PT1287134E - Subunidade beta-1a humana do canal de sódio dependente de voltagem e métodos de utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SUBUNIDADE BETA-1A HUMANA DO CANAL DE SÓDIO DEPENDENTE DE VOLTAGEM E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Este caso reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. N.° 60/294405 apresentado no dia 7 de Junho de 2000 e intitulado "ADN codificando para a subunidade βίΑ Humana do canal de sódio dependente da voltagem" e Pedido de Patente Provisório U.S. N.° 60/236664 apresentado a 29 de Setembro de 2000 e intitulado "ADN codificando para a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio dependente da voltagem". A entrada rápida de iões de sódio para dentro das células causa despolarização e geração do potencial de acção. Tal entrada de iões de sódio, em resposta à alteração de voltagem na membrana plasmática em células excitáveis, é mediada por canais de sódio dependentes de voltagem (VGSC). Por conseguinte, os canais de sódio dependentes de voltagem desempenham um papel fundamental no controlo da excitabilidade neuronal nos sistemas nervoso central e periférico. O VGSC é um complexo proteico compreendendo, pelo menos, uma subunidade α de grandes dimensões (200-300 kDa), formadora de poros e duas subunidades pequenas βΐ e β2 reguladoras (30-40 kD) (Catterall, 1992 & 1993; Isom et al., 1992; Isom et al., 1995). É bem conhecido que as subunidades α de VGSC determinam as propriedades básicas do canal, dado que a expressão apenas da subunidade α de VGSC nos sistemas de expressão heterólogos, tais como células HEK, 1 células CHL e oócitos de Xenopus é suficiente para sintetizar um canal de sódio funcional, porém alterado. A co-expressão das subunidades βΐ e β2 de VGSC com a subunidade α habitualmente normalizará as propriedades de canal em sistemas de expressão heterólogos. Por outras palavras, as subunidades βΐ e β2 de VGSC modulam quase todos os aspectos das propriedades de canal incluindo a activação de porta, activação e inactivação dependentes de voltagem e aumento do número de canais funcionais na membrana plasmática. As subunidades β de VGSC podem constituir igualmente a etapa limitante de velocidade que controla a expressão aumentada de canais de sódio (Caterall, 1992; Isom et al., 1994)

Estudos de clonagem molecular demonstraram que existe uma grande variedade de subunidades α de VGSC, que podem ser classificadas com base na sua sensibilidade em relação à neurotoxina e tetrodotoxina (TTX) (Marban, et al., 1998). Dado que o VGSC cerebral de tipo I, IIA, III, músculo esquelético de tipo I, proteína 6 do canal de sódio (SCP6) , o seu nervo periférico 4 quase homólogo (PN4) e nervo periférico 1 (PN1) são bloqueados por TTX a concentrações nanomolares, são designados canais de sódio sensíveis a TTX (TTX-S) . 0 canal de sódio cardíaco (Hl), o nervo periférico 3 (PN3/SNS) e NaN/SNS2 são normalmente bloqueados por TTX na gama micromolar e são designados canais de sódio resistentes a TTX (TTX-R).

Os estudos das subunidades β de VGSC estão muito atrasados relativamente aos das subunidades α de VGSC. Até à data, foram clonados e caracterizados apenas dois tipos de subunidades β, βΐ e β2 (Isom, et al. 1992, 1994 & 1995). Recentemente, uma nova

subunidade βΙΑ de VGSC, uma variante de excisão da subunidade βΐ, foi identificada em rato (Kazen-Gillespie, et al. 2000). A 2 subunidade βΙΑ de VGSC de rato resulta de um aparente evento de retenção de intrão. A análise de ADN genómico de rato indicou que a região divergente (região carboxilo) de βΙΑ é codificada pelo intrão 3 com um codão de terminação em fase. À semelhança da subunidade βΐ de VGSC, a subunidade βΙΑ aumenta a densidade de corrente do sódio e sitios de ligação a [3H] Saxitoxina e modula a activação e inactivação dependente de voltagem do tipo IIA de VGSC. De um modo mais interessante, o nivel de expressão e padrão da βΙΑ de VGSC nos gânglios da base dorsal (DRG) estão significativamente alterados no modelo animal de dor neuropática de Chung (ver a seguir), que é consistente com a observação que a corrente de sódio é aumentada após lesão nervosa. Moran et al. (2000) descrevem uma subunidade βΙΑ endógena expressa em células MEK - 293. As subunidades βΐ e βΙΑ de VGSC são glicoproteinas membranares integrais (Isom, et al. 1992, Kazon-Gillespie, et al., 2000) contendo um único domínio transmembranar na extremidade carboxilo e um motivo de enrolamento extracelular amino-terminal de tipo imunoglobulina mantido por uma única ponte perssulfureto putativa entre dois resíduos de cisteína altamente conservados. As βΐ e βΙΑ de VGSC podem classificar-se como membros do grupo V da superfamília de Ig, que inclui muitas moléculas de adesão celular, sugerindo que as subunidades βΐ e βΙΑ desempenham papéis, não apenas na modulação das propriedades do canal de sódio, mas também no direccionamento proteico e adesão celular (Isom e Catteral, 1996) .

Um aumento na velocidade de activação espontânea em neurónios é frequentemente observado nos gânglios periféricos sensoriais, no seguimento de lesão nervosa (Ochoa e Torebjork, 1980; Nordin et al., 1984; Devor, 1994; Woolf, 1994). Foi sugerido que esta hiperexcitabilidade em neurónios se deve à expressão alterada do canal de sódio em algumas síndromes de dor 3 crónica (Tanaka et al.f 1998). 0 aumento do número de canais de sódio conduzindo à activação inapropriada, repetitiva, dos neurónios foi referido nas extremidades de axónios lesionados em diversos tecidos nervosos periféricos, tal como o DRG que transmite sinais dos receptores periféricos para o sistema nervoso central (Waxman e Brill, 1978; Devor et al., 1989; Matzner e Devor, 1992; Devor et ai., 1992; England et ai., 1994; Matzner e Devor, 1994; England et ai., 1996). Os transcritos codificando a subunidade α-III, que estão presentes apenas a niveis muito baixos em neurónios DRG de controlo, são expressos a niveis moderados a elevados em neurónios axotomizados, juntamente com niveis elevados de ARNm de a-I e α-II (Waxman et ai., 1994). Inversamente, transcritos do canal de sódio a-SNS estão regulados negativamente em neurónios DRG no seguimento de axotomia (Dib-Hajj et al., 1996). Além disso, a eficácia parcial de agentes bloqueadores de sódio está bem documentada em doentes submetidos a tratamento da dor neuropática (Chabel et al., 1989; Devor et al., 1992; Omana-Zapata et al., 1997; Rizzo, 1997), proporcionando uma ligação importante entre o aumento da expressão do canal de sódio e a dor neuropática. Por conseguinte, as alterações na expressão do canal de sódio e subsequente função, podem constituir um evento molecular crucial subjacente à patofisiologia da dor após lesão nervosa periférica.

Recentemente, a subunidade βΙΑ de VGSC foi clonada e foi referido que aumenta a densidade da corrente de sódio na membrana plasmática, quando co-expressa com as subunidades αΙΙΑ em fibroblastos CHL (Kazan-Gillespie et al., 2000). A βίΑ é regulada em termos de desenvolvimento no cérebro, contudo o seu potencial papel na dor neuropática não foi explorado anteriormente. Por conseguinte, a expressão da proteína de βΙΑ 4 em neurónios DRG utilizando o modelo de Chung da dor neuropática (Kim e Chung, 1992) foi investigado, utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra uma região extracelular única de βίΑ não presente em βΐ. A imuno-histoquímica e a análise de imagem assistida por computador documentaram uma regulação positiva significativa das unidades βίΑ e βΐ de VGSC no seguimento de lesão neuronal, comparada a niveis muito baixos no DRG de animais operados ficticiamente. 0 salpicado de pontos distinto e a distribuição da marcação de membrana de βίΑ no seguimento de lesão nervosa periférica, sugeriu a tradução activa e possível acumulação dentro da membrana plasmática, contrariamente a βΐ, onde a distribuição subcelular permaneceu difusa. A fim de explorar adicionalmente as funções da subunidade βίΑ de VGSC, a subunidade βίΑ de VGSC humana foi clonada e caracterizada nesta invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma molécula de ADN codificando a subunidade βίΑ de VGSC humana foi clonada e caracterizada e representa uma nova isoforma da subunidade βίΑ de VGSC humana que é expressa de um modo preferido em tecidos importantes para a função neurológica. Utilizando um sistema de expressão recombinante, foram isoladas moléculas de ADN funcionais codificando a subunidade do canal. As propriedades biológicas e estruturais destas proteínas estão divulgadas, bem como está a sequência de aminoácidos e nucleotídica. As moléculas de ADN recombinantes, e partes destas, são úteis para o isolamento de homólogos das moléculas de ADN, identificação e isolamento de equivalentes genómicos das 5 moléculas de ADN e para a identificação, detecção ou isolamento de formas mutantes das moléculas de ADN.

Além disso, a subunidade βΙΑ está implicada na dor neuropática, como demonstrado utilizando um modelo estabelecido de dor neuropática.

Num primeiro aspecto da invenção, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, referido polinucleotídeo codificando a SEQ ID.N°:14; ou aminoácidos 150 a 268 de SEQ. ID.N°:14.

Numa forma de realização, o polinucleotídeo é ARN e, noutra forma de realização, o polinucleotídeo é ADN. Noutra forma de realização, a sequência nucleotídica é seleccionada a partir de um grupo consistindo em (SEQ. ID.N°:12) e (SEQ. ID.N°:13). Noutra forma de realização, a molécula de ADN isolada é ADN genómico. A invenção refere-se, ainda, a um vector de expressão para expressão de uma proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio num hospedeiro recombinante, em que o referido vector contém um gene recombinante codificando a SEQ ID N°:14. Numa forma de realização, o vector de expressão contém um gene clonado codificando uma proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, possuindo uma sequência nucleotídica seleccionada a partir de um grupo consistindo em: (SEQ ID.N°:12) e (SEQ. ID.N°:13). Noutra forma de realização, o vector de expressão contém ADN genómico codificando a SEQ ID N°:14. 6 A invenção refere-se, igualmente, a uma célula hospedeira recombinante contendo um gene clonado recombinantemente codificando a SEQ 10 N°:14.De um modo preferido, o gene possui uma sequência nucleotidica seleccionada a partir de um grupo consistindo em: (SEQ. ID.N°:12); (SEQ. ID.N°:13). Noutra forma de realização, o gene clonado é ADN genómico. A invenção contempla, igualmente, proteína isolada possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:14 que, quando combinada com uma proteína da subunidade α Humana do canal de sódio numa célula, permite o fluxo do ião de sódio na célula. A invenção refere-se a um processo para a expressão de uma proteina numa célula hospedeira, compreendendo as etapas de; (a) introdução numa célula de um vector de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos, possuindo a sequência de SEQ ID N°: 12 ou a sua sequência complementar ou a SEQ ID N°:13 ou a sua sequência complementar; (b) cultura da célula da etapa (a) sob condições que permitem a expressão de uma proteina codificada pela sequência nucleotidica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - São apresentadas a sequência de aminoácidos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio dependente de voltagem alinhada com (A) a subunidade βΙΑ de rato do canal de sódio dependente de voltagem e (B) subunidade βΐ Humana do canal de sódio dependente de voltagem. A identidade global entre as subunidades βΙΑ de VGSC humana e de rato é cerca de 72%, enquanto a identidade das suas regiões 7 terminais carboxilo é inferior a 33%. A identidade global das subunidades βΙΑ e βΐ de VGSC humanas é de 75%, porém a identidade das suas regiões terminais carboxilo é inferior a 17%. A Figura 2 ilustra a organização genómica e transcricional do gene de βΐ humana (SCN1B). 0 gene codificando as subunidades βΐ e βΙΑ do canal de sódio abrange cerca de 9-10 kb no cromossoma 19, contendo sete exões (1, 2, 3, 4A, 4, 5 e 6) e cinco intrões. Um exão alternativo 4A situa-se na região 5' do intrão 3. A subunidade βΐ humana é codificada pelo exão 1 - 3 e 4 - 6, enquanto a βΙΑ humana pelo exão 1 — 3 e exão 4A. A Figura 3 demonstra a co-expressão das subunidades βΙΑ e Nav 1.2 em oócito de Xenopus. O pico de corrente iónica conduzida por Nav 1.2 era aumentado de modo dependente da dose pela sua co-expressão com a subunidade βΙΑ em oócitos. As razões de ARNc das subunidades Nav 1.2 e βΙΑ estão indicadas na parte de baixo das barras. As médias dos dados foram calculadas do número de oócitos apresentado por cima das barras. As barras de erro representam o SEM. A Figura 4 ilustra a intensidade de marcação de βΙΑ em neurónios DRG em ratos normais e em ratos SNL em diversos tempos pós-cirurgia. As barras apresentadas representam a marcação em neurónios nociceptivos (barras em branco) e sensoriais (barras a sombreado) . N = 3 — 5 animais por grupo e 30 - 40 neurónios de cada tipo por animal. A intensidade da marcação em cada tipo neuronal a cada nivel de DRG aumentou com o tempo após cirurgia (ver tabela 1 para análise estatística). 8 A Figura 5 ilustra a intensidade de marcação de βΐ em neurónios DRG em ratos normais e em ratos SNL, em diversos tempos pós-cirurgia. As barras apresentadas representam a marcação em neurónios nociceptivos (barras em branco) e sensoriais (barras a sombreado) . N = 3 - 5 animais por grupo e 30 - 40 neurónios de cada tipo por animal. A intensidade da marcação variou com o tempo após cirurgia (ver tabela 1 para resultados estatísticos).

