JP2001511015A

JP2001511015A - サイクリン依存性プロテインキナーゼ

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Publication number: JP2001511015A
Application number: JP53492298A
Authority: JP
Inventors: ガーホルド，デイビツド・エル
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP0972011A1; CA2280206A1; EP0972011A4; WO1998035015A1

Abstract

(57)【要約】新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列を含み、ｃｄｋ／サイクリン複合体の調節に関与する従来保存されていた数個のアミノ酸残基を欠失する新規ヒトサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）をコードする単離核酸分子が開示される。関連タンパク質と生物学的に活性な突然変異形態も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】サイクリン依存性プロテインキナーゼ発明の技術分野本発明は新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列を含み、ｃｄｋ／サイクリン複合体の調節に関与する数個の従来保存されていたアミノ酸残基を欠失する新規ヒトサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）をコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明は関連ヒトＣＤＫタンパク質及びヒトＣＤＫ突然変異タンパク質にも関する。発明の背景真核生物における細胞増殖及び分裂は細胞周期を通して行われる。細胞周期は２つの中心間期により分離された２つの主事象から構成される。ＤＮＡ合成と複製はＳ期に行われ、有糸分裂はＭ期に行われる。第１間期はＧ₁と呼ばれ、Ｍ期とＳ期の間に位置し、酵素やＤＮＡ合成及びゲノム複製を生じるために必要な他の化合物を蓄積する。第２間期はＧ₂と呼ばれ、Ｓ期とＭ期との間に位置し、細胞分裂を行う前にＤＮＡ複製が適正であるか否かを点検管理する。ＣＤＫの活性化にはサイクリン調節サブユニットとの結合が必要であり、ＣＤＫ１〜ＣＤＫ６の場合にはスレオニン１６０／１６１（Ｔｈｒ１６０／１６１）のリン酸化が必要である。これらのＣＤＫはタンパク質のアミノ末端部分の近くにサイクリン結合部位を含む。活性化したＣＤＫ／サイクリン複合体は細胞周期の種々の段階に関与するタンパク質をリン酸化する。サイクリンタンパク質のファミリーはピーク発現レベルに応じて一般にＧ₁サイクリン又は有糸分裂サイクリンのいずれかに分類することができる。ＣＤＫはサイクリンのサブセットと結合することができる。例えば、ＣＤＫ４はサイクリンＤ１又はサイクリンＤ３と結合することが知られており、ＣＤＫ２はサイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、サイクリンＢ３及びサイクリンＥと結合することが知られている。脊椎動物サイクリンはサイクリンボックスと呼ばれる約１００アミノ酸の領域内に相同を示す。この領域はＣＤＫ結合及び活性に関与する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９２，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．３：１２７９−１２９４；Ｌｅｅｓら，１９９３，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，１３：１１９４−１２０１）。各ＣＤＫタンパク質のサイクリン結合ドメインと相互作用するのはサイクリンタンパク質のこの領域である。公知ＣＤＫ／サイクリン複合体の完全な活性化にはＣＤＫ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）によるリン酸化が必要である。脊椎動物ＣＡＫはＣＤＫ／サイクリン複合体であり、より詳細にはＣＤＫ７／サイクリンＨであると同定されている（ＦｉｓｈｅｒとＭｏｒｇａｎ，１９９４，Ｃｅｌｌ７８：７１３−７１４）。ＣＡＫ酵素は最適活性に必要であることが示されているスレオニン１７０残基を（ヒトＣＤＫ７に）含む（Ｐｏｏｎら，１９９４，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１０７：２７８９−２７９９；ＦｉｓｈｅｒとＭｏｒｇａｎ，１９９４，Ｃｅｌｌ７８：７１３−７２４）。ＣＤＫ／サイクリン複合体の阻害はＣＤＫサブユニットのスレオニン１４（Ｔｈｒ１４）及び／又はチロシン１５（Ｔｈｒ１５）のリン酸化により生じると考えられている。ＷｅｅｌキナーゼはＴｈｒ１４キナーゼ又はＴｈｒ１４及びＴｙｒ１５キナーゼであると示唆されている。更に、ＣＤＣ２５はＴｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５の両者をターゲットとする二重キナーゼであると考えられている（Ｍｏｒｇａｎ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７４：１３１−１３４）。別のＣＤＫタンパク質をコードする遺伝子が同定されるならば有利であろう。ＣＤＫタンパク質を発現する核酸分子が得られるならば、細胞周期のモジュレーターとして作用する化合物をスクリーニングするのに極めて有用であろう。このような化合物は癌に関連する細胞増殖又は免疫細胞増殖を制御するのに有用であろう。更に、このような新規遺伝子から発現される組換え形態のタンパク質は基質タンパク質、インヒビター及びサイクリンアクチベーターに対する特異性を決定するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイに有用であろう。更に、ＣＤＫ−１０又はその活性突然変異体をコードする単離精製ＣＤＫ１０ｃＤＮＡは大量の各タンパク質の組換え生産に有用であろう。大量のタンパク質を生産できるならば、ＣＤＫ１０タンパク質又は本明細書に開示する具体的突然変異体等の突然変異体を含む治療薬の製造に有用であろう。ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬は細胞周期及び／又はＣＤＫ１０関連疾患又はＣＤＫ１０応答性症状の治療に有用であろう。本発明はこの必要を検討し、満足する。発明の要約本発明は新規ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。このＣＤＫは新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、Ｔｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存されていたＴｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する。本発明は新規ヒトサイクリン依存性キナーゼを発現するｍＲＮＡをコードする新規単離核酸分子の生物学的に活性なフラグメント又は突然変異体に関する。前記生物学的に活性なフラグメント及び／又は突然変異体はいずれも新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、Ｔｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存されていたＴｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失するタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする。前記ポリヌクレオチドは、必ずしもこれらに限定するものではないが、いずれもヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切除及びカルボキシ末端切除を含み、これらの突然変異が診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードするように構成されている。本発明の単離核酸分子としては、１本鎖（コーディング又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）や、合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡが挙げられる。