ES2274878T3 - Moleculas de adn que codifican canales ionicos sensibles al ligado de dermacentor variabilis. - Google Patents

Abstract

Molécula purificada de ácido nucleico que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nos: 2 y 5, (b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia de moderada a alta con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica las SEC ID Nos 2 ó 5, (c) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia moderada con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos 1, 3 ó 4; en el que dicha molécula de ácido nucleico tiene por lo menos aproximadamente un 65% de identidad con por lo menos una de las segundas moléculas de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos 1, 3 y 4.

Description

Moléculas de ADN que codifican canales iónicos sensibles al ligado de Dermacentor variabilis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en parte a moléculas aisladas de ácido nucleico (polinucleótidos) que codifican los canales de cloruro sensibles a ligandos de Dermacentor variabilis (garrapata americana del perro). La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y huéspedes recombinantes que contienen un fragmento de ADN que codifica los canales de cloruro sensibles a ligandos de D. variabilis, formas sustancialmente purificadas de canales de cloruro asociados sensibles a ligandos de D. variabilis y fracciones de membrana recombinantes que comprenden estas proteínas, proteínas mutantes asociadas y procedimientos relacionados con la identificación de compuestos que modulan canales de cloruro asociados sensibles a ligandos de Dermacentor variabilis que serán útiles como insecticidas y acaricidas.

Antecedentes de la invención

Se han identificado canales de cloruro sensibles a glutamato, o receptores H, en el nervio y el músculo de artrópodos (Lingle y otros, 1981, Brain Res. 212: 481-488; Horseman y otros, 1988, Neurosci. Lett. 85: 65-70; Wafford y Sattelle, 1989, J. Exp. Bio. 144: 449-462; Lea y Usherwood, 1973, Comp. Gen. Pharmacol. 4: 333-350, y Cull-Candy, 1976, J. Physiol. 225: 449-464).

Los canales de cloruro sensibles a ligandos de los invertebrados son objetivos importantes de los compuestos antihelmínticos e insecticidas de uso generalizado de la clase de la avermectina. Las avermectinas son una familia de lactonas macrocíclicas originalmente aisladas a partir del actinomiceto Streptomyces avermitilis. El derivado semisintético de la avermectina, la ivermectina (22,23-dihidroavermectina B_{1a}), se utiliza en todo el mundo para tratar las pestes causadas por helmintos parásitos e insectos que afectan al ser humano y a los animales. Las avermectinas siguen siendo las endectocidas más potentes y de más amplio espectro con toxicidad reducida para el huésped. Después de utilizarlas durante muchos años en el sector, se observa poca resistencia a la avermectina en la población de insectos. La combinación de un buen índice terapéutico y una resistencia reducida sugieren firmemente que los canales iónicos sensibles a ligandos, y en especial los canales de cloruro sensibles a glutamato (LGIC/GluCl), siguen siendo buenos objetivos para el desarrollo de insecticidas.

Los canales de cloruro sensibles a glutamato han sido clonados a partir del nematodo terrestre Caenorhabditis elegans (Cully y otros, 1994, Nature 371: 707-711; véase también la patente de Estados Unidos n.º 5.527.703 y Arena y otros, 1992, Molecular Brain Research 15: 339-348) y de Ctenocephalides felis (pulga; véase WO 99/07828).

Además, con anterioridad se había identificado un gen que codifica un canal de cloruro sensible a glutamato en Drosophila melanogaster (Cully y otros, 1996, J. Biol. Chem. 271: 20.187-20.191; véase también la patente de Estados Unidos n.º 5.693.492).

Dermacentor variabilis (garrapata americana del perro) es endémica en la mayor parte de Estados Unidos, con huéspedes frecuentes conocidos en el ganado, el ciervo, los perros, los humanos y pequeños mamíferos. Esta garrapata se asocia con diversas enfermedades, como rickettsiosis exantemática americana, babesiosis, parálisis por garrapatas, anaplasmosis, tularemia y citoauxzoonosis.

A pesar de la identificación de los clones de ADNc anteriormente mencionados que codifican canales LGIC/GluCl no de garrapatas, sería ventajoso identificar otros genes que codifiquen canales LGIC/GluCl de D. variabilis que permitan un mejor cribado para identificar nuevos moduladores de los canales LGIC/GluCl que puedan tener actividad insecticida, acaricida y/o nematocida beneficiosa para la salud de los animales, en especial por su relación con el tratamiento de las infestaciones de garrapatas en el ganado y en animales domésticos, tales como perros y gatos. La presente invención se ocupa de estas necesidades y las satisface mediante la descripción de genes nuevos que codifican proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis y cuando se expresan en los oocitos de Xenopus producen la formación de canales LGIC/GluCl funcionales. La expresión heteróloga de un canal LGIC/GluCl de la presente invención permitirá el análisis farmacológico de compuestos con actividad contra especies parásitas de invertebrados que tienen relevancia para la salud humana y animal, en especial en el tratamiento de las infestaciones por garrapata directamente relacionadas con Dermacentor variabilis. Las líneas celulares heterólogas que expresan un canal LGIC/GluCl activo pueden utilizarse para establecer análisis funcionales o de fijación para identificar nuevos moduladores de los canales LGIC/GluCl que pueden ser útiles en el control de los grupos de especies anteriormente mencionados.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a una molécula aislada o purificada de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica una proteína nueva del canal LGIC del invertebrado Dermacentor variabilis (garrapata americana del perro), que incluye, pero no se limita necesariamente a, una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis. Las moléculas de ADN descritas en la presente pueden transfectarse en una célula huésped de elección en la que la célula huésped transfectada proporciona una fuente para una cantidad sustancial de solo LGIC homomultímero o heteromultímero funcional expresado. Tales canales iónicos funcionales sensibles a ligandos pueden responder posiblemente a otros ligandos conocidos que a su vez proporcionarán otros objetivos de cribado para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como eficaces tratamientos insecticidas, acaricidas, mitacidas y/o nematocidas de uso en animales y humanos y/o para la protección de los cultivos.

La presente invención se refiere además a una molécula aislada de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína del canal LGIC/GluCl de Dermacentor variabilis, comprendiendo esta molécula de ADN la secuencia nucleótida descrita en la presente como SEC ID No:1, SEC ID No:3, SEC ID No:4 y SEC ID No:6.

La presente invención también se relaciona con fragmentos o mutantes biológicamente activos de las SEC ID Nos:1, 3, 4 y 6 que codifican ARNm que expresa una nueva proteína del canal LGIC/GluCl del invertebrado Dermacentor variabilis. Cualquier fragmento y/o mutante biológicamente activo de este tipo codificará tanto una proteína como un fragmento de proteína que por lo menos mimetice sustancialmente las propiedades farmacológicas de una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, que incluye, pero no se limita a, proteínas del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, tal y como se establece en la SEC ID No:2, la SEC ID No:5 y la SEC ID No:7. Cualquier polinucleótido de este tipo incluye, pero no necesariamente limitado a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en nucleótidos, tales que estas mutaciones codifican ARNm que expresa un canal funcional LGIC/GluCl de D. variabilis en una célula eucariota, tal como los oocitos de Xenopus, para que sea útil para el cribado de agonistas y/o antagonistas de la actividad LGIC/GluCl de D. variabilis.

Un aspecto preferido de esta parte de la presente invención se describe en la figura 1 (SEC ID No:1; denominada DvLGIC/GluCl 1), la figura 3 (SEC ID No:3; denominada DvLGIC/GluCl 11), la figura 4 (SEC ID No:4; denominada DvLGIC/GluCl 7-1) y la figura 6 (SEC ID No:6; denominada DvLGIC/GluCl 10-2), que codifican formas nuevas de proteínas del canal LGIC/GluCl de Dermacentor variabilis.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), tal como ADN genómico y ADN complementario (ADNc), que puede ser monocatenario (cadena codificante o no codificante) o bicatenario, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido monocatenario de síntesis. La molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención también puede incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto eucariotas como procariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que se describen a lo largo de esta memoria.

La presente invención también se refiere en parte a una forma sustancialmente purificada de una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 2 (SEC ID No:2), la figura 5 (SEC ID No:5) y la figura 7 (SEC ID No:7).

Un aspecto preferido de esta parte de la presente invención es una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 2 (SEC ID No:2), la figura 5 (SEC ID No:5) y la figura 7 (SEC ID No:7).

Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a una proteína madura del canal LGIC/GluCl, sustancialmente purificada y procesada por completo (incluidos cualquier procedimiento proteolítico, glucosilación y/o fosforilación), obtenida a partir de una célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión de ADN que comprende una secuencia nucleótida tal como se establece en las SEC ID Nos:1, 3, 4 y/o 6 y que expresa el precursor de DvLGIC/GluCl o una forma madura de la proteína respectiva. Es especialmente preferible que la célula huésped recombinante sea, pero no se limitan a, una célula huésped eucariota, como una línea celular mamífera, una línea celular de insecto, tal como las células S2, u oocitos de Xenopus.

Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a un preparado de membrana sustancialmente purificado, a preparados de membrana parcialmente purificados o a un lisado celular que se ha obtenido a partir de una célula huésped recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa adecuadamente un marco abierto de lectura completo tal y como se establece en las SEC ID Nos:1, 3, 4 y/o 6, lo que produce una forma funcional del canal DvLGIC/GluCl respectivo. Las fracciones subcelulares de membrana y/o los lisados celulares que contienen membrana procedente de células huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como células transformadas/transfectadas de manera estable y transitoria) contienen las proteínas funcionales y procesadas codificadas por los ácidos nucleicos de la presente invención. Este preparado de membrana de base recombinante puede comprender un canal LGIC/GluCl de D. variabilis y básicamente carece de proteínas contaminantes, que incluye, pero no se limitan a, otras proteínas de una fuente de D. variabilis o de proteínas huésped de una célula recombinante que expresa la proteína del canal LGIC/GluCl de LGIC/GluCl 1 (SEC ID No:2), LGIC/GluCl 11 (también SEC ID No:2), LGIC/GluCl 7-1 (SEC ID No:5) y/o LGIC/GluCl 10-2 (SEC ID No:7). Por lo tanto, un aspecto preferido de la invención es un preparado de membrana que contiene un canal LGIC/GluCl de D. variabilis que comprende una proteína LGIC/GluCl que comprende la forma funcional de las proteínas del canal LGIC/GluCl, tal como se describe en la figura 2 (SEC ID No:2; LGIC/GluCl 1 y LGIC/GluCl 11), la figura 5 (SEC ID No:5; LGIC/GluCl 7-1) y/o la figura 7 (SEC ID No:7; LGIC/GluCl 10-2). Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán tanto variaciones del tipo salvaje como variaciones mutantes que son formas biológicamente funcionales de los canales LGIC/GluCl de D. variabilis. Cualquier canal funcional único, combinación homomultímera o heteromultímera de las proteínas DvLGIC/GluCl descritas en la presente, se considera a concentraciones sustancialmente por encima de las concentraciones endógenas y en consecuencia será útil en varios de los análisis descritos a lo largo de esta memoria. También es posible que las proteínas del canal que se describen, solas o en combinación, puedan formar canales heteromultiméricos funcionales con las proteínas del canal ya identificadas. Una célula huésped eucariota preferida para expresar los canales sensibles a glutamato de la presente invención es una línea celular mamífera, una línea celular de base insecto, tal como las células S2, u oocitos de Xenopus.

La presente invención también se refiere a fragmentos biológicamente activos y/o mutantes de una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se establece en las SEC Nos:2, 5 y 7, que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en aminoácidos, tales que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y que serían útiles para el cribado de moduladores selectivos que
incluyen, pero no se limitan a, agonistas y/o antagonistas de la farmacología del canal LGIC/GluCl de D. variabilis.

Un aspecto preferido de la presente invención se describe en la figura 2 (SEC ID No:2), la figura 5 (SEC ID No:5) y la figura 7 (SEC ID No:7), secuencias de aminoácidos que comprenden, respectivamente, las proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis de la presente invención. La caracterización de una o más de estas proteínas del canal permiten el cribado de procedimientos para identificar nuevos moduladores del canal LGIC/GluCl que puedan tener actividad insecticida, acaricida y/o nematocida beneficiosa para la salud de los animales, los humanos y/o la protección de los cultivos. Tal y como se ha señalado anteriormente, la expresión heteróloga de un único canal funcional, un canal homomultimérico o heteromultimérico que comprende una proteína o una combinación de las proteínas DvLGIC/GluCl descritas en la presente, se considera a concentraciones sustancialmente superiores a las concentraciones endógenas y permitirá el análisis farmacológico de compuestos activos contra especies de invertebrados parásitos relevantes para la salud de los animales y los humanos en general, así como posibles moduladores específicos de DvLGIC/GluCl que puedan ser útiles para controlar diversas infestaciones parasitarias. Las líneas celulares heterólogas que expresan un canal funcional DvLGIC/GluCl (por ejemplo, formas funcionales de las SEC ID Nos: 2, 5 y/o 7) pueden utilizarse para establecer análisis funcionales o de fijación a receptores para identificar nuevos moduladores del canal LGIC/GluCl que puedan ser útiles en el control de los grupos de especies anteriormente mencionados.

La presente invención también se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales desarrollados en respuesta a las formas descritas de DvLGIC/GluCl, o a un fragmento biológicamente activo de los mismos.

La presente invención también se refiere a construcciones de fusión de DvLGIC/GluCl, que incluyen, pero no se limitan a, construcciones de fusión que expresan una parte del DvLGIC/GluCl unida a diversos marcadores, que incluyen, pero de ningún modo limitados a, la proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein, GFP), el epítopo MYC, GST y Fc. Cualquier construcción de fusión de este tipo puede ser expresada en la línea celular de interés y utilizarse para detectar moduladores de una o más de las proteínas DvLGIC/GluCl descritas en la presente.

La presente invención se refiere a procedimientos para expresar proteínas del canal LGIC/GluCl de D. variabilis y equivalentes biológicos descritos en la presente, a análisis que emplean estos productos génicos, a células huésped recombinantes que comprenden construcciones de ADN que expresan estas proteínas y a compuestos identificados a través de estos análisis que actúan como agonistas o antagonistas de la actividad del canal LGIC/GluCl.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una molécula aislada de ácido nucleico (por ejemplo, SEC ID Nos: 1, 3, 4 y 6) que codifica una forma nueva de LGIC/GluCl de D. variabilis, o fragmentos, mutantes o derivados de DvLGIC/GluCl, proteínas tal como se establece en las SEC ID Nos: 2, 5 y 7, respectivamente. Cualquier polinucleótido de este tipo incluye pero no se limita a sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en nucleótidos, tales que estas mutaciones codifican ARNm que expresa una proteína o fragmento de proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y que sería útil para detectar moduladores selectivos para la farmacología de los LGIC/GluCl de invertebrados.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar proteínas o fragmentos de proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis codificados por las moléculas de ácido nucleico a las que se hace referencia en el párrafo anterior.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar vectores recombinantes y células huésped recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis o un equivalente biológico de las mismas.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una forma sustancialmente purificada de proteínas LGIC/
GluCl de D. variabilis, tal como se establece en las SEC ID Nos: 2, 5 y 7, respectivamente.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar una forma recombinante sustancialmente purificada de proteína LGIC/GluCl de D. variabilis que se ha obtenido a partir de una célula huésped recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa adecuadamente un marco abierto de lectura completo tal como se establece en las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y 6, que produce una forma funcional del canal DvLGIC/GluCl respectivo. Es especialmente preferible que la célula huésped recombinante sea una célula huésped eucariota, tal como una línea celular mamífera.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar, respectivamente, fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis, tal como se establece en las SEC ID Nos: 2, 5 y 7, que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en aminoácidos, tales que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso diagnóstico, terapéutico y/o profiláctico.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar preparados subcelulares de membrana sustancialmente purificados, preparados subcelulares de membrana parcialmente purificados o lisados sin purificar procedentes de células recombinantes que comprenden canales LGIC/GluCl de D. variabilis farmacológicamente activos, respectivamente, especialmente fracciones subcelulares obtenidas a partir de una célula huésped transfectada o transformada con un vector de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende el aminoácido tal como se establece en la figura 2 (SEC ID No:2), la figura 5 (SEC ID No:5) y/o la figura 7 (SEC ID No:7).

