ES2260948T3 - Moleculas de adn que codifican variantes ajustadas de la proteina del receptor de la melanocortina-1. - Google Patents
Moleculas de adn que codifican variantes ajustadas de la proteina del receptor de la melanocortina-1.Info
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica la proteína del receptor de la melanocortina 1 humana, en la que el receptor de la melanocortina 1 humana comprende una región carboxi terminal en la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC DE ID Nº 27.
Description
Moléculas de ADN que codifican variantes
ajustadas de la proteína del receptor de la
melanocortina-1.
La presente solicitud reivindica la prioridad
del Documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/113.401,
presentada el 23 de Diciembre de 1998.
La presente invención se refiere a moléculas de
ADN que codifican las variantes ayustadas de la proteína del
receptor de melanocortina-1 (MC-R1)
que pertenece a la subfamilia de la rodopsina de los receptores
acoplados de la proteína G, a los vectores recombinantes que
comprenden las moléculas de ADN que codifican las proteínas
variantes ayustadas de MC-R1, a las células huésped
recombinantes que contienen un vector recombinante que codifican
variantes ayustadas de la MC-R1, a las proteínas
MC-R1 humanas codificadas por la molécula de ADN, y
a los procedimientos para identificar los agonistas y antagonistas
selectivos de las proteínas variante ayustadas de la
MC-R1 descritas a lo largo de esta memoria.
Los receptores de la melanocortina pertenecen a
la subfamilia de la rodopsina de los receptores acoplados de la
proteína (GPCR) de. Se conocen cinco subtipos diferentes. Estos
receptores de la melanocortina se enlazan y se activan mediante
péptidos tales como hormonas \alpha-, \beta-, o \gamma- que
estimulan los melanocitos (\alpha-, \beta-,
\gamma-MSH) derivadas del gen de la
pro-opiomelanocortina (POMC). Se cree que un amplio
intervalo de funciones fisiológicas están mediadas por los péptidos
de la melanocortina y sus receptores.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.532.347,
concedida el 2 de Julio de 1996, a Cone y Mountjoy describe y
reivindica moléculas de ADN en seres humanos y ratón que codifican
MC-R1 (también conocida en la técnica como
\alpha-MSH-R). La proteína humana
expresada contiene 317 aminoácidos.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.849.871,
concedida el 15 de Diciembre de 1998, a Cone y Mountjoy describe y
reivindica MC-R1 de seres humanos y ratón. Tal como
se ha señalado en el párrafo anterior, la proteína humana expresada
contiene 317 residuos de aminoácidos.
Mountjoy, y col., (1992, Science 257:
1248-1251) describen moléculas de ADN y la proteína
concomitante para MC-R1 humana y
MC-R2 humana.
Chhajlani, y col., (1992, FEBS Letters
309: 417-420) describen también una molécula de ADN
humano que comprende un marco abierto de lectura que codifica la
MC-R1 humana.
Cone y col., (1996, Recent Progress in
Hormone Research 51: 287-318) revisan el estado
de los receptores de la melanocortina de mamíferos conocidos, desde
MC-R1 a MC-R5.
Jackson (1997, Human Molecular Genetics
6: 1613-24) y Koppula y col., (1997, Human Mutation
9:30-36) revisan la incidencia y el significado
potencial de los polimorfismos dentro de la secuencia que codifica
la forma A de la MC-R1 humana.
Es deseable correlacionar los datos in
vivo con la actividad bioquímica in vitro de los
compuestos.
Es también deseable seleccionar compuestos que
activen una o más proteínas del receptor de la melanocortina humana
in vitro.
Es deseable además descubrir nuevos fármacos que
afecten a procesos patofisiológicos modulando la actividad del
receptor de la melanocortina, seguido por ensayos clínicos en seres
humanos.
La presente invención se dirige a y satisface
estas necesidades describiendo moléculas de ácido nucleico aisladas
que expresan las variantes ayustadas de la MC-R1
humana, los vectores recombinantes que alojan estas moléculas de
ácido nucleico, las células huésped recombinantes que expresan estas
formas alternativas de la MC-R1 humana y/o sus
equivalentes biológicamente activos, y las propiedades
farmacológicas de estas proteínas MC-R1 humanas.
La presente invención se refiere a una serie de
moléculas de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos) que
codifican variantes nuevas de la proteína del receptor de la
melanocortina-1, denominadas en el presente
documento como proteínas MC-R1B. Las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención están sustancialmente libres
de otros ácidos nucleicos. Estas moléculas aisladas de ácido
nucleico codifican una proteína MC-R1 que contiene
un dominio intracelular con un residuo adicional de 65 aminoácidos
en comparación con la MC-R1 humana descrita
anteriormente, denominada en el presente documento como
MC-R1A. Por tanto, la presente invención se refiere
a moléculas de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos) que
codifican un ARNm que expresa una proteína MC-R1
humana nueva, estas moléculas de ADN incluyen, pero no se limitan en
forma alguna, moléculas de ADN que comprenden las secuencias de
nucleótidos descritas en el presente documento como SEC DE ID Nº: 1,
SEC DE ID Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9,
SEC DE ID Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 16, SEC DE ID Nº:
19, SEC DE ID Nº: 22, y SEC DE ID Nº: 25.
La presente invención se refiere también a las
moléculas de ácido nucleico aisladas que representan clones
genómicos humanos que comprenden al menos un único intrón dentro del
marco abierto de lectura que codifica variantes nuevas de la
proteína MC-R1B humana. Por tanto, la presente
invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas
(polinucleótidos) que codifican una molécula de ARN que se ayusta
para generar una molécula de ARNm que codifica una variante nueva
de la proteína MC-R1 humana, estás moléculas de ADN
incluyen, pero no se limitan en forma alguna, las moléculas de ADN
que comprenden las secuencias de nucleótidos descritas en el
presente documento como SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 18, SEC DE
ID Nº: 21, y SEC DE ID Nº: 24. En este extremo, la presente
invención se refiere también a la molécula de ARNm respectiva
generada a partir de cada una de las moléculas de ADN representadas
como SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 18, SEC DE ID Nº: 21, y SEC DE
ID
Nº: 24.
Nº: 24.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
presente invención comprenden una extensión 3' en el marco abierto
de lectura que codifica la extensión COOH- terminal de 65
aminoácidos en la MC-R1 conocida. Por tanto, la
presente invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico
aisladas, moléculas tanto de ADN como de ARN, que codifican una
variante ayustada de la MC-R1 conocida que codifica
esta extensión COOH- terminal de los 65 aminoácidos. La totalidad
de moléculas de ácido nucleico de la presente invención, entre las
que incluyen el ADN, ADNc, ARN y ARNm genómico, se denominarán en
el presente documento como "variantes ayustadas de
MC-R1", que identificarán una molécula de ácido
nucleico descrita que codifica una proteína con la actividad del
receptor de la melanocortina 1 en combinación con este exón 3'
adicional que codifica una extensión COOH- terminal de 65
aminoácidos. Estas moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen,
pero no se limitan en forma alguna a la SEC DE ID Nº: 1. SEC DE ID
Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE ID
Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC DE
ID Nº: 18; SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22,
SEC DE ID Nº: 24, y SEC DE ID Nº: 25.
La presente invención se refiere también a
fragmentos o mutantes biológicamente activos de las variantes
ayustadas de MC-R1 que codifican el ARNm que expresa
una MC-R1 humana nueva. Cualquiera de estos
fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de las variantes
ayustadas de MC-R1 descritas en el presente
documento codificarán una proteína o fragmento de proteína que
imite, al menos de manera sustancial, las propiedades farmacológicas
de la proteína MC-R1 de tipo salvaje, y comprende
al menos una parte de la extensión de aminoácidos COOH terminal
descrita como SEC DE ID Nº: 27. Cualquiera de dichos polinucleótidos
incluye, pero no se limita de manera necesaria a las sustituciones,
delecciones, adiciones, truncamientos amino terminales, y
truncamientos carboxi terminales de nucleótidos tales como estas
mutaciones que codifican el ARNm que expresa una proteína o
fragmento de proteína para uso diagnóstico, terapéutico o
profiláctico, y serían podrían resultar útiles para seleccionar los
agonistas y/o antagonistas de la función de
MC-R1B.
Un aspecto preferido de esta parte de la
presente invención se define como las SEC DE ID Nº: 1, SEC DE ID Nº:
3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE ID Nº:
11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC DE ID
Nº: 18, SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22, SEC DE
ID Nº: 24, y SEC DE ID Nº: 25, las moléculas de ácido nucleico que
comprende el marco abierto de lectura completo para las proteínas
MC-R1B de la presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
presente invención pueden incluir una molécula de ácido
desoxurribonucleico (ADN), tal como el ADN genómico y el ADN
complementario (ADNc) que pueden ser cadenas únicas (cadena
codificante o no codificante) o cadenas dobles, así como un ADN
sintético, tal como un polinucleótido sintetizado de cadena única.
La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede
incluir también una molécula de ácido ribonucleico (ARN).
La presente invención se refiere también a
vectores recombinantes y huéspedes recombinantes, tanto procariotas
como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico
sustancialmente purificado, descritas a lo largo de esta memoria,
que incluyen pero no se limitan a las moléculas de ácido nucleico
aisladas tales como las que se definen en la SEC DE ID Nº: 1, SEC DE
ID Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE
ID Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC
DE ID Nº: 18, SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22,
SEC DE ID Nº: 24, y SEC DE ID Nº: 25.
La presente invención se refiere también a las
fracciones subcelulares de membranas de las células huésped
recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como a las
células transformadas de manera estable y transitoria) que
contienen las proteínas codificadas mediante los ácidos nucleicos de
la presente invención. Estas fracciones subcelulares de membranas
comprenderán formas mutantes de tipo salvaje de la proteínas del
receptor de la melanocortina-1 humana que comprenden
la extensión COOH terminal en niveles sustancialmente por encima de
los niveles endógenos y serán útiles por lo tanto en diversos
ensayos descritos a lo largo de esta memoria.
La presente invención se refiere también a la
forma sustancialmente purificada de las variantes COOH terminal de
la proteína del receptor de melanocortina-1, que
comprenden las secuencias de aminoácidos según se describen en las
Figuras 5A-5F y tal como se definen en la SEC DE ID
Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID
Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE
ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y SEC DE ID Nº: 26. Estas proteínas
MC-R1 comprenden una extensión de 65 aminoácidos en
el término COOH cuando se comparan con las MC-R1
humanas conocidas y se denominan a lo largo de esta memoria como
proteínas MC-R1B o proteínas variantes ayustadas
MC-R1.
La presente invención se refiere también a los
fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de las proteínas
MC-R1B humanas descritas a lo largo de esta memoria,
que incluyen pero no se limitan de manera necesaria a las
sustituciones, delecciones, adiciones, truncamientos amino
terminales y truncamientos carboxi terminales de aminoácidos, de
forma que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de
proteínas para uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico para las
proteínas o fragmentos de proteína y serían útiles para seleccionar
los agonistas y/o antagonistas de la función de las
MC-R1B.
La presente invención se refiere también a las
moléculas aisladas de ácido nucleico que son construcciones de
fusión que expresan las proteínas de fusión útiles en los ensayos
para identificar los compuestos que modulan la actividad de las
MC-R1B en vertebrados de tipo salvaje. Un aspecto
preferido de esta parte de la invención incluye, pero no se limita
a, los constructos de la fusión de MC-R1B con la
glutatión S-transferasa (GST) que incluyen, pero no
se limitan a, tanto la región intracelular de la
MC-1RB humana como en un marco de fusión en el
término carboxilo del gen GST, o la región de enlace transmembrana y
extracelular del ligando de la MC-R1B fusionada con
el término amino de GST, o la región transmembrana y extracelular de
la MC-R1B fusionada con un gen de inmunoglobulina
mediante procedimientos conocidos por una persona normalmente
experta en la técnica. Se pueden expresar las proteínas de fusión
GST-MC-R1B recombinantes solubles en
diversos sistemas de expresión, que incluyen las células del
insecto (Invitrogen) Spodoptera frugiperda (Sf21) usando un
vector de expresión de baculovirus (pAcG2T, Pharmingen).
La presente invención se refiere, por tanto, a
los procedimientos para expresar las proteínas
MC-R1B humanas descritas en el presente documento y
los equivalentes biológicos, a los ensayos que emplean estos
productos de gen, a las células huésped recombinantes que comprenden
constructos de ADN que expresan estas proteínas del receptor, y a
los compuestos identificados mediante estos ensayos que actúan como
agonistas o antagonistas de la actividad de las
MC-R1B.
La presente invención se refiere también a
anticuerpos policlonales y monoclonales despertados en respuesta
tanto a la forma humana de la proteína MC-R1B, como
a un fragmento biológicamente activo de la misma.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una
forma nueva de la MC-R1B humana, o fragmentos de
la MC-R1B humana, proteínas mutantes o derivadas de
la MC-R1B humana tal como se define en las Figuras
5A-5F y en la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC
DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12,
SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº:
23, y la SEC DE ID Nº: 26. Cualquiera de dichos polinucleótidos
incluye, pero no se limita de manera necesaria, a sustituciones,
delecciones, truncamientos amino terminales, y truncamientos carboxi
terminales de nucleótidos tales como estas mutaciones que codifican
el ARNm que expresa una proteína o fragmento de proteína para uso
diagnóstico, terapéutico o profiláctico, y que podrían ser útiles
para seleccionar los agonistas y/o antagonistas para la función de
la MC-R1B en vertebrados.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar las proteínas o fragmentos de proteína de la
MC-R1B humana codificados por las moléculas de ácido
nucleico referidas en los párrafos anteriores.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar vectores recombinantes y células huésped
recombinantes que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifican estas proteínas MC-R1B humanas o
equivalentes biológicos de las mismas.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar una forma sustancialmente purificada de cualquiera de
las proteínas MC-R1B humanas, que incluyen, pero no
se limitan a las proteínas tal como se define en las Figuras
5A-5F y la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE
ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC
DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23;
y la SEC DE ID Nº: 26.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar fragmentos y/o mutantes biológicamente activos para las
proteínas MC-R1B humanas descritas en el presente
documento, que incluyen, pero no se limitan de manera necesaria a
las sustituciones, delecciones, adiciones, truncamientos amino
terminales y truncamientos carboxi terminales de aminoácidos de
forma que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de
proteínas para uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar ensayos basados en la MC-R1B para
seleccionar moduladores de esta proteína del receptor. Estos ensayos
son de manera preferible ensayos basados en células, en los que una
molécula de ADN que codifica MC-R1B se transfecta o
transforma en el interior de una célula huésped ensayada en el que
se deja crecer esta célula huésped recombinante durante un tiempo
suficiente para expresar la MC-R1B antes del uso
en los diversos ensayos descritos en el presente documento.
