JP2006508652A - 鱗翅目の電位依存性カルシウムチャネル - Google Patents

Abstract

【課題】鱗翅目のカルシウムチャネルサブユニットをコード化する新しい核酸配列、ならびに、組換え型体の発現および同様のものからなる宿主細胞を提供する。
【解決手段】単離した鱗翅目のカルシウムチャネルサブユニット、鱗翅目のカルシウムチャネルサブユニットを発現している宿主細胞、鱗翅目のカルシウムチャネルサブユニットの作製し、鱗翅目のカルシウムチャネルサブユニットに特異的な抗体を作製し、モジュレーター識別法および／または鱗翅目のカルシウムチャネルのインヒビターをも作製する。

Description

本発明は、農芸化学、獣医学または薬学の分野で有用な核酸配列に関する。本発明は特に、ポリペプチドと、農薬または医薬品として有効な化合物の識別または開発で有用となるポリペプチドをコード化する核酸配列に関する。

電位依存性カルシウムチャネルは、生理学的応答の調節で重要な役割を果たしている。すなわち、電位依存性カルシウムチャネルの脱分極により、チャネル孔を通じてのカルシウムの通過が生じ、これによって、筋収縮および神経伝達物質の分泌などのさまざまな生理学的応答が生じると考えられている（非特許文献１）；（非特許文献２）；（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）；および（非特許文献７）。同様に、殺虫剤などの生物学的に活性な化合物を識別するための手段としてこのチャネルを標的とするための方法を開発しようとの要求が存在する（非特許文献８）；（非特許文献９）；（非特許文献１０）；（非特許文献１１）。

Ｊｅｚｉｏｒｓｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏ．，２０３、８４１−８５６ページ（２０００） Ｅｄｗｉｎ Ｗ．ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４，３０４−３１２ページ（１９９４） Ｈｅｒｍａｎ Ｍｏｒｅｎｏ Ｄａｖｉｌａ，Ａｎａｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０２−１１７ページ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｗ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，３０巻、４号、２９９−３１２ページ（１９９８） Ｈｏｆｍａｎｎら、Ａｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７、３９９−４１８ページ（１９９４） Ｅｄｗａｒｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ａｎｄ Ｔｏｎｉ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４８巻、１１１１−１１２４ページ（１９９５） ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，第２８回Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（２００２年６月） Ｍｉｎｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５巻、８２７−８２９ページ（１９９２） Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻、６号、５０５−５１２ページ（２０００） Ｗａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６４，４８８−４９４ページ（１９９９） Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、７号、５５９−５６６ページ（１９９７）

電位依存性カルシウムチャネルは、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、シビレエイ（Ｄｉｓｃｏｐｙｇｅ Ｏｍｍａｔａ）などの脊椎動物で発現し、これらの動物からクローン化されている（非特許文献１２）；（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５）；（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；（非特許文献１９）；（非特許文献２０）。電位依存性カルシウムチャネルは、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｓｔｙｌｌｐｈｏｒａ ｐｉｓｔｉｌｌａ、Ｂｄｅｌｌｏｕｒｅａ ｃａｎｄｉｄａ、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、ヤリイカ（Ｌｏｌｉｇｏ ｂｌｅｅｋｅｒ）、ゾウアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）およびマボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ ｒｏｒｅｔｚ）などの無脊椎動物でも発現し、これらの動物からクローン化されている（非特許文献２１）。

Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２９４巻、２０−４７ページ（１９９９） Ｈｅｒｍａｎ Ｍｏｒｅｎｏ Ｄａｖｉｌａ、Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０２−１１７ページ Ｈｏｆｍａｎｎら、Ａｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１７，３９９−４１８ページ（１９９４） Ｅｄｗａｒｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ａｎｄ Ｔｏｎｉ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４８巻、１１１１−１１２４ページ（１９９５） Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，第２８回Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（２００２年６月） Ｈｏｒｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０巻，３７８７−３７９１ページ（１９９３） Ｒｏｕｓｓｅｔら、Ｊ．ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５３２，３，５８３−５９３ページ（２００１） Ｎｅｅｌａｎｄｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２９３３−２９４４ページ（２０００） Ｂｒｕｓｔら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３２巻、１１号、１０８９−１１０２ページ（１９９３） Ｊｅｚｉｏｒｓｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏ．，２０３，８４１−８５６ページ（２０００））

本発明は、農芸化学、獣医学または薬学の分野で有用な核酸配列に関する。本発明は特に、ポリペプチドと、農薬または医薬品として有効な化合物の識別または開発で有用となるポリペプチドをコード化する核酸配列に関する。

本発明の一実施形態は、農薬または医薬品としての（潜在的な）活性を有する化合物の識別または開発で有用なアミノ酸配列をコード化する核酸配列、または、これらのアミノ酸配列の発現に利用することの可能な核酸配列に関連するものである。以下に詳述するこれらの核酸配列は、その突然変異体およびフラグメントを含めて、ここでは「本発明の核酸配列」とも呼ぶ。

本発明の別の実施形態は、本発明の核酸配列によってコード化されたり、本発明の核酸配列の適切な発現によって得られる可能性のある、蛋白質またはポリペプチドなどのアミノ酸配列に関連するものである。以下に詳述するこれらのアミノ酸配列は、その突然変異体およびフラグメントを含めて、ここでは「本発明のアミノ酸配列」とも呼ぶ。

本発明のさらに別の実施形態は、例えば本発明のアミノ酸配列の発現についてなど、宿主細胞または宿主生物のトランスフォーメーションにおいて、好ましくは後述のような適切な遺伝子構成の形態での、本発明の核酸配列の利用に関連するものである。本発明はさらに、本発明の核酸配列でトランスフォームしたり、本発明のアミノ酸配列を発現することのできる宿主細胞または宿主生物とも関連する。

さらにまた別の実施形態では本発明は、上述の核酸配列、アミノ酸配列、遺伝子構成、宿主細胞または宿主生物を使用しての、本発明のアミノ酸配列の生物学的活性を変調または阻害することが可能な化合物の識別または開発のための方法に関連するものである。通常は測定またはスクリーニングで利用されることになるこうした方法については、以下に詳述する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで（も）、本発明のアミノ酸配列（の生物学的活性）を変調する化合物または、本発明のアミノ酸配列と相互作用する化合物と関連する。本発明はさらに、こうした化合物を含有する合成物ならびに、これらの合成物の調製および害虫の制御でのこうした化合物の利用とも関連する。

今回の発明の核酸はここでは一括して「本発明の核酸」と呼ぶ。さらに、以下の発明の詳細な記述の本文では適切な場合には、「本発明の核酸配列」および「本発明の核酸」という語は、基本的に同等であり、基本的に相互変換が可能であると考えても差し支えない。

さらに、今回の発明の目的では、核酸とは、通常は結合している別の核酸分子および配列の少なくとも一つから分離されている場合には、−例えば、本来の生物学的起源などから−「基本的に分離された（形態のもの）」と考える。同様に、ポリペプチドとは、通常は結合している別のポリペプチド分子から効率的に分離されている場合には、−例えば、本来の生物学的起源などから−「基本的に分離された（形態のもの）」と考える。核酸またはポリペプチドは、特に、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、および、最高１０００倍以上に精製されている場合には、「基本的に分離されている」と考える。

今回の発明は、化合物およびその他の因子とのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用において、本発明のアミノ酸配列が（潜在的な）「標的」として利用可能であるという所見から確立された（「標的」という語は、本明細書に援用して組み込まれる（特許文献１）での定義のように、当該技術での通常の意味を持つものである）。その結果、（以下に記述された方法などにより）本発明のアミノ酸配列と相互作用するとされている化合物または因子は、農芸化学、獣医学または薬学の分野で活性物質として有用なものとなる可能性がある。

国際公開第９８／０６７３７号

一実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸に関し、好ましくは（基本的に）分離された形態で、特に配列番号１という核酸配列と関連する。配列番号１の核酸配列は、後述の実施例の項で詳述された方法で、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の生体に由来またはこれから分離されたものである。この配列は、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα１についての不完全なコード化配列を示す。

別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸に関し、好ましくは（基本的に）分離された形態で、特に配列番号５という核酸配列と関連する。配列番号５の核酸配列はキメラ配列であり、これでは配列番号１のオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα１が、ワタアブラムシｃＤＮＡライブラリ（実施例１）に由来する配列番号３で列挙した核酸１から４２９までのストップコード化ンと共に示されている。このアブラムシ由来の配列は、アブラムシの電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα１に由来する。この配列の構成については、後述の実施例の項で詳述する。この配列は、機能的キメラコード化配列を示す。

別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸に関し、好ましくは（基本的に）分離された形態で、特に配列番号７、配列番号９または配列番号１１という核酸配列と関連する。配列番号７、配列番号９または配列番号１１という核酸配列は、後述の実施例の項で詳述された方法などで、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の生体に由来またはこれから分離されたものである。これらの配列はそれぞれ、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の電位依存性カルシウムチャネルサブユニットβ-１、β-２、β-３についての完全なコード化配列を示している。

別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸に関し、好ましくは（基本的に）分離された形態で、特に配列番号１３という核酸配列と関連する。配列番号１３という核酸配列は、後述の実施例の項で詳述された方法で、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の生体に由来またはこれから分離されたものである。この配列は、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα２δについての完全なコード化配列を示している。

別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸に関し、好ましくは（基本的に）分離された形態で、特に配列番号１５または配列番号１７という核酸配列と関連する。配列番号１５または配列番号１７という核酸配列は、後述の実施例の項で詳述された方法などで、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の生体に由来またはこれから分離されたものである。これらの配列はそれぞれ、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα２δ−１およびα２δ−２についての完全なコード化配列を示している。

一般的に、本発明の核酸配列は、核酸の形態をとっている場合には、ＤＮＡまたはＲＮＡであると思われ、一本鎖または二本鎖となることがある。例えば、本発明の核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡとなることがある（企図した宿主細胞または宿主生物で発現するように特に適応させたコード化ンを利用しているＤＮＡなどで、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ベセズダ）のＢａｃｋＴｒａｎｓｌａｔｅ解析ツールなどの適切なコンピュータプログラムを用いてデザインされたものなどであることがある）。従って、本発明の核酸配列は、イントロン配列を含むことがあり、一般的に種々のスプライシング変異体からなることもある。

これとは別の実施形態として、本発明の核酸配列に向けての二本鎖ＲＮＡ分子に関連するものがある（うち一本の鎖は通常、少なくとも本発明の核酸配列の一部からなる）。こうした二本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子機能のＲＮＡ干渉の研究で特に有用である（Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３（２０００））。本発明はさらに、こうした二本鎖ＲＮＡ分子を提供するために利用することが可能な遺伝子構造とも関連する（Ｅ．ｃｏｌｉなどの菌株での例など、宿主細胞または宿主生物での適切な発現によるものなど）。こうした構造については、（非特許文献２２）といった参考文献がある。

Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）

広い意味では、「本発明の核酸配列」という語は以下のものから構成される：
−配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列の一部またはフラグメント；
−下記に詳述するような、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列の（天然または合成による）突然変異体、変異体、対立遺伝子、類縁体、オルソログ（本明細書では以下、総称して「突然変異体」と呼ぶ）；
−こうした（天然または合成による）突然変異体の一部またはフラグメント；
−少なくとも一つのさらに別の核酸配列と、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７（またはこれらの一部またはフラグメント）の核酸配列の核酸融合物；
−少なくとも一つのさらに別の核酸配列と、（天然または合成による）突然変異体（またはその一部もしくはフラグメント）の核酸融合物；
こうした突然変異体、一部、フラグメントまたは融合物は、主として以下に記述するようなものである。

本発明は、上述の核酸配列の種々のスプライシング変異体からも構成されている。

主として、本発明の核酸配列は少なくとも５００個の長さのヌクレオチドからなり、好ましいものとしては最低１，０００個のヌクレオチド、さらに好ましいものとしては最低２，０００個のヌクレオチド、最高ではほぼ８，０００個のヌクレオチド、望ましくは多くの場合７，５００個のヌクレオチド、さらに好ましい場合には多くの場合７，０００個のヌクレオチドとなる。

配列番号１の核酸配列の一部もしくはフラグメント、またはその（天然または突然変異による）突然変異体の一部もしくはフラグメントの例には、５’または３’切断核酸配列または、フレームスタートコード化ンまたはストップコード化ンの導入を受けた核酸配列が含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明の核酸配列の一つまたは複数についての二つまたはそれ以上のこうした部分またはフラグメントが、適切に組み合わされて（フレーム中のリガンドなど）、さらに本発明の核酸配列となることがある。

望ましくは、こうした一部またはフラグメントは、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列からの少なくとも１００個、望ましくは２５０個、さらに望ましくは少なくとも５００個、さらに１，０００個以上となることもあるヌクレオチドからなる少なくとも一つの連続的伸展から構成されるものとなる。配列番号５の場合には、本発明によるフラグメントは、配列番号５からの少なくとも５個、望ましくは１０個、さらに望ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。

さらに、当業者によれば、本明細書の公開に基づいて（別の個体の）同一生物種（例えば、異なる菌株または系列の個体からなどのもので、突然変異体を含むがそれに限定しない）からの配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列の天然の「突然変異体」（上述のもの）を識別したり、入手したり、分離したりすることが可能となると予想される。また、当業者によれば、本明細書の公開に基づいて配列番号１の核酸配列の合成突然変異体（本明細書上述で定義したもの）を提示したり、提供することができるようになると予想される。

具体的な実施形態の一つとしては、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７またはその一部またはそのフラグメントの核酸配列をコード化する突然変異体がある。
本明細書で記述した突然変異体は、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列についての一つまたは複数、望ましくはすべての構造的特徴を有しているか、または、以下に記述した特徴を保存していることが好ましい。

特に、本明細書で記述したあらゆる突然変異体、一部またはフラグメントは、少なくとも、本発明の対応するアミノ酸配列の活性部位または触媒部位および本発明の対応するアミノ酸の結合ドメインをコード化しているものとすることができる。

さらに、本明細書で記述したあらゆる突然変異体、一部またはフラグメントは、好ましくはヌクレオチドレベルで、少なくとも７５％、望ましくは最低８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％、特に９０％以上、および最高９５％以上にわたり、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列とある程度の「配列の同一性」を有することになる。

さらに、主として、本発明の核酸配列のあらゆる突然変異体、一部またはフラグメントは、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％、特に９０％以上、および最高９５％以上にわたり、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７のアミノ酸配列とある程度の「配列の同一性」を有することになるが、この「配列同一性」の割合については、以下で算定する。

こうした目的では、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の配列と比較して、ヌクレオチドの欠失、挿入、置換または付加を、単独ヌクレオチド位での相違と考え、該当する核酸配列において、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の核酸配列での対応する位置でヌクレオチドが同一となっているヌクレオチドの数を、該当する核酸配列での総ヌクレオチド数で割って１００％を掛けることにより、該当する核酸配列と配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の核酸配列との間の「配列同一性」を算定することができる。