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un preparado de membrana sustancialmente purificado, preparados subcelulares de membrana parcialmente purificados o lisados sin purificar obtenidos a partir de una célula huésped recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa adecuadamente un marco abierto de lectura completo tal como se establece en las secuencias SEC ID Nos:1, 3, 4 y/o 6, que producen una forma funcional procesada del canal DvLGIC/GluCl respectivo. Es especialmente preferible que la célula huésped recombinante sea una célula huésped eucariota, tal como, pero no se limitan a una línea celular mamífera, una línea insectil, tal como las células S2, u oocitos de Xenopus.

Es también un objetivo de la presente invención utilizar proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis o preparados de membrana que contengan proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis o un equivalente biológico para detectar moduladores, preferiblemente moduladores selectivos de la actividad del canal LGIC/GluCl de D. variabilis y/o un canal LGIC/GluCl de invertebrados. Cualquier proteína de este tipo o proteína asociada a la membrana será de utilidad para detectar y seleccionar estos moduladores activos contra especies de invertebrados parásitos que son relevantes en la salud de los animales y del ser humano. Tales especies son, además de los canales de la garrapata americana del perro descritos en la presente, gusanos, moscas, otras especies de garrapata y piojos. Estos preparados de membrana pueden originarse a partir de líneas celulares heterólogas que expresan estos LGIC/GluCl y pueden constituir una proteína en toda su longitud, fragmentos biológicamente activos de esta proteína en toda su longitud o pueden contar con proteínas de fusión expresadas a partir de diversos construcciones de fusión que pueden construirse con materiales disponibles en el estado de la técnica.

Tal como se utiliza en la presente, "carece sustancialmente de otros ácidos nucleicos" significa que como mínimo carece de otros ácidos nucleicos en un 90%, preferiblemente en un 95%, más preferiblemente en un 99% e incluso más preferiblemente en un 99,9%. Tal como se utiliza de manera intercambiable con las expresiones "carece sustancialmente de otros ácidos nucleicos" o "sustancialmente purificado" o "ácido nucleico aislado" o "ácido nucleico purificado" también se refiere a moléculas de ADN que comprenden una región codificante para una proteína LGIC/GluCl de D. variabilis que ha sido purificada separándola de otros componentes celulares. Así, un preparado de ADN de LGIC/GluCl de D. variabilis que carece sustancialmente de otros ácidos nucleicos contendrá, como porcentaje del total de ácidos nucleicos, hasta un 10% de ácidos nucleicos LGIC/GluCl no de D. variabilis, preferiblemente hasta un 5%, más preferiblemente hasta un 1% e incluso más preferiblemente hasta un 0,1%. Puede determinarse si un preparado de ADN de LGIC/GluCl de D. variabilis carece sustancialmente de otros ácidos nucleicos mediante tales técnicas convencionales para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos, como por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa combinada con procedimientos de tinción adecuados, por ejemplo tinción con bromuro de etidio, o mediante secuenciación.

Tal como se utiliza en la presente, "carece sustancialmente de otras proteínas" o "sustancialmente purificado" significa que como mínimo carece de otras proteínas en un 90%, preferiblemente en un 95%, más preferiblemente en un 99% e incluso más preferiblemente en un 99,9%. Así, un preparado de proteína de LGIC/GluCl de D. variabilis que carezca sustancialmente de otras proteínas contendrá, como porcentaje de las proteínas totales, hasta un 10% de proteínas LGIC/GluCl que no sean de D. variabilis, preferiblemente hasta un 5%, más preferiblemente hasta un 1% e incluso más preferiblemente hasta un 0,1%. Puede determinarse si un preparado dado de proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis carece sustancialmente de otras proteínas mediante tales técnicas convencionales para evaluar la pureza de las proteínas, tal como por ejemplo la electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio y dodecilo (SDS-PAGE) combinada con métodos de detección adecuada, por ejemplo, tinción de plata o inmunotransferencia. Tal como se utiliza de manera intercambiable con las expresiones "carece sustancialmente de otras proteínas" o "sustancialmente purificada", las expresiones "proteína aislada de LGIC/GluCl de D. variabilis" o "proteína purificada de LGIC/GluCl de D. variabilis" también se refieren a una proteína LGIC/GluCl de D. variabilis que ha sido aislada de una fuente natural. El uso de los términos "aislado" o "purificado" indica que la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis ha sido eliminada de su entorno celular normal. Así, una proteína aislada de LGIC/GluCl de D. variabilis puede hallarse en una disolución libre de células o bien situada en un entorno celular distinto de aquel en el que suele aparecer. El término aislado no implica que una proteína aislada de LGIC/GluCl de D. variabilis sea la única proteína presente, sino que significa que una proteína aislada de LGIC/GluCl de D. variabilis carece sustancialmente de otras proteínas y de sustancias no aminoácidas (por ejemplo, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono) asociadas de manera natural con la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis in vivo. Así, una proteína de LGIC/GluCl de D. variabilis que se expresa de manera recombinante en una célula eucariota o procariota y sustancialmente purificada a partir de esta célula huésped que no expresa de manera natural (es decir, sin intervención) esta proteína LGIC/GluCl es evidentemente una "proteína aislada de LGIC/GluCl de D. variabilis" bajo cualquier circunstancia descrita la presente. Tal como se ha señalado anteriormente, un preparado de proteínas LGIC/GluCl de D. variabilis que constituye una proteína aislada o purificada LGIC/GluCl de D. variabilis carecerá sustancialmente de otras proteínas y contendrá, como porcentaje del total de proteínas, hasta el 10% de proteínas de LGIC/GluCl no de D. variabilis, preferiblemente hasta el 5%, más preferiblemente hasta el 1% e incluso más preferiblemente hasta el 0,1%.

Tal como se utiliza de manera intercambiable en la presente, la expresión "equivalente funcional" o "equivalente biológicamente activo" hace referencia a una proteína que no tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos tal como ocurre de manera natural en LGIC/GluCl de D. variabilis, debido al corte y empalme, las deleciones, las mutaciones, las sustituciones o las adiciones alternativos, pero que conserva sustancialmente la misma actividad biológica que LGIC/GluCl de D. variabilis. Tales equivalentes funcionales tendrán una identidad considerable con la secuencia de aminoácidos natural de LGIC/GluCl de D. variabilis y los genes y el ADNc que codifican tales equivalentes funcionales pueden detectarse mediante hibridación, de astringencia reducida, con una secuencia de ADN que codifique el LGIC/GluCl de D. variabilis de aparición natural. Por ejemplo, una proteína LGIC/GluCl de D. variabilis de aparición natural descrita en la presente comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID No:2 y es codificada por la SEC ID No:1. Un ácido nucleico que codifique un equivalente funcional tiene como mínimo un 50% de identidad a nivel de nucleótidos con la SEC ID No:1.

Tal como se utiliza en la presente, una "sustitución de aminoácidos conservadora" hace referencia a la sustitución de un residuo aminoácido por otro residuo aminoácido, químicamente similar. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras son: sustitución de un residuo hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro; sustitución de un residuo polar por otro residuo polar de la misma carga (por ejemplo, arginina por lisina; ácido glutámico por ácido aspártico).

Tal como se utiliza en la presente, "LGIC" hace referencia a un canal iónico sensible a ligandos.

Tal como se utiliza en la presente, "GluCl" hace referencia a un canal de cloruro sensible a L-glutamato.

Tal como se utiliza en la presente, "LGIC/GluCl" hace referencia a un canal iónico sensible a ligandos/canal de cloruro sensible a L-glutamato.

Tal como se utiliza en la presente, "DvLGIC/GluCl" hace referencia a un canal de Dermacentor variabilis sensible a ligandos/canal de cloruro sensible a L-glutamato.

Tal como se utiliza en la presente, el término "mamífero" hará referencia a cualquier animal, incluido el ser humano.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 A-C muestra la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 1, establecida en la SEC ID No:1.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 1 y DvLGIC/GluCl 11, tal como se establece en la SEC ID No:2.

La figura 3 A-C muestra la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 11, tal como se establece en la SEC ID No:3.

La figura 4 A-B muestra la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 7-1, tal como se establece en la SEC ID No:4.

La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 11, tal como se establece en la SEC ID No:5.

La figura 6 A-C muestra la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 10-2, tal como se establece en la SEC ID No:6.

La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis, DvLGIC/GluCl 10-2, tal como se establece en la SEC ID No:7.

La figura 8 muestra la comparación de secuencias de aminoácidos para proteínas de DvLGIC/GluCl 1 (SEC ID No:2), DvLGIC/GluCl 11 (SEC ID No:2), DvLGIC/GluCl 7 (SEC ID No:5) y DvLGIC/GluCl 10-2 (SEC ID No:7).

La figura 9 muestra la activación actual en oocitos de Xenopus inyectados con ARNm de DvLGIC/GluCl. La activación actual fue máxima con 1 \muM de ivermectina-fosfato.

La figura 10 muestra la activación mediante ivermectina con DvLGIC/GluCl 7-1 expresada en oocitos de Xenopus. La activación actual fue máxima con \sim1 \muM de ivermectina-fosfato.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl del invertebrado Dermacentor variabilis. Las moléculas aisladas o purificadas de ácido nucleico de la presente invención carecen sustancialmente de otros ácidos nucleicos. En la mayor parte de casos de clonación, el ADN es el ácido nucleico preferido. Tal como se ha señalado anteriormente, las moléculas de ADN descritas en la presente pueden ser transfectadas a una célula huésped de elección en la que la célula huésped recombinante proporciona una fuente de niveles sustanciales de un LGIC, homomultimérico o heteromultimérico, funcional expresado. Tales canales iónicos funcionales sensibles a ligandos posiblemente respondan a otros ligandos conocidos que a su vez proporcionan otros objetivos de detección para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como un eficaz tratamiento insecticida, mitacida y/o nematocida beneficioso para la salud de animales y del ser humano, y/o en la protección de los cultivos. En la presente se muestra que DvLGIC/GluCl 1, 11 y 7-1 expresados en oocitos de Xenopus muestran una corriente en respuesta a la adición de ivermectina fosfato. En cambio, DvLGIC/GluCl 10-2 no era sensible a la ivermectina fosfato o al glutamato. No obstante, debería señalarse que la subunidad gamma del GABA A no expresa un homomultímero funcional. Por lo tanto, las proteínas expresadas de la presente invención pueden actuar in vivo como un componente de un canal iónico sensible a ligandos de tipo salvaje que contiene numerosas proteínas de canal y/o secundarias, como las proteínas del canal descritas en la presente. No obstante, no es necesario que las proteínas LGIC de la presente invención emulen directamente el canal de tipo salvaje para que sean de utilidad al experto en la técnica. En lugar de ello, la capacidad de formar un solo canal funcional asociado a la membrana dentro de una célula huésped recombinante hace que estas proteínas puedan tratarse con la metodología de cribado conocida en el estado de la técnica y descrita en parte en esta memoria. Por lo tanto, tal como se ha señalado en esta memoria, las proteínas de los canales de Dv descritas en la presente invención son útiles como canales funcionales únicos, como canal homomultimérico o como canal heteromultimérico con varias proteínas descritas en la presente con o sin otras proteínas de la subunidad del canal de Dv o secundarias que pueden contribuir a todo el canal funcional de LGIC.

La presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica ARNm que expresa una nueva proteína del canal LGIC/GluCl del invertebrado Dermacentor variabilis, la molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos descrita en la presente como SEC ID No:1, SEC ID No:3, SEC ID No:4 y SEC ID No:6.

El aislamiento y la caracterización de las moléculas de ácido nucleico de DvLGIC/GluCl de la presente invención se describen con detalle en el ejemplo del apartado 1. Estas moléculas de ADNc, tal como se argumenta en la presente, son especialmente útiles para establecer nuevos selecciones insecticidas, para validar los posibles compuestos de plomo con actividad insecticida, especialmente para utilizar en el tratamiento de infestaciones parasitarias en humanos y animales, tales como ganado, perros y gatos o que puedan eliminar a otros arácnidos. Estos ADNc, o partes de los mismos, también son útiles como sondas de hibridación para aislar genes relacionados de otros organismos para establecer otras selecciones de pesticidas. Los ADNc de la presente invención que codifican DvLGIC/GluCl fueron aislados a partir de la garrapata americana del perro de la especie Dermacentor variabilis. La secuencia de ADN predice las proteínas que comparten características con la clase de canales de cloruro sensibles al glutamato y a la ivermectina. Cuando los ADNc de DvLIGC/GluCl se expresan en oocitos de Xenopus, se observa un canal sensible al glutamato y/o la ivermectina. La farmacología de los compuestos que actúan sobre estos canales sería probablemente distinta según las especies. Mediante el cribado del canal arácnido será más probable descubrir compuestos específicos para arácnidos. Por lo tanto, los ADNc de la presente invención pueden expresarse en líneas celulares o en otros sistemas de expresión y utilizarse en experimentos de competencia de unión o en análisis de canales de cloruro funcionales para seleccionar compuestos que activen, bloqueen o modulen el canal.

Los canales de cloruro sensibles a ligandos (LGIC/GluCl) de los invertebrados están relacionados con los canales de cloruro sensibles a glicina y GABA y se diferencian de los receptores excitadores del glutamato (p. ej,. receptores NMDA o AMPA). Los dos primeros elementos de la familia LGIC/GluCl fueron identificados en el nematodo C. elegans, tras un cribado funcional del receptor de la ivermectina antihelmíntica. Ahora se han clonado otros varios LGIC/GluCl en otras especies de invertebrados. No obstante, todavía no se dispone de pruebas de la existencia de homólogos de los LGIC/GluCl en vertebrados; por este motivo los LGIC/GluCl son objetivos excelentes de los antihelmínticos, los insecticidas, los acaricidas, etc. Algunos moduladores específicos de LGIC/GluCl, tales como el ácido nodulispórico y sus derivados, cuentan con un perfil de seguridad ideal porque carecen de toxicidad basada en el mecanismo en vertebrados. La presente invención se refiere en parte a cuatro clones nuevos de LGIC/GluCl de D. variabilis: DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11, DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 10-2. Los ADNc de DvLGIC/GluCl se aislaron a partir de una genoteca de ADNc de la garrapata Dermacentor. Se utilizaron dos sondas de hibridación. En primer lugar se amplificó con PCR una sonda del gen de GluCl de la garrapata Rhipicephalus sanguineus (RsGluCl) para generar un fragmento que va del nucleótido 448 hasta el 1.645 del marco abierto de lectura de RsGluCl 1. A continuación se amplificó con PCR una segunda sonda procedente del clon GluCl2 del gen de la garrapata R. sanguineus (RsGluCl2) para generar un fragmento que va del nucleótido 166 hasta el 1.315 del marco abierto de lectura de Rs GluCl 2. En la selección original se identificaron ocho clones positivos, incluidos DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11, DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 10-2. Los DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11 y DvLGIC/GluCl 7-1 fueron identificados por ambas sondas mientras que el DvLGIC/GluCl 10-2 sólo fue identificado por la sonda RsLGIC/GluCl 2.

