JP5134750B2 - Dermacentorvariabilis由来の、リガンド依存性イオンチャネルをコードするDNA分子 - Google Patents
Dermacentorvariabilis由来の、リガンド依存性イオンチャネルをコードするDNA分子 Download PDFInfo
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2000年3月31日出願の暫定的米国特許出願第60/193,935号の優先権を主張する。
【0002】
米国政府支援研究開発に関する申立て
該当せず。
【0003】
マイクロフィッシュ補遺の参照
該当せず。
【0004】
発明の分野
本発明は、部分的に、Dermacentor variabilis(アメリカイヌマダニ)のリガンド依存性塩素イオンチャネルをコードする分離核酸分子(ポリヌクレオチド)に関する。また、本発明は、ショウジョウバエのリガンド依存性イオンチャネルをコードするDNA断片を含む組換えベクターおよび組換え宿主、関連するD.variabilisリガンド依存性塩素イオンチャネルおよびこれらのタンパク質を含む組換え膜分画の実質的に純粋な形態、関連する突然変異タンパク質、および関連するDermacentor variabilisリガンド依存性塩素イオンチャネルを調節し、殺虫剤および殺ダニ剤として有用と思われる化合物の同定に関わる方法にも関する。
【0005】
発明の背景
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル、またはH受容体は、節足動物の神経および筋肉において同定された(Lingle et al、1981、Brain Res.212:481−488;Horseman et al.、1988、Neurosci.Lett.85:65−70;Wafford and Sattelle、1989、J.Exp.Bio.144:449−462;Lea and Usherwood、1973、Comp.Gen.Parmacol.4:333−350;およびCull−Candy、1976、J.Physiol.255:449−464)。
【0006】
無脊椎動物のグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、汎用されているアベルメクチン群の駆虫性および殺虫性化合物にとって重要な標的である。アベルメクチン類は、放線菌Streptomyces avermitilisから最初に分離された大環ラクトンの一群である。半合成アベルメクチン誘導体のイベルメクチン(22,23−ジヒドロアベルメクチン B1a)は、人間や動物の寄生虫および害虫を処理するために、世界中で使用されている。アベルメクチン類は、今尚、宿主に対して低毒性の最も有効な広範囲殺風土病虫剤である。多年にわたる野外使用の後でも、昆虫集団の中にアベルメクチンに対する耐性は殆ど残らない。良好な治療指数と低い耐性が相俟って、リガンド依存性イオンチャネル、および特にグルタミン酸依存性塩素イオン(LGIC/GluCl)チャネルは依然として殺虫剤開発の良い標的であることが、強く示唆される。
【0007】
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、土壌線虫のCaenorhabditis elegans(Cully et al.、1994,Nature 371:707−711;米国特許第5527703号およびArena et al.、1992,Molecular Brain Research.15:339−348も参照されたい)およびCtenocephalides felis(ノミ;国際公開第99/07828号を参照されたい)からクローニングされた。
【0008】
その上、ショウジョウバエ melanogasterから得られるグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする遺伝子が、以前に同定された(Cully et al.、1996,J.Biol.Chem.271:20187−20191;米国特許第5693492号も参照されたい)。
【0009】
Dermacentor variabilis(アメリカイヌマダニ)は、米国の大部分の土地に原産し、家畜、シカ、イヌ、ヒトおよび小哺乳類の公知の一般的宿主を有する。このダニは、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、ダニ麻痺、アナプラスマ症、ツラレミアおよびサイトークスゾーン症を含む様々な疾患に関与している。
【0010】
非ダニ性LGIC/GluClチャネルをコードする前記cDNAが同定されてはいたが、D.variabilisのLGIC/GluClチャネルをコードする他の遺伝子を同定し、その結果、動物の健康、特に家畜およびイヌやネコ等の馴化動物に外寄生するマダニの処置に関わる殺虫性、殺ダニ性および/または殺線虫性を有し得る、新規なLGIC/GluClチャネルモジュレーターを同定するための、改良されたスクリーニングを可能とする場合に有利であると思われる。本発明は、D.variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードする新規な遺伝子であって、アフリカツメガエル卵母細胞において発現されると、機能性のLGIC/GluClチャネルを形成する遺伝子を開示することによって、これらの必要性に対処し、それを満足させる。本発明のLGIC/GluClチャネルの異種発現によって、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物、特にDermacentor variabilisに直接関係するマダニの外寄生の処置における化合物の薬理学的分析が可能になると思われる。活性なLGIC/GluClチャネルを発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なLGIC/GluClチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【0011】
発明の概要
本発明は、D.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質を含むが、必ずしもそれに限らないDermacentor variabilis(アメリカイヌマダニ)の新規な無脊椎動物LGICチャネルタンパク質をコードする分離または精製された核酸分子(ポリヌクレオチド)に関する。本明細書に開示したDNA分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、トランスフェクトされたその宿主細胞は、単一の発現した機能性のホモ多量体またはヘテロ多量体のLGICの実質的な量の供給源となる。このような機能性のリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドが、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および/または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性、ダニ駆虫性および/または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための他のスクリーニング標的を提供すると思われる。
【0012】
更に、本発明は、新規なDermacentor variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質を発現するmRNAをコードする分離された核酸分子(ポリヌクレオチド)に関するものであって、このDNA分子は配列番号1、配列番号3、配列番号5および配列番号6と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【0013】
また、本発明は、新規なDermacentor variabilis無脊椎動物LGIC/GluClチャネルタンパク質を発現するmRNAをコードする配列番号1、3、4および6の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片または突然変異体は、配列番号2、配列番号5および配列番号7に示したD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質を含むが、それらに限らない各D.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質の薬理学的性質を、少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能性のD.variabilis LGIC/GluClチャネルを発現するmRNAをコードすることによって、D.variabilis LGIC/GluCl活性の作動薬および/または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限るものではない。
【0014】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規な形態のDermacentor variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質をコードする図1(配列番号1;DvLGIC/GluCl 1と命名)、図3(配列番号3;DvLGIC/GluCl 11と命名)、図4(配列番号4;DvLGIC/GluCl 7−1と命名)および図6(配列番号6;DvLGIC/GluCl 10−2と命名)に開示されている。
【0015】
本発明の分離核酸分子は、1本鎖(コード鎖または非コード鎖)または2本鎖であってもよいゲノムDNAおよび相補的DNA(cDNA)、ならびに合成1本鎖ポリヌクレオチド等の合成DNA等のデオキシリボ核酸分子(DNA)を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子(RNA)も含み得る。
【0016】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主細胞にも関している。
【0017】
また、本発明は、図2(配列番号2)、図5(配列番号5)および図7(配列番号7)に開示したアミノ酸配列を含んだD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質の実質的に精製された形態にも一部関連している。
【0018】
本発明のこの部分の好ましい態様は、図2(配列番号2)、図5(配列番号5)および図7(配列番号7)に開示したアミノ酸配列からなるD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質である。
【0019】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号1、3、4および/または6に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各タンパク質のDvLGIC/GluCl前駆体または成熟形を発現するDNA発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、(任意のタンパク質分解処理、グリコシル化および/またはリン酸化を含めて)十分に処理された成熟LGIC/GluClチャネルタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、S2細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【0020】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号1、3、4および/または6に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能体態の各DvLGIC/GluClチャネルを生じるDNA発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または細胞溶解物に関する。(原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換またはトランスフェクションの安定な細胞および一時的な細胞の)組換え宿主細胞から得た細胞内膜分画および/または膜含有細胞溶解物は、本発明の核酸によってコードされ、機能的でプロセシングされたタンパク質を含んでいる。組換え体に基づくこの膜調製物は、D.variabilis LGIC/GluClチャネルを含む可能性があり、かつLGIC/GluCl 1(配列番号2)、LGIC/GluCl 11(やはり配列番号2)、LGIC/GluCl 7−1(配列番号5)および/またはLGIC/GluCl 10−2(配列番号7)のLGIC/GluClチャネルタンパク質を発現する組換え細胞から得られる他のD.variabilis起源タンパク質や宿主タンパク質を含むが、これらのタンパク質に限らない汚染性タンパク質を本質的に含んでいない。したがって、本発明の好ましい一態様は、図2(配列番号2のLGIC/GluCl 1とLGIC/GluCl 11)、図5(配列番号5のLGIC/GluCl 7−1)および/または図7(配列番号7のLGIC/GluCl 10−2)に開示したLGIC/GluClチャネルタンパク質の機能体を含むLGIC/GluClタンパク質を含んだD.variabilis LGIC/GluClチャネルを含んでいる膜調製物である。これらの細胞内膜分画は、D.variabilis LGIC/GluClチャネルの生物学的機能体である野生型または突然変異型の変異を含むと思われる。本明細書に開示したDvLGIC/GluClタンパク質の任意の機能的単一チャネル、ホモ多量体またはヘテロ多量体の組合せは、内在量より実質的に多量にあると予想され、したがって本明細書を通して記載される様々な試験において有用と思われる。また、開示したチャネルタンパク質が、単独または組合せにより、未だ同定されていないチャネルタンパク質を有する機能性のヘテロ多量体チャネルを形成することも可能である。本発明のグルタミン酸依存性チャネルを発現するために選択される好ましい真核宿主細胞は、哺乳類細胞系、S2細胞等の昆虫系細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞である。
【0021】
また、本発明は、配列番号2、5および/または7に示したアミノ酸配列を含むD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質の生物活性な断片および/または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、かつD.variabilis LGIC/GluClチャネルの薬理作用に対する作動薬および/または拮抗薬を含むが、それらに限らない選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらに限らない変異を含んだものにも関する。
【0022】
本発明の好ましい一態様は、本発明のD.variabilis LGIC/GluClタンパク質を各々含む各アミノ酸配列に関して、図2(配列番号2)、図5(配列番号5)および図7(配列番号7)に開示されている。これらのチャネルタンパク質の1個または複数を特定することによって、動物の健康、人間の健康および/または作物保護のために殺虫性、殺ダニ性および/または殺線虫性を有し得る新規なLGIC/GluClチャネルモジュレーターを同定するためのスクリーニング法が可能となる。前記のように、本明細書に開示するDvLGIC/GluClタンパク質の1種または組合せからなる、機能性の単一チャネル、ホモ多量体またはヘテロ多量体チャネルの異種発現は、内在量より実質的に多量であると予想され、その発現によって、動物や人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物一般、ならびに様々な寄生種の外寄生を抑制するのに有用となり得るDvLGIC/GluCl特異的モジュレーターの候補物質の薬理分析が可能になると思われる。機能性のDvLGIC/GluClチャネル(例えば、配列番号2、5および/または7の機能体)を発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なLGIC/GluClチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【0023】
本発明は、DvLGIC/GluClの開示形、またはその生物活性な断片に反応して増加するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも関する。
【0024】
また、本発明は、GFP(グリーン蛍光タンパク質質)、MYCエピトープ、およびFCを含むが、これらに限らない様々な標識に結合したDvLGIC/GluClの一部を発現する融合構築体を含むが、これらに限られることのないDvLGIC/GluCl融合構築体にも関する。このような任意の融合構築体を、関心のある細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するDvLGIC/GluClタンパク質の1種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【0025】
本発明は、本明細書に開示するD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質および生物学的等価物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いた試験、これらのタンパク質を発現するDNA構築体を含んだ組換え宿主細胞、およびこれらの試験によって同定され、LGIC/GluClチャネル活性の作動薬または拮抗薬として作用する化合物に関する。
【0026】
本発明の一目的は、配列番号2、5および7で各々示したタンパク質である、D.variabilis LGIC/GluClの新規な形態、あるいはDvLGIC/GluClの断片、突然変異体または誘導体、これらのタンパク質をコードする分離核酸分子(例えば、配列番号1、3、4および6)を提供することである。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を発現するmRNAをコードし、無脊椎動物LGIC/GluCl薬理作用の選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限られるものではない。
【0027】
本発明の更なる目的は、前段落で述べた核酸分子によってコードされるD.variabilis LGIC/GluClタンパク質またはタンパク質断片を提供することである。
【0028】
本発明の更なる目的は、D.variabilis LGIC/GluClタンパク質またはその生物学的等価物をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提供することである。
【0029】