全体的な配列アラインメントを行い、配列同一性を決定する好ましいコンピュータプログラムとしてはｃｌｕｓｔａｌＷがあり（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））、これは、種々のコンピュータプラットフォームで利用可能であると発表されている。蛋白質配列アラインメントについてのｃｌｕｓｔａｌＷプログラムの好ましいパラメータは、ｋｔｕｐｌｅ＝１，ｄｉａｇｏｎａｌｓ＝５，ｗｉｎｄｏｗｓ＝５，ｇａｐ＝３，Ｓｃｏｒｅ＝ＰＥＲＣＥＮＴＡＧＥ，ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ、ｏｐｅｎ ｐｎａｌｔｙ＝１０．０、および、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５である。

さらに、好ましい意図としては、本明細書で記述したあらゆる突然変異体、一部またはフラグメントは、下記の標準的な測定法により測定した場合、最低５０％、好ましくは最低７５％、最高９０％といった範囲で、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の配列について上で記載されている生物学的活性に基本的に類似した生物学的活性を有する蛋白質またはポリペプチドをコード化することになる。

本明細書で記述したあらゆる突然変異体、一部およびフラグメントは、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の核酸配列と、「きわめて厳密な」条件下で、ハイブリダイゼーションすることが可能であることが好ましい。当業者にとってはこうした条件は、本明細書に援用して組み入れられている上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらなどの標準的なハンドブック、および、（特許文献２）、（特許文献３）または（特許文献４）などから、明確なものとなるはずである。

欧州特許第０９６７２８４号 欧州特許第１０８５０８９号 国際公開第００／５５３１８号

本発明の核酸配列を一つまたは複数の別の核酸配列と融合させたものを利用することも、（上述のように）本発明の意図の範囲内であり、こうした配列には、コード化配列、非コード化配列または制御配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。望ましくは、こうした融合においては、一つまたは複数の別の核酸配列が操作可能な形で、本発明の核酸配列と結合している（下記参照）（例えば、別の核酸配列がコード化配列である場合には、ヌクレオチド融合物は下記のように蛋白質融合物をコード化する）。

別の実施形態は、本発明は、本発明の核酸配列に対するアンチセンス分子に関連する。

本発明の核酸は、やはり下記に記述するように、遺伝子構成物の形を取ることがある。本発明の遺伝子構成物は一般的に少なくとも一つの本発明の核酸配列から構成され、下記に記述するように、それ自体で知られている遺伝子構成物の一つまたは複数の成分と連結していることがある。こうした遺伝子構成物はＤＮＡまたはＲＮＡであることがあり、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。構成物は、企図する宿主細胞または宿主生物のトランスフォーメーションに適した形態、企図する宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みに適した形態または、企図する宿主生物での独立した複製、維持および伝達に適した形態で存在することもある。遺伝子構成物は例えば、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（「ＹＡＣ」）、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどのベクターの形態で存在することがある。特に、ベクターは発現ベクター、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（下記のような適切な宿主細胞または宿主生物において）で発現させることの可能なベクターである。本発明の核酸配列からなる発現ベクターは、本明細書では組換え発現ベクターとも呼ばれている。これらの構成物は本明細書では「本発明の遺伝子構成物」とも呼ばれることになる。

好ましい実施形態では、組換え発現ベクターでのこうした構成物は、以下のものから構成される：
ａ）本発明の核酸配列で、以下のものに操作可能な形で結合したもの：
ｂ）プロモーターおよび任意の適切なターミネーター等の一つまたは複数の調節成分；
および、さらに任意により：
ｃ）それ自体で知られている一つまたは複数の遺伝子構成物の別の成分；ここで、「調節成分」、「プロモーター」、「ターミネーター」、「別の成分」および「操作可能な形での結合」という語は、以下に示す意味を有している。

上述の一つまたは複数の「別の成分」として、本発明の遺伝子構成物は一般的に、一つまたは複数の適切な調節成分（適切なプロモーター、エンハンサーまたはターミネーター、３’−または５’−非翻訳領域（「ＵＴＲ」）配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカーもしくはレポーター遺伝子、または、トランスフォーメーションもしくは組み込み（の効率）を促進若しくは増大させる可能性のある成分など）を含有する。こうした遺伝子構成物に対してのこれらおよびその他の適切な成分は、当業者にとっては明白なものであり、場合によっては使用する構成物のタイプ、企図された宿主細胞または宿主生物、対象となる発明の核酸配列が発現される方法（構成的発現、一過性の発現または誘発性の発現）、および、使用されるトランスフォーメーション技術に依存することがある。

本発明の遺伝子構成物では、一つまたは複数の成分が、本発明の核酸配列または相互に「操作可能な形で」結合していることが望ましく、これは一般的に、互いに機能的な関連で存在することを意味する。例えば、プロモーターがコード化配列の転写または発現を開始または制御または調節することができる場合には、このプロモーターはコード化配列と「操作可能な形で」結合していると考えられる（この場合、このコード化配列は、このプロモーターの「制御下にある」と理解しなければならない）。

一般的に、二つの核酸配列が操作可能な形で結合している場合には、これらは同一の方向を向いており、通常は同一のリーディングフレーム内に存在する。さらにこれらは通常、基本的に隣接しているが、必ずしもこれが必要とされるわけでもない。

好ましくは、本発明で使用される遺伝子構成物の任意のその他の成分は、企図された宿主細胞または宿主生物内で企図された生物学的機能を示せる状態であることが好ましい。

例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターが企図された宿主細胞または宿主生物内で「操作可能」でなければならず、これは、（例えば）上述のプロモーターが、それが操作可能な形で結合した核酸配列、すなわちコード化配列の転写の開始、制御または調節をできるものでなければならないことを意味する。

こうしたプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘発性プロモーターであることがあり、さらに、宿主細胞または宿主生物の特定の発達段階で発現を提示したり（するのみであったり）、特定の細胞、組織、臓器または多細胞宿主生物の一部で発現を提示したり（するのみであったり）することもある。

一部の特に好ましいプロモーターには、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、ｐＳＶＬ ＳＶ４０ Ｌａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）などのシミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）、または単純疱疹ウイルス（「ＨＳＶ」）といった哺乳動物細胞での発現のための構成的プロモーターや、Ｊａｒｖｉｓらによって記述され（非特許文献２３）、ＮｏｖａｇｅｎからｐＩＥベクターとして販売されている（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．ウィスコンシン州マディソン）即時型バキュロウイルスプロモーターなどの昆虫型構成的プロモーター、または、Ｂｕｎｃｈらによって記述され（非特許文献２４）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからベクターとして販売されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎプロモーターなどの昆虫型誘発性プロモーターが含まれるが、これに限定されるわけではない。

Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３９巻、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｅｄ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，． Ｈａｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ（１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻、３号、１０４３−１０６（１９８８）

選択マーカーは、適切な選択条件下で、本発明の核酸配列により（成功裏に）トランスフォームを受けた宿主細胞または宿主生物を、（成功裏に）トランスフォームを受けていない宿主細胞または生物と区別できるものでなければならない。こうしたマーカーの好ましい例としては、抗生物質（ジェネチシンもしくはＧ−４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）、カナマイシン、または、アンピシリンなど）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、または、トランスフォームをしていない細胞または生物の生存に必要不可欠なある種の因子、化合物または（栄養）成分が培地内に存在しなくても宿主細胞または宿主生物が生存できるようにする遺伝子などがあるが、これに限定されるものではない。

リーダー配列は、企図した宿主細胞または宿主生物で、翻訳後に希望の変形を行ったり、転写されたｍＲＮＡをシグナルペプチドなどの細胞の希望の場所または細胞小器官に方向付けるようにしたりするものでなければならない。リーダー配列は、対象となる細胞から発現産物を分泌させることもある。このような場合、リーダー配列は、ピコルナウイルスリーダー、ポティウイルスリーダー、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（「ＢｉＰ」）、タバコモザイクウイルスリーダー（「ＴＭＶ」）およびトウモロコシクロロテック斑紋ウイルスリーダー（「ＭＣＭＶ」）などの宿主細胞または宿主生物内で操作可能なプロ配列、プレ配列またはプレプロ配列となることがあるが、これらに限定されるわけではない。

発現マーカーおよびレポーター遺伝子は、宿主細胞または宿主生物内で遺伝子構造（上に存在する遺伝子または核酸配列）の発現を検出するものでなければならない。発現マーカーではさらに、任意により、細胞の特定の部位もしくは細胞小器官、または、特定の細胞、組織、臓器または多細胞生物の一部などで、発現産物の位置を確認できることがある。こうしたレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列との融合蛋白質として発現することもある。好ましいものの一部として、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質、ベクター内で得られるＶ５エピトープもしくはポリヒスチジンなどの抗体認識蛋白質およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから供給されている抗体、または、ニッケルカラムでの精製を可能にするポリヒスチジンやメトトレキセートカラムでの精製を可能にするジヒドロ葉酸レダクターゼなどの精製アフィニティ・ハンドル、または、Ｅ．ｃｏｌｉのβガラクトシダーゼ遺伝子などの遺伝子を発現している細胞を選別できるマーカーなどがあるが、これらに限定されるわけではない。

プロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカーおよび、本発明の遺伝子構成物中に存在するまたはそこで利用される可能性のあるその他の成分−ターミネーター、転写エンハンサーもしくは翻訳エンハンサーまたは組み込み因子−についての限定的ではない例の一部としては、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの一般的なハンドブック、Ｗ．Ｂ．Ｗｏｏｄらの”Ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅらの“Ｃ．ＥＬＥＧＡＮＳ ＩＩ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、さらに、（特許文献５）、（特許文献６）、（特許文献７）、（特許文献８）、（特許文献９）、（特許文献１０）、（特許文献１１）、（特許文献１２）、（特許文献１３）、（特許文献１４）および（特許文献１５）などに言及されており、これらはそれぞれ、本明細書に援用して組み込まれている。当業者にとっては、その他の実施例は、明確なものである。

国際公開第９５／０７４６３号 国際公開第９６／２３８１０号 国際公開第９５／０７４６３号 国際公開第９５／２１１９１号 国際公開第９７／１１０９４号 国際公開第９７／４２３２０号 国際公開第９８／０６７３７号 国際公開第９８／２１３５５号 米国特許第６，２０７，４１０号 米国特許第５，６９３，４９２号 欧州特許第１０８５０８９号

本発明の別の実施形態は、トランスフォームを受けたり、本発明での一つまたは複数の核酸配列、一つまたは複数の核酸もしくは一つまたは複数の遺伝子構成物を含む宿主細胞または宿主生物に関連するものである。本発明は、本発明のアミノ酸配列の一つまたは複数を（適切な条件下などで）発現する、または、（少なくとも）発現することのできる宿主細胞または宿主生物とも関連する。一部の実施形態では、宿主細胞が、機能性フラグメントおよびキメラなどを含む、キメラとしての電位依存性カルシウムチャネルのα１、ＴＢＷ β−１および／またはβ−２および／またはβ−３およびアブラムシα２δおよび／またはＴＢＷ α２δ−１および／またはα２δ−２サブユニットを発現する組換えベクターから構成され、α１、βおよびα２δサブユニットのうちの少なくとも一つが、本発明の、望ましくは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および／または配列番号１７といった、α１、ＴＢＷ β−１および／またはβ−２および／またはβ−３ならびにＴＢＷ α２δ−１および／またはα２δ−２および／またはアブラムシα２δサブユニットのキメラとなる、機能性の電位依存性カルシウムチャネルを形成することがある。一部の好ましい実施形態では、宿主細胞が、機能性フラグメントおよびキメラなどを含む、電位依存性カルシウムチャネルのα１、βおよびα２δサブユニットを発現する組換えベクターから構成され、望ましくは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、および／または配列番号１７といった、本発明のα１、ＴＢＷ β−１および／またはβ−２および／またはβ−３ならびにＴＢＷ α２δ−１および／またはα２δ−２サブユニットのうちの少なくとも二つのキメラとなる、機能性の電位依存性カルシウムチャネルを形成する。一部の好ましい実施形態では、宿主細胞が、本発明の核酸分子であるコード化配列からのα１、βおよびα２δサブユニットを発現する組換えベクターから構成され、望ましくは、配列番号５と、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３のうちの一つまたは複数と、配列番号１５および／または配列番号１７のうちの一つまたは複数といった、本発明のα１と、ＴＢＷ β−１および／またはβ−２および／またはβ−３と、ＴＢＷ α２δ−１および／またはα２δ−２および／またはアブラムシα２δサブユニットのキメラとなる。こうした宿主細胞または宿主生物は本明細書では集合的に、「本発明の宿主細胞または宿主生物」と呼ばれることもある。

以下に例示するように、宿主細胞は、適切な細胞（真菌、原核細胞または真核細胞）または細胞系列となることがある：
−Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎｔａｓなどの菌株、ただしこれらに限定されない；
−ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどの真菌細胞種、ただしこれらに限定されない；
−ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母細胞種、ただしこれらに限定されない；
−アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞などの両生類の細胞または細胞系列。

殺虫性化合物の発見および開発で本発明の核酸配列を使用（しようと）する場合に特に有用であると思われる一つの具体的な実施形態では、宿主細胞が、以下のような昆虫由来の細胞または細胞系列となることがある：
−Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ＳＦ９およびＳｆ２１細胞などの鱗翅目に由来する細胞または細胞系列、ただしこれらに限定されない；
−Ａｐｈｉｓに由来する細胞または細胞系列；
−シュナイダー細胞およびＫｃ細胞など、Ｄｒｏｓｏｈｉｌａに由来する細胞または細胞系列；および
−オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）など、対象となる有害生物種（後述のもの）に由来する細胞または細胞系列。

宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞およびヒト細胞またはＨＥＫ，ＨｅＬａおよびＣＯＳなどの細胞系列といった哺乳動物細胞または細胞系列となることもあるが、これらの限定されるわけではない。

宿主生物は、以下のような適切な多細胞生物（脊椎動物または無脊椎動物）となることがあるが、これらに限定されるわけではない：
−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどのＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属に由来する線形動物、ただしこれに限定されない；
−Ａｐｈｉｓ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓまたは、対象となる有害生物種（上述のもの）などの昆虫、ただしこれらに限定されない；
−ゼブラフィッシュなど、その他のよく知られているモデル生物；
−ラットまたはマウスなどの哺乳動物；
前述のハンドブックおよび特許出願からの例のように、当業者にとってはその他の適切な宿主細胞または宿主生物は明白なものである。

本発明の核酸配列が多細胞生物で発現した場合には、当該生物の全体で発現する可能性も、該当する細胞、組織、臓器または一部に特異的なプロモーターの制御下での発現などの場合には、一つまたは複数の特殊な細胞、組織、臓器またはその一部のみで発現する可能性もあることに留意しなければならない。

核酸配列は、やはり発達または生活環での該当する段階に特異的なプロモーターの制御下での発現などの場合には、宿主細胞または宿主生物の発達または生活環の特定の段階のみで発現することもある。さらに、すでに上で述べたように、該当する発現は、構成的なものであったり、一過性のものであったり、誘発性のものであったりする可能性がある。

これらの宿主細胞または宿主生物は、（さらに、宿主生物の場合には：少なくともその一つの細胞、一部、組織または臓器で）本発明のアミノ酸配列を（適切な条件下などで）発現する、または、（少なくとも）発現することのできるものであることが好ましい。本発明にはさらに、本発明の宿主細胞または宿主生物のその後の世代、後代および子孫が対象となり、これらは例えば、細胞分裂または有性生殖もしくは無性生殖で得られたものとなることがある。