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La presente invención se refiere a la molécula de ADN aislada o purificada que se describe en la figura 1 (DvLGIC/GluCl) y tal como se establece en la SEC ID No:1, que codifica la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis descrita en la figura 2 y establecida como SEC ID No:2, la secuencia de nucleótidos DvLGIC/GluCl 1 es tal como:

1

2

3

La presente invención también se refiere a la molécula de ADN aislada o purificada que se describe en la figura 3 (DvLGIC/GluCl 11) y establecida como SEC ID No:3, que codifica la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis descrita en la figura 2 y establecida como SEC ID No:2, la secuencia de nucleótidos de DvLGIC/GluCl es tal como:

5

6

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La presente invención también se refiere a la molécula de ADN aislada o purificada que se describe en la figura 4 (DvLGIC/GluCl 7-1) y establecida como SEC ID No:4, que codifica la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis descrita en la figura 5 y establecida como SEC ID No:5, la secuencia de nucleótidos de DvLGIC/GluCl 7-1 es tal como

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7

8

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La presente invención también se refiere a la molécula de ADN aislada o purificada que se describe en la figura 6 (DvLGIC/GluCl 10-2) y establecida como SEC ID No:6, que codifica la proteína LGIC/GluCl de D. variabilis descrita en la figura 7 y establecida como SEC ID No:7, la secuencia de nucleótidos de DvLGIC/GluCl 10-2 es tal como:

9

10

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Las moléculas de ADN aisladas que aparecen como ejemplo sobre estas líneas, mostradas en las figuras 1, 3, 4 y 6, respectivamente, comprenden las siguientes características:

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DvLGIC/GluCl 1 (SEC ID No:1):

3.598 nucleótidos de inicio Met (nucl. 170-172) y un codón de terminación "TAG" (nucl. 1.361-1.363), el marco abierto de lectura produce una proteína expresada de 397 aminoácidos, tal como se establece en la SEC ID No:2.

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DvLGIC/GluCl 11 (SEC ID No:3):

3.442 nucleótidos de inicio Met (nucl. 32-34) y un codón de terminación "TAG" (nucl. 1.223-1.225), el marco abierto de lectura produce una proteína expresada de 397 aminoácidos, tal como se establece en la SEC ID No:2. La proteína de DvLGIC/GluCl 11, como la DvLGIC/GluCl 1, comprende la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:2. En las secuencias de nucleótidos que forman parte del marco abierto de lectura de la SEC ID No:3 y la SEC ID No:1 se observan sustituciones en 9 nucleótidos. Tres de las sustituciones son cambios A-G posiblemente debidos a alteraciones en la edición de ARN, mientras que el resto de cambios es más probable que se deban a diferencias alélicas dentro de la población de garrapatas.

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DvLGIC/GluCl 7-1 (SEC ID No:4):

2.194 nucleótidos de inicio Met (nucl. 47-49) y un codón de terminación "TGA" (nucl. 1.313-1.315), el marco abierto de lectura produce una proteína expresada de 442 aminoácidos, tal como se establece en la SEC ID No:5.

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DvLGIC/GluCl 10-2 (SEC ID No:6):

4.177 nucleótidos de inicio Met (nucl. 360-362) y un codón de terminación "TGA" (nucl. 1.329-1.331), el marco abierto de lectura produce una proteína expresada de 323 aminoácidos, tal como se establece en la SEC ID No:7.

El porcentaje de identidad a nivel de nucleótidos para varios de los ejemplos de moléculas de ADNc de la presente invención se obtuvo utilizando el algoritmo de Smith y Waterman mejor ajustado a GCG. A continuación se muestra el porcentaje comparativo de identidad:

LGIC/GluCl\alpha1 de Drosophila (patente n.º 5.693.492 de EE.UU.) y DvLGIC/GluCl 1 - 54.869%;

GluCl\alpha1 de Drosophila y DvLGIC/GluCl 7-1 - 58,029%;

GluCl\alpha1 de Drosophila y DvLGIC/GluCl 10-2 - 54,938%;

DvLGIC/GluCl 1 y DvLGIC/GluCl 7-1 - 66,555%;

DvLGIC/GluCl 1 y DvLGIC/GluCl 10-2 - 75,000%;

DvLGIC/GluCl 1 y DvLGIC/GluCl 11 - 99,246%; y,

DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 10-2 - 69,103%.

Hasta aquí, la presente invención se refiere a una molécula purificada de ácido nucleico que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en la que el ácido nucleico comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de un grupo que consta de las SEC ID Nos:2, 5 y 7; o (b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia moderada con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica las SEC ID Nos:2, 5 y 7; o, (c) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia de moderada a elevada con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos:1, 3, 4 y 6, y esta molécula de ácido nucleico tiene por lo menos un 65% de identidad a nivel de nucleótidos dentro del marco abierto de lectura con por lo menos una de las segundas moléculas de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y 6.

La presente invención también se refiere a fragmentos o mutantes biológicamente activos de las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y 6, respectivamente, que codifican ARNm que expresa una nueva proteína del canal LGIC/GluCl del invertebrado Dermacentor variabilis. Cualquier fragmento y/o mutante biológicamente activo de este tipo codificará bien una proteína o bien un fragmento de proteína que por lo menos emule sustancialmente las propiedades farmacológicas de una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, tal como, pero no se limitan a, proteínas del canal LGIC/GluCl de D. variabilis tal como se establece en la SEC ID No:2, SEC ID No:5 y SEC ID No:7. Cualquier polinucleótido de este tipo incluye, pero no se limitan a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en nucleótidos, tales que estas mutaciones codifican ARNm que expresa un canal funcional de LGIC/GluCl de D. variabilis en una célula eucariota, tal como oocitos de Xenopus, de utilidad en el cribado de actividad agonista y/o antagonista en LGIC/GluCl de D. variabilis.

Un aspecto preferido de esta parte de la presente invención se describe en la figura 1 (SEC ID No:1; denominada DvLGIC/GluCl 1), la figura 3 (SEC ID No:3; denominada DvLGIC/GluCl 11), la figura 4 (SEC ID No:4; denominada DvLGIC/GluCl 7-1) y la figura 6 (SEC ID No:6; denominada DvLGIC/GluCl 10-2) que codifican una nueva proteína de LGIC/GluCl de Dermacentor variabilis.

La presente invención también se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico que son construcciones de fusión que expresan proteínas de fusión de utilidad en análisis para identificar compuestos que modulan la actividad de DvLGIC/GluCl de tipo salvaje, además de generar anticuerpos contra DvLGIC/GluCl. Un aspecto de esta parte de la invención incluye, pero no se limitan a, construcciones de fusión de DvLGIC/GluCl-glutatión-S-transferasa (GST). Las proteínas de fusión recombinantes de GST-DvLGIC/GluCl pueden expresarse en varios sistemas de expresión, como en las células del insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) (Invitrogen) utilizando un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T, Pharmingen). Otro aspecto involucra construcciones de fusión DvLGIC/GluCl vinculadas a diversos marcadores tales como, pero no se limitan a, la proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein, GFP), el epítopo MYC y GST. De nuevo, cualquier construcción de fusión de este tipo puede expresarse en la línea celular de interés y utilizarse para seleccionar moduladores de una o más de las proteínas DvLGIC/GluCl descritas en la presente.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), tal como un ADN genómico y un ADN complementario (ADNc), que puede ser monocatenario (cadena codificante o no codificante) o bicatenario, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido monocatenario sintetizado. La molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención también puede incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).

La degeneración del código genético es tal que, para todos los aminoácidos menos dos, más de un solo codón codifica un aminoácido en particular. Esto permite la construcción de ADN sintético que codifica la proteína de DVLGIC/GluCl en la que la secuencia de nucleótidos del ADN sintético difiere sustancialmente de la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos:1, 3, 4 y 6, pero sigue codificando la misma proteína de DvLGIC/GluCl igual que las SEC ID Nos:1, 3, 4 y 6. Tales ADN sintéticos se pretende que estén dentro del campo de aplicación de la presente invención. Si se quiere expresar tales ADN sintéticos en una célula huésped u organismo en particular, puede ajustarse el uso de codones de tales ADN sintéticos para reflejar el uso de codones de aquel huésped en particular, de modo que se consigue una mayor expresión de la proteína del canal DvLGIC/GluCl en el huésped. En otras palabras, esta redundancia en los diversos codones que codifican aminoácidos específicos se halla dentro del campo de aplicación de la presente invención. Por lo tanto, esta invención también está dirigida a aquellas secuencias de ADN que codifican ARN que comprende codones alternativos que codifican la traducción definitiva del aminoácido idéntico, tal como se muestra a continuación:

A	=	Ala	=	alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU
C	=	Cys	=	cisteína: codones UGC, UGU
D	=	Asp	=	ácido aspártico: codones GAC, GAU
E	=	Glu	=	ácido glutámico: codones GAA, GAG
F	=	Phe	=	fenilalanina: codones UUC, UU
G	=	Gly	=	glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU
H	=	His	=	histidina: codones CAC, CAU
I	=	Ile	=	isoleucina: codones AUA, AUC, AUU
K	=	Lys	=	lisina: codones AAA, AAG
L	=	Leu	=	leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	=	Met	=	metionina: codón AUG
N	=	Asp	=	asparagina: codones AAC, AAU
P	=	Pro	=	prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU
Q	=	Gln	=	glutamina: codones CAA, CAG
R	=	Arg	=	arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	=	Ser	=	serina: codones AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	=	Thr	=	treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU
V	=	Val	=	valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU
W	=	Trp	=	triptófano: codón UGG
Y	=	Tyr	=	tirosina: codones UAC, UAU

Por lo tanto, la presente invención describe una redundancia de codones que puede dar como resultado moléculas de ADN distintas que expresan una misma proteína. Para el propósito de esta memoria, una secuencia en la que se hayan sustituido uno o más codones se definirá como una variación degenerada. Otra variación de la secuencia puede tener lugar durante la edición de ARN, tal como se comenta más abajo. Tal edición de ARN puede producir otra forma de redundancia de codones, en la que la existencia de un cambio en el marco abierto de lectura no produzca un residuo de aminoácidos alterado en la proteína expresada. Las mutaciones, tanto en la secuencia de ADN como en la proteína traducida, que no alteran sustancialmente las propiedades físicas fundamentales de la proteína expresada también se hallan dentro del campo de aplicación de esta invención. Por ejemplo, es posible que la sustitución de una valina por una leucina, una arginina por una lisina o una asparagina por una glutamina no cause ninguna modificación en la funcionalidad del polipéptido.

Es sabido que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden estar alteradas de modo que codifiquen un péptido que tenga propiedades que sean distintas de aquellas del péptido de aparición natural. Entre los procedimientos para alterar las secuencias de ADN se incluye, pero no se limitan a, la mutagénesis sitio-dirigida. Entre los ejemplos de propiedades alteradas se incluyen, pero no se limitan a, modificaciones en la afinidad de una enzima por un sustrato o de un receptor por un ligando.

En la presente invención se incluyen secuencias de ADN de que se hibridan con las SEC ID Nos:1, 3, 4 y 6 en condiciones de astringencia de moderada a muy elevada. A modo de ejemplo, sin que sea una limitación, un procedimiento que utiliza condiciones de astringencia elevada es tal como sigue:

La prehibridación de filtros que contienen ADN se realiza durante un intervalo de 2 horas a toda una noche a 65ºC en un tampón compuesto por SSC 6X, disolución de Denhardt 5X y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante un intervalo de tiempo de 12 a 48 horas a 65ºC en una mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de una sonda marcada con fósforo 32. El lavado de los filtros se lleva a cabo a 37ºC, durante 1 hora, en una disolución que contiene SSC 2X, SDS 0,1%. A continuación se realiza un lavado en SSC 0,1X y SDS 0,1% a 50ºC durante 45 minutos antes de realizar la autorradiografía. Otros procedimientos que utilizan condiciones de astringencia elevada incluirían tanto una etapa de hibridación, que se lleva a cabo en SSC 5X, disolución de Denhardt 5X, formamida al 50% a 42ºC durante un intervalo de 12 a 48 horas, como una etapa de lavado que se lleva a cabo en SSPE 0,2X y SDS 0,2% a 65ºC durante un intervalo de 30 a 60 minutos. Los reactivos mencionados en los procedimientos anteriores para llevar a cabo una hibridación de astringencia elevada son bien conocidos en el estado de la técnica. Los detalles sobre la composición de estos reactivos pueden hallarse en, por ejemplo, Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Además de las mencionadas, pueden utilizarse otras condiciones de astringencia elevada bien conocidas en el estado de la técnica.

La "identidad" es una medida de la identidad entre secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias están alineadas de tal modo que se obtiene el emparejamiento de mayor orden. La "identidad" en sí misma tiene un significado reconocido en el estado de la técnica y puede calcularse utilizando técnicas publicadas. Véase, por ejemplo: (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Mientras que existen numerosos procedimientos para determinar la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido para los expertos en el estado de la técnica (Carillo y Lipton, 1988, SIAM J Applied Math 48: 1.073). Los procedimientos utilizados con mayor frecuencia para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo y Lipton, 1988, SIAM J Applied Math 48: 1.073. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, el programa GCG (Devereux y otros, 1984, Nucleic Acids Research 12(1): 387), BLASTN, FASTA (Altschul y otros, 1990, J Mol. Biol. 215: 403).

A modo de ejemplo, mediante un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos, por ejemplo, un 95% de identidad con una secuencia de nucleótidos de la SEC ID No:1 de referencia se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales o nucleótidos alternativos por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No:1 de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos por lo menos idéntica en un 95% a la secuencia de nucleótidos de referencia, puede eliminarse o sustituirse por otro nucleótido hasta un 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia, o puede insertarse en la secuencia de referencia una cantidad de nucleótidos de hasta un 5% del total de nucleótidos de la secuencia de referencia. Estas mutaciones o sustituciones alternativas de nucleótidos de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, distribuidas tanto individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Una causa de tal "mutación" o alteración que se traduce en una identidad inferior al 100% puede producirse a través de la edición de ARN. El proceso de edición de ARN produce tal modificación en una molécula de ARNm que el uso de tal ARNm modificado como modelo o patrón para generar un ADNc clonado puede causar una o más alteraciones de nucleótidos, las cuales pueden traducirse, o no, en una alteración del codón. Se sabe que esta edición de ARN es catalizada por una ARN editasa. Tal ARN editasa es la ARN adenosina desaminasa, que convierte un residuo de adenosina en un residuo de inosina, que tiende a emular un residuo de citosina. Con este objetivo, la conversión de un residuo de ARNm de A a I se traducirá en transiciones de A a G en las regiones codificantes y no codificantes de un ADNc clonado (por ejemplo, véase Hanrahan y otros, 1999, Annals New York Acad. Sci. 868: 51-66); para una revisión véase Bass (1997, TIBS 22: 157-162).

Igualmente, mediante un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos, por ejemplo, un 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No:2 de referencia se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos puede incluir hasta cinco alteraciones en aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos de la SEC ID No:2 de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 95% a la secuencia de aminoácidos de referencia, puede eliminarse o sustituirse por otro aminoácido hasta un 5% de los residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia, o puede insertarse en la secuencia de referencia una cantidad de aminoácidos de hasta un 5% del total de residuos aminoácidos de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, distribuidas tanto individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia como en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De nuevo, tal como se ha señalado anteriormente, la edición de ARN puede producir una alteración en un codón que se traducirá en la expresión de una proteína que difiere en "identidad" de otras proteínas expresadas a partir de transcritos "sintetizados no de ARN", que se corresponden directamente con el marco abierto de lectura de la secuencia genómica.

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y huéspedes recombinantes, ambos procariotas y eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que se describen a lo largo de esta memoria. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican, por completo o en parte, una proteína del canal DvLGIC/GluCl pueden vincularse con otras moléculas de ADN, es decir moléculas de ADN a las que no se halla vinculada de manera natural la secuencia que codifica DvLGIC/GluCl, para formar "moléculas de ADN recombinante" que codifican una proteína respectiva del canal DvLGIC/GluCl. Las nuevas secuencias de ADN de la presente invención pueden insertarse en vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican DvLGIC/GluCl o un equivalente funcional. Estos vectores pueden estar compuestos por ADN o ARN; en la mayor parte de casos de clonación se prefieren vectores de ADN. Los vectores característicos incluyen plásmidos, virus modificados, bacteriófagos, cósmidos, cromosomas de levadura artificial y otras formas de ADN episómico o integrado que puede codificar una proteína del canal DvLGIC/GluCl. Se halla dentro del alcance del experto determinar un vector apropiado para la transferencia de un gen en particular o para otra aplicación.

