崩壊剤には、限定なしに、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴム等が包含される。
【００６９】
液状形態では、活性薬剤成分は、合成及び天然のゴム、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、メチルセルロース等のような適当に風味をつけた沈殿防止剤または分散助剤中に合わせることができる。用いることができる他の分散助剤には、グリセリン等が包含される。非経口投与では、滅菌した懸濁剤及び水剤が望ましい。静脈内投与が所望される場合には、一般に適当な防腐剤を含有する等張製剤を用いる。
【００７０】
有効薬剤成分を含有する局所製剤は、例えば、アルコール性溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリームまたはゲル配合物のシャンプーを生成せしめるために、例えば、アルコール、アロエ・ベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチル等のような当該技術分野において周知の様々な担体材料と混合することができる。
【００７１】
本発明の化合物またはモジュレーターはまた、小単層小胞、大単層小胞及び多重層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような様々なリン脂質から生成せしめることができる。
【００７２】
本発明の化合物はまた、化合物分子を連結する個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により送達することもできる。本発明の化合物またはモジュレーターはまた、目標設定可能な薬剤担体として可溶性ポリマーと連結することもできる。そのようなポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物またはモジュレーターは、薬剤の制御放出を行うことにおいて有用な生物分解性ポリマーのクラス、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポルアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋したまたは両親媒性ブロックコポリマーに連結することができる。
【００７３】
経口投与では、化合物またはモジュレーターをカプセル剤、錠剤もしくはボーラス形態で投与することができ、あるいはまた、それらを動物飼料中に混合することができる。カプセル剤、錠剤及びボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたはリン酸ジカルシウムのような適切な担体賦形剤と組み合わせた有効成分を含んでなる。これらの単位剤形は、均一な混合物が得られるように希釈剤、増量剤、崩壊剤及び／または結合剤を包含する適当な細かく粉末にした不活性成分と有効成分とをよく混合することにより調製する。不活性成分は、化合物またはモジュレーターと反応せず且つ処置する動物に無毒であるものである。適当な不活性成分には、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴム及び油等が包含される。これらの製剤は、処置する動物種の大きさ及びタイプ並びに感染のタイプ及び重さのような多数の因子により広範囲に変えられる量の有効及び不活性成分を含有することができる。有効成分はまた、化合物を飼料と単に混合することによりまたは化合物を飼料の表面に加えることにより飼料への添加剤として投与することもできる。あるいはまた、有効成分を不活性担体と混合することができ、そして得られた組成物を次に飼料と混合するかまたは動物に直接与えることができる。適当な不活性担体には、ひき割りトウモロコシ粉、柑橘類の粗びき粉、発酵残留物、ダイズ粒状物、乾燥穀粒等が包含される。最終組成物が０．００１〜５重量％の有効成分を含有するように粉砕、攪拌、微粉砕または混転により有効成分をこれらの不活性担体とよく混合する。
【００７４】
あるいはまた、化合物またはモジュレーターは、不活性液状担体に溶解した有効成分からなる製剤の注入により非経口的に投与することができる。注入は、筋肉内、管内（ｉｎｔｒａｒｕｍｉｎａｌ）、気管内または皮下のいずれかであることができる。注入可能な製剤は、適切な不活性液状担体と混合した有効成分からなる。許容しうる液状担体には、落花生油、綿実油、ゴマ油等のような植物油並びにソルケタール、グリセロールホルマール等のような有機溶媒が包含される。代わりのものとして、水性非経口製剤を用いることもできる。植物油が好ましい液状担体である。これらの製剤は、最終製剤が０．００５〜１０重量％の有効成分を含有するように有効成分を液状担体に溶解するかまたは懸濁することにより調製する。
【００７５】
化合物またはモジュレーターの局所施用は、本発明の化合物またはモジュレーターを水溶液または懸濁液として含有する液状浸漬液（ｄｒｅｎｃｈ）またはシャンプーの使用により可能である。これらの製剤は、一般に、ベントナイトのような沈殿防止剤を含有し、そして通常は消泡剤も含有する。０．００５〜１０重量％の有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は、０．０１〜５重量％の本発明の化合物またはモジュレーターを含有するものである。
【００７６】
以下の実施例は本発明を例示し、しかしながら、本発明をそれに限定しない。
実施例１：
ｐ５ＨＴ３ＢＲのクローン化
ｃＤＮＡ合成
第１ストランド合成：ｃＤＮＡ合成キット（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡを合成するために約５μｇのヒト小腸ｍＲＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。２μｌのＮｏｔＩプライマーアダプターを５μｌのｍＲＮＡに加えそして混合物を７０℃に１０分間にわたり加熱しそして氷上に置いた。下記の試薬を氷上に加えた：４μｌの５ｘ第１ストランド緩衝液（２５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ヌクレオチドトリホスフェート類）混合物および１μｌのＤＥＰＣ処理水。反応物を４２℃で５分間にわたりインキュベートした。最後に、５μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＲＴＩＩを加えそして４２℃でさらに２時間にわたりインキュベートした。反応を氷上で終結させた。
【００７７】
第２ストランド合成：第１ストランド生成物を水で９３μｌに調節しそして次の試薬：３０μｌの５ｘ第２ストランド緩衝液（１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭ ＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．７５ｍＭ β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ヌクレオチドトリホスフェート類）、１μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１０単位）、１μｌのＲＮａｓｅＨ（２単位）、４μｌのＤＮＡｐｏｌＩ（１０単位）を氷上に加えた。反応物を１６℃で２時間にわたりインキュベートした。第２ストランド合成からのＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しそして１６℃でＤＮＡ末端を平滑化させた。二重ストランド化したｃＤＮＡを１５０μｌのフェノールとクロロホルムとの混合物（１：１、ｖ：ｖ）で抽出しそして０．５容量の７．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃおよび２容量の無水エタノールを用いて沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄しそして３７℃で乾燥して残存するエタノールを除去した。二重ストランド化したＤＮＡペレットを２５μｌの水中に再懸濁させそして下記の試薬を加えた：１０μｌの５ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０μｌのＳａｌ１アダプターおよび５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ。成分を静かに混合しそして１６℃で一晩にわたり連結反応させた。連結反応混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、充分撹拌しそして室温で５分間にわたり１４，０００ｘｇにおいて遠心して相を分離した。水相を新しい管に移しそして容量を水で１００ｍｌに調節した。精製したＤＮＡをクロマスピン（ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）１０００カラム（クローンテク）上で寸法選択してより小さいｃＤＮＡ分子を排除した。二重ストランド化したＤＮＡをＮｏｔＩ制限酵素を用いて３−４時間にわたり３７℃で消化させた。制限消化物を０．８％低溶融アガロースゲル上で電気泳動させた。１−５ＫＢの範囲内のｃＤＮＡを切除しそしてゲルザイム（Ｇｅｌｚｙｍｅ）（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて精製した。生成物をフェノール：クロロホルムで抽出しそしてＮＨ_４ＯＡｃおよび無水エタノールを用いて沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄しそして１０ｍｌの水中に再懸濁させた。
【００７８】
ベクターに対するｃＤＮＡの連結反応：ｃＤＮＡを５個の管（各々２μｌ）に分割しそして４．５μｌの水、２μｌの５ｘ連結反応緩衝液、１μｌのｐ−スポート（ｐ−Ｓｐｏｒｔ）ベクターＤＮＡ（Ｓａｌ−１／ＮｏｔＩで切断されそしてホスファターゼ処理された）および０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼを加えることにより連結反応を設定した。連結反応物を４０℃で一晩にわたりインキュベートした。
【００７９】
連結反応させたｃＤＮＡの大腸菌中へのエレクトロポレーションによる導入：
連結反応量を水で２０μｌの合計量に調節した。５ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、１２．５ｍｌの７．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃおよび７０ｍｌの無水エタノール（−２０℃）を加えた。混合物を充分に撹拌し、そして直ちに室温で２０分間にわたり１４，０００ｘｇにおいて遠心した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄しそして各ペレットを５ｍｌの水中に再懸濁させた。全部で５個の連結反応物（２５ｍｌ）を貯蔵しそして１００μｌのＤＨ１０Ｂ電気−コンピテント細胞（ライフ・テクノロジーズ）を１ｍｌのＤＮＡを用いてエレクトロポレーションを行い（合計２０回のエレクトロポレーション）、次にアンピシリン板の上で平板培養して１μｌ当たりの組換え体の数（ｃｆｕ）を測定した。全ライブラリーを２リットルのスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ）中に接種し、そしてマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐｓ）をプロメガ・マキシ・プレップ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて作成しそして塩化セシウムグラジエント上で精製した。
ライブラリーのスクリーニング：
以上で構成されたライブラリーの１マイクロリットルのアリコートをエレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフ・テクノロジーズ）中にエレクトロポレーションを行った。容量をＳＯＣ媒体を用いて１ｍｌに調節しそして１時間にわたり３７℃で振りながらインキュベートした。ライブラリーを次にＬＢを含有する５０１５０ｃｍ^２板の上で平板培養して１つの板当たり５０００個のコロニーの密度にした。これらを一晩にわたり３７℃で成長させた。
【００８０】
５−ＨＴ３−Ｂに対するプローブをポリメラーゼ連鎖反応により下記のプライマー対を用いて作成した：
【００８１】
【表１】