本発明の一目的は、配列番号2、5および7で示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質の実質的に精製された形態をそれぞれ提供することである。
【0030】
本発明の他の目的は、配列番号1、3、4および6に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能的な形態の各DvLGIC/GluClチャネルを生じるDNA発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、D.variabilis LGIC/GluClタンパク質の実質的に精製された組換え形態を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系等の真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【0031】
本発明の一目的は、それぞれ配列番号2、5および7に示したようなD.variabilis LGIC/GluClタンパク質の生物活性な断片および/または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療および/または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供するように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限らないものを提供することである。
【0032】
更に、本発明の一目的は、それぞれ薬理作用があるD.variabilis LGIC/GluClチャネルを含む組換え細胞から得た、実質的に精製された細胞内膜調製物、部分的に精製された細胞内膜調製物または未精製溶解物、特に、図2(配列番号2)、図5(配列番号5)および/または図7(配列番号7)に示したアミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んだDNAベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞から得た細胞内分画を提供することである。
【0033】
本発明の他の目的は、配列番号1、3、4および/または6に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能性で処理された形態の各DvLGIC/GluClチャネルを生じるDNA発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または未精製溶解物を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、S2細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【0034】
モジュレーター、好ましくはD.variabilis LGIC/GluClチャネル活性および/または無脊椎動物LGIC/GluClチャネルの選択的モジュレーターをスクリーニングするために、D.variabilis LGIC/GluClタンパク質、またはD.variabilis LGIC/GluClタンパク質を含む膜調製物、または生物学的等価物を使用することも、本発明の一目的である。このような任意のタンパク質または膜結合タンパク質は、動物や人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性なこれらのモジュレーターをスクリーニングし、選択する際に有用となり得る。このような種は、本明細書に開示したアメリカイヌマダニチャネル以外に、蠕虫、ノミ、他のダニ類およびシラミを含む。これらの膜調製物は、これらのLGIC/GluClを発現する異種細胞系から創出されてもよく、完全長タンパク質、完全長タンパク質の生物活性断片を構成するか、または当分野で入手できる物質で構築し得る様々な融合構築体から発現される融合タンパク質に依存してもよい。
【0035】
本明細書で使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」とは、少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは99%、一層より好ましくは99.9%他の核酸を含まないことを意味する。用語を入れ換えて使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」、「実質的に精製された」、「分離された核酸」、「精製された核酸」のいずれも、他の細胞成分から分離・精製されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質に対するコード領域を含むDNA分子を指す。したがって、他の核酸を実質的に含まないD.variabilis LGIC/GluCl DNA調製物は、全核酸に対するパーセント表示で、10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは1%以下、一層より好ましくは0.1%以下の非D.variabilis LGIC/GluCl核酸を含むものと思われる。所与のD.variabilis LGIC/GluCl DNA調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかを、適当な染色法、例えば臭化エチジウム染色と組合せた、例えば、アガロースゲル電気泳動のような従来の核酸純度分析法、または配列決定によって、決定することができる。
【0036】
本明細書で使用する場合、「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」とは、少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは99%、一層より好ましくは99.9%他のタンパク質を含まないことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含まないD.variabilis LGIC/GluClタンパク質調製物は、全タンパク質に対するパーセント表示で、10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは1%以下、一層より好ましくは0.1%以下の非D.variabilis LGIC/GluClタンパク質を含むものと思われる。所与のD.variabilis LGIC/GluClタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかを、適当な検出法、例えば銀染色またはイムノブロッティングと組合せた、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)のような従来のタンパク質純度分析法によって、決定することができる。「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」という用語と入れ換えて使用する場合、「分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質」または「精製されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質」という用語も、天然の供給源から分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質を指す。「分離された」または「精製された」という用語の使用は、D.variabilis LGIC/GluClタンパク質が普通の細胞環境から取出されたことを示す。したがって、分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質は、無細胞溶液中にあるか、または自然に生成する環境とは異なる細胞環境中に置かれてもよい。分離されたという用語は、分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質が存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、むしろ分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質が、他のタンパク質やin vivoでD.variabilis LGIC/GluClタンパク質と自然に結びつく非アミノ酸物質(例えば、核酸、脂質、炭水化物)を実質的に含んでいないことを意味している。したがって、原核または真核細胞中に組換えによって発現され、このLGIC/GluClタンパク質を自然には(即ち、介在なしには)発現しないこの宿主細胞から実質的に精製されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質は、本明細書で言及する如何なる状況下でも、当然「分離されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質」である。前記のように、分離または精製されたD.variabilis LGIC/GluClタンパク質であるD.variabilis LGIC/GluClタンパク質調製物は、他のタンパク質を実質的に含まず、全タンパク質に対するパーセント表示で、10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは1%以下、一層より好ましくは0.1%以下の非D.variabilis LGIC/GluClタンパク質を含むものと思われる。
【0037】
本明細書で入れ換えて使用する場合、「機能的等価物」または「生物活性等価物」とは、スプライシング、欠失、突然変異、置換、付加のいずれかのために、天然のD.variabilis LGIC/GluClと正確には同じアミノ酸配列を有していないが、D.variabilis LGIC/GluClと実質的に同じ生物活性を保持しているタンパク質を意味する。このような機能的等価物は、天然のD.variabilis LGIC/GluClと顕著なアミノ酸配列の同一性を有すると思われ、このような機能的等価物をコードする遺伝子およびcDNAは、天然のD.variabilis LGIC/GluClをコードするDNA配列との低ストリンジェントなハイブリッド形成によって、検出することができる。例えば、本明細書で開示する天然のD.variabilis LGIC/GluClタンパク質は、配列番号2に示したアミノ酸配列を含み、配列番号1によってコードされる。機能的等価物をコードする核酸は、ヌクレオチドのレベルで配列番号1と少なくとも約50%の同一性を有する。
【0038】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、1つのアミノ酸残基の他の化学的に類似したアミノ酸残基による置き換えを指す。このような保存的置換の例は、1つの疎水性残基(イソロイシン、ロイシン、バリン、またはメチオニン)による他の疎水性残基の置換、および1つの極性残基による同じ電荷の他の極性残基の置換(例えば、リジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸)である。
【0039】
本明細書で使用する場合、「LGIC」とは、リガンド依存性イオンチャネルを指す。
【0040】
本明細書で使用する場合、「GluCl」とは、L−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【0041】
本明細書で使用する場合、「LGIC/GluCl」とは、リガンド依存性イオンチャネル/L−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【0042】
本明細書で使用する場合、「DvLGIC/GluCl」とは、Dermacentor variabilisリガンド依存性イオンチャネル/L−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【0043】
本明細書で使用する場合、「哺乳類の」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳類を指すことにする。
【0044】
図面の簡単な説明
図1A〜Cは、配列番号1に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 1のヌクレオチド配列を示す。
【0045】
図2は、配列番号2に示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質、DvLGIC/GluCl 1およびDvLGIC/GluCl 11のアミノ酸配列を示す。
【0046】
図3A〜Cは、配列番号3に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 11のヌクレオチド配列を示す。
【0047】
図4A〜Bは、配列番号5に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 7−1のヌクレオチド配列を示す。
【0048】
図5は、配列番号5に示したD.variabilis LGIC/GluClのタンパク質、DvLGIC/GluCl 7−1のアミノ酸配列を示す。
【0049】
図6A〜Cは、配列番号6に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 10−2のヌクレオチド配列を示す。
【0050】
図7は、配列番号7に示したD.variabilis LGIC/GluClのタンパク質、DvLGIC/GluCl 10−2のアミノ酸配列を示す。
【0051】
図8は、DvLGIC/GluCl 1(配列番号2)、DvLGIC/GluCl 11(配列番号2)、DvLGIC/GluCl 7−1(配列番号5)およびDvLGIC/GluCl 10−2(配列番号7)の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す。
【0052】
図9は、DvLGIC/GluCl 1 mRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電流活性を示す。電流活性は1μMのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【0053】
図10は、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したDvLGIC/GluCl 7−1のイベルメクチンによる活性を示す。電流活性は〜1μMのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【0054】
発明の詳細な説明
本発明は、Dermacentor variabilis無脊椎動物LGIC/GluClチャネルタンパク質をコードする分離核酸分子(ポリヌクレオチド)に関する。本発明の分離または精製核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。大部分のクローニングのためには、DNAが好ましい核酸である。前記のように、本明細書に開示したDNA分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、発現した機能性の単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体LGICの実質的な量の供給源となる。このような機能性のリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドが、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および/または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および/または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための追加のスクリーニング標的を提供すると思われる。本明細書では、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現されたDvLGIC/GluCl 1、11および7−1が、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示すことが示してある。一方、DvLGIC/GluCl 10−2はリン酸イベルメクチンまたはグルタミン酸に反応しなかった。しかし、GABA−Aサブユニットのガンマが機能性のホモ多量体を発現しないことに注意すべきである。したがって、本発明の発現タンパク質は、本明細書に開示するチャネルタンパク質を含め、幾つかの附属および/またはチャネルタンパク質を含んだ野生型リガンド依存性イオンチャネルの成分として、in vivoで機能し得る。しかし、本発明のLGICタンパク質が、技術者にとって有用となるために、野生型チャネルを直接模倣する必要はない。むしろ、組換え宿主細胞内に機能性で単一の膜結合チャネルを形成することができるために、これらのタンパク質は、当分野で公知の、本明細書内に一部記載したスクリーニング手順になじみやすい。したがって、本明細書内に記述したように、本発明の開示Dvチャネルタンパク質は、完全な機能性LGICチャネルに寄与し得る他のDvチャネルサブユニットタンパク質やサブユニットタンパク質を含むかまたは含まない本明細書内に開示した様々なタンパク質を有する、単一の機能性チャネルとして、ホモ多量体チャネルとして、またはヘテロ多量体チャネルとして有用である。
【0055】
本発明は、Dermacentor variabilisの新規な無脊椎動物LGIC/GluClチャネルタンパク質を発現するmRNAをコードする分離された核酸分子(ポリヌクレオチド)に関するものであって、このDNA分子は配列番号1、配列番号3、配列番号4および配列番号6と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【0056】
本発明のDvLGIC/GluCl核酸分子の分離および特定は、実施例1節に詳述したように確認された。本明細書で考察するこれらのcDNA分子は、殺虫剤の新規なスクリーニング手段を確立し、特にヒトおよび家畜、イヌ、ネコ等の動物における寄生種の外寄生を処置するのに使用するためか、または他のクモ形類動物を殺すために、殺虫剤活性を有して可能性のある鉛化合物を実証するのに、特に有用である。これらのcDNAまたはその一部は、追加の殺虫農薬スクリーニング手段を確立するために、他の生物から関連遺伝子を分離するためのハイブリッド形成プローブとしても有用である。本発明のDvLGIC/GluClコード化cDNAは、アメリカイヌマダニ種Dermacentor variabilisから分離された。そのDNA配列は、グルタミン酸およびイベルメクチンに感応性の塩素イオンチャネル群と共通の特徴を共有するタンパク質を予測する。DvLGIC/GluCl cDNAをアフリカツメガエル卵母細胞中に発現するとき、グルタミン酸および/またはイベルメクチン感応性チャネルを認める。これらのチャネルで作用する化合物の薬理作用は、これらの種の間で恐らく差が出ると思われる。クモ形類動物のチャネルをスクリーニングすることによって、クモ形類動物特異的な化合物を発見する可能性が高まると思われる。したがって、本発明のcDNAを、細胞系や他の発現系で発現させることができ、かつ、チャネルを活性化し、阻止し、または調節する化合物をスクリーニングするために、競合結合実験や機能性塩素イオンチャネル試験に使用することができる。