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições O termo "domínio proteico" como aqui utilizado refere-se a uma região de uma proteína que pode enrolar-se numa estrutura tridimensional estável, independente do resto da proteína. Esta estrutura pode manter uma função específica dentro da proteína, incluindo o sítio de actividade enzimática, criação de um motivo de reconhecimento para outra molécula ou proporcionar componentes estruturais necessários para a existência de uma proteína num determinado ambiente. Os domínios proteicos são normalmente regiões de proteínas evolutivamente conservadas, tanto no seio de uma família de proteínas como no seio de superfamílias proteicas que desempenham funções semelhantes. O termo "superfamília de proteínas" como aqui utilizado refere-se a proteínas cuja relação evolutiva pode não estar inteiramente estabelecida ou pode ser distante por padrões filogenéticos reconhecidos, porém apresentam uma estrutura tridimensional semelhante ou exibem consensos únicos de aminoácidos críticos. O termo "família de proteínas" como aqui utilizado refere-se a 9 proteínas cuja relação evolutiva foi estabelecida por padrões filogenéticos reconhecidos. 0 termo "proteína de fusão" como aqui utilizado refere-se a construções de proteínas que são o resultado da combinação de múltiplos domínios proteicos ou regiões de ligação. As proteínas de fusão são criadas muito frequentemente por clonagem molecular das sequências nucleotídicas para resultar na criação de uma nova sequência polinucleotídica que codifica para a proteína desejada. Alternativamente, a criação de uma proteína de fusão pode ser realizada ligando quimicamente duas proteínas uma a outra. 0 termo "região de ligação" ou "domínio de ligação" ou termos descritivos semelhantes, como aqui utilizados, referem-se a extensões de sequência polinucleotídica ou polipeptídica que são utilizadas na construção de um vector de clonagem ou proteína de fusão. As funções de uma região de ligação podem incluir a introdução de sítios de clonagem na sequência nucleotídica, a introdução de um componente flexível ou região criadora de espaço entre dois domínios proteicos ou a criação de uma marca de afinidade para interacção molecular específica. Uma região de ligação pode ser introduzida numa proteína de fusão sem um fim específico, porém resulta de escolhas feitas durante a clonagem. 0 termo "sítio de clonagem" ou "sítio de policlonagem", como aqui utilizado, refere-se a uma região da sequência nucleotídica contida dentro de um vector de clonagem ou manipulada dentro de uma proteína de fusão, que tem uma ou mais sequências consenso de endonucleases de restrição disponíveis. Estas sequências nucleotídicas podem ser introduzidas dentro de 10 outros vectores de clonagem para facilitar a clonagem, a criação de novas proteínas de fusão ou estas podem ser utilizadas para introduzir mutações dirigidas pontuais especificas. É bem conhecido pelos especialistas na técnica que os sitios de clonagem podem ser manipulados numa localização desejada por intermédio de mutação silenciosa, mutação conservada ou introdução de uma região de ligação que contém sequências consenso de enzimas de restrição desejadas. É igualmente bem conhecido pelos especialistas na técnica que a localização exacta de um sitio de clonagem pode ser flexivel, desde que a função desejada da proteina ou seu fragmento a clonar seja mantida. 0 termo "marca" como aqui utilizado refere-se a uma sequência nucleotidica que codifica uma sequência de aminoácidos que facilita o isolamento, purificação ou detecção de uma proteina de fusão que contém a marca. Uma ampla variedade de tais marcas é conhecida dos especialistas na técnica e são adequadas para utilização na presente invenção. Marcas adequadas incluem mas não estão limitadas a peptideo HA, peptideos de poli-histidina, biotina/avidina e outros sitios de ligação de epitopos a anticorpos.

Isolamento do ácido nucleico da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio dependente de voltagem 0 canal de sódio dependente de voltagem é um complexo proteico de múltiplas subunidades contendo uma subunidade formadora de poro α e duas subunidades reguladoras, βΐ e β2. Enquanto a subunidade α determina as propriedades básicas do canal, as subunidades βΐ e β2 modulam quase todos os aspectos 11 das propriedades de canal, incluindo a activação de porta dependente de voltagem, activação e inactivação dependente de voltagem e, de forma muito notável, densidade crescente de canais funcionais na membrana. A partir de perspectivas farmacológicas e electrofisiológicas moleculares, existem mais subtipos de canal de sódio dependente de voltagem nas células excitáveis do que subunidades α clonadas. 0 que pode dever-se, em parte, à existência de mais subunidades α na natureza a serem clonadas e caracterizadas. Por outro lado, pode igualmente supor-se que possa existir mais de um tipo de subunidades βΐ e β2. Por outras palavras, a variedade de canais de sódio dependentes de voltagem pode resultar da associação dos diferentes tipos de subunidades α a um tipo de subunidade βΐ e β2 e vice-versa. De facto, o estudo bioquímico tinha revelado que existe mais do que um tipo de subunidade βΐ de canal de sódio, como determinado por transferência Western com anticorpo específico de βΐ (Sutkowski, et al., 1990).

Recentemente foi clonada a βΙΑ, uma nova subunidade do canal de sódio dependente de voltagem e variante de excisão de βΐ, e foi referido que aumenta a densidade da corrente de sódio na membrana plasmática e que altera a cinética dependente de voltagem, quando co-expressa com as subunidades αΙΙΑ em fibroblastos CHL (Kazan-Gillespie et al., 2000). A βΙΑ é regulada em termos de desenvolvimento no cérebro. Os estudos da distribuição subcelular da unidade βΙΑ de VGSC de rato demonstraram que estava alterada, para além de estar regulada positivamente nos neurónios DRG, em consequência de lesão nervosa periférica. Além disso, a subunidade βΙΑ de VGSC de rato pode ser importante na regulação da aberrante série de canais de sódio expressa após lesão nervosa. 12 A fim de estudar a subunidade βΙΑ humana, procurou clonar-se, primeiro, a subunidade utilizando uma estratégia de clonagem homóloga. Visto que a βΙΑ é um variante de excisão intrónico retido na extremidade carboxilo da subunidade βΐ, o iniciador directo foi concebido com base na subunidade βΐ de VGSC humana; ao passo que o iniciador inverso foi concebido com base na subunidade βΙΑ de VGSC de rato. Inesperadamente, este par de iniciadores não amplificou nenhum fragmento de ADN a partir de bancos de ADNc preparados para Marathon™ de glândula supra-renal, cérebro fetal e de cérebro adulto humano. Foram então concebidos três iniciadores inversos diferentes com base na sequência codificando a extremidade carboxilo da subunidade βΙΑ de rato. Contudo, nenhum destes iniciadores emparelhados com o iniciador directo conseguiu amplificar qualquer fragmento de ADN a partir dos bancos de ADNc anteriores, com diversas condições de PCR, sugerindo que a subunidade βΙΑ de VGSC humana era significativamente diferente da sua equivalente no rato. A fim de clonar o variante de excisão da subunidade βΙΑ de VGSC humana, foi utilizada a técnica de Amplificação Rápida da Extremidade de ADNc (RACE-PCR). Ao contrário do RT-PCR normal, que requer dois iniciadores específicos do gene, o RACE-PCR requer apenas um iniciador específico que emparelha com um iniciador universal (AP1 ou AP2) para amplificação por RT-PCR. Isto requer a adição de um adaptador reconhecido pelo iniciador universal à extremidade de cada ADNc aquando da preparação do banco. Actualmente, este tipo de banco de ADNc encontra-se disponível comercialmente (banco de ADNc preparado para Marathon™, Clontech) . Por conseguinte, por intermédio desta técnica, a subunidade βΙΑ de VGSC humana poderia ser amplificada com um iniciador específico da βΐ humana (SB1-10, ver exemplo 1) sem o conhecimento da sequência da extremidade carboxilo de βΙΑ 13 humana. A dificuldade técnica desta aplicação consiste em distinguir eficazmente a nova βΙΑ da subunidade βΐ, em virtude da utilização do iniciador especifico da subunidade βΐ para o RACE-PCR. Para resolver este problema, os transformantes foram pré-pesquisados por PCR com um par de iniciadores reconhecendo, apenas, a subunidade βΐ de VGSC humana e os clones negativos (que não poderiam ser amplificados por este PCR) seriam submetidos a caracterização e sequenciação adicionais. Com esta estratégia, foi clonada uma nova subunidade βΙΑ de VGSC humana a partir do banco de ADNc preparado para Marathon™ de glândula supra-renal humana e amplificado subsequentemente a partir do banco de ADNc preparado para Marathon™ de cérebro fetal humano com iniciadores específicos da βΙΑ humana. A análise da sequência primária revelou que a subunidade βΙΑ de VGSC humana é, igualmente, uma variante de excisão da subunidade βΐ com um intrão retido e codão de terminação em fase. Esta nova subunidade β de VGSC contém igualmente a estrutura básica da subunidade β de VGSC: um motivo amino-terminal extracelular de tipo imunoglobulina e um domínio transmembranar carboxilo-terminal. Contudo, a subunidade βΙΑ de VGSC humana é significativamente diferente da sua equivalente de rato. Estas partilham apenas cerca de 35% de identidade na sua região codificante terminal carboxilo. A presente invenção refere-se a ADN codificando a subunidade βΙΑ de VGSC humana que foi isolado a partir de células produtoras de subunidade βΙΑ de VGSC humana. 0 termo "subunidade βΙΑ de VGSC humana", como aqui utilizado, refere-se a proteína que pode funcionar especificamente como uma subunidade de canal. Ou seja, pode combinar-se com outras 14 subunidades proteicas para formar um canal de cálcio que funciona. A proteina recombinante é útil para identificar moduladores da subunidade βΙΑ de VGSC humana funcional. A análise de transferência Northern demonstrou que a subunidade βΙΑ de VGSC estava amplamente distribuída numa variedade de tecidos incluindo, nomeadamente, no cérebro, coração, músculo esquelético, fígado, pulmão, placenta, rim e pâncreas. No cérebro, a subunidade βΙΑ de VGSC expressa mais elevadamente na região do cerebelo. 0 estudo imuno-histoquímico demonstra igualmente, que a βΙΑ de VGSC era expressa, não apenas nos gânglios das raízes dorsais (DRG), mas está igualmente regulada positivamente após lesão nervosa, sugerindo que desempenha um papel na dor neuropática. A alteração na expressão e/ou função do canal de sódio pode ter uma profunda influência nas propriedades de activação de neurónios periféricos e centrais e muitos outros tecidos.

Além disso, como proporcionado no Exemplo 12 a seguir, a expressão da subunidade βΙΑ e βΐ foi investigada em neurónios DRG a partir de um modelo de ligação nervosa de dor neuropática em ratos utilizando a imuno-histoquímica e análise de imagem. Os níveis de expressão da subunidade βΙΑ e de βΐ estavam aumentados, mais notavelmente nos neurónios DRG nociceptivos, embora se verificassem igualmente aumentos nos neurónios DRG sensoriais. Contudo, a marcação subcelular destes dois polipeptídeos diferiu drasticamente nos neurónios DRG após lesão nervosa periférica. Estes estudos demonstraram que a lesão nervosa periférica está associada à regulação positiva da subunidade βΙΑ e subunidades βΐ do canal de sódio e a padrões de distribuição celular alterados de βΙΑ em DRG. Esta é a prova que 15 a subunidade βΙΑ do canal de sódio é importante na regulação da expressão aberrante do canal de sódio em neurónios DRG após lesão nervosa.

Pode ser utilizada uma variedade de células e linhas celulares para isolar ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, utilizando iniciadores seleccionados com base na sequência nucleotidica codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio.

Pode utilizar-se qualquer um de uma variedade de processos conhecidos na técnica para clonar molecularmente ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, a fim de obter sequências relacionadas ou variantes alélicos. Estes métodos incluem mas não estão limitados a expressão funcional directa dos genes da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, no seguimento da construção de um banco de ADNc contendo a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, num sistema vector de expressão apropriado. Outro método consiste em pesquisar um banco de ADNc contendo a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, construído num vector vaivém de bacteriófago ou plasmídico com uma sonda oligonucleotídica marcada, concebida a partir da sequência de aminoácidos das subunidades da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Um método adicional consiste em pesquisar um banco de ADNc contendo a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, construído num vector vaivém de bacteriófago ou plasmídico com um ADNc parcial codificando a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Este ADNc parcial é obtido pela amplificação de PCR específica de fragmentos de ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, através da concepção de iniciadores oligonucleotídicos degenerados a partir da 16 sequência de aminoácidos da proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio purificada.

Outro método consiste em isolar ARN a partir de células produtoras da subunidade βΙΑ de VGSC humana e traduzir o ARN em proteína por meio de um sistema de tradução in vitro ou in vivo. A tradução do ARN em um peptídeo ou proteína resultará na produção de, pelo menos, uma parte da proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio que pode ser identificada, por exemplo, pela reactividade imunológica com um anticorpo anti-subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio ou pela actividade biológica da proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Neste método, os agregados de ARN isolado a partir de células produtoras da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio podem ser analisados quanto à presença de um ARN que codifica, pelo menos, uma parte da proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. 0 fraccionamento adicional do agregado de ARN resulta na purificação do ARN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio a partir do ARN da subunidade βΙΑ não Humana do canal de sódio. 0 peptídeo ou proteína produzida por este método pode ser analisada para proporcionar sequências de aminoácidos que, por sua vez, são utilizadas para proporcionar iniciadores para a produção de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, ou o ARN utilizado para tradução pode ser analisado para proporcionar sequências nucleotídicas codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e produzir sondas para esta produção de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Este método é conhecido na técnica e pode consultar-se, por exemplo, em Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989. 17 É facilmente perceptível para os especialistas na técnica que bancos de ADNc adequados podem ser preparados a partir de células ou linhas celulares que possuam actividade de subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. A selecção de células ou linhas celulares para utilização na preparação de um banco de ADNc para isolar ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser efectuada, em primeiro lugar, pela medição da actividade associada às células da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, utilizando a medição da actividade biológica associada à subunidade βίΑ Humana do canal de sódio ou um ensaio de ligação de ligando. A preparação de bancos de ADNc pode ser realizada por intermédio de técnicas padrão bem conhecidas na técnica. Técnicas de construção de bancos de ADNc bem conhecidas podem consultar-se, por exemplo, em Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) . É igualmente facilmente perceptível para os especialistas na técnica que ADN codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser igualmente isolado a partir de um banco de ADN genómico adequado. A construção de bancos de ADN genómico pode ser realizada por intermédio de técnicas padrão bem conhecidas na técnica. Técnicas de construção de bancos de ADN genómico bem conhecidas podem consultar-se em Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989). 18 A fim de clonar o gene da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pelos métodos supracitados, pode ser necessária a sequência de aminoácidos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Para realizar isto, pode purificar-se a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e determinar-se a sequência parcial de aminoácidos por intermédio de sequenciadores automatizados. Não é necessário determinar a sequência completa de aminoácidos, não obstante a sequência linear de duas regiões de 6 a 8 aminoácidos da proteína ser determinada para a produção de iniciadores para amplificação por PCR de um fragmento parcial de ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio.