【００８２】
５０−６０℃のアニーリング温度および鋳型としてのヒト小腸ｃＤＮＡを用いて増殖を３５回循環させた。生成したＰＣＲ断片（４００−５００ｂｐ）をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片およびオリゴ標識付けキット（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて３２Ｐ−標識付けをした。断片を次にＳ−２００カラム（ファーマシア）中の１回通過によりクリーニングした。
【００８３】
ライブラリーコロニーをニトロセルロースフィルター上に吊り上げそして紫外線照射（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により架橋結合させた。フィルターを緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中で４２℃で３回洗浄した。フィルターを次に１：１サザーン・プレヒブ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｒｅｈｙｂ）：ホルムアミド中で鮭精子ＤＮＡ（５０ｍｇ、沸騰させた）を用いて６時間にわたり４２℃で予備ハイブリッド形成した。フィルターを次にプローブ（１×１０^６個／ｍｌ）を用いてハイブリッド形成した。フィルターを次に２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳを用いて室温で１５分間にわたり１回、それぞれ０．２×ＳＳＳ／０．１％ＳＤＳを用いて４５℃で３０分間にわたり２回洗浄した。フィルターを次にプラスチックラップ中に包みそしてフィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ）に一晩にわたり−８０℃で露呈した。
【００８４】
陽性クローンを同定した。生じた陽性クローンを元の板からコア処理（ｃｏｒｅｄ）し、ＬＢ中で４５分間にわたり３７℃でインキュベートしそして一晩にわたり再び平板培養した。フィルター上昇／ハイブリッド形成／洗浄／コロニー採取工程を、個別のｃＤＮＡを表示する単独クローンまたはクローン類が単離されるまで反復した。
【００８５】
ヒトの新しい５ＨＴ３−類似受容体用のスクリーンから、全てのｃＤＮＡクローンを単離しそして配列化した。１つのクローンであるｐＨ３Ｒは２６９９個のｂｐ挿入部を含有していた（図１）。この配列はヌクレオチド２９９〜１３３５の見掛け読み取り枠を有していた（図２）。この読み取り枠が４４５個のアミノ酸のタンパク質をコードしていた（図３）。
実施例２
５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの哺乳動物発現ベクター中へのクローニング
５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡ類（まとめてＰｐ５ＨＴ３ＢＲと称する）を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）（インビトロゲン）中にクローン化した。５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡクローンをヒト小腸ｃＤＮＡライブラリーから単離した。全長ｃＤＮＡをクローン化用のＢａｍＨＩ（５′ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＡＧＴ ＧＴＡ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＧＧ ＧＣＣ３′）［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３］およびＨｉｎｄＩＩＩ（５′ＡＡＣ ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＴ ＧＡＡ Ｇ３′）［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４］部位を有する特異的プライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をカラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ ＤＮＡ精製キット）上で精製しそしてＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（ＮＥＢ）を用いて消化して付着末端を作成した。生成物を低溶融アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）ベクターをＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ酵素を用いて消化しそして引き続き低溶融アガロースゲル上で精製した。線状ベクターを使用して５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡ挿入部に連結反応させた。組換え体を単離し、５−ＨＴ３−Ｂと指定し、そして哺乳動物細胞をトランスフェクトさせるために使用して電気穿孔法によりｐＣＩｎｅｏベクターにトランスフェクトされたヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体を安定的に発現させる（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩクローン化部位を用いる）（５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ２９３細胞）。Ｇ４１８およびゼオシンの存在下での成長により安定な細胞クローンを選択した。単独Ｇ４１８／ゼオシン耐性クローンが単離されそして無傷の５−ＨＴ３−Ｂ遺伝子を含有することが示された。ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡを含有するクローンを、フルオ−４を用いてセロトニンおよび１−ＰＢＧに応答するＣａ^２＋流入を測定することによりｐ５ＨＴ３ＢＲ発現に関して分析した（図９ａ、ｂ、ｃ）。応答を５−ＨＴ３−Ａ−発現性ＨＥＫ２９３細胞と比較した。
【００８６】
ヒト５−ＨＴ３−Ａと一緒にヒト５−ＨＴ３−Ｂを安定的に発現する細胞をヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現および機能活性を試験するために使用した。これらの細胞を使用して他の化合物がヒト５−ＨＴ３−Ｂを調節、抑制または活性化するそれらの能力を同定しそして試験する。５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの両方を発現する他の細胞を使用して他の化合物がヒト５−ＨＴ３−Ｂを調節、抑制または活性化するそれらの能力を同定しそして試験することができる。
【００８７】
プロモーターに関して正の配向でヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡを含有するカセットをプロモーターの適当な制限部位３′中に連結反応させそして制限部位地図作成および／または配列化により同定した。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを線維芽細胞宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３、中に電気穿孔法または化学的工程（カチオン性リポゾーム、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシウム）を包含するがそれらに限定されない標準的方法により導入した。
【００８８】
哺乳動物の過渡発現用に使用したベクターの全てを使用してヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現する安定な細胞系統を制定することができる。発現ベクター中にクローン化された未変更のヒト５−ＨＴ３−Ｂ構成体はヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を製造するための宿主細胞をプログラムすることが予期される。トランスフェクション宿主細胞はＨＥＫ２９３、ＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １５７５ （１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１： ２２３ （１９７７）］、ＮＳ／０、およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９： ６０１， （１９８２）］を包含するがそれらに限定されない。
【００８９】
ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターと、Ｇ４１８、ゼオシン、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ、ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを包含するがそれらに限定されない薬品選択プラスミドとのコ−トランスフェクションが安定的にトランスフェクトされたクローンの選択を可能にするであろう。ヒト５−ＨＴ３−Ｂの水準はここに記載された検定により定量化される。
【００９０】
ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡ構成体は、最高可能水準のヒト５−ＨＴ３−Ｂを合成する哺乳動物細胞クローンの製造用の増幅可能な薬品耐性マーカーを含有するベクター中にも連結反応される。これらの構成体の細胞中への導入後に、プラスミドを含有するクローンを適当な試薬を用いて選択し、そして高い複製数のプラスミドを有する過剰発現クローンの単離を試薬の用量の増加における選択により行う。
【００９１】
組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現は全長ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの哺乳動物宿主細胞中へのトランスフェクションにより行われる。
実施例３
ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の一次構造
ｐ５ＨＴ３ＢＲのヌクレオチド配列は図２に示されているように約１３２６個の塩基対の単独の大きな読み取り枠を示した。ｃＤＮＡ類はｐ５−ＨＴ３−ＢＲに関する約１４１および約４５６個のヌクレオチド類の５′および３′−未翻訳延長部を有していた。第１の枠内メチオニンが、約５０．３ｋＤａの推定分子量（Ｍ_ｒ）を有するヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を予測する読み取り枠用の開始コドンとして指定された。タンパク質はアミノ酸２２で始まる成熟タンパク質を生ずるであろうシグナル切断部位を高度に予測する配列を有する疎水性アミノ末端残基を含有していた。
【００９２】
予測されたヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をヌクレオチドおよびタンパク質データベースに合わせると、既知の５−ＨＴ３−Ａ受容体と関連することが見いだされた。５−ＨＴ３−Ｂ中のアミノ酸の約７０％が高度に保存され、受容体のセロトニン５−ＨＴ３族内での少なくとも４４％のアミノ酸一致を示した。受容体のこの族内で見られた保存されたモチーフ、例えば同様な間隔を有する４つの推定膜貫通ドメイン、もヒト５−ＨＴ３−Ｂ配列中で見られた。ヌクレオチドレベルでの５−ＨＴ３−Ｂ受容体と５−ＨＴ３−Ａ受容体の一致は約６０％だけであった。ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質はリガンドでゲート化されたイオンチャンネルのアゴニスト結合部位を形成しうる保存されたシステイン−システインループ中で見られた保存されたシステイン基を含有していた（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ネズミの５−ＨＴ３−Ａおよびニコチン性ＡＣｈＲα７［ｘＩＷｘＰＤＩＬｘｘＥｘｘＤ］中の第１Ｎ−末端ループ中の提唱されたリガンド認識部位との強い相同関係があり、５−ＨＴ３−Ｂタンパク質中の示された「一致」中の唯一の差は保存された変化：Ｌ１１９〜Ｉ１１９である。５−ＨＴ３−Ａ中のＥ１０６（ネズミ）は高親和性５−ＨＴ結合にとって重要である（Ｂｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００９３】