La presente invención también se refiere a una forma sustancialmente purificada de una proteína respectiva del canal DvLGIC/GluCl, que comprende la secuencia de aminoácidos que se describe en la figura 2, la figura 5 y la figura 7, y tal como se establece en las SEC ID Nos:2, 5 y 7, respectivamente. Las proteínas de DvLGIC/GluCl descritas contienen un marco abierto de lectura de 397 aminoácidos (DvLGIC/GluCl 1 y DvLGIC/GluCl 11, SEC ID No:2), 442 aminoácidos (DvLGIC/GluCl 7-1, SEC ID No:5) y 323 aminoácidos (DvLGIC/GluCl 10-2, SEC ID No:7) de longitud, tal como se muestra en las figuras 2, 5 y 7, y tal como:

12

120

La figura 8 compara las secuencias de aminoácidos de las proteínas DvLGIC/GluCl 1 y 11 (SEC ID No:2), DvLGIC/GluCl 7-1 (SEC ID No:5) y DvLGIC/GluCl 10-2 (SEC ID No: 7).

La presente invención también se refiere a fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de las proteínas DvLGIC/GluCl que comprenden la secuencia de aminoácidos tal como se establece en las SEC ID Nos:2, 5 y 7, tales como, pero no se limitan a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales en aminoácidos, tales que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de aplicación diagnóstica, terapéutica o profiláctica y que podrían ser útiles para la detección de agonistas y/o antagonistas de la función de DvLGIC/GluCl.

Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a una proteína del canal DvLGIC/GluCl sustancialmente purificada y procesada por completo, obtenida a partir de una célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en las SEC ID Nos:1, 3, 4 y/o 6, y que expresa la proteína respectiva precursora de DvLGIC/GluCl. Es en especial preferible que la célula huésped recombinante sea una célula huésped eucariota, tal como, pero no se limitan a, una línea celular mamífera, una línea celular insectil, tal como las células S2, u oocitos de Xenopus, tal como se señaló anteriormente.

Al igual que con muchas proteínas, es posible modificar muchos de los aminoácidos de la proteína del canal DvLGIC/GluCl y seguir manteniendo sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína de tipo salvaje. Así, esta invención incluye polipéptidos modificados de DvLGIC/GluCl con deleciones, adiciones o sustituciones en aminoácidos, pero que siguen manteniendo sustancialmente la misma actividad biológica que el respectivo DvLGIC/GluCl correspondiente. Generalmente se acepta que las sustituciones en un solo aminoácido normalmente no alteran la actividad biológica de una proteína (véase, por ejemplo, Molecular Biology of the Gene, Watson y otros, 1987, 4.ª ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., pág. 226; y Cunningham & Wells, 1989, Science 244: 1.081-1.085). De acuerdo con esto, la presente invención incluye polipéptidos en los que se ha realizado la sustitución de un aminoácido en las SEC ID Nos:2, 5 y/o 7, en las que los polipéptidos todavía mantienen sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína correspondiente de DvLGIC/GluCl. En particular, la presente invención incluye realizaciones en las que las sustituciones descritas anteriormente son sustituciones conservadoras.

Un experto en la técnica también reconocería que los polipéptidos que son equivalentes funcionales de DvLGIC/GluCl y presentan alteraciones respecto de la secuencia de aminoácidos de DvLGIC/GluCl, que son pequeñas deleciones o inserciones de aminoácidos, también habrían podido producirse siguiendo las mismas indicaciones (es decir, reduciendo al mínimo las diferencias entre las secuencias de aminoácidos de DvLGIC/GluCl y de proteínas relacionadas). Las pequeñas deleciones o inserciones generalmente afectan a intervalos de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. El efecto de tales pequeñas deleciones o inserciones en la actividad biológica del polipéptido modificado de DvLGIC/GluCl puede determinarse fácilmente produciendo sintéticamente el polipéptido o realizando las alteraciones necesarias en el ADN que codifica DvLGIC/GluCl y, a continuación, expresando de manera recombinante el ADN y analizando la proteína producida por tal expresión recombinante.

La presente invención también incluye formas truncadas de DvLGIC/GluCl que contienen la región que comprende el sitio activo de la enzima. Tales proteínas truncadas son de utilidad en varios de los análisis descritos en la presente, en estudios de cristalización y en estudios sobre la relación entre la actividad y la estructura.

La presente invención también se refiere a lisados no purificados que contienen membrana, fracciones de membrana subcelular parcialmente purificadas o sustancialmente purificadas procedentes de células huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como células estables y transformadas/transfectadas temporalmente) que contienen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Estas células huésped recombinantes expresan DvLGIC/GluCl o un equivalente funcional, que tras la traducción pasa a relacionarse con la membrana celular de una manera biológicamente activa. Estas fracciones de membrana subcelular comprenderán tanto formas de tipo salvaje como mutantes de DvLGIC/GluCl a concentraciones sustancialmente superiores a la concentración endógena y, por lo tanto, serán de utilidad para seleccionar moduladores de proteínas o canales de DvLGIC/GluCl. En otras palabras, una aplicación específica de tales membranas subcelulares implica la expresión de DvLGIC/GluCl en la célula recombinante seguida de aislamiento y sustancial purificación de las membranas separadas de otros componentes celulares y su posterior aplicación en análisis para seleccionar moduladores, tales como agonistas o antagonistas de la proteína o canal biológicamente activo que comprende una o más de las proteínas descritas en la presente. Por otro lado, las células lisadas, que contienen las membranas, pueden utilizarse directamente en análisis para seleccionar moduladores de la proteína o proteínas expresadas de manera recombinante. Por lo tanto, otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a un preparado de membrana sustancialmente purificado o a los componentes celulares lisados de manera recombinante entre los que se incluyen membranas, que se han obtenido a partir de una célula huésped recombinante, transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa apropiadamente un marco abierto de lectura, tal como se establece en las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y/o 6, que produce una forma funcional del canal respectivo de DvLGIC/GluCl. Es especialmente preferible que la célula huésped recombinante sea una célula huésped eucariota, tal como, pero no se limitan a, una línea celular mamífera igual que una línea insectil, tal como células S2, u oocitos de Xenopus, tal como se ha señalado anteriormente.

Puede utilizarse cualquiera de varias intervenciones para clonar DvLGIC/GluCl. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a: (1) una técnica de clonación RACE PCR (Frohman y otros., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 8998-9002). La RACE 5' y/o 3' puede realizarse para generar una secuencia de ADNc en toda su longitud. Esta estrategia requiere utilizar cebadores de oligonucleótidos específicos del gen para la amplificación de la PCR del ADNc de DvLGIC/GluCl. Estos cebadores específicos del gen se han determinado mediante la identificación de una secuencia de nucleótidos tag (expressed sequence tag, EST) de secuencia expresada que se ha identificado buscando en cualquier base de datos de proteínas o ácidos nucleicos disponible para el público; (2) la expresión funcional directa del ADNc de DvLGIC/GluCl posterior a la construcción de una genoteca de ADNc que contiene DvLGIC/GluCl en un sistema apropiado de vectores de expresión, (3) el cribado de una genoteca de ADNc que contiene DvLGIC/GluCl construido en un vector lanzadera de bacteriófagos o plásmidos con una sonda marcada de oligonucleótidos en degeneración y diseñada a partir de una secuencia de aminoácidos de la proteína de DvLGIC/GluCl; (4) el cribado de una genoteca de ADNc que contiene DvLGIC/GluCl construida en un vector lanzadera de un bacteriófago o un plásmido con un ADNc parcial que codifica la proteína de DvLGIC/GluCl. Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación específica de PCR de fragmentos de ADN de DvLGIC/GluCl gracias al diseño de cebadores de oligonucleótidos en degeneración procedentes de la secuencia de aminoácidos conocida por otras subunidades de canales iónicos que están relacionadas con la proteína de DvLGIC/GluCl; (5) el cribado de una genoteca de ADNc que contiene DvLGIC/GluCl construido en un vector lanzadera de un bacteriófago o un plásmido con un ADNc parcial o un oligonucleótido homólogo con una proteína de DvLGIC/GluCl. Esta estrategia también puede significar utilizar cebadores de oligonucleótidos específicos para un gen para la amplificación de PCR de ADNc de DvLGIC/GluCl, identificado como un EST tal como se describe anteriormente; o (6) el diseño de oligonucleótidos 5' y 3' específicos para un gen utilizando patrón o modelo las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y/o 6 como, de modo que o bien pueda generarse un ADNc en toda su longitud mediante técnicas RACE conocidas, o bien pueda generarse una parte de la región codificante mediante estas mismas técnicas RACE conocidas, para generar una parte aislada de la región codificante para utilizarla como sonda para cribar uno de los numerosos tipos de ADNc y/o genotecas genómicas para aislar una versión en toda su longitud de la secuencia que codifica DvLGIC/GluCl. Por otro lado, los ADNc de DvLGIC/GluCl 11 (1, 11 y 7) y DvLGIC/GluCl 12 (10-2) de la presente invención pueden clonarse tal como se describe en el ejemplo 1.

Para los expertos en el uso de la técnica es obvio que otros tipos de genotecas, así como genotecas construidas a partir de otros tipos celulares o tipos de especies, pueden ser de utilidad para aislar un ADN que codifique el DvLGIC/GluCl o un homólogo del DvLGIC/GluCl. Otros tipos de genoteca incluyen, pero no se limitan a, genotecas de ADNc derivadas de otros tipos celulares de garrapata americana del perro.

Para los expertos en el uso de la técnica es obvio que pueden prepararse genotecas de ADNc apropiadas a partir de células o líneas celulares que tienen actividad DvLGIC/GluCl. La selección de células o líneas celulares útiles para la preparación de una genoteca de ADNc para aislar un ADNc que codifique DvLGIC/GluCl puede llevarse a cabo determinando en primer lugar la actividad de DvLGIC/GluCl asociada a la célula mediante cualquier análisis conocido disponible para tal propósito.

La preparación de genotecas de ADNc puede realizarse mediante técnicas estándar bien conocidas en el estado de la técnica. Pueden hallarse técnicas conocidas de construcción de una genoteca de ADNc, por ejemplo, en Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Las genotecas de ADN complementario también pueden obtenerse a partir de numerosas fuentes comerciales, tales como, pero no se limitan a, los Clontech Laboratories, Inc. y Stratagene.

Para los expertos en el uso de la técnica también es obvio que el ADN que codifica el DvLGIC/GluCl también puede aislarse a partir de una genoteca genómica apropiada de ADN. La construcción de genotecas genómicas de ADN puede realizarse mediante técnicas estándar bien conocidas en el estado de la técnica. Las técnicas de construcción de una genoteca genómica de ADN pueden hallarse en Sambrook y otros, véase anteriormente. Pueden prepararse genotecas genómicas, especialmente en vectores cromosómicos artificiales de P1, a partir de los cuales pueden aislarse los clones genómicos que contienen el DvLGIC/GluCl utilizando sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de DvLGIC/GluCl descritas en la presente. Los procedimientos para preparar tales genotecas son bien conocidos en el estado de la técnica (Ioannou y otros., 1994, Nature Genet. 6: 84-89).

Para clonar un gen de DvLGIC/GluCl mediante uno de los procedimientos preferidos, quizás sea necesaria una secuencia de ADN de DvLGIC/GluCl o una proteína homóloga. Para ello, puede purificarse una proteína respectiva del canal DvLGIC/GluCl y determinarse la secuencia parcial de aminoácidos mediante secuenciadores automatizados. No es necesario determinar la secuencia completa de aminoácidos, pero puede determinarse la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos para la amplificación de la PCR de un fragmento parcial de ADN de DvLGIC/GluCl. Una vez que se han identificado las secuencias de aminoácidos apropiadas, se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Puesto que el código genético es degenerado, puede utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido en particular y, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de una serie de oligonucleótidos similares de ADN. Sólo un elemento de la serie será idéntico a la secuencia de DvLGIC/GluCl, pero otros elementos de la serie podrán hibridar el ADN de DvLGIC/GluCl incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con errores. Los oligonucleótidos emparejados incorrectamente del ADN podrán seguir hibridándose suficientemente con el ADN de DvLGIC/GluCl para permitir la identificación y el aislamiento de ADN que codifique el DvLGIC/GluCl. Por otro lado, la secuencia de nucleótidos de una región de una secuencia expresada puede identificarse mediante buscando una o más bases de datos genómicas disponibles. Pueden utilizarse cebadores específicos para un gen para llevar a cabo la amplificación de la PCR de un ADNc de interés a partir de una genoteca de ADNc o de una población de ADNc. Tal como se ha señalado anteriormente, puede obtenerse la secuencia apropiada de nucleótidos de aplicación en un procedimiento basado en una PCR a partir de las SEC ID Nos: 1, 3, 4 y/o 6, tanto para el propósito de aislar productos RACE 5' y 3' para la generación en toda su longitud de una secuencia que codifique el DvLGIC/GluCl como para aislar una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el DvLGIC/GluCl para utilizarla como sonda para seleccionar uno o más ADNc o genotecas de base genómica para aislar en toda su longitud una secuencia que codifique DvLGIC/GluCl o proteínas del tipo DvLGIC/GluCl.

Esta invención también incluye vectores que contienen un gen de DvLGIC/GluCl, células huésped que contienen los vectores y procedimientos para purificar sustancialmente la proteína de DvLGIC/GluCl que comprenden las etapas de introducir el gen de DvLGIC/GluCl en una célula huésped y cultivar la célula huésped bajo condiciones apropiadas tales que se produzca DvLGIC/GluCl. El DvLGIC/GluCl producido de este modo puede obtenerse de manera convencional a partir de las células huésped. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a procedimientos para expresar la proteína de DvLGIC/GluCl y equivalentes biológicos descritos en la presente, análisis que utilizan estos productos génicos, células huésped recombinantes que comprenden construcciones de ADN que actúan como agonistas o antagonistas de la actividad DvLGIC/GluCl.

