ES2232822T3 - Dna que codifica los canales de cloruro de apertura regulada por glutamato. - Google Patents

Abstract

SE HAN CLONADO Y CARACTERIZADO DNAS QUE CODIFICAN PARA CANALES DE GLUTAMATO SENSIBLES A AVERMECTINA Y GLUTAMATO. LAS SUBUNIDADES INDIVIDUALES ALFA Y BETA, SON CAPACES DE FORMAR CANALES HOMOMERICOS Y HETEROMERICOS, QUE SE ABREN SELECTIVAMENTE, BIEN CON AVERMECTINA, BIEN CON GLUTAMATO. DICHOS CDNAS HAN SIDO EXPRESADOS EN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES, QUE PRODUCEN PROTEINA RECOMBINANTE ACTIVA. LA PROTEINA RECOMBINANTE SE PURIFICA TAMBIEN A PARTIR DE LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES. ADEMAS, LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES SE UTILIZAN PARA ESTABLECER UN METODO DE IDENTIFICACION DE MODULADORES DE LA ACTIVIDAD RECEPTORA. LOS MODULADORES DE RECEPTORES SON UTILES COMO INSECTICIDAS Y COMO AGENTES ANTIHELMINTICOS.

Description

DNA que codifica los canales de cloruro de apertura regulada por glutamato.

Antecedentes de la invención

Las avermectinas son una familia de lactonas macrocíclicas originalmente aisladas del actinomiceto Streptomyces avermitilis. El derivado semisintético de la avermectina, la ivermectina (22,23-dihidro-avermectin B_{1a}), es usado en todo el mundo para tratar pestes de insectos y helmintos parásitos de hombres y animales. Descubiertas hace unos 15 años, las avermectinas se mantienen como los endectocidas de amplio espectro más potentes, mostrando baja toxicidad en el anfitrión. Las avermectinas exhiben una interacción esencialmente irreversible con sitios de alta afinidad en membranas de nemátodos [Schaeffer, J.M. & Haines, H.W. Biochem. Pharm. 38, 2329-2338 (1989); Cully, D.F. & Paress P.S., Molecular Pharm. 40:326-332 (1991)] y de insectos [Rohrer, S.P., Meinke, P.T., Hayes, E.C., Mrozik, H. & Schaeffer, J.M. Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 4168-4172 (1992)], e inducen un incremento de la permeabilidad del cloruro en membranas de nemátodos [Martin, R.J. & Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989)], de artrópodos [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Duce I.R. & Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85, 395-401 (1985)] y de crustáceos [Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)]. El ligando natural de los canales de cloruro sensitivos a las avermectinas se mantiene poco claro [Turner M.J. & Schaeffer, J.M. in Ivermectin and Abamectin (eds. Campbell, W.C.) 73-88 (Springer-Verlag, New York, 1989)]. Los canales de apertura por glutamato, o los receptores-H, han sido identificados en los nervios y músculos de artrópodos [Linge, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D.J. Neurosci. Lett. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Bio. 144, 499-462 (1989)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Parmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cully-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. Se ha propuesto que las avermectinas activan los canales de cloruro controlados por glutamato, en músculos de langosta [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic, Sci. 16, 599-604 (1985)].

El nemátodo del suelo Caenorhabditis elegans es muy sensible a las avermectinas y es usado en un modelo in vitro para examinar la eficacia de distintos compuestos antihelmínticos [Schaeffer J.M. & Haines, H.W. Biochem. Pharm. 38, 2329-2338 (1989)]. Oocitos de Xenopus laevis inyectados con ARN poli (A)^{+} de C. elegans, expresan canales de cloruro sensibles a las avermectinas [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991)]. Se ha establecido que este canal es también sensible al glutamato [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)].

Similares a los receptores-H de los músculos de la langosta, la corriente sensible al glutamato y a las avermectinas, es activada por ibotenato, y bloqueada con baja afinidad por la picrotoxina [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)].

Sumario de la invención

Se ha clonado y caracterizado un objetivo de la acción de las avermectinas en invertebrados, y esto representa una novedosa clase de canales de cloruro de apertura controlada por ligandos. Usando un sistema de expresión recombinante, se han aislado dos moléculas de ADN funcional que codifican a los canales de cloruro sensibles al glutamato y a la avermectina, en invertebrados. Se han revelado las propiedades estructurales y electrofisiológicas de estas proteínas, así como sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos. Las proteínas recombinantes son muy útiles para identificar los moduladores del canal. Los moduladores identificados en este proceso son muy útiles como agentes terapéuticos, como insecticidas y como antihelmínticos.

Breve descripción de las ilustraciones

Figura 1 - La secuencia de nucleótidos de GluCl\alpha.

Figura 2 - La secuencia de nucleótidos de GluCl\beta.

Figura 3 - La secuencia de aminoácidos de GluCl\alpha.

Figura 4 - La secuencia de aminoácidos de GluCl\beta.

Figura 5 - Propiedades electrofisiológicas de las corrientes sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, en oocitos de Xenopus.

Figura 6 - Permeabilidad y dependencia del voltaje del GluCl\alpha y el GluCl\beta.

Figura 7 - Modulación de la corriente sensible al glutamato, por el IVMPO_{4}.

Figura 8 - Un análisis poligenético del GluCl\alpha y del GluCl\beta.

Descripción detallada

La presente invención comprende al DNA codificante de los canales de cloruro sensibles al glutamato y a la avermectina (GluCl), de invertebrados, los cuales fueron aislados de células productoras de GluCl. GluCl, según lo explicado aquí, se refiere a la proteína que puede funcionar específicamente como un canal anión de apertura controlada por glutamato.

La secuencia de aminoácidos de GluCl de invertebrados, no era conocida con anterioridad, ni tampoco la secuencia de nucleótidos que codifican los GluCl. Esta es la primera clonación reportada, de un canal de cloruro de apertura controlada por glutamato. Es también el primer informe de la clonación de un objetivo de la avermectina en invertebrados, y de un canal de cloruro sensible a la avermectina, en invertebrados. Se predice que todos los organismos sensibles a la avermectina, contendrán los canales sensibles a la avermectina y al glutamato ya descritos. Las células de invertebrados capaces de producir GluCl están incluidas en, aunque no limitadas a, músculos o células nerviosas aisladas de estos organismos que muestran sensibilidad a las avermectinas. Los animales sensibles a la avermectina son variados e incluyen invertebrados pertenecientes a los filos Artrópodos y Nemátodos.

Otras células y líneas celulares pueden ser también apropiadas para usarse en el aislamiento de cDNA de los GluCl. La selección de células adecuadas puede realizarse mediante la búsqueda de actividad de GluCl en extractos celulares. La actividad de GluCl puede ser monitorizada realizando un binding assay (Cully and Paress, supra; Roher et al, supra) o por medida electrofisiológica directa de un canal de cloruro sensible a la avermectina y al glutamato [Martin, R.J. & Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989); Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985); Duce, I.R. & Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85, 395-401 (1985); Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)]. Las células que muestren actividad GluCl en este análisis, pueden ser también apropiadas para el aislamiento de DNA o mRNA de los GluCl.

Toda una variedad de procedimientos conocidos en esta materia pueden ser usados para clonar molecularmente ADN de los GluCl. Estos métodos incluyen (aunque no están limitados solo a) la expresión funcional directa de los genes de los GluCl tras la construcción de un archivo que contenga cADN de los GluCl, en un sistema de vectores de expresión apropiados. Otro método es monitorizar archivos de cADN de GluCl construidos en un plásmido o bacteriófago que actúe como vector-lanzadera, con una sonda de oligonucleótidos etiquetados diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos de las subunidades de los GluCl. Un método adicional consiste en el seguimiento de una archivo de cADN de GluCl construido en un plásmido o bacteriófago usado como vector-lanzadera, con un cADN parcial, codificante de las subunidades de GluCl. Este cADN parcial se obtiene por la amplificación específica de PCR, de fragmentos de ADN de GluCl, a través del diseño de cebadores de oligonucleótidos degenerados, procedentes de la secuencia de aminoácidos de las subunidades purificadas de GluCl.

Otro método es aislar ARN de células productoras de GluCl, y traducirlo a proteínas mediante un sistema de trascripción in vitro, o mediante uno in vivo. La traducción de ARN a un péptido y una proteína producirá al menos una porción de la proteína de los GluCl, la cual podrá ser identificada, por ejemplo, mediante reactividad inmunológica con un anticuerpo anti-GluCl, o por actividad biológica del la proteína de GluCl. En este método, reservas de ARN aislado de las células productoras de GluCl, pueden ser analizados por la presencia de un ARN que codifique al menos una porción de la proteína de GluCl. Pueda realizarse un posterior fraccionamiento de la reserva de ARN, para purificar el ARN de los GluCl, del ARN que no pertenece a los GluCl. Los péptidos o proteínas generados por este método, pueden ser analizados para proveer secuencias de aminoácidos, que se usarán para crear cebadores para la producción de cADN de GluCl; o el ARN utilizado en la traducción, puede ser analizado para proveer secuencias de nucleótidos codificantes de GluCl, y generar sondas para la producción del cADN de los GluCl. Este método es reconocido, y se lo puede hallar, por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

Es evidente para los expertos en la materia, que otros tipos de archivos, además de archivos construidos a partir de otras células, o tipos celulares, pueden ser muy útiles para aislar el ADN codificante de los GluCl. Otros tipos de archivos incluyen (aunque no quedan limitados a) archivos de cADN derivado de otras células, a partir de otros organismos, además de C. elegans; y archivos de ADN que incluyen CAL (cromosomas artificiales de levaduras), y archivos de cósmidos.

Es claramente evidente para aquellos cualificados en la materia, que los archivos de cADN apropiado, pueden ser preparados a partir de células, o de líneas celulares, con actividad GluCl. La selección células o líneas celulares para preparar archivos de cADN para aislar cADN de los GluCl, puede ser realizada mediante una medición inicial de la actividad de células asociadas a GluCl, usando sistemas de medición electrofisiológicos, de canales cloruro sensibles a las avermectinas o al glutamato; o mediante binding assay de ligandos a las avermectinas y al glutamato.

La preparación de bibliotecas de cADN puede llevarse a cabo mediante técnicas estándar bien conocidas en esta disciplina. Se pueden encontrar técnicas de construcción de cADN reconocidas en, por ejemplo, Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989).

Es también evidente para los expertos en la técnica, que el ADN codificante de GluCl puede ser aislado también a partir de archivos de ADN apropiado genómicamente. La construcción de bibliotecas de ADN genómico puede ser realizada vía técnicas estándar bien conocidas. Técnicas reconocidas pueden ser encontradas en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989).

Para clonar los genes de GluCl mediante los métodos descritos anteriormente, la secuencia de aminoácidos de los GluCl puede ser necesaria. Para lograrlo, pueden purificarse proteínas de GluCl, y determinarse secuencias parciales de aminoácidos mediante secuenciadores automáticos. No es necesario determinar la secuencia entera de aminoácidos, pero la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína, es determinada por la producción de cebadores para la amplificación mediante PCR, de un fragmento parcial de ADN de GluCl.

Una vez que las secuencias de aminoácidos apropiadas han sido identificadas, se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Como el código genético es degenerado, mas de un codón puede ser usado para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de los nucleótidos de un set de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del set será idéntico a la secuencia del GluCl, pero será capaz de hibridizar con el ADN de los GluCl, incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con incompatibilidades. Los oligonucleótidos de ADN con incompatibilidades, pueden incluso hibridizar suficientemente con el ADN de los GluCl, para permitir la identificación y aislamiento del ADN codificante de los GluCl. El ADN aislado por estos métodos, puede ser utilizado para monitorizar archivos de ADN procedente de distintos tipos celulares, tanto de invertebrados como de vertebrados, y para aislar genes homólogos.

Los GluCl activos, purificados biológicamente, pueden tener varias formas físicas distintas. Los GluCl pueden existir como polipéptidos íntegros, recién creados y si procesar; o como polipéptidos parcialmente procesados; o como combinaciones de polipéptidos procesados. Los polipéptidos íntegros y recién creados, pueden ser modificados tras la traducción, por eventos específicos de escisión, que darán lugar a fragmentos del polipéptido original. Un fragmento, o asociación física de fragmentos, puede tener la actividad biológica completa asociada con el GluCl (canal de cloruro de apertura controlada por la avermectina y el glutamato); sin embargo, el grado de actividad de los GluCl puede variar entre fragmentos individuales de GluCl y fragmentos de polipéptidos de GluCl físicamente asociados.

El ADN de GluCl clonado, obtenido mediante los métodos descritos aquí, puede ser expresado recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de expresión que contenga un promotor apropiado, y otros elementos reguladores de la trascripción adecuados, y que sea transferido a células anfitrionas procariotas o eucariotas, para producir GluCl recombinante. Las técnicas para estas manipulaciones son completamente descritas en Maniatis, T, et al. supra, y son bien conocidas en este medio. Los vectores de expresión son definidos aquí como secuencias de ADN que son requeridas para la trascripción de copias clonadas de genes, y para la traducción de su mARN, en un anfitrión apropiado. Estos vectores pueden ser usados para expresar genes eucarióticos, en una variedad de hospedadores tales como bacterias, incluyendo E. coli, algas verdea-azuladas, células vegetales, células de insectos, células de hongos (incluyendo células de levaduras), y células animales.

Los vectores diseñados específicamente, permiten los transportes de ADN entre anfitriones, tales como de bacterias a células de levadura; o de bacterias a células animales; o de bacterias a células de hongos; o de bacterias a células de invertebrados. Un vector de expresión construido adecuadamente, debería contener: un origen de replicación para replicación autónoma en células anfitrionas; marcadores seleccionables; un número limitado de sitios de restricción enzimática; potencial para un número alto de copias; y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige a la ARN-polimerasa para unirse con el ADN, y así iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que implica la producción de mARN con una alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir (aunque no quedan limitados a) vectores de clonación; vectores de clonación modificados; plásmidos o virus específicamente diseñados.

