JP2001525197A

JP2001525197A - ヒト核内受容体タンパク質ｎＮＲ５をコードするＤＮＡ分子

Info

Publication number: JP2001525197A
Application number: JP2000524316A
Authority: JP
Inventors: チエン，フアン
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2001-12-11
Also published as: WO1999029725A1; US20030096348A1; EP1044219A1; CA2314434A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、nNR5と称されるヒト核内受容体スーパーファミリーの新規メンバーをコードするcDNA分子の単離および特徴づけを開示する。組換えベクター、組換え宿主細胞、nNR5活性のモジュレーターに関するスクリーニング方法、およびnNR5またはそのエピトープに対する抗体の製造も、該開示の範囲内に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、1つには、脊椎動物核内受容体タンパク質（特に、本明細書の全体にわたりnNR5として例示されるヒト核内受容体）をコードする単離された核酸分
子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明はまた、nNR5をコードするDNA断片を含有する組換えベクターおよび組換え宿主、実質的に精製された形態の関連ヒト
nNR5タンパク質、ヒト突然変異タンパク質、ならびにnNR5活性をモジュレーショ
ンする化合物の同定に関連した方法に関する。

【０００２】（発明の背景）ステロイドホルモン受容体を含む核内受容体スーパーファミリーは、発生、分
化および生理的機能の制御において何らかの役割を果たすことが示されている、
小さな化学リガンドにより誘導されうる転写因子である。核内受容体をコードす
るcDNAクローンの単離は、いくつかの特徴を明らかにする。第1に、該NH₂末端領
域は受容体によって長さが様々であり、高度に可変性であり、ファミリーメンバ
ー間で低い相同性を有する。ドメインI、IIおよびIIIと称される保存された3つの内部領域が存在する。領域Iは、DNA結合ドメイン（DBD）と称されるシステインに富む領域である。領域IIおよびIIIは、該タンパク質のCOOH末端領域内に存在し、リガンド結合ドメイン（LBD）とも称される。概説としては、Powerら（19
92, Trends in Pharmaceutical Sciences 13: 318-323）を参照されたい。

【０００３】ステロイド受容体を活性化する親油性ホルモンはヒトの疾患に関連しているこ
とが公知である。したがって、それぞれの核内受容体は、治療的介入のための可
能な標的と目されている。種々のステロイドホルモン受容体の作用メカニズムの
概説としては、TsaiおよびO’Malley（1994, Annu. Rev. Biochem. 63:451-486 ）を参照されたい。

【０００４】また、非ステロイド核内受容体に関する最近の研究は、治療的介入のための薬
物標的としての可能性を示している。この研究は、保存されたDBD領域により同定されたペルオキシソーム増殖剤活性化受容体g（PPARg）が活性化に際して脂肪
細胞の分化を促進し、抗糖尿病薬のクラスであるチアゾリジンジオンがPPARgを介して機能すると報告している（Tontonozら, 1994, Cell 79: 1147-1156; Lehm
annら, 1995, J. Biol. Chem. 270(22): 12953-12956; Teboulら, 1995, J. Bio
l. Chem. 270(47): 28183-28187）。これは、PPARgがグルコースの恒常性および
脂質の代謝において何らかの役割を果たしていることを示している。

【０００５】 Wangら（1989, Nature 340:163-166）は、該著者らがCOUP転写因子（COUP-TF ）を核内受容体スーパーファミリーのメンバーとして分類するように促したデー
タを示している。

【０００６】 Mangelsdorfら（1995, Cell 83:835-839）は、核内受容体スーパーファミリー
の公知メンバーについて概説している。

【０００７】核内受容体スーパーファミリーのメンバー（特に、ヒト、ラット、マウスなど
の種からの脊椎動物メンバー）である追加的な遺伝子を同定することができれば
有益であろう。核内受容体タンパク質を発現する核酸分子は、細胞分化、細胞発
生および生理的機能のモジュレーターとして作用する化合物に関するスクリーニ
ングに有用であろう。本発明は、細胞の分化および発生において何らかの役割を
有するヒト核内受容体タンパク質を発現する単離された核酸分子を開示すること
により、これらの要求について検討し、それらを満足させるものである。

【０００８】（発明の概要）本発明は、本発明において核内受容体スーパーファミリーのメンバーとして示
される新規核内受容体タンパク質をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレ
オチド）に関する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、この核内受容体ス
ーパーファミリーの脊椎動物メンバー、好ましくは、ヒト核内受容体タンパク質
、例えば、本明細書の全体にわたりnNR5として例示され呼称されるヒト核内受容
体タンパク質をコードする。本発明の単離されたポリヌクレオチドにコードされ
る核内受容体タンパク質は、インビボでの細胞増殖および／または細胞発生の調
節に関与する。

【０００９】本発明はまた、核内受容体スーパーファミリーに属する生物学的に活性な新規
脊椎動物核内受容体を発現するmRNAをコードする単離された核酸断片に関する。
好ましい実施形態は、nNR5の生物学的に機能的な誘導体を発現するmRNAをコード
する配列番号１の単離された核酸断片に関する。そのようないずれの核酸断片も
、少なくとも、細胞内DNA結合ドメインおよび／またはリガンド結合ドメイン、ヒト核内受容体ファミリードメインの全体にわたり保存されているドメイン [nN
R5（配列番号２）中に存在するもの]を含むタンパク質またはタンパク質断片のいずれかをコードするであろう。そのようないずれのポリヌクレオチドも、ヌク
レオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端
トランケート化を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない（これらの
突然変異は、診断用、治療用または予防用のタンパク質またはタンパク質断片を
発現するmRNAをコードし、nNR5のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関
するスクリーニングに有用であろう）。

【００１０】本発明の単離された核酸分子には、デオキシリボ核酸分子（DNA）、例えばゲノムDNAおよび相補的DNA（cDNA）[これは一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であることが可能である]、ならびに合成DNA、例えば合成された一
本鎖ポリヌクレオチドが含まれうる。また、本発明の単離された核酸分子には、
リボ核酸分子（RNA）が含まれうる。

【００１１】本発明はまた、本明細書の全体にわたり開示する実質的に精製された核酸分子
を含有する組換えベクターおよび組換え宿主（原核および真核の両方）に関する
。

【００１２】本発明の好ましい実施形態は、実質的に眼（特に、網膜）内で発現されるヒト
核内受容体タンパク質をコードする単離されたcDNA分子である。本発明の単離さ
れたcDNA分子および発現され単離された核内受容体タンパク質は、遺伝子発現の
調節に関与する。それは網膜組織内で高度に発現されるため、nNR5は眼機能にお
いて重要な役割を果たしているはずである。眼の疾患（白内障および緑内障が含
まれるが、これらに限定されるものではない）および網膜に特異的な疾患（例え
ば、糖尿病、色素性網膜炎、黄斑変性、網膜剥離および網膜芽細胞腫）に関与し
ている可能性がある網膜組織においてnNR5と相互作用しその活性を調節する治療
用化合物が選択されうる。

【００１３】本発明の特に好ましい実施形態を、図１Ａ〜Ｂおよび配列番号１（新規核内ト
ランス作用性受容体タンパク質nNR5をコードする単離されたヒトcDNA）に開示す
る。

【００１４】本発明のもう1つの好ましい態様は、図２Ａ〜Ｂおよび図３に開示し配列番号２に記載する実質的に精製された形態の新規核内トランス作用性受容体タンパク
質nNR5に関する。

【００１５】本発明のもう1つの実施形態は、配列番号１８のヌクレオチド#971〜ヌクレオチド#1847の単一のイントロンをも含有するnNR5をコードする単離されたcDNA分子に関する。

