ES2300318T3 - Adn codificante para el receptor humano de la vainilloide vr3. - Google Patents

Abstract

Una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:7 o 9.

Description

ADN codificante para el receptor humano de la vainilloide VR3.

Antecedentes de la invención

Los estímulos químicos, térmicos y mecánicos nocivos estimulan las terminaciones nerviosas de las neuronas sensoriales de diámetro pequeño (nociceptores) en los ganglios sensoriales (p. ej., raíz dorsal, ganglios nodosos y del trigémino) e inician señales que son percibidas como dolor. Estas neuronas son cruciales para la detección de los estímulos perjudiciales o potencialmente perjudiciales (calor) y la lesión tisular (H^{+} (acidosis tisular local), y/o tensión) que surgen de cambios en el espacio extracelular durante las condiciones inflamatorias o isquémicas (Wall y Melzack, 1994). El vainilloide capsaicina (8-metil-N-vainillil-6-nonenamida), el principal ingrediente picante en los pimientos capsicum "picantes", es un activador muy selectivo de los aferentes nociceptivos con una capa fina de mielina o sin ella (Szolcsanyi, 1993; Szolcsanyi, 1996). Los estudios electrofísicos han demostrado que los vainilloides excitan las neuronas sensoriales pequeñas activando un canal de membrana plasmática que no es selectivamente permeable a los cationes (Bevan y Szolcsanyi, 1990; Oh et al., 1996; Wood et al., 1988). El ultrapotente diterpeno tricíclico resiniferatopxina de las plantas de Euphorbia (RTX; (Szolcsanyi et al., 1991)) se une con una afinidad nanomolar en el sitio de unión de la capsaicina y se ha revelado una distribución muy localizada de los receptores de capsaicina para las neuronas sensoriales primarias somáticas y viscerales de rata (Szallasi, 1995).

Se piensa que el receptor vainilloide VR1 (Caterina et al., 1997) es un receptor sensible al calor cuyo umbral disminuye en presencia de protones o capsaicina (Tominaga et al., 1998). La capsaicina y los protones interaccionan en sitios de reconocimiento de membrana específicos (receptores vainilloides) expresados casi exclusivamente por las neuronas sensoriales primarias implicadas en la nocicepción y la inflamación neurogénica (Bevan y Szolcsanyi, 1990). El receptor vainilloide ("capsaicina") VR1 es activado por la capsaicina y RTX, y la activación de VR1 es bloqueada por los antagonistas capsazepina (CPZ; (Bevan et al., 1992)) y rojo de rutenio (RR; (Caterina et al., 1997: Wood et al., 1988)).

El análisis del carácter hidropático de la secuencia de aminoácidos de VR1 revela 6 regiones potenciales que abarcan la membrana (S1-S6) y una supuesta región pobre en bucles entre S5 y S6. Un gran dominio intracelular contiene 3 dominios repetidos de anquirina (Caterina et al., 1997). Este canal tiene similitudes estructurales significativas con la supuesta familia del canal del calcio TRP "operados por reservorios". VR1 es un canal de cationes no selectivo dependiente del ligando que muestra una rectificación hacia afuera pronunciada (Caterina et al., 1997). Importantemente, VR1 es muy permeable a Ca^{2+}, un ión conocido por ser muy importante en la regulación de la función celular ((Blackstone y Sheng, 1999; Gupta y Pushkala, 1999; van Haasteren et al., 1999)).

La búsqueda de bases de datos genómicas ha revelado VRL-1, una subunidad relacionada estructuralmente con VR1. VLR-1 de rata y humana (AF129113 y AF129112, respectivamente) son idénticas en un -49% y similares en un 66% a VR1 de rata (AF029310)) (Caterina et al., 1999). La proteína VRL humana (AF103906) clonada por Wood y col. (no publicada) es idéntica en un 99% a VRL-1 (AF129112). Recientemente, se publicó una solicitud de patente de Partiseti y Renard que describía hVRCC (canal catiónico de tipo receptor vainilloide humano) que es casi idéntico a AF129112 (la única diferencia es la deleción de Q418). Los autores de la presente invención se referirán a estas secuencias como VR2. En conjunto, la estructura pronosticada de VR1 y VR2 es característica de una familia de canales iónicos definida por los canales de potencial receptor transitorio (TRP) clonada originalmente de Drosophila melanogaster, un canal permeable al Ca que juega un papel en la fototransducción (Lu y Wong, 1987; Minke y Selinger, 1996). Este receptor también parece estar implicado en la sensación de calor que produce dolor (Caterina et al., 1999). La expresión de VR2 en oocitos y células HEK confería normalmente una sensibilidad de las células a las temperaturas nocivas (>53ºC), que no era sensibles a CPZ pero era bloqueada casi completamente con rojo de rutenio 10 \muM. La activación de VR2 induce una corriente catiónica no selectiva con una elevada permeabilidad al Ca^{2+}. Interesantemente, el umbral para la sensibilidad al calor disminuía con la aplicación repetida de estímulos nocivos, pero no de temperaturas por debajo del umbral (Caterina et al., 1999).

Se piensa que el canal SIC de rata (canal inhibido por el estiramiento; Genbank AB015231), codificado por 529 aminoácidos, forma un canal iónico inhibido por el estiramiento (Suzuki et al., 1999). Los primeros 379 aminoácidos son homólogos a VR1 de rata. SIC carece del gran dominio citoplásmico N-terminal de la familia VR pero contiene una secuencia homóloga al exón A antes del supuesto TM1. Los últimos 163 aminoácidos, comenzando en el centro del supuesto TM6 de SIC de rata son similares a la correspondiente secuencia de aminoácidos de VR3 A+B- humano de la presente invención.

La presente invención describe la clonación y la función de un nuevo miembro de la familia de receptores vainilloides, VR3. Este gen parece estar empalmado alternativamente para crear al menos 3 isoformas.

Compendio de la invención

Las moléculas de ADN que codifican las 3 isoformas del receptor vainilloide humano 3 (hVR3) han sido clonadas y caracterizadas. Las propiedades biológicas y estructurales de estas proteínas están descritas, como lo están la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos. La proteína recombinante es útil para identificar los moduladores del receptor VR3. Los moduladores identificados en el análisis descrito en la presente memoria son útiles como agentes terapéuticos, que son candidatos para el tratamiento de las condiciones inflamatorias y para su uso como analgésicos para el dolor intratable asociado con la neuralgia postherpética, la neuropatía diabética, el dolor post-mastectomía, los síndromes de dolor regional complejo, la artritis (p. ej., reumatoide y osteoartritis), así como las úlceras, las enfermedades neurodegenerativas, el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el síndrome del intestino irritable, y la psoriasis. Los usos incluyen el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades del tracto intestinal, proliferación anormal y cáncer especialmente en el sistema digestivo, la próstata y las gónadas femeninas, úlceras, enfermedades del hígado, enfermedades del riñón, control de vísceras innervadas por los ganglios de la raíz dorsal, o para diagnosticar o tratar cualquier trastorno relacionado con la expresión anormal de estos polipéptidos hVR3, entre otros. En otro aspecto, la invención hace referencia a los métodos para identificar los agonistas y antagonistas utilizando los materiales proporcionados por la invención, y tratar las afecciones asociadas con el desequilibrio de hVR3. Las moléculas de ADN recombinante, y las porciones de las mismas, son útiles para aislar homólogos de las moléculas de ADN, identificando y aislando los homólogos de las moléculas de ADN, identificando y aislando los equivalentes genómicos de las moléculas de ADN, e identificando, detectando o aislando las formas mutantes de las moléculas de ADN.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - SEQ ID NO:5. Secuencia de nucleótidos VR3A+B- humano de la región codificadora (2616 pb).

Figura 2 - SEQ ID NO:6. Se muestra la secuencia de nucleótidos de VR3A+B- humano incluyendo la región no traducida de 337 pb 5' (UT) y de 547 pb 3'UT (3500 pb).

Figura 3 - SEQ ID NO:7. Secuencia codificadora para VR3A+B- humano (871 aminoácidos)

Figura 4 - SEQ ID NO:8. Secuencia de nucleótidos de VR3A-B- humano de la región codificadora (2436 pb).

Figura 5 - SEQ ID NO:9. Secuencia codificadora para VR3A-B- humano (811 aminoácidos)

Figura 6 - SEQ ID NO: 10. Secuencia de nucleótidos de VR3A+B+ humano de la región codificadora (2229 pb).

Figura 7 - SEQ ID NO: 11. Se muestra la secuencia de nucleótidos de VR3A+B+ humano incluyendo los 836 pb 5' UT y los 994 pb 3'UT (4059 pb).

Figura 8 - SEQ ID NO: 12. Secuencia codificadora para VR3A+B+ humano (742 aminoácidos)

Figura 9 - Se muestra la expresión funcional de las isoformas de VR3 en oocitos de Xenopus: la viabilidad de oocitos mantenida en ND-96 con 2 Ca^{2+} disminuía significativamente 4-6 días después de la inyección con 3,25 ng de ARNc de VR3 A+B- y VR3 A+B+ (5 ng) pero no de VR3 A-B- (1,5 ng). Los datos para los oocitos a los que se inyectó VR3 A+B- y agua se obtuvieron de 5 experimentos diferentes. Los oocitos muertos se determinaron visualmente. Los datos se analizaron utilizando el análisis de la Chi cuadrado.

Figura 10 - Función en oocitos: las isoformas de VR3 están activadas por el calor. A. Se muestra la corriente del pico principal obtenida mediante una transición de calor de 25ºC a 46ºC y mantenida a 46ºC durante al menos 15 segundos. La corriente es el incremento sobre la corriente inicial a +80 mV. Las transiciones de voltaje se aplicaron de -120 a +80 mV a lo largo de 400 mseg cada 2 seg. Los oocitos se inyectaron con 3,25, 1,25 y 5 ng de ARNc de VR3 A+B-, A-B-, y A+B+, respectivamente, y se registraron hasta 6 días más tarde. Barra sólida: controles a los que se inyectó agua (n=8); barra transparente: isoforma VR3 A+B- (n= 11); barra sombreada: isoforma VR3 A-B- (n=8); barra punteada: isoforma VR3 A+B+ (n=5). Todas las isoformas muestran un incremento significativo sobre los controles con agua (p = 0,001, 0,03 y 0,007, respectivamente: ensayo de la t de Student). La respuesta inducida por el calor es aproximadamente 2 veces más grande en la isoforma A+B- en comparación con las otras dos isoformas pero las diferencias no son significativas (p = 0,051 y p = 0,16, para A+B- en comparación con A-B- y A+B+, respectivamente). Los datos se obtuvieron de 2 grupos de oocitos inyectados. Los datos mostrados son la media y el error típico de la media. B. Se registraron las corrientes inducidas por la transición de voltaje durante la aplicación de calor creciente a oocitos inyectados con agua (arriba), VR3 A+B- (segundo por arriba), VR3 A-B- (3º por abajo), y VR3A+B+ (abajo). Los oocitos fueron perfundidos constantemente con Ca^{2+} ND-96 y la solución se calentó por medio de un dispositivo calentador en línea (TC-324B junto con el calentador en línea SH- 27A: Warner Instrument Corp.). Se presentan las corrientes inducidas por la transición (en \muA, como se indica en el eje de la y) obtenidas a temperaturas de 37ºC a 46ºC; solamente se marcan con la temperatura correspondiente los vestigios de corriente a las temperaturas más elevadas.

Figura 11 - Función en oocitos: VR3A+B- confiere sensibilidad al rojo de rutenio 10 \muM para la corriente activada por perfusión (I_{perfusión}) observada en oocitos que expresan VR1 inducidos por perfusión celular mediante soluciones salinas extracelulares. La activación de I_{perfusión} por una perfusión incrementada fue bloqueada por rojo de rutenio solamente en oocitos que expresaban VR1 a los que se había inyectado ARNc de VR3 A+B-, y no en oocitos que expresaban solamente VR1. (a). Se sensibilizó un oocito al que se había inyectado ARNc de VR [4 ng] con transiciones de voltaje entre -120 y +80 mV a lo largo de 400 mseg a partir de un potencial de mantenimiento de -70 mV. Las corrientes inducidas por la transición aumentaron después del comienzo de la perfusión del oocito a una velocidad de 10 ml/min. La preincubación con rojo de rutenio 10 \muM durante 0,5 minutos bloqueó la corriente. El bloqueo era parcialmente reversible (no mostrado). (b). Un oocito al que se había inyectado ARNc de VR1 [4 ng] junto con VR3 A+B- [1,3 ng] se sensibilizó con transiciones de voltaje entre -120 y +80 mV a lo largo de 400 mseg desde un potencial de mantenimiento de -70 mV. Las corrientes inducidas por la transición aumentaron después del comienzo de la perfusión del oocito a una velocidad de 10 ml/min. La preincubación con rojo de rutenio 10 \muM durante 0,5 min tuvo un efecto pequeño sobre I_{perfusión}. La I_{perfusión} tenía magnitudes similares en ambos grupos de oocitos. Vrev para la corriente inhibida por RR fue de aproximadamente -13 mV (flecha).

Figura 12 - Función en oocitos: VR3A+B- junto con VR1. La magnitud y la cinética de decaimiento de la respuesta a la capsaicina 1 \muM disminuyó cuando se expresaba simultáneamente ARNc de VR1 con ARNc de VR3 A+B- a razones iguales [2,9 ng cada uno].

Figura 13 - El análisis de la distribución de la matriz de ADN indica que los ARNm de hVR3 son expresados en una variedad de tejidos, y existe cierto solapamiento en una variedad de tejidos, y existe cierto solapamiento de la expresión con VR1 a nivel del tejido completo. La secuencia de ADN utilizada en la matriz de ADN no está presente en A+B+, solamente en las isoformas A+B- y A-B-. Obsérvese que la especie de ADNc fue clonada de las glándulas pituitaria y prostática.