Distintos vectores de expresión de mamíferos pueden ser utilizados para expresar GluCl recombinantes, en células de mamíferos. Vectores de expresión de mamíferos, disponibles comercialmente, y que sean apropiados para la expresión de GluCl recombinante, incluyen (aunque no quedan limitados a): pMAMneo (Clontech); pcDAN3 (Invitrogen); pMC1neo (Stratagene); pXT1 (Stratagene); pSG5 (Stratagene);

EBO-pSV2-neo (ATCC 37593); pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110); pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224); pRSVgpt (ATCC 37199); pRSVneo (ATCC 37198); pSV2-dhfr (ATCC 37146); pUCTag (ATCC 37460); y IZD35 (ATCC 37565).

Distintos vectores de expresión bacterianos pueden ser usados para expresar GluCl recombinante en células bacterianas. Vectores de expresión disponibles comercialmente, que pueden ser apropiados para la expresión de los GluCl recombinantes, incluyen (aunque no están limitados a): vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen). Distintos vectores de expresión de células fúngicas pueden ser usados para la expresión de GluCl recombinante, en células de hongos, como levaduras. Vectores de expresión en células fúngicas, disponibles comercialmente, y que son apropiadas para la expresión de GluCl recombinante, incluyen (aunque no están limitados a): pYES2 (Invitrogen) y el vector de expresión Pichia (Invitrogen).

Distintos vectores de expresión de células de insectos, pueden ser usados para expresar GluCl recombinantes en células de insectos. Vectores de expresión de células de insectos, apropiados para la expresión de GluCl recombinante, y disponibles comercialmente, incluyen (aunque no están limitados a): pBlueBacII (Invitrogen).

El ADN codificante de los GluCl puede ser también clonado en un vector de expresión, para la expresión en una célula hospedadora recombinante. Las células hospedadoras recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo (aunque no quedando limitadas a) bacterias como la E. coli; células fúngicas como las levaduras; células de mamíferos, incluyendo (aunque sin quedar limitadas a) líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de monos y de roedores; y células de insectos, incluyendo (aunque sin quedar limitados a) líneas celulares derivadas de la drosophila, o de los gusanos de seda. Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos, que pueden ser apropiadas, y comercialmente disponibles, incluyen (aunque no quedan limitadas a): CV-1 (ATCC CCL 70); COS-1 (ATCC CRL 1650); COS-7 (ATCC CRL 1651); CHO-K1 (ATCC CCL 61); 3T3 (ATCC CCL 92); NIH/3T3 (ATCC CRL 1658); HeLa (ATCC CCL 2); C1271 (ATCC CRL 1616); BS-C-1 (ATCC CCL 26); MRC-5 (ATCC CCL 171); células L; y HEK-293 (ATCC CRL1573).

Los vectores de expresión pueden ser introducidos en la célula hospedadora mediante cualquiera de las técnicas que incluyen (aunque no quedan limitadas a): transformación; transfección; fusión de protoplastos; lipofección; y electroporación. Las células que contienen vectores de expresión son propagadas clónicamente, y analizadas individualmente, para determinar si producen proteínas de GluCl. La identificación de las células hospedadoras con expresión de GluCl, puede ser realizada por muchas vías, incluyendo (aunque sin quedar limitadas a): reactividad inmunológica con anticuerpos anti-GluCl; y la presencia de actividad GluCl asociada a células hospedadoras.

La expresión de ADN de GluCl puede ser realizada también usando mRNA sintético producido in vitro. El mRNA sintético, o el mRNA aislado de células productoras de GluCl, pueden ser traducidos eficientemente en distintos sistemas libres de células, incluyendo (aunque sin quedar limitados a) extractos de germen de trigo, y extractos de reticulocitos; así como pueden ser traducidos eficazmente en sistemas basados en células, incluyendo (aunque sin quedar limitados a) la microinyección en oocitos de rana, siendo esta la preferida.

Para determinar la secuencia (o secuencias) de ADN de GluCl que dan lugar a niveles óptimos de actividad GluCl y/o proteínas de los GluCl (incluyendo, aunque no quedando limitado a, las moléculas de ADN de GluCl), puede construirse lo siguiente: el marco de lectura, totalmente abierto, del cADN codificante del GluCl, que codifica las subunidades GluCl\alpha (52.550 kDa) y GluCl\beta (49.900 kDa), va aproximadamente desde la base 51 hasta aproximadamente la base 1433, y desde la base 14 hasta aproximadamente la base 1315, respectivamente (estos números corresponden al primer nucleótido de la primera metionina, y al último nucleótido antes del primer codón de detención) y muchas construcciones conteniendo porciones del cADN codificante de la proteína del GluCl. Todas las construcciones pueden ser diseñadas para contener ninguna, todas, o porciones de las regiones sin traducir 5' o 3', del cADN de GluCl. La actividad de GluCl, y los niveles de expresión de proteínas, pueden ser determinados siguiendo la introducción de aquellas construcciones, tanto individualmente como en combinación, dentro de las células anfitrionas adecuadas. Siguiendo la determinación de la expresión de cassettes de producción óptima de ADN de GluCl en análisis pasajeros, estas construcciones de ADN de GluCl son transferidas a distintos vectores de expresión, para la expresión en células anfitrionas que incluyen (aunque no quedan limitadas a): células de mamíferos; células de insectos infectadas por bacilovirus; E. coli; y la levadura S. cerevisiae.

Las células hospedadoras transfectantes, y los oocitos microinyectados, pueden ser analizados para observar tanto los niveles de actividad de los canales de GluCl, como los niveles de proteínas de GluCl, siguiendo los siguientes métodos. En el caso de las células hospedadoras recombinantes, esto implica la co-transfección de uno, o posiblemente dos o más plásmidos, conteniendo el ADN de GluCl, una o más subunidades. En el caso de los oocitos, esto incluye la co-inyección de sARN sintético para una o más subunidades de GluCl. Dejando pasar un periodo de tiempo apropiado para permitir la expresión, la proteína celular es etiquetada metabólicamente con, por ejemplo, ^{35}S-metionina, durante 24 horas, después de las cuales el lisado celular y el sobrenadante de los cultivos celulares es recogido y sujeto a inmuno-precipitación con anticuerpos policlonales, dirigidos contra la proteína de GluCl.

Otros métodos para detectar actividad de GluCl, incluyen la medida directa de actividad de GluCl en células enteras transfectadas con cADN de GluCl, o en oocitos inyectados con mARN de GluCl. La actividad de GluCl se mide mediante ligandos de unión específica, y por las características electrofisiológicas de las células hospedadoras que expresan ADN de GluCl. En el caso de las células hospedadoras recombinantes que expresan GluCl, se pueden usar técnicas de análisis del potencial de membrana, para medir la actividad de los canales de cloruro, y cuantificar la proteína de GluCl. En el caso de los oocitos, se pueden usar tanto técnicas de potencial de membrana, como de potencial entre dos electrodos, para medir la actividad de los canales de cloruro y cuantificar la proteína de GluCl.

Los niveles de proteína de GluCl en células anfitrionas, son cuantificados mediante técnicas de inmunoafinidad y/o de afinidad de ligandos. Las células que expresan GluCl, pueden ser analizadas por el número de moléculas de GluCl expresadas, midiendo la cantidad de glutamato o ivermectina radioactivos, unidos a la membrana celular. Cromatografía de afinidad específica para GluCl o anticuerpos específicos para el GluCl, son usados para aislar proteína de GluCl etiquetada, por ejemplo, con ^{35}S-metionina; o proteína de GluCl no etiquetada. La proteína etiquetada es analizada mediante SDS-Page. La proteína no etiquetada es detectada mediante Western, ELISA o análisis RIA, empleando anticuerpos específicos de GluCl.

Puesto que el código genético es degenerado, mas de un codón puede ser utilizado para codificar un aminoácido en particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquier oligonucleótido de un set de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del set será idéntico a la secuencia de GluCl, pero tendrá la capacidad de hibridar con el ADN de GluCl, incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con incompatibilidades, bajo condiciones adecuadas. Bajo condiciones alternas, los oligonucleótidos de ADN incompatibles, pueden incluso hibridar con el ADN del GluCl, para permitir la identificación y aislamiento del ADN codificante del GluCl.

El ADN codificante del GluCl, de un organismo en particular, puede ser utilizado para aislar y purificar homólogos de GluCl de otros organismos. Para conseguir esto, el primer ADN de GluCl puede ser mezclado con una muestra que contenga ADN codificador de homólogos de GluCl, bajo condiciones apropiadas de hibridación. El complejo de hibridación de ADN puede ser aislado, y el ADN codificante de ADN homólogo, puede entonces ser purificado.

Se sabe que hay una cantidad sustancial de redundancia en los distintos codones que codifican para aminoácidos específicos. Por tanto, esta invención está dirigido también a aquellas secuencias de ADN que contienen codones alternativos, que codifican para la traducción eventual de los aminoácidos idénticos. Para los propósitos de esta especificación, una secuencia que lleva uno o más codones reemplazados, será definida como una variación degenerada. También se incluyen en el ámbito de esta invención, las mutaciones, o en la secuencia de ADN, o las proteínas traducidas que no alteran sustancialmente las propiedades físicas últimas de las proteínas expresadas. Por ejemplo, la sustitución de la valina por leucina, la arginina por lisina, o la asparraguina por glutamina, pueden no causar un cambio en la funcionalidad de los polipéptidos.

Se sabe que las secuencias de ADN codificantes para un péptido, pueden ser alteradas para codificar un péptido con propiedades distintas de las naturales para ese péptido. Métodos para alterar las secuencias de ADN incluyen (aunque no están limitadas a) mutagénesis dirigida a un sitio. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen (aunque no quedan limitadas a) cambios en la afinidad de una enzima por un substrato, o de un receptor por un ligando.

Según lo explicado aquí, un "derivado funcional" del GluCl es un compuesto que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la actividad biológica del GluCl. En el término "derivados funcionales" se intenta incluir los "fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o a los "derivados químicos" del GluCl. El término "fragmento" se refiere a cualquier subconjunto de polipéptidos de GluCl. El término "variante" se refiere a una molécula sustancialmente similar en estructura y función a la molécula entera de GluCl, o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" al GluCl si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares, o si ambas moléculas poseen similar actividad biológica. Por tanto, si las dos moléculas poseen sustancialmente la actividad similar, se las considera variantes, incluso si no encontramos la estructura de una de las moléculas en la otra, o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a una molécula sustancialmente similar en función, tanto a la molécula entera de GluCl, como a un fragmento de la misma.

Siguiendo la expresión de GluCl en una célula hospedadora recombinante, la proteína de la GluCl puede ser recuperada, para proporcionar GluCl en forma activa. Bastantes procedimientos de purificación de GluCl están disponibles para el uso, y son adecuados. Tal como se describió más arriba para la purificación de GluCl desde fuentes naturales, le GluCl recombinante puede ser purificado desde lisados y extractos celulares, o desde medios de cultivo acondicionados, por varias combinaciones de, o aplicaciones individuales de, fraccionamiento salino, hidroxilapatita, cromatografía de absorción, y cromatografía de interacción hidrofóbica.

Además, el GluCl recombinante puede ser separado de otras proteínas celulares, mediante el uso de columnas de inmunoafinidad hechas con anticuerpos mono o policlonales, específicos para GluCl íntegro recién creado, fragmentos de polipétidos de GluCl, o subunidades de GluCl.

Anticuerpos monoespecíficos del GluCl son purificados a partir de antisuero de mamíferos, que contiene anticuerpos reactivos contra el GluCl, o que son preparados como anticuerpos monoclonales reactivos con el GluCl, usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Anticuerpo monoespecífico, tal como lo mencionamos aquí, se definen como una especie de anticuerpos simple, o una especie de anticuerpos múltiples, con características de unión homogéneas para el GluCl. Unión homogénea, tal como lo mencionamos aquí, se refiere a la habilidad de la especie de anticuerpos, para unirse a un antígeno específico, o epítopo, semejante a aquellos asociados con el GluCl, tal como se describe anteriormente. Se eleva la cantidad de anticuerpos específicos al GluCl, inmunizando a animales como ratones, ratas, cerdos de Guinea, conejos, cabras, caballos, y similares, siendo los conejos los preferidos, usando una concentración apropiada de GluCl, tanto con la participación de un coadyuvante inmune, como sin ella.