【0057】
無脊椎動物グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル(LGIC/GluCl)は、グリシンおよびGABA依存性塩素イオンチャネルと関係しており、興奮性グルタミン酸受容体(例えば、NMDAまたはAMPA受容体)とは異なる。LGIC/GluClファミリーの最初の2種の構成体が、駆虫薬イベルメクチンの受容体に対する機能性スクリーニングの後に、線虫C.elegansにおいて確認された。今では、更に数種のLGIC/GluClが、他の無脊椎動物種においてクローニングされた。しかし、脊椎動物においてLGIC/GluClに相当するものが存在する証拠は未だない。このために、LGIC/GluClは駆虫剤、殺虫剤、殺ダニ剤等にとって優れた標的である。ノジューリスポア酸(nodulisporic acid)およびその誘導体のような特異的LGIC/GluClモジュレーターは、脊椎動物において機構に基づく毒性を欠いているので、理想的な安全性プロファイルを有する。本発明は、4種の新規なD.variabilis LGIC/GluClクローンに部分的に関するものである。DvLGIC/GluCl 1、DvLGIC/GluCl 11、DvLGIC/GluCl 7−1およびDvLGIC/GluCl 10−2が元のスクリーニングで確認された。DvLGIC/GluCl 1、DvLGIC/GluCl 11、およびDvLGIC/GluCl 7−1を両プローブで確認したが、DvLGIC/GluCl 10−2はRsLGIC/GluCl2プローブだけで認めた。
【0058】
本発明は、図1(DvLGIC/GluCl1)に記載し、配列番号1として示した分離または精製DNA分子に関するもので、そのDNA分子は図2に記載し、配列番号2として示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードし、DvLGIC/GluCl1のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【0059】
【化1】
【0060】
本発明は、図3(DvLGIC/GluCl11)に記載し、配列番号3として示した分離または精製DNA分子にも関するもので、そのDNA分子は図2に記載し、配列番号2として示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードし、DvLGIC/GluClのヌクレオチド配列は次のとおりである。
【0061】
【化2】
【0062】
本発明は、図4(DvLGIC/GluCl7−1)に記載し、配列番号4として示した分離または精製DNA分子にも関するもので、そのDNA分子は図5に記載し、配列番号5として示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードし、DvLGIC/GluCl7−1のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【0063】
【化3】
【0064】
本発明は、図6(DvLGIC/GluCl10−2)に記載し、配列番号6として示した分離または精製DNA分子にも関するもので、そのDNA分子も図7に記載し、配列番号7として示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードし、DvLGIC/GluCl10−2のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【0065】
【化4】
【0066】
各々図1、3、4および6に示し、前に例示した分離DNA分子は、次の特性を有する。
【0067】
DvLGIC/GluCl1(配列番号1):
3598ヌクレオチド残基:開始のMet(ヌクレオチド残基170〜172位)および「TAG」終止コドン(ヌクレオチド残基1361〜1363位)で、読み取り枠が、配列番号2に示したアミノ酸397個の発現タンパク質を生じる。
【0068】
DvLGIC/GluCl11(配列番号3):
3442ヌクレオチド残基:開始のMet(ヌクレオチド残基32〜34位)および「TAG」終止コドン(ヌクレオチド残基1223〜1225位)で、読み取り枠が、配列番号4に示したアミノ酸397個の発現タンパク質を生じる。DvLGIC/GluCl 11タンパク質は、DvLGIC/GluCl 1と同様に、配列番号2に示したアミノ酸配列を含んでいる。配列番号3および配列番号1の読み取り枠内のヌクレオチド配列は、9個のヌクレオチド置換を示す。その置換中3個はRNA編集事象から生じると思われるが、その他の変化は、恐らくマダニ集団内の対立遺伝子による差異の結果である。
【0069】
DvLGIC/GluCl 7−1(配列番号4):
2194ヌクレオチド残基:開始のMet(ヌクレオチド残基47〜49位)および「TGA」終止コドン(ヌクレオチド残基1313〜1315位)で、読み取り枠が、配列番号5に示したアミノ酸422個の発現タンパク質を生じる。
【0070】
DvLGIC/GluCl 10−2(配列番号6):
4177ヌクレオチド残基:開始のMet(ヌクレオチド残基360〜362位)および「TGA」終止コドン(ヌクレオチド残基1329〜1331位)で、読み取り枠が、配列番号7に示したアミノ酸323個の発現タンパク質を生じる。
【0071】
例示した本発明の様々なcDNA分子に対するヌクレオチドレベルでの同一性パーセントは、GCG−Best fit−Smith and Watermanのアルゴリズムを用いて生成された。相対的な同一性パーセントは以下のとおりである。
ショウジョウバエ LGIC/GluClα1(米国特許第5693492号)とDvLGIC/GluCl 1:54.869%;
ショウジョウバエ GluClα1とDvLGIC/GluCl 7−1:58.029%;
ショウジョウバエ GluClα1とDvLGIC/GluCl 10−2:54.938%;
DvLGIC/GluCl 1とDvLGIC/GluCl 7−1:66.555%;
DvLGIC/GluCl 1とDvLGIC/GluCl 10−2:75.000%;
DvLGIC/GluCl 1とDvLGIC/GluCl 11:99.246%;および
DvLGIC/GluCl 7−1とDvLGIC/GluCl 10−2:69.103%。
【0072】
この目的のために、本発明は、D.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質をコードする精製核酸分子であって、(a)配列番号2、5および7からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、または(b)配列番号2、5および7をコードする第2の核酸分子の相補体と、中度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子、または(c)配列番号1、3、4および6に示した第2の核酸分子の相補体と、中度ないし高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子を含み、かつ読み取り枠内のヌクレオチドレベルで、配列番号1、3、4および6に示した第2の核酸分子の少なくとも1種と少なくとも約65%の同一性を有する核酸分子に関する。
【0073】
また、本発明は、新規なDermacentor variabilis無脊椎動物LGIC/GluClチャネルタンパク質を各々発現するmRNAをコードする配列番号1、3、4および6の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片および/または突然変異体は、配列番号2、配列番号5および配列番号7に示したD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質を含むが、それらに限らないD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能性のD.variabilis LGIC/GluClチャネルを発現するmRNAをコードすることによって、D.variabilis LGIC/GluCl活性の作動薬および/または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限られるものではない。
【0074】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規なDermacentor variabilis LGIC/GluClタンパク質をコードする図1(配列番号1;DvLGIC/GluCl 1と命名)、図3(配列番号3;DvLGIC/GluCl 11と命名)、図4(配列番号4;DvLGIC/GluCl 7−1と命名)および図6(配列番号6;DvLGIC/GluCl 10−2と命名)に開示されている。
【0075】
また、本発明は、野生型DvLGIC/GluCl活性を調節する化合物を同定する試験において有用な融合タンパク質を発現するばかりでなく、DvLGIC/GluClに対する抗体も発生させる融合構築体の分離核酸分子に関する。本発明のこの部分の一態様は、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)−DvLGIC/GluCl融合構築体を含むが、それに限らない。組換えGST−DvLGIC/GluCl融合タンパク質を、バキュロウィルス発現ベクター(pAcG2T、Pharmingen)を用いたSpodoptera frugiperda(Sf21)昆虫細胞(Invitrogen)を含む様々な発現系で発現させてもよい。他の態様は、GFP(グリーン蛍光タンパク質質)、MYCエピトープおよびGSTを含むが、これらに限らない様々な標識に連結したDvLGIC/GluCl融合構築体に関する。前と同じように、このような任意の融合構築体を関心のある細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するDvLGIC/GluClタンパク質の1種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【0076】
本発明の分離核酸分子は、1本鎖(コード鎖または非コード鎖)または2本鎖であってもよいゲノムDNAおよび相補的DNA(cDNA)、ならびに合成1本鎖ポリヌクレオチド等の合成DNA等のデオキシリボ核酸分子(DNA)を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子(RNA)も含み得る。
【0077】
遺伝暗号の縮重は、2種以外の全てのアミノ酸に対して、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードするようなものである。これによって、DvLGIC/GluClタンパク質をコードする合成DNAであって、そのヌクレオチド配列が配列番号1、3、4および6のヌクレオチド配列と有意に異なるが、それでもなお配列番号1、3、4および6と同じDvLGIC/GluClタンパク質をコードする合成DNAの構築が可能となる。このような合成DNAは、本発明の範囲に入ることを意図している。このような合成DNAを特定の宿主細胞や生物において発現させることを所望する場合、このような合成DNAのコドン使用法をその特定の宿主のコドン使用法を反映するように調節することによって、宿主内でのDvLGIC/GluClチャネルタンパク質の発現量を増加させることができる。換言すれば、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンのこの重複は、本発明の範囲に入る。したがって、本発明は、以下に示すように、最終的に同一のアミノ酸を翻訳するためにコードする代替コドンを含むRNAをコードするDNA配列も対象としている。
【0078】
A=Ala=アラニン:コドン GCA、GCC、GCG、GCU
C=Cys=システイン:コドン UGC、UGU
D=Asp=アスパラギン酸:コドン GAC、GAU
E=Glu=グルタミン酸:コドン GAA、GAG
F=Phe=フェニルアラニン:コドン UUC、UUU
G=Gly=グリシン:コドン GGA、GGC、GGG、GGU
H=His=ヒスチジン:コドン CAC、CAU
I=Ile=イソロイシン:コドン AUA、AUC、AUU
K=Lys=リジン:コドン AAA、AAG
L=Leu=ロイシン:コドン UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU
M=Met=メチオニン:コドン AUG
N=Asp=アスパラギン:コドン AAC、AAU
P=Pro=プロリン:コドン CCA、CCC、CCG、CCU
Q=Gln=グルタミン:コドン CAA、CAG
R=Arg=アルギニン:コドン AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU
S=Ser=セリン:コドン AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU
T=Thr=スレオニン:コドン ACA、ACC、ACG、ACU
V=Val=バリン:コドン GUA、GUC、GUG、GUU
W=Trp=トリプトファン:コドン UGG
Y=Tyr=チロシン:コドン UAC、UAU
【0079】
したがって、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なったDNA分子を生じ得るコドンの重複を開示する。本明細書のために、1個または複数の置換コドンを有する配列を縮重変異配列と定義することにする。他の配列変異は、以下に考察するように、RNA編集を介して起こり得る。このようなRNA編集は、読み取り枠の変化が発現タンパク質中のアミノ酸残基の変化を起こさない他の形式のコドン重複を生じ得る。発現タンパク質の最終的物性を実質的に変化させないDNA配列中または翻訳タンパク質中の突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、またはグルタミンの代わりにアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化が起こらないかもしれない。
【0080】
あるペプチドをコードするDNA配列を、天然のヘプチドと異なる性質を有するペプチドをコードするように変化させ得ることは公知の。DNA配列を変化させる方法は、部位特異的突然変異誘発を含むが、それに限らない。変化した性質の例は、酵素が基質に対して、または受容体がリガンドに対して示す親和性の変化を含むが、これらに限らない。
【0082】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高次の一致が得られるように、各配列が配列される。「同一性」自体は、当業界で認識された意味を有し、公表された技法を用いて計算することができる。例えば、(Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.、ed.Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993;Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin,A.M.and Griffin,H.G.、eds.、Humana Press、New Jersey、1994;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Academic Press、1987;およびSequence Analysis Primer、Gribskov,M.and Devereux,J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991)を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの2個の配列間の同一性を測定する幾つかの方法があるが、「同一性」という用語は技術者に周知である(Carillo and Lipton、1988、SIAM J Applied Math 48:1073)。2個の配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法は、Guide to Huge Computers、Martin J.Bishop、ed.、Academic Press、San Diego、1994およびCarillo and Lipton、1988、SIAM J Applied Math 48:1073に開示されている方法を含むが、これらに限られるものではない。同一性や類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム中に体系化されている。2個の配列間の同一性や類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux,et al、1984、Nucleic Acids Research 12(1):387)、BLASTN、FASTA(Altschul、et al.、1990、J Mol.Biol.215:403)を含むが、これらに限られるものではない。
【0083】
一例として、配列番号1の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば95%の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号1の参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド各100個当たり5点までの突然変異や代替ヌクレオチドを含み得ることを除けば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの5%までが欠失するか、または他のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異や代替ヌクレオチド置換は、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在するか、または参照配列内の1個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで起こってもよい。100%未満の同一性を生じるこのような「突然変異」または変化の一発生源は、RNA編集を介して起こり得る。RNA編集の過程は、改変されたmRNAをクローニングされるcDNAを発生させる鋳型として使用したとき、コドン変化が起こる場合も起こらない場合もある1個または複数のヌクレオチド変化が起こるように、mRNA分子の改変を起こす。このRNA編集は、RNAエディターゼによって触媒されることが公知である。このようなRNAエディターゼはRNAアデノシンデアミナーゼであり、それはシトシン残基を模倣する傾向のあるイノシン残基にアデノシン残基を変換する。この目的のために、mRNA残基のAからIへの変換が、クローニングされるcDNAのコードおよび非コード領域においてAからGへのトランジションを起こすと思われる(例えば、Hanrahan et al、1999、Annals New York Acad.Sci.868:51−66を参照されたい。総説としては、Bass、1997、TIBS 22:157−162を参照されたい)。