Após terem sido identificadas as sequências adequadas de aminoácidos, as sequências de ADN capazes de as codificar são sintetizadas. Dado que o código genético é degenerado, pode ser utilizado mais de um codão para codificar um determinado aminoácido e, por conseguinte, a sequência de aminoácidos pode ser codificada por qualquer um de um conjunto de oligonucleotídeos de ADN semelhantes. Apenas um membro do conjunto será idêntico à sequência da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio mas será capaz de se hibridizar ao ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, até mesmo na presença de oligonucleotídeos de ADN com disparidades. Os oligonucleotídeos de ADN com disparidades podem, todavia, hibridizar-se suficientemente ao ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio para permitir a identificação e isolamento do ADN codificante da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. 0 ADN isolado através destes métodos pode ser utilizado para pesquisar bancos de ADN de uma variedade de tipos celulares, desde fontes de invertebrados e vertebrados, e para isolar genes homólogos. 19 A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio biologicamente activa purificada pode apresentar várias formas físicas diferentes. A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode existir enquanto polipeptídeo de comprimento completo nascente ou não processado, ou enquanto polipeptídeos parcialmente processados ou combinações de polipeptídeos processados. 0 polipeptídeo nascente de comprimento completo da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser modificado pós-tradução através de eventos específicos de clivagem proteolítica que resultam na formação de fragmentos do polipeptídeo nascente de comprimento completo. Um fragmento ou associação física de fragmentos pode possuir a actividade biológica completa associada à subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, contudo, o grau de actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode variar entre fragmentos individuais da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e fragmentos polipeptídicos fisicamente associados da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio.

Dado que o código genético é degenerado, pode ser utilizado mais de um codão para codificar um determinado aminoácido e, por conseguinte, a sequência de aminoácidos pode ser codificada por qualquer um de um conjunto de oligonucleotídeos de ADN semelhantes. Apenas um membro do conjunto será idêntico à sequência da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio mas será capaz de se hibridizar ao ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, até mesmo na presença de oligonucleotídeos de ADN com disparidades sob condições apropriadas. Em condições alternativas, os oligonucleotídeos de ADN com disparidades podem, todavia, hibridizar-se suficientemente ao ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio para permitir a identificação e isolamento do ADN codificante da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. 20 0 ADN codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio de um determinado organismo pode ser utilizado para isolar e purificar homólogos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio de outros organismos. Para realizar isto, o primeiro ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser misturado com uma amostra que contém ADN codificando homólogos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio sob condições de hibridização apropriadas. 0 complexo de ADN hibridizado pode ser isolado e o ADN codificando o ADN homólogo por ser purificado a partir deste. IDENTIDADE ou SEMELHANÇA, como conhecido na técnica, são relações entre duas ou mais sequências polipeptidicas ou duas ou mais sequências polinucleotidicas, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, a identidade significa igualmente o grau de parentesco entre sequências polipeptidicas ou polinucleotidicas, consoante o caso, conforme determinado pela correspondência entre fiadas de tais sequências. Tanto a identidade como a semelhança podem ser facilmente calculadas (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova

Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsia, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991) . Embora exista um certo número de métodos para medir a identidade e semelhança entre duas sequências polinucleotidicas ou polipeptidicas, ambos os termos são bem conhecidos dos especialistas (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis 21

Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., (1988) SIAM J. Applied Math., 48, 1073). Os métodos geralmente empregues para determinar a identidade ou semelhança entre sequências incluem, mas não estão limitados aos divulgados em Carillo, H., e Lipman, D., (1988) SIAM J. Applied Math., 48, 1073. Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para proporcionar a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e semelhança são codificados em programas informáticos. Os métodos preferidos de programas informáticos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., (1984) Nucleic Acids Research 12(1), 387), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul, S. F. et al., (1990) J. Molec. Biol. 215, 403). POLINUCLEOTÍDEO(S) refere-se, geralmente, a qualquer polirribonucleotideo ou polidesoxirribonucleotideo, que pode ser ARN ou ADN não modificado ou ARN ou ADN modificado. Deste modo, por exemplo, polinucleotídeos como aqui utilizado refere-se, entre outros, a ADN monocatenário e bicatenário, ADN que é uma mistura de regiões monocatenárias e bicatenárias ou regiões monocatenárias, bicatenárias e tricatenárias, ARN monocatenário e bicatenário, e ARN que é mistura de regiões monocatenárias e bicatenárias, moléculas hibridas compreendendo ADN e ARN que pode ser monocatenário ou, mais normalmente, bicatenário, ou tricatenário, ou uma mistura de regiões monocatenárias e bicatenárias. Adicionalmente, polinucleotídeo como aqui utilizado refere-se a regiões tricatenárias compreendendo ARN ou ADN ou tanto ARN como ADN. As cadeias em tais regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir a totalidade de uma ou mais das moléculas, porém mais 22 normalmente envolvem, apenas, uma região de algumas das moléculas. Uma das moléculas de uma região de helicoidal tripla é frequentemente um oligonucleotídeo. Como aqui utilizado, o termo polinucleotideo inclui ADN ou ARN como anteriormente descrito que contém uma ou mais bases modificadas. Deste modo, ADN ou ARN com esqueletos modificados devido a estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" de acordo com o presente significado do termo. Além disso, ADN ou ARN compreendendo bases invulgares, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiladas, para referir apenas dois exemplos, são polinucleotídeos de acordo com o presente significado do termo. Será entendido que uma grande variedade de modificações foi efectuada ao ADN e ARN que serve muitos objectivos úteis conhecidos dos especialistas na técnica. 0 termo polinucleotideo como é aqui empregue, engloba tais formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, bem como as formas químicas de ADN e ARN características de vírus e células, incluindo células simples e complexas, inter alia. Os polinucleotídeos englobam polinucleotídeos curtos, frequentemente referidos como oligonucleotídeo (s) . 0 termo polipeptídeos, como aqui utilizado, refere-se à estrutura química básica de polipeptídeos que é bem conhecida e foi descrita em inumeráveis manuais escolares e outras publicações na técnica. Neste contexto, o termo é aqui utilizado para se referir a qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si numa cadeia linear por ligações peptídicas. Como aqui utilizado, o termo refere-se tanto a cadeias curtas, que habitualmente também são referidas na técnica por peptídeos, oligopeptídeos e oligómeros, por exemplo, como a cadeias mais compridas que, geralmente, são 23 referidas na técnica por proteínas, das quais existem muitos tipos. Será entendido que os polipeptídeos contêm, frequentemente, aminoácidos excluindo os 20 aminoácidos habitualmente referidos como os 20 aminoácidos de ocorrência natural e que muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, podem ser modificados num dado peptídeo, quer por processos naturais, tais como processamento e outras modificações pós-tradução, mas igualmente por técnicas de modificação química que são bem conhecidas da técnica. Até mesmo as modificações comuns que ocorrem naturalmente em polipeptídeos são demasiado numerosas para serem aqui listadas exaustivamente encontrando-se, não obstante, bem descritas em textos de base e em monografias mais pormenorizadas, bem como numa volumosa literatura de investigação e são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Os polipeptídeos da presente invenção incluem o polipeptídeo de SEQ. ID.N°:14 (em particular, o polipeptídeo maduro).

Expressão recombinante da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio O ADN clonado da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, obtido através dos métodos aqui descritos, pode ser expresso recombinantemente por clonagem molecular num vector de expressão contendo um promotor adequado e outros elementos reguladores de transcrição adequados, e transferido para células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas para produzir a proteína recombinante da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. As 24 técnicas para tais manipulações estão totalmente descritas em Maniatis, T, et al., supra, e são bem conhecidas na técnica.

Os vectores de expressão são aqui definidos como sequências de ADN que são requeridas para a transcrição de cópias clonadas de genes e para a tradução dos seus ARNm num hospedeiro apropriado. Tais vectores podem ser utilizados para expressar genes eucarióticos numa variedade de hospedeiros, tais como bactérias incluindo E. coli de algas azuis-verdes, células vegetais, células de insecto, células de fungos, incluindo células de levedura e células animais.

Vectores especificamente concebidos permitem o vaivém de ADN entre hospedeiros, tais como bactérias-levedura ou bactérias-células animais ou bactérias-células de fungos ou bactérias-células de invertebrados. Um vector de expressão apropriadamente construído deve conter: uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras, marcadores seleccionáveis, um número limitado de sítios de enzimas de restrição úteis, um potencial para elevado número de cópia e promotores activos. Um promotor é definido como uma sequência de ADN que direcciona a ARN polimerase para se ligar a ADN e iniciar a síntese de ARN. Um promotor forte é aquele que faz com que os ARNm sejam iniciados com elevada frequência. Os vectores de expressão podem incluir mas não estão limitados a vectores de clonagem, vectores de clonagem modificados, plasmídeos especificamente concebidos ou vírus.

Uma variedade de vectores de expressão de mamífero pode ser utilizada para expressar a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante em células de mamífero. Vectores de expressão de mamífero comercialmente disponíveis que podem ser adequados 25 para a expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante incluem mas não estão limitados a pMAMneo (Clontech), vectores plRES (Clontech), pTET-On e pTET-Off (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene) , pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593, ATCC, Manassas, VA) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) e 1ZD35 (ATCC 37565).

Uma variedade de vectores de expressão bacterianos pode ser utilizada para expressar a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante em células bacterianas. Vectores de expressão bacterianos comercialmente disponíveis que podem ser adequados para a expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante incluem mas não estão limitados a vectores pET (Novagen), vectores pGEX (Pharmacia) e vectores pQE (Qiagen).

Uma variedade de vectores de expressão de células de fungos pode ser utilizada para expressar a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante em células de fungos tal como a levedura. Vectores de expressão de células de fungos comercialmente disponíveis que podem ser adequados para a expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante incluem, mas não estão limitados a pYES2 (Invitrogen) e vector de expressão Pi chia (Invitrogen) .

Uma variedade de vectores de expressão de células de insecto pode ser utilizada para expressar a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante em células de insecto. Vectores de expressão de células de insecto comercialmente disponíveis que podem ser adequados para a expressão da 26 subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante incluem mas não estão limitados a pBlueBacII (Invitrogen). 0 ADN codificando a SEQ ID N°:14 pode ser clonado num vector de expressão para expressão numa célula hospedeira recombinante. As células hospedeiras recombinantes podem ser procarióticas ou eucarióticas incluindo mas não limitado a bactérias, tais como E. coli, células de fungos, tais como levedura, células de mamifero incluindo, mas não limitado a linhas celulares de origem humana, bovina, porcina, de macaco e roedora, e células de insecto incluindo mas não limitado a linhas celulares derivadas de drosófila e bicho-da-seda. Linhas celulares derivadas de espécies de mamifero que podem ser adequadas e que estão comercialmente disponíveis incluem, mas não estão limitadas a CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, HEK-293 (ATCC CRL1573), PC12 (ATCC CRL-1721). O vector de expressão pode ser introduzido em células hospedeiras por meio de qualquer uma de várias técnicas incluindo, mas não limitado a transformação, transfecção, fusão de protoplastos, lipofecção e electroporação. As células contendo vectores de expressão são propagadas clonalmente e individualmente analisadas a fim de determinar se produzem a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. A identificação dos clones de células hospedeiras expressando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser efectuada por diversos meios incluindo, mas não limitado a reactividade imunológica com anticorpos anti-subunidade βΙΑ Humana do canal 27 de sódio e pela presença de actividade de subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio associada a células hospedeiras. A expressão de ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser igualmente realizada utilizando ARNm sintético produzido in vitro. ARNm sintético ou ARNm isolado a partir de células produtoras de SEQ ID N°:14 pode ser eficientemente traduzido em diversos sistemas isentos de células incluindo mas não limitado a extractos de gérmen de trigo e extractos de reticulócitos, bem como eficientemente traduzido em sistemas baseados em células incluindo, mas não limitado a micro-injecção em oócitos de rã, com a micro-injecção em oócitos de rã sendo geralmente preferida. A fim de determinar a(s) sequência(s) de ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio que produz(em) níveis óptimos de actividade de subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e/ou proteína de subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, podem ser construídas moléculas de ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio incluindo mas não limitado ao seguinte: a fase de leitura aberta de comprimento completo do ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio codificando a proteína de 32 kDa desde, aproximadamente, a base 4 até, aproximadamente, à base 808 (estes números correspondem ao primeiro nucleotídeo da primeira metionina e último nucleotídeo antes do primeiro codâo de terminação) e diversas construções contendo partes do ADNc codificando a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio — todas as construções podem ser concebidas para conter nenhuma, todas ou partes da região em 5' ou em 3' não traduzida do ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. A actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e níveis de expressão proteica podem ser determinados no seguimento da introdução, 28 tanto isoladamente como em combinação, destas construções em células hospedeiras apropriadas. Após a determinação de que a cassete de ADN da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio produz expressão óptima em ensaios transientes, esta construção de ADN da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio é transferida para uma variedade de vectores de expressão, para expressão em células hospedeiras incluindo mas não limitado a células de mamífero, células de insecto infectadas com baculovírus, E. coli, e a levedura S. cerevisiae. Métodos de ensaio para a subunidade βίΑ Humana do canal de sódio

Os transfectantes de células hospedeiras e oócitos micro-injectados podem ser utilizados para ensaiar, tanto os níveis de actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio funcional, como os níveis de proteína total da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio, através dos seguintes métodos. No caso de células hospedeiras recombinantes, isto implica a co-transfecção de um ou, possivelmente, dois ou mais plasmídeos contendo o ADN da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio codificando um ou mais fragmentos ou subunidades. No caso de oócitos, isto implica a co-injecção de ARN sintéticos para a proteína da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio. Após um período de tempo apropriado para permitir a expressão, a proteína celular é marcada metabolicamente com, por exemplo, 35S-metionina durante 24 horas, após o qual os lisados celulares e sobrenadantes da cultura de células são recolhidos e submetidos a imunoprecipitação com anticorpos policlonais dirigidos contra a proteína da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio. 29

Os níveis proteicos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio nas células hospedeiras são quantificados através de técnicas de imunoafinidade e/ou afinidade de ligando. As células que expressam a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio podem ser ensaiadas relativamente ao número de moléculas da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio expressas pela medição da quantidade de [ligando] radioactivo que se liga às membranas celulares. Esférulas de afinidade específicas da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio ou anticorpos específicos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são utilizados para isolar, por exemplo, a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio marcada com 35S-metionina ou não marcada. A proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio marcada é analisada por SDS-PAGE. A proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio não marcada é detectada por intermédio de ensaios de transferência Western, ELISA ou RIA empregando anticorpos específicos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio.