El suero preinmune se recoge antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre unos 0,1 mg y unos 1000 mg de GluCl asociado con un coadyuvante inmune aceptable. Estos coadyuvantes aceptables incluyen (aunque no quedan limitados a) el completo de Freund; el incompleto de Freund; precipitado de alumbre; agua en emulsión de aceite, conteniendo Corynebacterium parvum y tRNA. La inmunización inicial consiste en GluCl en, preferiblemente, adyuvante completo de Freund, en múltiples sitios, o bien subcutáneamente (SC), o bien intraperitonealmente (IP), o ambas. Cada animal es sangrado a intervalos regulares, preferiblemente de manera semanal, para determinar el nivel de anticuerpos. Los animales pueden recibir, o no, inyecciones para aumentar la presión, tras la inmunización inicial. A aquellos animales que si reciben las inyecciones posteriores, se les suele dar una cantidad igual de antígeno en adyuvante de Freund incompleto, por la misma ruta. Las inyecciones para aumentar la presión del tratamiento, se suministran durante intervalos de tres semanas, hasta que se obtengan los niveles máximos de anticuerpos. Sobre los 7 días posteriores a cada inyección de inmunización, o semanalmente tras la inmunización única, los animales son sangrados, el suero recolectado, y las alícuotas son almacenadas a unos -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (mAc) reactivos con el GluCl, se preparan inmunizando con GluCl, fetos de ratones, preferiblemente Balb/c. Los ratones son inmunizados vía IP o SC, con entre 0,1 mg y 10 mg (preferiblemente 1 mg) de GluCl en 0,5 ml de tampón o salino incorporado en un volumen igual de un adyuvante apropiado, tal como los expuestos anteriormente. El preferido es el adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial el día 0, y se les deja en reposo entre 3 y 30 semanas. Los ratones inmunizados reciben una o más inmunizaciones adicionales, de aproximadamente 0,1 a 10 mg de GluCl en solución tampón, tal como fosfato tamponado salino, por vía intravenosa (IV). Los linfocitos de ratones con anticuerpos positivos, preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtienen extrayendo los bazos de los ratones inmunizados, mediante procedimientos estándar conocidos en el medio. Las células hibridomas se producen mezclando los linfocitos esplénicos con un patrón de fusión adecuado, preferiblemente células del mieloma, bajo condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los patrones de fusión pueden incluir (aunque no están limitados a): mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, siendo el Sp 2/0 el preferido. Las células productoras de anticuerpos, y las células del mieloma, se unen en glicol de polietileno, de unos 1000 mol/peso, a concentraciones de entre el 30% y el 50%. Los hibridomas fusionados se seleccionan por crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina, suplementados con el Medio de Eagles Modificado, de Dulbecco (MEMD), mediante procedimientos conocidos en la materia. Se recolectan los fluidos sobrenadantes de las fuentes con crecimientos positivos, los días 14, 18 y 21, y se monitorizan para detectar producción de anticuerpos, usando inmunoensayos tales como inmunoradioensayo de fase sólida (SPIRA), usando GluCl como antígeno. Los fluidos del cultivo también son estudiados, usando el análisis de precipitación Ouchterlony, para determinar los isótopos de los mAc. Las células de hibridoma procedentes de las fuentes con anticuerpos positivos, son clonadas mediante técnicas tales como la técnica de agar blando de MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.

Los anticuerpos monoclonales son producidos in vivo mediante inyección en ratones preparados con pristane, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con entre 2 x 10^{6} y 6 x 10^{6} hibridomas, unos 4 días después de la preparación. El fluido ascite es recogido unos 8-12 días después de la transferencia celular, y los anticuerpos monoclonales son purificados mediante técnicas conocidas en la materia.

La producción in vitro de mAc anti-GluCl se realiza mediante el crecimiento del hibridoma en MEMD que contenga un 2% de suero fetal de ternero, para obtener suficientes cantidades del mAc específico. Los mAc son purificados usando técnicas conocidas en el medio.

Los niveles de anticuerpo de fluidos de cultivos de ascitas o hibridomas, se determinan mediante distintos ensayos inmunológicos o serológicos, que incluyen (aunque no quedan limitados a) precipitación; aglutinación pasiva; técnica de anticuerpo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA); y técnicas de inmunoradioensayo (RIA). Ensayos similares son usados para detectar la presencia de GluCl en fluidos corporales, o extractos celulares y tisulares.

Es evidente para aquellos expertos en la materia, que los métodos para producir anticuerpos monoespecíficos descritos anteriormente, puede ser usados para producir anticuerpos específicos para fragmentos de polipéptidos de GluCl, o para polipéptidos de GluCl enteros recién creados, o para subunidades individuales de GluCl. Específicamente, es claro para los expertos en la materia, que los anticuerpos monoespecíficos, pueden ser generados para ser específicos para solo una subunidad de GluCl, o para el canal cloruro de apertura controlada por avermectina o glutamato, totalmente funcional.

Las columnas de afinidad de anticuerpos GluCl, se realizan añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorda), un soporte de gel que es activado con un éster N-hidroxisuccinimida, de tal modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de gel de agarosa. Los anticuerpos se unen entonces al gel, vía enlaces amida, con el brazo espaciador. Los esteres activados que quedan, se saturan con etanolamina HCl (pH 8) 1 M. Se lava la columna con agua, seguida de glicina HCl (pH 2,6) 0,23 M, para remover cualquier anticuerpo no conjugado, o proteínas extrañas.

Entonces se equilibra la columna con tampón fosfato salino (pH 7,3), y se hace pasar lentamente a través de la columna al sobrenadante o a los extractos celulares que contienen GluCl, o subunidades de GluCl. Finalmente, se lava la columna con tampón fosfato salino hasta que la densidad óptica (A_{280}) baje hasta el fondo, y entonces se enjuaga la proteína con glicina HCl (pH 2,6) 0,23 M. Entonces se dializa la proteína GluCl purificada, contra tampón fosfato salino.

Dos clones DNA, denominados pGluCl\alpha y pGlucCl\beta, se han identificado como codificadores de proteínas que, cuando se expresan en oocitos de Xenopus, forman un canal cloruro sensible al glutamato y al 4-O-fosfato de ivermectina (IVMPO_{4}). Cada subunidad es capaz de formar canales cloruro homoméricos, que muestran distintivamente propiedades electrofisiológicas y farmacológicas distintas. Cuando las subunidades GluCl\alpha y_GlucCl\beta son coexpresadas, las propiedades resultantes indican una interacción de las dos proteínas, para formar canales cloruro heteroméricos en los oocitos. La coexpresión de GluCl \alpha y \beta implica la reconstitución de las propiedades observadas en oocitos inyectados con poli (A)^{+} ARN codificante de GluCl [Arena, J.P., Liu. K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40. 368-374 (1991)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Esto incluye: activación directa de la corriente con IVMPO_{4}, glutamato e ibotenato; des-sensitización en presencia del glutamato; potenciación de la corriente sensible al glutamato, mediante IVMPO_{4}; una relación aparente de rectificación I/V; bloqueo de baja afinidad por picrotoxina y ácido flufenámico; e insensibilidad al GABA y la
glicina.

Los canales de cloruro controlados por glutamato, solo han sido reportados en invertebrados, y se encuentran en músculos de insectos, y en somas neuronales de músculo de crustáceos, y se expresan en oocitos, desde poli
(A)^{+} RNA, de músculo de insectos [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D.J. Neurosci. Len. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J.Physiol. 255, 449-464 (1976)]. [Fraser, S.P., et al., Mol. Brain Res. 8, 331-341 (1990)]. La terminología receptor H (hiperpolarización) se usa para distinguir los canales cloruro controlados por glutamato, de los receptores excitatorios de glutamato D (despolarización), en músculo de langosta [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. Similares a los oocitos inyectados con ARN de GluCl \alpha&\beta, los receptores H de los artrópodos, son activados característicamente con ibotenato, bloqueados con baja afinidad por la picrotoxina, y no se activan con GABA [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351-363 (1973)]. Los receptores H del músculo de langosta son activados directamente con las avermectinas, del mismo modo en que lo son los canales de cloruro controlados por glutamato, expresados a partir de ARN poli (A)^{+} de C.elegans [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Además, los canales cloruro controlados por glutamato, de soma neuronal de langosta, son potenciados, y directamente activados, por avermectina [Aydar, E., harding, L., Beadle, D.J. & Bermudez, I. Proceedings of the British Pharmacological Society p24 (1993)]. Por lo tanto, GluCl\alpha y GluCl\beta parecen representar una clase de canales de cloruro de apertura controlada por ligandos, relacionados con los receptores H de los artrópodos. Esta clase de canales, representan el blanco para las avermectinas en C. elegans, y pueden mediar las acciones antihelmínticas e insecticidas de las avermectinas en otros organismos. Los análisis filogenéticos sugieren que GluCl\alpha y GluCl\beta representan una subclase única de canales de cloruro regulados por ligandos, que pueden estar relacionados con la glicina \alpha y \beta, y proteínas Lym z y Dros rdl. Aunque esas proteínas están filogenéticamente relacionadas, responden a distintos ligandos, y son farmacológicamente diferentes [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. & Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)], [French-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. & Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)], [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963-970 (1990)], [Hutton, M.L., Harvey, R.J., Earley, F.G.P., Barnard, E.A. & Darlison, M.G. FEBS letters 326, 112-116 (1993)]. La relación de la subunidad GluCl\alpha con la GluCl\beta se refleja también en la evidente conservación de sitios de unión tanto para el glutamato, como para el IVMPO_{4}. Los canales GluCl\beta homoméricos, son directamente activados por con el glutamato, pero también se unen al IVMPO_{4}, puesto que la activación de la corriente por el glutamato, es inhibida por el IVMPO_{4}. En canales GluCl\alpha homoméricos, la corriente activada directamente por el IVMPO_{4}, es aún más activada por el glutamato, demostrando que hay un sitio de unión al glutamato en los GluCl\alpha.

Se ha informado que las avermectinas interactúan con otros miembros de la familia de los canales de cloruro regulados por ligandos. En nemátodos e insectos, las avermectinas bloquean la corriente sensible al GABA, mientras que en cangrejos, las avermectinas activan directamente un canal de cloruro regulado por multitransmisores (glutamato, acetilcolina, GABA) [Martin, R.J. & Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989)], [Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)], [Holden-Dye, L. & Walker, R.J. Parasitology 101, 265-271 (1990)], [Bermudez, I., Hawkins, C.A., Taylor, A.M. & Beadle, D.J. Journal of Receptor Research 11, 221-232 (1991)]. En oocitos que expresan receptores GABA_{a}, de cerebro de pollito, las avermectinas potencian la respuesta GABA [Sigel, E. & Baur, R. Mol. Pharmacol. 32, 749-752 (1987)]. Además, las avermectinas inhiben la unión de la estricnina a los receptores de glicina, en mamíferos [Graham, D., Pfeiffer, F. & Betz, H. Neurosci. Letters 29, 173-176 (1982)]. Sin embargo, las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta son los únicos miembros de la familia de canales cloruro regulados por ligandos, que muestran características farmacológicas únicas con respecto al glutamato y el ibotenato, y por tanto representan una nueva subclase de la familia de los canales iónicos regulados por ligandos.

La presente invención está también dirigido a métodos para monitorizar compuestos que modulen la expresión del ADN o el ARN codificantes del GluCl, además de la función de la proteína GluCl in vivo. Los compuestos que modulan esas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no-proteináceas. Los compuestos que modulan la expresión del ADN o el ARN codificantes del GluCl, o la función de la proteína GluCl, pueden ser detectados por una variedad de ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo "si/no" para determinar si hay un cambio en la expresión o en la función. El ensayo puede ser hecho cuantitativo, comparando la expresión o la función de una muestra de prueba, con los niveles de expresión o de función en una muestra estándar. Los moduladores identificados en este proceso, son muy útiles como agentes terapéuticos, insecticidas y antihelmínticos.

Los kits que contienen ADN de GluCl, anticuerpos de GluCl, o proteínas de GluCl, pueden ser preparados. Estos kits son usados para detectar ADN que hibridiza con el ADN del GluCl, o para detectar la presencia de proteína de GluCl, o de fragmentos de péptido, en una muestra. Esta caracterización es muy útil para una variedad de propósitos, que incluyen (aunque no quedan limitados a) análisis forenses y estudios epidemiológicos.

Las moléculas de ADN, las de ARN, las proteínas recombinantes, y los anticuerpos de la presente invención, pueden ser usados para monitorizar y medir los niveles de ADN de GluCl, de ARN de GluCl, o proteína GluCl. Las proteínas recombinantes, las moléculas de ADN, las moléculas de ARN y los anticuerpos, se prestan para la formulación de kits apropiados para la detección y tipeo del GluCl. Un kit como estos, comprendería un transportador compartimentalizado apropiado para contener en estricto confinamiento al menos un envase. El transportador abarcaría incluso re-agentes como proteína GluCl recombinante, o anticuerpos anti-GluCl, apropiados para detectar GluCl. El transportador también contendría un medio para la detección, tal como antígenos marcados, o substratos enzimáticos, o similares.

Las secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia de ADN codificante del GluCl, pueden ser sintetizadas por terapia "de sentido contrario". Esas moléculas de "sentido contrario" pueden ser ADN; derivados estables de ADN tales como fósforotioatos o metilfosfonatos; ARN; derivados estables del ARN tales como 2'-O-alkilARN; u otros oligonucleótidos de GluCl de "sentido contrario", miméticos. Las moléculas de GluCl de "sentido contrario" pueden ser introducidas en células, vía microinyección; encapsulación en liposomas; o por expresión a partir de vectores que albergan la secuencia de "sentido contrario". La "terapia de sentido contrario" del GluCl, puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades donde es beneficioso reducir la actividad GluCl.

La terapia con genes de GluCl puede ser utilizada para introducir GluCl en las células de los organismos que son nuestro objetivo. Los genes de GluCl pueden ligarse a vectores virales, los cuales median en la transferencia del AND de GluCl, infectando las receptoras células hospedadoras. Los vectores virales apropiados incluyen retorvirus, adenovirus, virus adeno-asociados, herpes virus, virus de la vacuna, polio virus, y similares. Alternativamente, el ADN de GluCl puede ser transferido a las células, mediante terapia génica con técnicas no-virales, que incluyen transferencia de ADN-blanco mediante receptor, usando conjugados de ligandos de ADN, o conjugados de ligandos de ADN a adenovirus, o fusión de membrana de lipofección, o microinyección directa. Estos porcedimientos, y sus variaciones, son apropiadas tanto para terapia génica de GluCl ex vivo como in vivo. La terapia con genes de GluCl puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades donde es beneficioso elevar la actividad del GluCl.

Composiciones farmacéuticamente útiles que comprendan ADN de GluCl, ARN de GluCl, o proteína GluCl, o moduladores de la actividad del receptor de GluCl, pueden ser formuladas de acuerdo a métodos conocidos, tales como la adición de un transportador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de estos transportadores y de estos métodos de formulación, pueden ser hallados en Remington's Pharmaceutical Sciencies. Para crear una composición farmacéuticamente aceptable, apropiada para una administración eficaz, estas composiciones contendrán una cantidad efectiva de la proteína, ADN, ARN, o modulador.

Composiciones terapéuticas o diagnósticas de la invención, son administradas a un individuo, en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos en los cuales se ha indicado la modulación de la actividad relacionada con el GluCl. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo a la variedad de factores, tales como la condición del individuo, el peso, el sexo y la edad. Otros factores incluyen el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden ser dadas al individuo por varias vías, como la subcutánea, la tópica, la oral, o la intramuscular.