【００１６】本発明はまた、アミノ酸の置換体、欠失体、付加体、アミノ末端トランケート
化体およびカルボキシ末端トランケート化体などのnNR5の突然変異体および生物
学的に活性な断片を含む（これらに限定されるものではない）、配列番号２に記
載のnNR5の生物学的に機能的な誘導体（これらの断片は、診断用、治療用または
予防用のタンパク質またはタンパク質断片を与え、nNR5の機能のアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに有用であろう）に関する。

【００１７】本発明はまた、本明細書に開示するヒト形態のnNR5またはその生物学的に機能
的な誘導体に対して産生したポリクローナルおよびモノクローナル抗体に関する
。ヒト核内受容体スーパーファミリーに属する他の公知タンパク質に対して最低
の相同性を示すnNR5のNH₂末端ドメイン内のエピトープに対する抗体を産生させるのが特に好ましいであろう。この目的のために、本発明のDNA分子、RNA分子、
組換えタンパク質および抗体を使用して、ヒトnNR5をスクリーニングし、そのレ
ベルを測定することができる。該組換えタンパク質、DNA分子、RNA分子および抗
体は、ヒトnNR5の検出およびタイピングに適したキットの製剤化に有用である。

【００１８】本発明はまた、野生型ヒトnNR5活性をモジュレーションする化合物を同定する
ためのアッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離
された核酸分子に関する。本発明のこの形態の好ましい態様には、グルタチオン
S-トランスフェラーゼGST-nNR5融合構築物が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。これらの融合構築物には、GST遺伝子のカルボキシ末端におけるインフレーム融合体としてのそれぞれnNR5のリガンド結合ドメインの全部または一
部が含まれるが、これらに限定されるものではない。配列番号１〜２の開示は、
GST-核内受容体融合タンパク質をコードするそのような任意の核酸分子を当業者
が構築するのを可能にする。可溶性組換えGST-核内受容体融合タンパク質は、バ
キュロウイルス発現ベクター（例えば、InvitrogenからのBac-N-Blue DNAまたは
PharmingenからのpAcG2T）を使用してスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera
frugiperda）（Sf21）昆虫細胞（Invitrogen）などの種々の発現系内で発現させることができる。

【００１９】ヒトnNR5などの新規形態の核内受容体タンパク質、nNR5などの完全長タンパク
質のヒト核内受容体タンパク質断片、および配列番号２の誘導体である突然変異
体をコードする単離された核酸分子を提供することが、本発明の1つの目的である。そのようないずれのポリヌクレオチドも、ヌクレオチドの置換、欠失、付加
、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化を含むが、必
ずしもこれらに限定されるものではない（これらの突然変異は、診断用、治療用
または予防用のタンパク質またはタンパク質断片を発現するmRNAをコードし、nN
R5の機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに
有用であろう）。

【００２０】本発明のもう1つの目的は、本発明のプローブまたは抗体を使用する組織タイピングである。特定の実施形態においては、nNR5 mRNAを発現する組織を同定するためにポリヌクレオチドプローブを使用する。もう1つの実施形態においては、nNR5の発現またはnNR5受容体の提示に基づいて組織の型を同定するために、プ
ローブまたは抗体を使用することができる。

【００２１】前段落に記載の核酸分子にコードされるヒト核内受容体タンパク質またはタン
パク質断片を提供することが、本発明のもう1つの目的である。

【００２２】ヒトnNR5またはそれらの生物学的等価体をコードする核酸配列を含む組換えベ
クターおよび組換え宿主細胞を提供することが、本発明のもう1つの目的である。

【００２３】配列番号２に記載の実質的に精製された形態のnNR5を提供することが、本発明
の1つの目的である。

【００２４】アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末
端トランケート化を含む（必ずしもこれらに限定されるものではない）、nNR5の
生物学的に機能的な誘導体（これらの断片および／または突然変異体は、診断用
、治療用または予防用のタンパク質またはタンパク質断片を与える）を提供する
ことが、本発明の1つの目的である。

【００２５】 nNR5に基づくインフレーム融合構築物、これらの融合構築物および本発明で開
示する生物学的等価体を発現させる方法、関連アッセイ、これらの構築物を発現
する組換え細胞、ならびにnNR5およびnNR2などのヒト核内受容体タンパク質をコ
ードするDNA分子の使用により同定されたアゴニストおよび／またはアンタゴニスト化合物を提供することも、本発明の目的である。

【００２６】本発明で用いる「DBD」は、DNA結合ドメインを意味する。

【００２７】本発明で用いる「LBD」は、リガンド結合ドメインを意味する。

【００２８】本発明で用いる「哺乳動物宿主」なる語は、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味
する。

【００２９】（発明の詳細な記載）本発明は、核内受容体（好ましくはヒト受容体であるが、必ずしもこれに限定
されるものではない）に相当する単離された核酸およびタンパク質形態に関する
。これらの発現タンパク質は新規核内受容体であり、下流標的遺伝子とそれらの
活性を調節するリガンドとの同定に有用である。本発明の単離されたポリヌクレ
オチドにコードされる核内受容体タンパク質は、インビボでの細胞増殖および／
または細胞発生の調節に関与する。核内受容体スーパーファミリーは、化学的に
異なるリガンドにより調節される構造的に関連した受容体の一群よりなる。核内
受容体に共通の構造は、該ペプチドの中央に位置する高度に保存されたDNA結合ドメイン（DBD）、およびCOOH末端のリガンド結合ドメイン（LBD）である。9個の非変異システインのうちの8個が、他のDNA結合タンパク質から核内受容体を区
別する2つのII型ジンクフィンガーを形成する。該DBDは、脊椎動物における最も
遠いメンバー間でさえ少なくとも50％〜60％のアミノ酸配列相同性を共有する。
この10年の間に、該スーパーファミリーは、約25個のサブファミリーを含むまで
に拡張されている。いくつかの代表的なサブファミリーメンバーの全ペプチド配
列を使用するESTデータベースの検索により、核内受容体スーパーファミリーの新規メンバーの一部をコードするヒトEST（GenBank受託番号W27871; dbEST Id 5
34939; 検索はNational Center for Biotechnology Information-http://www.nc
bi.nlm.nih.gov/dbEST/index.htmlにより利用可能である）を同定した。また、ヒト網膜cDNAライブラリーとClontech（Palo Alto, CA）から商業的に入手可能な20個の主要ヒト組織に由来するmRNAから作製したライブラリーとを低いストリ
ンジェンシーでスクリーニングするためのプローブとして、アンドロゲン受容体
（AR）、エストロゲン受容体b（ERb）、グルココルチコイド受容体（GR）および
ビタミンD受容体（VDR）のDBD領域をコードするDNA断片を使用して、nNR5をコー
ドする例示されているcDNAを単離した。実験室内で構築したヒト網膜cDNAライブ
ラリーからの250,000個の一次クローンをスクリーニングすることにより、20個の陽性クローンを得た。該精製クローンの1つを直接的に配列決定することにより、配列情報を得た（図１Ａ〜Ｂ；配列番号１）。該cDNAにコードされる367アミノ酸のペプチドは、核内受容体の真正なドメイン構造を有する（図２Ａ〜Ｂ、
図３；配列番号２）。データベース検索は、非保存領域においてこのクローンと
合致する網膜ライブラリーからの他の2つのESTを示し、これらはGen Bank受託番
号W21793（dbEST Id 534939; http://www. ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ index.htm
l）およびGen Bank受託番号W21801（dbEST Id 534939; http://www. ncbi.nlm.n
ih.gov/dbEST/index.html）である。ペプチド配列レベルでnNR5に最も関連している公知遺伝子は、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子（COUP-T
F）である。タンパク質nNR5は、重複領域においてCOUP-TFに対して43％相同であ
る。ヒトnNR5をコードする遺伝子は第15染色体上に位置する。ヒトnNR5の発現は
、RT-PCRで調べた組織の大多数においては検出されなかったが、スクリーニング
の結果に基けば、それは網膜内には非常に豊富に存在する。したがって、nNR5は
核内受容体スーパーファミリー内の他のメンバーに対して低い相同性を有するた
め、nNR5は核内受容体スーパーファミリーの新規サブファミリーに相当する。