Outros métodos para detectar a actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio implicam a medição directa da actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio em células intactas transfectadas com ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio ou oócitos injectados com ARNm da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio e, facultativamente, ARNm da subunidade α do canal de sódio. A actividade da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio é medida pelas características biológicas das células hospedeiras que expressam ADN da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. No caso de células hospedeiras recombinantes que expressam a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, podem utilizar-se técnicas de voltagem de patch clamp para medir a actividade de canal e quantificar a modificação de um fluxo iónico da subunidade do canal de sódio em função da proteína da 30 subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. No caso de patch clamp de oócitos, bem como de duplo eléctrodo, as técnicas de voltagem clamp podem utilizar-se para medir a actividade de canal de sódio e quantificar a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio.

Purificação de proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio

Após a expressão de SEQ ID N°:14 numa célula hospedeira recombinante, a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio pode ser recuperada para proporcionar a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio purificada na forma activa. Estão disponíveis e são adequados para utilização diversos processos de purificação da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Como anteriormente descrito para a purificação de SEQ ID N°:14 a partir de fontes naturais, uma subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante pode ser purificada a partir de lisados e extractos celulares ou a partir de meio de cultura condicionado, através de diversas combinações ou aplicação individual de fraccionamento de sal, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção de hidroxilapatite e cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de lectina e cromatografia de afinidade de anticorpo/ligando.

As subunidades βΙΑ humanas do canal de sódio recombinantes podem ser separadas de outras proteínas celulares através da utilização de uma coluna de imunoafinidade, preparada com anticorpos monoclonais ou policlonais específicos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio nascente de comprimento completo, 31 fragmentos polipeptídicos da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio ou subunidades da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. A resina de afinidade é depois equilibrada num tampão adequado, por exemplo, solução salina tamponada com fosfatos (pH 7,3) e os sobrenadantes da cultura de células ou extractos celulares contendo uma subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio ou subunidades da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são passados lentamente através da coluna. A coluna é depois lavada com o tampão até que a densidade óptica (A28o) desça para niveis do ruido de fundo, em seguida a proteína é eluída pela alteração do estado do tampão, tal como pela diminuição do pH utilizando um tampão tal como glicina-HCl a 0,23 M (pH 2,6). A proteína é em seguida dialisada contra um tampão adequado tal como solução salina tamponada com fosfatos.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção. EXEMPLO 1

Clonagem Subunidade βΙΑ Humana do Canal de Sódio

Amplificação Rápida da Extremidade de ADNc (RACE-PCR): O banco de ADNc (Cat. No. 7430-1) da glândula supra-renal humana Marathon-Ready™ foi comprado a Clontech (Paio Alto, CA) . O PCR Race primário foi realizado num volume final de 50 pL. A mistura de reacção contém 5 pL de ADNc da glândula supra-renal humana Marathon-Ready™, 5 pL de tampão de reacção 10 x, 200 pM de dNTP, 200 nM de iniciador APl (Clontech, 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' SEQ. ID.N°:01), 200 nM de iniciador específico da subunidade βΐ Humana do canal de sódio SB1-10 (5'-TGG ACC TTC

CGC CAG AAG GGC ACTG-3' SEQ. ID.N°:02) e 1 pL de mistura de ADN 32 polimerase Advatage2 50 x (Clontech). O parâmetro do termociclador para o RACE-PCR foi: desnaturação inicial a 94 °C durante 30 seg, 5 ciclos de 94 °C/5 seg e 72 °C/4 min, 5 ciclos de 94 °C/5 seg e 70 °C/4 min, e 20 ciclos de 94 °C/5 seg e 68 °C/4 min.

Avaliação do produto de RACE-PCR: A qualidade da reacção de RACE-PCR foi avaliada testando se a extremidade carboxilo da subunidade βι Humana do canal de sódio fora amplificada. O qual foi realizado por PCR com 1 pL do produto do RACE-PCR como molde e 200 nM de dois iniciadores específicos da subunidade βι Humana do canal de sódio. Os iniciadores específicos são: um iniciador directo SB1-11 (5'-CTG GAG GAG GAT GAG CGC TTC GAG-3' SEQ. ID.N°:3) situado a jusante de SB1-10 e um iniciador inverso SB1-13 (5'-CTA TTC GGC CAC CTG GAC GCC-3' SEQ. ID.N°:4) situado na extremidade da subunidade βι Humana do canal de sódio. O parâmetro da reacção de PCR foi: desnaturação inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 20 seg, hibridação a 55 °C durante 20 seg e extensão a 72 °C durante 1 min. Como previsto, foi observado um intenso fragmento de ADN de 0,5 kb, sugerindo que o RACE-PCR foi bem sucedido em termos de amplificação da extremidade carboxilo da subunidade βι Humana do canal de sódio.

Clonagem de Produtos de RACE-PCR no vector pPCR-Script: O produto do RACE-PCR foi clonado com o PCR-Script™ Amp Cloning Kit (Statagene, CA) seguindo o protocolo proporcionado pela empresa. Resumidamente, o produto de RACE-PCR foi purificado, em primeiro lugar, pela coluna de purificação de PCR da StrataPrep. Dez pL de produto de RACE-PCR purificado foram, em seguida, cortados em extremidades rombas a 72 °C durante 30 min num volume final de 13 pL com 10 pL de produto de RACE-PCR 33 purificado, 1,3 pL de tampão de polimento, 1 pL de 10 mM de dNTP e 1 pL de 0,5 U/pL de Pfu ADN polimerase clonada. A ligação foi realizada à temperatura ambiente durante 1 hora num volume final de 10 mL contendo 4,5 pL de produto de RACE-PCR cortado em extremidades rombas, 1 pL de vector de clonagem pPCR-Script a 10 ng/pL, 1 pL de tampão de reacção de PCR-Script 10 x, 0,5 pL de rATP a 10 mM, 1 pL de 5 U/pL de enzima de restrição Srfl e 1 pL de 4 U/pL de T4 ADN ligase. A reacção de ligação foi interrompida por aquecimento da amostra a 65 °C durante 10 min e, finalmente, 2 pL da mistura de ligação foram transformados em bactérias XLIO-Gold.

Identificação do Clone β1Α Humano do Canal de Sódio: Visto que o iniciador especifico da subunidade βχ Humana do canal de sódio foi utilizado para o RACE-PCR da extremidade carboxilo da subunidade βχΑ, teoricamente, ambas as subunidades βχ e βχΑ serão clonadas. Para excluir a subunidade βχ, os clones individuais foram caracterizados por PCR com um par de iniciadores para amplificação especifica da subunidade βχ. Os iniciadores utilizados no PCR são: iniciador directo SB1-17 (5'-GTG TCT GAG ATC ATG ATG-3' SEQ. ID.N°:5) e iniciador inverso SB 1-13 (ver anterior). O parâmetro da reacção de PCR foi: desnaturação inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 20 seg, hibridação a 55 °C durante 20 seg e extensão a 72 °C durante 1 min. Todos os clones de PCR negativos são subunidades não βχ e são submetidos a análise de sequenciação adicional.

Clonagem da subunidade β1Α do canal de sódio para ADNc de cérebro fetal humaN0: Com os iniciadores específicos da subunidade β1Α Humana do canal de sódio obtidos por RACE-PCR, foi igualmente clonado o canal de sódio β1Α a partir do banco de ADNc 34 de cérebro fetal humano Marathon-Ready™ (Clontech cat. N° 7402-1, Paio Alto, CA) . O PCR foi realizado num volume final de 50 pL, contendo 5 pL de ADNc de glândula supra-renal humana Marathon-Ready™, 5 pL de tampão de reacção 10 x, 200 pM de dNTP, 200 nM de iniciador SB1-6 (5'-GCC ATG GGG AGG CTG CTG GCC TTA GTG GTC-3' SEQ. ID.N°:6) e iniciador SB1-19 (5'-GTG TGC CTG CAG CTG CTC AA-3' SEQ. ID.N°:7) e 1 pL de mistura de ADN polimerase Advantage2 50 x (Clontech). O parâmetro da reacção de PCR foi: desnaturação inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 20 seg, hibridação a 55 °C durante 20 seg e extensão a 72 °C durante 1 min. Quatro clones independentes foram colhidos e submetidos a análise de sequenciação de ADN bicatenário. Todos os quatro clones independentes de cérebro fetal humano possuem sequências idênticas à subunidade βιΑ clonada por RACE-PCR da glândula supra-renal humana. A região codificante do ácido nucleico da βιΑ humana é proporcionada enquanto SEQ ID N°: 12 e todo o ADNc isolado, incluindo as regiões não traduzidas (UTR), é proporcionado enquanto SEQ ID N°:13. A região 5' não traduzida é idêntica à subunidade βΐ Humana do canal de sódio dependente de voltagem. A região 3' não traduzida tem cerca de 160 pb de comprimento sem a cauda poliA. A tradução principia no ATG iniciando no nucleotideo 4 e termina no codão de terminação no nucleotídeo 808. 35 EXEMPLO 2

Estrutura Primária da Proteína da Subunidade βίΑ Humana do Canal de Sódio Dependente de Voltagem E Estrutura Genómica de βΐ e Gene βίΑ (SCN1B)

Pela utilização de uma técnica de RACE-PCR, foi clonada uma nova subunidade βίΑ Humana do canal de sódio. 0 ADNc continha uma região codificante de 807 pares de bases para 268 aminoácidos e uma região 3' não traduzida de 164 pares de bases. A sequência de aminoácidos traduzida é proporcionada enquanto SEQ ID N°: 14 e inclui uma sequência sinal e sítios de potencial glicosilação ligada a N, bem como um domínio transmembranar. 0 clone, designado βίΑ, é da mesma família da subunidade βΐ do canal de sódio. Os motivos conservados verificados na família da subunidade βΐ do canal de sódio incluem uma sequência sinal peptídica, domínio extracelular de enrolamento de imunoglobulina e domínio transmembranar terminal carboxilo. O peptídeo previsto contém resíduos hidrofóbicos amino-terminais (resíduos 1 — 16) com sequências altamente indiciantes dos sítios de clivagem do sinal que teriam como resultado que as proteínas maduras começassem no aminoácido 17 [alanina]. Os resíduos hidrofóbicos terminais carboxilo (resíduos 243 — 262) podem servir como domínio transmembranar. A massa molecular proteica calculada é cerca de 28,8 kD após remoção do peptídeo sinal da extremidade amino. A subunidade βίΑ Humana do canal de sódio clonada migrou com um Mr aparente de 32 kDa quando analisado por SDS/PAGE a 8 — 20%. A comparação da sequência peptídica revela que o peptídeo previsto é 72% idêntico, tanto à subunidade βΐ Humana do canal de sódio, como à subunidade βίΑ de VGSC de rato. À semelhança da subunidade βίΑ de rato do canal de sódio, a subunidade βίΑ Humana do canal de 36 sódio contém uma região amino terminal (1 — 149) de 100% de identidade em relação à subunidade βΐ humana e uma nova região terminal carboxilo (150 - 268) com uma identidade inferior a 17% em relação à da subunidade βΐ humana (Figura 1) . O estudo da organização genómica do gene da subunidade βΐ Humana do canal de sódio, SCNIB (Makita, et al. 1994) revelou que o gene abrange cerca de 9 kb com seis exões e cinco intrões no cromossoma 19 (19ql3.l-ql3.2). Uma pesquisa blast de sequências genómicas humanas revelou que a região amino terminal da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio (1 — 149) é codificada pelo exão 1—3, ao passo que a nova região terminal carboxilo era codificada pelo intrão 3 adjacente ao exão 3 (Figura 2) . Visto que o sitio de divergência entre o ADNc das subunidades βΐ e βΙΑ se situava precisamente na fronteira exão 3 — intrão 3 do gene SCNIB, a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio deve ser considerada como um variante de excisão da subunidade βΐ por meio do intrão retido com um codão de terminação em fase. Contudo, a região terminal carboxilo da subunidade βΙΑ de VGSC humana é menos de 33% idêntica à subunidade βΙΑ de VGSC de rato. A pesquisa blast de sequência genómica humana com o ADNc codificando a extremidade carboxilo de βΙΑ de rato não identificou qualquer região homóloga no gene βΐ humano, que sugere fortemente que, tanto as extremidades carboxilo de βΙΑ de rato como humanas, são codificadas pelo intrão 3 e a diferença se deve às diferenças de espécie.