別の態様では、本発明は、好ましくは（基本的に）分離された形態での核酸と関連しており、この核酸は、（本明細書に定義するような）本発明のアミノ酸配列、特に、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸をコード化しているか、これら本発明のアミノ酸配列の発現に利用することが可能なものである。

配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列は、当業者に知られている、蛋白質の分離および精製のための技術を用いて、上述の生物種から分離されることがある。これとは別に、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列は、以下に詳述するように、適切な宿主細胞または宿主生物で、適切な核酸配列−それぞれ、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の核酸配列および、その適切な突然変異体など−を適切に発現させることによって得られることがある。

別の態様では、本発明は、好ましくは（基本的に）分離された形態での蛋白質またはポリペプチドに関連しており、該当する蛋白質またはポリペプチドは、（上述に定義するような）本発明のアミノ酸配列、特に配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列からなっている。

広い意味では、「本発明のアミノ酸配列」という語は以下のものから構成される：
−配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列の一部またはフラグメント；
−配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列の（天然または合成による）突然変異体、変異体、対立遺伝子、類縁体、オルソログ（本明細書では以下、総称して「類縁体」と呼ぶ）；
−こうした類縁体の一部またはフラグメント；
−配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列（またはその一部もしくはフラグメント）と、少なくとも一つの別のアミノ酸残基またはアミノ酸配列との融合物；
−類縁体（またはその一部若しくはフラグメント）のアミノ酸と、少なくとも一つのさらに別のアミノ酸残基またはアミノ酸配列との融合物；
こうした突然変異体、一部、フラグメントまたは融合物は、以下に記述するようなものであることが好ましい。

「本発明のアミノ酸配列」という語は、プレフォーム、プロフォームもしくはプレプロフォームまたは適切なリーダー配列との融合体など、上述のアミノ酸配列の「不完全な」形態をも包含する。さらに、本発明のアミノ酸配列は、該当のアミノ酸配列の発現または産生に使用した宿主細胞または宿主生物によっては、翻訳後プロセシングまたは適切なグリコシル化を受けたり；またはその他の変形（該当技術ではそれ自体が知られている化学的手法などにより）を受けたりすることがある。

配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列の一部もしくはフラグメント、または、その突然変異体を含む、その（天然または合成による）類縁体の一部若しくはフラグメントの例には、Ｎ末端およびＣ末端切断アミノ酸配列などがあるが、これらに限定されない。さらに、本発明のアミノ酸配列の一つまたは複数の一部またはフラグメントの二つまたはそれ以上が適切に統合して、本発明のアミノ酸配列となることがある。

本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１００個、好ましくは最低２５０個、さらに望ましくは最低３５０個の長さのアミノ酸、最大では２，５００個、好ましくは多くの場合に２，０００個、さらに望ましくは少なくとも１，７５０個のアミノ酸を有していることが好ましい。

こうした一部またはフラグメントは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のアミノ酸配列からの、少なくとも５個、望ましくは最低１０個、さらに望ましくは最低２０個、さらに好ましいものとしては最低３０個以上のアミノ酸からなる、少なくとも一つの連続的伸展から構成されるものとなる。配列番号６のフラグメントの場合には、フラグメントは、配列番号２からの少なくとも４個、望ましくは８個、さらに望ましくは１５個以上のアミノ酸を含んでいなければならない。

特に、本明細書で記述した一部またはフラグメントは、（少なくとも）本発明での活性部位若しくは触媒部位に対応するアミノ酸配列、または、本発明での結合ドメインに対応するアミノ酸配列から構成されるものである。当業者にとっては明確であるように、こうした一部またはフラグメントには、（下記で全般的に記述するように）測定技術およびスクリーニング技術、ならびに、（該当する部位またはフラグメントが結晶の形で提供される場合には）Ｘ線結晶解析で、特別な利用法が見出される可能性がある。

さらに、当業者によれば、本明細書の公開に基づいて、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列の天然の「類縁体」（上述のもの）を識別したり、入手したり、分離したりすることが可能となると予想される。こうした突然変異体は、（別の個体の）同一生物種（例えば、異なる菌株または細胞系列からのもので、突然変異株または細胞系列を含むがそれに限定しない）から、または、別の生物種（の個体）から得ることができた。例えば、こうした類縁体は、上述の昆虫種から得ることができた。

さらに、当業者によれば、本明細書の公開に基づいて、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列の合成「類縁体」（上述で定義したもの）を提示したり、提供することができるようになると予想される。

本明細書で記述した突然変異体は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列についての一つまたは複数、望ましくはすべての構造的特徴を有しているか、または、以下に記述した特徴を保存しているものであることが好ましい。

本明細書で記述したあらゆる類縁体、一部またはフラグメントは、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％、特に９０％以上および最高９５％以上の度合いで、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸と、「配列の同一性」を有するものであることが好ましい。

こうした目的では、−配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列と比較して−アミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加を、単独アミノ酸（位）での相違と考え、該当するアミノ酸配列において配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列での対応する位置でアミノ酸残基が同一となっているアミノ酸残基の数を、該当するアミノ酸配列での総アミノ酸数で割って１００％を掛けることにより、該当するアミノ酸配列と配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列との間の「配列同一性」を算定することができる。上述のように、こうした算定で配列アラインメントの対比を実施するために適した方法は、ｃｌｕｓｔａｌＷプログラムである。

さらに、望ましくは、本明細書で記述したあらゆる類縁体、一部またはフラグメントは、下記の標準的な測定法により測定した場合、最低１０％、好ましくは最低５０％、さらに望ましくは最低７５％および、最高９０％といった範囲で、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の配列について、上で記載されている生物学的活性と基本的に類似した生物学的活性を有することになる。

蛋白質融合の提供などのように、本発明のアミノ酸配列を一つまたは複数の別のアミノ酸配列と融合させたものを利用することも、（上述のように）本発明の意図の範囲内である。以下に詳述するように、一般的に、こうした融合物は、適切な宿主細胞または宿主生物で−本発明の核酸配列を、一つまたは複数の別のコード化配列と適切に融合させるなど−本発明の適切な核酸配列の適切な発現によって得られる。

具体的な実施形態の一つでは、こうした融合物が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、緑色蛍光蛋白質（「ＧＦＰ」）、ルシフェラーゼまたはその他の蛍光蛋白質などのような、レポーター蛋白質と融合した本発明のアミノ酸配列から構成されることがある。当業者にとっては明らかであるように、こうした融合物が、発現解析および同様の方法で特に有用とされることがある。

別の実施形態では、該当するアミノ酸または残基に対するアフィニティ法を用いる場合など、融合相手が、発現したアミノ酸配列の精製で利用される可能性のあるアミノ酸配列またはアミノ酸残基となることがある。その後、該当する配列または残基は除去され（化学的切断または酵素的切断などにより）、本発明の核酸配列が得られる（この目的のためには、アミノ酸配列または残基は、切断可能なリンカー配列を介して、本発明のアミノ酸配列に任意で結合することができる）。こうした残基の好ましい例としては、複数のヒスチジン残基およびグルタチオン残基があるが、これらに限定されない。

好ましいものではあるが限定的ではない態様では、こうした融合物は、下記の標準的な測定法により測定した場合、最低１０％、好ましくは最低５０％、さらに望ましくは最低７５％および、最高９０％といった範囲で、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の配列について、上で記載されている生物学的活性と基本的に類似した生物学的活性を有することになる。

本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、一般的に、以下の構造的特徴または保存された特徴のうちの一つまたは複数の存在によって、特徴付けられると思われる。

Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｅｒｅｓｃｅｎｓの遺伝子については、配列番号１は、オープンリーディングフレームを取り囲むｃＤＮＡ配列であり；配列番号２は、配列番号１によってコード化された蛋白質である。ＨｅｌｉｏｔｈｉｓのＮ型電位依存性カルシウムチャネルの蛋白質配列は、以下の表に示すように、他のＮ型電位依存性カルシウムチャネルの蛋白質と関連しており、関連性の値は、ｃｌｕｓｔａｌＷおよび上述に示したパラメータを用いて決定された。

１ Ｇｅｎｅｂａｎｄ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ４７４０６，（非特許文献２５）
２ Ｇｅｎｅｂａｎｄ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ３６８６８，（非特許文献２６）

Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６（２４）、７８６８−７８７９、１９９６ Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９６）、２０１２−２０１８、１９９８

他のカルシウムチャネルから類推されるように、機能性蛋白質は単量体である可能性が高い。（非特許文献２７）などを参照されたい。

Ｈａｎｎａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｙ．Ｐｉｃｈｏｎ，１９９３、Ｂｉｒｋｈｕａｓｅ Ｖｅｒｌａｇ（スイス・バーゼル）

上述に基づき、本発明は特定の説明または機序に特に限定されていないが、核酸配列およびアミノ酸配列は、電位依存性カルシウムチャネルとしての（生物学的な）活性を有する。特に、今回の発明は、穿孔虫、根切り虫、アワヨトウ、オオタバコガ、ｆｒｕｉｔ ｗｏｒｍ、アオムシ、ガおよびｌｏｐｐｅｒなど、特にオオタバコガの鱗翅目の族の昆虫と、穿孔および吸引に適した口器を有する半翅類の昆虫から、電位依存性カルシウムチャネルとして活性が示されている。

当該技術で知られているように、こうした種類の生物学的活性は、標識された既知のリガンドとの結合部位での完全な競合；蛍光共鳴エネルギー移動などの蛋白質相互作用に基づく蛍光測定法によるカルシウム蛍光色素を用いたカルシウム流動性の測定（Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｅらを参照）による、経時的な蛍光の消失または蛍光法もしくは比色法によるレポーターアッセイ；電位依存性カルシウムチャネルの測定に適したあらゆる技術など、標準的な測定法を用いて測定することができる。生物学的活性は、カルシウム蛍光色素を用いたカルシウム流動性を測定することによって測定することが好ましい。

本発明の別の実施形態は、ある程度厳密な条件下、好ましくは厳密性が高いものおよび特に厳密な条件下（いずれも、上述のもの）で、本発明の核酸配列とハイブリダイゼーションすることが可能な核酸プローブに関連する。こうした核酸プローブは、例えば、本発明の核酸配列の検出もしくは分離で利用されたり、本発明の核酸配列の増幅でプライマーとして利用されることがある；いずれも、それ自体で知られている技術を用いており、やはり、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの一般的なハンドブックに記述されている。

本発明の別の核酸配列を検出または分離する際に利用する場合には、こうした核酸プローブは、通常は１５個から１００個、好ましくは２０個から８０個の間の長さのヌクレオチドを有することが好ましい。増幅のプライマーとして使用する場合には、こうした核酸プローブは、２５個から７５個、好ましくは２０個から４０個の間の長さのヌクレオチドを有することになる。

一般的に、こうしたプローブは、当業者が、適切なコンピュータプログラムを任意に使用しながら、本発明の核酸配列またはアミノ酸配列−特に、配列番号１または配列番号２、配列番号５または配列番号６、配列番号７または配列番号８、配列番号９または配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６および配列番号１７まはた配列番号１８から開始することによってデザインすることができる。さらに、当業者にとっては明白であるように、こうしたプローブは変性プローブとすることもできる。

別の態様では、本発明は、今回の発明の核酸配列の突然変異体および遺伝子構成物を調製するための方法と関連する。

今回の発明の核酸配列の天然の突然変異体は、実施例で記載されている方法と基本的に類似した方法、または、以下のような代替法で、得ることができる：
−適切な発現ベクター系での、対象となる生物者からのＤＮＡライブラリの構築と、それに続く突然変異配列の直接発現；
−適切な発現ベクター系での、対象となる生物者からのＤＮＡライブラリの構築と、それに続く、本発明のプローブ（下記のもの）または本発明の核酸配列を用いての、該当するライブラリのスクリーニング；
−対象となる生物者からの、突然変異配列をコード化するｍＲＮＡの分離と、それに続く、逆転写酵素を用いてのｃＤＮＡの合成；
または、それ自体で知られている何らかの他の適切な方法または技術により得るが、これについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（第２版）、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら、”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７）などの標準的なハンドブックで述べられている。

今回の発明の核酸配列のこうした合成配列を作製するための技術は、当業者にとっては明らかであり、例えば、自動化ＤＮＡ合成法；部位特異的突然変異誘発；天然に存在する一つまたは複数の配列の二つまたはそれ以上の部分を結合しての、切断された発現産物の発現を導く突然変異の誘発；一つまたは複数の制限酵素認識部位の誘発（適切な制限酵素を用いた場合に容易に切断または結合されると思われる部位または領域を作製するなど）および、例えば天然に存在する電位依存性カルシウムチャネルの配列をテンプレートとして利用して、一つまたは複数の「不適正」プライマーを用いてのＰＣＲ法による突然変異の誘発といったものがあるが、これらに限定されるわけではない。これらおよびその他の手法は、当業者にとっては明らかなものであり、やはり、上述のような、ＳａｍｂｒｏｏｄらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの標準的なハンドブックに記載されている。

本発明の遺伝子構成物は一般的に、上述の、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの一般的なハンドブックに記載されている技術を用いるなどして、本発明の核酸配列を、上述の一つまたは複数の別の成分と適切に結合させることによって得られる。

本発明の遺伝子構成物は、それ自体で知られている適切な（発現）ベクターに、本発明の核酸配列を挿入することによって得られることが多くなる。限定的なものではないが好ましい適切な発現ベクターの実施例の一部に、以下のようなものがある：
−哺乳動物細胞での発現のためのベクター：ｐＳＶＬ ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＥＢＯ−ｐＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０），ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４），ｐＲＳＶ ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１１９），ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６），ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）および１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）；
−細菌での発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）；
−酵母またはその他の真菌細胞での発現のためのベクター：ｐＹＥＳ３２（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
−昆虫細胞での発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ），ｐＥＩ１（Ｎｏｖａｇｅｎ），ｐＭＴ／Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

別の態様では、本発明は、本発明の核酸配列、本発明の核酸または本発明の遺伝子構成物による宿主細胞または宿主生物のトランスフォーミングのための方法に関連する。本発明はさらに、宿主細胞または宿主生物をトランスフォームする本発明の核酸配列、本発明の核酸または本発明の遺伝子構成物の利用とも関連する。

具体的な実施形態では、宿主細胞または宿主生物で本発明の核酸配列の発現が、元の（すなわち天然の）宿主細胞または宿主生物に比べて低下することがある。これは、例えば、技術領域でよく知られているアンチセンス技術またはＲＮＡ干渉技術を用いた一時的な方法、もしくは、本発明の核酸配列のランダムな、部位特異的または化学的な突然変異誘発を用いた構成的な方法で、行った場合などに生ずることがある。

適切なトランスフォーメーション技術は、当業者には明白であり、企図されている宿主細胞または宿主生物もしくは、利用予定の遺伝子構成物に依存することがある。限定的なものではないが好ましい適切な技術の例には、粒子射撃法によるトランスフォーメーション、（マイクロ）インジェクション、トランスフェクション（適切なトランスポゾンを使用したものなど）、電気穿孔法およびリポフェクチン法などがある。これらの技術およびその他の適切な技術については、やはり、上述のハンドブックおよび特許出願に記載されている。