【0084】
同様に、配列番号2の参照アミノ酸配列に、少なくとも例えば95%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が、配列番号2の参照アミノ酸のアミノ酸各100個当たり5個までのアミノ酸の改変を含み得ることを除けば、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の5%までが欠失するか、または他のアミノ酸で置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基の5%までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中の残基間に個々に散在するか、または参照配列内の1個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで起こってもよい。前記のように再び、RNA編集が、ゲノム配列の読み取り枠に直接対応する「非RNA編集」転写体から発現する他のタンパク質と、「同一性」の異なる発現タンパク質を生じるコドン変化を起こし得る。
【0085】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主にも関する。DvLGIC/GluClチャネルタンパク質を全体として、または部分的にコードする本発明の核酸分子は、他のDNA分子、即ちDvLGIC/GluClコード配列が自然には連結されないDNA分子と連結されることによって、各DvLGIC/GluClチャネルタンパク質をコードする「組換えDNA分子」を形成することができる。本発明の新規なDNA配列を、DvLGIC/GluClをコードする核酸または機能的等価物を含むベクター中に挿入することができる。これらのベクターはDNAまたはRNAで構成されてもよいが、大抵のクローニングのためにはDNAベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、修飾ウィルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびDvLGIC/GluClチャネルタンパク質をコードし得る他の形態のエピソームや組込み型DNAを含む。特定の遺伝子導入や他の用途のために適切なベクターを決定することは、技術者が十分に扱い得る範囲に入る。
【0086】
また、本発明は、図2、図5および図7に開示し、配列番号2、5および7で各々示したアミノ酸配列を含む、各DvLGIC/GluClチャネルタンパク質の実質的に精製された形態にも関する。開示した各DvLGIC/GluClタンパク質は、図2、5および7に示すように、長さがアミノ酸397個(各々DvLGIC/GluCl 1およびDvLGIC/GluCl 11、配列番号2)、アミノ酸422個(DvLGIC/GluCl 7−1、配列番号5)およびアミノ酸323個(DvLGIC/GluCl 10−2、配列番号7)の読み取り枠を含んでおり、次のとおりである。
【0087】
【化5】
【0088】
図8は、DvLGIC/GluCl 1およびDvLGIC/GluCl 11(配列番号2)、DvLGIC/GluCl 7−1(配列番号5)およびDvLGIC/GluCl 10−2(配列番号7)の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す。
【0089】
また、本発明は、配列番号2、5、および7に示したようなアミノ酸配列を含むDvLGIC/GluClタンパク質の生物活性な断片および/または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、DvLGIC/GluCl機能の作動薬および/または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらに限らない突然変異を含むものにも関する。
【0090】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号1、3、4および/または6に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各DvLGIC/GluCl前駆体タンパク質を発現するDNA発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、十分にプロセシングされたLGIC/GluClチャネルタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳類細胞系、S2細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【0091】
多くのタンパク質と同様に、DvLGIC/GluClチャネルタンパク質のアミノ酸の多くを改変し、それでも尚、野生型タンパク質と実質的に同じ生物活性を保持することが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、それでも尚、対応する各DvLGIC/GluClと実質的に同じ生物活性を保持する改変DvLGIC/GluClポリペプチドを含む。単一のアミノ酸置換では、普通、タンパク質の生物活性は変化しないと一般に受入れられている(例えば、Molecular Biology of the Gene,Watson et al.,1987,Fourth Ed.The Benjamin/Cummings Publishing Co.,Inc.,page226およびCunningham & Wells,1989,Science 244:1081−1085)。したがって、本発明は、配列番号2、5、および/または7で1個のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するDvLGIC/GluClタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドを含む。また、本発明は、配列番号2、5または7で2個以上のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するDvLGIC/GluClタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドも含む。特に本発明は、前記置換が保存的置換である実施形態を含む。
【0092】
当業者であれば、DvLGIC/GluClの機能的等価物であって、アミノ酸の小さな欠失または挿入をDvLGIC/GluClアミノ酸配列からの変化とするポリペプチドも、同じ指針に従うことによって、即ちDvLGIC/GluClと関連タンパク質とのアミノ酸配列の差を最小化することによって、産生し得ることを認めるであろう。小さな欠失または挿入は、一般に約1個から5個のアミノ酸の範囲にある。このような小さな欠失または挿入の改変DvLGIC/GluClポリペプチドの生物活性に対する効果は、そのポリペプチドを合成により生成するか、あるいは、DvLGIC/GluClをコードするDNAの必要な変化を起こした後、そのDNAを組換えで発現させ、そのような組換え発現で生成したタンパク質を検定することによって、容易に試験することができる。
【0093】
本発明は、酵素の活性部位を含む領域を含んだDvLGIC/GluClの末端切断形も含んでいる。このような末端切断タンパク質は、本明細書に記載の様々なアッセイ、結晶化研究、および構造−活性相関の研究において有用である。
【0094】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含んだ(原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換/形質移入の安定な細胞および一時的な細胞の)組換え宿主細胞から得た、膜含有未精製溶解物または部分的に精製されたもしくは実質的に精製された細胞内膜分画にも関する。これらの組換え宿主細胞は、翻訳後に生物活性な様式で細胞膜と結合するDvLGIC/GluClまたは機能的等価物を発現する。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のDvLGIC/GluClの野生型または突然変異形態を含み、したがってDvLGIC/GluClタンパク質またはチャネルのモジュレーターを選択する試験において有用と思われる。換言すれば、このような細胞内膜分画の特定の用途には、組換え細胞内でDvLGIC/GluClを発現後、他の細胞成分からその膜を分離、実質的に精製し、その後、そのタンパク質あるいは本明細書に開示するそのタンパク質の1種または複数を含む生物活性なチャネルの作動薬や拮抗薬等のモジュレーターを選択する試験に使用することが必要である。あるいは、その膜を含む溶解細胞を、組換えで発現した本明細書に開示するタンパク質のモジュレーターを選択する試験に直接使用してもよい。したがって、本発明の他の好ましい態様は、配列番号1、3、4および/または6に示す完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現するDNAベクターで形質転換またはトランスフェクトされた結果、機能性で処理された形態の各DvLGIC/GluClチャネルを生じる組換え宿主細胞から得られた膜を含む、実質的に精製された膜調製物または溶解組換え細胞成分に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳類細胞系、S2細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【0095】
DvLGIC/GluClをクローニングするために、様々な手順のいずれを使用してもよい。これらの方法は以下の方法を含むが、それらに限らない。(1)RACE PCRクローニング法(Frohman、et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998−9002)。完全長cDNA配列を作製するために、5’および/または3’RACEを行ってもよい。この戦略は、DvLGIC/GluCl cDNAのPCR増幅のために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。これらの遺伝子特異的プライマーは、公然と入手し得る任意数の核酸およびタンパク質データベースを捜すことによって同定された、発現配列タグ(EST)ヌクレオチド配列の同定を経て設計される;(2)適切な発現ベクター系においてDvLGIC/GluCl含有cDNAライブラリを構築した後の、DvLGIC/GluCl cDNAの直接的な機能性発現;(3)DvLGIC/GluClタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したDvLGIC/GluCl含有cDNAライブラリの検索;(4)DvLGIC/GluClタンパク質をコードする部分的cDNAによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したDvLGIC/GluCl含有cDNAライブラリの検索。この部分的cDNAは、DvLGIC/GluClタンパク質と関連する他のイオンチャネルサブユニットに対して公知のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介した、DvLGIC/GluCl DNA断片の特異的PCR増幅によって得られる;(5)哺乳類DvLGIC/GluClタンパク質と相同性を有する部分的cDNAまたはオリゴヌクレオチドによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したDvLGIC/GluCl含有cDNAライブラリの検索。この戦略には、前記のESTとして同定された、DvLGIC/GluCl cDNAのPCR増幅用遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用も必要となるかもしれない;あるいは、(6)鋳型として配列番号1、3、4および/または6を用いて5’および3’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計することによって、完全長cDNAを公知のRACE法で作製するか、または、DvLGIC/GluClをコードする全長型のヌクレオチド配列を分離することを目的として、cDNAおよび/またはゲノムライブラリの多数の型のひとつを検索するプローブとして使用するコード化領域の一部を作製し、分離するために、同じこれらの公知のRACE法でコード化領域の一部を作製すること。あるいは、本発明のDvLGIC/GluCl1(1、11および7−1)およびDvLGIC/GluCl2(10−2)cDNAを、実施例1節に記載のようにクローニングしてもよい。
【0096】
他の型のライブラリ、ならびに他の細胞型や種型から構築したライブラリが、DvLGIC/GluClコード化DNAまたはDvLGIC/GluCl相同体を分離するために有用であることは、当業者には自明である。他の型のライブラリは、他のアメリカイヌマダニ細胞型に由来するcDNAライブラリを含むが、それに限らない。
【0097】
DvLGIC/GluCl活性を有する細胞や細胞系から適当なcDNAライブラリを調製し得ることは、当業者には自明である。DvLGIC/GluClをコードするcDNAを分離するための、cDNAライブラリの調製に使用する細胞や細胞系の選択は、このような目的に利用できる任意の公知の試験を用いて、細胞結合DvLGIC/GluCl活性を先ず測定することによってなし得る。
【0098】
cDNAライブラリの調製は、当分野で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のcDNAライブラリ構築法は、例えば、Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New Yorkに見出すことができる。相補的DNAライブラリを、Clontech Laboratories,Inc.およびStratageneを含むが、これらに限らない多数の市販源から得てもよい。
【0099】
DvLGIC/GluClをコードするDNAを適当なゲノムDNAライブラリから分離し得ることも、当業者には自明である。ゲノムDNAライブラリの構築は、当分野で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のゲノムDNAライブラリの構築法は、前記のSambrook等に見出すことができる。特に、P1人工染色体ベクター中にゲノムライブラリを調製し、そこから本明細書に開示するDvLGIC/GluClヌクレオチド配列に基くプローブを用いて、DvLGIC/GluClを含むゲノムクローンを分離してもよい。このようなライブラリを調製する方法は、当分野で公知である(Ioannou et al.、1994、Nature Genet.6:84−89)。
【0100】
好ましい方法中の一法によってDvLGIC/GluCl遺伝子をクローニングするために、DvLGIC/GluClまたは相同タンパク質のアミノ酸配列やDNA配列が必要となるかもしれない。これを実現するために、各DvLGIC/GluClチャネルタンパク質を精製し、部分的アミノ酸配列を自動化した配列分析装置で決定してもよい。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的なDvLGIC/GluCl DNA断片をPCR増幅するために、6から8アミノ酸の2領域の線状配列を決定することができる。適当なアミノ酸配列を同定してしまうと、それらをコードすることのできるDNA配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンを使用してもよく、したがって、そのアミノ酸配列は、一組の類似したDNAオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードされ得る。その一組中の1種だけがDvLGIC/GluCl配列と同一であると思われるが、その一組中の他のものも、ミスマッチを有するDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、DvLGIC/GluCl DNAとハイブリッドを形成することができると思われる。ミスマッチを有するDNAオリゴヌクレオチドは、それでも、DvLGIC/GluClコード化DNAの同定および分離を可能とするのに十分なだけ、DvLGIC/GluCl DNAとハイブリッドを形成するかもしれない。あるいは、発現された配列の一領域のヌクレオチド配列を、1個または複数の入手可能なゲノムデータベースを調査することによって同定してもよい。cDNAライブラリとcDNA集合体のいずれかから、所望のcDNAのPCR増幅を行うために、遺伝子特異的プライマーを使用してもよい。前記のように、DvLGIC/GluClをコードする完全長配列を作製するために、重複する5’および3’RACE産物を分離する目的で、あるいは、DvLGIC/GluClまたはDvLGIC/GluCl様タンパク質をコードする完全長配列を分離するために、1種または複数のcDNA系またはゲノム系ライブラリを検索するプローブとして用いる、RsGluClをコードするヌクレオチド配列の一部を分離する目的で、PCR基準法に用いる適当なヌクレオチド配列を配列番号1、3、4または6から得てもよい。
【0101】
本発明は、DvLGIC/GluCl遺伝子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、およびDvLGIC/GluCl遺伝子を宿主細胞に導入する段階、およびDvLGIC/GluClの生成に適当な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む実質的に純粋なDvLGIC/GluClタンパク質を生産する方法も含んでいる。このようにして生産したDvLGIC/GluClを従来の方法で宿主細胞から回収してもよい。したがって、本発明は、DvLGIC/GluClタンパク質および本明細書で開示する生物学的等価物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いる試験、これらのタンパク質を発現するDNA構築体を含む組換え宿主細胞、およびこれらの試験により、DvLGIC/GluCl活性の作動薬や拮抗薬として作用することが確認された化合物にも関する。
【0102】