El término "derivado químico" describe una molécula que contiene fragmentos químicos adicionales, que normalmente no son parte de la molécula base. Estos fragmentos pueden mejorar la solubilidad, la vida media, la absorción, etc. de la molécula base. Alternativamente, estos fragmentos pueden atenuar indeseables efectos secundarios de la molécula base, o disminuir la toxicidad de la misma. Se describen ejemplos de estos fragmentos en distintos textos, como el Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados de acuerdo a los métodos aquí divulgados, pueden ser usados solos, en dosis apropiadas definidas por pruebas de rutina, con el fin de obtener una inhibición óptima del receptor GluCl o de su actividad, mientras se minimiza cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la co-administración, o la administración secuencial de otros agentes.

La presente invención también tiene el objetivo de proveer formulaciones farmacéuticas apropiadas, de tipo tópico, oral, sistémico o parenteral, para su uso en los nuevos métodos de tratamiento de la presente invención. Las composiciones que contienen compuestos identificados de acuerdo a esta invención como el ingrediente activo para su uso en la modulación de los receptores de GluCl, pueden ser administradas en una amplia variedad de formas de dosis terapéuticas, en vehículos convencionales para su administración. Por ejemplo, los compuestos pueden ser administrados en forma de dosis orales, vía comprimidos, cápsulas (cada una incluyendo formulaciones de liberación por tiempo, o liberación sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, siropes y emulsiones, o por inyección. Así mismo, también pueden ser suministradas vía intravenosa (tanto en forma de bolo, como de infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o por vía intramuscular, siendo todas estas, formas bien conocidas para los expertos en temas farmacéuticos. Una cantidad efectiva, pero no tóxica, del compuesto deseado, puede ser empleado como un agente modulador del GluCl.

La dosis diaria de los productos, puede variar sobre un amplio rango, desde los 0,01 a los 1000 mg por paciente, por día. Para la administración oral, las composiciones se dan preferiblemente en forma de comprimidos marcados, conteniendo 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 y 50,0 miligramos del ingrediente activo, para el ajuste sintomático de la dosis para el paciente en tratamiento. Una cantidad efectiva de la droga es suministrada ordinariamente a un nivel de dosis de entre 0,0001 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, por día. El rango está más particularmente entre los 0,001 mg/kg y los 10 mg/kg de peso corporal, por día. Las dosis de los moduladores de los receptores GluCl, son ajustadas cuando se combinan para alcanzar los efectos deseados. Por otro lado, las dosis de esos distintos agentes, pueden ser optimizadas independientemente, y combinadas para alcanzar un resultado sinérgico allí donde la patología se reduce más de lo que sucedería si cada agente se usara por separado.

Ventajosamente, los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en una única dosis diaria, o la dosis total diaria puede ser administrada en dosis divididas en dos, tres o cuatro tomas diarias. Además, los compuestos para la presente invención, pueden ser administrados de forma intranasal, por vía de vehículos intranasales apropiados, por vía tópica; o bien por rutas transdermales, usando aquellas formas de parches cutáneos transdermales, bien conocidos por los expertos en la materia. Para ser administrados de forma transdermal, la dosis de administración será, por supuesto, más bien continua que intermitente, a lo largo del régimen de dosificación.

Para tratamiento de combinación, con más de un agente activo, donde los agentes activos se encuentran en dosis de formulaciones separadas, los agentes activos pueden ser administrados concurrentemente, o bien cada uno de ellos puede ser administrado por separado, en tiempos escalonados.

El régimen de dosificación al usar los compuestos de la presente invención, se selecciona de acuerdo con distintos factores, incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo, y condición médica del paciente; la severidad de la enfermedad a ser tratada; la ruta de administración; las funciones renal y hepática del paciente; y el compuesto empleado en particular. Un médico o veterinario corrientes pueden fácilmente determinar y prescribir las cantidades efectivas de la droga, requeridas para prevenir, contrarrestar o detener el avance de la enfermedad. La precisión óptima al conseguir concentraciones de la droga que estén en el rango que proporciona eficacia sin toxicidad, requiere un régimen basado en las cinéticas de la disponibilidad de la droga sobre los objetivos. Esto incluye una consideración de la distribución, el equilibrio, y la eliminación de la droga.

En los métodos de la presente invención, los compuestos descritos aquí en detalle, pueden formar el ingrediente activo, y son administrados típicamente mezclados con diluyentes farmacéuticos apropiados, excipientes o transportadores (colectivamente referidos aquí como materiales "transportadores") adecuadamente seleccionados con respecto a las forma intencionada de administración, que es pastillas orales, cápsulas, elixires, siropes y similares, y consistentes con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de pastilla oral o cápsula, el componente activo de la droga puede ser combinado con un transportador oral inerte aceptable, farmacéuticamente no tóxico, tal como el etanol, glicerol, agua y similares. Es más, cuando se desee, o sea necesario, se pueden incorporar a la mezcla, agentes colorantes, desintegrantes, lubricantes y cobertores, apropiados. Los agentes cobertores apropiados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa o beta-lactosa, dulcificantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como la acacia, tragacanto o alginato sódico, carboximetilcelulosa, glicol polietileno, ceras, y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen, sin limitación, oleato sódico, esterato sódico, esterato de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, y similares. Los desintegradores incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, goma de xantano, y similares.

Para las formas líquidas, los componentes activos de la droga pueden combinarse con agentes suspensores o dispersores, adecuadamente sazonados, tales como las gomas sintéticas y naturales, por ejemplo el tragacanto, la acacia, la metil-celulosa, y similares. Otros agentes dispersantes que pueden ser empleados incluyen la glicerina, y similares. Para administración parenteral, se prefieren soluciones y suspensiones estériles. Las preparaciones isotónicas que contienen preservativos adecuados, se emplean cuando se prefiere la administración intravenosa.

Las preparaciones tópicas que contienen el componente activo de la droga, pueden ser mezcladas con distintos materiales transportadores bien conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, alcoholes, gel de aloe vera, allantoína, glicerina, aceites de vitaminas A y E, aceite mineral, PPG2 miristil propionato, y similares; para formar, por ejemplo, soluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas limpiadoras, geles cutáneos, lociones cutáneas, y champúes en crema o gel.

Los compuestos de la presente invención pueden ser también administrados en forma de liposomas, tales como pequeñas vesículas unilamelares, vesículas unilamelares grandes, y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden estar formados por distintos fosolípidos, tales como el colesterol, estearilamina, o fosfatidilcolinas.

Los compuestos de la presente invención pueden ser también liberados mediante el uso de anticuerpos monoclonales que actúan como transportadores individuales a los que se unen las moléculas del compuesto. Los compuestos de la presente invención pueden unirse también con polímeros solubles, que funcionarán como transportadores de la droga. Estos polímeros pueden incluir polivinilo-pirrolidona, piran-copolímero, polihidroxipropilmetacril-amidefenol, polihidroxietilaspartamidefenol, o polietil-eneoxidepolilisina sustituida con residuos de palmitol. Es más, los compuestos de la presente invención pueden unirse a una clase de polímeros biodegradables muy útiles en la liberación controlada de una droga, como por ejemplo, ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidro-piranos, policianoacrilatos, o copolímeros de hidrogeles, de bloque anfipático, o enlazados en cruz.

Los compuestos son agentes antiparasitarios contra endo y ectoparásitos, particularmente helmintos y artrópodos, que causan numerosas enfermedades parasitarias en humanos, animales y plantas.

Las enfermedades parasitarias pueden ser causadas tanto por endoparásitos, como por ectoparásitos. Los endoparásitos son aquellos parásitos que viven dentro del cuerpo del hospedador, ya sea dentro de un órgano (como el estómago, los pulmones, el corazón, los intestinos, etc...), o simplemente bajo la piel. Los exoparásitos son aquellos parásitos que viven sobre la superficie externa del hospedador, pero aún cogen nutrientes del mismo.

Las enfermedades endoparasitarias generalmente referidas como helmintiasis, se deben a la infección del hospedador por gusanos parasitarios conocidos como helmintos. La helmintiasis es un problema económico serio y extendido a nivel mundial, debido a la infección de animales domésticos tales como cerdos, ovejas, caballos, ganado vacuno, cabras, perros, gatos, y aves de corral. Muchas de esas infecciones son causadas por el grupo de gusanos descrito como nemátodos, los cuales causan enfermedades en distintas especies de animales, a lo largo de todo el mundo. Esas enfermedades son frecuentemente serias, y pueden acabar en la muerte del animal infectado. Los géneros más comunes de nematodos que afectan a los animales mencionados antes, son Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, y Parascaris. Muchos parásitos son especies específicas (infectan solo a un hospedador), y la mayoría tienen también un sitio preferido de infección dentro del animal. Así, Haemonchus y Ostertagia infectan sobre todo el estómago, mientras que Nematodirus y Cooperia atacan sobre todo los intestinos. Otros parásitos prefieren residir en el corazón, ojos, pulmones, vasos sanguíneos, y similares, mientras que otros son parásitos subcutáneos. Las helmintiasis pueden llevar a debilidad, pérdida de peso, anemia, daños intestinales, malnutrición, y daños en otros órganos. Si se dejan sin tratar, estas enfermedades pueden acabar en la muerte del animal.

Las infecciones por artrópodos ectoparásitos como garrapatas, ácaros, piojos, moscas de los establos, tábanos, moscardas, pulgas y similares, son un serio problema también. La infección por estos parásitos, implica pérdida de sangre, lesiones cutáneas, y puede interferir con los hábitos normales de alimentación, lo que provoca pérdida de peso. Estas infecciones pueden también acabar en transmisión de enfermedades importantes que pueden ser fatales, como encefalitis, anaplasmosis, viruela porcina, y similares.

Los animales pueden ser infectados por muchas especies de parásitos al mismo tiempo, puesto que la infección provocada por uno de los parásitos, puede debilitar al animal, y hacerle más susceptible a la infección por una segunda especie de parásito. Por lo tanto, un compuesto con un amplio espectro de actividad es particularmente ventajoso en el tratamiento de esas enfermedades. Los compuestos de esta invención tienen actividad contra esos parásitos, y además son activos contra Dirofilaria en perros, Nematospiroides y Syphacia en roedores, insectos picadores, y larvas díperas migrantes, como Hypoderma sp. en ganado vacuno, y Gastrophilus en caballos. Los compuestos son también muy útiles contra endo y ectoparásitos que causan enfermedades parasitarias en humanos. Ejemplos de estos endoparásitos que pueden infectar al hombre, incluyen parásitos gastro-intestinales de los géneros Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, y similares. Otros endoparásitos que infectan al hombre se ubican en la sangre o en otros órganos. Ejemplos de esos parásitos son los gusanos filarias Wucheria, Brugia, Onchocerca, y similares, además de estados extra-intestinales de los gusanos intestinales Strongyloides y Trichinella. Los ectoparásitos que parasitan al hombre, incluyen artrópodos tales como garrapatas, pulgas, ácaros, piojos y similares, y al igual que con los animales domésticos, las infecciones por esos parásitos pueden acabar en la transmisión de serias, e incluso fatales, enfermedades. Los compuestos son activos contra estos endo y ectoparásitos, y además son también activos contra insectos picadores y otras pestes de dípteros que molestan al hombre.

Los compuestos son también muy útiles contra las pestes corrientes de las casas, tales como Blastella sp. (cucaracha), Tineola sp. (polilla de la ropa), Attagenus sp. (escarabajo de las alfombras), Musca domestica (mosca común), y contra Solenopsis invicta (hormiga roja importada).

Los compuestos son incluso útiles contra pestes agrícolas, tales como áfidos (Acyrthiosiphon sp.), langostas, gorgojos, además de contra pestes de insectos que atacan el grano almacenado, tales como Tribolium sp., y contra estados inmaduros de insectos, que viven en los tejidos vegetales. Los compuestos también son muy útiles como nematodicidas para el control de los nemátodos del suelo, lo que puede ser importante agrícolamente.

Para ser usados como agente antiparasitario, los compuestos pueden administrarse internamente, bien oralmente, bien por inyección, o tópicamente, como friegas, o como champú.

Para la administración oral, los compuestos pueden administrarse en cápsulas, pastillas, o bolos, o pueden mezclarse alternativamente en la comida de los animales. Las cápsulas, pastillas y bolos, son comprimidos del ingrediente activo en combinación con un vehículo transportador apropiado, tal como almidón, talco, estereato magnésico, o fosfato di-cálcico. Estas formas de unidad dosificadora se preparan mezclando íntimamente el ingrediente activo con ingredientes inertes apropiados, finamente pulverizados, incluyendo agentes diluyentes, rellenantes, y desintegrantes, y/o cobertores, de tal modo que se obtiene una mezcla uniforme. Un ingrediente inerte es aquel que no reaccionará con los compuestos, y que es no-tóxico para el animal bajo tratamiento. Los ingredientes inertes indicados, incluyen al almidón, lactosa, talco, estereato magnésico, gomas vegetales, y aceites, y similares. Esas formulaciones pueden contener una cantidad ampliamente variable de los ingredientes activos e inactivos, dependiendo de numerosos factores tales como el tamaño y tipo de la especie animal a ser tratada, y del tipo y severidad de la infección. El ingrediente activo puede ser administrado también como un aditivo en la comida, simplemente mezclando el compuesto con la materia alimentaria, o aplicando el compuesto en la superficie del alimento. Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser mezclados con un transportador inerte, y la composición resultante puede ser entonces mezclada con la comida, o bien ser suministrada directamente al animal. Los transportadores inertes aceptables incluyen harina de maíz, pulpa de cítricos, residuos de fermentaciones, harina de soja, granos desecados, y similares. Los ingredientes activos esta íntimamente mezclados con esos transportadores inertes, mediante molienda y agitado, de tal manera que la composición final contiene entre el 0,001 y el 5% del peso de ingrediente activo.