De manera alternativa, se puede ensayar un
ensayo que utiliza fracciones de membrana sustancialmente purificada
procedente de dicha célula huésped transfectada con un vector de
ADN que codifica la proteína MC-R1B, tal que el
enlace de los compuestos de ensayo en relación con un ligando
MC-R1B conocido. En este extremo, es un objetivo
adicional proporcionar preparaciones de membrana procedente de las
células huésped transfectadas o transformadas con una molécula de
ADN que codifica la MC-R1B para uso en ensayos para
seleccionar los moduladores de la actividad de la
MC-R1B.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar las construcciones basadas en marcos de fusión para la
MC-R1B, los procedimientos de expresión de estos
constructos de fusión, los equivalentes biológicos descritos en el
presente documento, los ensayos relacionados, las células
recombinantes que expresan estos constructos, y los compuestos
agonistas y/o antagonistas identificados mediante el uso del ácido
nucleico que codifica la proteína MC-R1B en
vertebrados así como la proteína expresada.
Tal como se usa en el presente documento,
"variantes ayustadas de MC-R1" y/o "variantes
ayustadas de MC-R1B", se refieren a la molécula
de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad en el
receptor de la melanocortina-1 que comprende un
segmento exón 3' que codifica una extensión COOH terminal de 65
aminoácidos identificada en la SEC DE ID Nº: 27. Dichas moléculas de
ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a la SEC DE ID Nº: 1,
SEC DE ID Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9,
SEC DE ID Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº:
16, SEC DE ID Nº: 18; SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID
Nº: 22, SEC DE ID Nº: 24, y la SEC DE ID Nº: 25.
Tal como se usan en el presente documento,
"MC-R1B" y/o "proteínas variantes ayustadas
de MC-R1" se refieren a las proteínas traducidas
a partir de las moléculas de ácido nucleico variantes ayustadas de
MC-R1 descritas en el presente documento. Estas
proteínas de la MC-R1B humana incluyen pero no se
limitan a la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC
DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14,
SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC DE ID
Nº: 26.
Tal como se usa en el presente documento,
"GPCR" se refiere a -el receptor acoplado de la proteína
G-.
Los términos "asilado" y "purificado"
se usan de manera intercambiable para denotar un ácido nucleico, una
proteína, y una fracción de membrana de tal manera que está
sustancialmente libre de otros componentes similares.
Cuando se usa en el presente documento el
término "mamífero huésped" se referirá a cualquier mamífero
incluyendo un ser humano.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de las secuencias de la MC-R1 humana.
MC-RIMO (Genbank con nº de acceso # X65634) y
MC-RICH (GenBank con nº de acceso # X67594) también
se denomina en el presente documento como genes
MC-R1A. En la SEC DE ID Nº: 21 se describe la
secuencia de nucleótidos de mc1-8 (que incluye un
intrón único). En el Ejemplo de la Sección 1 se describe el EST
representado.
La Figura 2 muestra el ayustado alternativo del
gen de la MC-R1 humana. Se conoce en la técnica el
ADNc de la MC-R1A. Las uniones intrón del gen de la
MC-R1 son como se muestran, por ejemplo en la SEC DE
ID Nº: 21 (mc1-8). El ADNc de la
MC-R1B muestra el exón adicional en el extremo 3'
del gen, que codifica una extensión de 65 aminoácidos, comenzando
con el residuo Ser en el amino ácido 318. La MC-R1A
contiene un residuo Trp-317 mientras que la
MC-R1B contiene un residuo Cys-317.
Los cajetines oscuros de MC-R1A y
MC-R1B representan porciones del ADNc que codifican
los dominios transmembrana, mientras que los cajetines oscuros del
gen de la MC-R1 representan los dos exones que
codifican la proteína(s) MCR1B.
La Figura 3 muestra la secuencia de ADN del clon
genómico, mc1-8 (SEC DE ID Nº: 21). Las letras
mayúsculas grandes representan regiones exón mientras que las letras
mayúsculas pequeñas representan los nucleótidos del intrón único
del gen de la MC-R1.
Las Figuras 4A-4B muestran el
ADN y la secuencia deducida de aminoácidos del clon genómico mc
1-8 en la forma A (SEC de ID N^{os}: 45 y 46) y la
forma B (SEC DE ID N^{os}: 21 y 23) ilustrando las formas
ayustadas MCR1-A y MC-R1B.
Las Figuras 5A-5F muestran el
alineamiento grupal de las secuencias de aminoácidos de diversos
clones humanos de MC-R1A y MCR1B.
La presente invención se refiere a las moléculas
de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos) que codifican las
proteínas variantes del receptor de la
melanocortina-1 humana denominadas como proteínas
MC-R1B. Las moléculas de ácido nucleico de la
presente invención están sustancialmente libres de otros ácidos
nucleicos. Para la mayor parte de los objetivos de clonación, el ADN
es un ácido nucleico preferido.
La presente invención se refiere a una serie de
moléculas aisladas de ácido nucleico (polinucleótidos) que
codifican el ARNm que expresa variantes ayustadas nuevas de la
MC-R1, denominadas como proteínas
MC-R1B. Estas moléculas de ADN comprenden las
secuencias de nucleótidos descritas a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1. MC-R1ESTCll
\vskip1.000000\baselineskip
2. MC-R1ESTC11.6
\vskip1.000000\baselineskip
3. MC-R1ESTc12
\newpage
4. MC-R1ESTc2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. MC R1ESTc4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6. MC-R1ESTc5
\newpage
7. MC-R1ESTc6
\vskip1.000000\baselineskip
8. mc1-3 (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
9. mc1-3 (marco abierto de
lectura)
\newpage
10. mc1-6 (genómico)
\newpage
11. mc1-6 (marco abierto de
lectura)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12. mc1-8 (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
13. mc1-8 (marco abierto de
lectura)
\newpage
14. mc1-9 (genómico)
\newpage
15. mc1-8 (marco abierto de
lectura)
Las moléculas de ADN aisladas ejemplificadas
anteriormente codifican polimorfismos de la MC-R1B
humana, los clones comprenden un marco abierto de lectura que
codifica 65 aminoácidos adicionales (desde el residuo 318 al 382;
SEC DE ID Nº: 27), así como una sustitución de un residuo
Cys-317 para el residuo Trp-317 de
la proteína MC-R1A. De manera más específica, las
SEC DE ID N^{os}: 1, 3, 5, 7, 9, 11, y 13 representan los clones
de ADNc que contienen 1149 nucleótidos, con un marco abierto de
lectura del nucleótido 1 al nucleótido 1146, con un codón de
terminación "TAG" entre los nucleótidos
1147-1149. Estos marcos de lectura abiertos
codifican una proteína MC-R1B de 382 aminoácidos de
longitud, tal como se muestra en las Figuras 5A-5F y
como se muestra en las SEC DE ID N^{os}: 2, 4, 6, 8, 10, 12, y 14,
de manera respectiva.
La presente invención se refiere también a los
clones genómicos de MC-R1B, a los marcos de lectura
abiertos predichos para estos clones y a la proteína
MC-R1B traducida a partir de la molécula de ARNm
respectiva de cada clon genómico. Esta memoria ejemplifica, pero no
se limita de manera necesaria, a las variaciones polimórficas de
MC-R1 tal como se describen en mc1-3
(SEC DE ID Nº: 15), mc1-6 (SEC DE ID Nº: 18),
mc1-6 (SEC DE ID Nº: 21), mc1-9 (SEC
DE ID Nº: 24). Estas moléculas de ADN representan los clones
genómicos de la MC-R1B humana que contienen 1530
nucleótidos, con un intrón entre los nucleótidos
951-1331 (véase el Ejemplo de la Sección 1). El
marco abierto de lectura respectivo de cada uno de estos clones
genómicos se describe en la SEC DE ID Nº: 16
(mc1-3), SEC DE ID Nº: 19 (mc1-6),
SEC DE ID Nº: 22 (mc1-6), y SEC DE ID Nº: 25
(mc1-9). Cada uno de estos marcos de lectura
abiertos codifica una supuesta proteína que comprende 382
aminoácidos tal como se describe en la SEC DE ID Nº: 17
(pro-mc1-3), SEC DE ID Nº: 20 (pro-mc1-6), SEC DE ID Nº: 23 (pro-mc1-6), y la SEC DE ID Nº: 25 (pro-mc1-9).
(pro-mc1-3), SEC DE ID Nº: 20 (pro-mc1-6), SEC DE ID Nº: 23 (pro-mc1-6), y la SEC DE ID Nº: 25 (pro-mc1-9).
La presente invención se refiere también a los
fragmentos o mutantes biológicamente activos de las variantes
ayustadas que codifican el ARNm que expresa una
MC-R1B humana nueva, Cualquiera de dichos fragmentos
y/o mutantes biológicamente activos de las variantes ayustadas de
MC-R1 descritas en el presente documento codificará
una proteína o fragmento de proteína que imita sustancialmente al
menos las propiedades farmacológicas de una proteína
MC-R1 de tipo salvaje y comprende al menos una
porción de la extensión COOH terminal de aminoácidos descrita como
SEC DE ID Nº: 27. Cualquiera de dichos polinucleótidos incluye pero
no se limita de manera necesaria a las sustituciones, delecciones,
adiciones, truncamientos amino terminales y truncamientos carboxi
terminales de nucleótidos tales como estas mutaciones que codifican
el ARNm que expresa una proteína o fragmento de proteína de uso
diagnóstico, terapéutico o profiláctico y que podría ser útil para
seleccionar los agonistas y/o antagonistas para la función de la
MC-R1.
Un aspecto preferido de esta parte de la
presente invención se muestra como la SEC DE ID Nº: 1, SEC DE ID Nº:
3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE ID Nº:
11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC DE ID
Nº: 18, SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22, SEC DE
ID Nº: 24, y la SEC DE ID Nº: 25, moléculas de ácido nucleico humano
que comprende el marco abierto de lectura completo para las
proteínas MC-R1 de la presente invención.
Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la
presente invención pueden incluir una molécula de ácido
desoxirribonucleico ADN, tal como ADN genómico y ADN complementario
(ADNc) que puede ser única (cadena codificada o no codificada) o
cadena doble, así como un ADN sintético, tal como un polinucleótido
de cadena única tal como se sintetiza. La molécula aislada de ácido
nucleico de la presente invención puede incluir también una molécula
de ácido ribonucleico (ARN) de manera especial una molécula de ARN
generada a partir de un clon genómico de una variante ayustada de
MC-R1 humana tal como se describe en
mc1-3 (SEC DE ID Nº: 15), mc1-6 (SEC
DE ID Nº: 18), mc1-6 (SEC DE ID Nº: 21),
mc1-9 (SEC DE ID Nº: 24) y sus respectivos marcos de
lectura abiertos, la SEC DE ID Nº: 16 (mc1-3), SEC
DE ID Nº: 19 (mc1-6), SEC DE ID Nº: 22
(mc1-6, y la SEC DE ID Nº: 25
(mc1-9).
Se sabe que existe una cantidad sustancial de
redundancia en los diversos codones que codifican los aminoácidos
específicos. Por tanto, esta invención se dirige también a aquellas
secuencias de ADN que codifican el ARN que comprende los codones
alternativos que codifican la traducción eventual de los aminoácidos
idénticos, tal como se muestra a continuación:
A = Ala = Alanina: codones GCA, GCC, GCG,
GCU
C = Cys = Cisteína: codones UGC, UGU
D = Asp = Ácido aspártico: codones GAC, GAU
E = Glu = Ácido glutámico: codones GAA, GAG
F = Phe = Fenilalanina: codones UUC, UUU
G = Glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU
H = His = Histidina: codones CAC, CAU
I = Ile = Isoleucina: codones AUA, AUC, AUU
K = Lys = Lisina: codones AAA, AAG
L = Leu = Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC,
CUG, CUU
M = Met = Metionina: codón AUG
N = Asp = Asparagina: codones AAC, AAU
P = Pro = Prolina: codones CCA, CCC, CCG,
CCU
Q = Gln = Glutamina: codones CAA, CAG
R = Arg = Arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC,
CGG, CGU
S = Ser = Serina: codones AGC, AGU, UCA, UCC,
UCG, UCU
T = Thr = Treonina: codones ACA, ACC, ACG,
ACU
V = Val = Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU
W = Trp = Triptófano: codón UGG
Y = Tyr = Tirosina: codones UAC, UAU.
La presente invención describe, por tanto, la
redundancia del codón que puede dar como resultado moléculas de ADN
diferentes que expresan una proteína idéntica. Para los objetivos de
esta memoria, una secuencia que soporta uno o más codones
sustituidos se definirá como una variación degenerada. Incluidas
también dentro del alcance de esta invención están las mutaciones en
la cualquiera de las secuencias de ADN o de la proteína traducida
que no altera de manera sustancial las propiedades físicas últimas
de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por
leucina, de arginina por lisina, o de asparagina por glutamina puede
no producir un cambio en la funcionalidad del polipéptido.
Se sabe que se pueden alterar las secuencias de
ADN que codifican un péptido de forma que codifiquen un péptido que
tenga propiedades que sean diferentes de las del péptido que se
produce de manera natural. Entre los ejemplos de las propiedades
alteradas incluyen pero no se limitan a los cambio en la afinidad de
un enzima por un sustrato o un receptor para un ligando.