トランスフォーメーション後には、本発明の核酸配列または遺伝子構成物によってトランスフォーメーションが成功した宿主細胞または宿主生物の検出および選別の手順がとられることがある。これは、例えば、本発明の遺伝子構成物中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択手順、または、特異的な抗体などを用いての本発明のアミノ酸配列の検出によるステップなどとなることがある。

トランスフォーメーションを受けた宿主細胞（安定な細胞系列の形をとることがある）または宿主生物（安定な突然変異系列または株の形をとることがある）は、今回の発明の別の態様を形成する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列を産生するための方法に関連する。

本発明のアミノ酸配列の発現を生じさせたり、得たりするためには、一般的に、本発明の（希望の）アミノ酸配列が発現または産生するような条件下で、トランスフォーメーションを受けた宿主細胞またはトランスフォーメーションを受けた宿主生物を、保持したり、維持したり、培養したりすることになる。適切な条件は、当業者にとっては明らかであり、通常、使用した宿主細胞または宿主生物、ならびに、本発明の（関連する）核酸配列の発現を制御する制御因子に依存する。これについても、上の、本発明の遺伝子構成物についてのパラグラフで述べた、ハンドブックおよび特許出願に記載されている。

一般的に、適切な条件には、適切な培地の使用、適切な栄養源または適切な栄養分の存在、適切な温度の利用、ならびに、任意により、適切な誘発因子または化合物の存在（本発明の核酸配列が、誘発性プロモーターの制御下にある場合など）が含まれることがある；これらはいずれも、当業者によって選択される。この場合にも、こうした条件下で、本発明のアミノ酸配列は、構成的な方法、一過性の方法または、適切な誘発が行われた場合にのみ、発現できる。

本発明のアミノ酸配列が（最初は）不完全な形で生じ（上述のように）、その後、使用した宿主細胞または宿主生物に応じて、トランスフォーメーション後の変形を受けることがあるということも、当業者には明白である。さらに、本発明のアミノ酸配列は、使用した宿主細胞または宿主生物に応じて、グリコシル化を受けることがある。

本発明のアミノ酸配列はその後、宿主細胞または宿主生物、もしくは、該当する宿主細胞または宿主生物が培養された培地から、（分離用）クロマトグラフィー法および電気泳動法、沈降分離法、アフィニティ法（本発明のアミノ酸配列と融合した、特異的な切断可能なアミノ酸配列を使用するなど）および、調製用の免疫学的手法（分離予定のアミノ酸配列に対する抗体を使用するなど）などの、それ自体が知られている蛋白質分離精製技術を用いて、分離される。

実施形態の一つでは、該当する配列もしくは、その抗原部位またはエピトープに対して特異的な抗体を得るために、こうして得られたアミノ酸配列を利用することもある。

実施形態の一つでは、今回の発明は、今回の発明のアミノ酸配列、望ましくは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８、もしくは、これらの類縁体、変異体、対立遺伝子、オルソログ、一部、フラグメントまたは、配列番号６に特異的な抗体が、配列番号４などのアブラムシα１と交差反応しない場合には、エピトープに対して特異的に作製された、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体などの抗体に関連する。

本発明の別の態様となるこうした抗体は、（特許文献１６）、（特許文献１７）、（特許文献１８）、（特許文献１９）、（特許文献２０）、（特許文献２１）および（特許文献２２）などに記述されている、それ自体が知られた方法で作製される。排他的ではないものの、こうした方法は、全般的に、該当するアミノ酸配列に対しての抗体が生ずるような方法に従って、免疫応答性の宿主を本発明の妥当なアミノ酸配列または免疫原性を有するその一部（特定のエピトープなど）で免疫し、その後、該当の宿主より得られた血液または血清などから、生じた抗体を回収することによるものであることが多い。

英国特許出願公開第２３５７７６８号 米国特許第５，６９３，４９２号 国際公開第９５／３２７３４号 国際公開第９６／２３８８２号 国際公開第９８／０２４５６号 国際公開第９８／４１６３３号 国際公開第９８／４９３０６号

例えば、ポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタまたはマウスなどの適切な宿主を、任意により、免疫原性のキャリアー（ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシニアンなど）、もしくは、フロイントのアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムまたは同様の界面活性剤などのアジュバントを用いて、本発明のアミノ酸配列（のエピトープ）で免疫することによって、得ることができる。適切な免疫応答が生じた後に（通常は１〜７日以内）、やはり（特許文献２３）などに言及されている、それ自体が知られている方法により、免疫した動物から採取した血液または血清から抗体を分離するが、任意によって、既知の免疫測定法技術を用いての、希望する性質（特異性など）を有する抗体についてのスクリーニング段階が含まれることがある。

国際公開第９６／２３８８２号

例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマをベースとしたものおよび同様の方法など、培養物での連続的な細胞系列を用いて産生させることができ、これについても基本的には上述で引用した参考文献に記載されている。従って、本発明のアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体を産生する細胞または細胞系列は、本発明のアミノ酸配列に対する抗体産生法と同様、本発明の別の態様を形成し、こうした方法では一般的に、こうした細胞の培養と、培養物または倍地の抗体の分離が関与し、やはり、それ自体が知られている技術が用いられる。

さらに、本発明のアミノ酸配列に対するＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ）_２，Ｆａｂ’およびＦａｂフラグメント）は、それぞれ、ペプシンまたは別のプロテアーゼによる抗体の消化、ジスルフィド結合の開裂、ならびに、パパインおよび還元剤による処理によって得ることができる。Ｆａｂ−発現ライブラリは、Ｈｕｓｅらの方法、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１２７５−１２８１等によって得ることができる。

別の実施形態では、本発明のアミノ酸配列、または、こうしたアミノ酸配列をコード化し、発現する組換え発現ベクターからなる宿主細胞もしくは宿主生物を用いて、本発明のアミノ酸配列の（生物学的）活性を変調したりその他の点でこれと相互作用をすることのできる化合物またはその他の因子を、識別したり開発したりすることもでき、こうした利用法により、本発明の別の態様が形成される。当業者には明白なように、こうした状況では、本発明のアミノ酸配列は、こうした化合物または因子との相互作用の標的となる。

こうした状況では、「変調する」、「変調」、「モジュレーター」および「標的」という語は、当該技術でのその通常の意味を有し、とりわけ、国際公開第９８／０６７３７号で定義が示されている。一般的に、モジュレーターは、生物学的活性または過程（例えば、本発明のアミノ酸配列の生物学的活性など）の機能的性質を、促進、阻害または低減またはその他の変更、感化または影響（「変調」と総称する）することのできる化合物または因子である。

こうした状況では、本発明のアミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変調（測定またはスクリーニングの一部として）もしくは、ｉｎ ｖｉｖｏでの変調（標的を変調することが知られている化合物または因子による変調で、こうした化合物または因子は、例えば、農芸化学、獣医学または薬学での利用で活性化合物として利用されることがある）の標的となることがある。

例えば、本発明のアミノ酸配列、宿主細胞または宿主生物は、一次的スクリーニング（標的に関して未知の活性を有する被験化合物の一連の群またはライブラリから、標的のモジュレーターを識別するために利用されるスクリーニング法など）または二次的測定（一次的スクリーニングで該当したものを確認したり、該当するものを導くための化学の一部などとして、該当する分子の最適化に使用される測定法）など、本発明のアミノ酸配列のモジュレーターを識別したり開発したりするために利用することのできる測定法またはスクリーニング法の一部として利用されることがある

例えば、こうした測定法またはスクリーニング法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法またはスクリーニング法として構成されることがあり、これは一般的に、標的に対する潜在的モジュレーターとして検討対象となる化合物または因子（本明細書では以下、「被験化合物」と呼ぶ）を標的と結合させ、該当する結合を生じた信号を測定するというものになる。こうしたｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングに適した技術は、当業者には明白なものとなり、（非特許文献２８）および（非特許文献２９）などに記載されている。例えば、こうした測定法またはスクリーニング法が、結合測定法またはスクリーニング法として構成されることがあり、この場合、被験化合物は、標的からの検出可能なリガンドを置換するために用いられ（放射性リガンドまたは蛍光リガンドなど）、これによって、モジュレーターによって標的から置換されたリガンドの量が決定される。

Ｅｌｄｅｇｒａｗｉら（１９８７）．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１巻、２６２−２７１ページ Ｒａｕｈら（１９９０），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１１巻、３２５−３２９ページ

こうした測定法またはスクリーニング法は、細胞をベースとした測定法またはスクリーニング法として構成されることもあり、この場合、本発明の宿主細胞は、被験化合物と結合したりこれにさらされ、これに基づいて、宿主細胞による少なくとも一つの生物学的応答が測定される。

さらに、こうした測定法またはスクリーニング法は、動物一個体でのスクリーニングとして構成されることがあり、この場合、本発明の宿主生物は、被験化合物と接触したりこれにさらされ、これに基づいて、宿主生物による少なくとも一つの生物学的応答（表現型の変化、挙動の変化または、麻痺または死亡を含むがこれに限定されない生理学的変化など）が測定される。

従って、一般的に、上述の測定法およびスクリーニング法は、特に、被験化合物による標的の変調を示す信号が発生するような方法で、被験化合物が標的（または、標的を発現している宿主細胞または宿主生物）と接触するための少なくとも一つの段階から構成される。ついで、その後の段階で、該当する信号が測定される。

従って、ある態様では、本発明は、本発明の該当するアミノ酸配列と被験化合物との相互作用を示すような信号を生じさせるための方法に関連しており、該当する方法は少なくとも以下の手順からなっている：
ａ）本発明のアミノ酸配列もしくは、アミノ酸配列を含有または発現する宿主細胞または宿主生物を、該当する被験化合物と該当するアミノ酸配列との間の相互作用を示す信号が発生するような方法で、該当する被験化合物と接触させる手順；および、任意により、
ｂ）これによって生ずる信号を検出する手順。

別の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列のモジュレーターおよび／またはインヒビターを識別するための方法に関連しており、
該当する方法は少なくとも以下の手順からなっている：
ａ）本発明のアミノ酸配列もしくは、アミノ酸配列を含有または発現する宿主細胞または宿主生物を、該当する被験化合物と該当する標的との間の相互作用を示す信号が発生するような方法で、該当する被験化合物と接触させる手順；および、任意により、
ｂ）これによって生ずる信号を検出し、該当する信号が該当するアミノ酸配列のモジュレーターおよび／またはインヒビターを識別するような手順。

従って、今回の発明は、鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のモジュレーターを識別する方法を示すものである。この方法は、核酸配列の少なくとも一つが本発明の核酸配列で、被験化合物の存在下でカルシウムチャネルを発現するような、機能性カルシウムチャネルをコード化する拡散配列を含む組換え発現ベクターから構成される被験細胞をカルシウムを含有する溶液と接触させ、被験細胞での細胞内カルシウム量を検出することによっての、試験方法の実施段階からなっている。好ましい実施形態では、機能性カルシウムチャネルは、本発明の二つまたはそれ以上のアミノ酸配列から作られている。一部の実施形態では、機能性カルシウムチャネルが、望ましくは、配列番号６と、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２のうちの一つ、ならびに、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のうちの一つという、本発明の三つのアミノ酸配列から作られている。この方法は、鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化し、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現する核酸配列を含有する組換え発現ベクターからなる陰性対照細胞を、被験化合物の非存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、陰性対照細胞での細胞内カルシウムの量を検出することによって陰性対照測定を実施する手順からも構成されている。被験細胞での細胞内カルシウムの量を、陰性対照細胞での細胞内カルシウムの量と比較する。陰性対照細胞での細胞内カルシウムの量と比較した場合の被験細胞での細胞内カルシウムの量の変化は、被験化合物が鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のモジュレーターであることを示すものである。好ましい実施形態の一部では、被験細胞がＣＨＯまたはＨＥＫとなる。好ましい実施形態の一部では、該当する細胞内部の色素が細胞内カルシウムと相互作用することによって生じた蛍光を測定するという測定法を用いることにより、細胞内カルシウムが検出される。一部の好ましい実施形態では、この方法はさらに、鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化し、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現する核酸配列を含有する組換え発現ベクターからなる陽性対照細胞を、被験化合物の非存在下および鱗翅目のカルシウムチャネル作動物質の存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、該当する陽性対照細胞での細胞内カルシウム量を検出することにより、陽性対照測定を行うというものである。一部の実施形態では、この方法はさらに、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現しない鱗翅目のカルシウムチャネル陰性細胞を、被験化合物の非存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させて、該当する鱗翅目のカルシウムチャネル陰性対照細胞に取り込まれたカルシウムの量を検出することによって、二番目のタイプの陰性対照測定を実施するか；および／または、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現しない鱗翅目のカルシウムチャネル陰性細胞を、被験化合物の非存在下および鱗翅目のカルシウムチャネル作動物質の存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させて、該当する鱗翅目のカルシウムチャネル陰性対照細胞に取り込まれたカルシウムの量を検出することによって、三番目のタイプの陰性対照測定を実施するかの、いずれかの段階からなっている。好ましい実施形態では、この方法で利用される鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質は、配列番号２または配列番号６、その突然変異体、そのフラグメントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有しており、これは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の群、その突然変異体、そのフラグメントからなる群から選択されたさらに別のサブユニットの一つまたは複数と組み合わされることがある。一部の実施形態では、鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化する核酸配列は、配列番号１または配列番号５で、補助的なサブユニットが存在する場合には、これは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７をコード化するものとなる。

一部の実施形態によると、鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のインヒビターを識別する方法は、鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化し、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現する核酸配列を含有する組換え発現ベクターからなる被験細胞を、被験化合物の存在下でカルシウムを含有する溶液および鱗翅目のカルシウムチャネル作動物質と接触させて、該当する被験細胞での細胞内カルシウムの量を検出することにより、検査測定法を実施するという段階から構成される。対照測定も、鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化し、鱗翅目のカルシウムチャネルを発現する核酸配列を含有する組換え発現ベクターからなる陰性対照細胞を、被験化合物の非存在下でカルシウムを含有する溶液および鱗翅目のカルシウムチャネル作動物質と接触させて、該当する陰性対照細胞での細胞内カルシウムの量を検出することにより実施される。被験細胞での細胞内カルシウムの量を、対照細胞での細胞内カルシウムの量と比較する。対照細胞での細胞内カルシウムの量と比較した場合の被験細胞での細胞内カルシウムの量の減少は、被験化合物が鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のインヒビターであることを示すものである。一部の好ましい実施形態では、被験細胞は、ＣＨＯまたはＨＥＫである。一部の好ましい実施形態では、細胞内カルシウムは、細胞内部の色素が細胞内カルシウムと相互作用することによって生じた蛍光を測定するという測定法を用いることによって検出される。一部の好ましい実施形態では、鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質は、配列番号２または配列番号６、その突然変異体、そのフラグメントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有しており、これは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の群、その突然変異体、そのフラグメントからなる群から選択されたさらに別のサブユニットの一つまたは複数と組み合わされることがある。一部の実施形態では、該当する鱗翅目のカルシウムチャネルをコード化する核酸配列は、配列番号１または配列番号５で、補助的なサブユニットが存在する場合には、これは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７をコード化するものとなる。