Descripción detallada

La presente invención describe 3 isoformas de un receptor vainilloide humano, denominado VR3: VR3A+B-, VR3A-B-, y VR3A+B+. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc del receptor VR3 humano revelaron un único marco de lectura abierto grande de aproximadamente 2616 (Figura 1), 2436 (Figura 4) y 2229 (Figura 6) pares de bases que codifican 871 (Figura 3), 811 (Figura 5), y 742 (Figura 8) aminoácidos para VR3 A+B-, A-B- y A+B+ humano, respectivamente. El ADNc para VR3 A+B- tiene prolongaciones 5' y 3'-no traducidas de aproximadamente 337 y aproximadamente 547 nucleótidos, como se muestra en la Figura 2, donde la 5'UTR es 1-337, la región codificadora es 338-2953, y la 3'UTR es 2954-3500. El ADNc para VR3 A+B+ tiene prolongaciones 5' y 3'-no traducidas de aproximadamente 836 y aproximadamente 994 nucleótidos como se muestra en la Figura 7, donde la 5'UTR es 1-836, la región codificadora es 837-3065, y la 3'UTR es 3066-4059. La primera metionina en marco fue diseñada como el codón de iniciación para un marco de lectura abierto que pronostica las proteínas receptoras VR3 humanas con una masa molecular estimada (M_{r}) de aproximadamente 98.242 Da, 91.294 Da y 83.310 Da para las isoformas A+B-, A-B- y A+B+, respectivamente. La isoforma A+B- codifica una proteína de 871 aminoácidos. El VR3 A-B- contiene una deleción de 60 aminoácidos desde el aminoácido 382 al 441 de VR3A+B-. VR3 A+B+ es idéntico a A+B- hasta el aminoácido 736 después de lo cual hay 6 aminoácidos divergentes y un codón de parada. La isoforma A+B+ de VR3 se extiende 20 aminoácidos después del supuesto TM6.

Las proteínas receptoras VR3 humanas pronosticadas fueron alineadas con las bases de datos de nucleótidos y proteínas y están relacionadas con la familia de los receptores vainilloides (VR1 y VR2). Existen numerosos motivos conservados encontrados en esta familia de receptores incluyendo un gran supuesto segmento hidrófilo N-terminal (aproximadamente 467 aminoácidos), tres supuestos dominios de repetición de anquirina en la región del extremo N, 6 regiones transmembrana pronosticadas y una región del poro. VR3 A+B- es idéntico en un 43% a VR1 humano, idéntico en un 39% tanto a VRL-1 humano (AF129112) como VRL humano (AF103906). De este modo el receptor VR3 descrito en la presente memoria es claramente un gen novedoso de la familia de receptores vainilloides.

Las formas VR3A+B- y VR3A-B- humanas son similares al canal inhibido por el estiramiento SIC de rata [Acceso Genbank AB015231] desde el aminoácido 694 al extremo. Se piensa que el SIC de rata, codificado por 529 aminoácidos, forma un canal iónico inhibido por el estiramiento. Carece del gran dominio citoplásmico N-terminal de la familia VR pero contiene una secuencia homóloga al exón A antes del supuesto TM1.

La secuencia genómica completa de las regiones codificadoras de VR3 descrita en la presente memoria parece encontrarse en un envío de secuencias "submission" de la secuencia de 380512 pares de bases de Genbank (clon de homo sapiens RPCI1-7G5 (AC007834), envío de secuencias directo por Worley, K.C.). Esta entrada de Genbank enumera muchos fragmentos de la secuencia de ADN y una secuencia contigua propuesta, pero carece de cualquier análisis de la secuencia de ácido nucleico y no logra caracterizar los rasgos de las secuencias de ácido nucleico de VR3, ni describe la presencia del gen VR3.

Aislamiento del ácido nucleico del receptor VR3 humano

La presente invención hace referencia al ADN que codifica el receptor VR3 humano que fue aislado de células productoras del receptor VR3 humano. El receptor VR3 humano, según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una proteína que puede funcionar específicamente como un receptor vainilloide humano.

La secuencia de aminoácidos completa del receptor VR3 humano no se había mostrado previamente, ni era la secuencia de nucleótidos completa que codificaba el receptor VR3 humano conocido. Se pronostica que una amplia variedad de células y tipos celulares contendrán el receptor VR3 humano descrito.

Otras células y líneas celulares también pueden ser adecuadas para su uso para aislar el ADNc del receptor VR3 humano. La selección de las células adecuadas se puede realizar escrutando la actividad del receptor VR3 humano en extractos celulares o en análisis de células completas, descritos en la presente memoria. Las células que poseen actividad de VR3 humano en cualquiera de estos análisis pueden ser adecuadas para el aislamiento del ADN o el ARNm del receptor VR3 humano.

Se puede utilizar cualquier variedad de procedimientos conocidos en la técnica para clonar molecularmente el ADN del receptor VR3 humano. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la expresión funcional directa de los genes del receptor VR3 humano después de la construcción de una genoteca de ADNc que contiene el receptor VR3 humano en un sistema vector de expresión apropiado. Otro método consiste en escrutar la genoteca de ADNc que contiene el receptor VR3 humano construida en un vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con una sonda oligonucleotídica marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de las subunidades del receptor VR3 humano. Un método adicional consiste en el escrutinio de una genoteca de ADNc que contiene el receptor VR3 humano construido en un vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con un ADNc parcial que codifica la proteína receptora VR3 humana. Este ADNc parcial se obtiene mediante amplificación por PCR específica de fragmentos de ADN del receptor VR3 humano a través del diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora VR3 humana purificada.

Otro método consiste en aislar el ARN a partir de células productoras del receptor VR3 humano y traducir el ARN a proteína por medio de un sistema de traducción in vitro o in vivo. La traducción del ARN a un péptido o proteína dará como resultado la producción de al menos una porción de la proteína receptora VR3 humana que puede ser identificada, por ejemplo, mediante la reactividad inmunológica con un anticuerpo anti-receptor VR3 humano o mediante la actividad biológica de la proteína receptora VR3 humana. En este método, se pueden analizar reservas de ARN aislado de células productoras del receptor VR3 humano en cuanto a la presencia de un ARN que codifica al menos una porción de la proteína receptora VR3 humana. Adicionalmente el fraccionamiento de la reserva de ARN se puede realizar para purificar el ARN del receptor VR3 humano a partir del ARN del receptor VR3 no humano. La proteína o péptido producido mediante este método se puede analizar para proporcionar secuencias de aminoácidos que a su vez se utilizan para proporcionar cebadores para la producción de ADNc del receptor VR3 humano, o se puede analizar el ARN utilizado para la traducción para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican el receptor VR3 humano y producir sondas para esta producción de ADNc del receptor VR3 humano. Este método es conocido en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. 1989.

Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que pueden resultar útiles otros tipos de genotecas, así como genotecas construidas a partir de otras células o tipos celulares, para aislar el ADN del receptor VR3 humano. Otros tipos de genotecas incluyen, pero no están limitados a, genotecas de ADNc derivadas de otras células, de organismos distintos del receptor VR3 humano, y genotecas de ADN genómico que incluyen YAC (cromosomas artificiales de levadura) y genotecas de cósmidos.

Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que se pueden preparar genotecas de ADNc adecuadas a partir de células o líneas celulares que tienen actividad de receptor VR3 humano. La selección de células o líneas celulares para su uso en la preparación de una genoteca de ADNc para aislar el ADNc del receptor VR3 humano se puede realizar midiendo primero la actividad del receptor VR3 humano asociada a la célula utilizando la medida de la actividad biológica asociada al receptor VR3 humano o un análisis de unión al ligando.

La preparación de genotecas de ADNc se puede realizar mediante mecanismos normalizados bien conocidos en la técnica. Se pueden encontrar mecanismos de construcción de genotecas de ADNc bien conocidos por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E.F.. Sambrook, J.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Asimismo es fácilmente evidente para los expertos en la técnica que el ADN que codifica el receptor VR3 humano también puede ser aislado a partir de una genoteca adecuada de ADN genómico. La construcción de genotecas de ADN genómico se puede realizar mediante mecanismos normalizados bien conocidos en la técnica. Los mecanismos de construcción de genotecas de ADN genómico bien conocidos se pueden encontrar en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Con el fin de clonar el gen del receptor VR3 humano por los métodos anteriores, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos del receptor VR3 humano. Para completar esto, se puede purificar la proteína receptora VR3 humana y determinar la secuencia de aminoácidos parcial por medio de secuenciadores automatizados. No es necesario determinar la secuencia de aminoácidos completa, si no que se determina la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína para la producción de cebadores para la amplificación mediante PCR de un fragmento de ADN del receptor VR3 humano parcial.

Una vez que se han identificado las secuencias de aminoácidos adecuadas, se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Debido a que el código genético es degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de una serie de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro de la serie será idéntico a la secuencia del receptor VR3 humano pero será capaz de hibridar con al ADN del receptor VR3 humano incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos. Los oligonucleótidos de ADN emparejados erróneamente todavía hibridarán suficientemente con el ADN del receptor VR3 humano para permitir la identificación y el aislamiento del ADN que codifica el receptor VR3 humano. El ADN aislado mediante estos métodos se puede utilizar para escrutar genotecas de ADN de una variedad de tipos celulares, de fuentes invertebradas y vertebradas, y para aislar genes homólogos.

El receptor VR3 humano biológicamente activo purificado puede tener varias formas físicas diferentes. El receptor VR3 humano puede existir en forma de un polipéptido naciente o no procesado completo, o en forma de un polipéptido parcialmente procesado o combinaciones de polipéptidos procesados. El polipéptido del receptor VR3 humano naciente completo puede ser modificado post-traduccionalmente por medio de eventos de escisión proteolítica específica que da como resultado la formación de fragmentos del polipéptido naciente completo. Un fragmento, o asociación física de fragmentos pueden tener toda la actividad biológica asociada con el receptor VR3 humano no obstante, el grado de actividad del receptor VR3 humano puede variar entre los fragmentos de receptor VR3 humano individuales y los fragmentos de polipéptido de VR3 humano asociados físicamente.

Debido a que el código genético es degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de un grupo de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del grupo será idéntico a la secuencia del receptor VR3 humano pero será capaz de hibridar con el ADN del receptor VR3 humano incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos en condiciones apropiadas. En condiciones alternativas, los oligonucleótidos de ADN emparejados erróneamente todavía pueden hibridar con el ADN del receptor VR3 humano para permitir la identificación y aislamiento de ADN que codifica el receptor VR3 humano.

El ADN que codifica el receptor VR3 humano a partir de un organismo concreto se puede utilizar para aislar y purificar homólogos del receptor VR3 humano de otros organismos. Para lograr esto, se puede mezclar el primer ADN del receptor VR3 humano con una muestra que contiene ADN que codifica homólogos del receptor VR3 humano en condiciones de hibridación apropiadas. El complejo de ADN hibridado se puede aislar y el ADN que codifica el ADN homólogo se puede purificar de allí.

Se sabe que existe una cantidad sustancial de redundancia en los diversos codones que codifican los aminoácidos específicos. Por lo tanto, esta invención también está dirigida a aquellas secuencias de ADN que contienen codones alternativos que codifican la traducción definitiva del aminoácido idéntico. Para los fines de esta memoria, una secuencia que porta uno o más codones remplazados se definirá como una variación degenerada. También están incluidas en el alcance de esta invención las mutaciones o bien en la secuencia de ADN o bien en la proteína traducida que no alteran sustancialmente las propiedades físicas finales de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina, o asparragina por glutamina pueden no causar cambios en la funcionalidad del polipéptido. Tales sustituciones son bien conocidas y se describen, por ejemplo en Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed. Benjamin Cummings Pub. Co. de Watson et al.

Se sabe que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden ser alteradas con el fin de que codifiquen un péptido que tenga propiedades que sean diferentes de las del péptido de origen natural. Los métodos de alteración de las secuencias de ADN incluyen, pero no están limitados a la mutagénesis dirigida al sitio, la sustitución quimérica, y las fusiones génicas. La mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para cambiar uno o más restos del ADN que puede dar como resultado una mutación silenciosa, una mutación conservativa, o una mutación no conservativa. Los genes quiméricos se preparan intercambiando dominios de genes similares o diferentes para remplazar dominios similares en el gen del receptor VR3 humano. De un modo similar, se pueden preparar genes de fusión que añaden dominios al gen del receptor VR3 humano, tal como una etiqueta de afinidad para facilitar la identificación y el aislamiento del gen. Se pueden preparar genes de fusión para remplazar regiones del gen del receptor VR3 humano, por ejemplo para crear una versión soluble de la proteína eliminando un dominio transmembrana o añadiendo una secuencia de redireccionamiento para redirigir el transporte normal de la proteína, o añadiendo nuevas secuencias de modificación post-traduccional al gen del receptor VR3 humano. Los ejemplos de las propiedades alteradas incluyen pero no están limitados a cambios en la afinidad de una enzima por un sustrato o de un receptor por un ligando.

Según se utiliza en la presente memoria, un "derivado funcional" del receptor VR3 humano es un compuesto que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la actividad biológica del receptor VR3 humano. Se pretende que el término "derivados funcionales" incluya los "fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o los "derivados químicos" del receptor VR3 humano. Se pretende que el término "fragmento" haga referencia a cualquier subgrupo de polipéptidos del receptor VR3 humano. Se pretende que el término "variante" haga referencia a una molécula sustancialmente similar en estructura y función o bien a la molécula del receptor VR3 humano completa o bien a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" al receptor VR3 humano si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Por lo tanto, si las dos moléculas poseen una actividad sustancialmente similar, se considera que son variantes incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" hace referencia a una molécula sustancialmente similar en función a la molécula del receptor VR3 humano completa o a un fragmento de la misma.