グリコシル化の５つの可能な部位（Ｍａｒｓｈａｌｌ， １９７２）は細胞外アミノ末端に位置し、そしてタンパク質キナーゼＣ用の１つの可能な部位（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８６）、カゼインキナーゼＩＩ用の３つの可能な部位（Ｐｉｎｎａ， １９９０）、および哺乳動物腺カゼインキナーゼ用の１つの部位が図３に示されているようにＭ３とＭ４との間の細胞質ループ内に位置していた。
実施例４
５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡの分布
５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ類の組織分布を半定量的ＰＣＲにより測定した。５−ＨＴ３−Ｂ（ＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣ［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８］；ＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧ［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９］）に特異的なプライマーセットを用いて種々のヒト組織（図４ａに示された組織タイプ）から抽出されたポリ（Ａ）ＲＮＡ（クローンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パラアルト、カリフォルニア州）から合成されたｃＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲを介して５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡの一部の増幅を完了させた。増幅した特異性および感度を得るために、オリゴヌクレオチド（ＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡ［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０］）を製造業者（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により記載されているようなポリヌクレオチドキナーゼを有するγ−^３２Ｐ−ＡＴＰを用いてホスホリル化しそして変性ＰＣＲ生成物にアニールしそして６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させた。引き続き、得られるゲルを次に乾燥しそして撮影した（ホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）４４５ＳＩ、モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））。
【００９４】
図４ａに示されているように、ＰＣＲに基づく組織分布分析は５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡが後頭、前頭および側頭を包含するヒト大脳皮質、扁桃、海馬、睾丸で発現されることを示す。非常に低い水準が副腎、骨髄、リンパ節、膵臓、甲状で観察された。心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、結腸、白血球、小脳、骨髄、脊髄、被殻、尾状核、脳梁、黒質、および視床では検知可能な転写は観察されなかった。
【００９５】
ＣＮＳでは、５−ＨＴ３レポーターが高い密度で下方脳幹の核、最後野および孤束の核で見られる。受容体のより低い密度は大脳皮質および海馬を包含する辺縁領域とで見られる。末梢では、５−ＨＴＳ受容体は感覚および腸神経系の両者の節前および節後ニューロン上に位置する（Ｅｇｌｅｎ ａｎｄ Ｂｏｎｈａｕｓ， １９９６）。ノザーン分析は５−ＨＴ３−Ｂおよび５−ＨＴ３−Ａ受容体分布の幾らかの重複を示した。
【００９６】
図４ｂは脾臓（ｂ１、ｂ２）および小腸（ｂ３、ｂ４）の正常なヒト組織に対して行われたＲＴ−ＰＣＲインシトゥハイブリッド形成法を示す。ヒト脾臓は小リンパ球（矢印）中で、それぞれ、強い５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ（ｂ１）および５−ＨＴ３−ＡｍＲＮＡ（ｂ２）信号（紫色−黒白写真では濃灰色）を有していた。同様に、小腸の間質線維芽細胞中では強い５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ（ｂ３）および５−ＨＴ３−ＡｍＲＮＡ（ｂ４）信号（紫色）が検出された。総倍率＝６００ｘ。
【００９７】
図４ｃは正常なサルの扁桃の一連の１０μｍ切片上で行われたＲＴ−ＰＣＲインシトゥハイブリッド形成法を示す。図４ｃ１（３００ｘ）および４ｃ３（６００ｘ）は７つのニューロン（矢印）中で正の５−ＨＴ３−ＡｍＲＮＡ信号（紫色−黒白写真では濃灰色）を示し、それはまた正の５ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ信号も示す（４ｃ２（３００ｘ）、４ｃ４（６００ｘ））。全てではない細胞がＲＴ−ＰＣＲ技術により５−ＨＴ３−Ｂまたは５−ＨＴ３−Ａに関する特異的プローブを用いて標識付けされた。
実施例５
アフリカツメガエル卵母細胞中のｐ５ＨＴ３ＢＲによりコードされたタンパク質の機能の同定
キセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を製造しそして以上で記載されそして当該技術分野で既知である標準的方法（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）を用いて注入した。成体の雌キセノプス・ラエビス（ナスコ（Ｎａｓｃｏ）、フォートアトキンソン、ウィスコンシン州）からの卵母細胞葉を漉き離し、（ｍＭで）ＮａＣｌ ８２．５、ＫＣｌ ２．５、ＭｇＣｌ_２ １、ＨＥＰＥＳ ５を含有しＮａＯＨでｐＨ７．０に調節された名目上Ｃａを含まない食塩水（ＯＲ−２）の中で数回洗浄し、そして０．２％のコラゲナーゼタイプ１（ＩＣＮバイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、アウロラ、オハイオ州）を含有するＯＲ−２の中で２−５時間にわたり静かに振った。小胞層の約５０％が除去された時に、段階ＶおよびＶＩ卵母細胞を選択しそして７５％のＯＲ−２および２５％のＮＤ−９６を含有する媒体中ですすいだ。ＮＤ−９６は（ｍＭで）ＮａＣｌ １００、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ_２ １、ＣａＣｌ_２ １．８、ＨＥＰＥＳ ５、ピルビン酸Ｎａ ２．５、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節されていた。細胞外Ｃａ^２＋を徐々に増加させそして細胞をＮＤ−９６中で注入前に２−２４時間にわたり保った。インビトロ転写用に、ヒト５−ＨＴ３−Ａ（ゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ｄ４９３９４）または５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡを含有するｐＧＥＭ ＨＥ（Ｌｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２））をＮｈｅＩを用いて線状化しそしてｃａｐ同族体ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下でＴ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いて転写させた。合成されたｃＲＮＡをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０回転カラムを用いて精製した。卵母細胞を５０ｎｌのヒトセロトニン５−ＨＴ３−Ａ受容体と共に５−ＨＴ３−ＢＲＮＡ（各々０．０２および０．００２−０．２ｎｇ）または他のチャンネルもしくは受容体サブユニットを用いてまたは用いずに注入した。対照卵母細胞を５０ｎｌの水と共に注入した。卵母細胞を２−１０日間にわたりＮＤ−９６中でヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現に関する分析前にインキュベートした。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化を室温で行った。注入された卵母細胞を４８ウェル細胞培養クラスター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、ケンブリッジ、マサチュセッツ州）中で１８℃に保った。全細胞アゴニスト−誘発電流を注入後１−１４日間にわたり一般的な二電極電圧クランプ（ジーンクランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ）５００、アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて以上で記載されそして当該技術で既知である標準的方法（Ｄａｓｃａｌ １９８７）を使用して測定した。微小電極に、１および２ＭΩの抵抗を有する３Ｍ ＫＣｌを充填した。細胞に連続的にＮＤ９６を１０ｍｌ／分で断らない限り室温で灌注した。膜電圧を断らない限り−８８ｍＶでクランプした。
【００９８】
５−ＨＴ（＞１００μＭ）は推定５−ＨＴ３−Ｂサブユニットを単独で（ｎ＝４（３．３ｎｇのｃＲＮＡ／卵母細胞）、ｎ＝１２（０．３３ｎｇ）、ｎ＝１２（０．０３３ｎｇ）、およびｎ＝３（０．００３３ｎｇ））が注入された卵母細胞中では効果がなく、これらの試験で使用された卵母細胞中では内因性の５−ＨＴ−誘発電流がなかったことを示す。５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡ（３．３ｎｇ）だけまたは５−ＨＴ３−ＢをｎＡＣｈβ１、β２およびβ３と一緒に注入された卵母細胞は、５−ＨＴ、ＡＣｈ、ヒスタミン、チラミン、トリプタミン、トリプトファンアミド、トリプトファン、ノレピネフィリン、オクトパミン、ＤＡ、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、ホモバニル酸、トリプトフォル、アルファ−メチルセロトニン、グルタメート、グリシン、ＧＡＢＡ、β−アラニン、タウリン、β−フェニルエチルアミン、５−ヒドロキシインドール酢酸、５−ヒドロキシインドール、６−ヒドロキシメラトニン、ガンマヒドロキシブチレート、シス−４アミノクロトン酸、アグマチン、ｄ−シクロセリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、アセチル−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸、Ｓ−α−ヒスタミン、Ｎ−α−メチルヒスタミン、メラトニン、５−ヒドロキシインドール２−カルボン酸、Ｎ−アセチルセロトニン、および５−ヒドロキシインドール３−アセトアミドを包含する３００種の神経活性化合物に対して＞１００μＭにおいて不感受性であった。記録の少なくとも３０分前における細菌性アルカリ性ホスファターゼ（０．２５−０．３Ｕ）と一緒に５−ＨＴ３−Ｂが注入された卵母細胞の注入はこれらのリガンド（ｎ＝３）に対する感受性の付与において非効果的であった。
【００９９】