被験化合物は、化合物の一連の群またはライブラリの一部となることがあり、当業者には明らかなように、これは、多種多様な一連の群またはライブラリ、もしくは、対象となる一連の群またはライブラリとなることがある。こうしたスクリーニングに使用されるライブラリは、技術で知られている化学的過程、または、化学合成での従来の手段を組み合わせて用いることで、調製が可能である。
本発明の測定法およびスクリーニング法は、例えば、適切なロボットを使用した自動化法などで、中程度のスループットからハイスループットで実施されることがある。特に、この実施形態では、本発明の方法は、標準的な２４穴、９６穴、３８４穴、１５３６穴または３４５６穴プレートなどのマルチウェルプレートのウェル内で標的を被験化合物と接触させることによって実施されることがある。

通常は、本発明の測定法およびスクリーニング法では、各々の測定について、標的または宿主細胞または宿主生物を、単独の被験化合物のみと接触させる。しかし、例えば、該当する併用によって相乗効果が生ずるか否かを検討するなどで、標的を二つまたはそれ以上の被験化合物と、同時にまたは連続的に接触させることも、本発明の意図の範囲内である。

被験化合物が本発明のアミノ酸配列に対してモジュレーターおよび／またはインヒビターとして識別された場合には（本明細書上述のようなスクリーニングまたは測定によって）、それ自体が、本発明の関連アミノ酸、望ましくは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８、その突然変異体、そのフラグメント、さらに望ましくは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のモジュレーターおよび／またはインヒビターとして利用されたり（農芸化学、獣医学または薬学での利用を目的とした作用物質として）、または、例えば、溶解度、吸収性、バイオアベイラビリティー、毒性、安定性、持続性、環境への影響などの性質を改善するために、任意によりさらに最適化されることがある。当業者にとっては、例えば二番目の測定法（の一部）などとして、本発明の核酸配列、望ましくは、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７、アミノ酸配列、宿主細胞または宿主生物および方法が、最適化法などで、さらに利用される可能性があることは明白である。

本発明は、モジュレーターおよび／またはインヒビター（被験化合物、化合物または因子）が、標的の変調、阻害または標的との相互作用を行う（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）際の特定の方法または機序を、特に限定するものではない。例えば、モジュレーターおよび／またはインヒビターは、作動物質、拮抗物質、逆作動物質、部分作動物質、競合的インヒビター、非競合的インヒビター、補助因子、アロステリックインヒビターまたは標的に対するその他のアロステリック因子であることがあったり、別の蛋白質またはポリペプチド、受容体、もしくは、細胞の細胞小器官の一部のように、他の生物学的化合物への標的の結合を促進または低下させる化合物または因子であったりする。同様に、モジュレーターおよび／またはインヒビターは、（活性部位、アロステリック部位、結合ドメイン、もしくは、共有結合または水素結合により標的の別の部位で）標的と結合したり、標的の活性部位を（可逆的、不可逆的または競合的に）遮断および／または阻害したり、標的の結合ドメインを（可逆的、不可逆的または競合的に）遮断および／または阻害したり、標的の構造に影響または変更を与えたりすることがある。

同様に、被験化合物、モジュレーターおよび／またはインヒビターは、例えば、以下のようなものであることがある：
−標的の既知の基質の類縁体；
−２〜２０個、望ましくは３〜１５個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド；
−アンチセンスまたは二本鎖ＲＮＡ分子；
−蛋白質、ポリペプチド；
−補助因子または補助因子の類縁体。

被験化合物、モジュレーターおよび／またはインヒビターが、参照化合物または因子であることもあり、これは、標的を変調、阻害したり、標的と相互作用することが知られている化合物（標的に対する既知の基質またはインヒビターなど）であったり、標的が属する一般的なクラスの他のものを、変調、阻害したり、これらと相互作用することが一般的に知られている化合物または因子（該当するクラスの既知の基質またはインヒビターなど）であったりすることがある。

しかし、被験化合物、モジュレーターおよび／またはインヒビターは小分子であることが望ましく、これの意味することは、分子量が１５００未満、望ましくは１０００未満のものということである。これは例えば、有機分子、無機分子または有機金属分子などであり、可溶性塩類などの適切な塩の形態をとっていることもある。「小分子」という語は、（総）分子量が上述の範囲である限りは、複合体、キレートおよび同様の分子を網羅するものでもある。

すでに上で述べたように、本発明のアミノ酸配列、望ましくは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のモジュレーターおよび／またはインヒビターとして識別または開発されている化合物または因子（およびこれらの化合物の前駆物質）は、農芸化学、獣医学または薬学での成分調製など、農芸化学、獣医学または薬学の領域で、作用物質として有用なものとなる可能性があり、こうしたモジュレーターとこれらを含有する成分はどちらも、本発明の別の態様である。

例えば、農芸化学の領域では、本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターは、有害生物（の侵襲）の予防または制御などで、接触剤および植物浸透剤の双方として、殺虫剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、殺蠕虫剤、殺ダニ剤またはその他のタイプの農薬もしくは殺生物剤として利用されることがある。同様に、モジュレーターおよび／またはインヒビターは、例えば、作物保護剤、家庭内用殺虫剤、または、有害生物によって生ずる損傷を予防または処理（種子、木材もしくは、貯蔵した作物または果物の保護など）するための薬剤として利用されることがある。本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターは、殺虫剤として利用されることが好ましい。こうした適用では、企図する最終的な使用法に適した処方品とするために、本発明の一つまたは複数のモジュレーターおよび／またはインヒビターが、一つまたは複数の農学的に許容されている担体、アジュバントまたは希釈剤と−さらに、それ自体で（例えば）植物保護剤（作用スペクトルを広げ、任意により相乗作用を生ずるため）、除草剤、肥料または植物成長調整剤としての活性を有する一つまたは複数の別の化合物も任意により併用して−適切に組み合わせられることがある。こうした処方品は、例えば、溶液、乳剤、散布剤、濃縮剤、エアロゾル、スプレイ、粉末、流動物、粒子、顆粒、錠剤、燻蒸剤、餌もしくはその他の適切な固体、半固体または液体といった処方品の形であることがあり、さらに、任意により、適切な溶剤、乳化剤、安定剤、界面活性剤、消泡剤、湿潤剤、展着剤、固着剤、誘引剤または（餌については）食物成分を含有することもある。”Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、ＡＣＳ発行物（１９６９）および”Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”，Ｗａｄｅ ｖａｎ Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇ Ｅｄ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ発行物（１９７３）などの標準的なマニュアルで言及されている。

こうした成分は一般的に、本発明の一つまたは複数のモジュレーターおよび／またはインヒビターを適切な含量で含有しており、これは一般的に、総成分の重量の０．１〜９９％、特に１０〜５０％範囲である。

本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターならびに成分は、特に、例えば、以下の目の望ましくないまたは有害な昆虫（成体および、幼虫などの未成熟体）を駆除または制御するための殺虫剤として有用である：
−Ｐｉｓｓｏｄｅｓ ｓｔｒｏｂｉ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉおよびＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａなどの甲虫目；
−Ｒｈａｇｏｌｅｔｉｓ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ，Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒおよびＬｉｒｉｏｍｙｚａ ｈｕｉｄｏｂｒｅｎｓｉｓなどの双翅目；
−Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ ｔａｅｄａｅ ｔｓｕｇａｅ、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓおよびＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｗａｇｎｅｒｉなどの膜翅目；
−Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ，Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ（Ｐａｌｉｓｏｔ ｄｅ ｂｅａｕｖｏｉｓ）およびＡｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅなどの半翅目；
−Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉなどの同翅亜目およびアブラムシ；ならびに
−オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｅｒｅｓｃｅｎｓ）などの鱗翅目。

有害または望ましくない生物を制御するために使用する際には、これらの生物が、生物の制御（死滅または麻痺など）に適した量で、本発明のモジュレーター、インヒビターまたは成分に直接接触することになる。こうした量は、当業者により（制御対象となる生物種に対して化合物を検討することにより）容易に決定することが可能で、通常は、約１０〜５００ｇ／ｈａ程度、特に１００〜２５０ｇ／ｈａとなる。

本発明のモジュレーター、インヒビターまたは成分は、系統的に適用されることもあり（制御対象となる生物の環境または土壌中などに）、植物、種子、果物などを保護するために、やはり、当業者によって決定することの可能な適切な量で、適用されることもある。本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターは、例えば、こうした組成で通常に使用される他の殺虫化合物と置き換えるために、−添加剤などとして−それ自体が知られている成分に組み込まれることがある。

具体的な実施形態の一つでは、本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターならびに成分は、農芸化学、獣医学またはヒトの健康の領域で、寄生虫、特に以下のような寄生性節足動物、線形動物および蠕虫によって生ずる感染症または損傷または不快感を予防または治療するために使用されることがある：
−マダニ、ダニ、ノミ、シラミ、サシバエ、ツノサシバエ、アオバエおよび、その他、咬み傷を生じたり吸血性の外部寄生虫などの、外寄生性節足動物；
−蠕虫などの内部寄生虫；
さらに、こうした寄生虫によって引き起こされたり伝播する疾患の予防または治療にも使用される。こうした目的のため、本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターは、例えば、錠剤、経口溶液または乳剤、注射用溶液または乳剤、ローション、エアロゾル、スプレイ、粉末、浸漬剤または濃縮剤として処方されることがある。

動物およびヒトの健康の領域では、本発明のモジュレーター、インヒビターおよび成分は、本発明のアミノ酸配列が標的として関与する疾患または障害の予防または治療にも使用されることがある。この目的のためには、本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターは、当業者にとっては明白な、薬学または獣医学での利用が許容されている一つまたは複数の添加剤、担体または希釈剤と共に処方されることがある。

このように、さらに別の態様で、本発明は、本明細書上述のような、農芸化学、獣医学または薬学での利用を目的とした成分の調製での本発明のモジュレーターおよび／またはインヒビターの利用に関連している。本発明は、やはり上述のように、有害生物の制御および有害生物によって引き起こされる感染症または損傷の予防での、本発明のモジュレーター、インヒビターおよび成分の利用に関連する。

本発明についてはここで、以下の非限定的な実施例により、さらに例証する。
（実施例）

実施例１−ｃＤＮＡライブラリの構成および配列データベース

全長クローンの豊富なｃＤＮＡライブラリが、（ａ）混合ライフステージのワタアブラムシ（ワタアブラムシｃＤＮＡライブラリ）および、（ｂ）虫齢の高いＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｅｓの幼虫から切断した頭部（ＴＢＷ頭部ｃＤＮＡライブラリ）から精製された、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カルフォルニア州カールスバッド）によって構築された。これらのライブラリはいずれも、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１で構成され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ＴｏｎＡ）にトランスフォームされた。これらのライブラリは、さらに増幅されることなく、グリセロール培養物として、−８０℃で貯蔵された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより、ワタアブラムシｃＤＮＡライブラリの一部が増幅され、標準化されて、３８４穴プレートに並べられた。並べられたクローンについては、クローン化されたｃＤＮＡの５’末端および３’末端に隣接するベクタープライマーを用いて、自動化配列決定分析が行われた（Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、マサチューセッツ州ウォルサム）。配列読み取り結果は、質およびベクターの混入についてトリミングが行われ、コンティグに構築されて、ＢＬＡＳＴコンパチブルデータベースに入力された。検索ツールのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）スートおよびこれらのツールの使用法ならびに、ＢＬＡＳＴコンパチブルデータベースへのアクセスは、米国立予防衛生研究所（メリーランド州ベセズダ）の全米バイオテクノロジー情報センターから行うことができる。