Expresión recombinante del receptor VR3 humano

El ADN del receptor VR3 humano clonado obtenido por medio de los métodos descritos en la presente memoria puede ser expresado recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y transferido a células anfitrionas procarióticas o eucarióticas para producir la proteína receptora VR3 humana recombinante. Los mecanismos para tales manipulaciones se describen cuidadosamente en Maniatis, T, et al. supra, y son bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión se definen en la presente memoria como secuencias de ADN que son requeridas para la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un anfitrión apropiado. Tales vectores se pueden utilizar para expresar genes eucarióticos en una variedad de anfitriones tales como bacterias incluyendo E. coli, algas verde-azuladas, células vegetales, células de insectos, células fúngicas incluyendo células de levadura, y células animales.

Los vectores diseñados específicamente permiten lanzar el ADN entre anfitriones tales como bacterias-levaduras o bacterias-células animales o bacterias-células fúngicas o bacterias-células de invertebrados. Un vector de expresión construido apropiadamente debe contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células anfitrionas, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios para enzimas de restricción útiles, un potencial de elevado número de copias, y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa a unirse al ADN e inicia la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que hace que los ARNm se inicien con una frecuencia elevada. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no están limitados a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados específicamente o virus.

Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión de mamíferos para expresar el receptor VR3 Humano recombinante en células de mamífero. Los vectores de expresión en mamíferos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del receptor VR3 Humano recombinante incluyen, pero no están limitados a, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (In Vitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565).

Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión bacterianos para expresar el receptor VR3 humano recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del receptor VR3 humano recombinante incluyen, pero no están limitados a vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen).

Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión en células fúngicas para expresar el receptor VR3 humano recombinante en células fúngicas tales como levaduras. Los vectores de expresión en células fúngicas disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del receptor VR3 humano recombinante incluyen, pero no están limitados a pYES2 (In Vitrogen) y vector de expresión en Pichia (In Vitrogen). Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión en células de insecto para expresar el receptor VR3 humano recombinante en células de insecto. Los vectores de expresión en células de insecto disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión recombinante del receptor VR3 humano incluyen, pero no están limitados a pBlueBacII (In Vitrogen).

El ADN que codifica el receptor VR3 humano puede ser clonado en un vector de expresión para la expresión en una célula anfitriona recombinante. Las células anfitrionas recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo pero no limitadas a bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de mamífero incluyendo pero no limitados líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedor, y células de insecto incluyendo pero no limitadas a la línea celular derivada de drosophila y de gusano de seda. Las líneas celulares derivadas de especies de mamífero que pueden ser adecuadas y que son asequibles comercialmente, incluyen, pero no están limitadas a CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, y HEK-293 (ATCC CRL1573).

El vector de expresión puede ser introducido en células anfitrionas por medio de una de las numerosas técnicas incluyendo, pero no limitadas a transformación, transfección, fusión de protoplastos, lipofección, y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se propagan clónicamente y se analizan individualmente para determinar si producen la proteína receptora VR3 humana. La identificación de los clones de las células anfitrionas que expresan el receptor VR3 humano se puede realizar mediante varios métodos, incluyendo, pero no limitados a la reactividad inmunológica con anticuerpos anti-receptor VR3 humano, y la presencia de actividad del receptor BR3 humano asociada con las células anfitrionas.

La expresión del ADN del receptor VR3 humano también se puede realizar utilizando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético o el ARNm aislado de células productoras del receptor VR3 Humano puede ser traducido eficazmente en diversos sistemas libres de células, incluyendo pero no limitados a extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como eficazmente traducido en sistemas basados en células, incluyendo pero no limitados a microinyección en oocitos de rana, siendo generalmente preferida la microinyección en oocitos de rana.

Para determinar la secuencia o las secuencias del ADN del receptor VR3 humano que produce niveles óptimos de actividad del receptor VR3 humano y/o proteína receptora VR3 humana, se pueden construir moléculas de ADN de receptor VR3 humano incluyendo, pero no limitadas a:

1

(estos números corresponden al primer nucleótido de la primera metionina y al último nucleótido antes del primer codón de parada) y numerosos constructos que contienen porciones del ADNc que codifica la proteína receptora VR3 humana. Todos los constructos se pueden diseñar para que contengan ninguna, toda o porciones de la región no traducida 5' o 3' del ADNc del receptor VR3 humano. La actividad del receptor VR3 humano y los niveles de expresión de la proteína se pueden determinar después de la introducción, tanto individual como combinada, de estos constructos en células anfitrionas apropiadas. Después de la determinación de la casete de ADN del receptor VR3 humano que produce la expresión óptima en análisis transitorios, este constructo de ADN del receptor VR3 Humano se transfiere a una variedad de vectores de expresión, para su expresión en células anfitrionas incluyendo, pero no limitadas a, células de mamífero, células de insecto infectadas por baculovirus, E. coli, y la levadura S. cerevisiae.

Métodos de análisis para el receptor VR3 humano

Se pueden utilizar transfectantes de células anfitrionas y oocitos microinyectados para analizar tanto los niveles de actividad del receptor VR3 humano funcional como los niveles de proteína receptora VR3 humana total mediante los siguientes métodos. En el caso de las células anfitrionas recombinantes, esto implica la co-transfección de uno o posiblemente dos o más plásmidos que contienen el ADN del receptor VR3 humano que codifica uno o más fragmentos, subunidades u otro gen funcional. En el caso de los oocitos, esto implica la inyección simultánea de los ARN sintéticos para la proteína receptora VR3 humana. Después de un período de tiempo apropiado para permitir la expresión, la proteína celular es marcada metabólicamente, por ejemplo con metionina-S^{35} durante 24 horas, después de lo cual se recogen los productos lisados celulares y los sobrenadantes de cultivo celulas y se someten a inmunoprecipitación con anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína receptora VR3 humana.

Los niveles de proteína receptora VR3 humana en las células anfitrionas se cuantifican mediante mecanismos de inmunoafinidad y/o afinidad por el ligando. Se utilizan cuentas de afinidad específica por el receptor VR3 humano o anticuerpos específicos del receptor VR3 humano para aislar por ejemplo la proteína receptora VR3 humana marcada con metionina-S^{35} o no marcada. La proteína receptora VR3 humana marcada se analiza mediante SDS-PAGE. La proteína receptora VR3 humana no marcada se detecta mediante transferencia Western, ELISA o análisis RIA empleando anticuerpos específicos del receptor Vr3 humano.

Otros métodos para detectar la actividad del receptor VR3 humano implican la medida directa de la actividad del receptor VR3 humano en células completas transfectadas con ADNc del receptor VR3 humano u oocitos inyectados con ARNm de receptor VR3 humano. La actividad del receptor VR3 humano se mide mediante unión específica al ligando o características biológicas de las células anfitrionas que expresan el ADN del receptor VR3 humano. En el caso de las células anfitrionas recombinantes que expresan el receptor VR3 humano se pueden utilizar técnicas de pinzamiento zonal de voltaje para medir la actividad del canal y cuantificar la proteína receptora VR3 humana. En el caso de los oocitos se pueden utilizar las técnicas de pinzamiento zonal así como pinzamiento zonal de voltaje de dos electrodos para medir la actividad del canal de calcio y cuantificar la proteína receptora VR3 humana.

Análisis basados en células

La presente invención proporciona un método con células completas para detectar la modulación del receptor VR3 humano. El método comprende las etapas de;

1)

poner en contacto un compuesto, y una célula que contiene el receptor VR3 humano funcional, y

2)

medir un cambio en la célula en respuesta a la función del receptor VR3 humano modificada por el compuesto.

La cantidad de tiempo necesario para el contacto celular con el compuesto se determina empíricamente, por ejemplo, haciendo pasar un lapso de tiempo con un modulador del receptor VR3 humano conocido y midiendo los cambios celulares como una función del tiempo.

Los medios de medida del método de la presente invención se pueden definir adicionalmente comparando una célula que ha sido expuesta a un compuesto con una célula idéntica que no ha sido expuesta de un modo similar al compuesto. Alternativamente dos células, una que contiene receptor VR3 humano funcional y una segunda célula idéntica a la primera, pero que carece de receptor VR3 humano funcional se podrían poner en contacto con el mismo compuesto y comparar las diferencias entre las dos células. Esta técnica también es útil en el establecimiento del ruido de fondo de estos análisis. Un experto medio en la técnica apreciará que estos mecanismos de control también permiten la fácil selección de cambios celulares que son sensibles a la modulación del receptor VR3 humano funcional.

El término "célula" hace referencia al menos a una célula, pero incluye una pluralidad de células apropiadas para la sensibilidad del método de detección. Las células adecuadas para la presente invención pueden ser bacterianas, de levadura, o eucarióticas.

Los métodos de análisis para determinar la modulación por el compuesto del receptor VR3 humano funcional pueden estar en un formato de laboratorio convencional o adaptado para un elevado rendimiento. El término "elevado rendimiento" hace referencia a un diseño de análisis que permite un análisis fácil de múltiples muestras simultáneamente, y con capacidad de manipulación robótica. Otro rasgo deseado de los análisis de elevado rendimiento es un diseño de análisis que está optimizado para reducir el uso de reactivos, o minimizar el número de manipulaciones con el fin de lograr el análisis deseado. Los ejemplos de los formatos de análisis incluyen pero no están limitados a, las placas de 96 pocillos o de 384 pocillos, las gotitas levitantes, y chips de microcanales "laboratorio en un chip" utilizados para experimentos de manipulación de líquidos. Es bien sabido por los expertos en la técnica que a medida que avanzan la miniaturización de los moldes de plástico y los dispositivos de manipulación de líquidos, o a medida que se diseñan dispositivos de análisis mejorados, se pueden realizar un número mayor de muestras utilizando el diseño de la presente invención.

Los cambios celulares adecuados para el método de la presente invención comprenden medir directamente los cambios en la actividad, función o cantidad de receptor VR3 humano, o midiendo los efectos aguas abajo de la función del receptor VR3 humano, por ejemplo midiendo las concentraciones del segundo mensajero o los cambios en la transcripción o mediante los cambios en los niveles de proteína de los genes que están influenciados transcripcionalmente por el receptor VR3 humano, o midiendo los cambios fenotípicos en la célula. Los medios de la realización preferida incluyen cambios en la cantidad de proteína receptora VR3 humana, cambios en la actividad funcional del receptor VR3 humano, cambios en la cantidad de ARNm, cambios en la proteína intracelular, cambios en la proteína de la superficie celular, o en la proteína secretada, o cambios en la concentración de Ca+2, AMPc o GTP. Los cambios en la cantidad o actividad funcional del receptor VR3 humano se describen en la presente memoria. Los cambios en los niveles de ARNm se detectan mediante una transcripción inversa acoplada a una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) o mediante expresión génica diferencial. La inmunoafinidad, la afinidad por el ligando, o la medida enzimática cuantifica los cambios inducidos por VR3 en los niveles de proteínas específicas en las células anfitrionas. Cuando la proteína es una enzima, la inducción de la proteína se controla mediante la escisión de un sustrato fluorogénico o colorimétrico.

Los medios de detección preferidos para la proteína de la superficie celular incluyen la citometría de flujo o la formación de imágenes celulares estadísticas. En ambas técnicas la proteína de interés se localiza en la superficie celular, se marca con una sonda fluorescente específica, y se detecta por medio del grado de fluorescencia celular. En la citometría de flujo, las células se analizan en una solución, mientras en las técnicas de formación de imágenes celulares, se compara un campo de células en cuanto a la fluorescencia relativa.

La presente invención también está dirigida a métodos de escrutinio para compuestos que modulan la expresión del ADN o el ARN que codifica el receptor VR3 humano así como la función de la proteína receptora VR3 humana in vivo.

Los compuestos pueden modular aumentando o atenuando la expresión del ADN o el ARN que codifica el receptor VR3 humano, o la función de la proteína receptora VR3 humana. Los compuestos que modulan la expresión del ADN o el ARN que codifica el receptor VR3 humano o la función de la proteína receptora VR3 humana pueden ser detectados mediante una variedad de análisis. El análisis puede ser un simple análisis "si/no" para determinar si hay un cambio en la expresión o la función. El análisis puede ser cuantitativo comparando la expresión o función de una muestra de ensayo con los niveles de expresión o función en una muestra normalizada. Los moduladores identificados en este procedimiento son útiles como agentes terapéuticos, y receptor VR3 humano.

Purificación de la proteína receptora VR3 humana

Después de la expresión del receptor VR3 humano en una célula anfitriona recombinante, la proteína receptora VR3 humana puede ser recuperada para proporcionar el receptor VR3 humano purificado. El receptor VR3 humano recombinante puede ser purificado a partir de productos lisados y extractos celulares, por medio de diversas combinaciones, o de la aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción con hidroxilapatita y cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía con lectina, y cromatografía de afinidad anticuerpo/ligando.

El receptor VR3 humano recombinante se puede separar de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad elaborada con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el receptor VR3 humano naciente completo, fragmentos polipeptídicos del receptor VR3 humano o subunidades del receptor VR3 humano. La resina de afinidad se equilibra después en un tampón adecuado, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3), y los sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que contienen el receptor VR3 humano o las subunidades del receptor VR3 humano se hacen pasar lentamente a través de la columna. La columna se lava después con el tampón hasta que la densidad óptica (A_{280}) cae hasta el fondo, después la proteína se hace eluir cambiando las condiciones del tampón, por ejemplo disminuyendo el pH utilizando un tampón tal como glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6). La proteína receptora VR3 humana purificada se somete a diálisis después frente a un tampón adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato.

Producción y uso de anticuerpos que se unen al receptor VR3 humano

Los anticuerpos monoespecíficos para el receptor VR3 humano se purifican a partir de antisuero de mamífero que contiene anticuerpos reactivos contra el receptor VR3 humano o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con el receptor VR3 humano utilizando la técnica descrita originalmente por Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Los mecanismos inmunológicas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A laboratory manual publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ISBN 0879693142. El anticuerpo monospecífico utilizado en la presente memoria se define como una única especie de anticuerpos o múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogéneas para el receptor VR3 humano. La unión homogénea utilizada en la presente memoria hace referencia a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico, tal como aquellos asociados con el receptor VR3 humano, como se ha descrito antes. Los anticuerpos específicos para el receptor VR3 humano se originan por medio de animales inmunizados tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, siendo preferidos los conejos, con una concentración apropiada de receptor VR3 humano con o sin coadyuvante inmunitario.