【００３０】本発明はまた、生物学的に活性な新規ヒト核内受容体を発現するmRNAをコード
するnNR5の単離された核酸断片（配列番号１）に関する。そのようないずれの核
酸断片も、少なくとも、細胞内DNA結合ドメインおよび／またはリガンド結合ドメイン、ヒト核内受容体ファミリードメインの全体にわたり保存されているドメ
イン（nNR5（配列番号２）内に存在するもの）を含むタンパク質またはタンパク
質断片のいずれかをコードするであろう。そのようないずれのポリヌクレオチド
も、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボ
キシ末端トランケート化を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない（
これらの突然変異は、診断用、治療用または予防用のタンパク質またはタンパク
質断片を発現するmRNAをコードし、nNR5の機能のアゴニストおよび／またはアン
タゴニストに関するスクリーニングに有用であろう）。

【００３１】本発明の単離された核酸分子には、デオキシリボ核酸分子（DNA）、例えばゲノムDNAおよび相補的DNA（cDNA）[これは一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であることが可能である]、ならびに合成DNA、例えば合成された一
本鎖ポリヌクレオチドが含まれうる。また、本発明の単離された核酸分子には、
リボ核酸分子（RNA）が含まれうる。

【００３２】本発明はまた、本明細書の全体にわたり開示する実質的に精製された核酸分子
を含有する組換えベクターおよび組換え宿主（原核性および真核性の両方）に関
する。

【００３３】本発明の好ましい態様を、図１Ａ〜Ｂおよび配列番号１（新規核内トランス作
用性受容体タンパク質nNR5をコードするヒトcDNA）に開示する（以下のとおり）
。

【００３４】

【化９】

【００３５】

【化１０】

【００３６】本発明はまた、図２Ａ〜Ｂおよび図３に示し配列番号２（以下に開示する）に
記載する実質的に精製された形態の新規核内受容体トランス作用性受容体タンパ
ク質nNR5に関する。

【００３７】

【化１１】

【００３８】本発明はまた、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およ
びカルボキシ末端トランケート化を含む（必ずしもこれらに限定されるものでは
ない）、配列番号２に記載のnNR5の生物学的に機能的な誘導体および／または突
然変異体（これらの突然変異は、診断用、治療用または予防用のタンパク質また
はタンパク質断片を与え、nNR5の機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トに関するスクリーニングに有用であろう）に関する。

【００３９】本発明はまた、ヒトNR5の全リーディングフレームをコードするヌクレオチド配列を含みヌクレオチド971〜ヌクレオチド1847のイントロン（以下においては下線で示され、配列番号１８に記載されている）を含有する単離されたcDNA分子
に関する。

【００４０】

【化１２】

【００４１】

【化１３】

【００４２】

【化１４】

【００４３】配列番号１８に記載のイントロン含有nNR5 cDNAは、該クローンの5’末端に追
加的な70ヌクレオチドを含有する。したがって、本発明はまた、nNR5をコードす
る単離されたポリヌクレオチドの5’末端におけるその追加的な70ヌクレオチドに加えて配列番号１のオープンリーディングフレームを含む単離されたcDNAに関
する。このヌクレオチド配列を以下に示し、配列番号１９に記載する。

【００４４】

【化１５】

【００４５】

【化１６】

【００４６】本発明はまた、野生型ヒトnNR5活性をモジュレーションする化合物を同定する
ためのアッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離
された核酸分子に関する。本発明のこの形態の好ましい態様には、グルタチオン
S-トランスフェラーゼGST-nNR5融合構築物が含まれるが、これに限定されるもの
ではない。これらの融合構築物には、GST遺伝子のカルボキシ末端におけるインフレーム融合体としてのそれぞれnNR5のリガンド結合ドメインの全部または一部
が含まれるが、これらに限定されるものではない。配列番号１〜２の開示は、GS
T-核内受容体融合タンパク質をコードするそのような任意の核酸分子を当業者が
構築するのを可能にする。可溶性組換えGST-核内受容体融合タンパク質は、バキ
ュロウイルス発現ベクター（例えば、InvitrogenからのBac-N-Blue DNAまたはPh
armingenからのpAcG2T）を使用してスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera f
rugiperda）（Sf21）昆虫細胞（Invitrogen）などの種々の発現系内で発現させることができる。

【００４７】本発明の単離された核酸分子には、デオキシリボ核酸分子（DNA）、例えばゲノムDNAおよび相補的DNA（cDNA）[これは一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であることが可能である]、ならびに合成DNA、例えば合成された一
本鎖ポリヌクレオチドが含まれうる。また、本発明の単離された核酸分子には、
リボ核酸分子（RNA）が含まれうる。

【００４８】特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには、かなりの量の重複が存在する
ことが公知である。したがって、本発明はまた、以下に示す同一アミノ酸の最終
的翻訳物をコードする代替的コドンを含むRNAをコードするDNA配列に関する。

【００４９】 A＝Ala＝アラニン：コドンGCA、GCC、GCG、GCU C＝Cys＝システイン：コドンUGC、UGU D＝Asp＝アスパラギン酸：コドンGAC、GAU E＝Glu＝グルタミン酸：コドンGAA、GAG F＝Phe＝フェニルアラニン：コドンUUC、UUU G＝Gly＝グリシン：コドンGGA、GGC、GGG、GGU H＝His＝ヒスチジン：コドンCAC、CAU I＝Ile＝イソロイシン：コドンAUA、AUC、AUU K＝Lys＝リシン：コドンAAA、AAG L＝Leu＝ロイシン：コドンUUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU M＝Met＝メチオニン：コドンAUG N＝Asp＝アスパラギン：コドンAAC、AAU P＝Pro＝プロリン：コドンCCA、CCC、CCG、CCU Q＝Gln＝グルタミン：コドンCAA、CAG R＝Arg＝アルギニン：コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU S＝Ser＝セリン：コドンAGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU T＝Thr＝トレオニン：コドンACA、ACC、ACG、ACU V＝Val＝バリン：コドンGUA、GUC、GUG、GUU W＝Trp＝トリプトファン：コドンUGG Y＝Tyr＝チロシン：コドンUAC、UAU

【００５０】したがって、本発明は、同一タンパク質を発現するDNA分子の相違をもたらしうるコドンの重複性を開示する。本明細書の目的においては、1以上の置換コドンを保持する配列を縮重変異体と定義する。また、発現されるタンパク質の最終
的な物理的特性を実質的に改変しない、DNA配列または翻訳されたタンパク質における突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンからバリン、
リシンからアルギニン、またはグルタミンからアスパラギンへの置換は、該ポリ
ペプチドの官能性における変化を引き起こさないであろう。

【００５１】あるペプチドをコードするDNA配列は、その天然に存在するペプチドとは異なる特性を有するペプチドをコードするように改変されうることが公知である。DN
A配列の改変方法には、部位特異的突然変異誘発が含まれるが、これに限定されるものではない。改変される特性には、例えば、基質に対する酵素の又はリガン
ドに対する受容体のアフィニティーの変化が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。