Uma pesquisa blast da base de dados NIH com a sequência terminal carboxilo da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio revelou igualmente um clone não atribuído (número de Registo: AI742310) na base de dados humana EST, que foi clonada a partir do agregado de cinco bancos de ADNc normalizados. O clone AI742310 era mais curto, porém 100% idêntico à região terminal 37 carboxilo (resíduos 150 - 268) da βιΑ do canal de sódio humano. A pesquisa blast semelhante não revelou qualquer sequência com mais de 25% de identidade a partir de quaisquer outras bases de dados. EXEMPLO 3 - Para referência

Produção de Anticorpos Policlonais:

Duas sequências peptídicas (HB1A-1 e HB1A-2) derivadas da extremidade carboxilo da subunidade βΙΑ humana foram seleccionadas para produção de anticorpos policlonais em coelhos. As sequências de aminoácidos são: (HB1A-1) AC-RWRDRWQAVDRTGC-AMIDE (SEQ IN N°:08) e (HB1A-2) AC-CVPHRRSGYRTQL-AMIDE (SEQ IN N°:09). Os peptídeos foram sintetizados e os anticorpos foram produzidos e purificados pela BioSource International, Inc. Os anticorpos foram testados por ELISA contra os peptídeos antigénicos e purificados por afinidade com os mesmos peptídeos. Anticorpos do soro e purificados por afinidade foram utilizados para a imunoanálise, tal como transferência Western, imunoprecipitação, imunocitoquímica e imuno-histoquímica. 38 EXEMPLO 4

Análise de tradução in vitro da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio. 0 ADNc da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio foi primeiro clonado no vector pAGA3, o qual foi manipulado para alta eficiência de transcrição e tradução in vitro. Resumidamente, o fragmento de ADNc codificando a subunidade βίΑ Humana do canal de sódio foi excisado da construção pcDNA3.1 (Ver Exemplo 6) pelo digerido com Ncol e Xbal. Um fragmento de ADNc de cerca de 900 pb foi separado em gel de agarose a 1% e purificado pelo Qiaquick Spin Purification Kit (Qiagen). O vector pAGA3 foi igualmente digerido com as enzimas de restrição Ncol e Xbal. O vector linear purificado foi ligado ao fragmento de ADNc e transformado em bactérias. Os recombinantes foram isolados e confirmados através de digestão por enzimas de restrição e sequenciação de ADN. A tradução in vitro da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio foi realizada com ο TnT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) seguindo o protocolo recomendado pelo vendedor. Resumidamente, 1 pg da construção Ηβ1Α/ρΑΰΑ3 foi adicionado a 4 0 pL de TNT Quick Master Mix com 2 pL de [35S]-metionina (1000 Ci/mmmol a 10 mCi/mL) num volume final de 50 pL. A mistura de reacção foi incubada a 30 °C durante 90 min. Cinco pL de mistura de reacção foram misturados com um volume igual de tampão de carregamento de SDS/PAGE e submetidos a 8 - 20% de SDS/PAGE para análise. Após electroforese, o gel foi corado com Azul de Coomassie R250, seco e exposto a filme de raios X. Tanto a βΐ humana como a βίΑ humana migram para o peso molecular previsto pela tradução das 39 sequências de aminoácidos a partir das sequências de ácidos nucleicos correspondentes. A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio traduzida in vitro foi igualmente analisada por transferência Western e imunoprecipitação. EXEMPLO 5

Análise de transferência Northern da expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio

Foi utilizada uma transferência Northern para analisar a distribuição tecidular da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. 0 fragmento de ADNc codificando os resíduos 217 — 268 da βΙΑ Humana do canal de sódio foi utilizado como sonda. Para preparar a sonda, um fragmento de ADN de 153 pb foi primeiro amplificado a partir da construção de ADN (NQC130) contendo ADNc de comprimento completo de βΙΑ Humana do canal de sódio com os iniciadores específicos de βΙΑ Humana do canal de sódio SB1-25 (5'-T CAA AGC ATG CCT GTC CC -3' SEQ.1D.N0. : 10) e SB1-20 (5'-TCA AAC CAC ACC CCG AGA AA-3' SEQ. ID.N0: 11). Após a amplificação, o produto de PCR foi clonado directamente no vector pCR2.1 (Invitrogen) e foi posteriormente confirmado por sequenciação de ADN. A construção resultante NQC226 foi digerida com a enzima de restrição HindIII e o ADN foi depois precipitado após extracção de fenol e clorofórmio. Para marcar a sonda, o fragmento de ADNc anti-sentido foi amplificado linearmente com o kit de PCR Strip-EZ™ (Ambion TX) . A reacção foi realizada num volume final de 20 pL, contendo 25 ng de NQC226 linearizado, 2 pL de tampão de reacção 10 x, 2 pL de solução de dNTP 10 x, 40 2 pL de [α-32Ρ]-dATP (Amersham Pharmacia Biotech) a 3000 Ci/mmol, 1 U de ADN polimerase termostável e 2 pL de iniciador SB1-20 a 10 pmol/pL. O parâmetro da reacção de PCR foi: desnaturação inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 20 seg, hibridação a 55 °C durante 20 seg e extensão a 72 °C durante 1 min. A sonda marcada foi depois separada do [a-32P] dATP livre com a coluna MicroSpin™ G-50 (Amersham Pharmacia Biotech).

A membrana (Cal. No.7760-1) MTN™ (Multiple Tissue Northern) humana e Membrana MTN™ II de Cérebro Humano (7755-1) foram compradas a Clontech (Paio Alto, CA) . As membranas foram pré-hibridizadas com 5 mL de UltraHyb Solution (Ambion, TX) a 42 °C durante 2 horas e, em seguida, hibridizadas na presença de 1 x 106 cpm/mL de sonda da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio a 42 °C de um dia para o outro. As membranas foram lavadas com 2 x 200 mL de solução 0,2 x SSC/0,1% SDS a 65 °C durante duas horas. Finalmente, as sondas foram expostas a um filme de raios X na arca congeladora a -80 °C de um dia para o outro.

Um fragmento de ADNc de 2,0 kb codificando a β-actina humana foi utilizado como sonda de controlo. As mesmas membranas foram lavadas a 68 °C durante 15 minutos com o kit de remoção Strip-EZ™ proporcionado pela Ambion. As membranas foram em seguida pré-hibridizadas com 5 mL de UltraHyb a 42 °C durante 2 horas e, em seguida, hibridizadas na presença da sonda de β-actina humana durante 2 horas a 42 °C. As membranas foram lavadas com 2 x 200 mL de solução 0,2 x SSC/0,1% SDS a 68 °C durante duas horas. Finalmente, as membranas foram expostas a um filme de raios X na arca congeladora a -80 °C durante 1 hora. 41 A análise por transferência Northern demonstrou que a subunidade βΙΑ de VGSC era altamente expressa, nomeadamente, na maioria das regiões do cérebro humano e músculo esquelético. Foram observados níveis inferiores de expressão no coração, placenta, fígado, rim e pâncreas. No cérebro, a subunidade βΙΑ de VGSC era expressa mais elevadamente na região do cerebelo. 0 tamanho dos transcritos da subunidade βΙΑ de VGSC variou ligeiramente em diferentes tecidos. Contudo, o transcrito principal tinha cerca de 7,5 kb de tamanho. EXEMPLO 6

Clonagem de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio num Vector de Expressão de Mamífero 0 ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio foi clonado nos vectores de expressão de mamífero plRESneo (Clontech) e pcDNA3 (Invitrogen) . Os fragmentos de ADNc codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio foram excisados dos plasmídeos pPCR-Script (NQC128) por digestão com BamHI e Not I, separados por electroforese em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação Qiaquick Spin (Qiagen). 0 vector plRESneo foi igualmente linearizado com BamHI e Notl e purificado, e ligado ao fragmento de ADNc de hblA isolado a partir de NQC128. Os recombinantes foram isolados e confirmados através de digestão por enzimas de restrição e sequenciação de ADN. Os clones NQC141 (ΙιβΙΑ/pIRESneo) foram depois utilizados para transfectar células de neuroblastoma humano (SK-N-SH) pelo SuperFect (Qiagen) seguindo o protocolo do vendedor. Os clones estáveis são seleccionados pelo crescimento na presença de G418. Clones únicos resistentes a G418 são isolados e demonstra-se que 42 contêm o gene intacto da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Os clones que contêm os ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são analisados em termos de expressão utilizando técnicas imunológicas, tais como transferência Western, imunoprecipitação e imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para as proteínas da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. 0 anticorpo é obtido de coelhos inoculados com peptídeos que são sintetizados a partir da sequência de aminoácidos prevista a partir das sequências da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. A expressão é igualmente analisada utilizando o ensaio de influxo de sódio. 0 gene da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio foi inserido no pcDNA3.1 (Invitrogen). 0 fragmento de ADNc codificando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio foi excisado do plasmídeo NQC130 por digestão com Xhol e Notl, e os insertos de ADNc isolados por electroforese em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação Qiaquick Spin (Qiagen). 0 vector, pcDNA3, foi digerido com BamHI e Notl e o vector linear isolado por electroforese em gel e ligado aos insertos de ADNc. Os plasmídeos recombinantes contendo a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio foram isolados e confirmados através de digestão por enzimas de restrição e sequenciação de ADN. 0 clone NQC139 (όβ1Α/ροϋΝΑ3.1) foi utilizado para transfectar transientemente células de neuroblastoma humano (SK-N-SH) por intermédio de SuperFect (Qiagen) e a função de hblA na modulação do influxo de sódio foi testada pelo ensaio de influxo de sódio.

As células que expressam a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio, estavelmente ou transientemente, são utilizadas para testar em termos de expressão de canal e em termos de actividade de ligação de ligando. Estas células são utilizadas para 43 identificar e examinar outros compostos em relação à sua capacidade para modular, inibir ou activar o canal e para competir pela ligação de ligando radioactivo.

As cassetes contendo o ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio na orientação positiva com respeito ao promotor são ligadas aos sítios de restrição apropriados em 3' do promotor e identificados por mapeamento de sítio de restrição e/ou sequenciação. Estes vectores de expressão de ADNc são introduzidos em células hospedeiras fibroblásticas, por exemplo COS-7 (ATCC# CRL1651), e tat CV-1 [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC N° CRL6362) ] por intermédio de métodos padrão incluindo, mas não limitado a electroporação, ou por processos químicos (lipossomas catiónicos, dextrano DEAE, fosfato de cálcio). As células transfectadas e sobrenadantes da cultura de células podem ser recolhidos e analisados quanto à expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio como aqui descrito.

Todos os vectores utilizados na expressão transiente de mamífero podem ser utilizados para estabelecer linhas celulares estáveis expressando a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Espera-se que as construções de ADNc inalteradas da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio clonadas nos vectores de expressão, programem as células hospedeiras para produzirem a proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Adicionalmente, a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio é expressa extracelularmente como proteína segregada pela ligação das construções de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio a ADN codificando a sequência sinal de uma proteína segregada. As células hospedeiras de transfecção incluem, mas não estão limitadas a CV-l-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 44

tk-L [Wigler, et al. Cell 11: 223 (1977)], NS/O e dHFr-CHO

[Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)]. A co-transfecção de qualquer vector contendo ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio com um plasmídeo de selecção de fármaco incluindo mas não limitado a G418, aminoglicosideo fosfotransferase; higromicina, higromicina-B fosfotransferase; APRT, xantina-guanina fosforibosil-transferase, irá permitir a selecção de clones estavelmente transfectados. Os níveis da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são quantificados pelos ensaios aqui descritos.

As construções de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são igualmente ligadas em vectores contendo marcadores de resistência a fármacos amplificáveis, para a produção de clones de células de mamífero, sintetizando os níveis mais elevados possíveis da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio. Após a introdução destas construções nas células, os clones contendo o plasmídeo são seleccionados com o agente apropriado e o isolamento de um clone de superexpressão com um elevado número de cópia de plasmídeos é realizado pela selecção em doses crescentes do agente. A expressão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante é alcançada pela transfecção de ADNc de comprimento completo da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio numa célula hospedeira de mamífero. 45 EXEMPLO 7

Clonagem de ADNc da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio num Vector de Expressão de Baculovirus para Expressão em Células de Insecto

Os vectores de baculovirus, que são derivados do genoma do vírus AcNPV, são concebidos para proporcionar expressão de elevado nível de ADNc na linha Sf9 de células de insecto (ATCC CRL N° 1711) . Os baculovirus recombinantes que expressam ADNc da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio são produzidos através dos seguintes métodos padrão (InVitrogen Maxbac Manual): as construções de ADNc da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio são ligadas ao gene da poliedrina numa variedade de vectores de transferência de baculovirus, incluindo o vector pAC360 e o BlueBac (InVitrogen). Os baculovirus recombinantes são gerados por recombinação homóloga no seguimento da co-transfecção do vector de transferência de baculovirus e ADN genómico AcNPV linearizado [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] em células Sf9. Os vírus recombinantes pAC360 são identificados pela ausência de corpos de inclusão em células infectadas e vírus recombinantes pBlueBac são identificados com base na expressão da B-galactosidase (Summers, M. D. e Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Após a purificação em placas, a expressão da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio é medida pelos ensaios aqui descritos. O ADNc codificando toda a fase de leitura aberta da subunidade βίΑ Humana do canal de sódio é inserido no sítio BamHI de pBlueBacII. As construções na orientação positiva são identificadas por análise de sequência e utilizadas para transfectar células Sf9 na presença de ADN linear de AcNPV de tipo moderado. A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio autêntica verifica-se no citoplasma de células infectadas. A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio activa é extraída de células infectadas através de lise hipotónica ou detergente. EXEMPLO 8

Clonagem de ADNc da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio num vector de expressão de levedura A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio recombinante é produzida na levedura S. cerevisiae, após a inserção do cistrão de ADNc óptimo da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio em vectores de expressão, concebidos para dirigir a expressão intracelular ou extracelular de proteínas heterólogas. No caso da expressão intracelular, vectores, tais como EmBLyex4 ou similares, são ligados ao cistrão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio [Rinas, U. et al., Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989)] . Quanto à expressão extracelular, o cistrão da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio é ligado a vectores de expressão de levedura que fundem um sinal de secreção (um peptídeo de levedura ou mamífero) na extremidade NH2 da proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio [Jacobson, Μ. A., Gene 85: 511-516 (1989); Riett L. e Bellon N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989)]. 47

Estes vectores incluem, mas não estão limitados a pAVEl>6, que funde o sinal da albumina do soro humano ao ADNc expresso [Steep 0. Biotechnology 8: 42-46 (1990)], e o vector pL8PL que funde o sinal da lisozima humana ao ADNc expresso [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728-2732)]. Adicionalmente, a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio é expressa na levedura como proteína de fusão conjugada à ubiquitina utilizando o vector pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705-709 (1989), McDonnell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Os níveis da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio expressa são determinados pelos ensaios aqui descritos. EXEMPLO 9

Purificação da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio Recombinante A subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio produzida recombinantemente pode ser purificada através de cromatografia de afinidade de anticorpo.