El ADNc de DvLGIC/GluCl clonado obtenido a través de los procedimientos descritos anteriormente pueden expresarse de manera recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión (tal como pcDNA3.neo, pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 o pLITMUS28, así como otros ejemplos, mencionados anteriormente) que contiene un promotor apropiado y otros elementos apropiados reguladores de la transcripción, y transferirse a células huésped procariotas o eucariotas para producir DvLGIC/GluCl recombinante. Los vectores de expresión se definen en la presente como secuencias de ADN necesarias para la transcripción de ADN clonado y la traducción de sus ARNm en un huésped apropiado. Tales vectores pueden utilizarse para expresar ADN eucariota en una variedad de huéspedes tales como bacterias, cianobacterias, células vegetales, células de insectos y células de mamíferos (por ejemplo, células humanas HEL). Algunos vectores diseñados específicamente para ello permiten el intercambio de ADN entre huéspedes tales como células de bacterias de levaduras y de bacterias de mamíferos. Un vector de expresión apropiadamente construido debería contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios útiles en las enzimas de astringencia, potencial para un número elevado de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige una polimerasa de ARN para que se una a un ADN e inicie la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que origina el inicio de los ARNm a una frecuencia elevada. Para determinar la secuencia, o secuencias, de ADNc de DvLGIC/GluCl que produce niveles óptimos de DvLGIC/GluCl, pueden construirse moléculas de ADNc que incluyan, pero no se limitan a, lo siguiente: un fragmento de ADNc que contenga, en toda su longitud, un marco abierto de lectura para DvLGIC/GluCl, así como varias construcciones que contengan partes de ADNc que sólo codifiquen dominios específicos de la proteína o dominios reorganizados de la proteína. Todas las construcciones pueden diseñarse para que contengan todos, algunos o ninguno de los elementos de la región sin traducir 5' y/o 3' de un ADNc de DvLGIC/GluCl. Los niveles de expresión y la actividad de DvLGIC/GluCl pueden determinarse siguiendo la introducción, tanto individualmente como en combinación, de estas construcciones en células huésped apropiadas. Tras la determinación del cartucho de ADNc de DvLGIC/GluCl que produce la expresión óptima en análisis transitorios, esta construcción de ADNc de DvLGIC/GluCl es transferida a una variedad de vectores de expresión (incluidos los virus recombinantes) entre los que se incluyen, pero no se limitan a, los de mamíferos, células vegetales, células de insectos, oocitos, bacterias y células de levaduras. Las técnicas para tales manipulaciones, descritas en Sambrook y otros, véase anteriormente, son bien conocidas y se hallan disponibles para cualquier experto en el uso de la técnica. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención incluye células huésped que han sido genomanipuladas para que contengan y/o expresen secuencias de ADN que codifiquen el DvLGIC/GluCl. Para la expresión de DvLGIC/GluCl en una célula huésped recombinante puede utilizarse un vector de expresión que contenga ADN que codifique un proteína del tipo DvLGIC/GluCl. Tales células huésped recombinantes pueden cultivarse en condiciones adecuadas para producir DvLGIC/GluCl o una forma biológicamente equivalente. Entre los vectores de expresión pueden incluirse, pero no se limitan a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus diseñados específicamente. Entre los vectores de expresión de mamíferos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de DvLGIC/GluCl se incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29 y pLITMUS39 (New England Biolabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pcMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATTC 37593), pBPV-1(8-2) (ATTC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATTC 37224), pRSVgpt (ATTC 37199), pRSVneo (ATTC 37198), pSV2-dhfr (ATTC 37146), pUCTag (ATTC 37460) y IZD35 (ATTC 37565). Asimismo, puede utilizarse una variedad de vectores de expresión bacteriana para expresar DvLGIC/GluCl recombinante en células bacterianas. Entre los vectores de expresión comercialmente disponibles que pueden ser adecuados para la expresión de DvLGIC/GluCl recombinante se incluyen, pero no se limitan a, pcR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen) y pKK223-3 (Pharmacia). Además, puede utilizarse una variedad de vectores de expresión de células fúngicas para expresar DvLGIC/GluCl recombinante en células fúngicas. Los vectores de expresión de células fúngicas comercialmente disponibles que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de DvLGIC/GluCl incluyen, pero no se limitan a, pYES2 (Invitrogen) y un vector de expresión de Pychia (Invitrogen). Asimismo, puede utilizarse una variedad de vectores de expresión de células de insectos para expresar una proteína recombinante en células de insectos. Los vectores de expresión de células de insectos comercialmente disponibles que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de DvLGIC/GluCl incluyen, pero no se limitan a, pBluebacIII y pBlueBacHis2 (Invitrogen), así como pAcG2T (Pharmingen).

Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, que incluyan pero no se limitan a bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levaduras, células de mamíferos tales como, pero no se limitan a, líneas celulares de origen bovino, porcino, de mono o de roedores; y células de invertebrados tales como, pero no se limitan a, D. variabilis y líneas celulares derivadas del gusano de seda. Por ejemplo, un sistema de expresión de insectos utiliza células del insecto Spodoptera frugiperda (sf21) (Invitrogen) junto con un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T, Pharmingen). Asimismo, las especies de mamíferos que pueden ser adecuadas y que se hallan comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, células L-M(TK^{-}) (ATTC CCL 1.3), células L-M (ATTC CCL 1.2), Saos-2 (ATTC HTB-85), 293 (ATTC CRL 1573), Raji (ATTC CCL 86), CV-1 (ATTC CCL 70), COS-1 (ATTC CRL 1650), COS-7 (ATTC CRL 1651), CHO-K1 (ATTC CCL 61), 3T3 (ATTC CCL 92), NIH/3T3 (ATTC CRL 1658), HeLa (ATTC CCL 2), C127I (ATTC CRL 1616), BS-C-1 (ATTC CCL 26), MRC-5 (ATTC CCL 171) y CPAE (ATTC CCL 209).

Un aspecto preferido para seleccionar moduladores de la actividad del canal DvLGIC/GluCl es un sistema de expresión para análisis electrofisiológicos para determinar la actividad del canal sensible a ligandos (tal como la actividad del canal GluCl) que comprende inyectar las moléculas de ADN o ARN de la presente invención en oocitos de Xenopus laevis. La utilización general de oocitos de Xenopus en el estudio de la actividad del canal iónico es conocida en el estado de la técnica (Dascal, 1987, Crit. Rev. Biochem. 22: 317-317; Lester, 1988, Science 241: 1.057-1.063; véase también Methods of Enzimology, vol.207, 1992, Caps. 14-25, Rudy y Iverson, eds., Academic Press, Inc., Nueva York). Los oocitos de Xenopus se inyectan junto con ácido nucleico que incluye, pero no se limitan a, ADN, ARNm o ARNc que codifican un canal sensible a ligandos, en el que después la actividad del canal también puede determinarse como respuesta del canal a los diversos moduladores.

La especificidad de los compuestos de unión que muestran afinidad por LGIC/GluCl se muestra determinando la afinidad de los compuestos para células recombinantes que expresan el receptor clonado o para membranas procedentes de estas células, que forman una canal funcional homomultimérico o heteromultimérico. La expresión del receptor clonado y la selección de compuestos que se unen a LGIC/GluCl o que inhiben la unión de un ligando conocido de LGIC/GluCl a estas células, o membranas preparadas a partir de estas células, proporciona un procedimiento efectivo para la selección rápida de compuestos con una afinidad elevada por LGIC/GluCl. Los compuestos identificados mediante el procedimiento anterior son probablemente agonistas o antagonistas de LGIC/GluCl y pueden ser péptidos, proteínas o moléculas orgánicas o inorgánicas no proteínicas.

De acuerdo con esto, la presente invención se dirige a procedimientos de selección de compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica una proteína de LGIC/GluCl. Los procedimientos para identificar agonistas y antagonistas de otros receptores son bien conocidos en el estado de la técnica y pueden adaptarse para identificar agonistas y antagonistas de un canal de LGIC/GluCl. Por ejemplo, Cascieri y otros (1992, Molec. Pharmacol. 41: 1096-1099) describen un procedimiento para identificar sustancias que inhiben la unión de agonistas a receptores de neurocinina en el gato y de este modo son agonistas o antagonistas potenciales de los receptores de neurocinina. El procedimiento implica transfectar células COS con vectores de expresión que contienen receptores de la neurocinina de rata, lo que permite que las células transfectadas crezcan durante un tiempo suficiente como para que se expresen los receptores de neurocinina, recoger las células transfectadas y resuspender las células en un tampón de valoración que contenga un agonista conocido, marcado radiactivamente, de los receptores de la neurocinina, tanto en presencia como en ausencia de la sustancia, y, a continuación, determinar la unión del agonista conocido y marcado radiactivamente al receptor de la neurocinina. Si el porcentaje de unión del agonista conocido es menor en presencia de la sustancia que en ausencia de la sustancia, entonces la sustancia es un ligando potencial del receptor de la neurocinina. A la hora de determinar la unión de una sustancia, tal como un agonista o un antagonista, al LGIC/GluCl, tal unión puede determinarse utilizando un ligando marcado. El ligando puede marcarse de cualquier modo conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, radiactivamente, por fluorescencia, enzimáticamente.

Por lo tanto, la presente invención se dirige a procedimientos de selección de compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifican una proteína de DvLGIC/GluCl. Los compuestos que modulan esta actividad pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas orgánicas o inorgánicas no proteínicas. Los compuestos pueden modular aumentando o atenuando la expresión de ADN o ARN que codifica DvLGIC/GluCl o la función de los canales DvLGIC/GluCl. Los compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica DvLGIC/GluCl o la función biológica del mismo pueden detectarse mediante una variedad de análisis. El análisis puede ser un simple ensayo de "sí o no" para determinar si hay o no un cambio en la expresión o la función. El análisis puede ser cuantitativo comparando la expresión o función de una prueba simple con los niveles de expresión o función en una muestra estándar. Los equipos (kits) que contienen DvLGIC/GluCl, anticuerpos de DvLGIC/GluCl o DvLGIC/GluCl modificado pueden prepararse mediante procedimientos conocidos para estos usos.

Hasta aquí, la presente invención se refiere en parte a procedimientos para identificar una sustancia que modula la actividad del receptor LGIC/GluCl que implican:

(a)

añadir una sustancia de prueba en presencia y en ausencia de una proteína receptora de LGIC/GluCl en el que dicha proteína receptora de LGIC/GluCl comprende la secuencia de aminoácidos tal como se establece en las SEC ID Nos: 2, 6 y/o 7; y,

(b)

determinar y comparar el efecto de la sustancia de prueba en presencia y en ausencia de la proteína receptora de LGIC/GluCl o del canal funcional respectivo.

Además, en la presente se describen varias realizaciones específicas para mostrar los diversos tipos de análisis de cribado o de selección que el experto en el uso de la técnica puede utilizar junto con un vector de expresión dirigiendo la expresión de la proteína receptora de LGIC/GluCl. Los procedimientos para identificar ligandos de otros receptores son bien conocidos en el estado de la técnica y pueden adaptarse a ligandos de LGIC/GluCl. Por lo tanto, estas realizaciones se presentan como ejemplos y no como limitaciones. Hasta aquí, la presente invención incluye análisis mediante los cuales pueden identificarse moduladores de LGIC/GluCl (tales como agonistas o antagonistas). De acuerdo con esto, la presente invención incluye un procedimiento para determinar si una sustancia es un agonista o antagonista potencial de LGIC/GluCl que comprende:

(a)

transfectar o transformar células con un vector de expresión que dirige la expresión de LGIC/GluCl en las células, produciendo células de prueba;

(b)

permitir el crecimiento de las células de prueba durante un tiempo suficiente para que se exprese LGIC/ GluCl y se origine un canal funcional;

(c)

exponer las células a un ligando marcado de LGIC/GluCl en presencia y en ausencia de la sustancia;

(d)

determinar la unión del ligando marcado al canal LGIC/GluCl; si el porcentaje de unión al ligando marcado es inferior en presencia de la sustancia que en ausencia de la sustancia, la sustancia es un ligando potencial de LGIC/GluCl.

Las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la etapa (c) del procedimiento son las condiciones que habitualmente se utilizan en la técnica para el estudio de interacciones proteína-ligando: por ejemplo, pH fisiológico; condiciones de salinidad tales como las representadas por tales tampones de uso habitual como PBS o en medios de cultivo tisular; una temperatura de entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 55ºC. Las células de prueba pueden recogerse y resuspenderse en presencia de la sustancia y del ligando marcado. En una modificación del procedimiento descrito anteriormente, se modifica la etapa (c) de tal manera que se recoge y resuspende el agonista conocido marcado radiactivamente en lugar de las células y la sustancia entra en contacto con las células mientras las células se hallan unidas a un sustrato, por ejemplo, placas de cultivo tisular.

La presente invención también incluye un procedimiento para determinar si una sustancia puede unirse a LGIC/
GluCl, es decir, si la sustancia es un modulador potencial de la activación del canal LGIC/GluCl, donde el procedimiento comprende:

(a)

transfectar o transformar células con un vector de expresión que dirige la expresión de LGIC/GluCl en las células, produciendo células de prueba;

(b)

exponer las células de prueba a la sustancia;

(c)

determinar el porcentaje de unión de la sustancia a LGIC/GluCl;

(d)

comparar el porcentaje de unión de la sustancia a LGIC/GluCl en las células de prueba con el porcentaje de unión de la sustancia en las células de control que no han sido transfectadas con LGIC/GluCl;

en el que si el porcentaje de unión a la sustancia es mayor en las células de prueba en comparación con las células de control, la sustancia puede unirse a LGIC/GluCl. A continuación puede determinarse si la sustancia es en realidad un agonista o un antagonista mediante el uso de análisis funcionales, tales como un análisis electrofisiológico descrito en la presente.

Las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la etapa (b) del procedimiento son condiciones que habitualmente se utilizan en la técnica para el estudio de las interacciones proteínas-ligandos: por ejemplo, pH fisiológico; condiciones de salinidad tales como las representadas por tales tampones de uso habitual como PBS o en medios de cultivo tisular; una temperatura de aproximadamente entre 4ºC y aproximadamente 55ºC. Las células de prueba son recogidas y resuspendidas en presencia de la sustancia.

Los análisis descritos anteriormente pueden ser análisis funcionales, en los que los ensayos electrofisiológicos (por ejemplo, véase ejemplo 2) se llevan a cabo en líneas celulares de mamíferos transfectadas, en una línea celular insectil o en oocitos de Xenopus para determinar los diversos efectos que los compuestos de prueba pueden tener sobre la capacidad de un ligando conocido (tal como glutamato) para activar el canal, o para que un compuesto de prueba module la actividad en el mismo y de sí mismo (parecido al efecto de la ivermectina sobre canales conocidos de LGIC/GluCl). Por lo tanto, el experto en el uso de la técnica no tendrá problemas para adaptar los clones de ADNc de la presente invención a una metodología conocida para que en ambas selecciones inicial y secundaria se seleccionen compuestos que se unan y/o activen los canales funcionales de LGIC/GluCl de la presente invención.

Un procedimiento preferido para identificar un modulador de la proteína del canal LGIC/GluCl comprende en primer lugar establecer contacto entre un compuesto de prueba y una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis seleccionada del grupo que consta de SEC ID No: 2, SEC ID No: 5 y SEC ID No: 7 y, en segundo lugar, determinar el efecto del compuesto de prueba en la proteína del canal LGIC/GluCl. Un aspecto preferido implica utilizar una proteína de LGIC/GluCl de D. variabilis que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula huésped recombinante.

Otro procedimiento preferido para identificar un compuesto que modula la actividad de la proteína del canal sensible a glutamato LGIC/GluCl comprende en primer lugar inyectar en una célula huésped una población de moléculas de ácido nucleico, de la que por lo menos una parte codifique una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis seleccionada del grupo que consta de SEC ID No: 2, SEC ID No: 5 y SEC ID No: 7, de modo que la expresión de dicha parte de moléculas de ácido nucleico active un canal sensible a ligandos, en segundo lugar determinar la corriente de la membrana de la célula huésped en presencia y en ausencia de un compuesto de prueba. Pueden utilizarse numerosos modelos o patrones, tales como, pero no se limitan a, ADN complementario, ARN mensajero poli A^{+} y ARN complementario.

Las moléculas de ADN, las moléculas de ARN, la proteína recombinante y los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para seleccionar y determinar la concentración de DvLGIC/GluCl. Las proteínas recombinantes, las moléculas de ADN, las moléculas de ARN y los anticuerpos son aptos para establecer equipos (kits) adecuados para la detección y tipificación de DvLGIC/GluCl. Tal equipo (kit) comprendería un portador compartimentado adecuado para restringir firmemente por lo menos un contenedor. Además, el portador comprendería reactivos tales como anticuerpos recombinantes DvLGIC/GluCl o anti-DvLGIC/GluCl adecuados para detectar DvLGIC/GluCl. El portador también puede contener un medio de detección, tal como un antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Los análisis descritos en la presente pueden llevarse a cabo con células que han sido transfectadas transitoriamente o de manera estable con DvLGIC/GluCl. Puede introducirse el vector de expresión en células huésped mediante cualquiera de numerosas técnicas entre las que se incluyen, pero no se limitan a, la transformación, la transinfección, la fusión protoplástica y la electroporación. La transinfección incluye cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica para introducir DvLGIC/GluCl en las células de prueba. Por ejemplo, la transinfección incluye transinfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio, lipofección, infección con una construcción retroviral que contiene DvLGIC/GluCl y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión son analizadas individualmente para determinar si producen proteína DvLGIC/GluCl. La identificación de células que expresan DvLGIC/GluCl puede llevarse a cabo de distintas maneras entre las que se incluyen, pero no se limitan a, la reactividad inmunológica con anticuerpos anti-DvLGIC/GluCl, la unión a ligandos marcados o la presencia de actividad funcional no endógena de DvLGIC/GluCl.