さらに、虫齢の高いＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｅｓの幼虫の腹側神経索および頭部から分離したポリ（Ａ）含有ＲＮＡより、ｃＤＮＡライブラリが構成された（ＴＢＷ神経索ライブラリ）。約１９５個の神経索および頭部を、第５虫齢初期のＴＢＷ幼虫から切断採取し、ドライアイス上で急速に冷凍した。この組織は、室温にて３ｍＬのＴＲＩＺＯＬ^ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でホモジナイズし、製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質は、ＵＶ吸収分光光度法（３２０ｎｍ〜２２０ｎｍ）および、少量のグリコシル化試料の１×ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ^ＴＭ−Ｇｌｙ緩衝液を含有する１％アガロースゲルでの電気泳動により確認した（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡは、製造業者の記述に従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）ｍＲＮＡ分離キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、アフィニティクロマトグラフィーにより全ＲＮＡから選択した。（非特許文献３０）の方法の改良法により、ｃＤＮＡを合成した。要約すると、６．２μｇのポリ（Ａ）含有ＲＮＡを、１１．２μｌの８０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび４００ｐｍｏｌのＳａｃｄＴプライマー（表Ｉ）と混合し、全量を２４μｌとした。プライマー／ＲＮＡ混合物は、サーモサイクラーで６５℃にて１０分加熱した後に４５℃まで冷却し、やはり４５℃に予温した７６μｌの合成緩衝液と混合した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成反応の最終組成は：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇ_２Ｃｌ、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．６ｍＭのｄＧＴＰ、０．６ｍＭのｄＡＴＰ、０．６ｍＭのＴＴＰ、０．６ｍＭの５−メチル−ｄＣＴＰ、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２０００単位／ｍｌのＲＮａｓｅＯＵＴ^ＴＭリボヌクレアーゼインヒビター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および２０，０００単位／ｍｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であった。反応は、４５℃での２分間のインキュベート、２分間をかけての３５℃への冷却、３５度での２分間のインキュベート、５０℃への上昇と５分間のインキュベート、最終的に５５℃への上昇と６０分間のインキュベートによるものであった。ファーストストランド反応は、ＥＤＴＡを１０ｍＭへ、ナトリウムＮ−ラウロイルサルコシンを０．１％（ｗ／ｖ）、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を０．２ｍｇ／ｍｌへと加えることにより、終了させた。混合物を４５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出した。水相を除去し、１００μｌの５ＭのＮＨ_４ＯＡｃと５００μｌのエタノールを加えて、ｃＤＮＡを−２０度で６０分間沈降させた。その後、遠心分離によりｃＤＮＡを採集し、７０％エタノールで１回洗浄した後、５００μｌの０．１×ＴＥ（１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解して、氷浴上で２００μｌのセカンドストランド合成緩衝液とあわせた。セカンドストランド反応の最終組成は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１３０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．６ｍＭのｄＡＴＰ、０．６ｍＭのｄＧＴＰ、０．６ｍＭのｄＣＴＰ、０．６ｍＭのＴＴＰ、１０Ｍｍのｂ−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、３単位のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、２．５単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および２５単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であった。セカンドストランド合成は、１５℃にて１５０分間行った。酵素混合物は７０℃での１０分間の加熱により不活化し、その後、氷浴上に放置した。１μｌ（５単位）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、１５℃での１５分間のインキュベートにより、二本鎖ｃＤＮＡを平滑末端とした。方向性のクローニングを促進するために、平滑末端としたｃＤＮＡに二本鎖Ｘｈｏアダプターを加え、その後、ファーストストランド合成のためのプライマーで独特の切断を行うＳａｃＩによる切断によって、３’末端から除去した。アダプターは、それぞれ２ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドＸｈｏＡｄ４とＸｈｏＡｄ５（表Ｉ）を４０μｌの２０ｍＭＮａＣｌであわせ、混合物を７０℃で３分間加熱してから、１０分間をかけて２５℃にゆっくりと冷却することによって、形成させた。アニールしたＸｈｏアダプター（４５０ｐｍｏｌ）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび６００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を含有する３０μｌの反応溶液中で、１．７μｇの二本鎖ｄＤＮＡと８℃にて一晩結合させた。上述の、プロテアーゼＫによる切断、フェノール：クロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈降で再度ｃＤＮＡを精製した。その後、１μｇのｃＤＮＡあたり２５単位の酵素の割合で、ＳａｃＩによりｃＤＮＡを切断し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよび０．１ＭのＮａＣｌで平衡化した２ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−２Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）ゲル濾過カラムでサイズ分画を行った。ピーク分画（７３０ｎｇのｃＤＮＡ）をプールし、エタノール沈降法によって濃縮して、１０μｌの０．１ＸＴＥ（ｐＨ８．０）に再溶解した。クローニングのために、５７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１１．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．１ｍＭのＡＴＰ、１１．４ｍＭのＤＴＴおよび２８μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する４．４μｌの溶液中で、５０ｎｇのｃＤＮＡを、バクテリオファージλｇｔＧｒｅｅｎ１Ｓから調製した、５００ｎｇのＸｈｏＩ／ＳａｃＩファージアームとあわせた（ｃＤＮＡとベクターの分子比は２：１）。０．３μｌ（３単位）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、混合液を３７℃で１５分間インキュベートして、ｃＤＮＡ上のＸｈｏアダプターをリン酸化した。その後、０．３μｌ（１２０単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えてｃＤＮＡをベクターと結合させ、混合液を１５℃にて一晩インキュベートした。バクテリオファージλｇｔＧｒｅｅｎ１Ｓはλｇｔ１１からの派生物であり（非特許文献３１）、これでは、（ａ）野生型バクテリオファージλゲノムのＳａｌＩ−Ｘｈｏフラグメント架橋座標３３２４５−３３４４９が除去され、（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含有する独特のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントが除去されて、直線型のｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）プラスミドに置き換えられている（図１Ａ）。ｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）の派生物であり（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）、これでは、（ａ）ｆ１の起点とアンピシリン耐性遺伝子とのあいだにｐＺＬ１のｉｎｃＡ遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挿入され、（ｂ）ｃｏｌＥ１の起点が除去されて、ｐＡＣＹＣ１８４の低コピー数のｐ１５Ａの起点に置き換えられ（ＡＴＣＣ数は３７０３３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス）、（ｃ）タンデム反復配列をしている二つのｌｏｘＰ部位（非特許文献３２）が独特のＭｆｅＩにより分離されて、ＰｍｅＩ切断酵素認識部位がｐ１５Ａの起点とアンピシリン耐性遺伝子とのあいだに挿入されている。ＭｆｅＩおよびＰｍｅＩによるｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）の直線化により、λｇｔＧｒｅｅｎ１Ｓに挿入される形のプラスミドが産生される（図１Ｂ）。製造業者によって記述されているように、結合反応の一部は、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄパッキングエキス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでファージにパッケージした。組換えプラスミドの調製には、パッケージしたファージをＥ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ（Ｚｉｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）株上に撒き込み、アンピシリンまたはカルベニシリンのいずれかを含有するＬＢ平板上での増殖により、コロニーを選択した。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ（Ｚｉｐ）株はｃｒｅリコンビナーゼを発現し、バクテリオファージλの複製を抑制するため、ｃｒｅを介する組換えによって、プロプラスミドに隣接するｌｏｘＰ部位で、ファージベクターからプラスミドを切除し、これを独自に複製するプラスミドとして確立することができる。

ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３０３巻、１９−４４ページ（１９９９）） Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８０巻、１１９４−１１９８ページ（１９８３） Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０巻、４６７−８６ページ（１９８１）

実施例２−オオタバコガ（「ＴＢＷ」）電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニット配列の識別
材料および方法
ＴＢＷ頭部ポリＡ ＲＮＡの分離。０．１％のジエチルピロカルボネート水溶液（「ＤＥＰＣ」；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を３７℃にて約１６時間インキュベートした後、オートクレーブで６０分間処理した。ガラス器具はすべて、２５０℃で４時間加熱し、ボトルの蓋はすべて、０．１％のＤＥＰＣ溶液で浸漬した。Ｂｒａｕｎホモジナイザーのマイクロプローブ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ペンシルバニア州アレンタウン）は５０ｍｌの１００％エタノール（「ＥｔＯＨ」）に浸漬した後、２５ｍｌのＲＮＡｚｏｌＢ（ＣＩＮＮＡ−ＢＩＯＴＥＣＸ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、テキサス州ヒューストンから入手可能な塩酸グアニジニウム標品）で稼動させた。ＴＢＷの頭部は、第４虫齢のオオタバコガ幼虫から切断採取し、氷浴上の風袋を測定した遠心管中に入れた。約０．５ｇのＴＢＷ頭部材料を入手した後、ＴＢＷ頭部は使用時まで−７０℃にて凍結した。その後、頭部を４ｍｌのＴＲＩＺＯＬ^ＴＭ試薬に入れ、室温にて最大速度で３０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズが終了した時点で、２ｍｌのクロロホルムを加え、生じた混合液をＳＳ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌ．Ｐ．、ノースカロライナ州アッシュビル）中で室温にて１２０００ｇで１５分間遠心分離した。この手順の完了後、上部水層を１５ｍｌの新しいコニカルチューブに入れ、等量のイソプロパノールを加えた。生じた混合液をＳＳ３４ローター中で室温にて１２０００ｇで１０分間遠心分離した。その後、生じた沈塊を１０ｍｌの７５％エタノール水溶液で洗浄し、ＳＳ３４ローター中で室温にて７５００ｇで５分間遠心分離した。上清を流去し、生じた沈殿塊を室温で５分間、風乾させた。その後、生じた沈殿塊を、１ｍｌの上述の０．１％ＤＥＰＣ溶液に溶解した。全ＲＮＡの濃度は、ＵＶ分光法で測定した（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＧｅｎｅＱｕａｎｔ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）。５００μｇの全ＲＮＡを用い、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ^ＴＭ ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のプロトコルに従って、ポリＡ ｍＲＮＡを分離した。ポリＡ ｍＲＮＡの濃度は、ＵＶ分光法により測定した。ポリＡ ｍＲＮＡ溶液は、その後の利用のために、−７０℃で保存した。

ファーストストランドｃＤＮＡの合成。逆転写は、１．０μｇのテンプレートＲＮＡに鳥類骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えることによって開始した。逆転写反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅキットに含まれている以下の試薬も関与した：４μｌの５Ｘ逆転写緩衝液、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター、１μｌの１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの８０ｍＭリン酸ナトリウムおよび、ランダムプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたは遺伝子特異的プライマーのうちのいずれか。５’および３’でのＲＡＣＥ反応では、製造業者の指示に従い、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーまたは遺伝子特異的プライマーにより、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ｍＲＮＡの逆転写を行った。反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）上で行い、４２℃にて６０分間維持した。その後、９５℃にて５分間加熱した後に４℃で５分間放置することによって、ＡＭＶ ＲＴを不活化した。Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ^ＴＭ ＲＬＭ−ＲＡＣＥキットを用いて、製造業者の指示に従って、５’−ＲＡＣＥ反応を行った。

ＰＣＲによる増幅。製造業者の指示に従い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で供給された緩衝液とｄＮＴＰを用いて、５０μｌのｃＤＮＡ反応液を作製した。変性プライマーを利用した増幅では通常、５０〜６０℃の範囲のアニーリング温度を利用し、アイソフォーム特異的プライマーを用いるものでは６５〜７０℃の範囲のアニーリング温度を利用した。３’および５’ＲＡＣＥ反応は、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により供給されたプライマーとプロトコルを利用して、製造業者の指示に従って行った。生じたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法により性質検討した。上述の方法で二次的な「ネステッド」増幅を行った後、ＮｕＳｉｅｖｅ（登録商標）ゲル（ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．、ペンシルバニア州フィラデルフィア）からバンドを切り出し、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、製造業者の指示に従って精製した。

プライマーの合成およびデザイン。オリゴヌクレオチドは、Ｓｅｑ Ｗｒｉｇｈｔ Ｉｎｃ．（テキサス州ヒューストン）が合成し、使用前に蒸留水で溶解する凍結乾燥品として提供された。ＰＣＲプライマーおよびプローブがデザインされ、ＩｎｆｏｒＭａｘ， Ｉｎｃ．（メリーランド州ベセズダ）からのＶｅｃｔｏｒＮＴＩ ｓｕｉｔｅ ６．０ソフトウェアと、Ｒｏｓｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６巻、１６２８−１６３５ページ（１９９８））からのＣｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（「ＣＯＤＥＨＯＰ」）を用いて、アニーリング温度が推定された。

サブクローニングおよび配列決定。精製ＰＣＲフラグメントは、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、製造業者の指示に従って、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにサブクローンされた。生じたｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの配列を決定し、その後、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ ｓｕｉｔｅ６．０ソフトウェアを用いて解析された。

プライマー。使用したプライマーは、表ＩＩに示すようなものであった：

上述のオリゴヌクレオチドの中で、変性プライマーは、Ｎ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）、Ｈ（Ａ、ＣまたはＴ）、Ｓ（ＣまたはＧ）、Ｙ（ＣまたはＴ）、Ｗ（ＡまたはＴ）、Ｄ（Ａ、ＧまたはＴ）またはＲ（ＡまたはＧ）の記号の入った位置に、単量体の統計学的混合物を組み込んでいる［ＩＵＰＡＣ総会と一致］。

オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）のα１サブユニット配列の増幅
オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）のα１サブユニットについての増幅の記述はいずれも、配列番号１で示された配列位置を指定している。

ＲＴ−ＰＣＲ反応では、プライマー１および２は、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の配列での３６７４位から４１１３位のヌクレオチドからのフラグメントを増幅するために使用され、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。

Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓの配列は、標準化していないＴＢＷ ｃＤＮＡライブラリプラスミドＤＮＡを用いたＰＣＲにより（実施例１）、プライマー３および５を用いて、上流方向に伸展され、その後、プライマー４および５を用いてネステッドＰＣＲが行われた。生じたＰＣＲ産物からは、２６２１位から３７７０位のヌクレオチドからの配列情報が得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。プライマー５は、ライブラリベクター配列からのＳＰ６である。
Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓの配列は、標準化していないＴＢＷ ｃＤＮＡライブラリプラスミドＤＮＡを用いたＰＣＲにより（実施例１）、プライマー６および８を用いて、下流方向に伸展され、その後、プライマー７および８を用いてネステッドＰＣＲが行われた。生じたＰＣＲ産物からは、４０２９位から５０４７位のヌクレオチドからの配列情報が得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。プライマー８は、ライブラリベクター配列からのＴ７である。

プライマー９および１１を用いての３’−ＲＡＣＥによる３’−末端ｃＤＮＡの回復と、プライマー１０および１２を用いてのその後のネステッドＰＣＲの試みでは、驚くべきことに、生じたＰＣＲ産物から、３’−末端ｃＤＮＡ配列の代わりに、１５８９位から２１４９位のヌクレオチドからの配列情報が得られた。このＰＣＲ産物のクローン化およびサブクローン化が行われた。その後、２１４９位から２６２１位のヌクレオチドからのＨｅｌｉｏｔｈｉｓ配列が、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのランダム六量体を用いた逆転写により得られ、ついで、プライマー１３および１５を用いてタッチダウンＰＣＲが行われた。その後、生じたｃＤＮＡは、ネステッドプライマー１４および１６を用いて増幅され、２０５６位から２６８５位のヌクレオチドからのアンプリマーが得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。

Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓの配列は、さらに、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットからのランダム六量体を用いた逆転写によって上流方向に伸展され、ついで、プライマー１７および１８を用いたタッチダウンＰＣＲが行われた。その後、生じたｃＤＮＡは、ネステッドプライマー１７および１９を用いて増幅された。生じたＰＣＲ産物からは、５２４位から１６４５位のヌクレオチドからの配列情報が得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。
Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓの配列は、さらに、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットからのランダム六量体を用いた逆転写によって上流方向に伸展され、ついで、プライマー１１および２０を用いたタッチダウンＰＣＲが行われた。ついで、この反応で生じたｃＤＮＡを、ネステッドプライマー１２および２１を用いて増幅した。生じたＰＣＲ産物からは、１８１位から６１３位のヌクレオチドからの配列情報が得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。

その後、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ^ＴＭ ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）からのランダム六量体を用いて、逆転写によりＨｅｌｉｏｔｈｉｓの配列の５’−末端ｃＤＮＡが回復され、プライマー２２および２４を用いてタッチダウンＰＣＲが行われた。この反応によって生じたｃＤＮＡは、ネステッドプライマー２３および２５を用いて増幅した。生じたＰＣＲ産物からは、１位から２５２位のヌクレオチドからの配列情報が得られ、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。

全長キメラα１サブユニットの構成
重複しているＤＮＡセグメントで制限酵素認識部位を介して上述ＰＣＲフラグメントをつなぎあわせることにより、配列番号１についての全長クローンが構成された。翻訳停止コード化ンを加えるために、結合されたクローンをＮｏｔＩで切断し、その後、ワタアブラムシライブラリ（実施例１）から得られた配列番号３に列挙されている１位から４２９位のヌクレオチドからの停止コード化ンを有するアブラムシα１遺伝子の３’−末端を融合させて、発現についての全長キメラクローンを作製した。キメラＤＮＡおよび蛋白質配列は、配列番号５および６のように示されている。全長キメラα１サブユニットは、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）に挿入された。

実施例３−オオタバコガ（「ＴＢＷ」）電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット配列の識別
材料および方法
実施例２と同様。

プライマー。使用したプライマーは、表ＩＩＩに示すようなものであった：

上述のオリゴヌクレオチドの中で、変性プライマーは、Ｎ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）、Ｈ（Ａ、ＣまたはＴ）、Ｓ（ＣまたはＧ）、Ｙ（ＣまたはＴ）、Ｗ（ＡまたはＴ）、Ｄ（Ａ、ＧまたはＴ）またはＲ（ＡまたはＧ）の記号の入った位置に、単量体の統計学的混合物を組み込んでいる［ＩＵＰＡＣ総会と一致］。

オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）のβサブユニット配列の増幅
オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）についての増幅の記述はいずれも、配列番号７で示された配列位置を指定している。

ＲＴ−ＰＣＲ反応では、プライマー１および２は、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の配列での８７４位から１１４０位のヌクレオチドからのフラグメントを増幅するために使用され、これについてのクローン化およびサブクローン化が行われた。