Los compuestos pueden ser alternativamente administrados, parenteralmente, vía inyección de una formulación consistente en el ingrediente activo disuelto en un transportador líquido inerte. La inyección puede ser o bien intramuscular, o intraruminal, o intratraqueal, o bien subcutánea. La formulación inyectable consta del ingrediente activo mezclado con un transportador líquido inerte adecuado. Los transportadores líquidos aceptables incluyen a los aceites vegetales, como el aceite de cacahuete, el aceite de semilla de algodón, el aceite de sésamo, y similares; además de solventes orgánicos tales como solketal, glicerol formal, y similares. Como una alternativa, pueden usarse también formulaciones acuosas parenterales. Los transportadores líquidos preferidos son los aceites vegetales. La formulación se prepara disolviendo o suspendiendo el ingrediente activo en el transportador líquido, de tal modo que la formulación final contenga entre 0,005 y el 10% del peso de ingrediente activo.

La aplicación tópica de los compuestos es posible mediante el uso de friegas o champúes que contengan los compuestos instantáneos en forma de solución acuosa o suspensión. Esas formulaciones contienen generalmente un agente suspensor, como la bentonita, y normalmente también contendrá un agente antiespumoso. Son aceptables las formulaciones que contengan entre el 0,005 y el 10% del peso de ingrediente activo. Las formulaciones preferidas son aquellas que contienen entre el 0,01 y el 5% del peso de los compuestos instantáneos.

Los compuestos son principalmente útiles como agentes antiparasitarios para el tratamiento y/o prevención de helmintiasis en animales domésticos como el ganado vacuno, ovejas, caballos, perros, gatos, cabras, cerdos, y aves de corral. También son muy útiles en el tratamiento y prevención de infecciones parasitarias de esos animales, por ectoparásitos como garrapatas, ácaros, piojos, pulgas y similares. Son efectivos también en el tratamiento de infecciones parasitarias en humanos. En el tratamiento de dichas infecciones, los compuestos pueden usarse individualmente, o en combinación de uno con el otro, o con otros agentes antiparasitarios sin relación. La dosis de los compuestos, requerida para los mejores resultados, depende de muchos factores, tales como la especie y tamaño del animal, el tipo y severidad de la infección, el método de administración, y el compuesto usado. La administración oral de los compuestos, a niveles de dosis entre los 0,0005 y los 10 mg por Kg de peso corporal del animal, ya sea en una dosis única, o bien en varias dosis espaciadas unos pocos días, generalmente da buenos resultados. Una única dosis de uno de los compuestos, normalmente da un control excelente, sin embargo se pueden dar dosis repetidas para combatir re-infecciones, o para tratar especies de parásitos que son inusualmente persistentes. Las técnicas de administración de esos compuestos a los animales, son conocidas por los expertos en el campo de la veterinaria.

Los compuestos pueden usarse también para combatir pestes agrícolas que atacan a las cosechas, ya sea en el campo, o en los almacenes. Los compuestos son aplicados para esos usos en forma de sprays, polvos, emulsiones, y similares, bien sobre las plantas en crecimiento, bien sobre lo cosechado. Las técnicas de aplicación de esos compuestos, de esta manera, son conocidas por los expertos en temas agrícolas.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención, aunque sin limitarla a ellos.

Ejemplo 1 Aislamiento de ARN de C. elegans

Se mantuvieron cultivos de C. elegans en placas petri con agar sembrado con E. coli, y se aislaron por flotación de sacarosa 60%, tal como lo describen Sulston and Hodgkin [In: The Nematode Caenorhabditis elegans p602-603 (1988) W.B. Wood editor, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York Publisher]. Las preparaciones de C. elegans se congelaron rápidamente en N_{2} líquido, y se sedimentaron con un mortero, mientras estaban sumergidas en el N_{2} líquido. Una solución que contenía tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico pH 7.0 5 mM, y \beta-mercaptoetanol 0,1 M, se mezcló en un homogeinizador politron, mientras los gusanos pulverizados congelados fueron añadidos, a 10 ml/g de gusanos. Tras 5 minutos de homgeinización, se añadió sarcosil sódico 0,5%, mezclándose bien, y la solución fue centrifugada a 10.000 rpm, durante 10 minutos. El sobrenadante se diferenció por capas sobre un cojín de CsCl 5,7 M, y se centrifugó durante 16 horas a 33.000 rpm. El pellet de ARN se lavó con etanol 70%, se resuspendió en H_{2}O, y se extrajo con cloroformo:isobutanol, 4:1 , y se precipitó con etanol. El ARN poli A(+) fue aislado tras dos rondas de purificación en columnas de oligo (dT)-celulosa.

Purificación de ARN poli A (+) en gel de agarosa

Se usó agarosa de temperatura ultra baja de gelificación (SeaPrep, FMC) para fraccionar el ARN poli A(+) por tamaño. La agarosa (2%) se hirvió en NaPO_{4} 15 mM, EDTA 1 mM, pH 6.5, y una vez que estuvo totalmente disuelta, se le añadió ácido iodoacético (AIA) 15 mM, y la agarosa se hirivió 2 minutos adicionales para desactivar cualquier ARN-asa presente. Todas las soluciones se trataron con dietilpirocarbonato 0,1% durante 12 horas, y pasadas por el autoclave durante 15 minutos. El gel, y el peine preparativo, se empaparon en AIA 15 mM durante 12 horas, y fueron aclarados con H_{2}O tratada con DEP. El gel se moldeó y se realizó la electroforesis a 4ºC en NaPO_{4} 15 mM, EDTA pH 6.5 1 mM y 6,5 V/cm, con circulación tampón. Se le realizó la electroforesis al ARN durante aproximadamente 20 horas, o hasta que el cilanol de xileno hubiera penetrado 7 cm en el gel. Se tomaron lonchas de gel de aproximadamente 1-2 mm, desde los 7,5 cm dentro del gel, hasta el origen del mismo, y se numeraron 1-47 (de abajo a arriba).

Fraccionamiento del ARN por tamaño

Se precipitó con etanol aproximadamente 150 \mug de ARN poli A(+) de C. elegans, y el pellet desecado se resuspendió en 400 \mul de formamida, y se desnaturalizó a 65ºC durante 3 minutos; se le añadió 50 \mul de SDS 1%, EDTA 10 mM, se mezcló, y la muestra se calentó a 65ºC durante 3 minutos. Se le añadió 50 \mul de tampón de carga de ARN (glicerol 50% EDTA 1mM BPB 0,4%, XC 0,4%), y la muestra fue inmediatamente cargada.

Recuperación del ARN

Las lonchas de gel se añadieron a tubos de 15 ml, y se bañaron a 65ºC hasta que se fundieron. Se añadió 10 ml de 1x oligo dT tampón de unión (BB) precalentado (KCl 0,5 M, HEPES pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM), y la muestra se mezcló, y se llevó a temperatura ambiente (unos 23ºC). Se hidrató en 1x BB, 1 g de celulosa oligo dT (Tipo 7, Farmacia), y se resuspendió en 15 ml de 1x BB con 1 ug/ml de tARN, y 25 u/ml de RNasin (Promega). Se proporcionaron 200 \mul de la suspensión en celulosa oligo dT, en las muestras de agarosa fundida, y se mezcló durante 1 hora. La muestra fue centrifugada, lavada una vez con 1x BB, y dos veces con tampón de lavado (KCl 0,1 M, HEPES pH 7.5 10 mM, y EDTA 1 mM). Se transfirió la muestra a tubos, y se centrifugó a 10.000 x g, 1 minuto, y el pellet fue resuspendido en 200 \mul de tampón de elución (HEPES pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM). El ARN fue extraído con fenol tamponado a 65ºC, y CHCl_{3} a 22ºC, y se añadió acetato sódico hasta los 0,3 M con 1 \mug de tARN transportador, y el ARN se precipitó con 2 volúmenes de etanol. Se repitió la precipitación de etanol, y el ARN se almacenó a -20ºC, hasta su uso, como un precipitado de etanol.

Ejemplo 2 Preparación de plásmidos

El plásmido vector pBluescript SKII(+) se obtuvo del Stratagene. El plásmido (4 \mug) se digirió con 20 unidades de Not I, y 24 unidades de EcoRV, en NaCl 150 mM, Tris-HCl pH 7.9 6 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, en un volumen de 46 \mul, durante 2 horas a 37ºC. Las enzimas fueron desactivas por calor a 65ºC, durante 10 minutos, y extraídas 2 veces con fenol tamponado, 2 veces con CHCl_{3}, y precipitado con Acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet fue resuspendido en 20,5 \mul de agua. y se añadió 2,5 \mul de tampón 10x AP (Tris-HCl pH 9.0 0,5 M, MgCl_{2} 10 mM, ZnCl_{2} 1 mM, espermidina 10 mM), con 1 \mul (1 unidad) de fosfatasa alcalina (Promega), y se les hizo reaccionar durante 30 minutos a 42ºC con una alícuota adicional de 1 unidad de AP añadida, y reaccionaron durante otros 30 minutos a 37ºC. La muestra fue sometida a electroforesis a través de gel de agarosa SeaKem LE 0,8%, en tampón TAE (Tris-Acetato 40 mM, EDTA pH 8.3 1 mM), y se purificaron los vectores lineales de ADN a partir del gel, usando el Clean Gene (Bio101).

Ligaduras

Aproximadamente 75 ng de ADN lineal pBluescript SK II(+) EcoRV-Not I digerido, se mezcló con aproximadamente 6 ng de cADN, de aproximadamente 3,1 ml del comienzo de la columna CL6B, en 15 \mul, y se trató con 0,5 unidades de ADN T4 ligasa (Boehringer Mannheim) durante 16 horas a 16ºC. Las muestras se precipitaron con la adición de 7,5 \mul de acetato amónico 8 M, y de 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet fue lavado en etanol 70%, secado y resuspendido en 2 \mul de agua.

Ejemplo 3 Clonación de pGluCl\alpha y pGluCl\beta Síntesis de cADN

Síntesis del primer filamento: Aproximadamente la mitad del ARN procedente de las fracciones 21 y 22 fue usado para sintetizar cADN. El precipitado de ARN fue centrifugado, y se lavó el pellet con etanol 70%, y se secó en el vacío. El pellet de ARN fue resuspendido en 25 \mul de H_{2}O tratada con DEP, calentado a 65ºC durante 10 minutos, y colocado en hielo. Los siguientes reagentes se añadieron una vez colocado en el hielo: 2 \mul de RNasin (40 u/\mul), 1 \mul de Actinomicina D (800 \mug/\mul refrescados en etanol 100%), 10 \mul de tampón 5x RT (Tris-HCl pH 8.3 250 mM, KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM, BRL), 5 \mul de DTT 0,1 M, 5 \mul de dNTPs 5 mM, 2,8 \mul de 1 lng/\mul oligonucleótido
primer

5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'

(SEQ. ID. NO.: 5), y 0,5 \mul de 200 u/\mul de transcriptasa inversa de virus Moloney Murine Leukemia. La reacción se incubó durante 60 minutos a 37ºC, se extrajo con fenol:CHCl_{3} (1:1, v:v, con fenol tamponado con Tris-HCl pH 7.4, BRL), y se purificó con una columna de sepharosa G-50, de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes (Boehringer Mannheim).

Síntesis del segundo filamento: La producción del primer filamento a partir de la columna G-50 (Boehringer Mannheim) se ajustó a 55 \mul, y se añadieron los siguientes reagentes, a 4ºC: 10 \mul de tampón 10x del segundo filamento (Tris pH 7.4 200 mM, MgCl_{2} 70 mM, KCl 1 M), 5 \mul de BSA (1 mg/ml), 3 \mul de dNTPs (nucleótido tri-fosfatos) 5 mM, 10 \mul de NAD (pH 7.2, 1,4 mM, hecho con métodos de ARNasa libre, y almacenado a -20ºC), 5 \mul de aP^{32}dCTP (3.000 Ci/mmol, 10,0 mCi/ml), 2,5 \mul de E. coli ligasa (NEBL 6 u/\mul), 1,1 \mul de ARNasa H (1,1 u/\mul Pharmacia), 7 \mul de ADN pol I (4 u/\mul Pharmacia). La reacción tuvo lugar a 16ºC durante 60 minutos, 22ºC durante 120 minutos, 65ºC durante 10 minutos, y luego se colocó en hielo. La reacción se extrajo 2 veces con fenol tamponado, y 2 veces con CHCl_{3}:alcohol isoamilo (24:1, v:v). Se quitó una muestra de 1 \mul para la cuantificación de la síntesis del cADN, y se añadió Acetato sódico hasta los 0,3 M, con 20 \mug de glicógeno (Boehringher Mannheim), y 2 volúmenes de etanol 100%, y el ADN precipitado a -20ºC. La síntesis de cADN se cuantificó mediante precipitación TCA. Se hizo una dilución 1:10 tras la síntesis del segundo filamento, y se añadió 1 \mul a 10 ml de Aquasol, para estimar el material radioactivo total que se había añadido. Se mezcló una alícuota de 1 \mul, con 50 \mug de ADN transportador en 100 \mul y 100 \mul de TCA 25%, y se añadió pirofosfato sódico 0,1%, en hielo, durante 15 minutos. El precipitado se recolectó por filtración de vacío en un filtro de cristal GF-B que había sido previamente empapado en TCA 10% y pirofosfato sódico 0,1%, a 4ºC, y se lavaron los filtros con TCA 10% congelado. Los filtros se añadieron a los frascos que contenían 10 ml de Aquasol, y se cuantificó la radioactividad. La producción estimada de cADN, de aproximadamente una mitad del ARN, de las fracciones 21 y 22, fue de 282 ng.