【００５２】本発明で用いる「精製（された）」および「単離（された）」は、問題の核酸
、タンパク質またはそれらのそれぞれの断片が、そのインビボ環境から実質的に
取り出されていて、それが当業者により種々の手段（例えば、核酸断片に関する
ヌクレオチドの配列決定、制限消化、部位特異的突然変異誘発および発現ベクタ
ー中へのサブクローニング、ならびにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
の産生の機会を与える純粋な相当量のタンパク質またはタンパク質断片の入手、
アミノ酸の配列決定およびペプチドの消化が挙げられるが、これらに限定される
ものではない）で操作されうることを表すために互換的に使用する。したがって
、本発明で特許請求する核酸は、全細胞中または細胞ライセート中または部分的
に精製された若しくは実質的に精製された形態中に存在することが可能である。
核酸は、それが周囲の混入物から精製されている場合に、実質的に精製されてい
るとみなされる。したがって、細胞から単離された核酸配列は、標準的な方法に
より細胞成分から精製されている場合に、実質的に精製されているとみなされ、
一方、化学合成された核酸配列は、その化学前駆体から精製されている場合に、
実質的に精製されているとみなされる。

【００５３】本発明はまた、本明細書の全体にわたり開示する実質的に精製された核酸分子
を含有する組換えベクターおよび組換え宿主（原核および真核の両方）に関する
。

【００５４】したがって、本発明はまた、nNR5およびその生物学的等価体（本発明で開示す
るもの）を発現させる方法、組換え的に発現されたこれらの遺伝子産物を使用す
るアッセイ、これらの遺伝子産物を発現する細胞、ならびにこれらの組換え形態
を利用するアッセイの使用により同定されたアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニスト化合物［LBDとの直接的接触を介する、またはDBDまたは野生型転写複合体
（これは、nNR5がトランスで相互作用し、それにより細胞分化または細胞発生を
モジュレーションするものである）と相互作用するリガンドとの直接的もしくは
間接的接触を介する、ヒトnNR5の1以上のモジュレーターを含むが、これらに限定されるものではない］に関する。

【００５５】本発明で用いる、野生型ヒトnNR5の「生物学的に機能的な誘導体」は、野生型
ヒトnNR5の生物活性に関連した生物活性を有する。「機能的（な）誘導体」なる
語は、野生型ヒトnNR5タンパク質の「断片」、「突然変異体」、「変異体」、「
縮重変異体」、「類似体」および「ホモログ」を包含する意である。「断片」な
る語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化および／また
はカルボキシ末端トランケート化を含むnNR5タンパク質を含む（これらに限定さ
れるものではない）野生型ヒトnNR5の任意のポリペプチドサブセットを意味する
。「突然変異体」なる語は、野生型形態に実質的に類似していることがあるが異
なる生物学的特性を有する生物学的に活性な断片のサブセットを意味する。その
ような改変された特性には、改変された基質結合性、改変された基質アフィニテ
ィー、およびヒトnNR5またはヒトnNR5機能的誘導体の生物活性に影響を及ぼす化
合物に対する改変された感受性が含まれるが、これらに限定されるものではない
。「変異体」なる語は、構造および機能において全野生型タンパク質またはその
断片に実質的に類似している分子を意味する。ある分子が野生型ヒトnNR5様タン
パク質に「実質的に類似」しているのは、両方の分子が、実質的に類似した構造
を有する場合、または両方の分子が、類似した生物活性を有する場合である。し
たがって、それらの2つの分子が、実質的に類似した活性を有する場合には、それらの分子の一方の構造が他方において見出されない場合であっても、あるいは
それらの2つのアミノ酸配列が同一でない場合であっても、それらは変異体であるとみなされる。「類似体」なる語は、完全長ヒトnNR5タンパク質またはその生
物学的に機能的な誘導体に機能において実質的に類似している分子を意味する。

【００５６】ヒトnNR5をクローニングするためには、種々の方法のいずれかを用いることが
可能である。これらの方法には、以下の技術が含まれるが、これらに限定される
ものではない。（1）RACE PCRクローニング技術（Frohmanら, 1988, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 85:8998-9002）。完全長cDNA配列を得るために、5’および／
または3’RACEを行なうことができる。この方法は、ヒトnNR5 cDNAのPCR増幅用の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴う。これらの遺伝子特
異的プライマーは、公に利用可能な多数の核酸およびタンパク質データベースを
検索することにより同定されたEST（発現しているタグ配列）ヌクレオチド配列の同定を介して設計する。（2）適当な発現ベクター系におけるヒトnNR5含有cDN
Aライブラリーの構築後のヒトnNR5 cDNAの直接機能発現。（3）ヒトnNR5タンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによる、
バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトnNR5
含有cDNAライブラリーのスクリーニング。（4）ヒトnNR5タンパク質をコードする部分cDNAによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に
構築されたヒトnNR5含有cDNAライブラリーのスクリーニング。この部分cDNAは、
ヒトnNR5タンパク質に関連した他のキナーゼに関して知られているアミノ酸配列
からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計による、ヒトnNR5 DNA断片の特
異的PCR増幅により得られる。（5）ヒトnNR5タンパク質をコードする部分cDNAに
よる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒ
トnNR5含有cDNAライブラリーのスクリーニング。この方法はまた、前記のとおり
にESTとして同定されたヒトnNR5 cDNAのPCR増幅用の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うことがある。（6）鋳型として配列番号１を使用することによる、5’および3’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの設計。それに
より、該完全長cDNAを公知PCR技術により作製するか、あるいは該コード領域の一部を、これらの同じ公知PCR技術により作製して、cDNAおよび／またはゲノムライブラリーの多数の型の1つをスクリーニングするためのプローブとして使用するコード領域の一部を作製し単離して、ヒトnNR5をコードするヌクレオチド分
子の完全長形態を単離することが可能である。

【００５７】 nNR5をコードするDNAまたはnNR5ホモログを単離するためには、他の型のライブラリーおよび他の細胞型または種型から構築したライブラリーが有用かもしれ
ないことが、当業者に容易に認められる。他の型のライブラリーには、ヒトの細
胞または組織以外の他の細胞または細胞系（例えば、マウス細胞、げっ歯類細胞
、あるいはnNR5をコードするDNAを含有しうる他の任意の脊椎動物宿主）に由来するcDNAライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに
、nNR5遺伝子およびホモログは、脊椎動物ゲノムライブラリー、例えばマウスゲ
ノムライブラリー、げっ歯類ゲノムライブラリーおよび付随するヒトゲノムDNA ライブラリーなど（これらに限定されるものではない）の、オリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーションスクリーニングにより
単離することが可能である。

【００５８】 nNR5活性を有する細胞または細胞系から適当なcDNAライブラリーが調製されう
ることは、当業者に容易に認められる。nNR5をコードするcDNAの単離用のcDNAラ
イブラリーの調製に使用するための細胞または細胞系の選択は、まず、細胞関連
nNR5活性を測定する（これは、そのような目的に利用可能な公知の任意のアッセ
イを用いて行なうことができる）ことにより行なうことができる。

【００５９】 cDNAライブラリーの調製は、当技術分野でよく知られた標準的な技術により行
なうことができる。よく知られたcDNAライブラリー構築技術は、例えば、Sambro
okら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されている。また、相補的DNA
ライブラリーは、Clontech Laboratories, Inc.およびStratageneを含む（これらに限定されるものではない）多数の商業的起源から入手することができる。

【００６０】また、ヒトnNR5をコードするDNAは、適当なゲノムDNAライブラリーからも単離
されうることが、当業者に容易に認められる。ゲノムDNAライブラリーの構築は、当技術分野でよく知られた標準的な技術により行なうことができる。よく知ら
れたゲノムDNAライブラリー構築技術は、Sambrookら（前掲）に記載されている。