La especificidad de la unión de compuestos que muestran afinidad por DvLGIC/GluCl se muestra determinando la afinidad de los compuestos por células recombinantes que expresan el receptor clonado o por membranas de estas células. La expresión del receptor clonado y la selección de compuestos que se unan a DvLGIC/GluCl o que inhiban la unión de un ligando, conocido, de DvLGIC/GluCl a estas células o a membranas preparadas a partir de estas células, proporciona un procedimiento efectivo para la selección rápida de compuestos con una afinidad elevada por DvLGIC/GluCl. No es necesario que tales ligandos estén radiomarcados sino que también puede tratarse de compuestos no isotópicos que pueden utilizarse para desplazar los compuestos unidos marcados mediante radiactividad, fluorescencia y enzimas o que pueden utilizarse como activadores en análisis funcionales. Los compuestos identificados mediante el procedimiento anterior es probable que sean agonistas o antagonistas de DvLGIC/GluCl.

Por lo tanto, la especificidad de unión de los compuestos que tienen afinidad por DvLGIC/GluCl se muestra determinando la afinidad de los compuestos por células recombinantes que expresan el receptor clonado o por membranas de estas células. La expresión del receptor clonado y la selección de compuestos que se unen a DvLGIC/GluCl o que inhiben la unión de un ligando radiomarcado conocido de DvLGIC/GluCl (tales como glutamato, ivermectina o ácido nodulispórico) a estas células, o membranas preparadas a partir de estas células, proporcionan un procedimiento efectivo para la selección rápida de compuestos con una afinidad elevada por DvLGIC/GluCl. Tales ligandos no es necesario que estén radiomarcados sino que también pueden ser compuestos no isotópicos que pueden utilizarse para desplazar los compuestos unidos marcados radiactivamente, por fluorescencia y enzimáticamente o que pueden utilizarse como activadores en análisis funcionales. Los compuestos identificados mediante el procedimiento anterior es probable que de nuevo sean agonistas o antagonistas de DvLGIC/GluCl. Tal como se señalado en otra parte de esta memoria, los compuestos pueden modular mediante el aumento o la atenuación de la expresión de ADN o ARN que codifica DvLGIC/GluCl o actuando como agonistas o antagonistas de la proteína receptora de DvLGIC/GluCl. De nuevo, estos compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica DvLGIC/GluCl o la función biológica del mismo pueden detectarse mediante varios análisis. El análisis puede ser un simple análisis de "sí o no" para determinar si se ha producido alguna modificación en la expresión o función. Para que el análisis sea cuantitativo se compara
la expresión o función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o función en una muestra estándar.

La expresión de ADN de DvLGIC/GluCl también puede llevarse a cabo utilizando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético puede traducirse de manera eficaz en varios sistemas que carezcan de células, tales como, pero no se limitan a, extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse de manera eficaz en sistemas de base celular, tales como, pero no se limitan a, la microinyección en oocitos de rana, siendo la microinyección con oocitos de rana el sistema preferido.

Tras la expresión de DvLGIC/GluCl en una célula huésped, puede recuperarse la proteína de DvLGIC/GluCl para proporcionar una proteína de DvLGIC/GluCl en su forma activa. Para ello se dispone de varios procedimientos adecuados de purificación de proteína de DvLGIC/GluCl. La proteína recombinante de DvLGIC/GluCl puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares por medio de diversas combinaciones, o por aplicación individual de fraccionamiento de sales, de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía por adsorción de hidroxiapatita y cromatografía por interacción hidrófoba. Además, la proteína recombinante de DvLGIC/GluCl puede separarse de otras proteínas celulares utilizando una columna de inmunoafinidad establecida con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de la proteína de DvLGIC/GluCl en toda su longitud o con fragmentos polipeptídicos de la proteína DvLGIC/GluCl.

Los análisis funcionales del canal de D. variabilis determinan una o más actividades del canal de cloruro sensible a ligandos en las que el canal es producido en su totalidad, o en parte, por el canal de DvLGIC/GluCl. La actividad del canal de DvLGIC/GluCl puede determinarse utilizando el propio canal descrito en la presente; o como subunidad en combinación con una o más subunidades adicionales del canal de cloruro sensible a ligandos (preferiblemente uno o más DvLGIC/GluCl), en el que las subunidades se combinan entre sí para proporcionar actividad funcional al canal. Los análisis que determinan la actividad del canal de cloruro controlado DvLGIC/GluCl incluyen selección funcional utilizando Cl^{36}, selección funcional utilizando electrofisiología de pinzamiento zonal de membrana y selección funcional utilizando tintes fluorescentes. Las técnicas para llevar a cabo tales análisis son, en general, bien conocidas por el experto en la técnica. (Véase, por ejemplo, Smith y otros, 1998, European Journal of Pharmacology 159: 261-269; González y Tsien, 1997, Chemistry & Biology 4: 269-277; Millar y otros, 1994, Proc. R. Soc. Lond. B. 258: 307-314; Rauh y otros, 1990, TiPS 11: 325-329, y Tsien y otros, patente de EE.UU. n.º 5.661.035.) Pueden realizarse análisis funcionales utilizando compuestos o preparados que contengan distintos compuestos. Una preparación que contenga distintos compuestos de los cuales uno o más compuestos influyan en la actividad del canal DvLGIC/GluCl puede dividirse en grupos más pequeños de compuestos para identificar el compuesto o compuestos que influyen en la actividad del canal DvLGIC/GluCl. En una realización de la presente invención se utiliza un preparado de prueba que contenga por lo menos 10 compuestos en un análisis funcional. En un análisis funcional pueden utilizarse los canales de DvLGIC/GluCl, producidos mediante recombinación, presentes en distintos entornos. Los entornos adecuados incluyen extractos de células vivas y de células purificadas que contienen el canal DvLGIC/GluCl y una membrana apropiada para la actividad; y el uso de un canal de DvLGIC/GluCl purificado producido mediante recombinación significa que se ha introducido en un entorno distinto, adecuado para determinar la actividad del canal de DvLGIC/GluCl. Pueden utilizarse derivados de DvLGIC/GluCl para analizar compuestos activos en el canal y para obtener información concerniente a regiones distintas del canal. Por ejemplo, pueden producirse derivados del canal de DvLGIC/GluCl en las regiones de aminoácidos del canal nativo que están alteradas y puede determinarse el efecto de la alteración en la actividad del canal para obtener información relativa a las distintas regiones del canal.

Pueden cultivarse anticuerpos monoclonales o policlonales contra DvLGIC/GluCl o un péptido sintético (habitualmente de 9 a 25 aminoácidos de longitud) a partir de una parte de DvLGIC/GluCl 1 (es decir, 1, 11 o 7-1) o de DvLGIC/GluCl 2 (10-2), tal como se describe en las SEC ID Nos: 2, 5 y/o 7. Los anticuerpos monoespecíficos de DvLGIC/GluCl se purifican de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos contra DvLGIC/GluCl o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con DvLGIC/GluCl utilizando la técnica de Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497). Tal como se utiliza en la presente, el anticuerpo monoespecífico se define como una sola especie de anticuerpo o una especie de anticuerpo múltiple con características de unión homogéneas para DvLGIC/GluCl. La unión homogénea, tal como se describe en la presente, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico, tales como aquellos asociados a DvLGIC/GluCl, tal como se describe anteriormente. Los anticuerpos humanos específicos de DvLGIC/GluCl se cultivan inmunizando a animales tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, con una concentración adecuada de proteína de DvLGIC/GluCl o de péptido sintético generado a partir de una parte de DvLGIC/GluCl con o sin adyuvante inmunitario.

El suero preinmunitario se extrae antes de la primera vacunación. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1.000 mg de proteína de DvLGIC/GluCl asociada a un adyuvante inmunitario aceptable. Tales adyuvantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, completo de Freund, incompleto de Freund, precipitado de aluminio, agua en emulsión de aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La vacunación inicial consta de proteína de DvLGIC/GluCl o de fragmento péptido de la misma en, preferiblemente, un adyuvante completo de Freund en múltiples localizaciones tanto subcutáneas (SC) como intraperitoneales (IP), o ambas. Se saca sangre a cada animal a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente, para determinar la valoración de anticuerpos. Los animales pueden recibir, o no, inyecciones de recuerdo tras la vacunación inicial. Los animales que reciben inyecciones de recuerdo reciben generalmente una misma cantidad de DvLGIC/GluCl en adyuvante incompleto de Freund mediante la misma vía. Las inyecciones de recuerdo se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen valoraciones máximas. Aproximadamente a los 7 días de cada vacunación de recuerdo, o aproximadamente cada semana tras una única vacunación, se saca sangre a los animales, se extrae el suero y se almacenan las partes alícuotas a una temperatura aproximada de -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (monoclonal antibodies, mAb) reactivos con DvLGIC/GluCl se preparan vacunando a ratones de laboratorio, preferiblemente Balb/c, con proteína de DvLGIC/GluCl. Los ratones se vacunan por vía IP o SC con aproximadamente entre 1 mg y 1.000 mg, preferiblemente aproximadamente 10 mg, de proteína de DvLGIC/GluCl en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución salina incorporados en un mismo volumen de un adyuvante aceptable, tal como se comenta anteriormente. Se prefiere adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una vacuna inicial el día 0 y permanecen en reposo durante un período aproximado de entre 3 y 30 semanas. Los ratones vacunados reciben una o más vacunas de recuerdo de aproximadamente 1 a 100 mg de DvLGIC/GluCl en una disolución tamponada, tal como solución salina tamponada con fosfato, por vía intravenosa (IV). Los linfocitos, procedentes de ratones con anticuerpos, preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtienen eliminando el bazo a ratones vacunados mediante procedimientos estándar conocidos en el estado de la técnica. Las células del hibridoma se producen mezclando los linfocitos esplénicos con un elemento (partner) de fusión adecuado, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los elementos (partner) de fusión pueden ser, pero no se limitan a, mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, siendo Sp 2/0 el preferido. Las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma se fusionan en glicol polietileno, aproximadamente 1.000 en peso molar, a concentraciones de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. Las células fusionadas del hibridoma son seleccionadas por crecimiento en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Los líquidos del sobrenadante de los pocillos de crecimiento positivo se extraen aproximadamente los días 14, 18 y 21 y se seleccionan para la producción de anticuerpos mediante inmunoanálisis, tal como radioinmunoanálisis de fase sólida (SPIRA), utilizando el DvLGIC/GluCl como antígeno. Los líquidos del cultivo también se someten a prueba mediante análisis de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb. Las células del hibridoma procedentes de pocillos que han dado positivo para anticuerpos son clonadas mediante una técnica tal como la técnica de agar blando de MacPherson, 1973, Soft Agar Thecniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, eds., Academic Press.

Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo inyectando a nuevos ratones Balb/c cebados con pristina, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con entre aproximadamente 2 x 10^{6} y aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma al cabo de unos 4 días después de la sensibilización. El líquido ascítico se extrae al cabo de aproximadamente 8-12 días tras la transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica.

La producción in vitro de mAb anti-DvLGIC/GluCl se lleva a cabo cultivando el hibridoma en DMEM que contenga aproximadamente un 2% de suero fetal de ternera para obtener una cantidad suficiente del mAb específico. Los mAb se purifican mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica.

Las valoraciones de ascitis en los anticuerpos o los líquidos de cultivo del hibridoma se determinan mediante varios análisis serológicos o inmunológicos entre los que se incluyen, pero no se limitan a, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de enzimoinmunoanálisis de adsorción (enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA) y técnicas de radioinmunoanálisis (RIA). Se utilizan análisis parecidos para detectar la presencia de DvLGIC/GluCl en los líquidos corporales o en los extractos celulares y tisulares.

Para los expertos en la técnica está claro que pueden utilizarse los procedimientos descritos anteriormente de producción de anticuerpos monoespecíficos para producir anticuerpos específicos para fragmentos péptidos de DvLGIC/GluCl, o para un DvLGIC/GluCl respectivo en toda su longitud.

Las columnas de afinidad por anticuerpos se construyen, por ejemplo, añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un sustrato en gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el sustrato en perlas de gel de agarosa. A continuación, con el brazo espaciador se acoplan los anticuerpos con el gel mediante enlaces amida. Entonces se detienen los restantes ésteres activados con 1 M de etanolamina-HCl (pH 8). La columna se lava con agua seguido de 0,23 M de glicina-HCl (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. A continuación se equilibra la columna en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) y se pasan lentamente a través de la columna los sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que contienen DvLGIC/GluCl en toda su longitud o fragmentos de proteína de DvLGIC/GluCl. A continuación se lava la columna con solución salina tamponada con fosfato hasta que la densidad óptica (A_{280}) descienda y se iguale con la del entorno, entonces se eluye la proteína con 0,23 M de glicina-HCl (pH 2,6). A continuación se separa la proteína purificada de DvLGIC/GluCl mediante diálisis con solución salina tamponada con fosfato.

La presente invención también se refiere a un animal transgénico no humano que sirve para estudiar la capacidad de una variedad de compuestos para actuar como moduladores de DvLGIC/GluCl, o de cualquier otro canal funcional de DvLGIC/GluCl in vivo para proporcionar células para el cultivo in vitro. En lo que se refiere a los animales transgénicos de esta invención, se hace referencia a transgenes y genes. Tal como se utiliza en la presente, un transgén es una construcción genética que incluye un gen. El transgén se integra en uno o más cromosomas en las células de un animal mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Una vez integrado, se transporta el transgén a por lo menos un lugar en el cromosoma de un animal transgénico. Evidentemente, un gen es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, tal como un clon de ADNc o una combinación de los clones de ADNc descritos en la presente. El gen y/o transgén también puede incluir elementos genéticos reguladores y/o elementos estructurales conocidos en el estado de la técnica. Un tipo de célula objetivo para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria. Las células madre embrionarias pueden obtenerse a partir del embrión preimplantado cultivado in vitro y fusionado con el embrión (Evans y otros, 1981, Nature 292: 154-156; Bradley y otros, 1984, Nature 309: 255-258; Gossler y otros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 83: 9065-9069; y Robertson y otros, 1986, Nature 322: 445-448). Los transgenes pueden introducirse de manera eficaz en las células madre embrionarias mediante una variedad de técnicas estándar, tales como la transinfección de ADN, la microinyección, o mediante la transducción mediada por retrovirus. Las células madre embrionarias transformadas que se producen pueden combinarse entonces con blastocitos procedentes de un animal no humano. Las células madre embrionarias introducidas pueden colonizar entonces el embrión y contribuir a la línea germinal del animal híbrido producido (Jaenisch, 1988, Science 240: 1468-1474).