前記の方法で得たクローニングしたDvLGIC/GluCl cDNAを、適当なプロモーターおよび他の転写調節因子を含む(pcDNA3.neo、pcDNA3.1、pCR2.1、pBlueBacHis2またはpLITMUS28、ならびに以下に列挙する他の例等の)発現ベクター中への分子クローニングによって組換えで発現させ、かつ原核または真核宿主細胞中に導入することによって、組換えDvLGIC/GluClを産生させてもよい。本明細書では、発現ベクターを、適当な宿主細胞において、クローニングしたDNAを転写し、そのmRNAを翻訳するのに必要なDNA配列と定義する。このようなベクターの使用によって、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞(例えば、HELヒト細胞)等の様々な宿主細胞中に真核細胞DNAを発現することができる。特定の設計をされたベクターは、細菌−酵母、細菌−動物細胞等の宿主間でのDNAの往復移動を可能にする。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞中における自律複製用複製源、選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数能力、および活性なプロモーターを含むはずである。プロモーターは、RNAポリメラーゼがDNAに結合し、RNA合成を開始するように指示するDNA配列と定義される。強力なプロモーターは、高い頻度でmRNAを開始させるものである。最適量のDvLGIC/GluClを産生するDvLGIC/GluCl cDNA配列を決定するために、次のものを含むが、それらに限らないcDNA分子を構築することができる:DvLGIC/GluClに対する完全長読み取り枠を含むcDNA断片、ならびにそのタンパク質の特異的ドメインまたはそのタンパク質の再配列ドメインだけをコードするcDNA部分を含む様々な構築体。DvLGIC/GluCl cDNAの5’および/または3’非翻訳領域を全く含まないか、その全部または一部を含むように、全ての構築体を設計することができる。これらの構築体を適当な宿主細胞中に単独および組合せて導入した後、DvLGIC/GluClの発現量および活性を決定することができる。暫定的試験で最適発現を生じるDvLGIC/GluCl cDNAカセットを決定した後、このDvLGIC/GluCl cDNA構築体を、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌、および酵母細胞用のものを含むが、それらに限らない(組換えウィルスを含む)様々な発現ベクターに導入する。このような操作に対する技法を前記のSambrook等に見出すことができ、それらは当業者に周知であり、利用可能である。したがって、本発明の他の態様は、DvLGIC/GluClをコードするDNA配列を含み、かつ/または発現するように処理された宿主細胞を含む。組換え宿主細胞中にDvLGIC/GluClを発現させるために、DvLGIC/GluCl様タンパク質をコードするDNAを含んだ発現ベクターを使用してもよい。DvLGIC/GluClまたは生物学的等価形態を産生するために、このような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特定の設計がなされたプラスミドまたはウィルスを含むが、それらに限らない。組換えDvLGIC/GluClの発現に適当と思われる市販の哺乳細胞用発現ベクターは、pcDNA3.neo(Invitrogen)、pcDNA3.1(Invitrogen)、pCI−neo(Promega)、pLITMUS28、pLITMUS29、pLITMUS38およびpLITMUS39(New England Bioloabs)、pcDNAI、pcDNAIamp(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO−pSV2−neo(ATCC37593)、pBPV−1(8〜2)(ATCC37110)、pdBPV−MMTneo(342〜12)(ATCC37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(ATCC37198)、pSV2−dhfr(ATCC37146)、pUCTag(ATCC37460)、およびlZD35(ATCC37565)を含むが、それらに限らない。また、細菌細胞中に組換えDvLGIC/GluClを発現させるために、様々な細菌用発現ベクターを用いてもよい。組換えDvLGIC/GluClの発現に適当と思われる市販の細菌用発現ベクターは、pCR2.1(Invitrogen)、pET11a(Novagen)、lambda gt11(Invitrogen)、およびpKK223−3(Pharmacia)を含むが、それらに限らない。その上、菌類細胞中に組換えDvLGIC/GluClを発現させるために、様々な菌類細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えDvLGIC/GluClの発現に適当と思われる市販の菌類細胞用発現ベクターは、pYES2(Invitrogen)およびPichia発現ベクター(Invitrogen)を含むが、それらに限らない。また、昆虫細胞中に組換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えDvLGIC/GluClの組換え発現に適当と思われる市販の昆虫細胞用発現ベクターは、pBlueBacIIIおよびpBlueBacHis2(Invitrogen)、およびpAcG2T(Pharmingen)を含むが、それらに限らない。
【0103】
組換え宿主細胞は、E.coli等の細菌、酵母等の菌類、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系を含むが、それらに限らない哺乳類細胞、およびD.variabilisや蚕由来の細胞系を含み、それらに限らない昆虫細胞を含み、それらに限らない原核または真核細胞であってもよい。例えば、昆虫の一発現系は、バキュロウィルス発現ベクター(pAcG2T、Pharmingen)と共に、Spodoptera frugiperda(Sf21)昆虫細胞(Invitrogen)を利用する。また、適当と思われ、市販されている哺乳細胞種は、L細胞L−M(TK−)(ATCC CCL1.3)、L細胞L−M(ATCC CCL1.2)、Saos−2(ATCC HTB−85)、293(ATCC CRL1573)、Raji(ATCC CCL86)、CV−1(ATCC CCL70)、COS−1(ATCC CRL1650)、COS−7(ATCC CRL1651)、CHO−K1(ATCC CCL61)、3T3(ATCC CCL92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL2)、C127I(ATCC CRL1616)、BS−C−1(ATCC CCL26)、MRC−5(ATCC CCL171)およびCPAE(ATCC CCL209)を含むが、それらに限らない。
【0104】
DvLGIC/GluClチャネル活性のモジュレーターをスクリーニングする好ましい一態様は、(GluClチャネル活性等の)リガンド依存性チャネル活性を測定する電気生理学系試験であって、本発明のDNAやRNA分子をXenopus laevis卵母細胞中に注入することを含む試験に用いる発現系である。イオンチャネル活性の研究におけるアフリカツメガエル卵母細胞の一般的使用は、当分野で公知である(Dascal,1987,Crit.Rev.Biochem.22:317−317;Lester,1988,Science 241:1057−1063;また、Methods of Enzymology,Vol.207,1992,Ch.14−25,Rudy and Iverson,ed.,Academic Press,Inc.,New Yorkも参照されたい)。アフリカツメガエル卵母細胞には、リガンド依存性チャネルをコードするDNA、mRNAまたはcRNAを含むが、それらに限らない核酸物質を注入し、その後でチャネル活性ならびにチャネルの様々なモジュレーターに対する反応を測定することができる。
【0105】
LGIC/GluClに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞に対するか、またはこれらの細胞に由来し、機能性のホモ多量体またはヘテロ多量体チャネルを形成する膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびLGIC/GluClに結合するか、またはLGIC/GluClの公知のリガンドのこれらの細胞やこれらの細胞由来の膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、LGIC/GluClに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。前記方法によって確認される化合物は、LGIC/GluClの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性の有機分子であるかもしれない。
【0106】
したがって、本発明は、LGIC/GluClタンパク質をコードするDNAまたはRNAの発現を調節する化合物、ならびにLGIC/GluClタンパク質の機能を変化させる化合物をスクリーニングする方法を対象とする。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は、当分野で周知であり、それらをLGIC/GluClチャネルの作動薬および拮抗薬を確認するように適合させることができる。例えば、Cascieri等(1992、Molec.Pharmacol.41:1096〜1099)は、ラットのニューロキニン受容体に結合する作動薬を阻害し、したがってニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る物質を確認する方法を記載している。その方法では、COS細胞にラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターをトランスフェクトし、ニューロキニン受容体の発現を可能とするに十分な時間の間、トランスフェクトしたその細胞を培養し、トランスフェクトしたその細胞を回収し、ニューロキニン受容体の公知の放射活性標識作動薬を含む試験緩衝液中に、その物質の存在下または不在下のいずれかでその細胞を再懸濁し、次いでニューロキニン受容体の公知のその放射活性標識作動薬のニューロキニン受容体への結合を測定する。公知の作動薬の結合量がその物質の不在下より存在下で少なければ、その場合、その物質はニューロキニン受容体のリガンドとなり得る。作動薬、拮抗薬等のその物質のLGIC/GluClへの結合を測定する場合、標識リガンドを用いることによって、このような結合を測定することができる。当分野に公知の任意の都合良い方法で、例えば、放射活性、蛍光、酵素によって、リガンドを標識することができる。
【0107】
したがって、本発明は、DvLGIC/GluClタンパク質をコードするDNAまたはRNAの発現を調節する化合物をスクリーニングする方法を対象とする。これらの活性を調節する化合物は、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機または無機分子であるかもしれない。化合物は、DvLGIC/GluClをコードするDNAまたはRNAの発現、あるいはDvLGIC/GluCl系チャネルの機能を増加または減少させることによって、調節すると思われる。DvLGIC/GluClをコードするDNAまたはRNAの発現、あるいはその生物学的機能を調節する化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定/否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。DvLGIC/GluCl、DvLGIC/GluClに対する抗体、または修飾DvLGIC/GluClを含むキットを、このような用途のために公知の方法で調製してもよい。
【0108】
この目的のために、本発明は、LGIC/GluCl受容体活性を調節する物質を確認する方法に部分的に関するものであって、その方法では、
(a)配列番号2、6および/または8に示すアミノ酸配列を含むLGIC/GluCl受容体タンパク質の存在下、および不在下で試験物質を合わせ、かつ
(b)LGIC/GluCl受容体タンパク質または各機能性チャネルの存在下および不在下で、その試験物質の作用を測定し、比較すること
が必要である。
【0109】
その上、LGIC/GluCl受容体タンパク質の発現を指示する発現ベクターと共に、技術者が利用し得る多様な型のスクリーニングまたは選択試験を示すために、幾つかの特定の実施形態を本明細書に開示している。他の受容体のリガンドを確認する方法は当分野で周知であり、それらをLGIC/GluClのリガンドに適合させることができる。したがって、これらの実施形態を例として提示するが、制限するためのものではない。この目的のために、本発明は、(作動薬、拮抗薬等の)LGIC/GluClモジュレーターを確認し得る試験を含む。したがって、本発明は、ある物質がLGIC/GluClの作動薬または拮抗薬となり得るか否かを決定する方法であって、
(a)細胞中においてLGIC/GluClの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
(b)LGIC/GluClの発現を可能にするのに十分な時間の間、かつ機能性チャネルが作製するように、その試験細胞を培養すること、
(c)その物質の存在下、および不在下で、その細胞をLGIC/GluClの標識リガンドに曝すこと、
(d)その標識リガンドのLGIC/GluClチャネルへの結合量を測定すること
を含み、その標識リガンドの結合量がその物質の不在下より存在下で少ない場合、その物質がLGIC/GluClのリガンドとなり得るとする方法を含む。
【0110】
この方法の段階(c)を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で普通に使用する条件:例えば、生理的pH;PBS等の普通に用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件;約4℃から約55℃の温度である。その試験細胞を回収し、その物質およびその標識リガンドの存在下で再懸濁してもよい。前記方法の一改良法では、その細胞を回収し、再懸濁するのではなく、細胞を基材、例えば組織培養皿に付着させた状態で、細胞に公知の放射能標識作動薬およびその物質を接触させるように、段階(c)を改良する。
【0111】
また、本発明は、ある物質がLGIC/GluClと結合することができるか否か、即ちその物質がLGIC/GluClチャネル活性化のモジュレーターとなり得るか否かを決定する方法であって、
(a)細胞中においてLGIC/GluClの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
(b)その試験細胞をその物質に曝すこと、
(c)その物質のLGIC/GluClへの結合量を測定すること、
(d)その試験細胞におけるその物質のLGIC/GluClへの結合量を、LGIC/GluClでトランスフェクトされていない対照細胞へのその物質の結合量と比較すること
を含み、その物質の結合量が、対照細胞と比較して試験細胞中で大きい場合、その物質はLGIC/GluClに結合することができるとする方法も含む。次いで、その物質が実際に作動薬または拮抗薬であるか否かの決定を、本明細書に記載の電気生理学的試験等の機能性試験の使用によって実現することができる。
【0112】
この方法の段階(b)を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で普通に使用する条件:例えば、生理的pH;PBS等の普通に用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件;約4℃から約55℃の温度である。その試験細胞を回収し、その物質の存在下で再懸濁する。
【0113】
前記試験は機能性試験であってよく、その場合、電気生理学的試験(例えば、実施例2を参照されたい)をトランスフェクトした哺乳類細胞系、昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞中で行うことによって、試験化合物が(グルタミン酸等の)既知リガンドのチャネル活性化能力に及ぼす様々な効果を測定するか、あるいは、本質的に自然に活性を調節する(公知のGluClチャネルに対するイベルメクチンの作用に類似した)試験化合物を探し求めてもよい。したがって、技術者であれば、本発明の機能性LGIC/GluClチャネルを結合および/または活性化する化合物を選択する一次および二次スクリーニング用の公知の技法に、本発明のcDNAクローンを快く適合させると思われる。
【0114】
LGIC/GluClチャネルタンパク質のモジュレーターを確認する好ましい方法は、第1に、配列番号2、配列番号6および配列番号8からなる群から選択されるD.variabilis LGIC/GluClチャネルタンパク質と、試験化合物を接触させること、および第2に、その試験化合物のLGIC/GluClチャネルタンパク質に対する作用を測定することを含む。好ましい一態様は、組換え宿主細胞内に含まれるDNA発現ベクターの産物であるD.variabilis LGIC/GluClタンパク質を用いることである。
【0115】
LGIC/GluClグルタミン酸依存性チャネルタンパク質の活性を調節する化合物を確認する他の好ましい方法は、第1に、少なくともその一部が配列番号2、配列番号6および配列番号8からなる群から選択されるD.variabilis GluClチャネルタンパク質をコードする、核酸分子の集団を宿主細胞内に注入することによって、核酸分子の前記部分の発現により、活性なリガンド依存性チャネルを生じること、第2に、試験化合物の存在下、および不在下で宿主細胞膜電流を測定することを含む。相補的DNA、ポリA+メッセンジャーRNAおよび相補的RNAを含むが、それらに限らない多数の鋳型を使用してもよい。
【0116】
DvLGIC/GluClの量をスクリーニングし、測定するために、本発明のDNA分子、RNA分子、組換えタンパク質および抗体を使用してもよい。組換えタンパク質、DNA分子、RNA分子および抗体は、DvLGIC/GluClの検出およびタイプ決定に適したキットの処方に有用である。このようなキットは、少なくとも1個の容器を緊密に閉じ込めるのに適した仕切り付き運搬具を含むと思われる。更に、その運搬具は、組換えDvLGIC/GluClまたはDvLGIC/GluClの検出に適した抗DvLGIC/GluCl抗体のような試薬を含むと思われる。また、その運搬具は、標識抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。
【0117】