【００６１】これらの好ましい方法の1つによりヒトnNR5遺伝子をクローニングするためには、ヒトnNR5または相同タンパク質のアミノ酸配列またはDNA配列が必要かもしれない。これを達成するために、nNR5タンパク質または相同タンパク質を精製し
、自動シークエネーターにより部分アミノ酸配列を決定することができる。全ア
ミノ酸配列を決定することは必ずしも必要でないが、部分ヒトnNR5 DNA断片のPC
R増幅のために、6〜8アミノ酸の2つの領域の直列（linear）配列を決定すること
が可能である。適当なアミノ酸配列を同定したら、それらをコードしうるDNA分子を合成する。遺伝暗号は縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに
2以上のコドンが使用されうる。したがって、該アミノ酸配列は、類似したDNAオ
リゴヌクレオチドの任意のセットによりコードされうる。該セットの1つのメンバーだけがヒトnNR5配列と同一になるであろう。しかし、該セットのその他のメ
ンバーは、ミスマッチを有するDNAオリゴヌクレオチドの存在下であっても、ヒトnNR5 DNAにハイブリダイズしうるであろう。そのミスマッチDNAオリゴヌクレオチドは、それでもなお、ヒトnNR5をコードするDNAの同定および単離を可能にするのに十分な程度にヒトnNR5 DNAにハイブリダイズしうる。あるいは、利用可
能な1以上のゲノムデータベースを検索することにより、発現される配列の領域のヌクレオチド配列を同定することができる。cDNAライブラリーまたはcDNA集団
から、関心のあるcDNAのPCR増幅を行なうためには、遺伝子特異的プライマーを使用することができる。前記のとおり、PCRに基づく方法で使用するための適当なヌクレオチド配列は、配列番号１から得ることが可能であり、これらを使用し
て、重複する5’および3’ RACE産物を単離し、ヒトnNR5をコードする完全長配列を作製したり、あるいはヒトnNR5をコードするヌクレオチド配列の一部を単離
して、cDNAまたはゲノムに基づくライブラリーの1以上をスクリーニングするためのプローブとして使用して、ヒトnNR5またはヒトnNR5様タンパク質をコードす
る完全長配列を単離することが可能である。

【００６２】例示する方法においては、本発明において配列番号３として識別されるヒトES
Tに対するオリゴヌクレオチドプライマー対でヒト網膜cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のヒトnNR5完全長cDNAを単離した。陽性cDNA
クローンを配列決定したところ、それはイントロンを含有することが示された。
このcDNAを配列分析に付し、本明細書に開示し、配列番号１８として記載する。
推定イントロンに隣接する第2のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して、該ヒト網膜cDNAライブラリーを再スクリーニングした。より短いcDNAクローン（
約2.1kb）を配列分析のために選択した。それらは、ヒトnNR5（配列番号２）をコードする連続的なオープンリーディングフレーム（例えば、配列番号１）を含
むことが示された。配列番号１８に開示するイントロン含有クローンは、該cDNA
クローンの5’末端に追加的な70ヌクレオチドを含有する。したがって、本発明の追加的な単離されたDNA分子には、本明細書に記載し配列番号１９に記載するD
NA分子が含まれるが、これに限定されるものではない。

【００６３】哺乳類細胞中で組換えヒトnNR5を発現させるためには、種々の哺乳類発現ベク
ターを使用することができる。発現ベクターは、本発明では、適当な宿主におけ
るクローン化DNAの転写およびそれらのmRNAの翻訳に必要なDNA配列と定義される
。そのようなベクターを使用して、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、動物細
胞などの種々の宿主中で真核性DNAを発現させることができる。特別に設計されたベクターは、細菌-酵母または細菌-動物細胞などの宿主間のDNAの往復（シャトル）を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内での自律複
製のための複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、潜在的な高
コピー数および活性なプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、RNA ポリメラーゼがDNAに結合しRNA合成を開始するのを指令するDNA配列と定義される。強力なプロモーターは、mRNAの高頻度の開始をもたらすものである。発現ベ
クターには、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に
設計されたプラスミドまたはウイルスを含めることができるが、これらに限定さ
れるものではない。

【００６４】組換えヒトnNR5の発現に適している可能性がある商業的に入手可能な哺乳類発
現ベクターには、pcDNA3.1（Invitrogen）、pLITMUS28、pLITMUS29、pLITMUS38 およびpLITMUS39（New England Bioloabs）、pcDNAI、pcDNAIamp（Invitrogen）
、pcDNA3（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5 （Stratagene）、EBO-pSV2-neo（ATCC37593）、pBPV-1(8-2)（ATCC37110）、pdB
PV-MMTneo(342-12）（ATCC37224）、pRSVgpt（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC3719
8）、pSV2-dhfr（ATCC37146）、pUCTag（ATCC37460）およびlZD35（ATCC37565）
が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００６５】細菌細胞中で組換えヒトnNR5を発現させるためには、種々の細菌発現ベクター
を使用することができる。組換えヒトnNR5の発現に適している可能性がある商業
的に入手可能な細菌発現ベクターには、pCRII（Invitrogen）、pCR2.1（Invitro
gen）、pQE（Qiagen）、pET11a（Novagen）、ラムダgt11（Invitrogen）およびp
KK223-3（Pharmacia）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００６６】真菌細胞中で組換えヒトnNR5を発現させるためには、種々の真菌細胞発現ベク
ターを使用することができる。組換えヒトnNR5の発現に適している可能性がある
商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターには、pYES2（Invitrogen）およびピチア（Pichia）発現ベクター（Invitrogen）が含まれるが、これらに限定される
ものではない。

【００６７】昆虫細胞中で組換え受容体を発現させるためには、種々の昆虫細胞発現ベクタ
ーを使用することができる。ヒトnNR5の組換え発現に適している可能性がある商
業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターには、pBlueBacIIIおよびpBlueBacHis2 （Invitrogen）、およびpAcG2T（Pharmingen）が含まれるが、これらに限定され
るものではない。

【００６８】組換え宿主細胞中でヒトnNR5を発現させるためには、ヒトnNR5様タンパク質を
コードするDNAを含有する発現ベクターを使用することができる。組換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり、それらには、大腸菌（E. c
oli）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるものではない）哺乳類細胞、および
ショウジョウバエ（Drosophila）およびカイコに由来する細胞系を含む（これら
に限定されるものではない）昆虫細胞が含まれる。商業的に入手可能であり適し
ている可能性がある哺乳類種に由来する細胞系には、L細胞L-M(TK^-)（ATCC CCL1
.3）、L細胞L-M（ATCC CCL1.2）、Saos-2（ATCC HTB-85）、293（ATCC CRL 1573
）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL 1650）、CO
S-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3
（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS-C-1（A
TCC CCL 26）、MRC-5（ATCC CCL 171）およびCPAE（ATCC CCL 209）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００６９】該発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合お
よびエレクトロポレーションを含む（これらに限定されるものではない）多数の
技術のいずれか1つにより宿主細胞中に導入することができる。該発現ベクター含有細胞を個々に分析して、それらがヒトnNR5タンパク質を産生するか否かを判
定する。ヒトnNR5を発現する細胞の同定は、抗ヒトnNR5抗体に対する免疫反応性
、標識リガンドの結合性および宿主細胞関連ヒトnNR5活性の存在の判定を含む（
これらに限定されるものではない）いくつかの手段により行なうことができる。

【００７０】前記の方法により得たクローン化ヒトnNR5 cDNAを、適当なプロモーターと他の適当な転写調節要素とを含有する発現ベクター（例えば、pcDNA3.1、pQE、pBl
ueBacHis2およびpLITMUS28）中への分子クローニングにより組換え的に発現させ
、原核性または真核性宿主細胞中に導入して、組換えヒトnNR5を産生させること
ができる。そのような操作のための技術は、Sambrookら（前掲）に記載されてお
り、実施例の部において詳細に記載されており、当業者によく知られており容易
に利用されうる。