El suero preinmunitario se recoge antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 100 mg de receptor VR3 humano asociado con un coadyuvante inmunitario aceptable. Tales coadyuvantes aceptables incluyen, pero no están limitados a, completo de Freund, incompleto de Freund, producto precipitado de alúmina, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial consiste en el receptor VR3 humano, preferiblemente en coadyuvante completo de Freund en múltiples sitios, subcutáneamente (SC), intraperitonealmente (IP) o ambos. Se toman muestras de sangre de cada animal a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente, para determinar el título de los anticuerpos. Los animales pueden recibir o no inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. A aquellos animales que reciben inyecciones de refuerzo se les administra generalmente una cantidad igual del antígeno en coadyuvante incompleto de Freund por la misma ruta. Las inyecciones de refuerzo se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen los títulos máximos. Aproximadamente a los 7 días de cada inmunización de refuerzo o aproximadamente semanalmente después de una única inmunización, se toman muestras de sangre de los animales, se recoge el suero, y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con el receptor VR3 humano se preparan inmunizando ratones endogámicos, preferiblemente Balb/c, en el receptor VR3 humano. Los ratones son inmunizados mediante ruta IP o SC con aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1,0 mg, preferiblemente aproximadamente 0,1 mg, de receptor VR3 humano en aproximadamente 0,1 ml de tampón o solución salina incorporados en un volumen igual de coadyuvante aceptable, como se ha comentado antes. Se prefiere el coadyuvante de Freund, utilizándose el coadyuvante completo de Freund para la inmunización inicial y utilizándose el coadyuvante incompleto de Freund después. Los ratones reciben una inmunización inicial el día 0 y se dejan descansar durante aproximadamente 2 a aproximadamente 30 semanas. Se administran a los ratones inmunizados una o más inmunizaciones de refuerzo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0 mg de receptor VR3 humano en una solución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato por ruta intravenosa (IV). Se obtienen linfocitos, de ratones positivos para el anticuerpo, preferiblemente linfocitos esplénicos separando los bazos de los ratones inmunizados mediante procedimientos normalizados conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mezclando los linfocitos esplénicos con un compañero de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los compañeros de fusión pueden incluir, pero no están limitados a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag4-1; MPC-11; S-194 y Sp2/0, prefiriéndose generalmente Sp2/0. Las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, aproximadamente 1000 mol. en peso, a concentraciones de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan mediante crecimiento en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de hipoxantina, timidina, y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los fluidos sobrenadantes se recogen de los pocillos con crecimiento positivo aproximadamente los días 14, 18, y 21 y se escrutan en cuanto a la producción de anticuerpo mediante un inmunoanálisis tal como un inmunoradioanálisis en fase sólida (SPIRA) utilizando receptor VR3 humano como antígeno. Los fluidos de cultivo también se someten a ensayo en el análisis de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb. Las células de hibridoma de los pocillos positivos para el anticuerpo se clonan mediante un mecanismo tal como la técnica de agar blando de MacPherson, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, Eds., Academic Press, 1973 o mediante la técnica de la dilución limitada.

Los anticuerpos monoclonales son producidos in vivo por medio de ratones Balb/c cebados con inyección de pristano, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con aproximadamente 1 x 10^{6} a aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma al menos aproximadamente 4 días después del cebado. Se recoge fluido de ascitis aproximadamente 8-12 días después de la transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante mecanismos conocidos en la técnica.

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Se lleva a cabo la producción in vitro de mAb anti-receptor VR3 humano haciendo crecer el hibridoma en medio para el cultivo de tejidos bien conocido en la técnica. Se puede realizar el cultivo celular in vitro de alta densidad para producir grandes cantidades de mAb anti-receptor VR3 humano utilizando mecanismos de cultivo en fibra hueca, reactores de arrastre, cultivos en botella Roller, o matraces de agitación conocidos en la técnica. Los mAb se purifican mediante mecanismos conocidos en la técnica.

Se determinan los títulos de anticuerpo de los fluidos de ascitis o cultivo de hibridoma mediante diversos análisis serológicos o inmunológicos que incluyen, pero no están limitados a, técnicas de precipitación, aglutinación pasiva, anticuerpo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA) y técnicas de radioinmunoanálisis (RIA). Se utilizan análisis similares para detectar la presencia de receptor VR3 humano en fluidos corporales o tejidos y extractos celulares.

Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que los métodos descritos antes para producir anticuerpos monoespecíficos se pueden utilizar para producir anticuerpos específicos para fragmentos polipeptídicos del receptor VR3 humano, o polipéptidos del receptor VR3 humano naciente completo, o las subunidades del receptor VR3 humano individuales. Específicamente, resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que se pueden generar anticuerpos monoespecíficos que son específicos solamente para una subunidad del receptor VR3 humano o para la proteína receptora VR3 humana completamente funcional. También es evidente para los expertos en la técnica que se
pueden generar anticuerpos monoespecíficos que inhiben la función normal de la proteína receptora VR3 humana.

Las columnas de afinidad del anticuerpo para el receptor VR3 humano se elaboran añadiendo los anticuerpos a un soporte de gel de manera que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de cuentas de gel. Los enlaces covalentes preferidos se realizan a través de los restos amino, aldehído, o sulfhidrilo contenidos en el anticuerpo. Los métodos para generar grupos aldehído o sulfhidrilo libres en los anticuerpos son bien conocidos en la técnica: los grupos amino son reactivos, por ejemplo, con los ésteres de N-hidroxisuccinimida.

Composiciones para kits que contienen reactivos específicos para el receptor VR3 humano

Se pueden preparar kits que contienen ADN o ARN del receptor VR3 humano, anticuerpos para el receptor VR3 humano, o la proteína receptora VR3 humana. Tales kits se utilizan para detectar el ADN que hibrida con el ADN del receptor VR3 humano o para detectar la presencia de la proteína receptora VR3 humana o de fragmentos peptídicos en una muestra. Semejante caracterización es útil para una variedad de fines incluyendo pero no limitados a análisis forenses, aplicaciones de diagnóstico, y estudios epidemiológicos.

Esta invención hace referencia al uso de polinucleótidos VR3 humanos para su utilización como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen VR3 humano asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede ayudar o definir el diagnóstico de una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad que resulta de la baja expresión o de la expresión excesiva del VR3 humano. Los individuos que portan mutaciones en el gen VR3 humano pueden ser detectados a nivel de ADN por medio de una variedad de mecanismos bien conocidos en la técnica, y descritos en la presente memoria.

Se pueden utilizar las moléculas de ADN, las moléculas de ARN, las proteínas recombinantes y los anticuerpos de la presente invención para escrutar y medir los niveles de ADN del receptor VR3 humano, de ARN del receptor VR3 humano o proteína receptora VR3 humana. Las propias proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y anticuerpos conducen a la formulación de kits adecuados para la detección y la tipificación del receptor VR3 humano. Semejante kit comprendería un portador compartimentado adecuado para contener en un confinamiento cerrado al menos un recipiente. El portador comprendería adicionalmente reactivos tales como proteína receptora VR3 humana recombinante o anticuerpos anti-receptor VR3 humano adecuados para detectar el receptor VR3 humano. El portador también podría contener un medio para la detección tal como un antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Terapia génica

Se pueden sintetizar secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia de ADN que codifica el receptor VR3 humano para la terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales como 2'-O-alquilARN, u otros miméticos oligonucleotídicos antisentido del receptor VR3 humano. Las moléculas antisentido del receptor VR3 humano se pueden introducir en las células mediante microinyección, encapsulación en liposomas o mediante expresión a partir de vectores que albergan la secuencia antisentido. La terapia antisentido del receptor VR3 humano puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que resulta beneficioso reducir la actividad del receptor VR3 humano.

Se puede utilizar la terapia génica con el receptor VR3 humano para introducir el receptor VR3 humano en las células de los organismos diana. El gen del receptor VR3 humano se puede ligar en vectores virales que median la transferencia del ADN del receptor VR3 humano mediante infección de las células anfitrionas receptoras. Los vectores virales adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, virus vacunal, poliovirus y similares. Alternativamente, el ADN del receptor VR3 humano puede ser transferido a células para la terapia génica mediante técnicas no virales incluyendo la transferencia de ADN dirigida mediada por el receptor utilizando los productos conjugados ligando-ADN o los productos conjugados adenovirus-ligando-ADN, la fusión de membranas por lipofección o la microinyección directa. Estos procedimientos y las variaciones de los mismos son adecuados para la terapia génica con el gen del receptor VR3 humano ex vivo así como in vivo. La terapia con el gen del receptor VR3 humano puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que resulta beneficioso elevar la actividad del receptor VR3 humano. Los protocolos para la metodología molecular de la terapia génica adecuados para su uso con el gen del receptor VR3 humano se describen en Gene Therapy Protocols, editado por Paul D. Robbins, Human press, Totawa NJ, 1996.

Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden el ADN del receptor VR3 humano, el ARN del receptor VR3 humano, o la proteína receptora VR3 humana, o moduladores de la actividad del receptor VR3 humano, pueden ser formuladas de acuerdo con los métodos conocidos tales como la mezcla de un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales portadores y métodos de formulación se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína, el ADN, el ARN, o el modulador.

Las composiciones terapéuticas o de diagnóstico de la invención se administran a los individuos en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos en los que está indicada la modulación de la actividad relacionada con el receptor VR3 humano. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo con una variedad de factores tales como el estado del individuo, el peso, el sexo y la edad. Otros factores incluyen el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar al individuo mediante una variedad de rutas tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular.

El término "derivado químico" describe una molécula que contiene radicales químicos adicionales que no son normalmente parte de la molécula base. Tales radicales pueden mejorar la solubilidad, la vida media, la absorción, etc. de la molécula base. Alternativamente los radicales pueden atenuar los efectos secundarios no deseables de la molécula base o disminuir la toxicidad de la molécula base. Los ejemplos de tales radicales se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar solos a dosis apropiadas definidas por el ensayo rutinario con el fin de obtener la inhibición óptima del receptor VR3 humano o su actividad a la vez que minimizan cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la administración simultánea o sucesiva de otros agentes.

La presente invención también tiene el objetivo de proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para su uso en los métodos de tratamiento novedosos de la presente invención. Las composiciones que contienen compuestos o moduladores identificados de acuerdo con esta invención como ingrediente activo para su uso en la modulación del receptor VR3 humano se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación terapéutica en vehículos convencionales para la administración. Por ejemplo, los compuestos o moduladores se pueden administrar en formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación controlada y de liberación sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Del mismo modo, también pueden ser administrados en forma intravenosa (tanto bolo como infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o intramuscular, utilizando todas formas bien conocidas por los expertos normales en las técnicas farmacéuticas. Se puede em-
plear una cantidad eficaz pero no tóxica del compuesto deseado como agente modulador del receptor VR3 humano.

La dosis diaria de los productos puede variar a lo largo de un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por paciente, por día. Para la administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos ranurados o no ranurados que contienen 0,01. 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, y 50,0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente que se va a tratar. La cantidad eficaz del fármaco es suministrada normalmente a un nivel de dosificación de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. El intervalo es más concretamente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones de los moduladores del receptor VR3 humano se ajustan cuando se combinan para lograr los efectos deseados. Por otra parte, las dosificaciones de estos diversos agentes se pueden optimizar y combinar independientemente para lograr un resultado sinérgico en el que la patología se reduce más de lo que lo haría si se utilizara cualquiera de los agentes solo.

Ventajosamente, los compuestos o moduladores de la presente invención se pueden administrar en una única dosis diaria, o se puede administrar la dosis diaria total en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Además, los compuestos o moduladores para la presente invención se pueden administrar en forma intranasal por medio del uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o por medio de rutas transdérmicas, utilizando aquellas formas de parches transdérmicos para la piel bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Para ser administrada en forma de sistema de liberación transdérmica, la administración de la dosificación será, por supuesto, continua en vez de intermitente durante todo el régimen de dosificación.

Para el tratamiento combinado con más de un agente activo, cuando los agentes activos están en formulaciones de dosificación separadas, se pueden administrar a la vez los agentes activos, o se puede administrar cada uno en momentos separadamente escalonados.

El régimen de dosificación que utiliza los compuestos o moduladores de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores incluyendo el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y el estado médico del paciente; la gravedad de la condición que se va a tratar; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente; y del compuesto concreto del mismo empleado. Un médico o veterinario experto normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del fármaco requerida para evitar, contrarrestar o detener el progreso de la afección. La precisión óptima al lograr las concentraciones de fármaco en el intervalo que proporciona eficacia sin toxicidad requiere un régimen basado en la cinética de la biodisponibilidad de los fármacos en los sitios diana. Esto implica una consideración de la distribución, el equilibrio, y la eliminación de un
fármaco.

En los métodos de la presente invención, los compuestos o moduladores de la presente memoria descritos con detalle pueden formar el ingrediente activo, y se administran típicamente mezclados con diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (referidos colectivamente en la presente memoria como materiales "portadores") adecuadamente seleccionados con respecto a la forma de administración pretendida, esto es, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes y similares, y coherentes con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o cápsula, el componente de fármaco activo se puede combinar con un portador inerte farmacéuticamente aceptable no tóxico, oral tal como etanol, glicerol, agua y similares. Por otra parte, cuando se desea o es necesario, también se pueden incorporar a la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen, sin limitación, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantana y similares.

Para las formas líquidas se puede combinar el componente activo en agentes suspensores o dispersantes adecuadamente aromatizados tales como gomas sintéticas y naturales, por ejemplo, tragacanto, acacia, metilcelulosa y similares. Otros agentes dispersantes que se pueden emplear incluyen glicerina y similares. Para la administración parenteral, se desean suspensiones y soluciones estériles. Las preparaciones isotónicas, que contienen generalmente conservantes adecuados, se emplean cuando se desea la administración intravenosa.