As colunas de afinidade de anticorpo da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio são preparadas pela adição de anticorpos anti-subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio a Affigel-10 (Biorad) , um suporte de gel que é pré-activado com

ésteres de N-hidroxisuccinimida, de modo a que os anticorpos formam ligações covalentes com o suporte de esférulas de gel de agarose. Os anticorpos são então conjugados ao gel por meio de ligações amida com o braço espaçador. Os ésteres activados remanescentes são então atenuados com etanolamina HC1 a 1 M 48 (ρΗ 8) . A coluna é lavada com água seguida de glicina HC1 a 0,23 M (pH 2,6) para remover qualquer anticorpo não conjugado ou proteína estranha. A coluna é depois equilibrada em solução salina tamponada com fosfatos (pH 7,3) juntamente com agentes de solubilização de membrana apropriados, tais como detergentes, e os sobrenadantes da cultura de células ou extractos celulares, contendo a subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio solubilizada, são passados lentamente através da coluna. A coluna é em seguida lavada com solução salina tamponada com fosfatos juntamente com detergentes, até que a densidade óptica (A28o) desça para níveis do ruído de fundo, depois a proteína é eluída com glicina-HCl a 0,23 M (pH 2,6) juntamente com detergentes. A proteína da subunidade βΙΑ Humana do canal de sódio purificada é em seguida dialisada contra solução salina tamponada com fosfatos. EXEMPLO 10

IMUNO-HISTOQUÍMICA DE TECIDO HUMANO

Imuno-histoquímica: Os protocolos para a imuno-histoquímica foram descritos anteriormente (D'Andrea, et ai., 1998). Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente. Depois de as lâminas terem sido levadas ao microondas em Target (Dako, Carpenturia, CA), as lâminas foram colocadas em PBS, depois em 3% de H202, enxaguadas em PBS e em seguida foi adicionado soro bloqueante apropriado durante 10 minutos. Subsequentemente, anticorpo primário, quer anticorpo policlonal de coelho anti-humano ϊιβΙΑ (HBlA-1, ver Exemplo 3) a um título de 1:200, quer anticorpo policlonal de coelho anti-rato βΙΑ a um título de 1:400 foi aplicado às lâminas durante 30 minutos. O anticorpo do isótipo próprio da espécie (Vector Labs, Burlingham, CA) foi 49 substituído enquanto anticorpo primário pelo controlo negativo. Após várias lavagens com PBS, um anticorpo secundário biotinilado (Vector Labs) foi colocado sobre as lâminas durante 30 minutos. Subsequentemente, as lâminas foram lavadas em PBS e, em seguida, o complexo avidina-biotina (ABC, Vector Labs) foi aplicado às células durante 30 minutos. A presença dos anticorpos primários foi detectada pela adição de DAB (3'-diaminobenzidina HC1; Biomeda, Foster City, CA) durante 2 vezes, 5 minutos. As lâminas foram expostas brevemente a hematoxilina de Mayer durante 1 minuto, desidratadas e cobertas com lamelas.

Resultados:

Com anticorpo anti-humano βΙΑ: Foi possível detectar βΙΑ intracelular nos neurónios DRG humanos. Foi igualmente identificada βΙΑ associada a membrana nas fibras neuroniais igualmente de DRG. Foi igualmente pesquisada uma miríade de tecidos humanos e determinou-se que a proteína βΙΑ está presente nas células epiteliais do intestino (microvilosidades), dos túbulos colectores (distai > proximal) do rim (demonstrando marcação saliente) e próstata. Foi igualmente observada imunomarcação de βΙΑ no cérebro (neurónios do córtex piramidal, células cerebelosas de Purkinje e muitas das fibras neuroniais por todo o cérebro), nas células endoteliais do pulmão e outros tecidos, membrana de macrófagos no pulmão e útero, e nos cardiócitos do coração. Não foram observados níveis detectáveis, significativos, de βΙΑ nos seguintes tecidos: tiróide, baço, fígado e pâncreas. Foi igualmente observada uma distribuição semelhante de βΙΑ em tecido de rato com este anticorpo anti-humano bla. 50 EXEMPLO 11

Análise de patch clamp da subunidade β31Α de VGSC expressa em oócitos de Xenopus 1. Síntese in vitro de ARNc: As construções de expressão da βΙΑ e Nav1.2 (uma subunidade alfa de tipo II da família das proteínas do canal de cálcio dependente de voltagem obtida do Dr. A. Corrêa, UCLA Medicai Center, Department of Anesthesiology) foram linearizadas com enzimas de restrição. Os ARNc foram sintetizados in vitro com a T7 ARN polimerase utilizando os reagentes e protocolos do kit de transcrição mMESSAGE mMACHINE™ {Ambion, Austin, TX) , com a excepção de que a etapa de precipitação de LiCl foi repetida duas vezes. Os ARNc foram suspendidos em H20 tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) a uma concentração final de 1 — 2 mg/mL. 2. Isolamento de Oócito: As rãs (Xenopus laevis) foram anestesiadas por imersão em 0,15 — 0,17% de tricaína em água e removidas do banho de tricaína. Os lobos ovarianos foram em seguida expostos através de uma pequena incisão feita dentro da sua parede abdominal, removidos e colocados em solução esterilizada OR-2 isenta de Ca2+ (OR-2 isenta de Ca2+: NaCl a 82,5 mM, KC1 a 2,5 mM, MgCl2 a 1 mM e HEPES a 5 mM, pH ajustado para 7,6 com NaOH) e as rãs regressaram para água isenta de tricaína para recuperação. Os lobos ovarianos foram depois enxaguados com água esterilizada, abertos e incubados à temperatura ambiente em OR-2 isenta de Ca2+ contendo 2 mg/mL de colagenase (tipo I, BRL) para provocar a libertação e desfoliculação dos oócitos. Depois de 1 h num agitador orbital (ca 60 ciclos por min) os 51 oócitos foram transferidos para uma placa de Petri com 0R- 2. Os oócitos mortos e demasiado pequenos foram removidos por aspiração e os oócitos seleccionados foram lavados várias vezes com solução OR-2 isenta de colagenase e isenta de Ca2+, incubados com agitação durante uma hora adicional com mudanças de solução a cada 7—8 min e colocados dentro de uma incubadora a 19°C e incubados durante 1 h adicional numa mistura 1:4 de soluções esterilizadas SOS e OR-2 isenta de Ca2+ (SOS: NaCl a 100 mM, KC1 a 2 mM, CaCl2 a 1,8 mM, MgCl2 a 1 mM, HEPES a 5 mM, pH ajustado para 7,6 com NaOH) e 30 min em SOS/OR-2 isenta de Ca2+ a 1:3. Os oócitos foram depois colocados em 100% de SOS, separados uma vez mais e mantidos a 19 °C. 3. Injecções: Os oócitos foram injectados com 50 nl contendo os ARNc a traduzir a uma concentração final de 100 yg/mL de cada espécie e oligonucleotideos nas concentrações indicadas. As injecções foram realizadas imediatamente após o isolamento ou em tempos variáveis a seguir, durante até três dias. Os oócitos injectados foram mantidos a 17 - 19 °C em SOS esterilizado contendo 50 yg/mL de gentamicina, com mudanças diárias de solução até à sua utilização no ensaio electrofisiológico (4-6 dias pós-injecção). 4. Gravações electrofisiológicas dos oócitos: O corte da fenda de vaselina para o clamp da voltagem do oócito (Taglialatela et al., 1992) foi realizado com uma configuração de clamp de oócito cortado com CA-1 (Dagan, Minneapolis, MN) . A solução externa experimental continha NMG-Mes a 120 mM, HEPES a 10 mM e Ca(Mes)2 a 2 mM a pH 7,4. A solução interna experimental continha NMG-Mes a 120 mM, 52 HEPES a 10 mM e EGTA a 2 mM a pH 7,4. As correntes de dispersão e potência linear foram compensadas e subtraídas, em linha, utilizando o protocolo p/-4 de -90 mV de potencial de espera (SHP). Os sinais foram filtrados com um filtro Bessel de oito pólos para 1/5 da frequência de amostragem. Todas as leituras foram realizadas à temperatura ambiente (22 - 23 °C). 5. Aquisição de Dados e Análise: As correntes de activação de porta e iónicas foram adquiridas com uma placa PC44 (Innovative Technologies, Moorpark, CA), que funciona como interface de um computador baseado em Pentium por meio de uma ranhura AT, IBM compatível. A curva do pico G-V foi obtida com uma solução interna de NaMes a 15 mM e uma solução externa de NaMes a 1 mM (com a N-metil-glucamina (NMG) para substituir os restantes catiões). 0 potencial de inversão foi determinado a partir de uma I-V instantânea, após subtrair o componente de activação de porta, e o pico da condutância foi calculado pela divisão do pico da corrente pela diferença de voltagem do potencial de inversão. Dentro da resolução temporal do clamp, a curva I-V instantânea era linear, portanto, não foram efectuadas mais correcções. 6. Resultados: Conforme apresentado na Figura 3, a corrente iónica conduzida por Nav1.2 era significativamente aumentada pela co-expressão com a subunidade βίΑ em oócitos. À razão de ARNc de 1:20 (Nav1.2 vs βίΑ) , a corrente iónica era aumentada cerca de 3 vezes. Os resultados indicam que a subunidade βΙΑ desempenha um papel importante no aumento do 53 número dos canais de sódio funcionais presentes na superfície celular. EXEMPLO 12 Regulação positiva e Redistribuição da Subunidade βΙΑ em Neurónios dos Gânglios das Raízes Dorsais de Rato Após Ligação do Nervo Espinal 1. Ligação do Nervo Espinal. Todos os processos envolvendo a utilização de animais foram efectuados em conformidade com as directrizes do Institutional Animal Care and Use Committee, The R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute e do American Association for Laboratory Animal Care. A ligação do nervo espinal (SNL) foi realizada como descrito por Kim e Chung (1992). Resumidamente, ratos Sprague-Dawley machos (Harlan, Indianapolis, IN) pesando aproximadamente 200 g foram anestesiados com isoflurano. O nervo espinal ao nível de L5 ou L6 foi exposto através de uma incisão à esquerda da linha média dorsal e, após remoção do processo vertebral transverso esquerdo L6, foi firmemente ligado com seda 6-0. A incisão foi depois fechada com vicril 4.0 (fáscia) e clips de seda. Deixaram-se os animais a recuperar da anestesia e foram avaliados quanto à função motora do membro posterior, antes de serem devolvidos ao alojamento de grupo. Os animais naive não foram submetidos a cirurgia. 2. Avaliação de Alodínia Mecânica. A alodínia foi avaliada pela colocação dos ratos individualmente numa plataforma de malha de arame, de modo a que a superfície plantar de cada pata posterior poderia ser estimulada a partir de baixo. Foi aplicada uma séria ascendente de estímulos tácteis utilizando filamentos von Frey calibrados (0,25 — 15 g) até 54 ser observada uma resposta rápida de levantamento da pata. Foi empregue um método "up-down" (Chaplan et al., 1994) a fim de determinar o limiar de resposta em gramas. Os animais a partir dos quais foi obtido tecido, foram testados em diversos intervalos de tempo pós-cirurgicamente, para assegurar que limiares de resposta da pata ipsilateral ficavam abaixo do critério das 4 g. Adicionalmente, um grupo de animais da mesma idade separado (ligados n = 3 — 12, naive n = 7) foi testado em termos de alodinia mecânica em vários tempos (3d, lOd, 21d e 8sa) após cirurgia para traçar um perfil do decorrer do tempo dos limiares da resposta ipsilateral e contralateral, bem como da resposta de animais naive. 3. Preparação do Tecido. No dia 2, dia 14 e 8a semana após a cirurgia, os animais (n = 3 — 5) foram sacrificados por asfixia com CO2 e perfundidos transcardialmente com 4% de paraformaldeído. Os DRG L4 e L5 foram removidos, processados para embebimento em parafina num formato multitecidular, seccionados em séries de 5 ym e montados sobre lâminas Superfrost-Plus (Fisher, Pittsburgh, PA) . 4. Imuno-histoquimica. Os protocolos para a imuno-histoquímica de rotina (IHC) foram descritos anteriormente (D'Andrea et al., 1998). Resumidamente, as lâminas de parafina foram desparafinadas, hidratadas e levadas ao microondas em tampão Target (Dako, Carpenteria, CA) . As secções foram arrefecidas, colocadas em solução salina tamponada com fosfatos (PBS, pH 7,4) e tratadas em seguida com 3,0% de H2O2 durante 10 min a fim de inactivar peroxidases endógenas. Todas as incubações com reagentes e lavagens subsequentes foram realizadas à temperatura 55 ambiente. Foi colocado sobre os tecidos soro de bloqueamento normal (Vector Labs, Burlingame, CA) durante 10 min seguido de breve enxaguadela em PBS. Os tecidos foram depois incubados com anticorpo primário durante 30 min, e lavados, e depois tratados com anticorpos secundários biotinilados, cabra anti-coelho (Vector Labs) durante 30 min. Os anticorpos policlonais de coelho anti-βΙΑ e anti-βΐ previamente caracterizados (Kazen-Gillespie et al., 2000) foram utilizados com títulos de 1:400. Após uma enxaguadela em PBS, os tecidos foram tratados com o reagente complexo avidina-biotina-HRP (Vector Labs) durante 30 min. As lâminas foram tratadas 2x5 minutos com 3,3'-diaminobenzidina (DAB, Biomeda, Foster City, CA), enxaguadas, contrastadas com hematoxilina, desidratadas, limpas em xileno e cobertas com uma lamela. Os anticorpos monoclonais específicos da proteína nuclear específica de neurónio (NeuN, 1:1000; Chemicon, Temecula, CA) foram utilizados como controlo positivo para confirmar a antigenicidade tecidular e qualidade de reagentes. Os controlos negativos incluíram a substituição do anticorpo primário por soro não imunizado do isótipo IgG da espécie (Vector Labs). 5. Avaliação da imunomarcação de βΙΑ e βΐ. Os tecidos montados sobre lâminas num formato multitecidular foram corados simultaneamente para minimizar potencial variabilidade de coloração. Os neurónios DRG ipsilaterais e contralaterais com núcleos salientes de L4 e L5 de cada animal foram caracterizados como nociceptivos se o diâmetro era < 25 pm em diâmetro; todos os outros foram designados como neurónios sensoriais (Oh et al., 1996; Gould et al., 1998) . A coloração de 30 — 40 neurónios por DRG por animal 56 foi pontuada de ; acordo com os seguintes critérios: 1) sem imunoreactividade foi pontuada como 0,0; 2) imunoreactividade fraca foi pontuada com 1,0; 3) imunoreactividade moderada foi pontuada com 2,0 e 4) imunoreactividade intensa foi pontuada com 3,0. Se a intensidade da imunomarcação estivesse entre estas unidades de números inteiros, um incremento de 0,5 foi utilizado (i. e., marcação fraca a moderada 1,5). As médias dos dados foram depois calculadas por animal e por grupo (n = 3 — 5 por grupo). A morfologia da imunoreactividade de βΙΑ e βΐ nos neurónios DRG nociceptivos L5 e sensoriais foi igualmente caracterizada como 1) homogénea: um padrão de marcação difuso; 2) salpicada de pontos: diversos agregados de coloração maciços, intracelulares, de tipo Nissl; e 3) membrana: marcação periférica saliente situada, predominantemente, ao longo da membrana celular. Os dados são apresentados como percentagem de cada padrão de marcação observado por DRG por grupo (Tabela 2).