上記の試験は、DvLGIC/GluClで一時的または安定にトランスフェクトした細胞を用いて実行することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むが、それらに限らない多数の技術の任意の一法を介して、宿主細胞中に導入してもよい。トランスフェクションとは、試験細胞中にDvLGIC/GluClを導入するための、当分野で公知の任意の方法を含むことを意味している。例えば、トランスフェクションは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム介在トランスフェクション、リポフェクション、DvLGIC/GluClを含んだレトロウィルス構築体による感染、およびエレクトロポレーションを含む。発現ベクター含有細胞は、DvLGIC/GluClタンパク質を産生するか否かを決定するために、個別に分析する。DvLGIC/GluCl発現細胞の確認は、抗DvLGIC/GluCl抗体を用いた免疫反応性、標識リガンド結合、または機能性で非内在性のDvLGIC/GluCl活性を含むが、それらに限らない幾つかの手段によってなし得る。
【0118】
DvLGIC/GluClに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびDvLGIC/GluClに結合するか、またはDvLGIC/GluClの既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、DvLGIC/GluClに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射性、蛍光、または酵素標識した化合物に置き換わるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、DvLGIC/GluClの作動薬か拮抗薬であると思われる。
【0119】
したがって、DvLGIC/GluClに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびDvLGIC/GluClに結合するか、またはDvLGIC/GluClの(グルタミン酸、イベルメクチンまたはノジューリスポア酸等の)放射能標識した既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、DvLGIC/GluClに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射性、蛍光、または酵素標識した化合物に置き換わるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、やはりDvLGIC/GluClの作動薬か拮抗薬であると思われる。本明細書の他の部分に記したように、化合物は、DvLGIC/GluClをコードするDNAまたはRNAの発現を増加または減少させることによって、あるいはDvLGIC/GluCl受容体タンパク質の作動薬または拮抗薬として作用することによって、調節すると思われる。この場合もDvLGIC/GluClをコードするDNAまたはRNAの発現、あるいはその生物学的機能を調節するこれらの化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定/否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。
【0120】
DvLGIC/GluCl DNAの発現を、in vitroで生成した合成mRNAを用いて行ってもよい。合成mRNAは、小麦の麦芽抽出物および網状赤血球抽出物を含むが、それらに限らない様々な無細胞系において効果的に翻訳できるだけでなく、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含むが、それに限らない細胞に基ずく系においても効果的に翻訳することができ、後者の場合、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションが好ましい。
【0121】
宿主細胞中でのDvLGIC/GluClの発現後、DvLGIC/GluClタンパク質の回収によって活性形のDvLGIC/GluClタンパク質を提供してもよい。DvLGIC/GluClタンパク質の幾つかの精製手順が利用でき、使用に適している。塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組合せや個々の適用によって、組換えDvLGIC/GluClタンパク質を細胞溶解物および抽出物から精製してもよい。その上、完全長DvLGIC/GluClタンパク質、またはDvLGIC/GluClタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で作製したイムノ親和性カラムを用いて、組換えDvLGIC/GluClタンパク質を他の細胞タンパク質から分離することができる。
【0122】
D.variabilisチャネルの機能性試験は、チャネルの全体または一部がDvLGIC/GluClチャネルで構成される場合の1種または複数のリガンド依存性塩素イオンチャネル活性を測定する。DvLGIC/GluClチャネル活性は、本明細書に記載のチャネルを単独で用いて、あるいは、それをサブユニットとして、リガンド依存性塩素イオンチャネルの1種または複数の追加のサブユニット(好ましくは、1種または複数のDvLGIC/GluCl)であって、共同して機能性チャネル活性をもたらすサブユニットと併用して、測定することができる。DvLGIC/GluCl依存性塩素イオンチャネル活性を測定する試験は、36Clを用いる機能性スクリーニング、パッチクランプによる電気生理学的試験を用いる機能性スクリーニングおよび蛍光色素を用いる機能性スクリーニングを含む。このような試験を行う技術一般は、当分野で周知である(例えば、Smith et al.,1998,European Journal of Pharmacology 159:261−269;Gonzalez and Tsien,1997,Chemistry & Biology 4:269−277;Millar et al.,1994,Proc.R.Soc.Lond.B.258:307−314;Rauh et al.,1990 TiPS 11:325−329およびTsien等、米国特許第5661035号を参照されたい)。機能性試験は、個々の化合物または異なる化合物を含んだ調製物を用いて行うことができる。異なる化合物を含み、1種または複数の化合物がDvLGIC/GluClチャネル活性に影響する調製物は、DvLGIC/GluClチャネル活性に影響する化合物を確認するための、より小さな化合物群の中に分類することができる。本発明の一実施形態では、少なくとも10種の化合物を含む試験調製物が、機能性試験において使用される。組換えで産生し、様々な環境中に存在するDvLGIC/GluClチャネルを、機能性試験において使用することができる。適当な環境は、DvLGIC/GluClチャネルを含んだ生細胞および精製細胞抽出物、および活性に適切な膜と、更に、DvLGIC/GluClチャネル活性の測定に適した異なる環境中に導入される組換え手段によって産生される精製DvLGIC/GluClチャネルの使用を含む。チャネルにおいて活性な化合物を試験し、かつチャネルの異なる領域に関する情報を得るために、DvLGIC/GluCl誘導体を使用することができる。例えば、生来のチャネル中の各アミノ酸領域が改変されたDvLGIC/GluClチャネル誘導体を産生することができ、その改変のチャネル活性に対する効果を測定することによって、異なる領域に関する情報を得ることができる。
【0123】
DvLGIC/GluCl、あるいは配列番号2、5、および/または7に開示したDvLGIC/GluCl1(すなわち、1、11、または7−1)またはDvLGIC/GluCl2(10−2)の一部に由来する(普通、長さが約9個から約25個のアミノ酸の)合成ペプチドに対する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。DvLGIC/GluClに対する単一特異性抗体は、DvLGIC/GluClに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、またはKohlerおよびMilstein(1975、Nature 256:495〜497)の技法を用いて、DvLGIC/GluClと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体とは、DvLGIC/GluClに対する均一結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種と定義する。本明細書で使用する均一結合は、その抗体種が、前記のDvLGIC/GluClと結合する種のように、特異的な抗原やエピトープと結合する能力を指す。ヒトのDvLGIC/GluCl特異的抗体は、免疫アジュバントと共に、またはそれなしに、DvLGIC/GluClタンパク質、またはDvLGIC/GluClの一部分から作製した合成ペプチドの適当な濃度で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を免疫することによって産生する。
【0124】
一次免疫の前に、免疫前血清を収集する。許容し得る免疫アジュバントと共に、DvLGIC/GluClタンパク質を約0.1mgから約1000mg各動物に投与する。このような許容し得るアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvumを含む油中水乳濁液およびtRNAを含むが、それらに限らない。初回免疫は、皮下(SC)、腹腔内(IP)またはその両径路による多部位における、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のDvLGIC/GluClタンパク質またはそのペプチド断片からなる。各動物から一定の間隔、好ましくは毎週採血することによって、抗体価を決定する。動物には、初回免疫後、追加免疫注射を行ってもよく行わなくてもよい。追加免疫注射を受けるそれらの動物には、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量のDvLGIC/GluClを同じ径路によって与えられる。最大の力価が得られるまで、約3週間隔で追加免疫注射を与える。各追加免疫から約7日後、または単回免疫から約1週後に、各動物から採血し、血清を収集し、その各分量を約−20℃で保存する。
【0125】
DvLGIC/GluClと反応性のモノクローナル抗体(mAb)は、同系交配のマウス、好ましくはBalb/cをDvLGIC/GluClタンパク質で免疫することによって調製される。約0.5mlの緩衝液または塩水を、前記のような同量の許容し得るアジュバント中に導入し、その中のDvLGIC/GluClタンパク質約1mgから約100mg、好ましくは約10mgでIPまたはSC径路によりマウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。初回免疫を0日にマウスに与え、約3週から約30週の間休息を与える。免疫マウスに、リン酸緩衝塩水等の緩衝液中、DvLGIC/GluCl約1mgから約100mgの追加免疫を1回または複数回、静脈内(IV)径路により与える。抗体陽性のマウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球は、当分野で公知の標準的手順で、免疫マウスから脾臓を除去することによって得られる。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を適当な融合相手の細胞、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすると思われる条件下で混合することによって産生される。融合相手の細胞は、各マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1、MPC−11、S−194およびSp2/0を含んでもよいが、それらに限らず、好ましくはSp2/0である。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、分子量約1000、濃度約30%から約50%のポリエチレングリコール中で融合する。融合ハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)中での増殖によって、当分野で公知の手順により選択される。上清液を約14、18および21日に増殖陽性ウェルから収集し、抗原としてDvLGIC/GluClを用いて、固相イムノラジオアッセイ(SPIRA)等のイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降検定で試験することによって、そのmAbのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、MacPherson、1973、Soft Agar Techniques、in Tissue Culture Methods and Applications、Kruse and Paterson、Eds.、Academic Pressの軟寒天法等の技法によってクローニングした。
【0126】
モノクローナル抗体は、元の感作Balb/cマウスに、感作後約4日に約2×106から約6×106のハイブリドーマ細胞を1匹当たり約0.5mlで注入することによって、in vivoで産生される。細胞導入後約8〜12日に腹水を収集し、モノクローナル抗体を当分野で公知の技法で精製する。
【0127】
抗DvLGIC/GluCl mAbのin vitroでの産生は、十分な量の特異的mAbを得るために、約2%のウシ胎児血清を含むDMEM中でハイブリドーマを増殖させることによって行われる。そのmAbを当分野で公知の技法で精製する。
【0128】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降、受動凝集、酵素連結イムノソルベント抗体(ELISA)法およびラジオイムノアッセイ(RIA)法を含むが、それらに限らない様々な血清学的または免疫学的試験によって決定される。体液または組織および細胞抽出液中のDvLGIC/GluClの存在を検出するために、同様の試験を用いる。
【0129】
DvLGIC/GluClペプチド断片、または各完全長DvLGIC/GluClに対する特異抗体を産生するために、単一特異性抗体を産生する前記方法を利用し得ることは、当業者には自明である。
【0130】
DvLGIC/GluCl抗体親和性カラムを、例えば、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、N−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のAffigel−10(Biorad)にその抗体を添加することによって作製する。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを1M エタノールアミンHCl(pH8)で消失させる。そのカラムを水、次いで0.23M グリシンHCl(pH2.6)で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝塩水(pH7.3)中で平衡化し、完全長DvLGIC/GluClまたはDvLGIC/GluClタンパク質断片を含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度(A280)がバックグランド値に下がるまで、カラムをリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を0.23M グリシンHCl(pH2.6)で溶出する。次いで、精製DvLGIC/GluClタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【0131】
また、本発明は、in vitroでの培養に細胞を提供することによって、DvLGIC/GluClまたは機能性DvLGIC/GluClの任意の代替チャネルのモジュレーターとして、in vivoで作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するに当たって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当分野で公知の方法によって、動物の細胞中の1個または複数の染色体の中に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも一箇所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のcDNAクローンの1種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および/または導入遺伝子も、当分野で公知の遺伝調節因子および/または構造因子を含み得る。遺伝子導入のための標的細胞型は、胚性幹細胞(ES)である。in vitroで培養した着床前の胚からES細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる(Evans et al.、1981、Nature 292:154〜156;Bradley et al.、1984、Nature 309:255〜258;Gossler et al.、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065〜9069;およびRobertson et al.、1986、Nature 322:445〜448)。DNAトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準的技法、またはレトロウィルス介在形質導入によって、導入遺伝子をES細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ES細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ES細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する(Jaenisch、1988、Science 240:1468〜1474)。
【0132】