El ADN procedente de la síntesis del segundo filamento, fue tratado con ADN T4 polimerasa, para desafilar los extremos del ADN. El pellet de ADN fue resuspendido en 25 \mul de agua, y se añadió 3 \mul de tampón 10x ADN T4 polimerasa, con 1,5 \mul de dNTPs 5 mM, y 0,5 \mul de ADN T4 polimerasa. La reacción tuvo lugar a 37ºC durante 30 minutos, y se detuvo mediante la adición de 0,5 \mul de EDTA 500 mM, se extrajo 2 veces con tampón fenol:CHCl_{3} (1:1), 2 veces con CHCl_{3}, y se precipitó con acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet de ADN se resuspendió en 17 \mul de agua y 0,2 \mul de BSA 1 mg/ml y 2 \mul de tampón 10x Not I (NEBL) y 0,4 \mul (4 u) de Not I, y fue incubado a 37ºC durante 3 horas. La muestra se extrajo 2 veces con tampón fenol:CHCl_{3} (1:1), 2 veces con CHCl_{3}, y se precipitó con acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol 100%. El precipitado de ADN se resuspendió en 25 \mul de agua, y se calentó a 65ºC durante 5 minutos, y se enfrió en hielo, y se añadieron 2,5 \mul de NaCl 5 M, y se aplicó la muestra sobre una columna de Sepharosa CL6B (0,7 x 22 cm), la cual estaba pre-equilibrada, y corría en NaCl 0,5 M, Tris-HCl pH 7.4 10 mM, y EDTA 1 mM. Se recolectaron 100 \mul de muestras, y se monitorizaron por el conteo de Cherenkoff para las fracciones que contuvieran cADN, las cuales estaban excluidas de la columna, y se enjuagaron del volumen de la columna vacía, aproximadamente 3,1 ml. El cADN se cuantificó basándose en las actividades específicas obtenidas a partir de la precipitación TCA, y estimándose una eficiencia en la medida del conteo de Cherenkoff, del 21%. Se estimó que la producción de cADN en el pico 8 de las fracciones, fue de unos 268 ng. Cada una de las fracciones de 100 \mul fue precipitada con etanol con 10 \mug de glicógeno, y dos volúmenes de etanol 100%. Los pellets se resuspendieron en 10 \mul de agua, y se extrajeron con tampón fenol:CHCl_{3} (1:1), siendo extraído el fenol cloroformo con 5 \mul de agua, y extraído dos veces con CHCl_{3}, añadido 1,5 \mul de acetato sódico 3 M y siendo añadido 16,5 \mul de isopropanol a 22ºC. Se recogió el pellet por centrigugación, se lavó y secó y resuspendió en 5 \mul de agua. Se le realizó la electroforesis al ADN, dentro de células TOP10 de E. coli (Invitrogen), y se seleccionaron los clones por crecimiento en medio líquido con ampicilina. El ADN extraído de archivos amplificados, representando 2 x 10^{5} recombinantes, fue Not I digerido, y separado por tamaño mediante electroforesis en gel. El ADN lineal de 4,0 a 4,7 Kb, fue recubierto (con Celan Gene, Bio101) y reclonado en reservas de 5000 recombinantes. Las 5000 colonias fueron sembradas en placas de agar LB-Amp individuales, crecieron por la madrugada, se recogieron por raspado en medio LB, y 1/3 fue congelado a -70ºC como reserva de bacterias, y el resto se usó para preparar ADN con el sistema Promega Wizard Miniprep. El ADN se linearizó con Not I, y se usó para sintetizar ARN in vitro.

Ejemplo 4 Caracterización de pGluCl\alpha y de pGlucl\beta

Los oocitos de Xenopus laevis fueron preparados e inyectados usando métodos estándar previamente descritos y conocidos en el medio [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena J.P., Liu K.K., Paress, P.S., Shaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Las hembras adultas de Xenopus laevis fueron anestesiadas con metanosulfonato de tricaína 0,17%, y los ovarios fueron extraídos quirúrgicamente, y colocados en un plato que contenía (mM): NaCl 82,5, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 5 ajustado a pH 7.5 con NaOH (OR-2). Los lóbulos ováricos fueron abiertos, enjuagados varias veces, y suavemente sacudidos en OR-2 conteniendo colagenasa (Sigma, Tipo 1A) 0,2% durante 2-5 horas. Cuando se hubieron quitado aproximadamente el 50% de las capas foliculares, fueron seleccionados los oocitos de las etapas V y VI, y se los colocó en un medio que contenía (mM): NaCl 86, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 5, piruvato sódico 2,5, teofilina 0,5, gentamicina 0,1 ajustada a pH 7.5 con NaOH (ND-96) durante 24-48 horas antes de la inyección. Los oocitos se inyectaron con 50-70 nl de ARN poly A(+) (1 mg/ml) o 50 nl de GluCl\alpha (0,1-100 ng) y/o GluCl\beta (0,1-100 ng). Los oocitos control se inyectaron con 50 nl de agua. Se incubaron los oocitos durante 2-10 días en ND-96 antes de las grabaciones. Las incubaciones y la digestión de la colagenasa se llevaron a cabo a 18ºC.

Las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente, 2-10 días después de la inyección. A menos que se indique de otro modo, las grabaciones se realizaron en suero salino estándar de rana, que contiene (mM): NaCl 115, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 10 ajustado a pH 7.5 con NaOH. Los oocitos fueron sometidos a gradiente de voltaje, usando un amplificador estándar de dos microelectrodos (Dagan 8500 o TEV-200, Minneapolis, MN). Se llenaron las pipetas con KCl 3 M, y se pusieron las resistencias entre 0,5-3,0 M\Omega. Un tanque de grabación, de plexiglás (volumen de 200 \mul) era constantemente rellenada, a un ritmo de 10 ml/min. El tanque de grabación estaba conectado a tierra directamente con el electrodo Ag/AgCl, o a través de un puente de agar KCl 3 M, si el cloruro extracelular hubiera variado. Para bajas soluciones de cloruro, el NaCl fue reemplazado con concentraciones equimolares de ácido isetiónico sódico. Para bajas soluciones de sodio, el NaCl fue reemplazado con KCl o Cl colina, equimolares. Se consiguieron los datos, y se analizaron, usando PCLAMP con una interfaz TL-1 (Axon Instruments, Foster City, CA). Se grabó una corriente de membrana con un potencial sostenido de -80 mV. La amplitud de la corriente sensible a la droga, fue determinada substrayendo la corriente sostenida a -80 mV, del pico de corriente obtenido en presencia de la droga. Se filtraron los datos a 30 Hz, y se muestrearon a 16,6 Hz. La relación corriente/voltaje (I/V), y los potenciales inversos (E_{rev}), se determinaron usando gradiente de voltaje de 1-3 s. sobre el rango de voltaje de -110 a +80 mV. Para los gradientes, los datos se filtraron a 0,3-3 kHz y se muestrearon a 160 Hz. La corriente en solución libre de droga, se substrajo de la corriente en presencia de droga, para obtener las relaciones de corriente/voltaje sensibles a la
droga.

Los oocitos de Xenopus inyectados con ARN Poli (A)+ de C. elegans, exhibieron una corriente sensible rápidamente activable, reversible con el glutamato, e irreversible con la ivermectina 4-O-fosfato (IVMPO_{4}) (Fig.5 [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M., & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992); Arena et al., 1991 supra]. Para aislar un clon de cADN funcional para el canal sensible a glutamato y IVMPO_{4}, se construyó un archivo de cADN direccional, a partir de las fracciones 1,7-1,9 Kb, del ARN poli (A)^{+} de C. elegans, fraccionado por tamaño. Se observaron las corrientes sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, tras la inyección de ARN sintetizado in vitro a partir de la reserva de 5.000 cADNs. El subfraccionamiento de esta población de cADNs en reservas menores, indicaron que eran necesarias dos subunidades para recuperar las respuestas del glutamato y el IVMPO_{4}. Se identificó que, dos reservas de 500 cADNs, al ser añadidas juntas, recuperaban ambas respuestas. El clon cADN del pGluCl\alpha, fue aislado por co-inyección de ARN procedente de una reserva subfraccionada con ARN de una segunda reserva de 500 cADNs. El clon cADN del pGluCl\beta, se aisló por subfraccionamiento de la segunda reserva de 500 clones, y por co-inyección con ARN in vitro de pGluCl\alpha. Cuando se redujo la complejidad de las reservas subfraccionadas, a 25 cADNs, fue posible identificar respuestas en oocitos inyectados con una única reserva.

Se examinaron las propiedades electrofisiológicas en oocitos inyectados con ARN in vitro de pGluCl\alpha y pGluCl\beta (Fig. 5). Los oocitos con expresión simultánea de las proteínas pGluCl\alpha&\beta, exhibieron la corriente rápidamente activable sensible a glutamato de manera reversible, y al IVMPO_{4}de manera irreversible, también encontrada en oocitos inyectados con ARN Poli (A)^{+} (Fig. 5). El tiempo para la máxima activación de la corriente sensible al IVMPO_{4}fue de 42\pm2 segundos para lo GluCl \alpha&\beta, y de 36\pm3 segundos para los ARN Poli (A)^{+}. La desensibilización de la corriente sensible a glutamato, vista en oocitos inyectados con ARN Poli (A)^{+}, también se observó en oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta, a concentraciones de glutamato mayores de 1 mM. Las subunidades individuales, GluCl\alpha o GluCl\beta, expresaron canales funcionales homoméricos, que respondieron selectivamente al IVMPO_{4}o al glutamato, respectivamente (Fig. 5). El tiempo transcurrido para la activación de los canales homoméricos GluCl\alpha por el IVMPO_{4}, fue de 18 \pm 1 segundos, más rápido que el observado para GluCl \alpha&\beta o para ARN Poli (A)^{+} (p<0,001). Los canales GluCl\alpha fueron insensibles al glutamato a concentraciones tan altas como 10 mM, mientras que el umbral de activación por el glutamato, de los canales GluCl\beta homoméricos, fue de 50 \muM. Fue necesario inyectar 10 veces más ARN a las subunidades individuales para conseguir corrientes con amplitudes comparables a las de los oocitos co-inyectados, sugiriendo que la formación funcional de canales homoméricos, es menos eficaz.

El análisis de las curvas de las respuestas a las dosis de glutamato e IVMPO_{4}, indicaron que la coexpresión de GluCl \alpha&\beta dieron como resultado cambios en la afinidad a los ligandos, y en el coeficiente de Hill (Fig. 5). La co-inyección de GluCl\alpha con GluCl\beta, dio lugar a un cambio en el EC_{50} para el glutamato, de 380 a 1360 \muM. (Fig. 1b). Los coeficientes de Hill, de 1,9 para el GluCl\beta, y de 1,7 para el GluCl \alpha&\beta, sugieren que se necesita más de una molécula de glutamato para regular los canales. La EC_{50} para la activación de corriente por el IVMPO_{4}, fue similar en oocitos inyectados con GluCl\alpha y GluCl \alpha&\beta, con valores de 140 y 190 nM, respectivamente (Fig. 5). Sin embargo, el coeficiente de Hill varió del 1,5 para el GluCl\alpha, al 2,5 para el GluCl \alpha&\beta, sugiriendo un incremento en el número de moléculas de IVMPO_{4} necesarias para abrir el canal. Los cambios observados en el EC_{50} y en el coeficiente de Hill, no pueden deberse a la activación de los canales GluCl\alpha por el glutamato, o a la activación de los canales GluCl\beta por el IVMPO_{4}, puesto que esos canales homoméricos no responden a esos ligandos (Fig. 5).

Las propiedades de permeabilidad, y las relaciones de voltajes de corriente en oocitos que expresan canales GluCl \alpha&\beta, fueron similares a los observados en oocitos con ARN poly (A)^{+} inyectado (Fig. 6) [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain. Res.15, 339-348 (1992)]. Los canales GluCl \alpha&\beta fueron selectivos para el cloruro, como se demostró con el cambio del potencial inverso (E_{rev}) para la corriente sensible al glutamato o al IVMPO_{4}, tras la sustitución del NaCl externo, con isotionato sódico (Fig. 6). Los canales GluCl \alpha&\beta fueron impermeables a los cationes monovalentes, puesto que al reemplazar el NaCl externo con KCl o colina-Cl, no hubo cambio en el E_{rev} (Fig. 6). Los estudios de la permeabilidad para los canales homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta, también revelaron selectividad para los aniones, antes que para los cationes (Fig. 6). Tanto en los canales GluCl\alpha como en los GluCl\beta, la sustitución de NaCl con isotionato sódico, generaron cambio del E_{rev} a voltajes positivos, mientras que la sustitución con KCl o con colina-Cl, no tuvo efecto en el E_{rev} (Fig. 6). El E_{rev} de los canales GluCl\alpha en el isotionato sódico, indicó que había permeabilidad al anión isotionato, mas grande, con un radio respecto al cloruro de 0,2 [Goldman, D.E. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943); Hodgkin, A.L. & Katz B. J. Physiol. (Lond.) 108, 37-77 (1949)].

La relación de tensión corriente (I/V) en oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta, mostró una dependencia externamente rectificante del voltaje (Fig. 6). La I/V para las corrientes sensibles al glutamato o al IVMPO_{4}, mostraron una dependencia similar del voltaje, tal como confirmaron los ajustes de los datos a la ecuación de campo constante (Fig. 6) [Goldman, D.E. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943)], [Hodgkinm A.L. & Katz B. J. Physiol. (Lond.) 108, 37-77 (1949)]. Las curvas I/V para los canales GluCl\alpha o GluCl\beta homoméricos, se desviaron mucho de las curvas I/V para GluCl \alpha&\beta, y no se ajustaron bien a los supuestos del campo constante (Fig. 6). La corriente sensible al glutamato de los canales GluCl\beta, exhibió una pronunciada dependencia del voltaje externamente rectificante con pequeñas corrientes en voltajes negativos (Fig. 6). La corriente sensible al IVMPO_{4}de los canales GluCl\alpha, mostró esencialmente una dependencia lineal del voltaje (Fig. 6).