このフラグメントから、プライマー３および４ならびに、ＲｅｃＡｃｔｉｖｅ^ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、カリフォルニア州カールズバッド）からのビオチン−ｄＮＴＰ混合物を含有するＰＣＲ反応によって、ビオチル化プローブ（９００位から１１１３位のヌクレオチドより）が合成された。このビオチル化プローブはその後、ゲル精製し、標準化されていないＴＢＷ ｃＤＮＡライブラリ（実施例１）からｒｅｃＡを介する遺伝子選択により、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社（カリフォルニア州カールズバッド）のＲｅｃＡｃｔｉｖｅ^ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットにより、全長ＴＢＷ βサブユニットｃＤＮＡをクローンするために利用された。３種類の全長クローンの配列が決定され、これは、配列番号７、８および９で示されている。配列番号７、８および９からそれぞれ翻訳された蛋白質配列に対応する配列番号１０、１１および１２に示すように、複数のアイソフォームが認められた。これらのｃＤＮＡは最初に発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）でクローン化され、発現ベクターへの追加サブクローニングを必要としなかった。

実施例４−ワタアブラムシ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットの配列の識別

蛋白質配列ＣＧ１２２９５−ＰＢを質問内容として用いて、ワタアブラムシコンティグデータベースのＴＢＬＡＳＴＮ検索を実施することにより（実施例１）、ワタアブラムシカルシウムチャネルα２δの配列が識別された。ＣＧ１２２９５−ＰＢは、遺伝子ＣＧ１２２９５について予測された翻訳産物であり、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゲノムで識別された３種類のカルシウムチャネルα２δ遺伝子のうちの一つである。ワタアブラムシα２δコンティグそれぞれを用いたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ蛋白質データベースのバージョン３のＢＬＡＳＴＸによる相互検索から、明らかにＣＧ１２２９５のワタアブラムシオルソログに属するコンティグの一つ（ＣＡｇ１２００１、１４８９ｂｐ）が識別された。

コンティグＣＡｇ１２００１に対応する全長ｃＤＮＡが、ＲｅｃＡｃｔｉｖｅ^ＴＭキットおよびＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社（カリフォルニア州カールズバッド）からのプロトコルを用いて、ＲｅｃＡを介する遺伝子増強により、ワタアブラムシｃＤＮＡライブラリから分離された。要約すると、約１０^６個の一次トランスフォーマントからなる一定量のワタアブラムシｃＤＮＡライブラリから、プラスミドＤＮＡが調製された。表示時の偏りは、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加した１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで細胞を３０℃にて１６時間増殖させることにより、最小限にした。プローブ合成のテンプレートは、ＣＡｇ１２００１特異的なプライマーであるＡｐｈ０４０９８４Ｕ５３１およびＡｐｈ０４０９８４Ｌ９５９（表ＩＶ）を用いたＰＣＲにより、ライブラリＤＮＡから合成し、Ｏｌｉｇｏ ６プライマー解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，コロラド州カスケード）を用いて命名した。ＰＣＲ反応では、最終容積１５μｌ中に、１００ｎｇのライブラリＤＮＡ、５ｐｍｏｌのＡｐｈ０４０９８４Ｕ５３１およびＡｐｈ０４０９８４Ｌ９５９プライマー、０．３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合液（それぞれ１０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）、１．５μｌの１０×Ｔｉｔａｎｉｕｍ^ＴＭ Ｔａｑ緩衝液、０．３μｌのＴｉｔａｎｉｕｍ^ＴＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）が含まれていた。反応では、９４℃での２分間の加熱の後に、９４℃での３０秒間の加熱変性、５５℃での３０秒間のアニーリングおよび、７２℃での１．５分間のプライマー伸展を１サイクルとして、３５サイクルのＤＮＡ合成を行った。反応産物は、低融点アガロースゲル（ＳｅａｌＰｌａｑｕｅ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）アガロース、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、メイン州ロックランド）上で分離し、ゲルから４５０ｂｐと予測されるバンドを抽出して、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）による蛍光染色により定量した。精製フラグメントをテンプレートとして用いて、１００ｐｇのテンプレートフラグメント、１０ｐｍｏｌのＡｐｈ０４０９８４Ｕ５３１およびＡｐｈ０４０９８４Ｌ９５９プライマー、７μｌのビオチン−ｄＮＴＰ混合液（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、５μｌの１０×Ｔｉｔａｎｉｕｍ^ＴＭ Ｔａｑ緩衝液および１μｌのＴｉｔａｎｉｕｍ^ＴＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌのＰＣＲ反応液中で、ビオチル化ＤＮＡの合成を行った。ビオチル化プローブは、１％の低融点アガロースゲル上で精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）による蛍光染色によって定量した。ついで、５０ｎｇのプローブフラグメントを用いて、ＲｅｃＡｃｔｉｖｅ^ＴＭキットにより提供されたプロトコルを利用して、５μｇのワタアブラムシライブラリＤＮＡからα２δクローンを選択した。最初の選択により約１０^５個のコロニーがプールされ、プラスミドＤＮＡが調製された。プールＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析から、標的とするα２δ配列が開始時のライブラリと比較して約６０倍に増大していることが示された。単独コロニースクリーニングで十分な量を得るために、５０ｎｇのビオチル化プローブを用いて、最初に得られたプラスミドＤＮＡのうちの３μｇを再度選択した。２回目の選択で得られたＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞をトランスフォームした後、ビオチル化プローブ合成で使用した領域に隣接するＣＡｇ１２００１特異的プライマー（Ａｐｈ０４０９８４Ｕ４５１およびＡｐｈ０４０９８４Ｌ１１０４プライマー、）を用いたＰＣＲにより、個々のコロニーのスクリーニングを行った。２回の選択の後、スクリーニングされたコロニー３６個のうち３４個がＣＡｇ１２００１配列に対して陽性だった。各々の陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩによる切断によって、ｃＤＮＡインサートの大きさを決定した。一つのクローン（ＲＡ１．１１）からのｃＤＮＡインサートは、完全に配列決定されている。ＲＡ１．１１は、４３８３ｂｐのインサート（配列番号１３）を有しており、１２４５個のアミノ酸オープンリーディングフレームを含み（配列番号１４）、これは、ＣＧ１２２９５−ＰＢと、１２３９残基にわたって４１％のアミノ酸配列を共有していた。さらに別の１５個の全長クローンについての制限酵素解析および部分配列決定から、少なくともｃＤＮＡの二つの異なる領域が関与した複雑な別のスプライシングのパターンが示された。別のスプライシングのパターンの一つでは、配列番号１４の８０５−８１５位の残基によって示される１１個のアミノ酸セグメントでの相違の存在が関与している。このセグメントは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＣＧ１２２９５−ＰＢ α２δ蛋白質配列には存在しないが、配列番号１６および１８に示されるＴＢＷ α２δ蛋白質配列では、同一の位置に局在しており、存在状態の異なる１１個のアミノ酸配列で部分的な相同性を有している（実施例５など）。

実施例５−オオタバコガ（「ＴＢＷ」）電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニット配列の識別

最初に、ＴＢＷ頭部ｃＤＮＡライブラリ（実施例１）から、以下の３種類の昆虫α２δオルソログで保存された蛋白質配列ブロックよりデザインされたコンセンサス変性ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯＰプライマー）を用いたＰＣＲにより、ＴＢＷ α２δ ＣＧ１２２９５オルソログの５’末端から得られたフラグメントを合成した：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからのＣＧ１２２９５−ＰＢ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅからのＥＮＳＡＮＧＰ００００００２１２１８および、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）からのＲＡ１．１１（配列番号１４、実施例４）。Ｂｌｏｃｋ Ｍａｋｅｒ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ． ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、６５６５−６５７２ページ（１９９１））を用いてこれら３種類の配列で保存された蛋白質ブロックのデータベースを構築し、ＣＯＤＥＨＯＰプライマーデザインプログラムの入力値として使用した（Ｒｏｓｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６巻、１６２８−１６３５ページ（１９９８））。変性正方向プライマーのＨｖＣａＡ２Ｄ１Ｆ（表Ｖ）は、配列番号８１の５’側でもっとも保存されている蛋白質ブロックのアミノ酸配列ＶＱＴＷＡＥＫＬから得られ、一方、変性逆方向プライマーのＨｖＣａＡ２Ｄ１Ｒ（表Ｖ）は、配列番号８２でＮ末端から蛋白質側方向へのおおむね１／３の位置に局在する保存配列ＣＮＱＡＩＭＩＶＳの相補鎖から得られた。ＴＢＷ頭部ｃＤＮＡライブラリ（実施例１）から分離された１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いてタッチダウンＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により９００ｂｐのフラグメントを分離して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。ＤＮＡ配列解析から、バンドはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ＣＧ１２２９５のＴＢＷオルソログに由来するものであることが確認された。この９００ｂｐのフラグメントの配列から、２種類の非変性遺伝子特異的プライマー（ＨｖＣａＡ２ＤＵ３８８およびＨｖＣａＡ２ＤＬ７７５、表Ｖ）をデザインし、ＰＣＲ反応のアニーリング温度を５５℃ではなく６２℃とした以外は、実施例４に記載されているのと同様にして、このプライマーを用いてビオチン化プローブを調製した。このビオチン化プローブは、ＴＢＷ神経索ライブラリからの５μｇのプラスミドＤＮＡから開始した、２回のｒｅｃＡを介した遺伝子増幅（実施例４など）で用いた。２回目の選択後にＰＣＲの検討対象となった２４個のコロニーのうち３個は、ＴＢＷ α２δ配列について陽性であった。これら３つのプラスミドはいずれも、〜５ｋｂのインサートを含有していた。クローンのうちの二つ（クローン２およびクローン７）は、全体についての配列決定が行われた。クローン２（５０２８ｂｐ、配列番号１５）は、１２７１個のアミノ酸（配列番号１６）によるオープンリーディングフレームを有しており、クローン７（４８９２ｂｐ、配列番号１７）は、１２５８個のアミノ酸（配列番号１８）によるオープンリーディングフレーム蛋白質を有していた。クローン２に存在する５’ＵＴＲセグメントは、クローン７で認められたものに比べて９８ｂｐ長かったが、二つの５’ＵＴＲ配列はその他の点では同一である。しかし、二つのｃＤＮＡのコード化領域で６９個の単独ヌクレオチドに多型性が存在し、３’ＵＴＲには少数の挿入／欠失が存在することから、二つのクローンは、ライブラリの構築に使用した非近交系ＴＢＷ集団で、異なる対立遺伝子に由来すると思われる。さらに、クローン２には、クローン７と比較した場合、コード化領域に以下の二つの小さな挿入を含有している：４９０−４１０位の残基でのアミノ酸２個の挿入（ＶＫ）および、８４２−８５２位の残基でのアミノ酸１１個の挿入（ＰＬＴＫＶＩＧＬＬＰＲ、配列番号８３）。コード化領域には多数の単独ヌクレオチドの多型性が含まれているが、蛋白質配列の相違を引き起こすのはこの二つのみであり、どちらの変化も、保存的なアミノ酸置換となっている。

実施例６−アフリカツメガエル卵母細胞でのオオタバコガ（「ＴＢＷ」）電位依存性カルシウムチャネルの機能性の発現
材料および方法
ポリ（Ａ）末端を有するキャップ構造ｍＲＮＡの構築。ｐＣＤＮＡ３．１でのキメラα１サブユニットは、ＮｓｉＩにより直線状にした；ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１ １でのＴＢＷ βサブユニットは、ＤｒｄＩにより直線状にした；ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１のアブラムシα２δは、ＮｏｔＩにより直線状にした；ｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）のＴＢＷ□２□は、ＮｈｅＩにより直線状にした。ついで、直線状にしたＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出と、エタノール沈降により精製した。このＤＮＡを用い、Ａｍｂｉｏｎ社からのｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ^ＴＭ高収量キャップ構造ｍＲＮＡ転写キットのマニュアルに従って、キャップ構造ｍＲＮＡを作製した。転写反応の後、試料をＤＮａｓｅＩで処理して、テンプレートＤＮＡを除去し、その後、Ａｍｂｉｏｎ社のポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、ＲＮＡにポリ（Ａ）末端を付加した。ポリ（Ａ）末端を有するキャップ構造ｍＲＮＡには、フェノール−クロロホルム抽出と、エタノール沈降を行った。ポリ（Ａ）末端を有するキャップ構造ｍＲＮＡの濃度は、ＵＶ分光法により測定した。ｍＲＮＡ溶液は、その後の利用のために、−２０℃で保存した。

卵母細胞発現およびパッチクランプ法：アフリカツメガエル卵母細胞遺伝子発現で使用した方法は、技術で十分に確立されているものである（非特許文献３３）および（非特許文献３４）。この手法を以下に要約する。０．１５％のＴｒｉｃａｉｎｅ（３−アミノ安息香酸エチルエステル）に沈めて麻酔したアフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（ＮＡＳＣＯ、ウィスコンシン州Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ）から、未受精の卵母細胞を外科的に摘出した。卵母細胞は、カルシウムを含まない生理食塩液（ＯＲ２：８２．５ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ_２，５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含有するＯＲ２中で、オービタルシェイカー上にて１７℃で２時間インキュベートした。ついで、ピンセットを用いて卵母細胞に機械的な濾胞除去を行った後、通常のカルシウム含有生理食塩液（ＮＤ９６：９６ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ_２，１．８ｍＭのＣａＣｌ_２，５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に入れた。ピストン式のマイクロインジェクター（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｎａｎｏｊｅｃｔ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州Ｂｒｏｏｍａｌｌ）を用いて、希望する遺伝子または遺伝子群からのＲＮＡ転写物を、各々の卵母細胞にインジェクションした。通常の実験では、４〜６ｎｇの各々のサブユニットのＲＮＡを、２３ｎＬの水に入れて導入した。インジェクションを受けた卵母細胞を、オービタルシェイカー上にて１７℃でインキュベートし、２〜４日でインジェクションしたチャネルの機能的な発現を検討した。

Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０７巻、Ｒｕｄｙ，Ｂ． Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｅ編著、セクションＩＩ、Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ、２２５−３９０ページ）

卵母細胞は、二電極電圧固定装置（ＡｘｏＣｌａｍｐ ２Ｂ，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、カリフォルニア州ユニオンシティー）を用いて、イオンチャネルの機能的な発現について検討した。標準的な電圧固定法での電流および記録法を用いた。記録電極は、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅピペットプラー（ＰＰ８３０型、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＵＳＡ、ニューヨーク州ロングアイランド）を用いて組み立て、４ｍＭの酢酸カリウムを充填した場合の入力抵抗が０．８〜３メガオームとなるように調節した。データは、アナログ−デジタルインターフェース（Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）クラスのコンピュータを用いて、ｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により統合した。カルシウムチャネルの性能を評価するための記録は、内因性のカルシウム活性化電流を最小限にするために処方されたＮＳ生理食塩液中（４０ｍＭのＢａ（ＯＨ）_２，５０ｍＭのＤ−グルコン酸ナトリウム、１ｍＭのＫＯＨ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，０．１ｍＭのニフルム酸、ｐＨ７．４）で行った。

結果：３種類の無脊椎動物カルシウムチャネルサブユニットをさまざまな形で組み合わせたものについて検討を行った。配列番号６で示されるα１サブユニット、配列番号１０で示されるβ−２サブユニット、配列番号１８で示されるα２δサブユニットは、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するものであった。ワタアブラムシからの配列番号１４で示されるα２δサブユニットについても、このサブユニットが天然のＨ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ α２δと置換できるか否かを調べるために、検討を行った。