【００７１】また、ヒトnNR5 DNAの発現は、インビトロで得た合成mRNAを使用して行なうこ
とができる。合成mRNAは、コムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を含む（こ
れらに限定されるものではない）種々の無細胞系中で効率的に翻訳されることが
可能であり、また、細胞に基づく系（カエル卵母細胞中へのマイクロインジェク
ションを含む）内で効率的に翻訳されることが可能であり、カエル卵母細胞中へ
のマイクロインジェクションが好ましい。

【００７２】最適レベルのヒトnNR5を与えるヒトnNR5 cDNA配列を決定するために、以下のものを含む（これらに限定されるものではない）cDNA分子を構築することができ
る：ヒトnNR5の完全長オープンリーディングフレームを含有するcDNA断片、およ
び該タンパク質の特異的ドメインまたは該タンパク質の再編成ドメインだけをコ
ードするcDNA部分を含有する種々の構築物。すべての構築物は、ヒトnNR5 cDNA の5’および／または3’非翻訳領域の全部または一部を含有するように或いはそ
れらを全く含有しないように設計することができる。ヒトnNR5の発現レベルおよ
び活性は、これらの構築物を単独で又は組合せて適当な宿主細胞中に導入した後
に測定することができる。一過性アッセイにおいて最適な発現を与えるヒトnNR5
cDNAカセットを決定した後、このnNR5 cDNA構築物を、哺乳類細胞、植物細胞、
昆虫細胞、卵母細胞、細菌および酵母細胞における発現のための発現ベクターを
含む（これらに限定されるものではない）種々の発現ベクター（組換えウイルス
を含む）に導入する。

【００７３】本発明はまた、本明細書に開示するヒト形態のnNR5またはその生物学的に機能
的な誘導体に対して産生したポリクローナルおよびモノクローナル抗体に関する
。ヒト核内受容体スーパーファミリーに属する他の公知タンパク質に対して最低
の相同性を示すnNR5のNH₂末端ドメイン内のエピトープに対する抗体を産生させるのが特に好ましいであろう。

【００７４】完全長nNR5タンパク質に又はnNR5タンパク質のポリペプチド断片に特異的なモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体で作製されたイムノアフィニティーカラ
ムの使用により、他の細胞タンパク質から組換えnNR5タンパク質を分離すること
ができる。さらに、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、配列番号２に
開示するタンパク質の一部に由来する合成ペプチド（通常、約9〜約25アミノ酸長）に対して産生させることができる。ヒトnNR5に対する単一特異性抗体は、ヒ
トnNR5に対して反応性の抗体を含有する哺乳類抗血清から精製したり、あるいは
KohlerおよびMilstein（1975, Nature 256:495-497）の技術を用いてヒトnNR5に
対して反応性のモノクローナル抗体として調製する。本発明で用いる単一特異性
抗体は、ヒトnNR5に対して均一な結合特性を有する複数の抗体種または単一の抗
体種と定義される。本発明で用いる均一な結合は、ある特定の抗原またはエピト
ープ（例えば、前記のヒトnNR5に伴うもの）に該抗体種が結合しうることを意味
する。ヒトnNR5特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウ
マなどの動物を、免疫アジュバントの存在下または不存在下で、適当な濃度のヒ
トnNR5タンパク質またはヒトnNR5の一部から作製した合成ペプチドで免疫するこ
とにより産生させる。

【００７５】初回免疫の前に、免疫前血清を集める。各動物に、許容される免疫アジュバン
トと共に約0.1mg〜約1000mgのヒトnNR5タンパク質を投与する。そのような許容されるアジュバントには、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿
物、油中水型エマルション（コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium
parvum）およびtRNAを含有するもの）が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。初回免疫は、好ましくはフロイント完全アジュバント中のヒトnNR5タン
パク質またはそれらのペプチド断片を複数部位において皮下（SC）、腹腔内（IP
）またはその両方に投与することよりなる。各動物から一定間隔で（好ましくは
毎週）採血して、抗体力価を測定する。初回免疫後、該動物は、ブースター注射
を受けても受けなくてもよい。ブースター注射を受ける動物には、一般には、フ
ロイント不完全アジュバント中の等量のヒトnNR5を同一経路で与える。ブースタ
ー注射は、最大力価が得られるまで約3週間間隔で行なう。各ブースター免疫の約7日後、または単回免疫後にほぼ毎週、該動物から採血し、血清を集め、アリコートを約-20℃で保存する。

【００７６】ヒトnNR5に対して反応性のモノクローナル抗体（mAb）は、近交系マウス、好ましくはBalb/cをヒトnNR5タンパク質で免疫することにより調製する。約0.5ml のバッファーまたは食塩水中の約1mg〜約100mg、好ましくは約10mgのヒトnNR5タ
ンパク質を等容積の許容される前記アジュバント中に含むもので、該マウスをIP
またはSC経路により免疫する。フロイント完全アジュバントが好ましい。該マウ
スは、0日に初回免疫を受け、約3〜約30週間休ませる。免疫マウスには、リン酸
緩衝食塩水などのバッファー溶液中の約1〜約100mgのヒトnNR5のブースター免疫
を静脈内（IV）経路により1回以上行なう。当技術分野で公知の標準的な方法により免疫マウスから脾臓を摘出することにより、抗体陽性マウスからリンパ球、
好ましくは脾リンパ球を得る。安定なハイブリドーマの形成を許容する条件下で
該脾リンパ球と適当な融合相手（好ましくは、骨髄腫細胞）とを混合することに
より、ハイブリドーマ細胞を産生させる。融合相手には、マウス骨髄腫P3/NS1/A
g4-1、MPC-11、S-194およびSp2/0（これらに限定されるものではない）が含まれ
うるが、Sp2/0が好ましい。該抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを、約30％〜約50％の濃度で分子量約1000のポリエチレングリコール中で融合させる。当技術分野で
公知の方法により、融合ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジンおよ
びアミノプテリンで補足されたダルベッコ変法イーグル基礎培地（DMEM）中での
増殖により選択する。上清流体を、約14、18および21日の増殖陽性ウェルから集
め、該抗原としてヒトnNR5を使用する固相イムノラジオアッセイ（SPIRA）などのイムノアッセイにより抗体産生に関してスクリーニングする。また、該培養流
体をオクタロニー沈降アッセイにおいて試験して、該mAbのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、MacPherson, 1973, Soft A
gar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, KruseおよびPate
rson編, Academic Pressの軟寒天技術などの技術によりクローニングする。

【００７７】約2×10⁶〜約6×10⁶のハイブリドーマ細胞を、プリスタン処理Balb/cマウスに
処理の約４日後に注射（約0.5ml/マウス）することにより、モノクローナル抗体
をインビボで産生させる。細胞導入の約8〜12日後に腹水を集め、該モノクローナル抗体を、当技術分野で公知の技術により精製する。

【００７８】約2％ウシ胎仔血清を含有するDMEM中で該ハイブリドーマを増殖させることにより、抗ヒトnNR5 mAbのインビトロ産生を行なって、十分な量の該特異的mAbを得る。当技術分野で公知の技術により、該mAbを精製する。

【００７９】腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を、沈降法、受身凝集反応、酵素
結合抗体免疫吸着（ELISA）技術およびラジオイムノアッセイ（RIA）技術を含む
（これらに限定されるものではない）種々の血清学的または免疫学的アッセイに
より測定する。体液または組織および細胞抽出物中のヒトnNR5の存在を検出する
ために、同様のアッセイを用いる。

【００８０】単一特異的抗体を産生させるための前記方法を用いて、ヒトnNR5ペプチド断片
あるいは完全長ヒトnNR5に特異的な抗体を産生させることが可能である、と当業
者に容易に認められる。