El IVMPO_{4} tuvo un efecto dual en los oocitos inyectados con ARN Poli (A)^{+} de C. elegans [Arena, J.P., Lui, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain. Res.15, 339-348 (1992)]. Además de la activación directa de la corriente (Fig. 5), la corriente sensible al glutamato es potenciada por bajas concentraciones de IVMPO_{4} (Fig. 7) [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain. Res. 15, 339-348 (1992)]. Así mismo, el IVMPO_{4} (5 nM) potenció 490\pm45% a la corriente sensible al glutamato, en oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta (Fig. 7). La co-aplicación del IVMPO_{4} y el glutamato, movió el EC_{50}para el glutamato, de 1360 a 360 \muM, y redujo el coeficiente de Hill, de 1,7 a 1,3. Las respuesta de la canales GluCl\beta homoméricos al glutamato, no fueron potenciados por el IVMPO_{4} (Fig. 7). En contraste, siguiendo a altas concentraciones de IVMPO_{4} (1 \muM), la corriente sensible al glutamato se redujo 88\pm4% en oocitos inyectados con GluCl\beta (Fig. 7). En oocitos que expresaban canales GluCl\alpha, los cuales no respondían al glutamato (Fig. 5), la activación primaria de la corriente por el IVMPO_{4}, dio lugar a un incremento de la corriente con glutamato, de 20\pm4% (Fig. 7). La corriente sensible al glutamato en oocitos inyectados con canales GluCl\alpha, fue observada solamente siguiendo a la activación de corriente con el IVMPO_{4}, y pudo ser observada con concentraciones de glutamato tan bajas como 10 \muM.

El perfil farmacológico de los oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta, fue distinto de todos los otros canales cloruro regulados por ligando clonados, y de los canales catión regulados por glutamato (Tabla 1). Se probaron muchos canales ion regulados por ligando, tanto agonistas como antagonistas, en oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta (Tabla 1). Todos los compuestos estaban inactivos, excepto por el ibotenato, un análogo estructural del glutamato, del cual se sabe que activa a los canales cloruro sensibles al glutamato [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain. Res. 15, 339-348 (1992); Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351-363 (1973)]. Las corrientes sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, fueron bloqueadas con picrotoxina y ácido flufenámico, con una dependencia de la concentración similar a la reportada para el ARN Poli (A)^{+} de C. elegans [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain. Res.15, 339-348 (1992)].

Muchas líneas de evidencia indicaron que la co-expresión de GluCl \alpha&\beta, lleva a la formación de canales heteróméricos. La primera indicación de asociación de subunidades, fue durante el procedimiento de clonación, donde se requirieron dos reservas de cADNs para obtener respuestas. En segundo lugar, es necesario inyectar 10 veces más ARN de las subunidades individuales, para alcanzar el nivel de expresión obtenido con los oocitos co-inyectados. Además, se observaron los siguientes cambios en las respuestas específicas para ligandos, en los oocitos que coexpresaron GluCl \alpha&\beta: el curso del tiempo de la activación de corriente por el IVMPO_{4}; la afinidad por el glutamato y el coeficiente de Hill de la activación de corriente por el IVMPO_{4}; diferencias en la rectificación de la relación I/V; la permeabilidad al isetionato; y la potenciación por el IVMPO_{4},de la respuesta al glutamato. La indéntica dependencia del voltaje en las curvas I/V sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, en oocitos co-inyectados, sugiere fuertemente que la mayoría de los canales formados son heteroméricos. Si un número significativo de canales homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta estuviesen presentes en los oocitos co-inyectados, entonces la curva I/V sensible al glutamato sería más externamente rectificante que la I/V para la corriente sensible al IVMPO_{4}. Estos resultados sugieren que las propiedades observadas en oocitos co-inyectados, representan las propiedades de los canales heteroméricos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Los oocitos fueron inyectados simultáneamente con RNA de GluCl\alpha y de GluCl\beta (25 pg cada uno). n = al menos cuatro para cada grupo.

a- Los datos son expresados como % de la respuesta obtenida con glutamato 10 mM. b- NR = no respuesta. c- N-metil-D-aspartato. d- ácido a-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol propiónico. e- El bloqueo se consideró 0 si la respuesta en presencia del bloqueador era \pm 3% del control. f- (-)-Bicuculina metocloruro. g- -6-ciano-7-nitroquino-xalino-2,3-diona.

Ejemplo 5 Binding assay del glutamato y la ivermectina sobre oocitos inyectados con ARN de GluCl

Los oocitos inyectados con ARN in vitro de GluCl\alpha y GluCl\beta, fueron usados en binding assays para la ivermectina-^{3}H y el glutamato-^{3}H. Se inyectó ARN de GluCl\alpha (1 ng) y de GluCl\beta (1 ng) en oocitos individualmente, o se co-inyectó (0,5 ng de cada uno), y 2 días después, se rompieron los oocitos con un homogeinizador dounce, y las proteínas de la yema del huevo fueron extraídas usando métodos estándar conocidos en la materia. Se realizaron binding assays de equilibrio de lingandos, usando procedimientos convencionales. Los oocitos que expresaban tanto GluCl \alpha&\beta como GluCl\alpha, se unieron a la ivermectina-^{3}H con una alta afinidad, aproximadamente 0,2 nM. Se observaron uniones específicas con el glutamato-^{3}H en preparaciones de membrana, a partir de oocitos inyectados con GluCl\alpha. Los oocitos que expresan GluCl \alpha&\beta, son usados para medir la afinidad de la unión de otros compuestos, y su capacidad para desplazar la unión a la ivermectina-^{3}H y al glutamato-^{3}H.

Ejemplo 6 Estructura primaria de los canales GluCl\alpha y GluCl\beta

Las secuencias de nucelótidos de pGluCl\alpha y de pGluCl\beta, revelaron grandes y únicos marcos abiertos de lectura, de entre 1383 y 1302 pares de bases. Los cDNAs tienen extensiones 5' y 3' sin traducir, de entre 50 y 90 nucleótidos para el pGluCl\alpha, y de entre 13 y 144 nucleótidos para el pGluCl\beta, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las pGluCl\alpha y pGluCl\beta, en las regiones de los marcos abiertos de lectura, compartieron aproximadamente el 50% de la identidad. Las primeras metioninas dentro del marco, fueron designadas como los codones de iniciación para los marcos abiertos de lectura, que predecían una proteína GluCl\alpha con una masa molecular (M_{r}) estimada de aproximadamente 52.550, y una proteína de GluCl\beta con una M_{r} de aproximadamente 49.900. Ambas proteínas contenían residuos amino terminales, hidrofóbicos, con secuencias altamente predictivas de los sitios con señales de escisión que darían lugar a proteínas maduras, iniciando en el aminoácido 21 en GluCl\alpha, y en el 23 en GluCl\beta. La comparación de las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta, mostraron un 45% de identidad de aminoácidos, y un 63% de similaridad.

Las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta predichas, fueron alineadas con nucleótidos y bases de datos de proteínas, y se encontró que estaban relacionadas con los receptores de glicina y de GABA_{a}. Aproximadamente el 21% de los aminoácidos en GluCl\alpha y GluCl\beta, estaban altamente conservados, mostrando al menos un 75% de identidad de aminoácidos, con la familia de los canales de cloruro regulados por ligandos. Los motivos conservados encontrados en esta familia de canales, tales como un gran dominio extracelular NH_{2}-terminal, y los cuatro dominios hidrofóbicos transmembrana, del M1 al M4, también fueron encontrados en las secuencias de GluCl\alpha y de GluCl\beta. Las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta contenían los residuos de cisteína conservados, encontrados en el dominio extracelular de todos los canales de cloruro regulados por ligandos (aminoácidos 191 y 205 en GluCl\alpha, y 161 y 175 en GluCl\beta). Había también dos residuos adicionales de cisteína, que también se encuentran en canales cloruro regulados por glicina (aminoácidos 252 y 263 en GluCl\alpha, y aminoácidos 223 y 234 en GluCl\beta). La proteína GluCl\alpha contenía una fuerte secuencia de consenso para el sitio de fosforilación por la proteín-kinasa C, localizado entre los dominios putativos atravesantes de la membrana, M3 y M4. En subunidades del receptor de GABA_{a}, se localizan similares sitios de fosforilación, en el dominio intracelular entre M3 y M4, y se cree que juegan un rol importante en la regulación de los canales [Leidenheimer, N.J., McQuilkin, S.J., Hahner, L.D., Whiting, P. & Harris, R.A. Mol. Pharm. 41, 1116-1123 (1992)], [Kellenberger, S., Malherbe, P. & Sigel, E. J. Biol. Chem. 267, 24660-25663 (1992)]. Al igual que lo encontrado en las secuencias de los receptores de glicina y GABA_{a}, las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta contenían en los dominios extracelulares propuestos, sitios putativos de glicosilación unida a N. Los análisis de alineación con la acetilcolina y las subunidades del canal catión glutamato, mostraron que GluCl\alpha y GluCl\beta compartían aproximadamente 10% y <5% de similaridad, respectivamente.

Se realizó un análisis filogenético con las secuencias enteras de las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta, las subunidades de los receptores de glicina y GABA_{a}, y secuencias de proteínas de invertebrados relacionadas. Se mostró una discreta división evolutiva en esta familia de proteínas, debido a una divergencia en dos ramas mayores, que acabaría en la división de las subunidades \alpha y \gamma del GABA_{a}, respecto a las restantes proteínas. Dentro de esas grandes ramas, hay sub-ramas que agrupan a las proteínas en las respectivas subclases, tales como GABA_{a} \alpha, \beta, \gamma, delta (d), rho ®, y glicina \alpha y \beta. Las secuencias de Drosophila melanogaster (Dros) y de Lymnae stagnalis (Lym), representan las secuencias de proteínas de invertebrados disponibles que son similares a los canales anión de apertura regulada por ligandos. Las secuencias de las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans están libremente agrupadas en la misma rama que la glicina \alpha y \beta, y que las proteínas Lym zeta (\zeta) y Dros rdl, sugiriendo que esas proteínas fueron originadas por un ancestro común. Las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta están más relacionadas con las glicinas que con las proteínas, tal como indica la menor longitud de sus miembros de unión. Este análisis sugiere que las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta forman una sub-rama independiente, separada de las otras proteínas. Se obtuvieron similares árboles filogenéticos, usando un programa de parsimonia máxima, o cuando se analizaron por separado los dominios extracelulares (y los que atraviesan la membrana) de GluCl\alpha y GluCl\beta.

Aunque las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta están filogenéticamente relacionadas con la glicina \alpha y \beta, y con las proteínas Lym zeta (\zeta) y Dros rdl, son farmacológicamente distintas. Los estudios de expresión en oocitos de Xenopus muestran que los canales de cloruro homoméricos funcionales están formados por las proteínas glicina \alpha, que son sensibles a la glicina [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. & Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)], y por las proteínas Dros rdl que son sensibles al GABA [Ffrench-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. & Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)]. Los canales de glicina b homomérica se forman con poca eficiencia [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963-970 (1990)], y las proteínas Lym \zeta no forman canales homoméricos funcionales [Hutton, M.L., Harvey, R.J., Earley, F.G.P., Barnard, E.A. & Darlinson, M.G. FEBS letters 326, 112-116 (1993)]. Puesto que los canales homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta son insensibles al GABA, glicina y canales agonistas y antagonistas relacionados (ver Tabla 1), esos canales parecen haber desarrollado ligandos distintos de manera selectiva, separados de sus canales relacionados filogenéticamente.

El análisis de hibridación fue realizado con ARN poli (A)+ y ADN genómico de C. elengans, usando los cADNs de GluCl\alpha y GluCl\beta como sondas. La hibridación de elevado rigor de las sondas de cADN con ADN genómico digerido con restricción, mostró que los cADNs de GluCl solo hibridan a un único fragmento de la copia del ADN. La hibridación de elevado rigor del ARN de C. elegans, mostró que el GluCl\alpha hibridizó a ARN de 2,4 y 1,7 Kb, y el GluCl\beta hibridizó a ARN de 1,7 Kb. Las sondas usadas para este estudio representan solo las regiones de los cADNs de GluCl\alpha y GluCl\beta que codifican los grandes marcos únicos de lectura abierta. Las sondas GluCl\alpha y GluCl\beta fueron hibridadas con YAC de C. elegans y con archivos de cósmidos. Esta hibridación mostró que el gen de GluCl\alpha está localizado en el cromosoma V, en el YAC # Y42B4 y en el cósmido # C25D4. El gen de GluCl\beta está localizado en el cormosoma I, YAC # Y24C9 y cósmido # C04E4. La clasificación de los YAC y cósmido, está sacada de John Sulston, MRC labs, Cambridge, England.

Ejemplo 7 Clonación de cADN de GluCl en vectores de expresión de E. coli

El GluCl recombinante es producido en E. coli, tras la transferencia del cassette de expresión del GluCl dentro de los vectores de expresión E. coli, incluyendo (aunque no quedando limitado a) la series pET (Novagen). Los vectores pET ponen la expresión de GluCl bajo el control del estrechamente regulado promotor bacteriófago T7. A continuación de la transferencia de esta construcción dentro del hospedador E. coli, el cual contiene una copia cromosomial del gen de la polimerasa ARN T7 conducido por el promotor inducible lac, la expresión de GluCl es inducida cuando un substrato lac adecuado (IPTG) es añadido al cultivo. Los niveles de GluCl expresados son determinados mediante los análisis indicados anteriormente.

El cADN que codifica todo el marco de lectura abierta para el GluCl\alpha y \beta, se inserta dentro del sitio NdeI del pET [16]11a. Las construcciones en la orientación positiva, son identificadas por análisis de secuencia, y se usan para transformar la cepa hospedadora de expresión BL21. Los transformantes son entonces usados para inocular cultivos para la producción de proteína GluCl. Los cultivos pueden realizarse en medios M9 o ZB, cuya formulación es conocida para los entendidos de la materia. Tras el crecimiento a OD_{600}=1,5, se induce la expresión de GluCl con IPTG 1 mM durante 3 horas, a 37ºC.