Dados e Análise Estatística. Os dados da coloração de βΙΑ e βΐ foram agrupados para identificar o nível espinal do DRG (L4 ou L5) , lateralmente (contralateral ou ipsilateral) , tipo neuronal (pequeno ou grande) e tempo de ligação (naive, 2 dias, 14 dias e 8 semanas pós-SNL) . Dentro dos 16 subgrupos resultantes, tanto as medidas de intensidade de coloração proteica, como factores de tempo de ligação representavam valores naturalmente ordenados. A avaliação inicial dos dados indicou a ausência de normalidade na distribuição da resposta pontuada, sugerindo a modelação através de um método não paramétrico. Deste modo, foi escolhido um teste de Jonckheere-Terpstra unilateral para avaliar a hipótese básica de que a 57 distribuição de pontuações médias de expressão proteica se alterou durante o tempo de ligação.

Resultados: Alodínia mecânica: Os ratos SNL exibiram um dramático decréscimo ipsilateral no limiar da resposta de Von Frey para menos de 2 g e depois 1 g até três e dez dias após a lesão, respectivamente. Este nivel melhorado de sensibilidade táctil na pata ipsilateral foi conservado durante todo o período de teste de oito semanas. Os limiares de resposta da pata contralateral foram, em geral, semelhantes às respostas naive ou pré-lesão, í. e., 13—15 g; contudo, sensibilidades melhoradas (8 - 10 g) verificaram-se três dias pós-lesão reflectindo, possivelmente, um efeito pós-cirúrgico generalizado. As respostas de animais naive à estimulação de Von Frey situaram-se dentro da gama de 13 - 15 g durante todo o período de tempo de oito semanas, bilateralmente.

Intensidade de marcação de βίΑ em DRG. Uma representação gráfica das intensidades médias de coloração em cada grupo de DRG estudado é apresentada na Figura 4. Tanto em neurónios nociceptivos como sensoriais, a imunomarcação de βίΑ aumentou com o tempo pós-cirúrgico, sendo este aumento mais saliente nos neurónios ipsilaterais. A Tabela I lista os valores de p resultantes da análise de Jonckheere-Terpstra da relação de intensidade versus tempo. Intensidade de marcação de β 1 em DRG. Uma representação gráfica da intensidade média de marcação para cada grupo de DRG estudado é apresentada na Figura 5. Embora a imunomarcação de βΐ tendesse a aumentar com o tempo pós-cirúrgico, esta tendência foi de maior importância no DRG L4 do que em L5 (Tabela 1). 58

Distribuição subcelular de βΙΑ e imunoreactiv idade de /31. Em ratos naive, as subunidades βΙΑ e βΐ do canal de sódio exibiram localizações subcelulares idênticas, estando praticamente toda a coloração difusamente distribuída por toda a célula. Contudo, pós-SNL, as distribuições subcelulares das subunidades divergiram nitidamente. Enquanto a coloração da subunidade βΐ permaneceu distribuída uniformemente dentro dos neurónios DRG nos quais estava localizada, a localização de βΙΑ, mais notavelmente nos neurónios nociceptivos, assumiu um padrão alterado de distribuição após SNL; a coloração da subunidade βΙΑ ficou discretamente localizada numa área proximal à membrana celular. Enquanto praticamente 100% da coloração de βΙΑ estava difusamente distribuída em células DRG de ratos naive, apenas 23% estava homogeneamente distribuída em neurónios DRG nociceptivos, ipsilaterais, L5, (Tabela 2) . Nestas células, 51% da coloração de βΙΑ estava localizada proximal à membrana celular. Neurónios DRG sensoriais ipsilaterais, bem como neurónios nociceptivos e sensoriais contralaterais, exibiram igualmente distribuições subcelulares de βΙΑ alteradas. Nestas células, 58 - 76% da coloração de βΙΑ permaneceu difusa, cerca de 20% surgiu salpicada de pontos ou de tipo Nissl e a restante localizava-se adjacente à membrana celular (Tabela 2) . Deste modo, além de exibirem diferenças na intensidade da sua marcação em neurónios DRG pós-SNL, as subunidades βΙΑ e βΐ do canal de sódio diferiram nitidamente nas suas localizações subcelulares pós-SNL. 59 EXEMPLO 13 - para referência

Pesquisa e identificação de pequenas moléculas que interagem directamente com a subunidade βΙΑ de VGSC

Uma das funções reguladoras da subunidade βΙΑ é aumentar os canais funcionais pelo recrutamento de subunidades α para a superfície da célula. A interrupção da função normal da subunidade βιΑ pode resultar na regulação negativa do canal de sódio funcional em DRG após lesão nervosa. Pequenas moléculas que interagem com a subunidade βΙΑ são identificadas pela tecnologia de electroforese de capilaridade de zona CETEK. Em primeiro lugar, a proteína alvo, subunidade βιΑ de VGSC foi superexpressa em bactérias. 0 ADNc da subunidade de βΙΑ foi subclonado no vector de expressão de bactérias pET29b (Novagen) . A construção de expressão foi em seguida transformada em BL21 (DE3) de E. Coli e a expressão da βίΑ induzida pela adição de IPTG à temperatura ambiente durante 4 horas. Uma única colónia fresca de uma placa foi inoculada em 50 mL de meio LB contendo 15 yg/mL de canamicina e incubada com agitação a 37 °C até que a ODêoo atingisse 0,6. A expressão da proteína de fusão da subunidade βίΑ foi induzida pela adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM e incubada à temperatura ambiente durante 4 horas. Para análise de SDS-PAGE, foram aliquotadas 100 yL de culturas antes e após indução de IPTG. As células foram centrifugadas, ressuspendidas em 20 mL de tampão de carregamento SDS e submetidas a SDS-PAGE a 4 - 20%. Após electroforese, o gel foi corado através de SimpleBlue™ SafeStain {Invitrogen) e descorado com água de um dia para o outro. Corredor 1: marcador proteico de elevado peso molecular (Bio- 60

Rad), corredor 2, lisado de celular total antes de indução e corredor 3 lisado celular total após indução. A proteína de fusão da subunidade βΙΑ resultante possuía uma marca S, um motivo de 15 aminoácidos, na sua extremidade N e seis histidinas na sua extremidade C. A proteína de fusão é em seguida purificada por afinidade com uma coluna de Ni+ e marcada não covalentemente com um fluoróforo na marca S. Os desvios de mobilidade da subunidade βιΑ na electroforese de capilaridade, após ligação a uma molécula pequena que altera a conformação ou carga de superfície da proteína alvo, são detectados com fluorescência induzida por laser. EXEMPLO 14

Ensaio funcional do canal de sódio: A actividade reguladora da subunidade βΙΑ é igualmente estudada pela sua co-expressão com a subunidade α formadora de poros e condutora de iões em células eucarióticas, onde a actividade do canal de sódio é testada através de bioensaios funcionais. As subunidades α são, entre outras, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.6, Navl.8 e Nav1.9, respectivamente. A determinação da actividade do canal de sódio é realizada pela utilização de ensaios baseados em duas células. 0 primeiro ensaio envolve a cultura de células em placas de 96 poços contendo uma placa de base de cintilação. As monocamadas celulares são estimuladas com veratridina ou qualquer outro activador do canal de sódio apropriado na presença de [14C]-guanidina. Quando o canal de sódio é aberto, os iões de [14C]-guanidínio fluem pelo seu gradiente de concentração para dentro das células. Visto que as 61 células estão na proximidade imediata da base de cintilação, é emitida luz. A quantidade de luz emitida é proporcional ao nivel de actividade do canal de sódio e é quantificada utilizando um contador de cintilações. 0 segundo ensaio utiliza um corante fluorescente, sensível ao potencial. As monocamadas de células são carregadas com o corante sensível ao potencial durante 30 min a 37 °C. Após este período de incubação, as células são estimuladas com veratridina ou qualquer outro activador do canal de sódio e a alteração na fluorescência é monitorizada por um fluorímetro, leitor de placa de imagiologia fluorescente (FLIPR) ou por um sistema de imagiologia celular baseado em fluorímetro. Quando as células despolarizam, o corante associa-se à membrana celular, resultando em fluorescência aumentada. Quando as células hiperpolarizam, o corante desassocia-se da membrana, resultando em fluorescência diminuída. EXEMPLO 15

Ensaio de adesão celular:

Dado que as subunidades β do canal de sódio foram implicadas na adesão homofílica célula-célula, a função de adesão celular da subunidade βΙΑ é testada. O ensaio de adesão utiliza fibroblastos de células L de rato, que não possuem a maioria das macromoléculas requeridas para a adesão célula-célula. Estas células L são estavelmente ou transientemente transfectadas com βΙΑ e plaqueadas em placas de 96 poços. Outro conjunto de transfectantes de βΙΑ de células L é carregado com um corante fluorescente viável e é adicionado às culturas nas placas de 96 poços na presença ou ausência de compostos candidatos. Após um determinado período de incubação, as placas 62 são colocadas num leitor de placa fluorescente. Se ocorrer adesão homofílica célula-célula, é observado um aumento detectável na fluorescência. A fim de determinar a actividade especifica, o sinal é comparado à fluorescência observada utilizando células L não transfectadas marcadas com corante fluorescente viável.

Tabela 1. Análises estatísticas de tendências no nível de expressão de βίΑ e β 1 em neurónios DRG ao longo do tempo pós-SNL. Os valores de p proporcionados foram obtidos com análises unilaterais de Jonckheere-Terpstra dos dados subjacentes às Figuras 9 e 10. DRG Sítio Relativo à Ligação Tipo de Neurónio DRG valor βίΑ de p pi L5 ipsilateral nociceptivo 0,003* 0, 058 sensorial 0,011* 0, 058 contralateral nociceptivo 0,029* 0,042* sensorial 0,035* 0, 097 L4 ipsilateral nociceptivo 0,007* 0,023* sensorial 0,006* 0,001* contralateral nociceptivo 0,001* 0,041* sensorial 0,036* 0,019* *valor de p < 0,05 63

Tabela 2. Distribuição subcelular de coloração de βΙΑ e βΐ em neurónios DRG L5 duas semanas pós-SNL.

Anticorpo Sítio Relativo à Ligação Distribuição de Coloração Percentagem do Total Nociceptivo Sensorial βΙΑ Ipsilateral Membrana 51 11 Salpicado de 26 18 Pontos Homogéneo 23 71 Contralateral Membrana 28 4 Salpicado de 14 20 Pontos Homogéneo 58 76 Pi Ipsilateral Membrana 0 0 Salpicado de 0 0 Pontos Homogéneo 100 100 Contralateral Membrana 0 0 Salpicado de 0 0 Pontos Homogéneo 100 100

Referências:

Balser JR (1999) " Structure and function of the cardiac sodium channels" Cardiovasc Res. 42: 327-38.

Catterall WA (1992) Cellular and molecular biology of voltage-gated sodium channels. Physiol Rev 72:S15-S48. 64

Catterall WA (1993) Structure and function of voltage-gated ion channels. Trends Neurosci 16:500-506.

Chabal C, Russel LC, Burchiel KJ (1989) The effect of intravenous lidocaine, tocainide, and mexiletine on spontaneously active fibers originating in rat sciatic neuromas. Pain 38:333-338.

Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, LL JM, Yaksh TL. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Meth 1994; 53:55-63. D'Andrea MR, Derian CK, Leturcq D, Baker SM, Brunmark A, Ling P, Darrow AL, Santulli RJ, Brass LF, Andrade-Gordon P. Characterization of protease activated receptor (PAR-2) immunoreactivity in normal human tissues. J. Histochem. Cytochem. 1998; 46:157-164.

Devor M, Keller CH, Deerinck TJ, Ellisman MH. (1989) Na+ channel accumulation on axolemma of afferent endings in nerve end neuromas in Apteronotus. Neurosci Lett 102:149-154.

Devor M, Wall PD, Catalan N (1992) Systematic lidocaine silences ectopic neuroma and DRG discharge without blocking nerve conduction. Pain 48:261-268.

Devor M (1994) The pathophysiology of damaged peripheral nerves. In Texbook of Pain, eds. Wall PD, Melzack R. (Churchill Liningstone, Edinburgh), 2a Ed., pp. 79-101. 65

Dib-Hajj S, Black JA, Felts P, Waxman SG (1996) Down-regulation of transcripts for Na channel α-SNS in spinal sensory neurons following axotomy. PNAS 93:14950-14954.

England JD, Gamboni F, Ferguson MA, Levinson SR (1994) Sodium channels accumulate at the tips of injured axons. Muscle Nerve 17:593-598.

England JD, Happel LT, Kline DG, Gamboni F, Thouron CL, Liu ZP, Levinson SR (1996) Sodium channel accumulation in humans with painful neuromas. Neurology 4:272-276.

Gould HJ 3rd, England ID, Liu ZP, Levinson SR. Rapid sodium channel augmentation in response to inflammation induced by complete Freund's adjuvant. Brain Research 1998; 802:69-74.

Isom LL, De Jongh KS, Patton DB, Reber BFX, Offord J, Charbonneau H, Walsh K. Goldin AL e Catterall WA (1992) Primary Structural and Functional Expression of the βΐ Subunit of the Rat Brain Sodium Channel" Science, 256; 839-842.