Las preparaciones tópicas que contienen el componente fármaco activo se pueden mezclar con una variedad de materiales portadores bien conocidos en la técnica, tales como, p. ej., alcoholes, gel de aloe vera, alantoína, glicerina, aceites con vitamina A y E, aceite mineral, miristilpropionato de PPG2, y similares, para formar, p. ej., soluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas limpiadoras, geles para la piel, lociones para la piel, y champús en crema o formulaciones en gel.

Los compuestos o moduladores de la presente invención también se pueden administrar en forma de sistemas de liberación de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

Los compuestos de la presente invención también se pueden liberar mediante el uso de anticuerpos monoclonales como portadores individuales a los cuales se acoplan las moléculas de compuesto. Los compuestos o moduladores de la presente invención también se pueden acoplar con polímeros solubles tales como portadores de fármacos dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilimetacrilamidofenol, polihidroxi-etilaspartamidofenol, o polietilenoxidopolilisina sustituida con restos palmitoilo. Además, los compuestos o moduladores de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles al lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsiloncaprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloques entrecruzados o anfipáticos de hidrogeles.

Para la administración oral, los compuestos o moduladores se pueden administrar en forma de cápsulas, comprimidos, o bolo o alternativamente se pueden mezclar en el alimento de los animales. Las cápsulas, comprimidos, y bolos están formados por el ingrediente activo combinado con un vehículo portador apropiado tal como almidón, talco, estearato de magnesio, o fosfato dicálcico. Estas formas de dosificación unitaria se preparan mezclando íntimamente el ingrediente activo con ingredientes inertes adecuadamente triturados finamente incluyendo diluyentes, cargas, agentes disgregantes, y/o aglutinantes de manera que se obtenga una mezcla uniforme. Un ingrediente inerte es aquél que no reacciona con los compuestos o moduladores y que no es tóxico para el animal que está siendo tratado. Los ingredientes inertes adecuados incluyen almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, gomas vegetales y aceites, y similares. Estas formulaciones pueden contener una cantidad ampliamente variable de los ingredientes activos e inactivos dependiendo de numerosos factores tales como el tamaño y el tipo de la especie de animal que se va a tratar y del tipo y la gravedad de la infección. El ingrediente activo también se puede administrar como un aditivo del alimento simplemente mezclando el compuesto con el pienso o aplicando el compuesto a la superficie del alimento. Alternativamente el ingrediente activo se puede mezclar con un portador inerte y la composición resultante se puede mezclar después con el alimento o se puede alimentar directamente al animal. Los portadores inertes adecuados incluyen harina de maíz, harina de cítrico, restos de fermentación, fibra de soja, granos secos y similares. Los ingredientes activos se mezclan íntimamente con estos portadores inertes triturando, agitando, moliendo, o volteando de manera que la composición final contenga del 0,001 al 5% en peso del ingrediente activo.

Alternativamente los compuestos o moduladores pueden ser administrados parenteralmente por medio de inyección de una formulación que consiste en el ingrediente activo disuelto en un portador líquido inerte. La inyección puede ser intramuscular, intraluminal, intratraqueal, o subcutánea. La formulación inyectable consiste en el ingrediente activo mezclado con un portador líquido inerte apropiado. Los portadores líquidos aceptables incluyen los aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo y similares así como disolventes orgánicos tales como solketal, glicerol formal y similares. Como alternativa, también se pueden utilizar formulaciones parenterales acuosas. Los aceites vegetales son los portadores líquidos preferidos. Las formulaciones se preparan disolviendo o suspendiendo el ingrediente activo en el portador líquido de manera que la formulación final contenga del 0,005 al 10% en peso del ingrediente activo.

La aplicación tópica de los compuestos o moduladores es posible por el uso de una poción líquida o un champú que contiene los presentes compuestos o moduladores en forma de una solución o suspensión acuosa. Estas formulaciones contienen generalmente un agente suspensor tal como bentonita y normalmente también contendrán un agente antiespumante. Son aceptables formulaciones que contienen del 0,005 al 10% en peso del ingrediente activo. Las formulaciones preferidas son aquellas que contienen del 0,01 al 5% en peso de los presentes compuestos o moduladores.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitar, sin embargo, la misma a estos.

Ejemplo 1 Generación de genotecas de ADNc de próstata y pituitaria humanas. Síntesis de ADNc

Síntesis de la primera hebra: Se utilizaron aproximadamente 5 \mug de ARNm de próstata o pituitaria humanas (Clontech) para sintetizar ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc (Life Technologies). Se añadieron 2 \mul de adaptador cebador Not1 a 5 \mul de ARNm y la mezcla se calentó a 70ºC durante 10 minutos y se colocó sobre hielo. Se añadieron los siguientes reactivos sobre hielo: 4 \mul de 5x tampón de la primera hebra (TRIS-HCl 250 mM (pH 8,3), KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM), 2 \mul de DTT 0,1 M, mezcla de dNTP 10 mM (nucleótido trifosfatos) y 1 \mul de agua tratada con DEPC. La reacción se incubó a 42ºC durante 5 minutos. Finalmente, se añadieron 5 \mul de Superscript RT II y se incubaron a 42ºC durante 2 horas más. La reacción se finalizó sobre hielo.

Síntesis de la segunda hebra: Se ajustó la primera hebra producto a 93 \mul con agua y se añadieron los siguientes reactivos sobre hielo: 30 \mul de 5x tampón de la segunda hebra (TRIS-HCl 100 mM (pH 6,9), KCl 450 mM, MgCl_{2} 23 mM, \beta-NAD+ 0,75 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM, 3 \mul de dNTP 10 mM (nucleótidos trifosfato), 1 \mul de ADN ligasa de E. coli (10 unidades) 1 \mul de ARNasa H (2 unidades), 4 \mul de ADN pol I (10 unidades). La reacción se incubó a 16ºC durante 2 horas. El ADN de la síntesis de la segunda hebra se trató con ADN polimerasa de T4 y se colocó a 16ºC para hacer romos los extremos del ADN. El ADNc de doble hebra se extrajo con 150 \mul de una mezcla de fenol y cloroformo (1:1, v:v) y se hizo precipitar con 0,5 volúmenes de NH40Ac 7,5 M y 2 volúmenes de etanol absoluto. El sedimento se lavó con etanol del 70% y se secó a 37ºC para eliminar el etanol residual. El sedimento de ADN de doble hebra se resuspendió en 25 \mul de agua y se añadieron los siguientes reactivos: 10 \mul de 5x tampón de ADN ligasa de T4, 10 \mul de adaptadores SalI y 5 \mul de ADN ligasa de T4. Los ingredientes se mezclaron suavemente y se ligaron durante la noche a 16ºC. La mezcla de ligación se extrajo con fenol:cloroformo: alcohol isoamílico, se sometió a vórtice cuidadosamente y se centrifugó a la temperatura ambiente durante 5 minutos a 14.000 x g para separar las fases. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y el volumen se ajustó a 100 ml con agua. El ADN purificado se seleccionó por tamaños sobre una columna Chromaspin 1000 (Clontech) para eliminar las moléculas de ADNc más pequeñas. El ADN de doble hebra se sometió a digestión con la enzima de restricción Not1 durante 3-4 horas a 37ºC. El producto de la digestión con enzimas de restricción se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0,8%. El ADNc en el intervalo de 1-5 kb se cortó y se purificó utilizando Gelzyme (In Vitrogen). El producto se extrajo con fenol:cloroformo y se hizo precipitar con NH_{4}OAc y etanol absoluto. El sedimento se lavó con etanol del 70% y se resuspendió en 10 ml de agua.

Ligación de ADNc al Vector: El ADNc se dividió en 5 tubos (2 \mul cada uno) y las reacciones de ligación se ajustaron añadiendo 4,5 \mul de agua, 2 \mul de 5x tampón de ligación, 1 \mul de ADN del vector p-Sport (cortado con Sal-1/Not1 y tratado con fosfatasa) y 0,5 \mul de ADN ligasa de T4. La ligación se incubó a 40ºC durante la noche.

Introducción de ADNc Ligado en E. coli mediante Electroporación

Se ajustó el volumen de la reacción de ligación a un volumen total de 20 \mul con agua. Se añadieron 5 \mul de ARNt de levadura, 12,5 ml de NH_{4}OAc 7,5 M y 70 ml etanol absoluto (-20ºC). La mezcla se sometió a vórtice cuidadosamente, e inmediatamente se centrifugó a la temperatura ambiente durante 20 minutos a 14.000 x g. Los sedimentos se lavaron en etanol del 70% y cada sedimento se resuspendió en 5 ml de agua. Las 5 ligaciones (25 ml) se reunieron y se sometieron a electroporación 100 \mul de células DH10B electrocompetentes (Life Technologies) con 1 ml de ADN (total de 20 electroporaciones), después se cultivaron en placas con ampicilina para determinar el número de recombinantes (cfu) por microlitro. Toda la genoteca se sembró en 2 litros de Super Broth y se realizaron Maxipreps utilizando el kit Promega Maxi Prep y se purificaron en gradientes de cloruro de cesio.

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Ejemplo 2 Escrutinio de la Genoteca/Generación de VR3 A+B+ Humano Escrutinio de genotecas de glándula pituitaria

Se sometieron a electroporación alícuotas de 1 \mul de la genoteca de glándula pituitaria humana en células Electromax DH10B (Life Technologies). El volumen se ajustó a 1 ml con medio SOC y se incubó durante 45 minutos a 37ºC con sacudimiento. La genoteca se cultivó en placa después sobre placas de 150 cm^{2} que contenían LB a una densidad de 20.000 colonias por placa. Estos cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37ºC.

Se generó una sonda de receptor VR3 humano mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando el siguiente par de cebadores:

5' oligo	(SEQ ID NO: 1):	5' ACCGGCCTATCCTCTTTGACATCGTG
3' oligo	(SEQ ID NO: 2):	5' TGTCCGCCTTCTTGTGGGGGTTCTC

La sonda se generó mediante PCR utilizando condiciones de PCR regulares empleando sondas oligonucleotídicas 5' y 3' (100 ng cada una) y 10 ng ADN de miniprep diluido. El fragmento de 493 pb resultante se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% y se purificó utilizando el kit de extracción QUIAquick Gel (Quiagen). Aproximadamente 100 ng de la sonda purificada se marcaron con P32 alfa utilizando un kit de oligomarcaje de Pharmacia y el ADN marcado se purificó con columnas S-200 (Pharmacia).

Las colonias de la genoteca se levantaron sobre filtros de nitrocelulosa Protran (Scheicher & Schuel) y el ADN se desnaturalizó en NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Los discos de filtro se neutralizaron con NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5 y después se entrecruzaron mediante UV con la membrana utilizando un UV-Stratalinker (Stratagene). Los filtros se lavaron varias veces en solución de lavado (Tris-HCl 1 M, pH 8,0; NaCl 5 M: EDTA 0,5 M; SDS al 20%) a 42ºC. Luego se incubaron los discos en 1 x tampón de pre-hibridación southern (5'-3' Inc) que contenía formamida al 50% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla (5'-3' Inc) durante 6 horas a 42ºC. Finalmente, se realizó la hibridación durante la noche a 42ºC en 1 x tampón de hibridación (5'-3') que contenía formamida al 50%, 100 ng de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla en presencia de sonda marcada (5x10^{5} a 1x10^{6} cmp/ml de tampón de hibridación).

Los discos se lavaron dos veces en 2xSSC, SDS al 0,2% a la temperatura ambiente (20 minutos cada uno) y una vez en 0,2xSSC, SDS al 0,1% a 50ºC durante 30 minutos. Las membranas se colocaron después sobre hojas de papel de filtro, se envolvieron en envoltura de plástico y se expusieron a la película a -20ºC durante la noche.

Se identificaron los clones positivos y se recogieron concentrando las colonias de la placa original. Las colonias se incubaron en LB durante 1 hora a 37ºC. Las diluciones de los cultivos se cultivaron en placa sobre placas de agar LB y se repitió el procedimiento de levantamiento del filtro, hibridación, lavado, selección de colonias. Se escogieron clones individuales del segundo escrutinio y se sometieron a digestión con SalI/NotI para determinar el tamaño de los insertos, y se secuenciaron los insertos.

Se generó el clon completo mediante PCR con polimerasa Pfu utilizando 10 ng del clon de la genoteca secuenciada como molde y oligos completos con sitios KpnI (FL 5'oligo SEQ ID NO: 3) y NotI (FL 3' oligo SEQ ID NO: 4).

FL 5' oligo (SEQ ID NO:3):

AACGTTGGTACCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGCG

FL3' oligo: (SEQ ID NO:4):

TAAAGCGGCCGCTTCAGGAGGGACATCGGTGAGCCTCAC

El producto de la PCR se digirió con las enzimas KpnI y NotI y se clonó en un vector de expresión pSP64T.GC. La preparación de ADN a gran escala se realizó utilizando un estuche MEGA prep (Quiagen).

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Ejemplo 3 Escrutinio de la Genoteca/Generación de VR3 A+B- humano y VR3 A-B- humano Escrutinio de la genoteca de próstata humana

Se sometieron a electroporación alícuotas de 1 \mul de la genoteca de próstata humana en células Electromax DH10B (Life Technologies). Se ajustó el volumen a 1 ml con medio SOC y se incubó durante 45 minutos a 37ºC con sacudimiento. Después la genoteca se cultivó en placa sobre placas de 150 cm^{2} que contenían LB hasta una densidad de 2.000 colonias por placa. Estos cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37ºC.

Se generó una sonda de receptor VR3 humano por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando el siguiente par de cebadores:

5' oligo	(SEQ ID NO: 13):	5' CTACCTGACGGAGAACCCCCACAAG
3' oligo	(SEQ ID NO: 14):	5' GTAGTAGGCGGTGAGACTGAAGATGA

La sonda se generó mediante PCR utilizando las condiciones de PCR regulares empleando sondas oligonucleotídicas 5' y 3' (100 ng cada una) y 10 ng de ADN miniprep diluido. El fragmento de 387 pb resultante se hizo correr sobre gel de agarosa al 1% y se purificó utilizando un kit de extracción QUIAquick Gel (Quiagen). Aproximadamente 100 ng de la sonda purificada se marcaron con P32 alfa utilizando el kit de oligomarcaje de Pharmacia y el ADN se purificó con columnas S-200 (Pharmacia).