Se puede usar cualquiera de los diferentes
procedimientos para clonar la variante ayustada de la
MC-R1 humana, entre los que se incluyen pero no se
limitan al procedimiento esbozado en la sección de Ejemplos. Estos
procedimientos incluyen, pero no se limitan a, (1) una técnica de
clonación RACE PCR (Forhman, y col., 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 8998-9002). Se pueden
llevar a cabo RACE 5' y/o 3' para generar una secuencia de ADNc de
longitud completa. Esta estrategia implica usar cebadores de
oligonucleótidos específicos del gen para la amplificación PCR del
ADNc de la MC-R1B humana. Estos cebadores
específicos del gen se designan mediante la identificación de una
secuencia expresada tag (EST) de la secuencia de nucleótidos que se
ha identificado investigando cualquier cantidad de ácido nucleico y
proteína públicamente disponible en las bases de datos; (2) la
expresión funcional directa del ADNc de la MC-R1b
que sigue a la construcción de una MC-R1B que
contiene la librería de ADNc en un sistema de vector de expresión
apropiado; (3) la selección de una MC-R1B humana
que contiene la librería de ADNc construida en un vector lanzadera
de bacteriófago o plásmido con una sonda de oligonucleótido marcado
designada a partir de la secuencia de aminoácidos dela proteína
MC-R1B humana; (4) seleccionar una
MC-R1B humana que contiene la librería de ADNc
construida en un vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con un
ADN parcial que codifica la proteína MC-R1B humana.
Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación PCR
específica de los fragmentos de ADN de la MC-R1B
humana mediante el diseño de cebadores de oligonucleótidos
degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos conocida por
otras quinasas que se relacionan con la proteína
MC-R1B humana; (5) seleccionar una librería de ADNc
que contiene la MC-R1B humana construida en un
vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con un ADNc parcial u
oligonucleótido con homología para una proteína
MC-R1B de mamífero. Esta estrategia puede implicar
también el uso de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen
para la amplificación PCR del ADNc de la MC-R1B
humana identificada como un EST tal como se ha descrito
anteriormente; o (6) diseñando los oligonucleótidos específicos del
gen 5' y 3' usando la SEC DE ID Nº: 1 como un indicador de tal
manera que se pueda generar el ADNc de longitud completa mediante
técnicas RACE conocidas, o se puede generar una porción de la
región de codificación mediante las mismas técnicas RACE conocidas
para generar y aislar una porción de la región de codificación para
usar como una sonda para seleccionar uno de los numerosos tipos de
ADNc y/o librerías genómicas con
el fin de aislar la versión de longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica la MC-R1B humana.
el fin de aislar la versión de longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica la MC-R1B humana.
Es fácilmente evidente para aquellas personas
expertas en la técnica que pueden ser útiles otros tipos de
librerías, así como las librerías construidas a partir de otros
tipos de células o tipos de especies, para aislar una
MC-R1B humana que codifique el ADN, o una
MC-R1B humana homóloga. Otros tipos de librería
incluyen, pero no se limitan a, las librerías de ADNc derivadas de
otras células humanas.
Es también fácilmente evidente para aquellas
personas expertas en la técnica que se pueden preparar librerías
adecuadas de ADNc a partir de células o líneas de células que tienen
actividad MC-R1B. La selección de células o líneas
de células para uso en la preparación de una librería de ADNc para
aislar un ADNc que codifica la MC-R1B se puede
hacer midiendo en primer lugar la actividad de la
MC-R1B asociada a la célula usando cualquier ensayo
conocido disponible para dicho propósito.
Se puede llevar a cabo la preparación de las
librerías de ADNc mediante técnicas convencionales bien conocidas
en la técnica. Se pueden encontrar técnicas bien conocidas de
construcción de librerías de ADNc por ejemplo, en Sambrook y col.,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Se pueden
obtener también librerías de ADN complementario a partir de
numerosas fuentes comerciales, entre las que se incluyen pero no se
limitan a Clontech Laboratories, Inc. y Stratagene.
Es también fácilmente evidente para aquellas
personas expertas en la técnica que se puede aislar también el ADN
que codifica la MC-R1B humana a partir de una
librería adecuada de ADN genómico. Se puede llevar a cabo la
construcción de librerías de ADN genómico mediante técnicas
convencionales bien conocidas en la técnica. Se pueden encontrar las
técnicas de construcción de librería s de ADN genómico bien conocido
en Sambrook, y col., más arriba.
Con el fin de clonar el gen de la
MC-R1B humana mediante uno de los procedimientos
preferidos, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos o la
secuencia de ADN de la MC-R1B humana o de una
proteína homóloga. Para llevar a cabo esto, se puede purificar la
proteína MC-R1B o una proteína homóloga y
determinarse la secuencia parcial de aminoácidos mediante
secuenciadores automatizados. No es necesario determinar la
secuencia completa de aminoácidos, pero se puede determinar la
secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos por la
amplificación PCR de un fragmento parcial del ADN de la
MC-R1B humana. Una vez se han identificado las
secuencias adecuadas de aminoácidos, se sintetizan las secuencias
de ADN capaces de codificarlos. Debido a que el código genético
está degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un
aminoácido particular, y por tanto, se puede codificar la secuencia
de aminoácidos para cualquier lote de oligonucleótidos de ADN
similares. Únicamente un miembro del conjunto será idéntico a la
secuencia de la MC-R1B humana pero otros miembros
del conjunto serán capaces de hibridar el ADN de la
MC-R1B humana incluso en presencia de los
oligonucleótidos de ADN que no se emparejan. Los oligonucleótidos de
ADN no emparejados pueden hibridarse aún de manera suficiente con
el ADN de la MC-R1B humana para permitir la
identificación y el aislamiento de la MC-R1B que
codifica el ADN. De manera alternativa, se puede identificar la
secuencia de nucleótidos de una región de una secuencia expresada
investigando en una o más bases de datos disponibles. Se pueden usar
cebadores específicos del gen para llevar a cabo la amplificación
PCR de un ADNc de interés a partir de una librería de ADNc o de una
población de ADNc. Se puede obtener una secuencia de nucleótidos
apropiada APRA uso en un procedimiento basado en PCR a partir de
cualquiera de las variantes ayustadas de la MC-R1B
identificada descritas en el presente documento, bien con el
objetivo de aislar los productos RACE 5' y 3' solapados para la
generación de una secuencia de longitud completa que codifique la
MC-R1B humana, o para aislar una porción de la
secuencia de nucleótidos que codifica la MC-R1B
humana para uso como sonda para seleccionar una o más librerías
basadas en el ADNc o genómico para aislar una secuencia de longitud
completa que codifica la MC-R1B humana o las
proteínas humanas similares a la MC-R1B.
Están incluidas en la presente invención las
Secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de nucleótidos
de las variantes ayustadas de la MC-R1B descritas
(es decir, la SEC DE ID Nº: 1, SEC DE ID Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC
DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE ID Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13,
SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC DE ID Nº: 18; SEC DE ID Nº:
19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22, SEC DE ID Nº: 24, y la SEC
DE ID Nº: 25) bajo condiciones restrictivas. Por medio de ejemplo,
y sin limitación, un procedimiento que usa condiciones de
restricción altas es como sigue: La prehibridación de los filtros
que contienen el ADN se lleva a cabo durante 2 horas durante la
noche a 65ºC en un tampón compuesto por solución 6X SSC 5X de
Denhardt, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 12 a 48 horas a
65ºC en una mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de
ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X
10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. El lavado de los filtros
se lleva a cabo a 37ºC durante 1 h en una solución que contiene 2X
SSC, y SDS al 0,1%. Se sigue esto por un lavado en 0,1 X SSC, y SDS
al 0,1% a 50ºC durante 45 min. antes de la autoradiografía. Otros
procedimientos usando condiciones de restricción elevada podrían
incluir llevar a cabo una etapa de hibridación en 5XSSX, solución 5X
de Denhardt, y formamida al 50% a 42ºC durante 12 a 48 horas o
llevar a cabo una etapa de lavado en = 2X SSPE, y SDS al 0,2% a 65ºC
durante 30 a 60 minutos.
Son bien conocidos en la técnica los reactivos
mencionados en los procedimientos anteriores para llevar a cabo la
hibridación con restricción alta. Se pueden encontrar los detalles
de la composición de estos reactivos en, por ejemplo, Sambrook y
col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. De manera
adicional a lo anterior, son bien conocidas en la técnica otras
condiciones de restricción alta que se pueden usar.
La presente invención se refiere también a unas
formas substancialmente purificadas de la proteína
MC-R1B humana que comprende las secuencias de
aminoácidos descritas en las Figuras 5A-5F y que se
muestran en la SEC DE ID Nº:2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6,
SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº:
14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC
DE ID Nº: 26. Estas proteínas MC-R1 comprende una
extensión de 65 aminoácidos en el término COOH, en comparación con
la MC-R1 humana conocida y se denominan a lo largo
de esta memoria como proteínas MC-R1B. Se relacionan
a continuación las secuencias de aminoácidos ejemplificadas:
1. MC- R1ESTc11
2. MC- R1ESTC11.6
3. MC- R1ESTc12
4. MC- R1ESTc2
5. MC- R1ESTc4
6. MC- R1ESTc5
\newpage
7. MC- R1ESTc6
8. pro mc1-3
9. pro mc1-6
10. pro mc1-8
\newpage
11. pro
mc-1-9
en las que M = Met (metionina), F =
Phe (fenilalanina), L = Leu (leucina), I = Ile (isoleucina), V = Val
(valina), S = Ser (serina), P = Pro (prolina), T = Thr (treonina), A
= Ala (alanina), Y = Tyr (tirosina), H = His (histidina), Q = Gln
(glutamina), N = Asn (asparagina), K = Lys (lisina), D = Asp (ácido
aspártico), E = Glu (ácido glutámico); C = Cys (cisteína), W = Trp
(triptófano), R = Arg (arginina), y G = Gly
(glicina).
Estas proteínas MC-R1B
comprenden una extensión de 65 aminoácidos en el término COOH cuando
se las compara con la MC-R1 conocida y se denominan
a lo largo de esta memoria como proteínas MC-R1B. De
manera más específica, el residuo aminoácido 317 de las proteínas
MC-R1B es Cys mientras que el residuo aminoácido
COOH terminal 317 de las proteínas MC-R1A conocidas
es Trp. A partir del residuo aminoácido 318 hasta el aminoácido COOH
terminal en 382 de las proteínas MC-R1B descritas
en el presente documento, la secuencia de aminoácidos es tal como
se muestra en la SEC DE ID Nº: 27, tal como se muestra a
continuación:
SQD RALVSWDVKS LGGSVCQELL PQQPQEKGLC DQKASSTALQ,
RLLQKEVKSL PQAKGPLQE PP
(SEC DE ID Nº: 27)
(SEC DE ID Nº: 27)
La presente invención se refiere también a los
fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de estas proteínas
MC-R1B humanas que comprenden la secuencia de
aminoácidos que se muestra como la SEC DE ID Nº: 2, que incluyen,
pero no se limitan de manera necesaria a las sustituciones,
delecciones, adiciones, truncamientos amino terminales y
truncamientos carboxi terminales de forma que estas mutaciones
proporcionen las proteínas o fragmentos de proteína para uso
diagnóstico, terapéutico o profiláctico y podrían ser útiles para
seleccionar los agonistas y/o antagonistas para la función de la
MC-R1B.
Las proteínas MC-R1B humanas
representan diversos aspectos preferidos de la presente invención
según se describe en las Figuras 5A-5F y se muestran
como la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID
Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE
ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC DE ID Nº: 26
todas la cuales comprenden la extensión de 65 aminoácidos COOH
terminales tal como se muestra en la SEC DE ID Nº: 27.
La presente invención se refiere también a los
polipéptidos de la MC-R1B modificados que tienen
delecciones, adiciones, o sustituciones de aminoácidos pero que
retienen aún sustancialmente la misma actividad biológica que la
MC-R1B. Se acepta de manera general que las
sustituciones de aminoácidos únicos no alteran de manera usual la
actividad biológica de una proteína (véase, por ejemplo,
Molecular Biology of the Gene, Watson y col., 1987, cuarta
Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., página 226; y
Cunningham & Wells, 1989, Science
244:1081-1085). De acuerdo con esto, la presente
invención incluye moléculas aisladas de ácido nucleico y proteínas
MC-R1B expresadas en las que se genera la
sustitución de un aminoácido y que esta proteína retiene de manera
sustancial la misma actividad biológica tal como la
MC-R1B de tipo salvaje. La presente invención
incluye también las moléculas aisladas de ácido nucleico y las
proteínas MC-R1B expresadas en las que se generan
sustituciones de dos o más aminoácidos en las que esta proteína
retiene de manera sustancial la misma actividad biológica tal como
la MC-R1B de tipo salvaje. De manera particular, la
presente invención incluye las formas de realización en las que las
sustituciones anteriormente descritas son sustituciones
conservativas. De manera particular, la presente invención incluye
las formas de realización
en las que no se producen las sustituciones anteriormente descritas en la región de enlace del ligando de la MC-R1B.
en las que no se producen las sustituciones anteriormente descritas en la región de enlace del ligando de la MC-R1B.
Tras la expresión de la MC-R1B
en una célula huésped, se puede recuperar la proteína
MC-R1B para proporcionar la proteína
MC-R1B en forma activa. Están disponibles y son
adecuados para diversos procedimientos de purificación de la
proteína MC-R1B. Se puede purificar la proteína
MC-R1B recombinante a partir de lisados y extractos
de células mediante diversas combinaciones de, o la aplicación
individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de
adsorción de hidroxilapatita y cromatografía de interacción
hidrófoba. De manera adicional, se puede separar la proteína
MC-R1B recombinante a partir de otras proteínas
celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad fabricada
con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la
proteína MC-R1B de longitud completa, o los
fragmentos de polipéptido de la proteína MC-R1B.
La presente invención se refiere también a las
moléculas de ácido nucleico aisladas que son construcciones de
fusión que expresan proteínas de fusión útiles en los ensayos para
identificar los compuestos que modulan la actividad de la
MC-R1B de tipo salvaje en vertebrados. Un aspecto de
esta parte de la invención incluye, pero no se limita a los
constructos de fusión de la MC-R1B con la glutatión
S-transferasa (GST) que incluyen, pero no se
limitan a, la región intracelular de la MC-R1B tal
como una fusión en marco en el término carboxilo del gen GST o la
región de enlace del ligando transmembrana y extracelular de la
MC-R1B fusionada con un GST o el gen de la
inmunoglobulina mediante procedimientos conocidos por una persona
normalmente experta en la técnica. Se pueden expresar las proteínas
de fusión de la MC-R1B con e GST recombinante en
diversos sistemas de expresión, que incluyen las células del
insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) Invitrogen) usando un
vector de expresión del baculovirus (pAcG2T, Pharmingen).