５−ＨＴ３−Ａ受容体アゴニスト−誘発応答の３つの特徴は５−ＨＴ３−Ｂ−注入卵母細胞中では劇的に変えられた。第一に、５−ＨＴ−誘発応答の動力学は顕著に変えられ（図５ａ）、第二に、ピーク電流が増加し（図５ｃ）、そして第三に、５−ＨＴ３−Ｂが５−ＨＴ、ビフェニルグアニド誘導体であるｍＣＰＢＧおよび１−ＰＢＧ、並びに２−Ｍｅ−５−ＨＴに対する用量−応答関係を特異的に変え、ドーパミン（ＤＡ）に対する用量−応答には検知可能な影響がなかった。
【０１００】
アフリカツメガエル卵母細胞中の５−ＨＴ３−Ａ受容体と一緒になったヒトセロトニン５−ＨＴ３受容体改質剤であるサブユニット５−ＨＴ３−Ｂの機能発現が図５に示されている。卵母細胞にＢａ^２＋を含有するＮＤ９６を１０ｍｌ／分の速度で室温で連続的に灌注した。５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体中の内部電流は図５ａに示されているように１〜１００μＭ５−ＨＴの連続的存在中に減衰し、この受容体に関してこれまでに記載された減感作と一致した（Ｂｅｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｌａｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。５−ＨＴ３−Ａ−発現性卵母細胞は５−ＨＴ、２−メチル−５−ＨＴ、ｍＣＰＢＲおよび１−ＰＢＧに対して、遅い減感作応答（左パネル；「遅い」応答物、卵母細胞バッチの７１％）、または速い減感作成分（右パネル、「速い」応答物）を包含する複雑な電流のいずれかで応答した。両方のサブユニットを発現する卵母細胞は均一な応答を生じた（中央パネル）。試験したアゴニストは５−ＨＴ（０．３および１０μＭ、応答は重複される）、ｍＣＰＢＲ（０．３および１０μＭ）、１−ＰＢＧ（１０および１００μＭ）、ＤＡ（０．１および１ｍＭ）、２−Ｍｅ−５−ＨＴ（１０μＭ）を包含した。アゴニストは記録上の水平線により示されている時間中に適用された。強い線から伸びるはっきりした線は、重なった図形の１つに関するより長いアゴニストに対する露呈を示す。時間目盛り線：４０秒間。
【０１０１】
等量の５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡが共に注入された卵母細胞は、対照５−ＨＴ３−Ａ−注入卵母細胞の２集団の応答動力学における明確な差にかかわらず、常に同様に応答した（表１っか。それ故、「遅い」卵母細胞では、最大近くの５−ＨＴ−誘発電流は５倍ほど速く減衰した（図５、左対中央パネル；図６ａ；表１）が、「速い」卵母細胞では、応答は３．５倍ほど遅く減衰した（図５、右対中央パネル；図６ｂ；表１）。さらに、５−ＨＴ（１０μＭ）に対する応答に関するピークまでの時間は試験した全ての卵母細胞に関して５−ＨＴ３−Ｂの存在下で３．３＋／−０．３秒間（ｎ＝３８）であった（図６ｃ、ｄ、強い線、「遅い」および「速い」応答物）。それ故、５−ＨＴ３−Ｂの存在下では、卵母細胞中の５−ＨＴ３受容体応答は中程度の過渡電流に標準化された。５−ＨＴ３−Ｂの不存在下で観察された複雑な応答波形とは対照的に、Ｂａ^２＋ＮＤ９６中の１０μＭ５−ＨＴにより誘発された内部電流は両方のサブユニットを発現する卵母細胞の８０％より多くで単独指数関数（τ＝４．９＋／−０．３秒間、ｎ＝２５）に最も良く一致した。この減衰定数は同一条件下での「速い」応答の減衰より有意に遅かった（ｐ＜５ｅ^−６）。５−ＨＴ３−Ｂを発現する「遅い」応答物では、５−ＨＴ、２−メチル−５−ＨＴ、ｍＣＰＢＧおよび１−ＰＢＧがｔ８０値を、それぞれ、５．６倍、５倍、２．０倍および１．７倍ほど減少させ、アゴニスト−依存性の差を示唆する（表１）。対照的に、これらのアゴニストに関する「速い」応答物のｔ８０値に対する５−ＨＴ３−Ｂ調節効果は約４倍であった。ｔ８０値における有意の差は１および１０μＭ ５−ＨＴにおいて全ての卵母細胞バッチで観察された。興味あることに、ＤＡ応答は５−ＨＴ３−Ｂ共発現により変えられなかったようである（図５ａ）。
【０１０２】
５−ＨＴに対するホモマーおよびヘテロマー受容体の応答は、電流が０ｍＶ近くに反転したため、非選択的カチオンチャンネルの活性化と一致した。動力学における差は５−ＨＴ３受容体機能における変動によりそして汚染性の内因性のＣａ^２＋で活性化されたクロリドチャンネルの活性化によるものでないようである。５−ＨＴ３−Ａ受容体はＣａ^２＋に透過性である（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｒｏｎｄｅ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓ， １９９８； Ｙａｎｇ， １９９０）が、Ｃａ^２＋の流入が内因性のクロリド電流を活性化するには不充分であるようである（Ｇｉｌｏｎ ａｎｄ Ｙａｋｅｌ， １９９５； Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。さらに、５−ＨＴ３−Ｂはヒト組換え受容体のＣａ^２＋透過性を減ずる（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。チャンネル性質の５−ＨＴ３−Ｂ調節はＣａ^２＋が枯渇した食塩水中でそしてクロリド平衡電圧近くの膜電圧において観察された。
【０１０３】
１−ＰＢＧに対する応答は５−ＨＴ３アンタゴニストであるトロピセトロンにより阻止された。１−ＰＢＧに対する対照応答（１００μＭ、強い線により示される）（図５ｂ、左パネル）を得た後に、卵母細胞を２分間にわたり洗浄し、次にトロピセトロン（１μＭ、はっきりした線）中で３０秒間にわたりインキュベートし、次に１−ＰＢＧおよびトロピセトロンの両者を加えた。１−ＰＢＧに対する応答は完全に阻止された（図５ｂ、中央パネル）。アンタゴニストの２分間の洗浄後にアゴニストに対する応答が回復した（図５ｂ、右パネル）。
【０１０４】
５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡと一緒になった５−ＨＴ３−Ａの共発現（強い点がついた棒、図５ｃ）はｍＣＰＢＧ、１−ＰＢＧおよび５−ＨＴに対する最大応答を５−ＨＴ３−Ａ単独での発現（はっきりしない点がついた棒、図５ｃ）と比べて有意に増加させた。Ｃａ^２＋を含有する食塩水対Ｂａ^２＋を含有する食塩水（−７．７＋／−１．４μＡ（ｎ＝１６）対−７．６＋／−０．９μＡ（ｎ＝２４））中の５−ＨＴ（１０μＭ）で誘発された最大流における差がないため、Ｂａ^２＋およびＣａ^２＋を含有する食塩水中で記録された卵母細胞からのデータを一緒にした。試験した卵母細胞の数は９〜６１の範囲であり、ＳＥＭ値は５−ＨＴ（１０μＭ）に関して１０％でありそしてｍＣＰＧＢ（１０μＭ）および１−ＰＢＧ（１００μＭ）に関して２１％であった。ｐ値が示されている：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（スチューデント式ｔ−試験）。
【０１０５】
応答の上昇および降下段階でピークまで８０％の間の時間（ｔ８０）を測定することにより応答の減感作を定量化した。減衰速度はＣａ^２＋がＢａ^２＋により置換された食塩水中、Ｃａ^２＋およびＢａ^２＋を含有する食塩水中ではより遅く、ｔ８０はそれぞれ１１．３＋／−２．６秒間（ｎ＝１８）および３０．３＋／−４．３秒間（ｎ＝３１、ｐ＜０．０００５）であった。試験した条件下ではｔ８０は電圧に依存しなかった。「速い」応答物の初期減衰はτ＝２．０＋／−０．３秒間（ｎ＝８）では単独指数関数により一致させることができた。卵母細胞電流から測定された動力学パラメーターの我々の定量化は同様な実験条件下で処理された卵母細胞の集団間の応答期間および開始を比較する手段を与える。比較的遅い適用方法および卵母細胞の幾何学的形状が溶液の急速な交換を妨害するため、それは明らかに基礎をなすチャンネル活性の正確な記述ではない。
【０１０６】
５−ＨＴ（１０μＭ）に対する応答のピークまでの時間は遅いおよび速い応答物に関して、それぞれ、６．２＋／−０．６秒間（ｎ＝４１、図６ｃ）および１．８＋／−０．２秒間（ｎ＝１０、図６ｄ）であった。同様な差が１００μＭ ５−ＨＴに対する応答で得られた。ホモマーの「速い」応答のｔ８０は「遅い」応答での発見と同様にＣａ^２＋およびＢａ^２＋を含有する食塩水の両者中で電圧非依存性であったが、後者とは対照的に、ｔ８０はＣａ^２＋の存在および不存在下で同様であった。
【０１０７】
５−ＨＴ３受容体の薬理学は試験した全てのバッチ中で５−ＨＴ３−Ｂ発現により同様に変えられそしてデータは一緒にされた。５−ＨＴの見掛け親和性は、卵母細胞中で５−ＨＴ３−Ｂが５−ＨＴ３−Ａと共に発現された場合に、減少した（図７ａ）。他方では、両方のサブユニットを発現する卵母細胞は５−ＨＴ３−Ａだけを発現する卵母細胞と比べて、低い濃度のｍＣＰＢＧおよび１−ＰＢＧの適用に対してより敏感であった（図５ａ）。低い濃度のＤＡに対する応答は５−ＨＴ３−Ｂにより促進されなかった。ピーク応答対低いおよび高い濃度のアゴニストの比が測定される場合には、共に注入された卵母細胞はビフェニルグアニド誘導体（１−ＰＢＧおよびｍＣＰＢＧ）に対するより大きい相対的応答を有するが、５−ＨＴに対するより少ない相対的応答を有し、そしてこれらの差の大きさは注入されたｃＲＮＡ類の相対比に依存した（図７ｂ）。注入されたｃＲＮＡの比に対するｔ８０値の依存性と一致して、５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡが５−ＨＴ３−ＡｃＲＮＡより１００倍ほど希釈された場合には薬理学における差はもはや観察されなかった。
【０１０８】
アゴニストである１−ＰＢＧおよびｍＣＰＢＧは０．３３ｎｇの５−ＨＴ３−Ｂサブユニットが単独で注入された卵母細胞では応答を誘発せず（１：１比を与えるために注入された濃度、ｎ＝４）、共に注入された卵母細胞中の１−ＰＢＧおよびｍＣＰＢＧ応答性における増加はこれらのアゴニストによる５−ＨＴ３−Ｂホモマルチタイマーの直接的活性化によらないことを示す。さらに、１−ＰＢＧに対する応答はトロピセトロン（１μＭ）、ＬＹ−２７８，５８４マレエート（１μＭ）、ｄ−ツボクラリン（３０μＭ）により可逆的方法で同様に遮断された。選択的５８４_２受容体アンタゴニストであるケタンセリン（１０μＭ）はアゴニスト応答に影響を与えなかった。共に注入された卵母細胞中の５−ＨＴ−誘発応答もこれらのアンタゴニストにより阻止された。
【０１０９】
しかしながら、５−ＨＴ３−Ｂはアゴニスト−誘発電流の電圧依存性を、それらが内部整流よりむしろ線状であるように変えた。５−ＨＴ３受容体中の電流が膜電圧の範囲で測定された実験では、５−ＨＴ３−Ａ受容体はそれぞれ逆電位に対して負および正である電圧において外部電流より内部電流を多く通した。５−ＨＴ３−Ｂの存在下では、内部および外部電流は同様でありそして電流−電圧関係はほぼ線状であった。５−ＨＴ３−ＢＲＮＡの注入は卵母細胞中で発現したｎＡＣｈ受容体中の電流（図８）並びに速い不活性化に寄与するＮ−末端領域を欠いたシェーカー（Ｓｈａｋｅｒ）カリウムチャンネル変異体に対して影響を与えなかった。
【０１１０】
卵母細胞中のヒト５−ＨＴ３−Ｂの調節効果の特異性が図８に示されている。全ての場合、注入された５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡの量は各ｎＡＣｈ受容体の濃度の少なくとも２倍であった。（ａ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝５）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝４）ｎＡＣｈ受容体α３β４を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジン露呈に対する応答に関するｔ８０。（ｂ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝８）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝９）ｎＡＣｈ受容体α４β２を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジン露呈に対する応答に関するｔ８０。（ｃ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝３）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝３）ｎＡＣｈ受容体α２β２を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジン露呈に対する応答に関するｔ８０。（ｄ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝１２）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝１５）ｎＡＣｈ受容体α７を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジン露呈に対する応答に関するｔ８０。