Las colonias de la genoteca se levantaron sobre filtros de nitrocelulosa Protran (Schleicher & Schuel) y el ADN se desnaturalizó en NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Los discos del filtro se neutralizaron con NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5 y después se entrecruzaron por medio de UV con la membrana utilizando un UV-Stratalinker (Stratagene). Los filtros se lavaron varias veces en solución de lavado (Tris-HCl 1 M, pH 8,0; NaCl 5 M; EDTA 0,5 M; SDS al 20%) a 42ºC. Después se incubaron los discos en 1x tampón de prehibridación southern (5'-3' Inc) que contenía formamida al 50% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla (5'-3' Inc) durante 6 horas a 42ºC. Finalmente, se realizó la hibridación durante la noche a 42ºC en 1x tampón de hibridación (5'-3') que contenía formamida al 50%, 100 ng de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla en presencia de sonda marcada (5x10^{5} a 1x10^{6} cmp/ml de tampón de hibridación).

Los discos se lavaron dos veces en 2xSSC, SDS al 0,2% a la temperatura ambiente (20 minutos cada uno) y una vez en 0,2xSSC, SDS al 0,1% a 50ºC durante 30 minutos. Después se colocaron las membranas sobre hojas de papel de filtro, se envolvieron en envoltura Saran y se expusieron a la película a -20ºC durante la noche.

Los clones positivos se identificaron y se recogieron concentrando las colonias de la placa original. Las colonias se incubaron en LB durante 1 hora a 37ºC. Las diluciones de los cultivos se cultivaron en placa sobre placas de agar LB y se repitió el procedimiento de levantamiento del filtro, hibridación, lavado, selección de colonias. Los clones individuales del segundo escrutinio se escogieron y se sometieron a digestión con EcoRI/NotI para determinar el tamaño de los insertos, y los insertos se secuenciaron.

El clon completo se generó mediante PCR con polimerasa Pfu utilizando 10 ng del clon de la genoteca secuenciada como molde y oligos completos con sitios NotI (FL 5'oligo SEQ ID NO:15) y XbaI (FL 3' oligo SEQ ID NO:16).

FL 5' oligo (SEQ ID NO: 15):

5' AACGTTGGCGGCCGCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGC G

FL3' oligo: (SEQ ID NO:16):

5' AACGTTTCTAGACTGGGCTGCAGTCCCTAG

El producto de la PCR fue digerido con las enzimas NotI y XbaI y clonado en un vector de expresión pGem HE. La preparación de ADN a gran escala se realizó utilizando un kit MEGA prep (Quiagen).

Ejemplo 4 Clonación del ADNc del receptor VR3 humano en un Vector de Expresión en Mamíferos

Se clonaron los ADNc del receptor VR3 humano (referidos colectivamente como hVR3) en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3.1/Zeo(+). El producto de la PCR clonado se purificó sobre una columna (kit de purificación de ADN "Wizard PCR DNA purification kit" de Promega) y se sometió a digestión con Not I y EcoRI (NEB) para crear extremos cohesivos. El producto se purificó mediante electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. El vector pcDNA3.1/Zeo(+) se sometió a digestión con las enzimas Not1 y XbaI (excepto para hVR3 A+B+, que se clonó en los sitios BamHI/NotI) y se purificó con posterioridad en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Se utilizó el vector lineal para ligarlo a los insertos de ADNc de VR3 humano. Se aislaron los recombinantes, se diseñó el receptor VR3 humano, y se utilizó para transfectar células de mamífero (células HEK293, COS-7 o CHO-K1) utilizando el kit de transfección basado en lípidos no liposomales Effectene (Quiagen). Los clones celulares estables se seleccionaron mediante crecimiento en presencia de zeocina. Los clones resistentes a zeocina individuales se aislaron y se demostró que contenían el gen del receptor VR3 humano intacto. Los clones que contenían los ADNc del receptor VR3 humano se analizaron en cuanto a la expresión de la proteína hVR3. Se utilizaron los plásmidos recombinantes que contenían ADN que codificaba VR3 humano para transformar las células COS o CHO o HEK293 de mamífero.

Las células que expresan el receptor VR3 humano, establemente o transitoriamente, se utilizan para someter a ensayo la expresión del receptor VR3 humano y la actividad de unión a H^{3}-RTX. Estas células se utilizan para identificar y examinar otros compuestos en cuanto a su capacidad para modular, inhibir o activar el receptor VR3 humano y para competir por la unión a H^{3}-RTX radiactivo.

Los casetes que contienen el ADNc del receptor VR3 humano en orientación positiva con respecto al promotor se ligan en sitios de restricción apropiados 30 del promotor y se identifican mediante mapeo de sitios de restricción y/o secuenciación. Estos vectores de expresión de ADNc se introducen en células anfitrionas fibroblásticas por ejemplo COS-7 (ATCC núm. CRL1651), y CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293. L (ATCC núm. CRL6362)] mediante métodos normalizados incluyendo, pero no limitados a electroporación, o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrano, fosfato de calcio). Las células transfectadas y los sobrenadantes de los cultivos celulares se cosechan y se analizan en cuanto a la expresión del receptor VR3 humano como se describe en la presente memoria.

Todos los vectores utilizados para la expresión transitoria en mamíferos se pueden utilizar para establecer líneas celulares estables que expresan el receptor VR3 humano. Se espera que los constructos de ADNc del receptor VR3 humano no alterados clonados en vectores de expresión programen las células anfitrionas para elaborar la proteína receptora VR3 humana. Las células anfitrionas para la transfección incluyen, pero no están limitadas a, CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wigler, et al. Cell 11: 223 (1977)], NS/0, y dHFr- CHO [Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].

La co-transfección de cualquier vector que contiene el ADNc del receptor VR3 humano con un fármaco de selección, incluyendo, pero no limitado a G418, aminoglicósido fosfotransferasa; higromicina, higromicina-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforribosil-transferasa, permitirá la selección de clones transfectados establemente. Los niveles de receptor VR3 humano se cuantifican por medio de los análisis descritos en la presente memoria.

Los constructos de ADNc de receptor VR3 humano también se ligan en vectores que contienen marcadores de resistencia a fármacos amplificables para la producción de clones de células de mamíferos que sintetizan los niveles más elevados posibles de receptor VR3 humano. Tras la introducción de estos constructos en las células, se seleccionan los clones que contienen el plásmido con el agente apropiado, y el aislamiento de un clon expresado en exceso con un elevado número de copias de plásmidos se completa mediante selección en dosis crecientes del agente.

La expresión del receptor VR3 humano recombinante se logra mediante transfección del ADNc del receptor VR3 humano completo en una célula anfitriona de mamífero.

Ejemplo 5 Caracterización de la proteína funcional codificada por pVR3R en oocitos de Xenopus

Se prepararon oocitos de Xenopus laevis y se inyectaron utilizando métodos normalizados descritos previamente y conocidos en la técnica (Fraser et al., 1993). Se apartaron lóbulos de ovario de Xenopus laevis hembra adulto (Nasco, Fort Atkinson. WI), se enjuagaron varias veces en solución salina sin calcio nominal que contenía: NaCl 82,5 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 5 mM, ajustado a pH 7,0 con NaOH (OR-2), y se sacudieron suavemente en OR-2 que contenía colagenasa de Tipo 1 al 0,2% (ICN Biomedicals, Aurora, Ohio) durante 2-5 horas. Cuando se separaron aproximadamente el 50% de las capas foliculares, se seleccionaron los oocitos en Fase V y VI y se enjuagaron en medio que consistía en 75% de OR-2 y 25% de ND-96. El ND-96 contenía: NaCl 100 mM, KCl 2 mM, MgCl_{2} 1 mM.

CaCl_{2} 1,8 mM, HEPES 5 mM, piruvato de Na 2,5 mM, gentamicina (50 \mug/ml), ajustado a pH 7,0 con NaOH. El Ca^{+2} extracelular aumentó gradualmente y

CaCl_{2} 1,8 mM, HEPES 5 mM, piruvato de Na 2,5 mM, gentamicina (50 \mug/ml), ajustado a pH 7,0 con NaOH. El Ca^{+2} extracelular aumentó gradualmente y las células se mantuvieron en ND-96 durante 2-24 horas antes de la inyección. Para la transcripción in vitro, se linealizó pGEM HE (Liman et al., 1992) que contenía VR3 humano con NheI y se transcribió con ARN polimerasa de T7 (Promega) en presencia del análogo protegido terminalmente m7G(5')ppp(5')G. El ARNc sintetizado se precipitó con acetato de amonio e isopropanol, y se resuspendió en 50 \mul de agua sin nucleasa, se cuantificó el ARNc utilizando geles de formaldehído (agarosa al 1%, 1xMOPS, formaldehído al 3%) frente a 1,2 y 1,5 \mul de marcadores de ARN (Gibco BRL, 0,24-9,5 Kb).

Se inyectaron 50 nl del ARN del receptor VR3 humano (0,3-5 ng) en los oocitos con o sin inyección simultánea de VR1 (2-3 ng). A los oocitos de control se les inyectaron 50 nl de agua. Los oocitos se incubaron durante 1-13 días en ND-96 antes del análisis de la expresión del VR3 humano.

Se llevaron a cabo incubaciones y digestión con colagenasa a la temperatura ambiente. Los oocitos que habían sido inyectados se mantuvieron en agrupaciones de cultivo de tejidos de 48 pocillos (Costar; Cambridge, MA) a 18ºC. Se midieron las corrientes inducidas por el agonista en células completas medidas 1-14 días después de la inyección con una pinza de voltaje de dos electrodos convencional (GeneClamp500, Axon Instruments, Foster City, CA) utilizando métodos normalizados descritos previamente y conocidos en la técnica (Dascal. 1987). Los microelectrodos se llenaron con KCl 3 mM, que tenía resistencias de 1 y 2 M\Omega. Las células fueron perfundidas continuamente con ND96 a -10 ml/min a la temperatura ambiente a menos que se indique de otro modo. El voltaje de la membrana se fijó a -70 mV a no ser que se especifique.

Los oocitos se sensibilizaron con una variedad de ligandos, pH bajo, y etapas de voltaje de despolarización así como de hiperpolarización pero no hubo diferencias detectables en la conductancia de la membrana entre los oocitos que expresaban VR3 humano y los oocitos de control [véase la Tabla 1]. No obstante, los oocitos a los que se había inyectado VR3 humano tenían propiedades que eran diferentes de lo controles en 4 aspectos. Primero, la inyección de ARNC de VR3 A+B- hizo que los oocitos murieran. La viabilidad de los oocitos a los que se habían inyectado isoformas de VR3 que tenían un inserto A era significativamente reducida en comparación con los controles de las hermanas 3-4 días después de la inyección (Figura 9). Segundo, las tres isoformas de VR3 aumentaban la respuesta inducida por calor (Figura 10). tercero, la inyección simultánea de A+B- con VR1 humano producía una corriente inducida por perfusión sensible el rojo de rutenio (I_{perfusión}) (Figura 11). Cuarto, la inyección simultánea de ARNc de VR3 A+B- humano con ARNc de VR1 humano alteró la sensibilidad de los oocitos a capsaicina 1 \muM, un agonista del receptor VR1 (Figura 12).

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TABLA 1

2

Viabilidad

Se muestra la expresión funcional de las isoformas VR3 humanas en oocitos de Xenopus: la viabilidad de los oocitos mantenidos en ND-96 que contenía 2 Ca^{2+} disminuía significativamente 4-6 días después de la inyección con ARNc de VR3 A+B- (3,25 ng) y de VR3 A+B+ (5 ng) pero no de VR3 A-B- (1,5 ng). Los datos para los oocitos a los que se había inyectado VR3 A+B- y de control inyectados con agua fueron similares en 5 experimentos separados y combinados. Los oocitos muertos se determinaron visualmente utilizando un microscopio de disección Bauch and Lomb. Los datos se analizaron utilizando el análisis de la Chi cuadrado. Los oocitos a los que se había inyectado VR3 A+B- fueron los menos viables: solamente aproximadamente un 9% de los oocitos sobrevivieron a los 4-6 días de la inyección. Aproximadamente un 33% de los oocitos a los que se había inyectado VR3 A+B+ humano sobrevivieron a los 4-6 días de la inyección. Aproximadamente un 67% de los oocitos de control a los que se había inyectado agua sobrevivieron el mismo período de tiempo en condiciones esencialmente idénticas. Los oocitos a los que se había inyectado VR3 A-B- revelaron una viabilidad similar a la de los controles a los que se había inyectado agua. Se obtuvieron datos similares de 2 lotes separados de ARNc.