La presente invención se refiere también a las
fracciones de membrana subcelular de las células huésped
recombinantes (procariotas y eucariotas así como las células
transformadas de manera estable y transitoria) que contienen los
ácidos nucleicos de la presente invención. Estas fracciones de
membrana subcelular comprenderán formas mutantes o de tipo salvaje
de las proteínas MC-R1B en niveles sustancialmente
por encima de los niveles endógenos y por tanto serán útiles en
diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria.
La presente invención se refiere también a los
vectores recombinantes y huéspedes recombinantes, tanto procariotas
como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico
sustancialmente purificadas descritas a lo largo de esta memoria.
Se pueden enlazar, de manera completa o en parte, las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención que codifican las variantes
ayustadas de la MC-R1B, se pueden enlazar con otras
moléculas de ADN, es decir moléculas de ADN en las que no se enlaza
de manera natural la MC-R1B, para formar
"moléculas de ADN recombinante" que contienen el receptor. Se
pueden insertar las nuevas secuencias de ADN de la presente
invención en vectores que comprende ácidos nucleicos que codifican
una MC-R1B o un equivalente funcional. Estos
vectores pueden estar comprendidos por ADN o ARN. Para la mayor
parte de los objetivos de clonación se prefieren los vectores de
ADN. Los vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados,
bacteriófagos y cósmidos, cromosomas artificiales de levadura y
otras formas de ADN integrado o episomial que pueden codificar una
MC-R1B. Está completamente comprendido dentro del
ámbito de la persona experta determinar un vector apropiado para
transferir un gen particular u otro uso.
A este fin, la presente invención incluye
también los vectores que contienen un gen de la
MC-R1B, las células huésped que contienen los
vectores, y los procedimientos para fabricar la proteína
MC-R1B sustancialmente pura, que comprenden las
etapas de introducir el gen de la MC-R1B en una
célula huésped, y cultivar la célula huésped bajo las condiciones
apropiadas de tal manera que se produzca la MC-R1B.
Por tanto, la presente invención se refiere también a lo
procedimientos de expresión de la proteína MC-R1B y
los equivalentes biológicos descritos en el presente documento, los
ensayos empleando estos productos de gen, las células huésped
recombinantes que comprenden los constructos de ADN que expresan
estas proteínas receptoras, y los compuestos identificados a través
de estos ensayos que actúan como agonistas o antagonistas de la
actividad de la MC-R1B.
Se puede expresar de manera conveniente el ADNc
de la MC-R1B clonada obtenido mediante los
procedimientos descritos anteriormente mediante clonación molecular
en un vector de expresión (tal como pcADN3.neo, pCADN3.1, pcCR2.1,
pBlueBacHis2 o pLITMUS28) que contiene un promotor adecuado y otros
elementos apropiados reguladores de la transcripción, y se
transfiere en células huésped procariotas o eucariotas para producir
la MC-R1B recombinante. Se pueden encontrar
descritas las técnicas para dichas manipulaciones en Sambrook, y
col., más arriba, se describen con mayor amplitud en la sección del
Ejemplo y son bien conocidas y fácilmente disponibles para la
persona normalmente experta en la técnica.
Se puede usar una variedad de vectores de
expresión en mamíferos para expresar la MC-R1B
recombinante en células de mamíferos. Los vectores de expresión se
definen en el presente documento como las secuencias de ADN que se
necesitan para la transcripción del ADN clonado y la traducción de
su ARNm en un huésped apropiado. Se pueden usar dichos vectores
para expresar el ADN eucariota en una variedad de huéspedes tales
como bacterias, algas verde azuladas, células de plantas, células de
insectos y células animales. Los vectores diseñados de manera
específica permiten el intercambio del ADN entre huéspedes tales
como bacterias-levaduras o
bacterias-células animales. Un vector de expresión
construido de manera apropiada deberá contener: un origen de la
replicación para la replicación autónoma en las células huésped,
marcadores seleccionables, un número limitado de emplazamientos
útiles para en enzima de restricción, un potencial para un número de
copias alto, y promotores activos. Un promotor se define como una
secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa para enlazar con en
ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que
produce ARNm para iniciarse con una frecuencia elevada. Entre los
vectores de expresión se pueden incluir, pero no se limitan a,
vectores de la clonación, vectores modificados de la clonación,
plásmidos o virus diseñados de manera específica. Los vectores de
expresión en mamíferos comercialmente disponibles que pueden ser
adecuados para la expresión de la MC-R1B
recombinante, incluyen, pero no se limitan a, pcADN3.neo
(Invitrogen), pcADN3.1 (Invitrogen), pCI-neo
(Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England
Biolabs), pcADNI, pcADNlamp (Invitrogen), pcADN3 (Invitrogen),
pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene),
EBO-pSV2-neo (ATCC 37593),
pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC
37224), pRSV gpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35
(ATCC 37565).
También se pueden usar una variedad de vectores
de expresión bacterianos para expresar la MC-R1B
recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión
bacteriana comercialmente disponibles que pueden ser adecuados para
la expresión de la MC-R1B recombinante incluyen,
pero no se limitan a pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), lambda
gt11 (Invitrogen), y pKK223-3 (Pharmacia).
De manera adicional, se puede usar una variedad
de vectores de expresión de células fúngicas. Los vectores de
expresión de células fúngicas comercialmente disponibles que pueden
ser adecuados para la expresión de la MC-R1B
recombinante incluyen pero no se limitan a pYES2 (Invitrogen) y el
vector de expresión de Pichia (Invitrogen).
También se puede usar una variedad de vectores
de expresión de células de insectos para expresar el receptor
recombinante en las células de insectos. Los vectores de expresión
de células de insectos comercialmente disponibles que pueden ser
adecuados para la expresión recombinante de la
MC-R1B incluyen, pero no se limitan a pBlueBacIII y
pBluebacHis2 (Invitrogen), y pAcG2T (Pharmingen).
Se puede llevar también a cabo la expresión del
ADN de la MC-R1B usando ARNm sintético producido
in vitro. Se puede traducir de manera eficiente el ARNm
sintético en diversos sistemas libres de células, que incluyen,
pero no se limitan a los extractos de germen de trigo y los
extractos de reticulocitos, así como traducir de manera eficiente en
los sistemas basados en células, que incluyen, pero no se limitan a
la microinyección en oocitos de rana, siendo preferida la
microinyección en oocitos de rana.
Para determinar la(s) secuencia(s)
de ADNc de la MC-R1B que da(n) como
resultado niveles óptimos de MC-R1B, entre las
moléculas de ADNc se incluyen, pero no se limitan a las siguientes
que se pueden construir: un fragmento de ADNc que contiene el marco
abierto de lectura de longitud completa de la
MC-R1B así como diversos constructos que contienen
porciones del ADNc que codifican únicamente regiones específicas de
la proteína o regiones reordenadas de la proteína. Se pueden
diseñar todos los constructos para contener todo, nada o las
porciones de la región sin traducir 5' y/o 3' del ADNc de la
MC-R1B. Se pueden determinar los niveles de
expresión y la actividad de la MC-R1B tras la
introducción, única y en combinación de estos constructos en las
células huéspedes apropiadas. Tras la determinación del cassette de
ADNc de la MC-R1B que da lugar a la expresión óptima
en ensayos transitorios, este constructo de ADNc de la
MC-R1B se transfiere a una variedad de vectores de
expresión (incluyendo los virus recombinantes), que incluyen, pero
no se limitan a aquellos para las células de mamíferos, células de
plantas, células de insectos, oocitos, bacterias y células de
levaduras.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
incluye las células huésped que han sido diseñadas para contener
y/o expresar las secuencias de ADN que codifican la
MC-R1B. Se pueden combinar dichas células huésped
recombinantes bajo condiciones adecuadas para producir
MC-R1B o una forma biológicamente equivalente. Las
células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas,
que incluyen, pero no se limitan a, bacterias tales como E.
coli, células fúngicas tales como levaduras, células de
mamíferos que incluyen, pero no se limitan a, líneas de células de
origen humano, bovino, porcino, monos, y roedores, y células de
insectos que incluyen pero no se limitan a líneas de células
derivadas de Drosophila y gusanos de seda. Se puede usar, por
tanto, un vector de expresión que contenga ADN que codifique una
proteína similar a la MC-R1B para la expresión de la
MC-R1B en una célula huésped recombinante. Las
células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas,
que incluyen pero no se limitan a bacterias tales como E.
coli, células fúngicas tales como levaduras, células de
mamíferos que incluyen pero no se limitan a las líneas celulares de
origen humano, bovino, porcino, monos y roedores, y las células de
insectos que incluyen pero no se limitan a las líneas de células
derivadas de Drosophila- y gusanos de la seda. Por ejemplo, un
sistema de expresión en insectos utiliza células del insecto
Spodoptera frugiperda (Sf21) (Invitrogen) en tánden con un
vector de expresión del baculovirus (pAcG2T, Pharmingen). También,
las especies de mamíferos que pueden ser adecuadas y que están
comercialmente disponibles, incluyen pero no se limitan a, células
L L-M(TK^{-}) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC
HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86),
CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL
1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1
(ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa
(ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26),
MRC-5 (ATCC CCL 171), y CPAE (ATCC CCL 209). Se
puede introducir el vector de expresión en las células huésped
mediante una cualquiera de las numerosas técnicas que incluyen pero
no se limitan a la transformación, transfección, fusión de los
protoplastos, y electroporación. Las células que contienen el vector
de expresión se analizan de manera individual para determinar si
producen la proteína MC-R1B. Puede llevarse a cabo
la identificación de las células que expresan la
MC-R1B mediante diversos medios, que incluyen pero
no se limitan a la reactividad inmunológica con anticuerpos
anti-MC-R1B,
el ligando enlazante marcado y la presencia de actividad de la MC-R1B asociada con células huésped.
el ligando enlazante marcado y la presencia de actividad de la MC-R1B asociada con células huésped.
Se pueden llevar a cabo los ensayos descritos en
el presente documento así como los esquemas de purificación de las
proteínas que se han transfectado o transformado de manera estable o
transitoria con un vector de expresión que dirige la expresión de
la MC-R1B. Se puede introducir el vector de
expresión en las células huésped mediante una cualquiera de las
numerosas técnicas que incluyen pero no se limitan a la
transformación, transfección, fusión de protoplastos, y
electroporación. Se entiende que la transformación abarca un cambio
genético en la célula diana resultante de una incorporación de ADN.
Se entiende que la transfección incluye cualquier procedimiento
conocido en la técnica para introducir la MC-R1b en
las células de ensayo. La transfección incluye, por ejemplo, la
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio, la
lipofección, la infección con un constructo retrovírico que contiene
la MC-R1B, y la electroporación. Las células que
contienen el vector de expresión se analizan de manera individual
para determinar si producen la proteína MC-R1B
humana. Puede llevarse a cabo la identificación de las células que
expresan la MC-R1B humana mediante diversos medios,
que incluyen pero no se limitan a la reactividad inmunológica con
anticuerpos de la MC-R1B antihumanos, ligando
enlazante marcado y la presencia de actividad de la
MC-R1B humana asociada con células.
La especificidad del enlace de los compuestos
que muestran afinidad por la MC-R1B se demuestra
midiendo la afinidad de los compuestos por las células recombinantes
que expresan el receptor clonado o por las membranas de estas
células la expresión del receptor clonado y la selección de los
compuestos que enlazan la MC-.R1B o que inhiben el enlace de un
ligando radiomarcado conocido de la MC-R1B con estas
células, o membranas preparadas a partir de estas células,
proporciona un procedimiento efectivo para la selección rápida de
los compuestos con elevada afinidad por la MC-R1B.
Dichos ligandos no necesitan de manera necesaria radiomarcarse pero
también pueden ser compuestos no isotópicos que se pueden usar para
desplazar el enlace de los compuestos radiomarcados o que se pueden
usar como activadores en ensayos funcionales. Los compuestos
identificados mediante el procedimiento anterior es posible que
sean agonistas o antagonistas de la MC-R1B y pueden
ser péptidos, proteínas y moléculas orgánicas no proteínicas.
Los receptores de la melanocortina pertenecen a
la subfamilia de la odopsina del GPRC. Sin embargo, se comparten
diversas características de la MC-R1B con el resto
de los receptores y están ausentes en la mayor parte del resto de
GPRC, entre los que se incluyen el motivo EN en TM1, la ausencia de
Cys en el bucle entre TM2 y TM3 o entre TM4 y TM5, el motivo
MxxxxxxxY en TM5, y el motivo DPxxY en TM7. Debido a que todos los
receptores de la melanocortina carecen de residuos Cys en los
bucles extracelulares que están presentes en otros miembros de la
subfamilia de la odopsina, el enlace disulfuro interhélice (por
ejemplo, entre los residuos Cys próximos a la parte superior de TM3
y TM5) pueden jugar la misma función tal como el enlace disulfuro
interbucle en el resto de GPRC. De acuerdo con esto, la presente
invención se dirige a los procedimientos para seleccionar los
compuestos que modulan la expresión del ADN o el ARN que codifica
una proteína MC-R1B así como a los compuestos que
efectúan la función de la proteína MC-R1B. Son bien
conocidos en la técnica los procedimientos para identificar los
agonistas y antagonistas de otros receptores y se pueden adaptar
para identificar los agonistas y antagonista de la
MC-R1B. Por ejemplo, Cascieri y col. (1992,
Molec. Pharmacol. 41:1096-1099) describen un
procedimiento para identificar sustancias que inhiben el enlace
agonista en los receptores de la neuroquinina de rata y de esta
manera son agonistas o antagonistas potenciales de los receptores de
la neuroquinina. El procedimiento implica transfectar células COS
con los vectores de expresión que contienen los receptores de la
neuroquinina de rata, dejando crecer las células transfectadas
durante un tiempo suficiente para permitir expresarse a los
receptores de la neuroquinina, cosechando las células transfectadas
y resuspendiendo las células en el tampón de ensayo que contiene un
agonista conocido radioactivamente marcado del receptor de la
neuroquinina en el receptor de la neuroquinina. Si la cantidad de
enlace del agonista conocido es inferior en presencia de la
sustancia que en ausencia de la sustancia, entonces la sustancia es
un agonista o antagonista potencial del receptor de la
neuroquinina. Cuando se mide el enlace de dicha sustancia como
agonista o antagonista de la MC-R1B, se puede medir
dicho enlace empleando una sustancia o agonista marcado. Se puede
marcar la sustancia o agonista de cualquier manera conveniente
conocida por la técnica, por ejemplo, de manera enzimática,
fluorescente, enzimática.