La presente invención también se refiere a un animal transgénico no humano que sirve para estudiar la capacidad de una variedad de compuestos para actuar como moduladores de DvLGIC/GluCl. En lo que se refiere a los animales transgénicos de esta invención, se hace referencia a transgenes y genes. Tal como se utiliza en la presente, un transgén es una construcción genética que incluye un gen. El transgén se integra en uno o más cromosomas en las células de un animal mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Una vez integrado, el transgén es transportado en por lo menos un lugar del cromosoma de un animal transgénico. Evidentemente, un gen es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, tal como un clon de ADNc o una combinación de los clones de ADNc descritos en la presente. El gen y/o transgén también puede incluir elementos genéticos reguladores y/o elementos estructurales conocidos en el estado de la técnica. Un tipo de célula objetivo para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria. Las células madre embrionarias pueden obtenerse a partir del embrión preimplantado cultivado in vitro y fusionado con el embrión (Evans y otros, 1981, Nature 292: 154-156; Bradley y otros, 1984, Nature 309: 255-258; Gossler y otros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 83: 9065-9069; y Robertson y otros, 1986, Nature 322: 445-448). Los transgenes pueden introducirse de manera eficaz en las células madre embrionarias mediante una variedad de técnicas estándar, tales como transinfección, microinyección, o mediante transducción mediada por retrovirus de ADN. Las células madre embrionarias producidas pueden combinarse entonces con blastocitos procedentes de un animal no humano. Las células madre embrionarias pueden colonizar entonces el embrión y contribuir a la línea germinal del animal híbrido producido (Jaenisch, 1988, Science 240: 1468-1474).

Para referirse a un gen de DvLGIC/GluCl de aparición natural se utiliza la expresión gen nativo y si no es mutante también puede hacerse referencia al mismo con la expresión de tipo salvaje. Un gen de DvLGIC/GluCl alterado no debería codificar por completo el mismo DvLGIC/GluCl que el nativo en el animal huésped, y su producto de expresión puede alterarse en menor o mayor grado, o ser totalmente ausente. En casos en los que es útil expresar un gen no nativo de DvLGIC/GluCl en un animal transgénico en ausencia de un gen nativo de DvLGIC/GluCl (tal como en C. elegans), es preferible que el gen alterado de DvLGIC/GluCl induzca un fenotipo knockout (inactivado) nulo en el animal. No obstante, un gen LGIC/GluCl con una modificación más moderada también puede ser útil y se halla dentro del campo de aplicación de la presente invención. La mutación DvLGIC/GluCl puede ser una mutación de deleción dirigida, una mutación de sustitución dirigida y/o una mutación de inserción dirigida. No obstante, la mutación preferida es una mutación de deleción y es en especial preferida una mutación de deleción que se traduzca en una deleción de la mayor parte del gen DvLGIC/GluCl, si no de todo. Se crean animales transgénicos que tienen un gen LGIC/GluCl alterado o, preferiblemente, eliminado por completo. En el gen LGIC/GluCl, las deleciones, las modificaciones y/o las inserciones pueden convertir el gen nativo en un gen no funcional, produciendo un animal transgénico "knockout" (con genes inactivados), o pueden originar un LGIC/GluCl con expresión o actividad alteradas. Tal como se ha señalado anteriormente, puede utilizarse un animal transgénico no humano sin un gen activado de DvLGIC/GluCl para probar/cribar moduladores de la expresión y/o actividad de DvLGIC/GluCl (moduladores tales como pequeñas moléculas o péptidos) que pueden invertir el fenotipo patológico producido por la sobreexpresión o deleción de DvLGIC/GluCl.

Una mutación de deleción preferida puede ser una deleción en cualquier lugar, desde 1 nucleótido hasta una deleción de todo el gen, incluido el marco abierto de lectura y las secuencias reguladoras que actúan como cis asociadas con el DvLGIC/GluCl de tipo salvaje. Una deleción menor dentro del marco abierto de lectura es preferiblemente no divisible por tres, de modo que produce una mutación de desplazamiento de marco (frameshift) que se traduce en una proteína que muy probablemente no será funcional. Es preferible que cualquier deleción más pequeña de este tipo no divisible por tres se dirija hacia la región 5' del marco abierto de lectura para aumentar la posibilidad de generar un producto proteico truncado no funcional. No obstante, tal como se ha señalado anteriormente, es preferible que la mutación de deleción abarque la mayor parte del gen DvLGIC/GluCl, si no todo, para asegurar que se previene la expresión de una proteína funcional de DvLGIC/GluCL. Por lo tanto, las células animales deficientes de DvLGIC/GluCL, el embrión transgénico no humano, los animales transgénicos no humanos y las camadas transgénicas, no humanas, de la presente invención pueden crearse mediante cualquiera de las técnicas conocidas en el estado de la técnica, tal como se ha ejemplificado en el párrafo anterior. También se halla dentro del alcance del experto en la técnica producir animales invertebrados transgénicos o knockout (con genes inactivados) (por ejemplo, C. elegans) que expresen el transgén de DvLGIC/GluCl en un entorno de LGIC/GluCL de C. elegans de tipo salvaje, así como en mutantes de C. elegans deficientes para una o más de las subunidades de LGIC/GluCl de C. elegans.

Pueden formularse composiciones de utilidad farmacéutica que comprendan moduladores de DvLGIC/GluCl de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como mediante la mezcla de un portador farmacéuticamente aceptable. Pueden hallarse ejemplos de tales portadores y procedimientos de formulación en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad efectiva de la proteína, ADN, ARN, DvLGIC/GluCl modificado, o bien agonistas o antagonistas de DvLGIC/GluCl, incluidos activadores o inhibidores de la tirosina cinasa.

Las composiciones terapéuticas o diagnósticas de la invención se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar enfermedades. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo con una variedad de factores del individuo, tales como la enfermedad que padece, el peso, el sexo y la edad. Otros factores incluyen la vía de administración.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al individuo mediante una variedad de vías, tales como la subcutánea, la tópica, la oral o la intramuscular.

La expresión "derivado químico" describe una molécula que contiene otras partes químicas que normalmente no forman parte de la molécula base. Tales partes pueden mejorar la solubilidad, la semivida, la absorción, etc. de la molécula base. Por otro lado, las partes pueden atenuar efectos secundarios indeseables de la molécula base o reducir la toxicidad de la molécula base. Ejemplos de tales partes se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente pueden utilizarse solos a dosis adecuadas. Por otro lado, puede ser deseable la administración simultánea o la administración secuencial de otras sustancias.

La presente invención también tiene por objetivo proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para utilizar en los nuevos procedimientos de tratamiento de enfermedades en las que intervienen componentes de la presente invención. Las composiciones que contienen como ingrediente activo compuestos identificados de acuerdo con esta invención pueden administrarse en una amplia variedad de presentaciones farmacéuticas terapéuticas en excipientes convencionales para su administración. Por ejemplo, los compuestos pueden administrarse en tales presentaciones orales como comprimidos, cápsulas (cada uno de las cuales incluye formulaciones de liberación prolongada y formulaciones de liberación sostenida), pastillas, polvos, granulados, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones o mediante inyección. Del mismo modo, también pueden administrarse en formulación intravenosa (tanto bolo como infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o intramuscular, en todos los casos utilizando formulaciones muy conocidas por los expertos en las técnicas
farmacéuticas.

Ventajosamente, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en un sola dosis diaria, o bien puede administrarse la posología diaria total en dos, tres o cuatro dosis diarias por separado. Además, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en una presentación intranasal mediante la administración tópica de excipientes intranasales adecuados, o por vías transdérmicas, utilizando presentaciones farmacéuticas en forma de parches transdérmicos bien conocidas por los expertos en el estado de la técnica. Para administrar la presentación farmacéutica de un sistema de liberación transdérmica, la administración de la posología será, evidentemente, continua y no intermitente durante toda la pauta posológica.

Para un tratamiento combinado con más de una sustancia activa, en el que las sustancias activas se hallan en presentaciones farmacéuticas separadas, las sustancias activas pueden administrarse simultáneamente, o cada una de ellas puede administrarse en tiempos escalonados separadamente.

La pauta posológica para utilizar los compuestos de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores entre los que se incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la situación médica del paciente; la gravedad de la enfermedad que hay que tratar; la vía de administración; las funciones renal, hepática y cardiovascular del paciente; y el compuesto en particular de la misma utilizado. Un médico o un veterinario que sean expertos en la técnica pueden determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco requerido para prevenir, contrarrestar o detener la evolución de la enfermedad. La exactitud óptima para conseguir concentraciones de fármaco dentro del intervalo que produce eficacia sin toxicidad requiere una pauta posológica basada en la cinética de la disponibilidad del fármaco para actuar sobre los focos de infección. Esto implica tener en cuenta la distribución, el equilibrio y la eliminación del fármaco.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención sin que, no obstante, se limite la misma a éstos.

Ejemplo 1

Aislamiento y expresión de los ADNc que codifican DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11, DvLGIC/GluCl 7-1 (DvLGIC/GluCl 11) y DvLGIC/GluCl 10-2 (DvLGIC/GluCl 2) a partir de una genoteca de ADNc de una garrapata Dermacentor.

Creación de una genoteca de ADNc de una garrapata Dermacentor- Se purificó un ARN poliA^{+} a partir de garrapatas enteras Dermacentor para crear una genoteca de ADNc ZAP sensibilizada a oligo(dT), clonada como insertos 5' EcoRI-3' XhoI. La genoteca ya constaba de aproximadamente 1,8 x 10^{6} clones independientes antes de la amplificación. El equipo (kit) ZAP Express cDNA Synthesis y el equipo (kit) ZAP Express^{TM} cDNA Gigapack III Gold Cloning se compraron a Stratagene (La Jolla, CA) y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Selección de genotecas y aislamiento de genes LGIC/GluCl de Dermacentor- Se utilizaron dos sondas de ADN.

1.

Una primera sonda procede del gen LGIC/GluCl 1 (RsLGIC/GluCL 11) de la garrapata Rhipicephalus sanguineus y fue amplificada mediante PCR utilizando como cebadores i) una hebra transcrita 5' CGG ATA TTG GAC AGC ATC 3' (SEC ID No: 8) y ii) una hebra complementaria 5' CCA GTA GAC GAG GTT GAA GAG G-3' (SEC ID No: 9) para crear un fragmento que va del nucleótido 448 al 1.645 del marco abierto de lectura de RsLGIC/GluCl 1. La secuencia de nucleótidos de la sonda RsLGIC/GluCL 11 es tal como:

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2.

Una segunda sonda procede del gen del clon LGIC/GluCL 2 de la garrapata Rhipicephalus sanguineus (RsLGIC/GluCL 2) que fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores i) una hebra transcrita 5' TGT GGT GGT GAT AGC TGC 3' (SEC ID No: 11) y ii) una hebra complementaria 5' GAG TTG ATC AAT CTG CTT GG 3' (SEC ID No: 12) para crear un fragmento que va del nucleótido 166 hasta el 1.315 del marco abierto de lectura de LGIC/GluCL 2. La secuencia de nucleótidos es tal como:

14

La Vent DNA Polymerase para la PCR se compró a New England Biolabs (Boston, MA). Cada ciclo de amplificación consistía en 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 72ºC y 1 minuto a 72ºC. Tras 35 ciclos, se llevaba a cabo una prolongación final de 5 minutos a 72ºC. El producto de la PCR era un gel de agarosa purificado, marcado con P^{32}-dCTP utilizando Random Primer DNA Labeling System (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) y la sonda resultante RsLGIC/GluCl 11 (SEC ID No: 11) se utilizó por primera vez para seleccionar aproximadamente 5,5 x 10^{5} recombinantes de la genoteca de ADNc de Dermacentor. La hibridación se llevó a cabo en SSPE 6x, SDS 0,1%, 10x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón (200 \mug/ml) y formamida al 45% a 42ºC. A continuación se lavaron las membranas dos veces en i) SSC 2x, SDS 0,5% a temperatura ambiente durante 15 minutos y ii) SSC 0,2x, SDS 0,5% a 42ºC durante 30 minutos, seguido de un solo lavado en SSC 0,2x, SDS al 0,5% a 55ºC durante 30 minutos. Se eliminó la sonda de RsLGIC/GluCl 11 de las membranas i) incubando durante aproximadamente 1 hora en una disolución de NaOH 0,05 M + NaCl 0,5 M, a continuación ii) incubando durante aproximadamente 1 hora en una disolución Tris:Cl 0,5 M (pH 7,4), a continuación iii) aclarando todo con SSPE 1X a temperatura ambiente. En la selección original se identificaron ocho clones positivos, incluidos DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11, DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 10-2. DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11 y DvLGIC/GluCl 7-1 fueron identificados por ambas sondas mientras que DvLGIC/GluCl 10-2 sólo fue reconocido por la sonda RsLGIC/GluCl 2. Se eliminaron los seis insertos del fago, convertido en vectores pBK-CMV fagémidos, utilizando el protocolo de los fabricantes (Stratagene, La Jolla, CA), y se secuenciaron sobre un secuenciador de ADN ABI PRISM^{TM} 377 (Perkin Elmer, Foster City, CA). El inserto de ADNc de DvLGIC/GluCl 1 es de 3.598 pares de bases y se describe en la figura 1A-C, se describe como SEC ID No: 1. El inserto de ADNc de DvLGIC/GluCl 11 es de 3.442 pares de bases y se describe en la figura 3A-C, se describe como SEC ID No: 3. El inserto de ADNc de DvLGIC/GluCl 7-1 es de 2.194 pares de bases y se describe en la figura 4A-B, se describe como SEC ID No: 4. Por último, el inserto de ADNc de DvLGIC/GluCl 10-2 es de 4.077 pares de bases y se describe en la figura 6A-C, se describe como SEC ID No: 6.

Síntesis de un ARN bloqueado transcrito in vitro - Se utilizó una estrategia de PCR para añadir el promotor T7 por encima de la metionina de inicio (ATG) y una cola de poliA^{+} a continuación del codón de terminación (TAG) del marco abierto de lectura de clones DvLGIC/GluCl 1, DvLGIC/GluCl 11, DvLGIC/GluCl 7-1 y DvLGIC/GluCl 10-2. Los marcos abiertos de lectura amplificados que contenían el promotor T7 contiguo y la cola de poliA^{+} se utilizaron directamente como modelo o patrón en la reacción de transcripción in vitro (mMessage mMachine^{TM}, Ambion, Austin, TX). Tras la eliminación del modelo de ADN, se adaptó el volumen a 100 \mul con agua libre de nucleasa y ARN purificado utilizando una columna Sephadex G-50 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se extrajo el eluido con un mismo volumen de fenol/cloroformo, seguido de una segunda extracción de cloroformo, se precipitó con isopropil alcohol y se resuspendió en agua libre de nucleasa hasta una concentración de 1 \mug/ml.

Ejemplo 2 Expresión funcional de clones de DvLGIC/GluCl 1 en oocitos de Xenopus

Los oocitos de Xenopus laevis se prepararon e inyectaron utilizando procedimientos estándares descritos anteriormente [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. La hembra adulta de Xenopus laevis se anestesió con tricaína metanosulfato al 0,5% y los ovarios se eliminaron quirúrgicamente y se colocaron en una solución que constaba de (mM): 82,5 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl_{2}, 5 HEPES, 2,5 piruvato de sodio, 100.000 unidades/l de penicilina G, 1.000 mg/l de sulfato de estreptomicina, pH 7,5 (Mod. OR-2). Los lóbulos ováricos se abrieron, se aclararon diversas veces con Mod. OR-2 y se incubaron en colagenasa al 0,2% (Sigma, tipo 1) en Mod. OR-2 a temperatura ambiente y removiendo ligeramente. Al cabo de 1 hora, se renovó la disolución de colagenasa y se incubaron los oocitos durante otros 30-90 minutos hasta que se liberó aproximadamente el 50% de los oocitos de los ovarios. Se seleccionaron los oocitos de las etapas V y VI y se colocaron en un medio de cultivo que contenía (mM): 96 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl_{2}, 1,8 CaCl_{2}, 5 HEPES, 2,5 piruvato de sodio, 0,5 teofilina, 50 mg/ml de gentamicina, pH 7,5 (ND-96) durante 16-24 horas antes de inyectarlos. Los oocitos se inyectaron junto con 50 nl de ARN de DvLGIC/GluCl 1 o DvLGIC/GluCl 7-1 a una concentración de 0,2 mg/ml. Los oocitos se incubaron a 18ºC durante 1-6 días en ND-96 antes de realizar el registro.