【０１１１】
さらに、低いおよび高い濃度のエピバチジン（ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎｅ）（０．３および１０μＭ）に対する応答はα７ｎＡＣｈが注入された卵母細胞中では５−ＨＴ３−Ｂの存在または不存在下で同様であり、用量応答関係が認識できるほど変えられなかったことを示している。
実施例６
ヒト５−ＨＴ３−Ｂの同定
ヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体を安定的に発現するヒトＨＥＫ２９３細胞をｐ５ＨＴ３ＢＲを用いてトランスフェクトした。１つの二重トランスフェクタントは対照５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ細胞と同様でありそして一般的には対照として使用された。３日後に、細胞をネオマイシン（５００μｇ／ｍｌ）およびゼオシン（２００μｇ／ｍｌ）の存在下で選択しそして３個の１：１０分割部分を通して約２週間にわたり成長させた。個別コロニーを採取しそして６−ウェル皿の中で成長させた。細胞を次に９６−ウェル板（バイオコート（Ｂｉｏｃｏａｔ）、ポリ−Ｄ−リシンコーテイングされた黒色／透明板、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）パート＃３５４６４０）上で平板培養しそして集密的となるまで３日間にわたり成長させた。ウェルをＦ１２／ＤＭＥＭですすぎ、次にフルオ−４（２μＭ）中でプルロン酸（２０％、４０μｌずつ、２０ｍｌの合計量で使用された）と共に１時間にわたり室温でインキュベートした。板をＦＬＩＰＲ（モレキュラー・デバイセス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＬ−１０１）を用いて評価した。細胞にアゴニスト（３倍濃度、４０μｌずつ、８０μｌとなるまで５０μｌ／秒の速度で加えられた）を加えた。
【０１１２】
全細胞パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８１）を使用して、＞２日間にわたり１２ｍｍカバースリップ上に保たれた５−ＨＴ３−Ａ受容体または５−ＨＴ３−Ａ受容体および５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を安定的に発現するＨＥＫ２９３からのリガンドで誘発された電流を記録した。細胞をＤＩＣノマルスコー（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学素子を有するニコン・ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）３００を用いて可視化した。細胞を連続的に断らない限り生理食塩水（〜０．５ｍｌ／分）中に灌注し。標準的生理食塩水（「チロデス（Ｔｙｒｏｄｅｓ）」）は（ｍＭで）１３０ ＮａＣｌ、４ ＫＣｌ、１ ＣａＣｌ_２、１．２ ＭｇＣｌ_２、および１０ ヘミ−Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、ウェスコル（Ｗｅｓｃｏｒ）５５００蒸気圧（ウェスコル・インコーポレーテッド（Ｗｅｓｃｏｒ Ｉｎｃ．）、ローガン、ユタ州）を用いて測定した２９５−３００ｍＯｓｍ）を含有していた。記録電極をホウ珪酸塩毛管（Ｒ６、ガーナー・グラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ）、クレアモント、カリフォルニア州）から製作し、先端を歯科用表面ワックス（マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、サウスベンド、インジアナ州）でコーテイングし、そして細胞内食塩水（ｍＭで、１００ グルコン酸Ｋ、２５ ＫＣｌ、０．４８３ ＣａＣｌ_２、３ ＭｇＣｌ_２、１０ ヘミ−Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび１ Ｋ_４−ＢＡＰＴＡ（１００ｎＭ遊離Ｃａ^２＋）、ｐＨ７．４、２９０ｍＯｓｍを得るために加えられたデキストロースを有する）を含有する場合には１−２ＭΩの抵抗を有していた。液体接合電位は標準的ピペットおよび浴溶液を用いて経験的およびコンピュータープログラムＪＰＣａｌｃ（Ｂａｒｒｙ， １９９４）を用いる両方で測定して−１８ｍＶであった。示されている全ての電圧は液体接合電位に関して補正された。電流および電圧信号を検知しそして２ｋＨｚにおいてアキソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）１Ｄパッチ−クランプ増幅器（アキソン・インスツルメンツ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてフィルターにかけ、ディジデータ（ＤｉｇｉＤａｔａ）１２００Ｂラボラトリー・インターフェース（アキソン・インスツルメンツ）およびＰＣ適合性コンピューターシステムを用いて記録し、そして磁気ディスクにオフ−ライン分析用に貯蔵した。データ採取および分析はＰＣランプ（ＰＣｌａｍｐ）ソフトウエアを用いて行った。保持電流における遅い変化を検知しそして２ｋＨｚで濾過し、そしてＬＰＦ２０２Ａ ＤＣ増幅器（ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ）、ハンデン、コネチカット州）およびＶＲ−１０Ｂデジタルデータレコーダー（インストルテク（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ）、グレートネック、ニューヨーク州）を用いてビデオテープ上に記録した。信号を後で１０Ｈｚにおいてアキソテープ（Ａｘｏｔａｐｅ）ソフトウエアを用いて分析した。
【０１１３】
合計膜キャパシタンス（Ｃ_ｍ）を、１０ｍＶ／ｍｓの速度で発生した−６８ｍＶ３０ｍＶ過分極電圧傾斜後の最大電流と最終電位（−９８ｍＶ）（Ｄｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）における定常電流との間の差として測定された。
【０１１４】
リガンド−誘発コンダクタンス変化の見掛け逆電位（Ｖ_ｒｅｖ）を電圧−傾斜プロトコル（Ｄｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を用いて測定した。電圧傾斜を１秒毎に適用し、そして生じた全細胞傾斜−誘発電流を記録した。一般的には電圧は負から正ないし負の値に傾斜させた。細胞を−６８ｍＶにおいてクランプするために必要な電流を連続的に監視した。リガンド−誘発コンダクタンスを電流−傾斜プロトコルによりリガンドの存在および不存在下で誘発された全細胞電流から測定した。対照傾斜電流とリガンドの存在下で得られたものとの比較がこれらの電流間の差を示し、そしてチャンネルタンパク質上のリガンドの影響を示す。正味のリガンド−誘発電流がない電圧を測定した（Ｖ_ｒｅｖ）。
【０１１５】
ほとんどの値は算術的平均＋／−平均の標準偏差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表示される。
【０１１６】
アゴニスト−誘発Ｃａ^２＋およびイオン性電流は５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの両者を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中では５−ＨＴ３−Ａ受容体を安定的に発現する細胞と比べて顕著に速い減衰動力学を有していた（図９）。５−ＨＴ３−Ｂおよび５−ＨＴ３−Ａの両者を発現する細胞（図９ａ、右）は、５−ＨＴ３−Ａ受容体−発現性細胞（図９ａ、左）と比べて速い減衰を有する３μＭ ５−ＨＴ（上部、最大応答）、３０μＭ １−ＰＢＧ（中央、最大応答）および３μＭ ｍＣＰＢＧ（下部、最大応答）に応答した。これらのデータは「遅い」卵母細胞から得られたものと同様である（図５）。高い濃度のアゴニストにより誘発されたＣａ^２＋流入上に同じ板からの低い濃度のアゴニストに対する細胞の応答が重ねられる（図９ａ）。卵母細胞（図７ｂ）では、ｍＣＰＢＧおよび１−ＰＢＧの低い用量に対する応答はより高い百分率の二重にトランスフェクトされた細胞中で観察された最大応答であった（図９ｃ；０．１および０．１７μＭ ｍＣＰＢＧにおけるｐ＜０．００５）。しかしながら、卵母細胞データ（図７ａ、ｂ）とは対照的に、低い濃度の５−ＨＴも二重トランスフェクタント中で５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫと比べてより大きい応答を誘発した（図９ｂ、６０、１００および１７０ｎＭ ５−ＨＴにおけるｐ＜０．００５）。５−ＨＴおよびｍＣＰＢＧ（図９ｂ、ｃ）並びに１−ＰＢＧ、２−メチル−５−ＨＴ、５ＨＴＱ、キパジン、ＤＡおよびｍＣＰＰに関する完全な用量応答関係は、減少したｎＨおよび５４０＋／−５０ｎＭ（ｎ＝７、ｐ＜０．００５）と比べて５−ＨＴ３−Ｂ−発現性細胞（５−ＨＴ、ＥＣ５０：２００＋／−２９ｎＭ（ｎ＝８）中でアゴニストに対するより高い親和性を示す。
【０１１７】
ＦＬＩＰＲシステムを用いる５−ＨＴ−活性化Ｃａ^２＋流入に関する用量応答が図９ｂに示されている。５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂヘテロマー受容体（三角形）は５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体（四角形）と比べて有意により高い５−ＨＴに対する親和性および減少したｎＨを有していた。ピーク応答を測定しそして最大観察応答に標準化した。４−１０回の別個の実験からの平均値が表示されている。データはボルツマン指数関数と一致した。
【０１１８】
ＦＬＩＰＲシステムを用いるｍＣＰＢＧ−活性化Ｃａ^２＋流入に関する用量応答。５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂヘテロマー受容体（三角形）および５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体（四角形）からのデータが図９ｃに示されている。ピーク応答を測定しそして最大観察応答に標準化した。値を４回の別個の実験から平均化した。データはボルツマン指数関数と一致した。
【０１１９】
受容体−介在Ｃａ^２＋流入を測定するＦＬＩＰＲシステム中でアゴニストの速い適用中に得られたデータは、３種全てのアゴニストが同様に行動することを示しており、両方のサブユニットを共発現させる細胞はより高い親和性に移動したより狭い用量−応答関係を示した。卵母細胞中および組換え哺乳動物細胞中の５−ＨＴ用量応答間の差の推定理由は、５−ＨＴ応答の速い減感作が卵母細胞試験における５−ＨＴの比較的遅い適用中に親和性における明らかな移動を生じたことである。これは１−ＰＢＧおよびｍＣＰＢＧに関しては、多分これらのアゴニストに対する応答はより遅く脱感作されたため、観察されなかった（表１）。
表１
５−ＨＴ３受容体に対する長期露呈に対する電流応答のｔ８０は５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの両方のヘテロマーを発現するアフリカツメカエル卵母細胞中で変えられる。−７０ｍＶの保持電位から得られたピーク応答に関する平均＋／−ＳＥＭ（ｎ）が示されている。ｐ値はスチューデント式ｔ−試験を用いて測定された。
【０１２０】
【表２】