Por tanto, la especificidad del enlace de los
compuestos que tienen afinidad por la MC-R1B se
demuestra midiendo la afinidad de los compuestos por las células
recombinantes que expresan el receptor clonado o por las membranas
de esta células. La expresión del receptor clonado y la selección de
los compuestos que enlazan con la MC-R1B o que
inhiben el enlace de un ligando radiomarcado conocido de la
MC-R1b de estas células o membranas preparadas a
partir de estas células, proporciona un procedimiento efectivo para
la selección rápida de los compuestos que tienen afinidad elevada
por la MC-R1B. Dichos ligandos no necesitan de
manera necesaria radiomarcarse pero pueden ser también compuestos
no isotópicos que se pueden usar para desplazar el enlace de los
compuestos radiomarcados o que se pueden usar como activadores en
ensayos funcionales. Los compuestos identificados mediante el
procedimiento anterior es posible que sean agonistas o antagonistas
de la MC-R1B y pueden ser péptidos, proteínas, o
moléculas orgánicas no proteínicas. Los compuestos pueden modular
aumentando o atenuando la expresión del ADN o del ARN que codifica
la MC-R1B, o actuar como un agonista o antagonista
de la proteína receptora MC-R1B. Se pueden detectar
mediante una variedad de ensayos estos compuestos que modulan la
expresión del ADN o del ARN que codifica la MC-R1B
o la función biológica de la misma. El ensayo puede ser un ensayo
simple de "si/no" para determinar si existe un cambio en la
expresión o función. Se puede hacer el ensayo cuantitativo
comparando la expresión o función de una muestra de ensayo con los
niveles de expresión o función en una muestra convencional. Los kits
que contienen MC-R1B, anticuerpos para la
MC-R1B, o la MC-R1B modificada se
pueden preparar mediante procedimientos conocidos para dichos
usos.
Por tanto, la presente invención se refiere a
los procedimientos para expresar la MC-R1B en
sistemas recombinantes y para identificar los agonistas y
antagonistas de la MC-R1B. Cuando se seleccionan
compuestos con el fin de identificar los potenciales compuestos
farmacéuticos que interactúan de manera específica con un receptor
diana, es necesario asegurar que los compuestos identificados sean
tan específicos como sea posible del receptor diana. Para hacer
esto, es necesario seleccionar los compuestos frente a una matriz
tan amplia como sea posible de receptores que sean similares al
receptor diana. De esta manera, con el fin de encontrar compuestos
que sean compuestos farmacéuticos potenciales que interactúen con
el receptor A (la "diana máxima" y produzcan el efecto
farmacológico deseado a través del receptor A, es también necesario
determinar que los compuestos no interactúan con los receptores B,
C, D, etc, (las "dianas mínimas"). De manera general, como
parte de un programa de selección, es importante tener la menor
cantidad posible de dianas mínimas (véase Hodgson, 1992,
Bio/Technology 10:973-980, @ 980).las
proteínas MC-R1B y las moléculas de ADN que
codifican esta proteína receptora tienen la utilidad adicional en
la que se pueden usar como "dianas mínimas" en selecciones
diseñadas para identificar los compuestos que interactúan de manera
específica con otros receptores acoplados con la proteína. Debido a
la homología con los GPCR, se cree que la MC-R1B de
esta invención funciona de manera similar a los GPRC y tiene una
actividad biológica similar. Son útiles en la comprensión de los
efectos biológicos y fisiológicos y el estudio de los compuestos
activos de melanocortina en primates, seguido por los ensayos
clínicos en seres humanos. De manera más notable, se identificarán y
evaluarán los agonistas de la MC-R1B por sus
efectos sobre la ingesta de alimentos, ganancia de peso e índice
metabólico para identificar nuevos agentes anti obesidad que sean
efectivos en los primates. Se pueden usar también para seleccionar
los agonistas y antagonistas de la melanocortina en monos; de
manera particular para ensayar la especificidad de los ligandos
identificados.
En este extremo, la presente invención se
refiere en parte a los procedimientos para identificar una sustancia
que modula la actividad del receptor de la MC-R1B,
que implica:
(a) combinar una sustancia de ensayo en
presencia o ausencia de una proteína receptora
MC-R1B, que incluye pero no se limita a las
proteínas MC-R1B que comprenden la secuencia de
aminoácidos tal como se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID
Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID
Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE
ID Nº: 23, y la SEC DE ID Nº: 26; y
(b) medir y comparar el efecto de la sustancia
de ensayo en presencia o ausencia de la proteína receptora
MC-R1B.
De manera adicional, se describen en el presente
documento diversas formas de realización para mostrar los diversos
tipos de selección o ensayo de selección que una persona experta
puede utilizar en tánden con un vector de expresión que dirige la
expresión de la proteína receptora MC-R1B. Son bien
conocidos en la técnica los procedimientos para identificar los
agonistas y antagonistas de otros receptores y se pueden adaptar
para identificar los agonistas y antagonistas de la
MC-R1B. Por tanto, estas formas de realización se
presentan como ejemplos y no como limitaciones. En este extremo, la
presente invención incluye ensayos mediante los cuales se pueden
identificar los moduladores de la MC-R1B (tales como
agonistas y antagonistas). De acuerdo con esto, la presente
invención incluye un procedimiento para identificar si una sustancia
es un agonista o antagonista potencial de la MC-R1B
que comprende:
(a) transfectar o transformar las células con un
vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B en las células, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) dejar crecer las células de ensayo durante
un tiempo suficiente para permitir expresarse a la
MC-R1B;
(c) exponer las células a un ligando marcado de
la MC-R1B en presencia o ausencia de la
sustancia;
(d) medir el enlace del ligando marcado en la
MC-R1B; en el que si la cantidad de enlace es
inferior en presencia de la sustancias que en ausencia de la
sustancia, entonces, la sustancia es un agonista o antagonista
potencial de la MC-R1B.
Las condiciones bajo las cuales se practica la
etapa (c) del procedimiento son condiciones que son usadas de manera
típica en la técnica para el estudio de las interacciones
proteína-ligando: por ejemplo, pH fisiológico,
condiciones salinas tales como aquellas representadas por dichos
tampones usados de manera común tales como PBS o en un medio de
cultivo de tejido; una temperatura de aproximadamente 4ºC a
aproximadamente 55ºC. Se pueden cosechar y resuspender las células
de ensayo en presencia de la sustancia y del ligando marcado. En una
modificación del procedimiento descrito anteriormente, se modifica
la etapa (c) en la que las células no se cosechan y resuspenden
sino que más bien se ponen en contacto el agonista conocido marcado
radioactivamente y la sustancia con las células mientras que las
células se ligan a un sustrato, por ejemplo, placas de cultivo de
tejido.
La presente invención incluye también un
procedimiento para determinar si una sustancia es capaz de enlazar
con la MC-R1B, es decir si la sustancia es un
agonista o un antagonista potencial de la MC-R1B, en
el que el procedimiento comprende:
(a) transfectar o transformar células con un
vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B en las células, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) exponer las células de ensayo a la
sustancia;
(c) medir la cantidad de enlace de la sustancia
con la MC-R1B;
(d) comparar la cantidad de enlace de la
sustancia con la MC-R1B en las células de ensayo con
la cantidad de enlace de la sustancia con las células control que no
se han transfectado con la MC-R1B;
en la que si la cantidad de enlace de la
sustancia es mayor en las células de ensayo en comparación con las
células control, la sustancia es capaz de enlazar con la
MC-R1B. Puede llevarse a cabo a continuación la
determinación si la sustancia es realmente un agonista o
antagonista mediante el uso de ensayos funcionales tales como, por
ejemplo, el ensayo que implica el uso de proteínas G promiscuas
descrito a continuación.
Las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo
la etapa (b) del procedimiento son condiciones que se usan de manera
típica en la técnica para el estudio de las interacciones
proteína-ligando: por ejemplo, pH fisiológico;
condiciones salinas tales como aquellas representadas por dichos
tampones usados de manera común tales como PBS o en un medio de
cultivo de tejido; una temperatura de aproximadamente 4ºC a
aproximadamente 55ºC. Las células de ensayo se cosechan y se
resuspenden en presencia de la sustancia.
Chen y col. (1995, Analytical
Biochemistry 226: 349-354) describen un ensayo
colorimétrico que utiliza una célula recombinante transfectada con
un vector de expresión que codifica un receptor acoplado con la
proteína G con un segundo vector de expresión que contiene un
promotor con un elemento que da respuesta al AMPc fusionado con el
gen LacZ. Se mide la actividad del receptor acoplado con la proteína
G como la expresión y la medida OD de \betaGal. Por tanto, otro
aspecto de esta parte de la invención incluye un procedimiento no
radioactivo para determinar si una sustancia es un agonista o
antagonista potencial de la MC-R1B que
comprende:
(a) transfectar o transformar células con un
vector de expresión que codifica la MC-R1B, dando
como resultado las células de ensayo;
(b) transfectar o transformar las células de
ensayo de la etapa (a) con un vector de expresión que comprende un
promotor inducible por el AMPc fusionado con un gen colorimétrico
tal como un LacZ;
(c) dejar crecer las células transfectadas
durante un tiempo suficiente para permitir expresarse a la
MC-R1B;
(d) cosechar las células transfectadas y
resuspender las células en presencia de un agonista conocido de la
MC-R1B y/o en presencia y ausencia del compuesto de
ensayo;
(e) medir el ensayo del agonista conocido y el
compuesto de ensayo para sobreexpresar la MC-R1B
mediante un ensayo colorimétrico que mide la expresión del promotor
inducible por el AMPc y comparar los niveles de expresión en
presencia del agonista conocido así como en presencia y ausencia de
una sustancia desconocida con el fin de determinar si la sustancia
desconocida actúa como un agonista o antagonista potencial de la
MC-R1B.
Los procedimientos adicionales para identificar
los agonistas o antagonistas incluyen pero no se entiende que
limiten lo siguiente
I. (a) transfectar o transformar las células con
un primer vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B y un segundo vector de expresión que dirige
la expresión de una proteína G promiscua, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) exponer las células de ensayo a una
sustancia que es un agonista sospechoso de la
MC-R1B;
(c) medir el nivel de fosfatos de inositol en
las células;
donde un incremento en el nivel de fosfatos de
inositol en las células en comparación con el nivel de fosfatos de
inositol en las células en ausencia del agonista sospechoso indica
que la sustancia es un agonista de la MC-R1B.
II. (a) transfectar o transformar las células
con un primer vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B y un segundo vector de expresión que dirige
la expresión de una proteína G promiscua, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) exponer las células de ensayo a una
sustancia que es un agonista de la MC-R1B;
(c) exponer de manera subsiguiente o concurrente
a la etapa (b) las células de ensayo a una sustancia que es un
antagonista sospechoso de la MC-R1B.
(d) medir el nivel de fosfatos de inositol en
las células;
donde una disminución en el nivel de fosfatos de
inositol en las células en presencia del antagonista sospechoso en
comparación con el nivel de fosfatos de inositol en las células en
ausencia del antagonista sospechoso indica que la sustancia es un
antagonista de la MC-R1B.
III. el procedimiento de II en el que el primer
y segundo vectores de expresión de la etapa (a) se sustituyen con
un vector de expresión único que expresa una proteína
MC-R1B quimérica fusionada en su término C con una
proteína G promiscua.
Se pueden modificar los procedimientos descritos
anteriormente en los que, más bien que exponer las células de
ensayo a la sustancia, se pueden preparar las membrana a partir de
las células de ensayo y se pueden exponer aquellas membranas a la
sustancia. Dicha modificación utilizando membranas más bien que
células es bien conocida en la técnica y se describe en, por
ejemplo, Hess y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.
184:260-268- de acuerdo con esto, otra forma de
realización de la presente invención incluye un procedimiento para
determinar si una sustancia enlaza y/o es un agonista o antagonista
potencial de la MC-R1B en el que se utilizan
preparaciones de membrana a partir de las células de ensayo en
lugar de las células de ensayo. Dichos procedimientos comprende lo
siguiente y pueden utilizar las condiciones fisiológicas tal como se
ha señalado anteriormente:
(a) transfectar o transformar células con un
vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B en las células, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) preparar las membranas que contienen la
MC-R1B de las células de ensayo y exponer las
membranas a un ligando de la MC-R1B bajo las
condiciones tales que el ligando enlace con la
MC-R1B en las membranas;
(c) exponer de manera subsiguiente o concurrente
a la etapa (b) las membranas de las células de ensayo a unas
sustancia;
(d) medir la cantidad de enlace del ligando con
la MC-R1B en las membranas en presencia y ausencia
de la sustancia;
(e) comparar la cantidad de enlace del ligando
con la MC-R1B en las membranas en presencia y
ausencia de la sustancia en la que una disminución en la cantidad de
enlace del ligando con la MC-R1B en las membranas
en presencia de la sustancia indica que la sustancia es capaz de
enlazar con la MC-R1B.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para determinar si una sustancia es capaz de enlazar
con la MC-R1B que comprende:
(a) transfectar o transformar las células con un
vector de expresión que dirige la expresión de la
MC-R1B en las células, dando como resultado las
células de ensayo;
(b) preparar las membranas que contienen la
MC-R1B de las células de ensayo y exponer las
membranas de las células de ensayo a la sustancia;
(c) medir la cantidad de enlace de la sustancia
con la MC-R1B en las membranas de las células de
ensayo;
(d) comparar la cantidad de enlace de la
sustancia con la MC-R1B en las membranas procedentes
de las células de ensayo con la cantidad de enlace de la sustancia
con las membranas procedentes de las células de control que no se
han transfectado con la MC-R1B, donde si la cantidad
de enlace de la sustancia con la MC-R1B en las
membranas procedentes de las células de ensayo es mayor que la
cantidad de enlace de la sustancia con las membranas procedentes de
las células de control, entonces la sustancia es capaz de enlazar
con la MC-R1B.
Una forma de realización preferida de la
presente invención es determinar diferentes afinidades de enlace del
ligando usando NDP-\alpha-MSH
marcado con ^{125}I como ligando marcado en presencia de
concentraciones variables de ligandos no marcados. La activación de
la ruta del segundo mensajero puede determinarse midiendo el AMPc
excitado por el agonista a diferentes concentraciones.