【００８１】例えば該抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにN-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されたゲル支持体であるAffigel-
10（Biorad）に該抗体を加えることにより、ヒトnNR5抗体アフィニティーカラム
を作製する。ついで該抗体を、スペーサーアームでアミド結合を介して該ゲルに
結合させる。ついで、残存する活性化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8.0
）でクエンチする。該カラムを水、ついで0.23MグリシンHCl（pH2.6）で洗浄して、未コンジュゲート化抗体または外来タンパク質を除去する。ついで該カラム
をリン酸緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、完全長ヒトnNR5またはヒトnNR5タンパク質断片を含有する細胞培養上清または細胞抽出物を、該カラムにゆっくり
通過させる。ついで、光学密度（A₂₈₀）がバックグラウンドに低下するまで、該
カラムをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ついで該タンパク質を0.23Mグリシン-HCl （pH2.6）で溶出する。ついで該精製ヒトnNR5タンパク質を、リン酸緩衝食塩水に対して透析する。

【００８２】宿主細胞中のヒトnNR5のレベルは、イムノアフィニティーおよび／またはリガ
ンドアフィニティー技術を含む（これらに限定されるものではない）種々の技術
により定量する。nNR5特異的アフィニティービーズまたはnNR5特異的抗体を使用
して、³⁵S-メチオニン標識または未標識nNR5を単離する。標識nNR5タンパク質を
SDS-PAGEにより分析する。未標識nNR5タンパク質は、nNR5タンパク質に特異的な
抗体および／または抗ホスホチロシン抗体を使用するウエスタンブロット法、EL
ISAまたはRIAアッセイにより検出する。

【００８３】宿主細胞中でnNR5を発現させた後、nNR5タンパク質を回収して、活性形態のnN
R5タンパク質を得ることができる。いくつかのnNR5タンパク質精製方法が利用可
能であり、使用に適している。塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ
排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよ
び疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は単独の適用により、細
胞ライセートおよび抽出物から、または馴らし培地から、組換えnNR5タンパク質
を精製することができる。

【００８４】本発明はまた、ヒトnNR5タンパク質をコードするDNAまたはRNAの発現をモジュ
レーションする化合物に関するスクリーニング方法に関する。これらの活性をモ
ジュレーションする化合物は、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質または非タンパ
ク質性有機分子であってもよい。化合物は、ヒトnNR5をコードするDNAまたはRNA
の発現あるいはヒトnNR5の機能を増強または減弱させることによりモジュレーシ
ョンしうる。ヒトnNR5をコードするDNAまたはRNAの発現あるいはその生物学的機
能をモジュレーションする化合物は、種々のアッセイにより検出することができ
る。該アッセイは、発現または機能の変化が存在するか否かを判定するための単
純な「イエス／ノー（yes/no）」アッセイであってもよい。試験サンプルの発現
または機能を標準サンプルにおける発現または機能のレベルと比較することによ
り、該アッセイを定量的なものとすることができる。ヒトnNR5、ヒトnNR5に対す
る抗体、または修飾されたヒトnNR5を含有するキットの製造は、そのような用途
のための公知方法により行なうことができる。

【００８５】本発明のDNA分子、RNA分子、組換えタンパク質および抗体を使用して、ヒトnN
R5をスクリーニングし、そのレベルを測定することができる。該組換えタンパク
質、DNA分子、RNA分子および抗体は、ヒトnNR5の検出およびタイピング（typing
）に適したキットの製剤化に有用である。そのようなキットは、少なくとも1つの容器を密閉的（close confinement）に収容するのに適した区画化された担体を含むであろう。該担体は更に、試薬（例えば、組換えヒトnNR5、またはヒトnN
R5の検出に適した抗nNR5抗体）を含むであろう。また、該担体は、標識抗原また
は酵素基質などの検出手段を含有していてもよい。

【００８６】ヒトnNR5のモジュレーターを含む医薬上有用な組成物は、医薬上許容される担
体の混合などの公知方法に従い製剤化することができる。製剤化のそのような担
体および方法の具体例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されて
いる。有効な投与に適した医薬上許容される組成物を形成させるためには、その
ような組成物は、該タンパク質、DNA、RNA、修飾ヒトnNR5、あるいはnNR5アゴニ
ストまたはアンタゴニストの有効量を含有するであろう。

【００８７】 nNR5のモジュレーターを含む治療用または診断用組成物は、障害を治療または
診断するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別
、年齢などの種々の因子によって様々となりうる。他の因子には、投与様式が含
まれる。

【００８８】該医薬組成物は、皮下、局所、経口、筋肉内などの種々の経路により個体に投
与することができる。

【００８９】「化学誘導体」なる語は、通常は該基礎分子の一部ではない追加的な化学的部
分を含有する分子を意味する。そのような部分は、該基礎分子の溶解性、半減期
、吸収性などを改善しうる。あるいは、該部分は、該基礎分子の望ましくない副
作用を減弱させたり、あるいは該基礎分子の毒性を減少させうる。そのような部
分の具体例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどの種々の刊行物に記
載されている。

【００９０】本明細書に開示する方法に従い同定された化合物は、適当な用量で単独で使用
することができる。あるいは、他の物質の同時投与または連続投与が望ましいか
もしれない。

【００９１】また、本発明は、本発明の新規治療方法において使用するための適当な局所、
経口、全身および非経口医薬製剤を提供するという目的を有する。本発明に従い
同定された化合物を有効成分として含有する組成物は、通常の投与用ビヒクル中
の多種多様な治療用剤形で投与することができる。例えば、該化合物は、錠剤、
カプセル剤（それぞれは時限放出（timed release）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳
剤などの経口剤形として又は注射により投与することができる。同様に、それら
を、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（occlus
ion）の存在下または不存在下）または筋肉内形態として投与することも可能であり、それらはすべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いることが可
能である。

【００９２】本発明の化合物を単回1日量で投与したり、あるいは合計1日量を、2、3または
4分割量で毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、本発明のための化合物は、適当な鼻腔内ビヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によ
く知られた経皮皮膚パッチの形態を使用して経皮経路により投与することができ
る。もちろん、経皮デリバリーシステムの形態で投与する場合には、該投与量の
投与は、該投与計画の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなる
であろう。

【００９３】別々の投与製剤中の2以上の活性剤での組合せ療法の場合には、該活性剤を同時に投与したり、あるいはそれらのそれぞれを、別々にずらした時点で投与する
ことができる。

【００９４】本発明の化合物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別
および医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓
血管機能；および使用するその個々の化合物を含む種々の因子に応じて選択され
る。通常の技量を有する医師または獣医は、該状態の進行の予防、阻止または停
止に必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うこ
となく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に
対する薬物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、
薬物の分布、平衡および排泄に関する考慮を含む。

【００９５】以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。

【００９６】実施例１ nNR5をコードするDNA分子の単離および特徴づけデータベースの検索中に、ヒト網膜cDNAライブラリーからのESTを同定した。このESTは、GenBank受託番号W27871およびdbEST Id No.534939として識別され、
これを以下に開示する。

【００９７】

【化１７】

【００９８】アンドロゲン受容体（AR）、エストロゲン受容体b（ERb）、グルココルチコイ
ド受容体（GR）およびビタミンD受容体（VDR）のDBD領域をコードするDNA断片を
PCRにより作製し、pCRクローニングベクター内に、該製造業者が記載していると
おりにサブクローニングした。プラスミドのサブクローニング用の断片を得るた
めに、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。