【０１２１】
Ｃａ^２＋流入実験で観察された動力学および薬理学における差はＣａ^２＋流入試験で緩衝する変更した細胞内Ｃａ^２＋によるものではなかった。同様な結果は５−ＨＴおよび１−ＰＢＧで誘発された全細胞電流に関しても観察された（図９ｄ）。５−ＨＴ３−Ａ受容体だけを発現する細胞では、１０μｍ １−ＰＢＧ（黒い棒）は小さい内部電流およびコンダクタンスにおける増加を生じた（図９ｄ、上左）。細胞に電圧傾斜プロトコルを行って、同時に全細胞コンダクタンス変化（１Ｈｚ）を測定し、傾斜−誘発電流（図９ｄ中のスパイク波形）は図９ｅ中により速い時間目盛りで示されている。細胞は引き続き大きな５−ＨＴ応答を示した（白い棒は１０μＭ ５−ＨＴが適用された場合を示す）。二重トランスフェクタントでは、１０μＭ １−ＰＢＧに対する応答は匹敵する５−ＨＴ応答を生ずる細胞中より大きかった（図９ｄ上右）。上部：−６８ｍＶの保持電位からの１０μＭ １−ＰＢＧ（黒い棒）および１０μＭ ５−ＨＴ（白い棒）により誘発される内部電流。下部：１００μＭ １−ＰＢＧにより誘発された内部電流（点のついた棒）。１−ＰＢＧ（１０μＭ）は個別の５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ中の１０μＭ ５−ＨＴに対する応答の３＋／−１％（ｎ＝７）である応答および個別の５−ＨＴ３−Ａ／５−ＨＴ３−Ｂ／ＨＥＫ細胞中の１０μＭ ５−ＨＴに対する１０倍高い（２８％および３４％）応答を誘発した。５−ＨＴ（１０μＭ、図９ｄ上部、黒い棒）および１−ＰＢＧ（３０μＭ、図９ｄ下部、点のついた棒）に対する応答の減衰速度は一般的に５−ＨＴ３−Ｂの存在下で加速された。
【０１２２】
５−ＨＴ誘発電流の電圧依存性は５−ＨＴ３−Ａ−発現性細胞中では整流性でありそして５−ＨＴ３−Ｂの存在下ではより線状性であった（図９ｅ）。５−ＨＴはホモマー受容体（左）並びに５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂサブユニット（右）を発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの電流を誘発した。電圧傾斜を細胞に対して−１２０〜＋８０ｍＶ（−１８ｍＶの接合電位に関して補正されていない）に２００ｍｓｅｃ（１ｍＶ／ｍｓ）にわたりアゴニスト適用の前（黒丸）および最中（白丸）に適用した。Ｖ_ｒｅｖは両方の応答に関して同様でありそして０ｍＶに近かった。（ｄ）中の記録上の星印は（ｅ）中に拡大目盛りで示されている傾斜電流を示す。Ｖ_ｒｅｖから正および負の５０ｍＶで測定された５−ＨＴ誘発電流の比が整流度の指示値として計算された。５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ細胞では、内部電流は外部電流より２倍大きかった（比：０．５３＋／−０．０４、ｎ＝１０）。両方のサブユニットを発現する細胞では、電流−電圧関係は線状であった（比：１．０７＋／−０．１０、ｎ＝５）。２種のトランスフェクタント間で観察されたこの整流差は統計学的に異なっていた（ｐ＜０．００５）。
【０１２３】
試験した全ての細胞系統では、それらのＥＣ５０近くの濃度でのアゴニスト添加中に観察されたＣａ^２＋流入は特異的５−ＨＴ３受容体アンタゴニストであるトロピセトロン（ＩＣ５０〜１０ｎＭ）、ＬＹ２７８５８４（ＩＣ５０〜６ｎＭ）およびＭＤＬ７２２２２（ＩＣ５０〜１５ｎＭ）により完全に阻止された。５−ＨＴ_２受容体におけるアンタゴニストであるケタンセリンは１０μＭまでの５−ＨＴまたは１−ＰＢＧ誘発Ｃａ^２＋応答に対して影響を有していなかった。５−ＨＴ_２ＡおよびＤ_２ＤＡ受容体におけるアンタゴニストであるスピペロンは１μＭより上の濃度において５−ＨＴ３−Ａ受容体における部分的アゴニストであるようであった。
【０１２４】
５−ＨＴ３−Ｂの存在下で変化する動力学の基礎となる機構は知られていない。１つの可能性では、５−ＨＴ３−Ｂが減感作速度をアロステリックに調節する。その場合には、１つの予測はホモマー性受容体（これは観察されなかった）と比べた５−ＨＴ３−Ｂを含有する受容体中のピーク電流における減少であるが、この予測は単独チャンネルコンダクタンスに変化を推量する。ヘテロマーチャンネルは実際にホモマーチャンネルに比べて有意に大きい単独チャンネルコンダクタンスを有する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。第二の可能性では、５−ＨＴ３−Ｂがアゴニスト結合速度を最初の潜伏期間がヘテロマーではホモマーと比べて短くなり且つ減感作速度が変わらないように変更する。同様なモデルはナトリウムチャンネルに関して発表されていた（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。応答の上昇および降下段階での８０％ピーク値の間の時間（ｔ８０）はピーク応答までの時間に比例するようであり、それは後者の機構と一致する。卵母細胞の多くでは、ピークまでの時間は５−ＨＴ３−Ａが５−ＨＴ３−Ｂと共に注入される場合には２倍速かった。さらに、変えられた薬理学もチャンネル開放に関する最初の潜伏期間における短縮と一致する。観察された効果（５−ＨＴ３−Ｂの存在下での減少したｎＨおよび減少したＥＣ_５０）は５−ＨＴ３−Ａサブユニットが５−ＨＴ３−Ｂと一緒である場合の負の協同性の損失（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｄｉｌｇｅｒ， １９９３）により説明することができ、それはアゴニストに関する検知可能な機能結合部位を有していない。このモデルでは、アゴニストの結合が受容体複合体中のアゴニストに関する他のアゴニスト結合部位の親和性を減ずる。５−ＨＴ３受容体は非常に強い協同性を示し、ヒル（Ｈｉｌｌ）係数は機能試験から２または３付近であると測定された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。最初の潜伏期間が短縮するが減感作速度は未変化であるモデルでは、より短い時間窓内でのチャンネル開放により増加したピーク電流があることが予測され、それは観察された。ホモマー受容体はサブ−ｐＳ単独チャンネルコンダクタンスを有するため、単独チャンネル分析はこのシステムでは禁制であるかもしれない（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ヘテロマー受容体だけが単独チャンネル開放を確実に測定するのに充分な大きい単独チャンネルコンダクタンスを有する（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
実施例７
ヒト５−ＨＴ３−Ｂおよび５−ＨＴ３−Ａコトランスフェクトされた哺乳動物細胞に対する結合アッセイ
ヒト５−ＨＴ３−Ｂを用いてまたは用いずに５−ＨＴ３−Ａ受容体を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を^３Ｈ−［ｍＣＰＢＧ］結合検定において使用することができる。平衡リガンド結合アッセイは従来工程（Ｌｕｍｍｉｓ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， １９９７； Ｌｕｍｍｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）を用いて行うことができる。特異的な^３Ｈ−［ｍＣＰＢＧ］結合が５−ＨＴ３受容体およびヒト５−ＨＴ３−Ｂトランスフェクト細胞からの膜調合物中で観察される。５−ＨＴ３−Ａおよびヒト５−ＨＴ３−Ｂを発現する卵母細胞を使用して他の化合物の結合の親和性および^３Ｈ−［ｍＣＰＢＧ］結合を置換するそれらの能力を測定することができる。
実施例８
ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの大腸菌発現ベクター中へのクローニング
組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂは大腸菌中で、発現カセットからｐＥＴシリーズ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を包含するがそれに限定されない大腸菌発現ベクターへの伝達に従い製造される。ｐＥＴベクターはヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現をきっちり調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの調節下におく。この構成体から誘発可能なｌａｃラプロモーターにより駆動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌宿主中への伝達後に、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）が培養物に加えられる場合にヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現が誘発される。発現したヒト５−ＨＴ３−Ｂのレベルはここに記載されているアッセイ法により測定される。
【０１２５】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂに関する全読み取り枠をコードするｃＤＮＡがｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位の中に挿入される。正の配向における構成体が配列分析により同定されそして発現宿主菌株ＢＬ２１を形質転換するために使用される。形質転換細胞を次に使用してヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の製造用の培養物を接種する。培養物をＭ９またはＺＢ培地中で成長させることができ、その調合は当業者に既知である。ＯＤ_６００の約１．５までの成長後に、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３時間にわたり３７℃でヒト５−ＨＴ３−Ｂの発現が誘発される。
実施例９
ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの昆虫細胞中の発現用バクロウイルス発現ベクターへのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから誘導されたバクロウイルスベクターが昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃ １７１１）のＳｆ９系統中のｃＤＮＡの高水準発現を与えるために指定される。ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡを発現する組換えバクロウイルスは下記の標準的方法（インビトロゲン・マクスバック・マニュアル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａｌ））に従い製造される：ヒト５−ＨＴ３−ｃＤＮＡ構成体をｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（インビトロゲン）を包含する種々のバクロウイルス伝達ベクター中でポリヘドリン遺伝子中に連結反応させる。組換えバクロウイルスは、バクロウイルス伝達ベクターおよび線状化されたＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡのコトランスフェクション後のＳｆ９細胞への相同的組換えにより製造される［Ｋｉｔｔｓ， Ｐ．Ａ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １８： ５６７７ （１９９０）］。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは感染細胞中の封入体の不存在により同定されそして組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現を基にして同定される（Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ．， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ． Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５）。プラーク精製後に、ヒト５−ＨＴ３−Ｂ発現がここに記載されているアッセイ法により測定される。
【０１２６】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂに関する全読み取り枠をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入させる。正の配向の構成体を配列分析により同定しそして線状ＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクトするために使用する。
【０１２７】
真正活性ヒト５−ＨＴ３−Ｂが感染細胞の細胞質中で見られる。活性ヒト５−ＨＴ３−Ｂを感染細胞から等張液または洗浄液溶解により抽出する。
実施例１０
ヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの酵母発現べクターへのクローニング
異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を指向するように設計された発現ベクター中への最適なヒト５−ＨＴ３−ＢｃＤＮＡの挿入後に、組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂが酵母であるＳ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で製造される。細胞外発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４などの如きベクターをヒト５−ＨＴ３−Ｂシストロンに連結反応させる［Ｒｉｎａｓ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ５４３−５４５ （１９９０）； Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５： ４１８９−４１９２ （１９８９）］。細胞外発現用には、ヒト５−ＨＴ３−Ｂシストロンを、分泌シグナル配列（酵母または哺乳動物ペプチド）をヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質のＮＨ_２末端に融合させる酵母発現ベクター中に連結反応させる［Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ａ．， Ｇｅｎｅ ８５： ５１１−５１６ （１９８９）； Ｒｉｅｔｔ Ｌ． ａｎｄ Ｂｅｌｌｏｎ Ｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８： ２９４１−２９４９ （１９８９）］。
【０１２８】
これらのベクターは発現したｃＤＮＡにヒト血清アルブミンのシグナル配列を融合させるｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ Ｏ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ４２−４６ （１９９０）］および発現したｃＤＮＡにヒトリゾチームのシグナル配列を融合させるベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｙ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８： ２７２８−２７３２）］を包含するがそれらに限定されない。さらに、ヒト５−ＨＴ３−Ｂを酵母中でベクターｐＶＥＰを利用するウビキチンに共役結合された融合タンパク質として発現させる［Ｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｊ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ７７１５−７７１９ （１９８９）， Ｓａｂｉｎ， Ｅ．Ａ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ７０５−７０９ （１９８９）， ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｄ．Ｐ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９： ５５１７−５５２３ （１９８９）］。発現したヒト５−ＨＴ３−Ｂの水準はここに記載されているアッセイ法により測定される。
実施例１１
組換えヒト５−ＨＴ３−Ｂの精製
組換え的に製造されたヒト５−ＨＴ３−Ｂを抗体親和クロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１２９】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体親和カラムは抗−ヒト５−ＨＴ３−Ｂ抗体をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化されているゲル担体であるアフィゲル−１０（Ａｆｆｉｇｅｌ−１０）（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に対して抗体がアガロースゲルビーズ担体との共有結合を形成するような方法で加えることにより製造される。抗体を次にゲルに対してスペーサーアームを用いてアミド結合を介して結合させる。残存している活性化されたエステル類を次に１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて捕捉する。カラムを水で、次に０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して共役結合されていない抗体または余分のタンパク質を除去する。カラムを次に適当な膜安定剤、例えば洗剤、と一緒になったホスフェート緩衝食塩水（ｐＨ７．３）の中で平衡化し、そして細胞培養上澄み液または可溶化にされたヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有する細胞抽出物をカラム中にゆっくり通す。カラムを次に洗剤と一緒にしたホスフェート緩衝食塩水で光学濃度（Ａ２８０）が背景値に降下するまで洗浄し、次にタンパク質を洗剤と一緒にした０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）を用いて溶離する。精製したヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を次にホスフェート緩衝食塩水に対して透析する。
【０１３０】
【表３】