La presente invención también se refiere a
anticuerpos policlonales y monoclonales aumentados en respuesta a
cualquiera de las formas de la MC-R1B, o a un
fragmento biológicamente activo de la misma. Los anticuerpos
policlonales o monoclonales se pueden aumentar frente a la
MC-R1B o un péptido sintético (normalmente con una
longitud comprendida entre aproximadamente 9 y aproximadamente 25
aminoácidos) procedente de una porción de MC-R1B,
por ejemplo según se describe en las SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº:
4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID
Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE
ID Nº: 23, y SEC DE ID Nº: 26. Los anticuerpos monospecíficos frente
a MC-R1B se purifican de antisuero de mamífero que
contiene anticuerpos reactivos frente a MC-R1B o se
preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con la
MC-R1B usando la técnica de Kohler y Milstein (1975,
Nature 256: 495-497). Un anticuerpo
monospecífico, tal como se usa en el presente documento, se define
como una especie de anticuerpo único, o especie de anticuerpo
múltiple, con características de enlace homogéneas frente a la
MC-R1B. El enlace homogéneo, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a la capacidad de la especie de
anticuerpo para enlazarse con un antígeno o epítopo específico,
tales como los asociados con MC-R1B, tal como se ha
descrito más arriba. Los anticuerpos específicos de
MC-R1B se aumentan inmunizando animales tales como
ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, con
una concentración apropiada de la proteína MC-R1B o
un péptido sintético generado a partir de un fragmento de
MC-R1B con o sin coadyuvante inmunitario.
El suero preinmune se recoge antes de la primera
inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y
aproximadamente 1000 mg de la proteína MC-R1B
asociada con un coadyuvante inmunitario aceptable. Entre dichos
coadyuvantes aceptables se incluyen, pero no se limitan a, completo
de Freund, incompleto de Freund, alum precipitado, emulsión de agua
en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La
inmunización inicial comprende la proteína MC-R1B o
el fragmento peptídico de la misma en, de manera preferible, el
coadyuvante completo de Freund en emplazamientos múltiples por vía
tanto subcutánea (SC), intraperitoneal (IP) o ambas. Se extrajo
sangre a cada animal a intervalos regulares, de manera preferible
semanalmente, para determinar el título de anticuerpo. Los animales
pueden recibir o no inyecciones de potenciación tras la inmunización
inicial. A los animales que reciben inyecciones de potenciación se
les proporciona por lo general una cantidad igual de
MC-R1B en coadyuvante incompleto de Freund por la
misma vía. Aproximadamente 7 días después de las inyecciones de
potenciación o aproximadamente semanalmente tras una inmunización
única, se extrae sangre de los animales, se recoge el suero, y las
alícuotas se almacenan a aproximadamente -20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con
la MC-R1B se preparan inmunizando ratones
endogámicos, de manera preferible Balb/c, con la proteína
MC-R1B. Los ratones se inmunizaron por vía IP o SC
con entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg, de manera
preferible entre aproximadamente 10 mg, de la proteína
MC-R1B en aproximadamente 0,5 ml de tampón o
solucion salina incorporada en un volumen igual de un coadyuvante
aceptable, como se ha descrito más arriba. Se prefiere el
coadyuvante completo de Freund. Los ratones recibieron una
inmunización inicial en el día 0 y se les deja descansar durante
entre aproximadamente 3 y aproximadamente 30 semanas. Se proporcionó
a los ratones inmunizados una o más inyecciones de potenciación de
entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mg de la
MC-R1B en una solución tampón tal como una solución
salina tamponada con fosfato por vía intravenosa (IV). Se obtuvieron
linfocitos, procedentes de ratones con positivo de anticuerpos,
retirando los bazos de los ratones inmunizados mediante
procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se produjeron
las células hibridoma mezclando los linfocitos del bazo con un
compañero de fusión adecuado, de manera preferible células de
mieloma, en condiciones que permitan la formación de hibridomas
estables. Entre los compañeros de fusión se pueden incluir, pero no
limitarse a, mielomas de ratón P3/NS l/Ag 4-1;
MPC-11; S-194 y Sp 2/0,
prefiriéndose Sp 2/0. Las células productoras de anticuerpos y las
células de mieloma se fusionan en polietilén glicol,
aproximadamente 1000 de peso molecular, en concentraciones
comprendidas entre aproximadamente 30% y aproximadamente 50%. Las
células de hibridoma fusionadas se seleccionan por crecimiento en
hipoxantina, timidina y aminopterina suplementadas con Medio de
Eagles modificado por Dulbecco (DMEM) mediante procedimientos
conocidos en la técnica. Se recogieron los fluidos sobrenadantes de
los pocillos con crecimiento positivo en aproximadamente los días
14, 18, y 21, se seleccionaron respecto de la producción de
anticuerpo mediante un inmunoensayo tal como el inmunoradioensayo
en fase sólida (SPIRA) usando MC-R1B como antígeno.
También se ensayaron los fluidos de cultivo en el ensayo de
precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb.
Las células de hibridoma procedentes de los pocillos con positivo de
anticuerpos se clonaron mediante una técnica tal como la técnica de
agar blando de MacFerson, 1973, Soft Agar Techniques, in Tissue
Culture Methods y Applications, Kruse y Paterson, Eds., Academic
Press.
Los anticuerpos monoclonales se produjeron in
vivo por inyección de ratones Balb/c cebados primeramente,
aproximadamente 0,5 ml por ratón, con entre aproximadamente 2 x
10^{6} y aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma
aproximadamente 4 días tras el cebado. Se recogió el fluido de los
ascites a aproximadamente 8-12 días después de la
transferencia celular, y se purificaron los anticuerpos monoclonales
mediante técnicas conocidas en la técnica.
La producción in vitro de mAb
anti-MC-R1B se lleva a cabo haciendo
crecer el hibridoma en DMEM que contiene suero fetal de ternero
aproximadamente un 2% para obtener suficiente cantidad del mAb
específico. Los mAb se purifican mediante técnicas conocidas en la
técnica.
Se determinaron los títulos de anticuerpo de
ascites o los fluidos de cultivo del hibridoma mediante diferentes
ensayos sexológicos o inmunológicos entre los que se incluyen, pero
no se limitan a, precipitación, aglutinación pasiva, técnicas de
anticuerpo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) y técnicas de
radioinmunoensayo (RIA). Se usaron ensayos similares para detectar
la presencia de MC-R1B en fluidos corporales o en
extractos tisulares y celulares.
Es rápidamente evidente para los expertos en la
técnica que los procedimientos anteriormente descritos para producir
anticuerpos monoespecíficos se pueden usar para producir anticuerpos
específicos para los fragmentos de péptido MC-R1B,
o MC-R1B de longitud completa.
Las columnas de afinidad del anticuerpo de
MC-R1B se fabrican, por ejemplo, añadiendo los
anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte de
gel que se preactiva con ésteres de
N-hidroxisuccinimida de forma que los anticuerpos
forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de
agarosa. A continuación, los anticuerpos se acoplan con el gel
mediante enlaces de amida con el brazo separador. El resto de los
ésteres activados se inactivan con etanolamina 1 M en HCl (pH 8). La
columna se lava con agua, seguido de glicina 0,23 M en HCl (pH 2,6)
para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña.
A continuación, la columna se equilibra en solución salina tamponada
con fosfato (pH 7,3) y los sobrenadantes del cultivo celular, o los
extractos celulares que contienen los fragmentos de las proteínas
MC-R1B o MC-R1B de longitud completa
se hacen pasar lentamente a través de la columna. A continuación, la
columna se lava con solución salina tamponada con fosfato hasta que
la densidad óptica (A_{280}) desciende hasta el nivel base, a
continuación se eluye la proteína con glicina 0,23 M en HCl (pH
2,6). La proteína MC-R1B purificada se dializa
seguidamente frente a solución salina tamponada con fosfato.
Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteína
recombinante y anticuerpos de la presente invención pueden usarse
para seleccionar y medir niveles de la MC-R1B. Las
proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y
anticuerpos llevan ellos mismos a la formulación de kits adecuados
para la detección y tipificación de la MC-R1B. Dicho
kit comprendería un envase compartimentalizado adecuado para
mantener en confinamiento cerrado al menos un contenedor. El
contenedor contendría además reactivos tales como
MC-R1B recombinante o anticuerpos
anti-MC-R1B adecuados para detectar
MC-R1B. El contenedor puede contener también un
medio para la detección de dicho antígeno marcado, o el sustrato
del enzima, o similares.
Se pueden formular composiciones
farmacéuticamente útiles que comprenden moduladores de la
MC-R1B de acuerdo con procedimientos conocidos,
tales como la premezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Pueden encontrarse ejemplos de dichos vehículos y procedimientos de
formulación en el Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formular
una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para
administración efectiva, dichas composiciones comprenderán una
cantidad efectiva de proteína, ADN, ARN, MC-R1B
modificado, o cualquiera de los agonistas o antagonistas de la
MC-R1B entre los que se incluyen activadores o
inhibidores de la tirosina quinasa.
Las composiciones terapéuticas o diagnosticas de
la invención se administran a un individuo en cantidades suficientes
para tratar o diagnosticar enfermedades. La cantidad efectiva puede
variar de acuerdo con una variedad de factores, tales como el
estado del individuo, peso, sexo y edad. Entre otros factores se
incluye la ruta de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden
suministrarse al individuo por diferentes vías, tales como
subcutánea, tópica, oral e intramuscular.
El término "derivado químico" describe una
molécula que contiene fracciones químicas adicionales que
normalmente no forma parte de la molécula base. Dichas fracciones
pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorción, etc. de la
molécula base. De forma alternativa, las fracciones pueden atenuar
efectos secundarios indeseables en la molécula base, o disminuir la
toxicidad de la molécula base. Se describen ejemplos de dichas
fracciones en diferentes textos, como Remington's Pharmaceutical
Sciences.
Los compuestos identificados de acuerdo con los
procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar en
solitario en las dosis apropiadas. De forma alternativa, puede ser
deseable la administración conjunta o secuencial de otros
agentes.
La presente invención también tiene el objetivo
de proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales,
sistémicas y parenterales adecuadas para uso en los nuevos
procedimientos de tratamiento de la presente invención. Las
composiciones que contienen compuestos identificados de acuerdo con
esta invención como el ingrediente activo, se pueden administrar en
una amplia variedad de formas de dosificación terapéutica en
vehículos convencionales para administración. Por ejemplo, los
compuestos se pueden administrar en formas de dosificación oral
tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones
de dosificación marcadas y dosificación continua) píldoras, polvos,
gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, siropes y
emulsiones, o mediante inyección. Igualmente, pueden administrarse
también de forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión),
intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o
intramuscular, todas estas formas de uso son bien conocidas de
aquellas personas normalmente expertas en las técnicas de la
farmacopea.
De forma ventajosa, los compuestos de la
presente invención pueden administrarse en una única dosis diaria,
o la dosificación diaria total se puede administrar en dosis
divididas de dos, tres o cuatro veces diarias. Además, los
compuestos de la presente invención se pueden administrar en forma
intranasal para uso tópico o vehículos intranasales adecuados, o por
rutas transdérmicas, usando dichas formas de parches transdérmicos
para la piel bien conocidos de aquellas personas normalmente
expertas en las técnica. Para administrarse en forma de un sistema
de dosificación transdérmica, la administración de la dosificación
será, por supuesto, continua en lugar de intermitente a lo largo de
todo el régimen de dosificación.
Para tratamiento en combinación con más de un
agente activo, donde los agentes activos están en formulaciones para
dosificación separada, los agentes activos pueden administrarse de
forma paralela, cada uno se puede administrar con calendarios de
suministro diferentes.
El régimen de dosificación usando los compuestos
de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad
de factores, entre los que se incluyen, tipo, especie, edad, peso,
sexo, y estado médico del paciente; la gravedad de la enfermedad a
tratar; la ruta de administración, el funcionamiento renal, hepático
y cardiovascular del paciente; y el compuesto concreto del mismo
empleado. Un médico o veterinario normalmente experto puede
determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de fármaco
necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la
enfermedad. La precisión óptima en la consecución de las
concentraciones de fármaco en el intervalo que proporcione eficacia
sin dar lugar a toxicidad requiere un régimen basado en la cinética
de la disponibilidad del fármaco en los emplazamientos diana. Esto
implica tener en cuenta la distribución, equilibrio y eliminación
del fármaco.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención sin limitar, sin embargo, la misma
por esta vía.
Identificación de la secuencia expresada Tag
(EST) - Se exploraron las bases de datos de Genbank usando el
programa de búsqueda Tblastn (Altschul y col., 1990, J. Mol.
Biol. 215: 403-410) con una secuencia de
aminoácidos procedente de proteínas del receptor de la
melanocortina. Se identificó un EST humano (GenBank acceso#
AI123000; dbEST Id#1881544; GenBank gi: 3538766; Clon Id: Imagen:
1509887 (3') depositado el 18 de agosto de 1997) derivado de cinco
bibliotecas de ADNc normalizadas y mezcladas con una puntuación
significativa en homología. El EST AI123000 mostró una identidad de
secuencia (> 90% a nivel de ADN) respecto de extremo 3' del gen
de la MC-1R humana. La secuencia de nucleótidos de
la EST AA123000 es como sigue:
Se depositó posteriormente un EST adicional el
13 de octubre de 1998 con una identidad de secuencia similar
respecto del extremo 3' del gen de la MC-R1 humana.
El número de acceso GenBank de este EST es #AI187892 (dbEST
Id#826102; GenBank gi: 1774101; Clon Id: Imagen: 625984 (3')). . La
secuencia de nucleótidos de la EST AA187892 es como sigue:
Una búsqueda adicional en el subconjunto dbEST
de Genbank identificó otros dos EST humanos con identidad de
secuencia respecto de la MC-R1R humana: el primero
está disponible bajo el número de acceso GenBank #AA431397, y se
aisló a partir de ARNm de testículo humano, y se introdujo el 22 de
mayo de 1997 (dbEST Id#1075968; GenBank gi: 2115105; Clon Id:
Imagen: 782133 (5')). La secuencia de nucleótidos de EST AA431397 es
como sigue:
Está disponible otro EST con el número de acceso
GenBank #AA778295 y se aisló de corazón fetal humano, y se
introdujo en la base de datos el 5 de febrero de 1998 (dbEST
Id#1075968; GenBank gi: 2115105; Clon Id: Imagen: 782133 (5')). La
secuencia de nucleótidos de EST AA431397 es como sigue:
El secuenciamiento del ADN de ambas cepas usando
las reacciones rápidas de terminación mediante tinte del ciclo de
secuenciación (Perkin Elmer-ABI), analizado en un
secuenciador cíclico 377 ABI Prism sugirió que este EST puede
representar un fragmento de una forma ayustada de manera alternativa
del gen de la MC-R1 humana, descrito en el conjunto
de esta memoria como una proteína MC-R1B, que
contiene 382 aminoácidos. La proteína MC-R1
anteriormente descrita que contiene 317 aminoácidos se denomina como
MC-R1A (Mountjoy, y col., 1992, Science 257:
1248-1251 [véase también la Patente de los Estados
Unidos Nº. 5.532.347]; Chhajlani y Wikberg, 1992, FEBS
Letters
309: 417-420). La Figura 1 muestra el alineamiento de estos EST en relación con los genes de MC-R1A y MC-R1B.