Sensibilidad al calor

Se muestra la expresión funcional de las isoformas de VR3 humano en oocitos de Xenopus: activación por calor. a). Se muestra la corriente pico principal lograda por una transición de calor desde 25ºC a 46ºC y mantenida a 46ºC durante al menos 15 seg. Las transiciones de voltaje se aplicaron desde -120 a +80 mV a lo largo de 400 mseg a una tasa de muestreo de 2 seg. La corriente mostrada fue el incremento en la corriente a lo largo y por encima de la corriente inicial lograda a +80 mV (el punto más a la derecha de la curva de voltaje de corriente mostrada en (b)). Se inyectaron a los oocitos 3,25, 1,5 y 5 ng de ARNc de VR3 A+B-, A-B-, y A+B+, respectivamente, y se registró hasta 6 días más tarde. Barra sólida: controles a los que se había inyectado agua (n=8); barra transparente: isoforma VR3 A+B- (n = 11); barra rayada: isoforma VR3 A-B- (n = 8): barra punteada: isoforma VR3 A+B+ (n=5). Todas las isoformas mostraron un incremento significativo sobre los controles con agua (p = 0,001, 0,03 y 0,007, respectivamente). La respuesta inducida por calor fue aproximadamente 2-veces mayor en la isoforma A+B- en comparación con las otras dos isoformas, pero las diferencia no fueron significativas (p = 0,051 y p = 0,16, para A+B- en comparación con A-B- y A+B+, respectivamente). Los datos se obtuvieron a partir de 2 grupos de oocitos inyectados. Los datos mostrados son la media y el error estándar de la media. (b). Las corrientes inducidas por la transición de voltaje fueron registradas durante la aplicación de calor creciente a oocitos a los que se había inyectado agua (arriba), VR3 A+B- (segundo por arriba), VR3 A-B- (3º por arriba), y VR3A+B+ (abajo). Los oocitos fueron perfundidos constantemente con Ca2+ ND-96 y la solución fue calentada por medio de un dispositivo calentador interno en línea (TC-324B junto con el calentador en línea SH-27A; Warner Instrument Corp.). Se presentan corrientes inducidas por la transición (en microAmperios, como se indica en el eje de la y) obtenidas a temperaturas de 37ºC a 46ºC; solamente las trazas de corriente a las temperaturas más altas están marcadas con la correspondiente temperatura.

Corrientes inducidas por perfusión (I_{perfusión}: Figura 11)

El comienzo de la perfusión en baño logró un aumento de la conductancia de la membrana en oocitos que a los que se había inyectado ARN transcrito de VR1 humano clonado con y sin ARN transcrito de ADNc de receptor VR3A+B- como se muestra en la Figura 11. Un oocito al que se había inyectado ARNc de VR1 (a) fue sensibilizado con transiciones de voltaje entre -120 y +80 mV a lo largo de 400 mseg. Las corrientes inducidas por transición se aumentaron después del comienzo de la perfusión del oocito a una tasa de 10 ml/min. Las corrientes inducidas por la transición de control de oocitos en solución salina extracelular (C) se registraron antes del comienzo de la perfusión en baño de Ca2+ ND-96. Durante la perfusión, las corrientes inducidas por la transición aumentaron, indicando un incremento en la conductancia (P). La posterior perfusión de rojo de rutenio (RR) 10 \muM no bloqueó la corriente inducida por perfusión (P) en los oocitos que expresaban VR1. De este modo, la corriente inducida por perfusión observada en oocitos que expresan VR1 solo era insensible al rojo de ruteno (RR) 10 \muM (A, "RR"). No obstante, la corriente inducida por perfusión lograda en oocitos que expresaban VR3A+B- y VR1 resultó espectacularmente inhibida por el rojo de rutenio 10 \muM (B, "RR"). Esta diferencia se observó en 6 oocitos. El bloque era parcialmente reversible (no mostrado). (b). Un oocito al que se había inyectado ARNc de VR1 junto con VR3 A+B- fue sensibilizado con transiciones de voltaje entre -120 y +80 mV a lo largo de 400 mseg. Las corrientes inducidas por la transición aumentaron después del comienzo de la perfusión del oocito a una tasa de 10 ml/min. Las corrientes activadas por perfusión tenían magnitudes similares en ambos grupos de oocitos. Vrev para la corriente inhibida por RR fue de aproximadamente -13 mV (flecha). Las corrientes inducidas por ambos agonistas fueron fuertemente rectificadoras aparentemente, como se ha informado previamente para VR1 de rata (Caterina et al.,
1997).

Corrientes inducidas por capsaicina en oocitos que expresan VR1 humano en presencia o ausencia de VR3 A+B- humano (Figura 12)

Se midieron las corrientes logradas por capsaicina 1 \muM (Figura 12) a un voltaje de mantenimiento de +50 mV puesto que las respuestas fueron las más grandes a este voltaje debido a una profunda rectificación aparente de las corrientes inducidas por capsaicina (Caterina et al., 1997). Se muestran 3 ejemplos de oocitos a los que se ha inyectado VR1 y agua (un control para la inyección con VR3) (a) y oocitos a los que se ha inyectado ARNc de VR1 y ARNc de VR3 A+B- (b). La capsaicina se aplicó como baño durante el tiempo indicado por la barra sólida horizontal. La magnitud de la respuesta primaria a capsaicina 1 \muM se disminuyó cuando se expresaba simultáneamente con ARNc de VR3 A+B- a razones iguales (2,9 ng cada uno). La diferencia mas notable fue la magnitud y la tasa de decaimiento de la respuesta secundaria, el segundo máximo que se obtenía normalmente al principio del lavado de capsaicina.

Ejemplo 6 Caracterización de VR3 humano en líneas celulares de mamífero

Se transfectan células HEK293, CHO-K1 y COS-7 humanas con las isoformas de VR3 humano pVR3A+B-R, pVR3A-B-R, o pVR3A+B+R. Se realizan transfecciones transitorias de 1 \mug de pVR3R por 10^{6} células por placa de 100 mm utilizando el kit de transfección Effectene (Quiagen; 301425). Tres días después de la transfección, las células se cultivan en placa sobre placas de 96 pocillos (Biocoat, placa negra/transparente cubierta con poli-D-lisina; Becton Dickinson parte núm. 354640). Al cabo de 1 día, los pocillos se enjuagan con F12/DMEM, después se incuban en Fluo-4 (2 \muM) con Pluronic F-127 (20%, 40 \mul utilizados en un volumen total de 20 ml) durante 1 hora a la temperatura ambiente. Las placas se analizan utilizando FLIPR (Molecular Devices, FL-101). Las células se sensibilizan con soluciones de diferente osmolaridad (40 \mul añadidos a 80 \mul a una velocidad de 50 \mul/seg). Algunos pocillos se mezclan vigorosamente para simular el incremento de perfusión de las células con solución extracelular. Las transfecciones con vector solo se utilizan como controles.

Al cabo de 3 días las células se seleccionan en presencia de neomicina (200 \mug/ml) y se hacen crecer a través de tres pases de dilución 1:10 durante aproximadamente dos semanas. Las colonias individuales se seleccionan y se hacen crecer en placas de 6 pocillos. Después las células se cultivan en placa sobre placas de 96 pocillos (Biocoat, placa negra/transparente recubierta con poli-D-lisina; Becton Dickinson parte núm. 354640) y se hacen crecer hasta la confluencia durante tres días. Los pocillos se enjuagan con F12/DMEM, después se incuban en Fluo-4 (2 \muM) con ácido Pluronic (20%, 40 \mul utilizados en un volumen total de 20 ml) durante 1 hora a la temperatura ambiente. Las placas se analizan utilizando FLIPR (Molecular Devices. FL-101). Las células se sensibilizan con agonistas (a una concentración de 3 veces en 40 \mul añadidos a 80 \mul a una velocidad de 50 \mul/seg).

Se utiliza la técnica del pinzamiento zonal de células completas (Hamill et al., 1981) para registrar las corrientes inducidas por el ligando de HEK293 que expresa establemente el receptor VR1 humano mantenido durante >2 días en cubres de 12 mm. Las células se visualizan utilizando Nikon Diaphot 300 con óptica DIC Nomarski. Las células se perfunden continuamente en solución salina fisiológica (\sim0,5 ml/min) a menos que se indique de otro modo. La solución salina fisiológica normalizada ("Tyrodes") contiene: NaCl 130 mM, KCl 4 mM, CaCl_{2} 1 mM. MgCl_{2} 1,2 mM. y hemi-Na-HEPES 10 mM (pH 7,3, 295-300 mOsm medido utilizando una presión de vapor Wescor 5500 (Wescor. Inc., Logan, UT). Los electrodos de registro están hechos de tubos capilares de borosilicato (R6; Garner Glass, Claremont, CA), las puntas están recubiertas con cera dental periférica (Miles Laboratories, South Bend, IN), y tienen resistencias de 1-2 M\Omega cuando contienen solución salina intracelular: K-gluconato 100 mM, KCl 25 mM, CaCl_{2} 0,483 mM, MgCl_{2} 3 mM, hemi-Na-HEPES 10 mM y K_{4}-BAPTA 1 mM (100 nM libre de Ca^{+2}); pH 7,4, con dextrosa añadida para lograr 290 mOsm). Los potenciales de contacto entre los dos electrolitos son de -18 mV utilizando una pipeta normalizada y soluciones de baño determinadas empíricamente y utilizando el programa de ordenador JPCalc ((Barry. 1994)). Todos los voltajes mostrados están corregidos para el potencial de contacto entre los electrolitos. Las señales de corriente y voltaje se detectan y se filtran a 2 kHz con un amplificador de pinzamiento zonal Axopatch 1D (Axon Instruments, Foster City, CA), registrado digitalmente con un interfaz de laboratorio DigiData 1200B (Axon Instruments), y un sistema de ordenador compatible con PC y se almacenan en un disco magnético para el análisis autónomo. Los datos de adquisición y el análisis se realizan con el soporte lógico PClamp. Los cambios lentos en la corriente de mantenimiento se detectan y se filtran a 2 kHz, y se registran con un amplificador LPF202A DC (Warner, Hamden, CT) y un aparato de registro digital VR10B (Instrutech, Great Neck, NY) en una cinta de vídeo. La señal se analiza más tarde a 10 Hz utilizando el soporte lógico Axotape.

Se determina la capacitancia de membrana total (C_{m}) como la diferencia entre la corriente máxima después de una transición de voltaje hiperpolarizante de 30 mM de -68 mV generada a una velocidad de 10 mV/ms y la corriente en estado estacionario al potencial final (-98 mV) (Dubin et al., 1999).

Los potenciales inversos aparentes (V_{rev}) de los cambios de conductancia inducidos por el ligando se determinan utilizando un protocolo de transición de voltaje (Dubin et al., 1999). Las transiciones de voltaje se aplican cada segundo y se registran las corrientes inducidas por la transición en la célula completa resultante. Normalmente el voltaje se hizo pasar de valores negativos a positivos a negativos. La corriente requerida para el pinzamiento de las células a -68 mV se controla continuamente. Las conductancias inducidas por ligando se determinan a partir de corrientes en células completas logradas mediante un protocolo de transición de voltaje en presencia y ausencia de ligando. Las corrientes inducidas por transiciones de voltaje medidas antes (control) y en presencia de ligando se comparan para revelar el efecto del ligando sobre el canal para modular la salida de corriente del canal. Se determina el voltaje al cual no hay corriente inducida por el ligando neta (V_{rev}).

Ejemplo 7 Estructura primaria de la Proteína receptora VR3 humana

La presente invención describe 3 isoformas de hVR3: A+B-, A-B-, y A+B+. La secuencia de nucleótidos de los ADNc del receptor VR3 humano reveló un único marco de lectura abierto grande de aproximadamente 2616, 2436 y 2229 pares de bases que codifican 871, 811, y 742 aminoácidos para VR3 A+B-, A-B- y A+B+ humano, respectivamente. El ADNc para VR3 A+B- tiene extensiones no traducidas 5' y 3' de aproximadamente 337 y aproximadamente 547 nucleótidos. El ADNc para VR3 A+B+ tiene extensiones 5' y 3'-no traducidas de aproximadamente 836 y aproximadamente 994 nucleótidos. La primera metionina en marco se designó codón de iniciación para un marco de lectura abierto que pronostica las proteínas receptoras VR3 humanas con una masa molecular (M_{r}) de aproximadamente 98.242 Da, 91.294 Da y 83.310 Da para las isoformas A+B-, A-B- y A+B+, respectivamente. La isoforma A+B- codifica una proteína de 871 aminoácidos. El VR3 A-B- contiene una deleción de 60 aminoácidos desde el aminoácido 382 al 441 de VR3A+B-. VR3 A+B+ es idéntico a A+B- hasta el aminoácido 736 después de lo cual hay 6 aminoácidos divergentes y un codón de parada. La isoforma A+B+ de VR3 se extiende 20 aminoácidos después del supuesto TM6.

Las proteínas receptoras VR3 humanas pronosticadas se alineraon con las bases de datos de nucleótidos y proteínas y se encontró que estaban relacionadas con la familia de receptores vainilloides (VR1 y VR2). Existen numerosos motivos conservados en esta familia de receptores incluyendo un supuesto gran segmento hidrófilo N-terminal (aproximadamente 467 aminoácidos), tres supuestos dominios de repetición de anquirina en la región N-terminal. 6 regiones transmembrana pronosticadas y una región del poro. VR3 A+B- es idéntico en un 43% al VR1 humano, idéntico en un 39% a VRL-1 humano (AF129112) y a VRL humano VRL (AF103906). De este modo el receptor VR3 descrito en la presente memoria es claramente un gen novedoso de la familia del receptor vainilloide.

Las formas VR3A+B- y VR3A-B- son muy similares al canal inhibido por el estiramiento SIC de rata [acceso genbank AB015231] desde el aminoácido 694 hasta el final. Se piensa que el SIC, codificado por 529 aminoácidos, forma un canal iónico inhibido por el estiramiento. Carece de dominio citoplásmico N-terminal grande de la familia VR pero contiene una secuencia homóloga al exón A antes del supuesto TM1.

La secuencia genómica completa de las regiones que codifican VR3 descrita en la presente memoria parece encontrarse en un envío de secuencias a bases de datos de secuencia de 380512 pares de bases a genbank (homo sapiens clon RPCI1-7G5 (AC007834), envió de secuencias directo por Worley, K.C.). Esta entrada de genbank enumera muchos fragmentos de la secuencia de ADN y una secuencia contigua propuesta, pero carece de cualquier análisis de la secuencia de ácido nucleico y no consigue caracterizar los rasgos de las secuencias de ácido nucleico de VR3, o describir la presencia del gen VR3.

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La comparación de las secuencias de la presente invención y la secuencia genómica revela que el gen VR3 está compuesto por al menos 15 exones. "A" es un inserto de 60 aminoácidos en el supuesto dominio citoplásmico N-terminal que se encuentra en los ADNc obtenidos de genotecas de ADNc de pituitaria y próstata. Existen secuencias limítrofes intrón/exón en los insertos A y B.