【０１３１】
【表４】

【０１３２】
【表５】

【０１３３】
【表６】

【０１３４】
【表７】

【０１３５】
【表８】

【０１３６】
【表９】

【０１３７】
【表１０】

【０１３８】
【表１１】

【０１３９】
【表１２】

【０１４０】
【表１３】

【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂの核酸配列（未翻訳領域を包含する全配列）が示されている；１９２３個の塩基（５′ＵＴＲの１４１個の塩基；３′ＵＴＲの４５６個の塩基）。
【図２】
５−ＨＴ３−Ｂのコード領域に関するヌクレオチド配列が示されている；１３２６個の塩基。
【図３】
ヒト５−ＨＴ３−Ｂのアミノ酸配列が示されている（４４１個のアミノ酸）。
【図４−パネルＡ】
ヒト５−ＨＴ３−ＢのＰＣＲをベースにした組織分布が示されている。レーンは指定された通りに標識付けされる：１、小脳；２、大脳皮質；３、骨髄；４、脊髄；５、後頭極；６、前頭葉；７、側頭葉；８、被殻；９、扁桃；１０、尾状核；１１、脳梁；１２、海馬；１３、全脳；１４、黒質；１５、視床；１６、心臓；１７、脳；１８、胎盤；１９、肺；２０、肝臓；２１、骨格筋；２２、腎臓；２３、膵臓；２４、脾臓；２５、胸腺；２６、前立腺；２７、睾丸；２８、卵巣；２９、小腸；３０、結腸（粘膜内層）；３１、末梢血管白血球。
【図４−パネルＢ】
ＲＴ−ＰＣＲインシトゥハイブリッド形成法を脾臓（ｂ１、ｂ２）および小腸（ｂ３、ｂ４）の正常なヒト組織に対して行った。ヒト脾臓は小リンパ球（矢印）中で、それぞれ、強い５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ（ｂ１）および５ＨＴ３−ＡｍＲＮＡ（ｂ２）シグナル（紫色−黒白写真では濃灰色）を有していた。同様に、強い５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ（ｂ３）および５ＨＴ３−ＡｍＲＮＡ（ｂ４）シグナル（紫色−黒白写真では濃灰色）が小腸（矢印）の間質腺維芽細胞中で検出された。総倍率＝６００ｘ。
【図４−パネルＣ】
ＲＴ−ＰＣＲインシトゥハイブリッド形成法を正常なサルの扁桃の一連の１０μｍ切片に対して行った。図４ｃ１（３００ｘ）および４ｃ３（６００ｘ）は正の５−ＨＴ３−ＡｍＲＮＡシグナル（紫色−黒白写真では濃灰色）を７つのニューロン（矢印）中で示しており、それはまた正の５−ＨＴ３−ＢｍＲＮＡ信号（４ｃ２（３００ｘ）、４ｃ４（６００ｘ））も示す。全てではない細胞がＲＴ−ＰＣＲＩＳＨ技術により５−ＨＴ３−Ｂまたは５−ＨＴ３−Ａに関する特異的プローブを用いて標識付けされた。
【図５−パネルＡ】
アフリカツメガエル卵母細胞中の５−ＨＴ３−Ａ受容体と一緒になったヒト５−ＨＴ３−Ｂの機能発現：５−ＨＴ３−Ｂはアゴニストのサブセットにより誘発された５−ＨＴ３−Ａ電流の動力学および量を変える。（ａ．）５−ＨＴ３−Ｂはアフリカツメガエル卵母細胞中でアゴニストで誘発された５−ＨＴ３−Ａ応答を標準化する。５−ＨＴ３−Ａ−発現性卵母細胞は、ゆっくり減感作する応答（左パネル；「遅い」応答物、卵母細胞バッチの７１％）、または急速に減感作する成分（右％；「速い」応答物）を包含する複雑な電流のいずれかを伴い、５−ＨＴ、２−メチル−５−ＨＴ、ｍＣＰＢＧおよび１−ＰＢＧに応答した。両方のサブユニットを発現する卵母細胞が均一な応答を生じた（中央パネル）。試験したアゴニストは５−ＨＴ（０．３および１０μＭ、応答は重なっている）；ｍＣＰＢＧ（０．３および１０μＭ）；１−ＰＢＧ（１０および１００μＭ）；ＤＡ（０．１および１ｍＭ）；２−Ｍｅ−５−ＨＴ（１０μＭ）を包含していた。アゴニストは記録上の水平線により示されている時間中に適用される。強い線から伸びるはっきりした線は、重なった図形の１つに関するより長いアゴニストに対してさらしたものを示す。Ｂａ^２＋を含有する食塩水を１０ｍｌ／分の速度で室温で卵母細胞に連続的に灌注した。時間目盛り線：４０秒間。（ｂ．）１−ＰＢＧに対する応答は５−ＨＴ３アンタゴニストであるトロピセトロンにより阻止された。１−ＰＢＧ（１００μＭ；強い線により示される）（左パネル）に対する対照応答を得た後に、卵母細胞を２分間にわたり洗浄し、次にトロピセトロン（１μＭ；はっきりした線）中で３０秒間にわたりインキュベートし、次に１−ＰＢＧおよびトロピセトロンの両方を加えた。１−ＰＢＧに対する応答は完全に阻止された（中央パネル）。２分間のアンタゴニストの洗浄後にアゴニストに対する応答が回復した（右パネル）。
【図５−パネルＢ】
５−ＨＴ３−Ａ（はっきりしない点のついた棒）並びに５−ＨＴ３−Ｂおよび５−ＨＴ３−Ａの両方（強い点のついた棒）を発現する卵母細胞からの指定されたアゴニストにより誘発されたピーク電流。Ｃａ^２＋を含有する食塩水対Ｂａ^２＋を含有する食塩水（−７．７＋／−１．４μＡ（ｎ＝１６）対−７．６＋／−０．９μＡ（ｎ＝２４））中の５−ＨＴ（１０μＭ）で誘発された最大電流における差がないため、Ｂａ^２＋およびＣａ^２＋を含有する食塩水中で記録された卵母細胞からのデータを一緒にした。試験した卵母細胞の数は９〜６１の範囲であり、ＳＥＭ値は５−ＨＴ（１０μＭ）に関して１０％でありそしてｍＣＰＧＢ（１０μＭ）および１−ＰＢＧ（１００μＭ）に関して２１％であった。ｐ値が示されている：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（スチューデント式ｔ−試験）。
【図６】
アフリカツメガエル卵母細胞中の５−ＨＴ３−Ａ受容体と一緒になったヒト５−ＨＴ３−Ｂの機能発現：５−ＨＴ３−Ｂは５−ＨＴ応答ｔ８０並びに「遅い」（ａ、ｃ）および「速い」（ｂ、ｄ）応答物中で同様な値へのピークに達するまでの時間を標準化する。（ａ．）５−ＨＴ３−Ａが注入された卵母細胞が遅く減衰する応答で５−ＨＴに応答するような実験からの５−ＨＴ（指定された濃度）により誘発された応答のｔ８０。５−ＨＴ３−Ａが注入された卵母細胞（はっきりしない点のついた棒、ｎはそれぞれ８、３８および１３個の個別卵母細胞であった）、５−ＨＴ３−Ａ受容体および５−ＨＴ３−Ｂが注入された卵母細胞（強い点がついた棒、ｎはそれぞれ１１、３３および１６個の個別卵母細胞であった）。全てのアゴニスト濃度において差は有意であった（それぞれ１、１０および１００μＭ ５−ＨＴに関してｐ＜０．０５、５ｅ^−９、０．００５）。（ｂ．）５−ＨＴ３−Ａが注入された卵母細胞が速く減衰する応答で５−ＨＴに応答するような実験からの５−ＨＴにより誘発された応答のｔ８０。５−ＨＴ３−Ａが注入された卵母細胞（はっきりしない点がついた棒、ｎはそれぞれ５、１１および１０個の個別卵母細胞であった）、５−ＨＴ３−Ａ受容体および５−ＨＴ３−Ｂが注入された卵母細胞（強い点がついた棒、ｎはそれぞれ９、１２および３個の個別卵母細胞であった）。１および１０μＭ ５−ＨＴにおいて有意な差が観察された（それぞれｐ＜０．００５、ｐ＜５ｅ^−５）。（ｃ．）遅い応答物中の１０μＭ ５−ＨＴに対する応答のピークまでの時間は、５−ＨＴ３−Ｂが５−ＨＴ３−Ａと共発現される場合（強い点がついた棒、ｎ＝２６）には５−ＨＴ３−Ａ単独（はっきりしない点がついた棒、ｎ＝４１、ｐ＜０．０００５）に比べて有意に速い。（ｄ．）「速い」応答物中の１０μＭ ５−ＨＴに対する応答のピークまでの時間は、５−ＨＴ３−Ｂが共発現される場合（強い点がついた棒、ｎ＝１２）にはホモマー（はっきりしない点がついた棒、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）に比べて有意に遅い。
【図７】
アフリカツメガエル卵母細胞中の５−ＨＴ３−Ａ受容体と一緒になったヒト５−ＨＴ３−Ｂの機能発現：アゴニスト用量応答関係は５−ＨＴ３−Ｂの存在下で変えられそしてアフリカツメガエル卵母細胞中に注入された５−ＨＴ３−Ｂ対５−ＨＴ３−ＡｃＲＮＡの比に依存する。（ａ．）卵母細胞に５−ＨＴ３−Ａまたは５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡの両者のいずれかを注入しそして示された濃度の５−ＨＴに対するそれらの応答に関して試験した。データは同一卵母細胞中で１００μＭ ５−ＨＴにより誘発された最大応答に関して表示されている。５−ＨＴ３−Ｂは５−ＨＴに関する５−ＨＴ３−Ａ受容体の見掛け親和性を減ずる。アゴニストを細胞に毎分１０ｍｌの速度で浴灌流物中で適用した。データをグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍ）を用いて分析し、そしてそれらはボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）指数関数と一致した。（ｂ．）０．３μＭ ５−ＨＴ、０．３μＭ ｍＣＰＢＧおよび１０μＭ １−ＰＢＧに関する百分率最大応答を５−ＨＴ３−Ａが単独で注入された卵母細胞（最も左にある点のついた棒）、１：１０比における２つのサブユニット（５−ＨＴ３−Ａ対５−ＨＴ３−Ｂ、強い点のついた棒）、１：１比における２つのサブユニット（３列の点のついた棒）、１：０．１比における２つのサブユニット（空白の棒）、および１：０．０１比における２つのサブユニット（２列の点のついた棒）に関してプロットされている。個別卵母細胞中で得られた最大応答の百分率を平均化した。有意な差は星印により示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図８】
卵母細胞中のヒト５−ＨＴ３−Ｂの調節効果の特異性が示されている。全ての場合、注入された５−ＨＴ３−ＢｃＲＮＡの量は各ｎＡＣｈ受容体の濃度の少なくとも２倍であった。（ａ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝５）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝４）、ｎＡＣｈ受容体α３β４を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジンにさらしたものに対する応答に関するｔ８０。（ｂ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝８）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝９）、ｎＡＣｈ受容体α４β２を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジンにさらしたものに対する応答に関するｔ８０。（ｃ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝３）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝３）、ｎＡＣｈ受容体α２β２を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジンにさらしたものに対する応答に関するｔ８０。（ｄ．）５−ＨＴ３−Ｂを用いて（強い点がついた、ｎ＝１２）および用いずに（はっきりしない点がついた、ｎ＝１５）、ｎＡＣｈ受容体α７を発現する卵母細胞への１０μＭエピバチジンにさらしたものに対する応答に関するｔ８０。
【図９−パネルＡ】
組換え宿主細胞中のヒト５−ＨＴ３−Ｂの機能発現が示されている：５−ＨＴ３−Ｂおよび５−ＨＴ３−Ａヘテロマーは５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体とは異なる薬理学的および電圧依存性質を示す。（ａ．）アゴニスト添加により誘発されたＣａ^２＋流入はＣａ^２＋敏感性染料フルオ−４（Ｆｌｕｏ−４）を用いてＦＬＩＰＲシステム上で測定された。０．１７および３μＭ ５−ＨＴ（上部）、６および３０μＭ １−ＰＢＧ（中央）、０．３および３μＭ ｍＣＰＢＧに対する応答が示されている。各記録は３．３３分を表す。アゴニストは２０秒後に加えられそして記録中ずっと存在していた。左：５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ細胞、右：５−ＨＴ３−Ａ／５−ＨＴ３−Ｂ／ＨＥＫ細胞。（ｂ．）ＦＬＩＰＲシステムを用いる５−ＨＴで活性化されたＣａ^２＋流入に関する用量応答。５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂヘテロマー受容体（三角形）は５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体（四角形）に比べて５−ＨＴに対して有意なより高い親和性を有しそしてｎＨを減じた。ピーク応答を測定しそして観察された最大応答に対して標準化された。４−１０回の別個の実験からの平均値が表示されている。データはボルツマン指数関数と一致した。
【図９−パネルＢ】
ＦＬＩＰＲシステムを用いるｍＣＰＢＧで活性化されたＣａ^２＋流入に関する用量応答。５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂヘテロマー受容体（三角形）並びに５−ＨＴ３−Ａホモマー受容体（四角形）からのデータが示されている。ピーク応答を測定しそして観察された最大応答に対して標準化された。４回の別個の実験からの平均値が表示されている。データはボルツマン指数関数と一致した。
【図９−パネルＣ】
５−ＨＴ３−Ａ／ＨＥＫ細胞（左）および５−ＨＴ３−Ａ／５−ＨＴ３−Ｂ／ＨＥＫ細胞（右）からの電圧クランプ記録。電流記録中のスパイク波形は全細胞膜コンダクタンスにおける変化を測定するために使用された電圧傾斜プロトコルにより誘発された電流である。電圧傾斜は１秒毎に誘発された。（ｄ．）上部：−６８ｍＶの保持電圧から１０μＭ １−ＰＢＧ（黒い棒）および１０μＭ ５−ＨＴ（白い棒）により誘発された内部電流。下部：１００μＭ １−ＰＢＧにより誘発された内部電流（点のついた棒）。（ｅ．）電圧傾斜プロトコルを用いて得られたアゴニストで誘発された電流に関する電圧関係。ホモマー受容体（左）並びに５−ＨＴ３−Ａおよび５−ＨＴ３−Ｂサブユニット（右）を発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの５−ＨＴで誘発された電流。電圧傾斜を細胞に対して−１２０〜＋８０ｍＶ（−１８ｍＶの接合電位に関して補正されていない）にわたりアゴニスト適用の前（黒丸）および最中（白丸）に２００ｍ秒間にわたり適用した。Ｖ_ｒｅｖは両方の応答に関して同様でありそして０ｍＶ近くであった。（ｄ）中の記録の上の星印は（ｅ）中の拡大目盛りで示されている傾斜電流を示す。