309: 417-420). La Figura 1 muestra el alineamiento de estos EST en relación con los genes de MC-R1A y MC-R1B.
Clonación de la variante ayustada de
MC-R (MC-RIB) procedente de ADN
Genómico Humano. Se llevó a cabo la PCR Touchdown con ADN humano
genómico partido (0,5 mg; Clontech, Palo Alto, CA) en un sistema
GeneAmp 9700 PCR (Perkin Elmer, Foster City, CA). Se diseñaron dos
cebadores sentido, MC1R-5' for1
(5'TCTCACACTCATCGTCCTCTGCCC3'; SEC DE ID Nº: 32) y
MClR-5' for2 (5'CATCGCCTACTACGACCACGTGGC3'; SEC DE
ID Nº: 33), basados en la secuencia publicada de la
MC-lRA humana (id). Los cebadores
antisentido, MC1R3' rev1 (5'CGCTGCAAGGCTGTTGGATGAAGC3'; SEC DE ID
Nº: 34) y MC1R3' rev2 (5'GTGGGAGTAGCTCTTGGCACACAC; SEC DE ID Nº: 35)
se derivaron de EST AI123000. Se usó un kit Advantage ADNc PCR
(Clontech, Palo Alto, CA) en las reacciones de PCR, siguiendo
esencialmente las instrucciones del fabricante. Dos excepciones
fueron la adición de DMSO al 5% a las reacciones de PCR y la
ciclación PCR como se describe a continuación: 1) 94ºC durante 1
minuto, 2) 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 3
minutos, 3) 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 70ºC durante 3
minutos, 4) 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 3
minutos. La secuenciación posterior de los productos PCR usando
reacciones rápidas de terminación mediante BIG DYE del ciclo de
secuenciación (Perkin Elmer, Foster City, CA) y análisis en un
secuenciador cíclico 377 ABI Prism (Perkin Elmer, Foster City, CA),
reveló la presencia de un intrón críptico de 381bp inmediatamente
corriente arriba (en el residuo C-terminal
Trp-317) del codón de detención TGA del gen de la
MC-R1 humana. Las fronteras del nucleótido que
describen este intrón usando como guía las secuencias de consenso
ayustadas de unión (Senapathy y col., 1990, Meth. Enzymol.
183: 252-278) son como sigue. Se encontró un
emplazamiento de donación ayustado de consenso conservado (A/C)
AG/gt (nucleótidos 950-952) que forma las dos
primeras bases del codón triplete Trp.
La Figura 2 muestra el ayustado alternativo de
las dos formas humanas de la MC-R1, mostrando las
regiones COOH-terminales de las proteínas
expresadas, así como las uniones ayustadas identificadas en los
diferentes clones genómicos que codifican la MC-R1B
humana.
La Figura 3 muestra un clon genómico
representativo de la MC-R1B humana, la secuencia de
ADN del clon genómico, mcl-8 (SEC DE ID Nº: 21).
Las letras grandes en mayúscula representan regiones del exón,
mientras que los nucleótidos en minúsculas pequeñas representan el
intrón sencillo del gen de la MC-R1. Se identificó
un emplazamiento conservado ayustado de consenso cag/R en los
nucleótidos 1330-1332. La formación de esta unión
ayustada surge del donante que suministra TG y del receptor que
suministra C para formar el codón del triplete de la Cys (en lugar
del amino C-terminal Trp de la
MC-R1A). La nueva secuencia de codificación da lugar
a otros 65 aminoácidos adicionales (que no incluyen la sustitución
Trp-317 a Cys) como resultado de este episodio de
ayuste.
Las Figuras 4A-4B muestran las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la porción amino terminal
de las formas MC-R1A y MC-R1B de
mcl-8, las secuencias de unión ayustadas 5' y 3',
así como las respectivas secuencias de aminoácidos de los
fragmentos carboxi terminal de MC-R1 A y
MC-R1B.
A continuación se llevó a cabo la PCR de
solapamiento para generar un marco continuo de lectura contiguo (382
aminoácidos) por causa del intrón que contiene este nuevo término en
carboxilo. Se produjeron los productos PCR de los exones I y II
conteniendo cada uno de ellos una pequeña cantidad del otro exón.
Los cebadores del exón I fueron como sigue:
1.
mcl-like-1f
(5'gggcccgaattcgccgccATGGCTGTGCAGGGATCCCAGAG3'; SEC DE
ID Nº: 36);
y
2.
mcl-like-1r
(5'GGCACGGTCCTGAGAGCAGGAGCATGTCAGCACCTCCTTG3'; SEC DE
ID Nº: 37), y contenían un emplazamiento EcoRI y una secuencia Kozak
(GCC GCC) para una traducción óptima. Los cebadores del exón II
fueron como
sigue:
1.
mcl-like-2f
(5'CTGACATGCTCCTGCTCTCAGGACCGTGCCCTCGTCAGC3'; SEC DE
ID Nº: 38);
y,
2.
mcl-like-2r
(5'agtttagcggccgcCTAGGGGGGCTCCTGCAAACCTGG3'; SEC DE ID
Nº: 39), que contiene un emplazamiento NotI. El marco de lectura
abierta MC1-like se generó a continuación a partir
de los exones I y II y los cebadores mcl-like 1 f y
mcl-like 2r. El fragmento MC1-like
ORF se digirió con EcoRI y NotI, se purificó en gel, se ligó en un
vector pcADN3 y se transformó en una E. coli SCS 1
(Stratagene, La Jolla, CA). Cada uno de los cuatro clones genómicos
de ejemplo (mcl-3, mcl-6,
mcl-8 y mcl-9) se aislaron con la
metodología anteriormente
descrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Clonación de la variante ayustada
MC-R (MCRI B) procedente de ARNm de testículo
humano - EL ADNc de longitud completa que codifica
MC-R1B se aisló de testículos humanos ARNm poli
(A)^{+} (combinación de 25 varones caucasianos). Se llevó a
cabo la RT-PCR usando 1 mg de ARNm de testículo
humano usando el Advantage RT para un kit de PCR con la
transcriptasa inversa MMLV (Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo
esencialmente las instrucciones del fabricante. A continuación se
llevó a cabo la PCR con el kit Advantage ADNc PCR (Clontech, Palo
Alto, CA) siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante
(condiciones de ciclación 94ºC durante 1 min., 60ºC durante 2 min.,
72ºC durante 2 min., 72ºC durante 10 min. El cebador de sentido
hacia delante utilizado (satélite de un emplazamiento de
restricción EcoRl y secuencia de iniciación optimizada basada en las
reglas de Kozak) fue
(5'GATCGAATTCGCCGCCATGGCTGTGCAGGGATCCCAGAGAAG3'; SEC DE ID Nº: 40)
mientras que los cebadores inversos antisentido fueron
(5'GATCGAATTCCTAGGGGGGCTCCTGCAAACCTG3'; SEC DE ID Nº: 41) o
(5'GATCGAATTCGTGCCCAGTCTGAGCCTTAGAACCG3': SEC DE ID Nº: 42). Los
productos amplificados se purificaron en gel de agarosa, se
digirieron con EcoRl y se enlazaron con el vector mamífero de
expresión pcADN-3,1 (-) (Invitrogen). Esta
metodología se utilizó para identificar la
MC-RlESTcl 1, así como otros clones de ADNc.
Se inocularon por triplicado cuatro recipientes
de 800 ml (Nalge Nunc) que contenían 125 ml de medio Tagle
modificado por Dulbecco (DMEM), (Gibco-BRL)
suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma),
L-glutamina (Gibco/BRL), y Pen/Strep (Gibco/BRL)
con células COS y se incubaron durante 4 días. Se recogieron las
células de cada recipiente eliminando el medio por vertido,
añadiendo 30 ml de tripsina/EDTA (0,05%,Gibco/BRL) a cada
recipiente, y dejando el frasco incubar a temperatura ambiente
durante 2 min. A continuación, se eliminó la solución de tripsina,
y los frascos se incubaron a 37ºC durante 10 minutos, se añadieron
30 ml de DMEM, y se recogieron las células a continuación. Las
células se fragmentaron a 1000 rpm durante 8 min., se lavaron dos
veces con PBS de Delbecco que carecía de Mg^{++} y Ca^{++}
(Gibco/BRL). Las células se contaron y resuspendieron hasta una
densidad de 1,2 X 10^{7}/ml en PBS que carecía de Mg^{++} y
Ca^{++}. Se introdujo el ADN en el interior de las células por
electroporación; se mezclaron 0,85 ml de las células con 20 \mug
del plásmido de expresión MC-R1 en una cubeta
(BioRad) de 0,4 cm enfriada en hielo. La solución se electroporó
con un electroporador BioRad Gene Pulsar ajustado a 0,26 kV, 960
FFD. Se combinaron las células procedentes de 30 electroporaciones
en 1 litro de DMEM y se dispensaron 125 ml por frasco triplicado y
se incubaron a 37ºC. Tres días después, se eliminó por vertido el
medio de cada recipiente, las células se lavaron dos veces con PBS
de Delbecco que carecía de Mg^{++} y Ca^{++}, y se añadieron 30
ml de tampón de disociación libre de enzima (Gibco/BRL). Tras
incubación a temperatura ambiente durante 10 min., las células se
recogieron, se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min. a 4ºC, y se
resuspendieron en 15 ml de tampón membrana (Tris 10 mM pH 7,4, con
inhibidores de la proteinasa). Una solucion de inhibidor de la
proteinasa contiene Leupeptina (Sigma) 2 \mug/ml, Fosforamidon
(Sigma) 5 \muM, Bacitracina (Sigma) 20 \mug/ml, Aprotinina
(Sigma) 2,5 \mug/ml, y AEBSF 0,05 M (Pefabloc). Las células se
rompieron con diez golpes de un almirez impulsado por motor, se
transfirió el homogenato a tubos Falcon de 50 ml, y se
centrifugaron a 2200 rpm, 4ºC durante 10 min. El sobrenadante se
transfirió a tubos de centrífuga de 50 ml y se centrifugaron a 18K
durante 20 min en una centrífuga Sorvall RC5B. LAs membranas se
resuspendieron en 0,6 ml de tampón membrana, se pasaron 2 veces a
través de una aguja talla 18, y 5 veces a través de una aguja talla
25, se tomaron alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido, y se
almacenaron a -80ºC hasta que fueron necesarias.
Ensayo de enlace del radioligando
melanocortina - Las reacciones de enlace (volumen total = 250
\mul) que contienen MBB (Tris 50 mM pH 7,2, CaCl_{2} 2 mM,
MgCl_{2} 1 mM), BSA al 0,1%, membrana cruda preparada a partir de
células que expresan el receptor de la MC-R1B
humana, 200 pM [^{125}I]-NDp \alphaMSH
(Amersham Corp.), y concentraciones crecientes de compuestos de
ensayo no marcados disueltos en DMSO (concentración final en DMSO =
2%). Las reacciones se incubaron durante 1 hora sin agitación, y a
continuación se filtraron en placas de filtro de 96 pocillos
(Packard Corp.). Los filtros se lavaron tres veces con tampón TNE
(Tris 50 mM pH 7,4, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM), se secó y contó usando
Microscint-20 en un contador por centelleo Topcount
(Packard). La concentración inhibitoria al 50% (CI_{50}, dada en
nM) se define como la concentración de péptidos de melanocortina no
marcados que desplazan el 50% del enlace de las membranas celulares
que expresan MC-1R. Se determinó el enlace no
específico en presencia de NDP \alphaMSH no marcado 2 \muM
(Peninsula laboratories). Las células COS-7
expresan de manera transitoria la MC-R1B enlazada
con [^{125}I]-NDp \alphaMSH con elevada afinidad
y especificidad (enlace específico, definido como la diferencia en
el enlace observado en ausencia y en presencia de NDP \alphaMSH 1
\muM no marcado fue >90% del enlace total). Se observó muy
poco, o nada, de enlace específico en las células
COS-7 transfectadas. Como se muestra en la Tabla 1
siguiente, algunos péptidos derivados de la melanocortina
(secuencia de aminoácidos definida más adelante según el código
IUPAC de letra única) desplazó el enlace de
[^{125}I]-NDP \alphaMSH indicando potencialmente
la presencia de un emplazamiento de enlace de alta afinidad
establecido por la expresión de la MC-1RB.
| Péptido | CI_{50} (nM) |
| \alphaMSH | 5 |
| \gammaMSH | 5 |
| NDP-\alphaMSH | 0,7 |
| SHU-9119 | 0,7 |
| MT-II | 0,2 |
| ACTH | 5 |
Ensayo del receptor funcional de AMPc -
Se ensayó la formación de AMP cíclico (AMPc) mediada por la
estimulación del receptor en células COS-7
transfectadas con plásmidos de expresión de la
MC-1RB. Las células que expresaban la
MC-1RB se disociaron de los recipientes de cultivo
de tejido lavando con solución salina tamponada con fosfato libre
de Ca y Mg (Life Technologies Gaithersburg, MD), y se despegaron
tras 5 min de incubación con tampón de disociación libre de enzima
(Specialty Media, Lavellette, NJ). Las células se recogieron por
centrifugación y resuspensión en solucion salina equilibrada de
Earle (EBSS) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) con adiciones de
HEPES 10 mM pH 7,5, MgCl_{2} 5 mM, glutamina 1 mM y 1 mg/ml de
albúmina de suero bovino. Las células se contaron y diluyeron de 2 a
4 x 10^{6}/ml. Se añadió el inhibidor de la fosfodiesterasa
3-isobutil-1metilxantina a una
concentración de 0,6 mM. Los péptidos de ensayo se diluyeron en EBSS
con las anteriores adiciones y DMSO al 10%; se añadieron 0,1 vol de
compuestos a 0,9 vol de células. Tras incubación a temperatura
ambiente durante 40 min., las células se lisaron por incubación a
100ºC durante 5 min. para liberar el AMPc acumulado. Se midió el
AMPc en una alícuota del lisato celular con el ensayo de detección
de AMPc Amersham (Arlington Heights, IL) (RPA556). La cantidad de
producción de AMPc que se produce a partir de un compuesto
desconocido se compara con la cantidad de AMPc producido en
respuesta a \alphaMSH, que se define como un agonista del
100%.