また、本発明は、DvLGIC/GluClのモジュレーターとして作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するにあたって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当分野で公知の方法によって、動物の細胞中の1個または複数の染色体中に組込まれる。いったん組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも1カ所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のcDNAクローンの1種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および/または導入遺伝子は、当分野で公知の遺伝調節因子および/または構造因子をも含み得る。導入遺伝子を導入する標的細胞型は、胚性幹細胞(ES)である。in vitroで培養した着床前の胚からES細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる(Evans et al.,1981,Nature 292:154−156;Bradley et al.,1984,Nature 309:255−258;Gossler et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065−9069;およびRobertson et al.,1986,Nature 322:445−448)。DNAトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準的技法、またはレトロウィルス介在形質導入によって、導入遺伝子をES細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ES細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ES細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する(Jaenisch,1988,Science 240:1468−1474)。
【0133】
自然に生成するDvLGIC/GluCl遺伝子をネイティブ遺伝子と称し、それが突然変異体でなければ、野生型と称することもできる。改変されたDvLGIC/GluCl遺伝子(線虫内など)は、宿主動物にとってネイティブなものと同じLGIC/GluClを完全にコードするはずはなく、その発現産物を多少とも改変することができるか、またはそれが全く存在しないこともあり得る。ネイティブLGIC/GluCl遺伝子が存在しない条件で、トランスジェニック動物中に非ネイティブDvLGIC/GluCl遺伝子を発現することが有用な場合では、その改変LGIC/GluCl遺伝子が、その動物中に特徴のないノックアウト表現型を誘発するのが好ましい。しかし、修飾の程度がもっと低いLGIC/GluCl遺伝子も有用となり得るし、本発明の範囲に入る。DvLGIC/GluClの突然変異は、標的欠失突然変異、標的置換突然変異および/または標的挿入突然変異であってもよい。しかし、好ましい突然変異は欠失突然変異であり、DvLGIC/GluCl遺伝子の全てと言えないまでも、その大部分の欠失を起こす欠失突然変異が特に好ましい。LGIC/GluCl遺伝子が改変されたか、好ましくは完全に欠失したトランスジェニック動物が生成する。LGIC/GluClの遺伝子欠失、遺伝子修飾および/または遺伝子挿入でネイティブ遺伝子が機能性を失う結果、「ノックアウト」トランスジェニック動物が生成するか、あるいはLGIC/GluClの発現または活性が変化する。前記のように、活性化されたDvLGIC/GluCl遺伝子を有しないヒト以外のトランスジェニック動物を、DvLGIC/GluClの過剰発現または欠失から起こる病理学的表現型を反転し得るDvLGIC/GluCl発現および/または活性のモジュレーター(小分子やペプチド等のモジュレーター)を試験/スクリーニングするために使用することができる。
【0134】
好ましい欠失突然変異は、ヌクレオチド1個から全遺伝子の欠失までの任意の部位の欠失であって、野生型DvLGIC/GluClに関する読み取り枠や関連するシス作用調節配列を含んだ欠失を含み得る。より小さな欠失は、非機能性である可能性が極めて高いタンパク質を生じるフレームシフト変異が起こるように、3で割り切れないのが好ましい。3で割り切れないこのような任意の小型の欠失は、非機能性の端部切断タンパク質生成物を生成する可能性を増すために、読み取り枠の5’領域に対してターゲッティングするのが好ましい。しかし、前記のように、機能性のDvLGIC/GluClタンパク質の発現防止を確実にするために、欠失突然変異がDvLGIC/GluCl遺伝子の全てと言えないまでも、その大部分を含むことが好ましい。したがって、本発明のDvLGIC/GluCl欠損動物細胞、ヒト以外のトランスジェニック胚、ヒト以外のトランスジェニック細胞、およびヒト以外のトランスジェニック同腹子を、前段に例示したような当分野で公知の任意の技法によって生成してもよい。線虫LGIC/GluClサブユニットの一方または両方をノックアウトされた線虫突然変異体において、野生型線虫LGIC/GluClバックグランド中にDvLGIC/GluCl導入遺伝子をも発現するトランスジェニックまたはノックアウト無脊椎動物(例えば、線虫)を作製することも、当該技術者の範囲内にあると思われる。
【0135】
薬剤として許容し得る担体の混合物のような公知の方法により、DvLGIC/GluClのモジュレーターを含む薬剤として有用な組成物を処方し得る。このような担体の例および処方の方法を、Remington’s Pharmaceutical Sciences中に見出し得る。効果的投与に適した、薬剤として許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、有効量のタンパク質、DNA、RNA、修飾DvLGIC/GluCl、あるいは、チロシンキナーゼ活性化剤または阻害剤を含むDvLGIC/GluCl作動薬または拮抗薬のいずれかを含むと思われる。
【0136】
本発明の治療または診断用組成物は、障害を治療または診断するのに十分な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢等の様々な要因に応じて変化し得る。他の要因には投与方式が含まれる。
【0137】
その薬剤組成物を、皮下、局所、経口、筋肉内等の多様な径路によって個体に供してよい。
【0138】
「化学的誘導体」という用語は、普通は基本分子の一部でない追加の化学的部分を含んだ分子を指す。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改良し得る。あるいは、その部分が、基本分子の好ましくない副作用を弱めるか、または基本分子の毒性を減少させるかもしれない。このような部分の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences等の様々なテキスト中に記載されている。
【0139】
本明細書に開示した方法に従って確認した化合物は、単独で適当な投与量で使用してもよい。あるいは、他の剤の同時投与または逐次投与が望ましいかもしれない。
【0140】
本発明は、本発明の成分を含む障害の新規な治療法に使用する適当な局所用、経口用、全身用および非経口用薬剤処方を提供する目的も有している。本明細書に従って確認した化合物を活性成分として含む組成物は、従来の投与用媒体中の非常に多様な治療剤形で投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤(適時放出および持続的放出処方を各々含む)、丸剤、散在、顆粒剤、エリキシール剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の経口剤形で、または注射によって、それらの化合物を投与することができる。同様に、静脈内(ボーラスでも輸液でも)、腹腔内、皮下、閉塞を伴っているか、または伴っていない局所、または筋肉内の剤形で、全て製剤技術者に周知の剤形を用いて、それらを投与することもできる。
【0141】
本発明の化合物を1日1回の用量で投与するか、または1日の全投薬量を1日2回、3回または4回の分割用量で投与するのが有利であるかもしれない。更にまた、適当な鼻腔内媒体の局所使用を介して鼻腔内剤形で、または、当業者に周知の経皮性皮膚パッチの形態を用いて経皮径路で、本発明の化合物を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、投薬プログラムを通して、投薬は当然間欠的ではなく連続的になると思われる。
【0142】
投薬が別々に処方されている複数の活性剤を用いる併用療法に対しては、各活性剤を同時に投与するか、または時間をずらしてそれらを投与することができる。
【0143】
本発明の化合物を利用する投薬プログラムは、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態;治療すべき状態の重度;投与径路;患者の腎、肝および心血管機能;および使用する特定の化合物を含む様々な要因に応じて選択される。平均的技量の医師または獣医であれば、病状の進行を防止、阻止または抑止するのに必要な有効量の薬物を容易に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を示す範囲内に、薬物濃度を最適な精度で実現するためには、標的部位に対するその薬物利用性動態学に基く投薬プログラムが必要である。これには、薬物の分布、平衡、および消失に関する考察が必要である。
【0144】
以下の実施例を、本発明を例示するために提供するが、制限するために提供するものではない。
【0145】
実施例1
DvLGIC/GluCl 1、DvLGIC/GluCl 11、DvLGIC/GluCl 7−1(DvGluCl1)およびDvLGIC/GluCl 10−2(DvGluCl2)をコードするcDNA分子の分離および発現
マダニDermacentor cDNAライブラリーの生成:5’EcoRI−3’XhoIインサートとしてクローニングされる、オリゴ(dT)がプライマーのZAP cDNAライブラリーを生成するために、PolyA+RNAをDermacentorマダニの全虫から精製した。そのライブラリーは、増幅する前に約1.8×106個の独立したクローンから成っていた。ZAP Express cDNA合成キットおよびZAP Express(商標) cDNA GIGAPACKIIIゴールドクローニングキットをStratagene(La Jolla,CA)から購入し、その製造会社の教示に従って使用した。
【0146】
Dermacentor LGIC/GluCl遺伝子のライブラリー検索および分離:2種のDNAプローブを使用した。
【0147】
1.第1プローブは、マダニRhipicephalus sanguineusのLGIC/GluCl1(RsLGIC/GluCl1)に由来し、プライマーとして、i)センス鎖5’CGG ATA TTG GAC AGC ATC3’(配列番号8)、およびii)アンチセンス鎖5’CCA GTA GAC GAG GTT GAA GAG G−3’(配列番号9)を用いて、それをPCR増幅することによって、RsLGIC/GluCl 1読み取り枠の448位から1645位までのヌクレオチド断片を生成した。RsLGIC/GluCl1プローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである。
【0148】
【化6】
【0149】
2.第2プローブは、マダニRhipicephalus sanguineusのLGIC/GluCl2クローン(RsLGIC/GluCl2)遺伝子に由来し、プライマーとして、i)センス鎖5’TGT GGT GGT GAT AGC TGC 3’(配列番号11)、およびii)アンチセンス鎖5’GAG TTG ATC AAT CTG CTT GG3’(配列番号12)を用いて、それをPCR増幅することによって、RsLGIC/GluCl 2読み取り枠の166位から1315位までのヌクレオチド断片を生成した。RsLGIC/GluCl1プローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである。
【0150】
【化7】
【0151】
PCR用のVent DNA PolymeraseをNew England Biolabs(Boston MA)から購入した。各増幅サイクルは、95℃、1分間、72℃、1分間、および72℃、1分間から成っていた。35サイクルの後、最後に72℃で5分間延長した。PCR産物をアガロースゲルで精製し、Random Primer DNA Labeling System(GibcoBRL,Gaitherburg,MD)を用いて32P−dCTPで標識し、生成したRsLGIC/GluCl1(配列番号11)プローブを、先ずDermacentor cDNAライブラリーの組換え体約5.5×105の検索に使用した。ハイブリッド形成は、6×SSPE、0.1%SDS、10×デンハルト溶液、サケ精子DNA(200μg/ml)および45%ホルムアミド中、42℃で行った。次いで、各膜をi)2×SSC、0.5%SDS中、室温で15分間、およびii)0.2×SSC、0.5%SDS中、42℃で30分間、各2回洗浄後、0.2×SSC、0.5%SDS中、55℃で30分間、1回洗浄した。RsLGIC/GluCl1プローブを、i)0.05M NaOH+0.5M NaCl溶液中、約1時間インキュベートし、次いでii)0.5M Tris:Cl(pH7.4)溶液中、約1時間インキュベートし、次いでiii)1×SSPE中、全て室温で濯ぐことによって、各膜から除去した。DvLGIC/GluCl1、DvLGIC/GluCl 11、DvLGIC/GluCl 7−1およびDvLGIC/GluCl 10−2を含む8種のポジティブクローンを始めの検索で確認した。DvLGIC/GluCl1、DvLGIC/GluCl 11およびDvLGIC/GluCl 7−1は両プローブで確認されたが、DvLGIC/GluCl 10−2はRsLGIC/GluCl2プローブだけで認めた。6種の全インサートをファージから切出し、製造業者の処方(Stratagene,La Jolla,CA)を用いてpBK−CMVファージミドベクターに転換し、ABI PRISM(商標)377DNAシークエンサー(Perkin Elmer,Foster City,CA)で配列決定した。DvLGIC/GluCl1 cDNAインサートは3598bpであって、図1A〜Cに開示され、配列番号1として開示されている。DvLGIC/GluCl11 cDNAインサートは3442bpであって、図3A〜Cに開示され、配列番号3として開示されている。DvLGIC/GluCl 7−1 cDNAインサートは2194bpであって、図4A〜Bに開示され、配列番号4として開示されている。最後に、DvLGIC/GluCl10−2 cDNAインサートは4077bpであって、図6A〜Cに開示され、配列番号6として開示されている。
【0152】
in vitroで転写されたキャップ構造RNAの合成:各クローンDvLGIC/GluCl1、DvLGIC/GluCl 11、DvLGIC/GluCl 7−1およびDvLGIC/GluCl 10−2の読み取り枠(ORF)の、開始メチオニン(ATG)上流のT7プロモーターおよび停止コドン(TAG)に続くポリA+テールを追加するために、PCR戦略を用いた。フランキングT7プロモーターおよびポリA+テールを含んだ増幅ORFを、in vitro転写反応における鋳型として直接使用した(mMessage mMachine,Ambion,Austin,TX)。DNA鋳型を除去した後、ヌクレアーゼ非含有水で体積を100μlに調節し、G−50セファデックスカラム(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を用いてRNAを精製した。溶出液を同体積のフェノール/クロロホルムで抽出後、クロロホルムで2回目の抽出を行い、イソプロピルアルコールで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁させることによって、保存濃度を1μg/μlにした。
【0153】
実施例2
アフリカツメガエル卵母細胞におけるDvLGIC/GluCl1クローンの機能性発現
アフリカツメガエル laevisの卵母細胞を調製し、以前に記載の標準的方法[Arena,J.P.,Liu,K.K.,Paress,P.S.&Cully,D.F.Mol.Pharmacol.40,368−374(1991);Arena,J.P.,Liu,K.K.,Paress,P.S.,Schaeffer,J.M.&Cully,D.F.,Mol.Brain Res.15,339−348(1992)]を用いてそれに注入した。成体雌アフリカツメガエル laevisを0.17%トリカインメタンスルホン酸で麻酔し、その卵巣を外科的に除去し、次の成分(mM)からなる溶液中に入れた:NaCl 82.5、KCl 2、MgCl2 1、HEPES 5、ピルビン酸Na 2.5、ペニシリンG 100,000ユニット/L、硫酸ストレプトマイシン 1000mg/L、pH7.5(Mod.OR−2)。卵巣葉を開き破り、Mod.OR−2中で数回濯ぎ、軽く振とうしながら室温で、Mod.OR−2中0.2%コラゲナーゼ(Sigma、1型)の中でインキュベートした。1時間後にコラゲナーゼ溶液を更新し、約50%の卵母細胞が卵巣から放出されるまで、卵母細胞を更に30〜90分間インキュベートした。V期およびVI期の卵母細胞を選択し、注入前の16〜24時間の間、次の成分(mM)を含んだ媒体中に入れた:NaCl 96、KCl 2、MgCl2 1、CaCl2 1.8、HEPES 5、ピルビン酸Na 2.5、テオフィリン 0.5、ゲンタマイシン 50mg/ml、pH7.5(ND−96)。卵母細胞に50nlのDvLGIC/GluCl1またはDvLGIC/GluCl 7−1 RNAを濃度0.2mg/mlで注入した。卵母細胞をND−96中、18℃で1〜6日間インキュベートした後、記録をとった。
【0154】
記録は、次の成分(mM)からなる改変ND−96中、室温でとった:NaCl 96、MgCl2 1、CaCl2 0.1、BaCl2 3.5、HEPES 5、pH7.5。マッキントッシュ7100/80コンピュータにインターフェースで接続したDagan CA1二微小電極増幅器(Dagan Corporation,Minneapolis,MN)を用いて、卵母細胞を電位クランプした。電流通過電極は0.7M KCl、1.7M クエン酸Kで満たし、電位記録電極は1M KClで満たした。実験の間中、卵母細胞に、改変ND−96(対照溶液)、またはチャネル活性化剤および阻止剤の可能性がある物質を含むND−96を約3ml/分の速度で注いだ。HEKA Elektronik(Lambrecht,Germany)製のパルスソフトウェアを用いて、データを100Hzで取得し、33.3Hzでフィルタにかけた。全ての記録を、0または−30mVのいずれかの保持電位で行った。
【0155】
DvLGIC/GluCl 1(図9)またはDvLGIC/GluCl 7−1(図10)を発現する卵母細胞は、1μMのリン酸イベルメクチンの施用に反応してゆっくりと活性化される電流を示した。リン酸イベルメクチンを洗い落としたとき、この電流は不可逆性であった。それに対し、1mMのグルタミン酸の施用では電流が活性化されなかった。
【0156】
実施例3
哺乳類細胞におけるDvLGIC/GluClクローンの機能性発現
DvLGIC/GluClを哺乳類発現ベクター中にサブクローニングし、選択した哺乳類細胞にトランスフェクトするために使用することができる。G418の存在下での増殖によって、安定な細胞クローンを選択する。G418耐性単一種クローンを分離し、無傷のDvLGIC/GluCl遺伝子の存在を確認するために試験をする。次いで、DvLGIC/GluClを含んだクローンを、DvLGIC/GluClタンパク質特異抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫蛍光等の免疫学的技法を用いて、発現について分析した。抗体は、DvLGIC/GluCl配列から予測されるアミノ酸配列から合成したペプチドを接種したウサギから得られる。パッチクランプ電気生理学法および陰イオンフラックスアッセイによっても、発現は分析される。