Claims (23)

1. ヒトセロトニン受容体サブユニットの機能を果たすヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質またはその機能性誘導体をコードする単離され、精製されたＤＮＡ分子。
2. （配列番号：１）；（配列番号：２）；及びその機能性誘導体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１の単離され、精製されたＤＮＡ分子。
3. 該ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである請求項１の単離され、精製されたＤＮＡ分子。
4. 請求項１に記載のヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質またはその機能性誘導体をコードする組換え遺伝子を含有する、組換え宿主におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の発現のための発現ベクター。
5. 発現ベクターが、（配列番号：１）；（配列番号：２）；及びその機能性誘導体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、ヒトセロトニン受容体サブユニットの機能を果たすヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をコードするクローン化遺伝子を含有する請求項４の発現ベクター。
6. 発現ベクターがヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する請求項４の発現ベクター。
7. ヒトセロトニン受容体サブユニットの機能を果たすヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質またはその機能性誘導体をコードする組換え的クローン化遺伝子を含有する組換え宿主細胞。
8. 該遺伝子が（配列番号：１）；（配列番号：２）；及びその機能性誘導体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項７の組換え宿主細胞。
9. ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質をコードする該クローン化遺伝子がゲノムＤＮＡである請求項７の組換え宿主細胞。
10. ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の機能を果たし、そしてヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体の調節因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の機能を果たす実質的に純粋な形態のタンパク質。
11. （配列番号：３）；（配列番号：４）；及びその機能性誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のタンパク質。
12. ヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体の調節因子の機能を果たすヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質と免疫学的に反応する単一特異性抗体。
13. 抗体がヒトセロトニン受容体の５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの活性を妨げる請求項１２の抗体。
14. （ａ）請求項４の発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入すること；及び
    （ｂ）発現ベクターからヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質を発現させる条件下で工程（ａ）の宿主細胞を培養すること
    を含んでなる、組換え宿主細胞におけるヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の発現方法。
15. （ａ）ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質活性のモジュレーターをヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質と合わせること、ここで、該タンパク質は場合によりヒト５−ＨＴ３−Ａ受容体の調節因子の機能を果たす、
    （ｂ）タンパク質に対するモジュレーターの作用を測定すること
    を含んでなる、ヒト５−ＨＴ３−Ｂタンパク質活性を調節する化合物を同定する方法。
16. タンパク質に対するモジュレーターの作用が、ヒト５−ＨＴ３受容体リガンドの結合を阻害しているかまたは増大している請求項１５の方法。
17. タンパク質に対するモジュレーターの作用が、ヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するセロトニン受容体の刺激または阻害である請求項１５の方法。
18. ヒト５−ＨＴ３−Ｂが、ヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するセロトニン受容体の速度論及び薬理学を改変している請求項１７の方法。
19. ヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するセロトニン受容体のモジュレーターである請求項１５の方法において活性のある化合物。
20. ５−ＨＴ３−Ａ及び５−ＨＴ３−Ｂタンパク質の両方からなる５−ＨＴ３受容体のサブクラスのアゴニストまたはアンタゴニストである請求項１５の方法において活性のある化合物。
21. ５−ＨＴ３−Ｂサブユニットの発現のモジュレーターである請求項１５の方法において活性のある化合物。
22. 請求項１５の方法において活性のある化合物を含んでなる製薬学的組成物であって、該化合物がヒト５−ＨＴ３−Ｂサブユニット活性のモジュレーターである製薬学的組成物。
23. 請求項１５の方法において活性のあるヒト５−ＨＴ３−Ｂ調節化合物の投与を含んでなる、そのような処置を必要とする患者のヒト５−ＨＴ３−Ｂを含有するセロトニン受容体によりもたらされる症状を処置する方法。

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