【００９９】

【化１８】

【０１００】 AR、ERbおよびGRに関するPCR鋳型は、ヒト胎児脳mRNAから作製したcDNAである
。VDRに関するPCR鋳型は、ヒト小腸mRNAから作製したcDNAであった。Qiagenゲル
抽出キットを使用して該DNA断片を精製した。該精製DNAのリン酸化、自己連結お
よび形質転換を、該製造業者が推奨しているとおりに行なった。前記のAR、Erb 、GRおよびVDRのDBD領域をプローブとして使用して、ヒト網膜cDNAライブラリー
を低いストリンジェンシーでスクリーニングした。２個の陽性クローンを選択し
、配列分析に付したところ、本明細書に示し配列番号１８に記載するイントロン
の存在が示された。クローンA8およびA9からのプラスミドDNAの直接配列決定は、hCOUP-TF（Wangら, 1989, Nature 340:163-166）に最も関連しているペプチド
をコードする3,012bp長の完全なcDNA分子（配列番号１８）を示した。これらのc
DNAクローンは、ヒトEST（GenBank受託番号W27871およびdbEST Id No.534939; 配列番号３）に対する相同性を示した。

【０１０１】 nNR5に関するイントロン無しのcDNAクローンを単離するために、該ヒト網膜cD
NAライブラリーを、ヒトEST（GenBank受託番号W27871およびdbEST Id No.534939
；配列番号３）に由来するプライマー対nNR5F2（5’-ATGAGCTCCACAGTGGCTGC-3’
；配列番号４）およびnNR5R（5’-CTGTCTCCGCACACGCGGCA-3’；配列番号５）を使用するPCR分析によりスクリーニングした。網膜cDNA上でnNR5F2/nNR5Rを使用するPCRによる該網膜cDNAライブラリーの更なるスクリーニングは、約250,000個
の一次クローンから合計20個の陽性クローンを与えた。このデータは、関心のあ
る遺伝子（最終的には、ヒトnNR5をコードするcDNAとして同定された）が網膜組
織内で豊富に発現されることを示した。厳密なイントロン-エキソン境界を定め、イントロン無しのcDNAを単離するために、推定イントロン領域に隣接するプラ
イマー対R5F3（5’-CTGATGAGAATATTGATGT-3’；配列番号１４）およびR5R4（5’
-CGTGAGCCGGCCCTGGGCA-3’；配列番号１５）を、その20個の陽性クローンに関す
るPCRにおいて使用した。2個のクローンE1およびF6が、イントロンを有するA8よ
り小さなサイズのバンドを与えた。このPCRからのDNA断片を精製し、配列決定の
ために提出した。SEQUENCHER（登録商標）3.0（Gene Codes Corporation, Ann A
rbor, MI）で自動配列決定ならびに配列の合体および分析を行なった。配列の読
取りにおける自動塩基呼出し間のアンビギュイティーおよび／または相違を視覚
的に検査し、正しい塩基呼出しに訂正した。配列決定の結果およびタンパク質配
列のアライメントに基づき、元のA8/A9クローンにおけるイントロン領域をヌクレオチド971〜1847と同定した。したがって、イントロンを有さない完全長cDNA は約2.1kbである。ヒトnNR5をコードするこのDNA分子を図１Ａ〜１Ｂに示し、配
列番号１に記載する。

【０１０２】 nNR5のゲノム地図の位置を同定するために、3’非コード領域内のプライマーを設計した。フォワードプライマーR5F9（5’-GGCATGGACCTCACTGAAGA-3’; 配列
番号１６）およびリバースプライマーR5R10（5’-ACTGGCAGGAACCTGTTATA-3’；配列番号１７）を、Stanford放射線ハイブリッドパネル（Coxら, 1990, Science
, 250:245-250）の83個のクローンに関するPCRスキャニング（sanning）において使用した。該PCRの結果を得点化し、連鎖解析のためにStanford Genome Cente
rに提出した。結果は、nNR5が第15染色体上に位置することを示している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ヒト核内受容体タンパク質nNR5をコードするオープンリーディングフレームを
含むヌクレオチド配列（配列番号（SEQ. ID NO:）１）を示す。

【図１Ｂ】ヒト核内受容体タンパク質nNR5をコードするオープンリーディングフレームを
含むヌクレオチド配列（配列番号（SEQ. ID NO:）１）を示す。

【図２Ａ】 nNR5をコードする単離されたcDNA分子（配列番号１）のコード鎖、およびnNR5
のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。太字の領域はDNA結合ドメインである。

【図２Ｂ】 nNR5をコードする単離されたcDNA分子（配列番号１）のコード鎖、およびnNR5
のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。太字の領域はDNA結合ドメインである。

【図３】図３は、nNR5のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。太字の領域はDNA結合ドメインである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA09 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 GA11 HA11 HA13 HA14 HA19 4B064 AG20 CA01 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA58X AA72X AA88X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列【化１】（配列番号２では3文字の略号で記載されている）を含むヒトnNR5タンパク質をコードする精製されたDNA分子。
【請求項２】請求項１に記載のDNA分子を含んでなる、組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項３】請求項２に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒトnNR5
タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項４】組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるための
方法であって、（a）請求項２に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトランスフェクトし、（b）該発現ベクターからの該ヒトnNR5タンパク質の発現を可能にする条件下、工程（a）の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項５】アミノ酸配列【化２】（配列番号２では3文字の略号で記載されている）よりなるヒトnNR5タンパク質をコードする精製されたDNA分子。
【請求項６】請求項５に記載のDNA分子を含んでなる、組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項７】請求項６に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒトnNR5
タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項８】組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるための
方法であって、（a）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトランスフェクトし、（b）該発現ベクターからの該ヒトnNR5タンパク質の発現を可能にする条件下、工程（a）の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項９】ヌクレオチド配列（配列番号１に記載のとおり）【化３】【化４】を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質をコードする精製されたDNA分子。
【請求項１０】配列番号１のヌクレオチド154〜ヌクレオチド約1257を含む、請求項９に記載のDNA分子。
【請求項１１】請求項９に記載のDNA分子を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項１２】請求項１１に記載のDNA分子を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項１３】請求項１１に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒト
nNR5タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１４】請求項１２に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒト
nNR5タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１５】組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるため
の方法であって、（a）請求項１１に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトランスフェクトし、（b）該発現ベクターからの該ヒトnNR5タンパク質の発現を可能にする条件下、工程（a）の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項１６】ヌクレオチド配列（配列番号１に記載のとおり）【化５】【化６】（配列番号１）よりなる、ヒトnNR5タンパク質をコードする精製されたDNA分子。
【請求項１７】配列番号１のヌクレオチド154〜ヌクレオチド約1257よりなる、請求項１６に記載のDNA分子。
【請求項１８】請求項１６に記載のDNA分子を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項１９】請求項１７に記載のDNA分子を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項２０】請求項１８に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒト
nNR5タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２１】請求項１９に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒト
nNR5タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２２】組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるため
の方法であって、（a）請求項１８に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトランスフェクトし、（b）該発現ベクターからの該ヒトnNR5タンパク質の発現を可能にする条件下、工程（a）の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項２３】ヌクレオチド配列（配列番号１９に記載のとおり）【化７】【化８】を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質をコードする精製されたDNA分子。
【請求項２４】請求項２３に記載のDNA分子を含んでなる、ヒトnNR5タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項２５】請求項２４に記載の発現ベクターを含有する、組換えヒト
nNR5タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２６】組換え宿主細胞内でヒトnNR5タンパク質を発現させるため
の方法であって、（a）請求項２４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトランスフェクトし、（b）該発現ベクターからの該ヒトnNR5タンパク質の発現を可能にする条件下、工程（a）の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項２７】配列番号１９のヌクレオチド224〜ヌクレオチド約1327よりなる、請求項２３に記載のDNA分子。
【請求項２８】配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる精製された
ヒトnNR5タンパク質。
【請求項２９】配列番号２に記載のアミノ酸配列よりなる、請求項２８に
記載の精製されたヒトnNR5タンパク質。