【0157】
活性なチャネルタンパク質の発現を試験するために、DvLGIC/GluClを安定に、または一時的に発現している細胞が使用される。これらの細胞は、各チャネルを調節、阻害または活性化する化合物の能力を確認し、調べるために、使用される。
【0158】
プロモーターに対してポジティブな方位にDvLGIC/GluCl cDNAを含むカセットは、プロモーターの3’に対して適当な制限部位中に連結され、制限部位地図作製および/または配列決定によって確認される。これらのcDNA発現ベクターを、繊維芽細胞性宿主細胞、例えば、COS−7(ATCC#CRL1651)、およびCV−1tat(Sackevitz et al.、1987,Science 238:1575)、293、L(ATCC#CRL6362)中に、エレクトロポレーションまたは化学的手順(陽イオンリポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム)を含むが、それらに限らない標準的方法で導入してもよい。トランスフェクトした細胞および細胞培養液上清を回収し、本明細書に記載のDvLGIC/GluCl発現の分析をすることができる。
【0159】
哺乳類細胞での一時的発現に使用するベクターは全て、DvLGIC/GluClを発現する安定な細胞系を樹立するために使用することができる。発現ベクター中にクローニングされた未改変のDvLGIC/GluCl cDNA構築体は、宿主細胞がDvLGIC/GluClタンパク質を産生するようにプログラムすると予想される。トランスフェクション宿主細胞は、CV−1−P(Sackevitz et al.、1987,Science 238:1575)、tk−L(Wigler,et al.、1977,Cell 11:223)、NS/0およびdHFr−CHO(Kaufman and Sharp,1982,J.Mol.Biol.159:601)を含むが、それらに限らない。
【0160】
G418、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ;ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−B ホスホトランスフェラーゼ;APRT、キサンチン−グァニン ホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、それらに限らない薬物選択プラスミドによる、DvLGIC/GluCl cDNAを含んだベクターの同時トランスフェクションは、安定にトランスフェクトされるクローンの選択を可能にすると思われる。DvLGIC/GluClのレベルは、本明細書に記載の試験によって定量化される。可能な限り多量のDvLGIC/GluClを合成する哺乳細胞クローンを作製するために、DvLGIC/GluCl cDNA構築体を、増幅可能な薬物耐性マーカーを含んだベクター中に連結してもよい。これらの構築体を細胞に導入後、プラスミドを含むクローンを適当な作用剤で選択し、その作用剤の用量増加による選択によって、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの分離が実現する。組換えDvLGIC/GluClの発現は、完全長DvLGIC/GluCl cDNAの哺乳類宿主細胞へのトランスフェクションによって実現される。
【0161】
実施例4
昆虫細胞中での発現を目的とした、バキュロウィルス発現ベクター中へのDvLGIC/GluCl cDNAのクローニング
AcNPVウィルスのゲノム由来のバキュロウィルスベクターを、昆虫細胞のSf9系(ATCC CRL#1711)内で高水準のcDNA発現量をもたらすように設計する。DvLGIC/GluCl cDNAを発現する組換えバキュロウィルスは、次の標準的方法(InVitrogen Maxbacマニュアル)によって作製される。DvLGIC/GluCl cDNA構築体を、pAC360およびBlueBacベクター(InVitrogen)を含む多様なバキュロウィルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウィルスは、バキュロウィルス移入ベクターおよび線状化AcNPVゲノムDNA(Kitts,1990,Nuc.Acid.Res.18:5667)の、Sf9細胞中への同時トランスフェクション後に起こる相同的組換えによって作製される。組換えpAC360ウィルスは、感染細胞中に封入体がないことによって確認され、組換えpBlueBacウィルスは、b−ガラクトシダーゼの発現に基いて確認される(Summers,M.D.and Smith,G.E.,Texas Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555)。プラークの精製後、本明細書に記載の試験によってDvLGIC/GluCl発現を測定する。
【0162】
DvLGIC/GluCl LGIC/GluClに対する読み取り枠全体をコードするcDNAを、pBlueBacIIのBamHI部位中に挿入する。ポジティブ方位の構築体を配列分析で確認し、線状AcNPVのマイルドタイプDNAの存在下、Sf9細胞にトランスフェクトするために使用する。
【0163】
実施例5
酵母発現ベクター中へのDvLGIC/GluCl cDNAのクローニング
異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を指示するように設計した発現ベクター中に、最適なDvLGIC/GluCl cDNAシストロンを挿入した後、組換えDvLGIC/GluClが酵母S.cerevisiae中に産生される。細胞内発現の場合には、EmBLyex4やその類似体等のベクターをDvLGIC/GluClシストロンに連結する(Rinas,et al.、1990,Biotechnology 8:543〜545;Horowitz B.et al.、1989,J.Biol.Chem.265:4189〜4192)。細胞外発現の場合は、分泌シグナル(酵母または哺乳類ペプチド)をDvLGIC/GluClタンパク質のNH2末端に融合する酵母発現ベクター中に、DvLGIC/GluCl LGIC/GluClシストロンを連結する(Jacobsen,1989,Gene 85:511〜516;Riett and Bellon,1989,Biochem.28:2941〜2949)。
【0164】
これらのベクターは、ヒト血清アルブミンシグナルを発現するcDNAに融合するpAVE1−6(Steep,1990,Biotechnology 8:42〜46)、およびヒトリゾチームシグナルを発現するcDNAに融合するベクターpL8PL(Yamamoto,Biochem.28:2728〜2732)を含むが、それらに限らない。その上、ベクターpVEPを利用して、DvLGIC/GluClはユビキチンと複合した融合タンパク質として酵母中に発現する(Ecker,1989,J.Biol.Chem.264:7715〜7719;Sabin,1989,Biotechnology 7:705〜709;McDonnell,1989,Mol.Cell Biol.9:5517〜5523(1989))。DvLGIC/GluClの発現量は、本明細書に記載の試験によって決定される。
【0165】
実施例6
組換えDvLGIC/GluClの精製
抗体親和性クロマトグラフィによって、組換え産生DvLGIC/GluClを精製し得る。DvLGIC/GluCl LGIC/GluCl抗体親和性カラムは、抗DvLGIC/GluCl LGIC/GluCl抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、N−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のAffigel−10(Biorad)に、その抗体を添加することによって作製される。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを1M エタノールアミンHCl(pH8)で消失させる。そのカラムを水、次いで0.23M グリシンHCl(pH2.6)で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、洗剤等の適当な膜溶解剤と共に、カラムをリン酸緩衝塩水(pH7.3)中で平衡化し、可溶化DvLGIC/GluClを含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度(A280)がバックグランド値に下がるまで、カラムを洗剤と共にリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を洗剤と共に0.23M グリシンHCl(pH2.6)で溶出する。次いで、精製DvLGIC/GluClタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 配列番号1に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 1のヌクレオチド配列を示す図である。
【図1B】 配列番号1に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 1のヌクレオチド配列を示す図である。
【図1C】 配列番号1に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 1のヌクレオチド配列を示す図である。
【図2】 配列番号2に示したD.variabilis LGIC/GluClタンパク質、DvLGIC/GluCl 1およびDvLGIC/GluCl 11のアミノ酸配列を示す図である。
【図3A】 配列番号3に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 11のヌクレオチド配列を示す図である。
【図3B】 配列番号3に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 11のヌクレオチド配列を示す図である。
【図3C】 配列番号3に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 11のヌクレオチド配列を示す図である。
【図4A】 配列番号5に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 7−1のヌクレオチド配列を示す図である。
【図4B】 配列番号5に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 7−1のヌクレオチド配列を示す図である。
【図5】 配列番号5に示したD.variabilis LGIC/GluClのタンパク質、DvLGIC/GluCl 7−1のアミノ酸配列を示す図である。
【図6A】 配列番号6に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 10−2のヌクレオチド配列を示す図である。
【図6B】 配列番号6に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 10−2のヌクレオチド配列を示す図である。
【図6C】 配列番号6に示したD.variabilis LGIC/GluClのcDNAクローン、DvLGIC/GluCl 10−2のヌクレオチド配列を示す図である。
【図7】 配列番号7に示したD.variabilis LGIC/GluClのタンパク質、DvLGIC/GluCl 10−2のアミノ酸配列を示す図である。
【図8】 DvLGIC/GluCl 1(配列番号2)、DvLGIC/GluCl 11(配列番号2)、DvLGIC/GluCl 7−1(配列番号5)およびDvLGIC/GluCl 10−2(配列番号7)の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図9】 DvLGIC/GluCl 1 mRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電流活性を示す図である。電流活性は1μMのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【図10】 アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したDvLGIC/GluCl 7−1のイベルメクチンによる活性を示す図である。電流活性は〜1μMのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【配列表】
Claims (22)
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードする精製された核酸分子であって、
(a)配列番号2及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、
(b)配列番号2または5をコードする第2の核酸分子の相補体と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子、または
(c)配列番号1、3または4に示す第2の核酸分子の相補体と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子を含む核酸分子。 - リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質であって、配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
- 組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項2に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、組換えD.variabilisチャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項3に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を発現する方法であって、
(a)請求項3に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
(b)前記発現ベクターから前記D.variabilisのチャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階(a)の宿主細胞を培養すること
を含む方法。 - リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号1に示すヌクレオチド配列からなる精製されたDNA分子。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号1に示すヌクレオチド配列の170位ヌクレオチドから1363位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるDNA分子。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号3に示すヌクレオチド配列からなる精製されたDNA分子。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号3に示すヌクレオチド配列の32位ヌクレオチドから1225位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるDNA分子。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質であって、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
- 組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項10に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、組換えD.variabilisのチャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を発現する方法であって、
(a)請求項11に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
(b)前記発現ベクターから前記D.variabilisのチャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階(a)の宿主細胞を培養すること
を含む方法。 - リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号4に示すヌクレオチド配列からなる精製されたDNA分子。
- リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質をコードし、配列番号4に示すヌクレオチド配列の47位ヌクレオチドから1315位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるDNA分子。
- 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号2に示すアミノ酸配列を含む、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質。
- 組換え宿主細胞内に含まれるDNA発現ベクターの産物である請求項16に記載の、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質。
- 請求項17に記載の組換え宿主細胞から精製された、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
- 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号5に示すアミノ酸配列を含む、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質。
- 組換え宿主細胞内に含まれるDNA発現ベクターの産物である請求項19に記載の、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質。
- 請求項20に記載の組換え宿主細胞から精製された、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
- 配列番号2および配列番号5に示す各アミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、D.variabilisのチャネルタンパク質。
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