各々のサブユニットのＲＮＡを、６ｎｇ／卵の用量でインジェクションした。各々のバッチの回収卵からの卵にインジェクションした対照電位依存性チャネルは、大量の電流を生じたという事実（データ未発表）にもかかわらず、α１サブユニット単独では電位依存性の電流を得ることはできなかった。α１サブユニットとβ−２サブユニットが共に発現した場合には、図２に示すように通常は１０〜２０ｎＡの範囲で、中程度の電流を生じた。しかし、電流の発現は不安定であり、卵ごとに一定していなかった。α１サブユニットおよびβ−２サブユニットにアブラムシα２δサブユニットを加えると、わずかではあるが明確な、電位感受性Ｎ型カルシウム電流が生じた（図３）。アブラムシα２δをＴＢＷ α２δ−２サブユニットに置換した場合にも、明確な電位感受性Ｎ型カルシウム電流が生じた（図４）が、観察された最大電流の大きさは、４０ｎＡ程度の大きさまで増大した。

上述の方法で集められたデータから、固定電圧の場合に電位段階に応じて発生した電流は、培地で増殖させたニューロンから生ずる、全細胞パッチクランプ記録で観察されるＮ型カルシウムチャネルに類似していると結論付けられる（非特許文献３５）。試験条件下でのクローン化されたチャネルと、培養ニューロンで観察されたものはどちらも、−３０ｍＶ付近で活性化ポイントを示し、見かけ上の逆転電位は＋５０ｍＶ付近である。卵母細胞で観察された電流は減少性であるが、その動態は、培養昆虫ニューロンで観察される、緩慢に不活化する電流を暗示するものである。さらに、配列番号６で示されるキメラα１サブユニットは、適切な昆虫βおよびα２δカルシウムチャネルサブユニットの存在下でＮ型カルシウムチャネルを暗示する、機能性電位感受性チャネルを形成することができると結論付けられる。

Ｈａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ， Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１７１巻、１５−４２ページ（１９９２）

コピー数の少ないプラスミドベクターｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）を図示したものである。複数のクローニング部位は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限酵素切断部位の間の小さな領域に局在しており、Ｔ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターによって隣接している。ｐ１５Ａの矢印は、ＤＮＡ複製でコピー数の少ないｐ１５Ａプラスミドの起点部の位置を示している。ｌｏｘＰの矢印は、Ｃｒｅリコンビナーゼによる部位特異的組換えで使用される３４ｂｐの反復配列の部位を示している。ＡｍｐＲの矢印は、抗生物質のアンピシリンおよびカルベニシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子の位置および方向を示している。ｉｎｃＡは、その存在によってＥ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ（ＺＩＰ）株でのＣｒｅリコンビナーゼを発現するＰ１プラスミドの反復を遮断するＤＮＡセグメントの位置を示している。ＡｍｐＲの矢印は、抗生物質のアンピシリンおよびカルベニシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子の位置および方向を示している。ｉｎｃＡは、その存在によってＥ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ（ＺＩＰ）株でのＣｒｅリコンビナーゼを発現するＰ１プラスミドの反復を遮断するＤＮＡセグメントの位置を示している。ｆ１（＋）ｏｒｉｇｉｎの矢印は、繊維状ファージｆ１のローリングサイクル複製の起点の位置と方向を示している。図１Ａ：バクテリオファージλｇｔ１１の誘導体に挿入を行う前のプラスミドの環状構造を示す。ｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）は、制限酵素ＭｆｅＩおよびＰｍｅＩによって切断され、バクテリオファージλｇｔ１１の誘導体の（破壊された）ＳａｃＩ部位とＥｃｏ ＲＩ部位のあいだに巨大な直線フラグメントが挿入された。λｇｔＧｒｅｅｎ１ＳのＸｈｏＩおよびＳａｃＩによる切断により、ファージに二つのアームが生ずるが、ｃＤＮＡライブラリの構成ではこれらを利用することが可能である。 コピー数の少ないプラスミドベクターｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）を図示したものである。複数のクローニング部位は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限酵素切断部位の間の小さな領域に局在しており、Ｔ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターによって隣接している。ｐ１５Ａの矢印は、ＤＮＡ複製でコピー数の少ないｐ１５Ａプラスミドの起点部の位置を示している。ｌｏｘＰの矢印は、Ｃｒｅリコンビナーゼによる部位特異的組換えで使用される３４ｂｐの反復配列の部位を示している。ＡｍｐＲの矢印は、抗生物質のアンピシリンおよびカルベニシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子の位置および方向を示している。ｉｎｃＡは、その存在によってＥ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ（ＺＩＰ）株でのＣｒｅリコンビナーゼを発現するＰ１プラスミドの反復を遮断するＤＮＡセグメントの位置を示している。ｆ１（＋）ｏｒｉｇｉｎの矢印は、繊維状ファージｆ１のローリングサイクル複製の起点の位置と方向を示している。図１Ｂ：バクテリオファージクローニングベクターλｇｔＧｒｅｅｎ１Ｓに存在する形での、直線型のプラスミドの構造を示す。ｐＧｒｅｅｎ１Ｓ（＋）Ｌｏｘ２（Ｘｂａ）は、制限酵素ＭｆｅＩおよびＰｍｅＩによって切断され、バクテリオファージλｇｔ１１の誘導体の（破壊された）ＳａｃＩ部位とＥｃｏ ＲＩ部位のあいだに巨大な直線フラグメントが挿入された。λｇｔＧｒｅｅｎ１ＳのＸｈｏＩおよびＳａｃＩによる切断により、ファージに二つのアームが生ずるが、ｃＤＮＡライブラリの構成ではこれらを利用することが可能である。 昆虫α１サブユニットとＴＢＷ β−２サブユニットを注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞での電位ステップに応じて生じた電流を示す。最大電流と電位との間の相関関係図である。最大電流は、マーカー１とマーカー２（逆三角形）とのあいだで決定された。 昆虫α１サブユニット、ＴＢＷ β−２サブユニットおよびワタアブラムシα２δサブユニットを注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞での電位ステップに応じて生じた電流を示す。最大電流と電位との間の相関関係図である。最大電流は、マーカー１とマーカー２（逆三角形）とのあいだで決定された。 昆虫α１サブユニット、ＴＢＷ β−２サブユニットおよびＴＢＷ α２δ−２サブユニットを注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞での電位ステップに応じて生じた電流を示す。最大電流と電位との間の相関関係図である。最大電流は、マーカー１とマーカー２（逆三角形）とのあいだで決定された。

【配列表】

Claims (43)

1. 配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８、その突然変異体、およびそのフラグメントからなるグループから選択されたアミノ酸配列を有する、実質的に純粋な蛋白質。
2. 前記蛋白質が、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の蛋白質。
3. 請求項１の蛋白質をコード化する核酸配列から構成される、分離された核酸分子。
4. 請求項３の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
5. 請求項４の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
6. 請求項２の蛋白質をコード化する核酸配列を含む、分離された核酸分子。
7. 請求項６の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
8. 請求項７の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
9. 配列番号１、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号５、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号７、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号９、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号１１、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号１３、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号１５、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、配列番号１７、および、少なくとも１０個のヌクレオチドを有するそのフラグメントからなる、分離された核酸分子であって、配列番号５のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチドを少なくとも５個含んでいる、核酸分子。
10. 配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる、請求項９記載の核酸分子。
11. 請求項１０の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
12. 請求項１１の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
13. 少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号１のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号５のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号７のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号９のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号１１のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号１３のフラグメント、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号１５のフラグメント、および、少なくとも１０個のヌクレオチドを有する配列番号１７のフラグメントからなる核酸分子であって、配列番号５のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチドを少なくとも５個含んでいる、請求項９記載の核酸分子。
14. １２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号５のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号７のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号９のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１１のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１３のフラグメント、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１５のフラグメント、および、１２個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１７のフラグメントからなる核酸分子であって、配列番号５のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチドを少なくとも５個含んでいる、請求項９記載の核酸分子。
15. １５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号５のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号７のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号９のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１１のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１３のフラグメント、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１５のフラグメント、および、１５個から１５０個のヌクレオチドを有する配列番号１７のフラグメントからなる核酸分子であって、配列番号５のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチドを少なくとも５個含んでいる、請求項９記載の核酸分子。
16. 配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のエピトープに結合する、分離された抗体であって、配列番号６に結合する抗体は、配列番号４と交差反応しない抗体。
17. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体。
18. 鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のモジュレーターを識別する方法であって、
    被験細胞が、キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクター、ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターおよびＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターのうちの少なくとも一つを含み、前記被験細胞が機能性カルシウムチャネルを発現する場合に、機能性カルシウムチャネルを含む細胞を、被験化合物の存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、前記被験細胞での細胞内カルシウムの量を検出することによって行う、被験測定法を実施することと、
    前記被験細胞が、キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクター、ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターおよびＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターのうちの少なくとも一つを含み、陰性細胞が機能性カルシウムチャネルを発現する場合に、機能性カルシウムチャネルを含む陰性対照細胞を、前記被験化合物の非存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、前記陰性対照細胞での細胞内カルシウムの量を検出することによって行う、陰性対照測定法を実施することと、
    前記被験細胞での細胞内カルシウム量を、陰性対照細胞での細胞内カルシウム量と比較することとを含み、
    前記陰性対照細胞での細胞内カルシウム量を、前記被験細胞でのカルシウム量と比較して変化が認められた場合に、前記被験化合物はカルシウムチャネル活性のモジュレーターであることが示される、方法。
19. 前記被験細胞がアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項１８記載の方法。
20. 前記細胞の内部の色素を細胞内カルシウムと接触させることで生ずる蛍光を測定する方法を使用することによって、前記細胞内カルシウムを検出する、請求項１８記載の方法。
21. 機能性カルシウムチャネルを含む陽性対照細胞を、前記被験化合物の非存在下およびカルシウムチャネル作動物質の存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、前記陽性対照細胞での細胞内カルシウム量を検出することによって、さらに陽性対照測定を実施する、請求項１８記載の方法。
22. 前記カルシウムチャネルが鱗翅目のカルシウムチャネルである、請求項２１記載の方法。
23. 機能性カルシウムチャネルを発現していない陰性対照細胞を、前記被験化合物の非存在下でカルシウムを含有する溶液と接触させ、前記カルシウムチャネル陰性対照細胞によって取り込まれるカルシウムの量を検出することによる、二番目のタイプの陰性対照測定法を実施すること、および／または
    機能性カルシウムチャネルを発現していない陰性対照細胞を、前記被験化合物の非存在下およびカルシウムチャネル作動物質の存在下で、カルシウムを含有する溶液と接触させ、前記カルシウムチャネル陰性対照細胞によって取り込まれるカルシウムの量を検出することによる、三番目のタイプの陰性対照測定法を実施することを含む、請求項１８記載の方法。
24. 前記カルシウムチャネルが鱗翅目のカルシウムチャネルである、請求項２３記載の方法。
25. 前記機能性カルシウムチャネルが、キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニット、ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよびＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットのうち少なくとも一つを含み、前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットは、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメントからなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットは配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、その突然変異体およびそのフラグメントからなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットは配列番号１６、配列番号１８、その突然変異体およびそのフラグメントからなる、請求項１８記載の方法。
26. 前記被験細胞がアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項２５記載の方法。
27. 前記細胞の内部の色素を細胞内カルシウムと接触させることで生ずる蛍光を測定する方法を使用することによって、前記細胞内カルシウムを検出する、請求項２５記載の方法。
28. 前記機能性カルシウムチャネルが、配列番号２からなるキメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニット、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２からなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット、および、配列番号１６または配列番号１８からなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットを含んでいる、請求項２５記載の方法。
29. 前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットが配列番号６を含んでいる、請求項２８記載の方法。
30. 前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号１からなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号７、配列番号９または配列番号１１からなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号１５または配列番号１７からなる、請求項２８記載の方法。
31. 前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する核酸配列が配列番号５を含んでいる、請求項３０記載の方法。
32. 鱗翅目のカルシウムチャネル蛋白質活性のインヒビターを識別する方法であって、
    被験細胞が、キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクター、ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターおよびＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターのうちの少なくとも一つを含み、前記被験細胞が機能性カルシウムチャネルを発現する場合に、機能性カルシウムチャネルを含む前記被験細胞を、被験化合物の存在下で、カルシウムおよびカルシウムチャネル作動物質を含有する溶液と接触させ、前記被験細胞での細胞内カルシウムの量を検出することによって行う、被験測定法を実施することと、
    陰性対照細胞が機能性カルシウムチャネルを発現する場合に、機能性カルシウムチャネルを含む前記陰性対照細胞を、前記被験化合物の非存在下でカルシウムおよびカルシウムチャネル作動物質を含有する溶液と接触させ、前記陰性対照細胞での細胞内カルシウム量を検出することによって行う、対照測定法を実施することと、
    前記被験細胞での細胞内カルシウム量を、前記対照細胞での細胞内カルシウム量と比較することとを含み、
    前記被験細胞での細胞内カルシウム量に、前記対照細胞での細胞内カルシウム量と比較して減少が認められた場合に、被験化合物はカルシウムチャネル活性のインヒビターであることが示される、方法。
33. 前記被験細胞がアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項３２記載の方法。
34. 前記細胞の内部の色素を細胞内カルシウムと接触させることで生ずる蛍光を測定する方法を使用することによって、前記細胞内カルシウムを検出する、請求項３２記載の方法。
35. 前記機能性カルシウムチャネルが、配列番号２、その突然変異体および、そのフラグメントからなるキメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットと、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、その突然変異体および、そのフラグメントからなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット、ならびに、配列番号１６、配列番号１８、その突然変異体および、そのフラグメントからなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットのうちの少なくとも一つを含んでいる、請求項３８記載の方法。
36. 前記被験細胞がアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項３５記載の方法。
37. 前記細胞の内部の色素を細胞内カルシウムと接触させることで生ずる蛍光を測定する方法を使用することによって、前記細胞内カルシウムを検出する、請求項３５記載の方法。
38. 前記機能性カルシウムチャネルが、配列番号２からなるキメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットと配列番号８、配列番号１０または配列番号１２からなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット、および、配列番号１６または配列番号１８からなるＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットを含んでいる、請求項３５記載の方法。
39. 前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットが配列番号６を含んでいる、請求項３８記載の方法。
40. 前記キメラＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号１からなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号７、配列番号９または配列番号１１からなり、前記ＴＢＷ電位依存性カルシウムチャネルα２δサブユニットをコード化する前記核酸配列が配列番号１５または配列番号１７からなる、請求項３８記載の方法。
41. 配列番号２、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号６、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号８、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号１０、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号１２、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号１６、その突然変異体、およびそのフラグメント、配列番号１８、その突然変異体、およびそのフラグメント；からなるグループから選択された前記アミノ酸配列を有する、分離された蛋白質の調製方法であって、請求項５の宿主細胞から前記蛋白質を分離する方法。
42. 昆虫を、請求項１８に記載の方法で識別されたモジュレーターと接触させることを含む、昆虫制御法。
43. 昆虫を、請求項３２に記載の方法で識別されたインヒビターと接触させることを含む、昆虫制御法。

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