Los registros se hicieron a temperatura ambiente en ND-96 modificado que constaba de (mM): 96 NaCl, 1 MgCl_{2}, 0,1 CaCl_{2}, 3,5 BaCl_{2}, 5 HEPES, pH 7,5. Se conectaron los oocitos y se utilizó un amplificador de dos microelectrodos Dagan CA1 (Dagan Corporation, Minneapolis, MN) conectado a un ordenador Macintosh 7100/80. El electrodo por el que pasaba corriente se impregnó con 0,7 M de KCl, 1,7 M de citrato de potasio y el electrodo que registraba el voltaje se impregnó con 1 M de KCl. Durante todo el experimento se superfusionaron los oocitos con ND-96 modificado (solución de control) o con ND-96 que contenía posibles activadores y bloqueantes del canal a una velocidad de aproximadamente 3 ml/min. Los datos se obtuvieron a 100 Hz y se filtraron a 33,3 Hz utilizando un programa Pulse de HEKA Elektronik (Lambrecht, Alemania). Todos los registros se llevaron a cabo a partir de un potencial sostenido de 0 o -30 mV.

Los oocitos que expresan DvLGIC/GluCl 1 (figura 9) o DvLGIC/GluCl 7-1 (figura 10) mostraron una corriente de activación lenta en respuesta a la aplicación de 1 \muM de ivermectina fosfato. Esta corriente era irreversible en el lavado de ivermectina fosfato. En cambio, la aplicación de 1 mM de glutamato no activó ninguna corriente.

Ejemplo 3 Expresión funcional de clones de DvLGIC/GluCl en células de mamíferos

Puede subclonarse un DvLGIC/GluCl en un vector de expresión de mamíferos y utilizarse para transfectar la línea celular mamífera de elección. Los clones celulares estables se seleccionan por crecimiento en presencia de G418. Se aíslan y someten a prueba los clones resistentes a G418 para confirmar la presencia de un gen intacto de DvLGIC/GluCl. A continuación, se analizan los genes que contienen los DvLGIC/GluCl mediante técnicas inmunológicas, tales como inmunoprecipitación, inmunoelectrotransferencia e inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de las proteínas de DvLGIC/GluCl. El anticuerpo se obtiene a partir de conejos a los que se inoculan péptidos que son sintetizados a partir de la secuencia de aminoácidos predicha a partir de las secuencias de DvLGIC/GluCl. La expresión también se analiza utilizando técnicas electrofisiológicas de pinzamiento zonal de membrana y análisis de flujo de aniones.

Se utilizan las células que expresan DvLGIC/GluCl de manera estable o transitoria para probar la expresión de proteínas activas del canal. Estas células sirven para identificar y analizar compuestos por su capacidad de modular, inhibir o activar el canal respectivo.

Los dominios que contienen el ADNc de DvLGIC/GluCl en orientación positiva respecto del promotor están unidos en sitios de astringencia apropiados 3' del promotor y se identifican mediante cartografía genética y/o secuenciación del sitio de astringencia. Estos vectores de expresión de ADNc pueden introducirse en células huésped fibroblásticas, por ejemplo, COS-7 (ATTC# CRL1651) y CV-1 tat [Sackevitz y otros, 1987, Science 238: 1575], 293, L (ATCC# CRL6362) mediante procedimientos estándar entre los que se incluyen incluidos, pero no se limitan a, electroporación o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, dextrano DEAE, fosfato de calcio). Las células transfectadas y los sobrenadantes del cultivo celular pueden extraerse y analizarse para la expresión de DvLGIC/GluCl, tal como se describe en la presente.

Todos los vectores utilizados para la expresión transitoria de mamíferos pueden utilizarse para establecer líneas celulares estables que expresen DvLGIC/GluCl. Se espera que las construcciones de ADNc de DvLGIC/GluCl sin alterar, clonadas en vectores de expresión, programen las células huésped para que produzcan proteínas de DvLGIC/GluCl. Las células huésped de transinfección incluyen, pero no se limitan a, CV-1-P [Sackevitz y otros, 1987, Science 238: 1575], tk-L [Wigler y otros, 1977, Cell 11: 223], NS/0 y dHFr-CHO [Kaufman y Sharp, 1982, J. Mol. Biol. 159: 601].

La transinfección simultánea de cualquier vector que contenga ADNc de DvLGIC/GluCl con un plásmido de selección de fármacos que incluya, pero no se limitan a, G418, aminoglucósido fosfotransferasa; higromicina, higromicina-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforibosil-transferasa, permitirá de modo estable la selección de clones transfectados. Los niveles de DvLGIC/GluCl se cuantifican por medio de los análisis descritos en la presente. Las construcciones de ADNc de DvLGIC/GluCl también pueden unirse a vectores que contengan marcadores amplificables resistentes a fármacos para la producción de clones celulares de mamíferos sintetizando los niveles más altos posibles de DvLGIC/GluCl. Tras la introducción de estas construcciones en las células, se seleccionan los clones que contienen el plásmido con la sustancia apropiada y se aísla un clon de sobreexpresión con un número de copias elevado de plásmidos mediante la selección de dosis crecientes de la sustancia. La expresión de un DvLGIC/GluCl recombinante se consigue mediante transinfección en toda su longitud de un ADNc de DvLGIC/GluCl a una célula huésped de mamífero.

Ejemplo 4 Clonación de un ADNc de DvLGIC/GluCl en un vector de expresión de baculovirus para la expresión en células de insectos

Los vectores de baculovirus, que proceden del genoma del virus AcNPV, han sido diseñados para proporcionar un nivel elevado de expresión de un ADNc en la línea Sf9 de células de insectos (ATCC CRL# 1711). Un baculovirus recombinante que exprese ADNc de DvLGIC/GluCl se produce siguiendo procedimientos estándar (In Vitrogen Maxbac Manual): las construcciones de ADNc de DvLGIC/GluCl están unidas a un gen de polihedrina en una variedad de vectores de transferencia de baculovirus, incluidos el pACC360 y el vector BlueBac (In Vitrogen). Los baculovirus recombinantes son creados por recombinación homóloga a continuación de la transinfección del vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico AcNPV lineal [Kitts, 1990, Nuc. Acid. Res. 18: 5667] a células Sf9. Los virus pAC360 recombinantes son identificados por la ausencia de cuerpos de inclusión en las células infectadas y los virus recombinantes pBluBac son identificados a partir de la expresión de b-galactosidasa (Summers, M. D. y Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Tras la purificación de la placa, se determina la expresión de DvLGIC/GluCl mediante los análisis descritos en la presente.

El ADNc que codifica la totalidad del marco abierto de lectura para LGIC/GluCl de DvLGIC/GluCl se inserta en el sitio BamHI de pBlueBacII. Las construcciones en orientación positiva se identifican mediante el análisis de la secuencia y se utilizan para transfectar células Sf9 en presencia de ADN AcNPV lineal de tipo suave.

Ejemplo 5 Clonación de ADNc de DvLGIC/GluCl en un vector de expresión de levaduras

El DvLGIC/GluCl recombinante se produce en la levadura S. cerevisae tras la inserción del cistrón óptimo de ADNc de DvLGIC/GluCl en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de la expresión intracelular, vectores tales como EmBLyex4 o similares están unidos al cistrón de DvLGIC/GluCl [Rinas y otros, 1990, Biotechnology 8: 543-545; Horowitz B. y otros, 1989, J Biochem. 265: 4189-4192]. Para la expresión extracelular, el cistrón LGIC/GluCl de DvLGIC/GluCl se une a vectores de expresión de levaduras que fusionan una señal de secreción (una levadura o un péptido de mamífero) al extremo NH_{2} de la proteína de DvLGIC/GluCl [Jacobson, 1989, Gene 85: 511-516; Riett y Bellon, 1989, Biochem. 28: 2941-2949].

Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, pAVE1-6, que se fusiona con la señal de la albúmina sérica humana en el ADNc expresado [Steep, 1990, Biotechnology 8: 42-46] y el vector pL8PL que fusiona la señal de la lisozima humana al ADNc expresado [Yamamoto, Biochem. 28: 2728-2732]. Además, el DvLGIC/GluCl se expresa en levaduras como una proteína de fusión conjugada a ubiquitina utilizando el vector pVEP [Ecker, 1989, J. Biol. Chem. 264: 7715-7719; Sabin, 1989, Biotechnology 7: 705-709; McDonnell, 1989, Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los niveles de DvLGIC/GluCl expresado se determinan mediante los análisis descritos en la presente.

Ejemplo 6 Purificación de DvLGIC/GluCl recombinante

El DvLGIC/GluCl producido de manera recombinante puede purificarse mediante cromatografía de afinidad de anticuerpos. Las columnas de afinidad de anticuerpos LGIC/GluCl de DvLGIC/GluCl se preparan añadiendo los anticuerpos LGIC/GluCl anti-DvLGIC/GluCl a Affigel-10 (Biorad), un sustrato en gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida tales que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el sustrato en perlas del gel de agarosa. A continuación, se acoplan los anticuerpos al gel mediante enlaces amida con el brazo espaciador. A continuación se detienen los restantes ésteres activados con 1 M de etanolamina-HCl (pH 8). La columna se lava con agua seguido de 0,23 M de glicina-HCl (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. Entonces se equilibra la columna con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3), junto con sustancias apropiadas de solubilización de membrana tales como detergentes y los sobrenadantes del cultivo celular o extractos celulares que contienen DvLGIC/GluCl solubilizado se pasan lentamente a través de la columna. A continuación se lava la columna con solución salina tamponada con fosfato, junto con los detergentes, hasta que la densidad óptica (A_{280}) se reduce hasta ser como la del entorno, entonces se eluye la proteína con 0,23 M de glicina-HCl (pH 2,6) junto con detergentes. A continuación se separa la proteína purificada de DvLGIC/GluCl mediante diálisis con solución salina tamponada con fosfato.

<110> Merck & Co., Inc.

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<120> MOLECULAS DE ADN QUE CODIFICAN CANALES IONICOS SENSIBLES AL LIGADO DE DERMACENTOR VARIABILIS

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<130> 20629 PCT

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<150> 60/193.935

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<151> 2000-03-31

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<160> 13

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 3598

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<212> ADN

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<213> Dermacentor variabilis

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<200>

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<221> CDS

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<222> (170)...(1363)

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<400> 1

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15

16

17

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<210> 2

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<211> 397

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<212> PTR

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<213> Dermacentor variabilis

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<400> 2

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18

19

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<210> 3

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<211> 3442

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<212> DNA

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<213> Dermacentor variabilis

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<200>

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<211> CDS

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<222> (32)...(1225)

\newpage

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<400> 3

20

21

22

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<210> 4

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<211> 2194

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<212> PDNA

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<213> Dermacentor variabilis

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<200>

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<211> CDS

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<222> (47)...(1315)

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<400> 4

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23

24

25

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<210> 5

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<211> 422

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<212> PTR

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<213> Dermacentor variabilis

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<400> 5

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26

27

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<210> 6

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<211> 4077

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<212> DNA

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<213> Dermacentor variabilis

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<200>

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<211> CDS

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<222> (360)...(1331)

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<400> 6

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28

29

30

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<210> 7

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<211> 323

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<212> PTR

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<213> Dermacentor variabilis

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<400> 7

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31

32

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<210> 8

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<200>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggatattgg acagcatc

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<200>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccagtagacg aggttgaaga gg

\hfill

22

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<210> 10

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<211> 1197

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<212> ADN

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<213> Rhipicephalus sanguineus

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<400> 10

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33

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<210> 11

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<200>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggtggtg atagctgc

\hfill

18

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<210> 12

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<200>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagttgatca atctgcttgg

\hfill

20

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<210> 13

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<211> 1150

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<212> ADN

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<213> Dermacentor variabilis

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\newpage

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<400> 13

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34

Claims (26)

1. Molécula purificada de ácido nucleico que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nos: 2 y 5,

(b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia de moderada a alta con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica las SEC ID Nos 2 ó 5,

(c) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de astringencia moderada con el complemento de una segunda molécula de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos 1, 3 ó 4; en el que dicha molécula de ácido nucleico tiene por lo menos aproximadamente un 65% de identidad con por lo menos una de las segundas moléculas de ácido nucleico tal como se establece en las SEC ID Nos 1, 3 y 4.

2. Molécula purificada de ácido nucleico que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, en el que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:2.

3. Vector de expresión para expresar una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en una célula huésped recombinante en el que dicho vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2.

4. Célula huésped que expresa una proteína recombinante del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en la que dicha célula huésped contiene el vector de expresión según la reivindicación 3.

5. Procedimiento para expresar una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, que comprende:

(a) transfectar el vector de expresión según la reivindicación 3 a una célula huésped adecuada; y,

(b) cultivar las células huésped de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis a partir de dicho vector de expresión.

6. Molécula purificada de ADN que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que consiste en una secuencia de nucleótidos tal como se establece en la SEC ID No:1.

7. Molécula de ADN según la reivindicación 6 que consiste en una secuencia de nucleótidos de aproximadamente el nucleótido 170 a aproximadamente el nucleótido 1.363.

8. Molécula purificada de ADN que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que consiste en una secuencia de nucleótidos tal como se establece en la SEC ID No:3.

9. Molécula de ADN según la reivindicación 8 que consiste en una secuencia de nucleótidos de aproximadamente el nucleótido 32 a aproximadamente el nucleótido 1.225.

10. Molécula purificada de ácido nucleico que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:5.

11. Vector de expresión para expresar una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en una célula huésped recombinante en el que dicho vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Célula huésped que expresa una proteína recombinante del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en la que dicha célula huésped contiene el vector de expresión según la reivindicación 11.

13. Procedimiento para expresar una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis en una célula huésped recombinante, que comprende:

(a) transfectar el vector de expresión según la reivindicación 11 en una célula huésped adecuada; y,

(b) cultivar las células huésped de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis a partir de dicho vector de expresión.

14. Molécula purificada de ADN que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que consiste en una secuencia de nucleótidos tal como se establece en la SEC ID No:4.

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15. Molécula de ADN según la reivindicación 14 que consiste en la secuencia de nucleótidos de aproximadamente el nucleótido 47 a aproximadamente el nucleótido 1.315.

16. Proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que sustancialmente carece de otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:2.

17. Proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis según la reivindicación 16 que es un producto del vector de expresión de ADN contenido en una célula huésped recombinante.

18. Preparado de membrana sustancialmente puro que comprende la proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis purificada a partir de la célula huésped recombinante según la reivindicación 17.

19. Proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis sustancialmente libre de otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:5.

20. Proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis según la reivindicación 19 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula huésped recombinante.

21. Preparado de membrana sustancialmente puro que comprende la proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis purificada a partir de la célula huésped recombinante según la reivindicación 20.

22. Proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID No:2 y la SEC ID No:5.

23. Procedimiento para identificar un modulador de la proteína del canal LGIC/GluCl, que comprende:

(a) contactar un compuesto de prueba con una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:2 y la SEC ID No:5, y

(b) determinar el efecto del compuesto de prueba en la proteína del canal LGIC/GluCl.

24. Procedimiento según la reivindicación 23 en el que la proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis de la etapa (a) es un producto de un vector de expresión contenido en una célula huésped recombinante.

25. Procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de la proteína del canal sensible a glutamato, que comprende:

(a) inyectar en una disolución de células huésped una población de moléculas de ácido nucleico, por lo menos de la parte que codifica una proteína del canal LGIC/GluCl de D. variabilis seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:2 y SEC ID No:5, de modo que la expresión de dicha parte de moléculas de ácido nucleico da lugar a un canal sensible a glutamato activo;

(b) añadir un compuesto de prueba a dicha disolución; y,

(c) determinar la corriente de membrana de la célula huésped a un potencial sostenido más positivo que el potencial inverso para el cloruro.

26. Procedimiento según la reivindicación 25 en el que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN complementario, ARN mensajero poli A^{+} y ARN complementario.