Ejemplo 8 Clonación de cADN de GluCl en vector de expresión de mamíferos

Los cADNs de GluCl fueron clonados en vectores de expresión de mamíferos, pMAMneo y pcDNA3. Los plásmidos Bluescript de GluCl\alpha y GluCl\beta fueron digeridos con Not I, y tratados con enzima Klenow, para crear un final romo de clonación. Los insertos fueron extraídos con digestión Sal I, y purificados mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector pMAMneo fue tratado con XhoI, enzima Klenow, y entonces Sal I, y con fosfatasa intestinal de ternera (PIT). El vector lineal fue purificado en gel de agarosa, y usado para ligarse a los insertos de cADN de GluCl. Se aislaron los recombinantes, designados GluCl\alpha-pMAMneo y GluCl\beta-pMAMneo, y se usaron para transfectar células de mamífero (células L) mediante precipitación CaPO_{4}-ADN. Las células fueron transfectadas con GluCl\alpha-pMAMneo, GluCl\beta-pMAMneo, o tanto GluCl\alpha-pMAMneo como GluCl\beta-pMAMneo. Se seleccionaron clones celulares estables mediante crecimiento en presencia de G418. Los únicos clones resistentes a G418 fueron aislados, y resultaron contener el gen GluCl\alpha o el gen GluCl\beta intactos, o incluso los dos genes, GluCl\alpha y GluCl\beta, intactos. Los clones que contenían los cADNs de GluCl son analizados para la expresión, usando técnicas inmunológicas, tales como inmunoprecipitación, un "Western", e inmunofluorescencia, usando anticuerpos específicos para las proteínas GluCl. El anticuerpo se obtiene de conejos inoculados con péptidos que son sintetizados a partir de la secuencia de aminoácidos predicha por las secuencias de GluCl. La expresión se analiza también mediante técnicas de potencial-parcheado electro fisiológico, y por binding assay con ivermectina-^{3}H y glutamato-^{3}H.

Los genes GluCl\alpha o GluCl\beta fueron insertados en pdDNA3. Los GluCl\alpha -Bluescript SKII+ y GluCl\beta - Bluescript SKII+ fueron digeridos con XhoI y NotI, y los insertos de cADN se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector, pcDNA3, se digirió con XhoI y NotI, se trató con PIT, y los vectores lineales se aislaron mediante electroforesis en gel, y se ligaron con los insertos de cADN. Los plásmidos recombinantes GluCl\alpha-pcDNA3 y GluCl\beta-pcDNA3 son usados para transformas las células de mamífero COS o CHO.

Las células que expresan GluCl\alpha o GluCl\beta, y GluCl\alpha & \beta, estable o transitoriamente, serán usadas para hacer pruebas para la expresión de canales cloruro sensibles al glutamato y a la avermectina, y para la actividad de unión de ligandos. Esas células se usan para identificar y examinar otros compuestos por su capacidad para modular, inhibir o activar a los canales de cloruro sensibles al glutamato y la avermectina, y para competir por con la unión de glutamato e ivermectina radioactivos.

Los cassettes que contienen el cADN de GluCl con orientación positiva con respecto al promotor, están ligados en los sitios apropiados de restricción 3' del promotor, y son identificados por mapeo y/o secuenciado del sitio de restricción. Esos vectores de expresión de cADN, son introducidos en células hospedadoras fiboblásticas, como por ejemplo COS-7 (ATCC# CRL1651), y CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC# CRL6362)], mediante métodos estandar que incluyen (aunque no están limitados a) la electroporación, o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrano, fosfato cálcico). Las células transfectadas y los sobrenadantes del cultivo celular, pueden ser cosechados y analizados para ver la expresión de GluCl, tal como se ha descrito aquí.

Todos los vectores usados para la expresión temporal en mamíferos, pueden ser usados para establecer líneas celulares expresantes de GluCl, de manera estable. Se espera que las construcciones de cADN de GluCl, inalteradas, y clonadas en vectores de expresión, programen a las células hospedadoras para producir proteína GluCl. Además, la GluCl es expresada extracelularmente como una proteína secretada al ligar construcciones de cADN de GluCl, al ADN codificante de la secuencia señal de la proteína secretada. Las células hospedadoras de transfección incluyen (aunque no están limitadas a) CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wigler, et al., Cell 11: 223 (1977)], NS/0, y dHFr-CHO [Kaufman and Sharp, J. Mol. Bil. 159: 601, (1982)].

La co-transfección de cualquier vector que contenga cADN de GluCl, con un plásmido de selección de droga, incluyendo (aunque no quedando limitados a) G418, fosfotransferasa aminoglicósido; higromicina, higromicin-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforibosil-transferasa; permitirá la selección de clones transfectados establemente. Los niveles de GluCl son cuantificados mediante los análisis descritos aquí mismo.

Las construcciones de cADN de GluCl también son ligadas a vectores que contienen marcadores amplificables de resistencia a drogas, para la producción de clones celulares de mamíferos que sinteticen los niveles más altos posibles de GluCl. A partir de la introducción de esas construcciones dentro de las células, se seleccionan los clones que contengan el plásmido, mediante el agente apropiado, y se realiza el aislamiento de un clon sobre-expresante con un elevado número de copias de plásmidos, mediante selección en crecientes dosis del agente.

La expresión de GluCl recombinante se alcanza mediante transfección de cADN de GluCl en toda su longitud, dentro de una célula de mamífero hospedadora.

Ejemplo 9 Clonación de cADN de GluCl en vector de expresión de Bacilovirus para la expresión en células de insectos

Los vectores bacilovirus, los cuales están derivados del genoma del virus AcNPV, son diseñados para para proporcionar un alto nivel de expresión de cADN en la línea Sf9 de células de insectos (ATCC CRL# 1711). El cADN expresante de GluCl, de bacilovirus recombinantes, es producido por los siguientes métodos estandar (en el Manual de Vitrogeno Maxbac): las construcciones están ligadas al gen polihedrin en distintos bacilovirus vectores de transferencia, incluyendo el pAC360 y el vector BlueBac (en Vitrogeno). Los bacilovirus recombinantes son generados por recombinación homóloga, siguiendo a la co-transfección del bacilovirus vector de transferencia, con el ADN genómico linearizado AcNPV [Kitts, P.A., Nuc, Acid. Res. 18: 5667 (1990)], dentro de células Sf9. Los virus recombinantes pAC360 son identificados por la ausencia de cuerpos de inclusión en células infectadas, y los virus recombinantes pBlueBac son identificados en la base de la expresión de \beta-galactosidasa (Summers, M.D. and Smith, G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Siguiendo a la purificación de placa, la expresión del GluCl es medida mediante los análisis descritos aquí.

El cADN codificante del marco entero de lectura abierta para las subunidades de GluCl, es insertado en el sitio BamHI del BlueBacII. Las construcciones con orientación positiva, son identificadas mediante análisis de secuencia, y se usan para transfectar células Sf9 en presencia del ADN AcNPV de tipo suave.

El auténtico GluCl activo se encuentra en el citoplasma de las células infectadas. El GluCl se extrae de las células infectadas mediante lisis hipotónica, o lisis con detergente.

Ejemplo 10 Clonación de cADN de GluCl en vector de expresión de levadura

El GluCl recombinante es producido en la levadura S. cerevisiae tras la inserción del cistrón cADN de GluCl óptimo, dentro de vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intra o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de la expresión intracelular, los vectores como el EmBLyex4, o similares, son ligados al cistrón GluCl [Rinas, U. et al., Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz, B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989)]. Para la expresión extracelular, el cistrón GluCl se liga dentro de vectores de expresión de levadura, los cuales fusionan una señal de secreción (un péptido de mamífero o de levadura) al término NH_{2} de la proteína de GluCl [Jacobson, M.A., Gene 85: 511-516 (1989); Riett, L. and Bellon, N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989)].

Esos vectores incluyen (aunque no quedan limitados a) el pAVE1>6, el cual fusiona la señal del suero humano de albúmina, al cADN expresado [Steep, O. Biotechnology 8: 42-46 (1990)]; y el vector pL8PL, el cual fusiona la señal de lisozima humana, al cADN expresado [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728-2732)]. Además, el GluCl es expresado en la levadura como una proteína de fusión, conjugada a la ubiquitina, usando el vector pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705-709 (1989), McDonell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los niveles de GluCl expresado, son determinados mediante los análisis descritos aquí.

Ejemplo 11 Purificación de GluCl recombinante

El GluCl producido mediante recombinación, puede ser purificado por cromatografía de afinidad por anticuerpos.

Las columnas de afinidad a anticuerpos de GluCl son hechas añadiendo los anticuerpos anti-GluCl al Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que es preactivado con ésteres N-hidroxisuccinimida, de tal modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de gel de agarosa. Los anticuerpos se unen entonces al gel a través de la unión de la amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados que quedan, son completados entonces con HCl-etanolamina (pH 8) 1 M. Se lava la columna con agua, seguida de HCl-glicina (pH 2,6) 0,23 M, para remover cualquier anticuerpo no-conjugado, o proteína extraña. A continuación se equilibra la columna con tampón fosfato salino (pH 7,3), junto con agentes solubilizantes de membrana apropiados, tales como detergentes, y entonces se pasan a través de la columna los sobrenadantes del cultivo celular, o los extractos celulares que contengan subunidades de GluCl, o GluCl solubilizada. La columna es lavada entonces con tampón fosfato salino, junto con detergentes, hasta que la densidad óptica (A280) caiga al nivel del trasfondo, y entonces la proteína es enjuagada con HCl-glicina (pH 2,6) 0,23 M, junto con detergentes. La proteína GluCl purificada se dializa entonces contra tampón fosfato salino.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

ASPIRANTES: Cully, Doris F.

\hskip3.7cm

Arena, Joseph P.

\hskip3.7cm

Liu, Ken K.

\hskip3.7cm

Vassilatis, Demetrios

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN CODIFICANTE DE LOS CANALES CLORURO DE APERTURA REGULADA POR GLUTAMATO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

DIRECCIONES DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Wallen, John W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 126 E. Lincoln Ave., P.O. Box 2000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rahway

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: New Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: E.E.U.U.

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(F)

ZIP: 07065

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMAS DE LECTURA POR EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

MEDIO TIPO: disquette

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/249.112

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE LA CUMPLIMENTACIÓN: 25 de mayo de 1994

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Wallen, John W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.403

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CEDULA: 19194

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (908) 594-3905

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (908) 594-4720

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1542 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FILAMENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1479 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FILAMENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 510 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FILAMENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 487 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FILAMENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FILAMENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GCGCGCCGCTT TTTTTTTTTT TTTTTT

\hfill

46

Claims (16)

1. Una proteína de canal cloruro regulado por glutamato (GluCl) de C. elegans, substancialmente libre de otras proteínas, que comprende ambas secuencias de aminoácidos dispuestas en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

2. Un vector de expresión para expresar proteína del canal GluCl de C. elegans, en una célula hospedadora recombinante, en la cual el vector de expresión mencionado comprende el ADN codificante de la secuencia de aminoácidos dispuesta en SEQ ID NO: 3.

3. Un vector de expresión para expresar proteína del canal GluCl de C. elegans, en una célula hospedadora recombinante, en la cual el vector de expresión mencionado comprende el ADN codificante de la secuencia de aminoácidos dispuesta en SEQ ID NO: 4.

4. El vector de expresión de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de nucleótidos dispuesta en SEQ ID NO: 1.

5. El vector de expresión de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos dispuesta en SEQ ID NO: 2.

6. Una molécula de ADN purificada que codifica un proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 3.

7. Una molécula de ADN purificada que codifica un proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 4.

8. La molécula de ADN purificada de la reivindicación 6 la cual está constituida por la secuencia de nucleótidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 1.

9. La molécula de ADN purificada de la reivindicación 7 la cual está constituida por la secuencia de nucleótidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 2.

10. Una célula hospedadora que expresa una proteína del canal GluCl recombinante de C. elegans, donde dicha célula contiene un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 o con la 4, y un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o con la 5.

11. Un proceso para expresar proteína del canal GluCl de C. elegans en una célula recombinante hospedadora, que comprende:

(a) la transfección, en una célula hospedadora apropiada, de un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 o con la 4, y un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o con la 5; y

(b) el cultivo de la célula hospedadora del paso (a) bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína del canal GluCl de C. elegans mencionada, a partir del mencionado vector de expresión.

12. Un método de identificación de compuestos que modulan la actividad de la proteína de unión al glutamato y/o la avermectina, que comprende:

(a) proveer, por medio de vectores de expresión recombinantes, de una proteína GluCl de C. elegans, donde dicha proteína comprende ambas secuencias de aminoácidos dispuestas en SEQ ID NO: 3 y en SEQ ID NO: 4; y

(b) combinar un modulador putativo de dicha actividad, con dicha proteína, y medir el efecto del modulador putativo sobre dicha proteína.

13. Un método de identificación de compuestos que modulan la actividad del canal anión de apertura regulada por el glutamato, que comprende:

(a) proveer una célula expresante de proteína GluCl de C. elegans, por medio de vectores de expresión recombinantes, o por medio de ARN sintético, donde la mencionada proteína comprende ambas secuencias de aminoácidos dispuestas en SEQ ID NO: 3 y en SEQ ID NO: 4; y

(b) combinar un modulador putativo de la actividad de dicho canal, con la mencionada célula, y medir el efecto del modulador putativo sobre el canal.

14. El método de la reivindicación 12, o de la 13, en el que el efecto medido es de inhibición o aumento de la unión de los ligandos a canales anión de apertura regulada por glutamato.

\newpage

15. El método de la reivindicación 12, o de la 13, en el que el efecto medido es de estimulación o inhibición del flujo de aniones mediada por los canales anión de apertura regulada por glutamato.

16. El método de la reivindicación 15 en el que el flujo de aniones es un flujo de cloruro en membrana.