Los estudios anteriores (Mountjoy, y col., 1992,
Science 257: 1248-1251 [véase también la
Patente de los Estados Unidos Nº 5.532.347]; Chhajlani y Wikberg,
1992, FEBS Letters 309: 417420) han documentado que la
activación de la isoforma MC-1RA por los agonistas
de la melanocortina da como resultado una elevación de la producción
intracelular de AMPc debido al acoplamiento de las
proteínas-G para activar la adenilato ciclasa
enlazada con la membrana. La expresión transitoria de la proteína
MC-R1B en COS-7 también produce un
aumento (\approx 3 veces a máxima concentración de agonista, en
comparación con la respuesta de fondo mediada en células
COS-7 transfectadas) en la formación de AMPc
intracelular evocada de forma específica por algunos agonistas de la
melanocortina o mezcla de agonistas/antagonistas entre los que se
incluyen \alphaMSH, MT-II,
SHU-9119, \gammaMSH,
NDP-\alphaMSH, y \betaMSH. Este resultado
indica que el ADNc de la MC-R1B codifica un receptor
funcional de las melanocortinas. El orden de potencia de los
péptidos anteriores para desencadenar una respuesta de AMPc fue
MT-II > NDP-MSH >
SHU-9119 > \alphaMSH > \betaMSH >
\gammaMSH.
La presente invención no se limita en su alcance
a las formas de realización específicas descritas en el presente
documento. Además, a partir de la descripción anterior serán
evidentes diferentes modificaciones de la invención además de las
descritas en el presente documento, que serán evidentes para
aquellas personas expertas en la técnica. Se pretende que dichas
modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> SOLICITANTE: Merk & Co.,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> TÍTULO: MOLÉCULAS DE ADN QUE
CODIFICAN VARIANTES AYUSTADAS DE LA PROTEÍNA DEL RECEPTOR DE LA
MELANOCORTINA 1 HUMANA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REFERENCIA REGISTRO/ARCHIVO:
20367PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> NÚMERO DE SECUENCIAS: 46
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<170> SOFTWARE: FastSEQ para Windows
versión 3.0
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humano)
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humano)
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humano)
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humano)
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humano)
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humano)
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<400> SEC DE ID Nº: 16
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humano)
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<400> SEC DE ID Nº: 17
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humano)
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<400> SEC DE ID Nº: 18
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<400> SEC DE ID Nº: 19
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<400> SEC DE ID Nº: 25
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humano)
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<400> SEC DE ID Nº: 29
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<400> SEC DE ID Nº: 30
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<210> SEC DE ID Nº: 31
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<211> LONGITUD: 263
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Homo sapiens (ser
humano)
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<210> SEC DE ID Nº: 35
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
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<400> SEC DE ID Nº: 35
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<210> SEC DE ID Nº: 36
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<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA
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<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
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<400> SEC DE ID Nº: 36
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<210> SEC DE ID Nº: 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 40
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
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<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 37
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> SEC DE ID Nº: 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgacatgct cctgctctca ggaccgtgcc ctcgtcagc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtttagcgg ccgcctaggg gggctcctgc aaacctgg
\hfill38
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgaattc gccgccatgg ctgtgcaggg atcccagaga ag
\hfill42
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgaattc ctaggggggc tcctgcaaac ctg
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRA INFORMACIÓN:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgaattc gtgcccagtc tgagccttag aaccg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Homo sapiens (ser
humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 43
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC DE ID Nº: 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Homo sapiens (ser
humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 44
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<210> SEC DE ID Nº: 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 962
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Homo sapiens (ser
humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC DE ID Nº: 45
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Una molécula de ácido nucleico purificada que
codifica la proteína del receptor de la melanocortina 1 humana, en
la que el receptor de la melanocortina 1 humana comprende una región
carboxi terminal en la secuencia de aminoácidos como se indica en la
SEC DE ID Nº 27.
2. Una molécula de ácido nucleico purificada de
la reivindicación 1 en el que la molécula de ácido nucleico se
selecciona entre el grupo constituido por la SEC DE ID Nº: 1, SEC DE
ID Nº: 3, SEC DE ID Nº: 5, SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 9, SEC DE
ID Nº: 11, SEC DE ID Nº: 13, SEC DE ID Nº: 15, SEC DE ID Nº: 16, SEC
DE ID Nº: 18; SEC DE ID Nº: 19, SEC DE ID Nº: 21, SEC DE ID Nº: 22,
SEC DE ID Nº: 24, y la SEC DE ID
Nº: 25.
Nº: 25.
3. Una molécula de ácido nucleico purificada que
codifica la proteína MC-R1B en el que la molécula de
ácido nucleico codifica una proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC DE ID
Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID
Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC DE
ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC DE ID
Nº: 26,
Nº: 26,
4. Un vector de expresión para la expresión de
una proteína MC-R1B humana en una célula huésped
recombinante, en la que el vector de expresión comprende una
molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la
reivindicación 1.
5. Un vector de expresión de la reivindicación 4
que es un vector de expresión eucariota.
6. Un vector de expresión de la reivindicación 4
que es un vector de expresión procariota.
7. Una célula huésped que expresa una proteína
MC-R1B humana recombinante en la que dicha célula
huésped contiene la expresión del vector de la reivindicación 4.
8. Una célula huésped que expresa una proteína
MC-R1B humana recombinante en la que dicha célula
huésped contiene la expresión del vector de la reivindicación 5.
9. Una célula huésped que expresa una proteína
MC-R1B humana recombinante en la que dicha célula
huésped contiene la expresión del vector de la reivindicación 6.
10. Una célula huésped de la reivindicación 7 en
la que dicha proteína MC-R1B humana se sobreexpresa
a partir de dicho vector de expresión.
11. Una célula huésped de la reivindicación 8 en
la que dicha proteína MC-R1B humana se sobreexpresa
a partir de dicho vector de expresión.
12. Una célula huésped de la reivindicación 9 en
la que dicha proteína MC-R1B humana se sobreexpresa
a partir de dicho vector de expresión.
13. Una fracción subcelular de la membrana
obtenida a partir de la célula huésped de la reivindicación 10 en la
que dicha fracción contiene una proteína MC-R1B
humana recombinante.
14. Una fracción subcelular de la membrana
obtenida a partir de la célula huésped de la reivindicación 11 en la
que dicha fracción contiene una proteína MC-R1B
humana recombinante.
15. Una fracción subcelular de la membrana
obtenida a partir de la célula huésped de la reivindicación 12 en la
que dicha fracción contiene una proteína MC-R1B
humana recombinante.
16. Una molécula de ácido nucleico purificada
que codifica una proteína MC-R1B humana en el que la
molécula de ácido nucleico codifica una proteína constituida por una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por
la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº:
8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID
Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC DE ID Nº:
26.
17. Una proteína del receptor de la
melanocortina 1 humana purificada que comprende una región de
aminoácidos carboxi terminal como se indica en la SEC DE ID Nº:
27.
18. Una proteína del receptor de la
melanocortina 1 humana purificada de la reivindicación 17 que
comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº:
6, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC. DE ID
Nº: 14, SEC. DE ID Nº: 17, SEC. DE ID N: 20, SEC. DE ID N: 23, y la
SEC DE ID Nº: 26.
\newpage
19. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es capaz de enlazarse con la MC-R1B humana
que comprende:
- (a)
- Proporcionar células de ensayo transfectando células con un vector de expresión de la reivindicación 4;
- (b)
- Exponer las células de ensayo a las sustancia;
- (c)
- Medir la cantidad de enlace de la sustancia a MC-R1B;
- (d)
- Comparar la cantidad de enlace de la sustancia a MC-R1B en las células de ensayo con la cantidad de enlace de la sustancia a células de control que no se han transfectado con MC-R1B.
20. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es capaz de activar la MC-R1B que
comprende:
- (a)
- Proporcionar células de ensayo transfectando células con un vector de expresión de la reivindicación 4;
- (b)
- Exponer las células de ensayo a la sustancia;
- (c)
- Medir la cantidad de enlace de la sustancia a MC-R1B;
- (d)
- Comparar la cantidad de AMPc en las células de ensayo en respuesta a la sustancia con la cantidad de AMPc en las células de ensayo que no se han expuesto a la sustancia.
21. Un procedimiento para identificar una
sustancia que modula la actividad del receptor de la
MC-R1B que comprende:
- (a)
- Combinar una sustancia de ensayo en presencia y ausencia de una proteína del receptor de MC-R1B en la que dicha proteína del receptor de MC-R1B comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC. DE ID N: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC. DE ID Nº: 6, SEC. DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 10, SEC. DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID Nº: 17, SEC. DE ID Nº: 20, SEC. DE ID Nº: 23, y la SEC. DE ID Nº: 26; y,
- (b)
- Medir y comparar el efecto de la sustancia de ensayo en presencia y ausencia de una proteína del receptor de MC-R1B
22. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es un agonista o antagonista potencial de la
MC-R1B que comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B en las células, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Dejar crecer las células de ensayo durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de la MC-R1B;
- (c)
- Exponer las células a un ligando de MC-R1B marcado en presencia y ausencia de la sustancia;
- (d)
- Medir la cantidad de enlace del ligando marcado con MC-R1B, en donde si la cantidad de enlace del ligando marcado es inferior en presencia de la sustancia que en ausencia de la sustancia, entonces la sustancia es un agonista o antagonista potencial de la MC-R1B.
23. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es capaz de enlazarse con la MC-R1B que
comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B en las células, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Exponer las células de ensayo a la sustancia;
- (c)
- Medir la cantidad de enlace de la sustancia a MC-R1B;
- (d)
- Comparar la cantidad de enlace de la sustancia a MC-R1B en las células de ensayo con la cantidad de enlace de la sustancia en células de control que no se han transfectado con MC-R1B.
Donde si la cantidad de enlace de la sustancia
es mayor en las células de ensayo en comparación con las células de
control la sustancia es capaz de enlazar con
MC-R1B.
24. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es capaz de enlazarse con la MC-R1B que
comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B en las células, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Preparar membranas que contienen MC-R1B procedentes de las células de ensayo, y exponer las membranas a un ligando de la MC-R1B en condiciones tales que el ligando se enlace con la MC-R1B en las membranas;
- (c)
- En serie o en paralelo con la etapa (b), exponer las membranas de las células de ensayo a una sustancia,
- (d)
- Medir la cantidad de enlace del ligando a la MC-R1B en las membranas en presencia y ausencia de la sustancia;
- (e)
- Comparar la cantidad de enlace del ligando a la MC-R1B en las membranas en presencia y ausencia de la sustancia, donde una disminución en la cantidad de enlace del ligando a la MC-R1B en las membranas en presencia de la sustancia indica que la sustancia es capaz de enlazarse con MC-R1B
25. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es capaz de enlazarse con la MC-R1B que
comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B en las células, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Preparar membranas que contienen MC-R1B procedentes de las células de ensayo, y exponer las membranas de las células de ensayo a la sustancia;
- (c)
- Medir la cantidad de enlace de la sustancia a la MC-R1B en las membranas de las células de ensayo;
- (d)
- Comparar la cantidad de enlace de la sustancia a la MC-R1B en las membranas de las células de ensayo con la cantidad de enlace de la sustancia a la membranas procedentes de células de control que no se han transfectado con MC-R1B, donde si la cantidad de enlace de la sustancia a la MC-R1B en las membranas de las células de ensayo es mayor que la cantidad de enlace de la sustancia a las membranas de las células de control, entonces la sustancia es capaz de enlazarse con MC-R1B.
26. Un procedimiento para identificar agonistas
de la MC-R1B que comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B y un segundo vector de expresión que dirige la expresión de una proteína G promiscua, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Exponer las células de ensayo a una sustancia sospechosa de ser agonista de la MC-R1B;
- (c)
- Medir el nivel de fosfatos de inositol en las células;
- Donde un aumento en el nivel de fosfatos de inositol en las células en comparación con el nivel de fosfatos de inositol en las células en ausencia del agonista sospechoso indica que la sustancia es una agonista de la MC-R1B.
27. Un procedimiento para identificar
antagonistas de la MC-R1B que comprende:
- (a)
- Transfectar o transformar células con un vector de expresión de la reivindicación 4 que dirige la expresión de la MC-R1B y un segundo vector de expresión que dirige la expresión de una proteína G promiscua, dando como resultado células de ensayo;
- (b)
- Exponer las células de ensayo a una sustancia sospechosa de ser antagonista de la MC-R1B;
- (c)
- En serie o en paralelo con la etapa (b), exponer las membranas de las células de ensayo a una sustancia sospechosa de ser antagonista de la MC-R1B,
- (d)
- Medir el nivel de fosfatos de inositol en las células;
Donde una disminución en el nivel de fosfatos de
inositol en las células en presencia del antagonista sospechoso en
comparación con el nivel de fosfatos de inositol en las células en
ausencia del antagonista sospechoso indica que la sustancia es una
agonista de la MC-R1B.
28. Un procedimiento para identificar
antagonistas de la MC-R1B según se describe en la
reivindicación 27 en el que el primer y segundo vector de la etapa
(a) se sustituyen con un vector de expresión única que expresa una
proteína MC-R1B quimérica fusionada en su extremo C
con una proteína G promiscua.
29. Un anticuerpo que se enlaza de forma
específica con la proteína MC-R1B en el que la
proteína del receptor de la MC-R1B comprende la
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por
la SEC DE ID Nº: 2, SEC DE ID Nº: 4, SEC DE ID Nº: 6, SEC DE ID Nº:
8, SEC DE ID Nº: 10, SEC DE ID Nº: 12, SEC DE ID Nº: 14, SEC DE ID
Nº: 17, SEC DE ID Nº: 20, SEC DE ID Nº: 23, y la SEC DE ID Nº:
26.
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