Las isoformas A+B- y A+B+ contienen un dominio en la supuesta región citoplásmica N-terminal con homología con las secuencias consenso del dominio de repetición de la anquirina. De este modo, las isoformas A+ de VR3 parecen tener una arquitectura similar a la pronosticada para VR1. El primer dominio era significativamente similar a la secuencia consenso (E= 2,6 e-5). Los 2 dominios siguientes no tienen trascendencia tomados por sí mismos (e= 37 y E= 2,7) no obstante tomados en conjunto, es probable que esta región contenga 3 dominios de unión a anquirina. La isoforma A- pierde 20 aminoácidos del supuesto 3^{er} dominio de repetición de anquirina y la secuencia yuxtapuesta no se ajusta a un dominio de repetición de anquirina.

La isoforma A+B- de VR3 tiene dos sitios de miristoilación potenciales: [GPGGE] en el extremo N y entre TM4 y TM5. Los supuestos sitios de fosforilación incluyen: 7 sitios de fosforilación PKC potencial: T112, S134, T175, T190, T380, S403, S688 [sin embargo, S688 está en una supuesta región extracelular]; 1 sitio de fosforilación PKA y PKG potencial: T181; 12 sitios de fosforilación caseína quinasa II potencial: T89, S162, T181, T395, S416, S422, S432, T426, S432, S441, T740, S836; 3 sitios de fosforilación caseína quinasa de la glándula mamaria potencial (SxE): S4, S726, S758; 1 sitio de fosforilación tirosina quinasa potencial: Y411 [presente en el inserto "A"]; y 1 sitio de glicosilación unido a N potencial: N651, [N201, N207 están en el supuesto dominio N-terminal intracelular y es poco probable que sea glicosilado]. No hay supuestos dominios de unión CaM en ninguna de las isoformas descritas en la presente invención.

En la isoforma A- que carece del inserto "A", faltan 2 sitios de fosforilación PKC, 6 sitios de fosforilación caseína quinasa II, y el único supuesto sitio de fosforilación tirosina quinasa.

La isoforma A+B+ codifica una supuesta proteína que carece de 2 sitios de fosforilación caseína quinasa II en la supuesta región intracelular C-terminal.

Ejemplo 8 Expresión de VR3 en tejidos humanos

Expresión utilizando una matriz de ADN (Luo et al., 1999). El análisis de distribución de la matriz de ADN indica que los ARNm de VR3 humano eran expresados en una variedad de tejidos, y había cierto solapamiento de expresión con VR1 a nivel del tejido completo [Figura 13]. El ARNc del tipo de tejido indicado en la columna de la izquierda contenía secuencias que codificaban el VR3 humano (columna del centro). La expresión de VR1 humano se muestra en la columna de la derecha y en la mayoría de los casos se solapaba con la expresión de VR3. OBSERVESE: NS era la expresión no significativa de VR1 humano. La secuencia del ADN de VR3 humano inmovilizado en la matriz de ADN era (SEQ ID NO:17)

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Esta secuencia de ADN no está presente en la isoforma A+B+, solamente en las isoformas A+B- y A-B-. Obsérvese que la especie de ADNc fue clonada a partir de glándula de próstata (*; Figura 13).

El análisis de transferencia Northern reveló la expresión de VR3 en cerebro completo, placenta, pulmón, riñón, páncreas y próstata.

Ejemplo 9 Clonación del ADNc del receptor VR3 humano en vectores de expresión de E. coli

El receptor VR3 humano recombinante es producido en E. coli después de la transferencia de la casete de expresión del receptor VR3 humano a vectores de expresión de E. coli, incluyendo pero no limitados a, la serie pET (Novagen). Los vectores pET colocan la expresión del receptor VR3 humano bajo el control del promotor del bacteriófago T7 estrechamente regulado. Después de la transferencia de este constructo a un anfitrión de E. coli que contiene una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa de T7 conducida por el promotor inducible lac, se induce la expresión del receptor VR3 humano cuando se añade un sustrato de lac apropiado (IPTG) al cultivo. Los niveles del receptor VR3 humano se determinan por medio e los análisis descritos en la presente memoria.

El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo para el receptor VR3 humano se inserta en el sitio NdeI de pET [16]11a. Los constructos en la orientación positiva se identifican mediante análisis de la secuencia y se utilizan para transformar la cepa del anfitrión de expresión BL21. Después se utilizan los transformantes para inocular los cultivos para la producción de la proteína receptora VR3 humana. Los cultivos se pueden hacer crecer en medio M9 o ZB, cuya formulación es conocida por los expertos en la técnica. Después de crecer a una DO_{600} = 1,5, se induce la expresión del receptor VR3 humano con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC.

Ejemplo 10 Clonación del ADNc del receptor VR3 humano en un Vector de Expresión de Baculovirus para la Expresión en Células de Insecto

Se diseñan vectores de Baculovirus, que derivan del genoma del virus AcNPV, para proporcionar un elevado nivel de expresión de ADNc en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRL núm. 1711). Los baculovirus recombinantes que expresan el ADNc del receptor VR3 humano se producen mediante los siguientes métodos normalizados (In Vitrogen Maxbac Manual):

se ligan los constructos de ADNc del receptor VR3 humano en el gen de la polihedrina en una variedad de vectores de transferencia de baculovirus, incluyendo el vector pAC360 y BlueBac (In Vitrogen). Se generan baculovirus recombinantes mediante recombinación homóloga después de la co-transfección del vector de transferencia de baculovirus y

se linealiza el ADN genómico de AcNPV [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] en células Sf9. Los virus pAC360 recombinantes se identifican mediante la ausencia de cuerpos de inclusión en las células infectadas y se identifican los virus pBlueBac recombinantes basándose en la expresión de la \beta-galactosidasa (Summers, M. D. y Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Tras la purificación en placa, se mide la expresión del receptor VR3 humano mediante análisis descritos en la presente memoria.

El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo para el receptor VR3 humano se inserta en el sitio BamHI de pBlueBacII. Se identifican los constructos en orientación positiva mediante análisis de la secuencia y se utilizan para transfectar células Sf9 en presencia de ADN de tipo salvaje de AcNPV lineal.

El receptor VR3 humano activo, auténtico se encuentra en el citoplasma de las células infectadas. El receptor VR3 humano activo se extrae de las células infectadas mediante lisis con hipotónica o con detergente.

Ejemplo 11 Clonación del ADNc del receptor VR3 humano en un vector de expresión de levadura

El receptor VR3 humano recombinante es producido en la levadura S. cerevisiae después de la inserción del cistrón de ADNc del receptor VR3 humano óptimo en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de la expresión intracelular, los vectores tales como EmBLyex4 o similar se ligan al cistrón del receptor VR3 humano [Rinas. U. et al., Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989)]. Para la expresión extracelular, el citrón del receptor VR3 humano se liga en los vectores de expresión de levadura que fusionan una señal de secreción (un péptido de levadura o mamífero) al extremo NH_{2} de la proteína receptora VR3 humana [Jacobson, M. A., Gene 85: 511-516 (1989); Riett L. y Bellon N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989)].

Estos vectores incluyen, pero no están limitados a pAVE1>6, que fusiona la señal de la seralbúmina humana al ADNc expresado [Steep O. Biotechnology 8: 42-46 (1990)], y el vector pL8PL que fusiona la señal de la lisozima humana al ADNc expresado [Yamamoto. Y., Biochem. 28: 2728-2732)]. Además, el receptor VR3 humano es expresado en levadura como una proteína de fusión conjugada con ubiquitina utilizando el vector pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705-709 (1989). McDonnell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los niveles de receptor VR3 humano expresado se determinan mediante los análisis descritos en la presente memoria.

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Ejemplo 12 Purificación del Receptor VR3 humano recombinante

El receptor VR3 humano producido recombinantemente se puede purificar mediante cromatografía de afinidad.

Se elaboran columnas de afinidad con anticuerpo para el receptor VR3 humano añadiendo los anticuerpos anti-receptor VR3 humano a Affigel-10 (Bio-Rad), un soporte en gel que es pre-activado con ésteres de N-hidroxisuccinimida de manera que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de cuentas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después al gel por medio de enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados restantes se sofocan después con etanolamina-HCl 1M (pH 8). La columna se lava con agua seguido de glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6) para separar cualquier anticuerpo o proteína extraña no conjugados. La columna se equilibra después en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) junto con agentes de solubilización de membrana apropiados tales como detergentes y el sobrenadante del cultivo celular o el extracto celular que contiene el receptor VR3 humano solubilizado se hace pasar a través de la columna. La columna se lava después con solución salina tamponada con fosfato junto con detergentes hasta que la densidad óptica (A280) cae hasta el fondo, después la proteína se hace eluir con glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con los detergentes. La proteína receptora VR3 humana purificada se somete a diálisis después frente a solución salina tamponada con fosfato.

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Referencias

Bevan, S., Hothi, S., Hughes, G., James, I. F., Rang, H. P., Shah, K., Walpole, C. S. J., y Yeats, J. C. (1992). Capsazepine: a competitive antagonist of the sensory neuron excitant capsaicin. Br. J. Pharmacol. 107, 544-52.

Bevan, S., y Szolcsanyi, J. (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications. Trends Pharmacol. Sci. 11, 330-3.

Blackstone, C., y Sheng, M. (1999). Protein targeting and calcium signaling microdomains in neuronal cells. Cell Calcium 26, 181-192.

Caterina, M. J., Rosen, T. A., Tominaga, M., Brake, A. J., y Julius, D. (1999). A capsaicin-receptor homolog with a high threshold for noxious heat. Nature (London) 398, 436-441.

Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., y Julius, D. (1997). The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature (London) 389, 816-824.

Fraser, S. P., Moon, C., y Djamgoz, M. B. A. (1993). Electrophysiology of Xenopus oocytes: An expression system in molecular neurobiology., D. Wallis, ed. (Oxford, UK: IRL).

Gupta, P. D., y Pushkala, K. (1999). Importance of the role of calcium in programmed cell death: a review. Cytobios 99, 83-95.

Lu, M., y Wong, F. (1987). A DNA deletion associated with multiple impaired transcripts in the visual mutant trp. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 28, 2092-5.

Luo, L., Salunga, R. C., Guo, H., Bitner, A., Joy, K. C., Galindo, J. E., Xiao, H., Rogers, K. E., Wan, J. S., Jackson, M. R., y Erlyer, M. G. (1999). Gene expression profiles of laser-captured adjacent neuronal subtypes. Nat. Med. (N. Y.) 5, 117-121.

Minke, B., y Selinger, Z. (1996). The roles of trp y calcium in regulating photoreceptor function in Drosophila. In Curr. Opin. Neurobiol., pp. 459-466.

Oh, U., Hwang, S. W., y Kim, D. (1996). Capsaicin activates a nonselective cation channel in cultured neonatal rat dorsal root ganglion neurons. J. Neurosci. 16, 1659-67.

Suzuki, M., Sato, J., Kutsuwada, K., Ooki, G., y Imai, M. (1999). Cloning of a stretch-inhibitable nonselective cation channel. J. Biol. Chem. 274, 6330-6335.

Szallasi, A. (1995). Autoradiographic visualization y pharmacological characterization of vainilloid (capsaicin) receptors in several species, including man. Acta Physiol. Scy., Suppl. 155, 1-68.

Szolcsanyi, J. (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In Capsaicin Study Pain, J. N. Wood, ed.: Academic, London, UK), pp. 1-26.

Szolcsanyi, J. (1996). Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog. Brain Res. 113, 343-359.

Szolcsanyi, J., Szallasi, A., Szallasi, Z., Joo, F., y Blumberg, P. M. (1991). Resiniferatoxin. An ultrapotent neurotoxin of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. Ann. N. Y. Acad. Sci. 632, 473-5.

Tominaga, M., Caterina, M. J., Malmberg, A. B., Rosen, T. A., Gilbert, H., Skinner, K., Raumann, B., Basbaum, A. I., y Julius, D. (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron 21, 531-543.

van Haasteren, G., Li, S., Muda, M., Susini, S., y Schlegel, W. (1999). Calcium signalling and gene expression. In J. Recept. Signal Transduction Res., pp. 481-492.

Wall, P. D., y Melzack, R. (1994). Textbook of Pain (New York: Churchill Livingstone).

Wood, J. N., Winter, J., James, I. F., Rang, H. P., Yeats, J., y Bevan, S. (1988). Capsaicin-induced ion fluxes in dorsal root ganglion cells in culture. J. Neurosci. 8, 3208-20.

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<110> Dubin, Adrienne E

\hskip1cm

Huvar, Ame

\hskip1cm

Erlyer, Mark G

\hskip1cm

Glass, Charles A

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<120> ADN que codifica Isoformas del Receptor Vanilloide VR3 Humano

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<130> Receptores VR3 humanos

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<140>

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<141>

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<160> 17

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido

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accggcctat cctctttgac atcgtg

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26

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<210> 2

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido

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48

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido

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39

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<211> 811

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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19

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<212> ADN

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21

22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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24

25

26

27

28

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<210> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda de Micromatriz de ADN

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<400> 17

29

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc.

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<120> ADN que codifica las Isoformas del Receptor Vanilloide VR3 humano

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<130> P031355EP

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<140> 01908798.0

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<141> 2001-02-01

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<150> US 09/500123

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<151> 2000-02-08

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<160> 17

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<212> ADN

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<211> 871

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<213> Homo sapiens

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<211> 2436

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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41

42

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<210> 12

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<211> 742

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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44

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

aacgttggcg gccgcgccac catggcggat tccagcgaag gcccccgcgc g

\hfill

51

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<210> 16

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sonda de hibridación

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

aacgtttcta gactgggctg cagtccctag

\hfill

30

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<210> 17

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<211> 233

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda de MicroMatriz de ADN

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<400> 17

46

Claims (3)

1. Una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:7 o 9.

2. Una proteína aislada como se define en la reivindicación 1, donde la proteína consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:7.

3. Una proteína aislada como se define en la reivindicación 1, donde la proteína consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:9.