Isom LL, De Jongh KS, Catterall WA (1994) Auxiliary β subunits of voltage-gated ion channels. Neuron 12:1183-1194.

Isom LL, Ragsdale DS, De Jongh KS, Westenbroek RE, Reber BFX, Scheuer T, Catterall WA (1995) Structure and function of the β2 subunit of brain sodium channels, a transmembrane glycoprotein with a CAM motif. Cell 83:433-442.

Isom LL, Catterall WA (1996) "Na+ channel subunits and Ig domains" Nature: 383(6598): 307-8. 66

Kazen-Gillespie K, Ragsdale DS, D'Andrea-MR; Laura N: Mattei Rogers KE, Isom LL (2000) Cloning, localization, and functional expression of sodium channel βία subunits. J Biol. Chem 275:2:1079-1088.

Kazen-Gillespie K, Ragsdale DS, D' Andrea MR, Rogers KE, Isom LL. Cloning, localization, and functional expression of sodium channel βΙΑ subunits. J Biol Chem 2000; 275:1-12.

Kim SH, Chung JM (1992) An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmentai spinal nerve ligation in the rat. Pain 50:355-363.

Kim SH, Chung JM. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmentai spinal nerve ligation in the rat Pain 1992; 50:355-363.

Marban E, Yamagisbi T, Tomaselli GF J Physiol (Lond) (1998) "Structure and function of voltage-gated sodium channels" 508 (Pt 3):647-57.

Matzner 0, Devor M (1992) Na+ conductance and the threshold for repetitive neuronal firing. Brain Res 597:92-98.

Matzner 0, Devor M (1994) Hyperexcitability at sites of nerve injury depends on voltage-sensitive Na+ channels. J

Neurophysiol 72:349-359.

Moran O, Nizzari M e Conti F (2000) Endogenous expression of the BIA sodium channel subunit in MEK-293 cells. FEBS Letters 473; 132-134. 67

Sutkowski EM e Catterall WA (1990) "βΐ subunits of sodium channels" J. Biol. Chem. 265; 12393-12399.

Nordin M, Nystrom B, Wallin U, Hagbarth K-E (1984) Ectopic sensory discharges and paresthesiae in patients with disorders of peripheral nerves, dorsal roots and dorsal columns. Pain 20:231-245.

Ochoa J, Torebjork HE (1980) Paresthesiae from ectopic impulse generation in human sensory nerves. Brain 103:835-854.

Oh Y, Sashihara S, Black JA, Waxman SG. Na+ channel βΐ subunit mRNA: differential expression in rat spinal sensory neurons. Mol Brain Res 1995; 30:357-361.

Omana-Zapata I, Khabbaz MA, Hunter JC, Clarke DE, Bley KR (1997) Tetrodotoxin inhibits neuropathic ectopic activity in neuromas, dorsal root ganglia and dorsal horn neurons. Pain 72(1-2):41-9.

Porreca F, Lai J, Bian D, Wegert S, Ossipov MH, Eglen RM, Kassotakis L, Novakovic S, Rabert DK, Sangameswaran L, Hunter JC (1999) " A comparison of the potential role of the tetrodotoxin-insensitive sodium channels, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat models of chronic pain" Proc Natl Acad Sei USA; 96: 7640-4.

Rizzo MA (1997) Successful treatment of painful mononeuropathy with carbamazepine: insights into a possible molecular pain mechanism. J Neurol Sei 152:103-106.

Tanaka M, Cummins TR, Ishikawa K, Dib-Hajj SD, Black JA, Waxman SG (1998) SNS Na+ channel expression increases in dorsal 68 root ganglion neurons in the carrageenan inflammatory pain model. NeuroReport 9(6):967-72.

Wallace RH, Wang DW, Singh R, Scheffer IE, George AL Jr, Phillips HA, Saar K, Reis A, Johnson EW, Sutherland GR, Berkovic SF, Mulley JC (1998) "Febrile seizures and generalized epilepsy associated with a mutation in the Na+-channel betai subunit gene SCN1B" Nature Genetics; 19: 366-70.

Waxman SG, Brill MH (1978) Conduction through demylineated plaques in multiple sclerosis: Computer simulations of facilitation by short internodes. J Neurol Neurosurg 41:408-417.

Waxman SG, Kocsis JD, Black JA (1994) Type III sodium channel mRNA is expressed in embryonic but not adult spinal sensory neurons, and is reexpressed following axotomy. J Neurophysiol 72:466-470.

Woolf CJ, Safieh-Garabedian B, Ma Q-P, Crilly P, Winters J (1994) Nerve growth factor contributes to the generation of inflammatory sensory hypersensitivity. Neuroscience 62:327-331.

Waxman SG, Dib-Hajj S, Cummins TR, Black JA. Sodium channels and pain. PNAS 1999; 96(14):7635-9. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Ortho McNeil Pharmaceutical, Inc. <120> ADNs codificando a subunidade betala Humana do canal de sódio 69 <13Ο> ORT-1221 <14 0> <141> <16 0> 14 <17Ο> Patentln Ver. 2.1

<210 > 1 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotidico < 4 0 0 > 1 ccatcctaat acgactcact atagggc 27

<210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotidico < 4 0 0 > 2 70 25 tggaccttcc gccagaaggg cactg

<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotidico < 4 0 0 > 3 ctggaggagg atgagcgctt cgag 24

<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotidico <400> 4 ctattcggcc acctggacgc c 21

<210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 71 iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotídico <400> 5 gtgtctgaga tcatgatg 18

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> iniciador <22 3> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotídico <400> 6 gccatgggga ggctgctggc cttagtggtc 30

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> iniciador <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotídico <400> 7 gtgtgcctgc agctgctcaa 20 <210> 8 72

<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: peptideo sintético <400> 8

Arg Trp Arg Asp Arg Trp Gin Ala Vai Asp Arg Thr Gly Cys 15 10

<210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: peptideo sintético <400> 9

Cys Vai Pro His Arg Arg Ser Gly Tyr Arg Thr Gin Leu 15 10

<210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial 73 <2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciadores oligonucleotidicos para análise de transferência Northern < 4 0 0 > 10 tcaaagcatg cctgtccc 18

<210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3> Descrição de Sequência Artificial: iniciadores oligonucleotidicos para análise de transferência Northern < 4 0 0 > 11 tcaaaccaca <210> 12 <211> 807 <212> ADN <213> Homo < 4 0 0 > 12 ccccggaaa sapiens 19 74 atggggaggc tgctggcctt agtggtcggc tgcgtggagg tggactcgga gaccgaggcc atctcctgca agcgccgcag cgagaccaac cagaagggca ctgaggagtt tgtcaagatc gaggaggatg agcgcttcga gggccgcgtg ctgcaggatc tgtctatctt catcaccaat tgccacgtct accgcctgct cttcttcgaa aagatccaca ttgaggtagt ggacaaaggt acccaccgga gagccagatg gagggacaga tgtgcctggc cagccaaccg cccacagcag tgcccactcc agctctggcc tctgtttctc gtcccccaca gacgctccgg gtacagaacc ggcaggtgcc ttctgtctct gagccaaagg cgatgtgttt ctcggggtgt ggtttga gcggcactgg tgtcctcagc ctgcgggggc 60 gtgtatggga tgaccttcaa aattctttgc 120 gctgagacct tcaccgagtg gaccttccgc 180 ctgcgotatg agaatgaggt gttgcagctg 240 gtgtggaatg gcagccgggg caccaaagac 300 gtcacctaca accactcggg cgactacgag 360 aactacgagc acaacaccag cgtcgfccaag 420 gagtcgggtg ctgcctgccc ctttaccgto 480 tggcaggcag tggacaggac aggctggctc 540 cgggctgagg gggaggggag cagcccctcc 600 tccagcccac ggagaggtca aagcatgcct 660 cagctctgtc acctgtgctg tatgacctct 720 gttgtcctgg gcttgcccgg gataataatc 780 807

<210> 13 <211> 974 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 75 gccatgggga ggctgctggc ggctgcgtgg aggtggactc tgcatctcct gcaagcgccg cgccagaagg gcactgagga ctggaggagg atgagcgctt gacctgcagg atctgtctat gagtgccacg tctaccgcct aagaagatcc acattgaggt gtcacccacc ggagagccag ctctgtgcct ggccagccaa tcctgcccac tccagctetg cctgtccccc acagacgctc tctggcaggt gccttctgtc atccgatgtg tttctcgggg ttgagcagct gcaggcacac gcggttctta ctgttgagta cgtgcctgtg ttgg cttagtggtc ggcgcggcac ggagaccgag gccgtgtatg cagcgagacc aacgctgaga gtttgtcaag atcctgcgct cgagggccgc gtggtgtgga cttcatcacc aatgtcacct gctcttcttc gaaaactacg agtggacaaa ggtgagtcgg atggagggac agatggcagg ccgcccacag cagcgggctg gcctctgttt ctctccagcc cgggtacaga acccagctct tctgagccaa agggttgtcc tgtggtttga gccattcttc cctggcttcc agcagagcct gctcagccct gctgctctct tggtgtcctc agcctgcggg 60 ggatgacctt caaaattctt 120 ccttcaccga gtggaccttc ISO atgagaatga ggtgttgcag 240 atggcagccg gggcaccaaa 300 acaaccactc gggcgactac 360 agcacaacac cagcgtcgtc 420 gtgctgcctg cccctttacc 480 cagtggacag gacaggctgg 540 agggggaggg gagcagcccc 600 cacggagagg tcaaagcatg 660 gtcacctgtg ctgtatgacc 720 tgggcttgcc cgggataata 780 catcatgggg ttcatgagga 840 tgcaggtggt ggcgagggtg 900 gtggtgatga ggcaagagag 960 974

<210> 14 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Gly Arg Leu Leu Ala Leu Vai Vai Gly Ala Ala Leu Vai Ser Ser 15 10 15

Ala Cys Gly Gly Cys Vai Glu Vai Asp Ser Glu Thr Glu Ala Vai Tyr 20 25 30

Gly Met Thr Phe Lys Ile Leu Cys Ile Ser Cys Lys Arg Arg Ser Glu 35 40 45 76

Xhr Asn Ala Glu Thr Phe Thr Glu Trp Thr Phe Arg Gin Lys Gly Thr 50 55 60

Glu Glu Phe Vai Lys Ile Leu Arg Tyr Glu Asn Glu Vai Leu Gin Leu 65 70 75 80

Glu Glu Asp Glu Arg Phe Glu Gly Arg Vai Vai Trp Asn Gly Ser Arg 85 90 95

Gly Thr Lys Asp Leu Gin Asp Leu Ser Ile Phe Ile Thr Asn Vai Thr 100 105 110

Tyr Asn His Ser Gly Asp Tyr Glu Cys His Vai Tyr Arg Leu Leu Phe 115 120 125

Phe Glu Asn Tyr Glu His Asn Thr Ser Vai Vai Lys Lys Ile His Ile 130 135 140

Glu Vai Vai Asp Lys Gly Glu Ser Gly Ala Ala Cys Pro Phe Thr Vai 145 150 155 160

Thr His Arg Arg Ala Arg Trp Arg Asp Arg Trp Gin Ala Vai Asp Arg 165 170 175

Thr Gly Trp Leu Cys Ala Trp Pro Ala Asn Arg Pro Gin Gin Arg Ala 180 185 190

Glu Gly Glu Gly Ser Ser Pro Ser Cys Pro Leu Gin Leu Trp Pro Leu 195 200 205

Phe Leu Ser Ser Pro Arg Arg Gly Gin Ser Met Pro Vai Pro His Arg 210 215 220

Arg Ser Gly Tyr Arg Thr Gin Leu Cys His Leu Cys Cys Met Thr Ser 225 230 235 240 77

Gly Arg Cys Leu Leu Ser Leu Ser Gin Arg Vai Vai Leu Gly Leu Pro 245 250 255

Gly Ile Ile Ile Arg Cys Vai Ser Arg Gly Vai Vai 260 265

Lisboa, 20 de Setembro de 2007 78

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleotídeo isolado que codifica a SEQ. ID. N°: 14 ou os aminoácidos 150 a 268 de SEQ. ID. N°:14.
2. 2. Polinucleotídeo da reivindicação 1, em que o polinucleotídeo é ARN.
3. 3. Polinucleotídeo da reivindicação 1, em que o polinucleotídeo é ADN.
4. 4. Polinucleotídeo da reivindicação 1, possuindo uma sequência nucleotídica seleccionada de um grupo consistindo em: SEQ. ID. N°:12 e SEQ. ID. N°:13.
5. 5. Polinucleotídeo da reivindicação 1, em que a referida molécula de ADN é ADN genómico.
6. 6. Vector de expressão contendo um gene recombinante codificando a SEQ. ID. N°:14.
7. 7. Vector de expressão da reivindicação 6, em que o vector de expressão contém uma sequência nucleotídica seleccionada a partir de um grupo consistindo em SEQ. ID. N°:12 e SEQ. ID. N°:13.
8. 8. Vector de expressão da reivindicação 6, em que o vector de expressão contém ADN genómico codificando a SEQ ID NO:14.
9. 9. Célula hospedeira contendo um polinucleotídeo codificando a SEQ ID N°:14. 1
10. 10. Célula hospedeira da reivindicação 9, em que o referido polinucleotideo possui uma sequência nucleotidica seleccionada a partir de um grupo consistindo em: SEQ. ID. N°:12 e SEQ. ID. N°: 13.
11. 11. Célula hospedeira da reivindicação 9, em que o referido polinucleotideo é ADN genómico.
12. 12. Processo para a expressão de uma proteína numa célula hospedeira, compreendendo: (a) a introdução de um vector de expressão numa célula, em que o vector compreende um polinucleotideo de SEQ. ID. N°:12 ou SEQ. ID. N°:13 ou um polinucleotideo cuja sequência é complementar a este; e (b) cultura da célula da etapa (a) sob condições que permitem a expressão de uma proteína codificada pela sequência nucleotidica ou pela sequência complementar a esta.
13. 13. Proteína isolada possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 14 que, quando combinada com uma proteína da subunidade α Humana do canal de sódio numa célula, permite o fluxo do ião de sódio na célula. Lisboa, 20 de Setembro de 2007 2