本発明の単離核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。本発明の好適態様の１つは配列番号１１と図１に開示され、新規ヒトサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ１０をコードするヒトＤＮＡフラグメントである。本発明は新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、数種の公知ＣＫＤの保存ＡＴＰ結合モチーフを構成するＴｈｒ１４とＴｙｒ１５を欠失し、更に保存Ｔｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する実質的に精製された新規サイクリン依存性キナーゼにも関する。本発明は新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列を含み、公知ＣＫＤの保存ＡＴＰ結合モチーフを構成するＴｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存Ｔｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する新規サイクリン依存性キナーゼの生物学的に活性なフラグメント及び／又は突然変異体にも関し、必ずしもこれらに限定するものではないが、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端切除及びカルボキシ末端切除を含み、これらの突然変異が診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを提供するように構成される。本発明の好適態様の１つはＣＤＫ１０のアミノ酸配列を示す配列番号３と図２に開示される。ＣＤＫ１０コーディング領域のオープンリーディングフレームは配列番号２のヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド１１８２に位置する。本発明の別の好適態様は配列番号１１に開示され、野生型形態（配列番号２）のヌクレオチド５８８が“Ｇ”から“Ａ”に突然変異している。本発明の別の好適態様は突然変異タンパク質（ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ）であり、配列番号１１のヌクレオチド５８８は野生型形態（配列番号２）に比較して “Ｇ”から“Ａ”に突然変異しており、その結果、配列番号１２に開示するように野生型アミノ酸配列（配列番号３）に比較してＡｓｐ１２７がＡｓｎ１２７に変化している。本発明は本明細書に開示するサイクリン依存性キナーゼの発現方法、これらのサイクリン依存性キナーゼを使用するアッセイ、これらのサイクリン依存性キナーゼを発現する細胞、及びこれらのサイクリン依存性キナーゼを使用することにより同定される化合物（例えばサイクリン依存性キナーゼとの直接接触、関連サイクリン又はＣＫＤ／サイクリン複合体を介するサイクリン依存性キナーゼのモジュレーター）にも関する。本方法で同定される前記モジュレーターは癌に一般に結び付けられている細胞増殖又は免疫細胞増殖を抑制するための治療薬として有用である。図面の詳細な説明図１はヒトＣＤＫ１０をコードする完全長ｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。図２はヒトＣＤＫ１０のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図３はヒトＣＤＫ１０をコードする完全長ＤＮＡフラグメントを生成するために使用したストラテジーを示す。図４はヒトＣＤＫ１０をコードするＤＮＡフラグメントの３’領域からの³²Ｐ標識プローブにハイブリダイズしたヒト組織ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。図５はヒトＣＤＫ１０をコードするＤＮＡフラグメントの３’領域からの³²Ｐ標識プローブにハイブリダイズしたヒト組織ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。発明の詳細な説明本発明は新規ヒトサイクリン結合ドメイン（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、公知ＣＤＫの保存ＡＴＰ結合モチーフを構成するＴｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存Ｔｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する新規サイクリン依存性キナーゼをコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明は新規ヒトサイクリン依存性キナーゼを発現するｍＲＮＡをコードする新規単離核酸分子の生物学的に活性なフラグメント及び／又は突然変異体にも関する。前記タンパク質は新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列（Ｐｒｏ −Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、Ｔｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存されていたＴｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する。本発明のタンパク質は必ずしもこれらに限定するものではないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切除及びカルボキシ末端切除を含み、これらの突然変異が診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードするよう構成されている。本発明の好適態様の１つは図１と配列番号２に開示され、新規サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ１０をコードする下記ヒトｃＤＮＡである。本発明は新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、Ｔｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存されていたＴｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する実質的に精製された新規サイクリン依存性キナーゼにも関する。前記核酸はいずれもこれらに限定するものではないが、ヒト及び齧歯類等の哺乳動物細胞から単離及び特性決定することができる。ヒト形態が特に好ましい形態であり、例えば配列番号２に示すような単離ｃＤＮＡや、配列番号１２に示すような優性ネガティブ突然変異形態が挙げられる。本発明は新規サイクリン結合ドメイン（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ；配列番号１）を含み、公知ＣＤＫの保存ＡＴＰ結合モチーフを構成するＴｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、更に保存Ｔｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する新規サイクリン依存性キナーゼの生物学的に活性なフラグメント及び／又は突然変異体にも関し、必ずしもこれらに限定するものではないが、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端切除及びカルボキシ末端切除を含み、これらの突然変異が診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを提供するように構成されている。このような核酸はいずれもこれらに限定するものではないが、ヒト及び齧歯類等の哺乳動物細胞から単離及び特性決定することができ、ヒト形態が特に好ましい形態である。本発明の好適態様の１つはＣＤＫ１０のアミノ酸配列を示した配列番号３と図２に開示される。ＣＤＫ１０コーディング領域のオープンリーディングフレームは配列番号２のヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド１１８２に位置する。新規サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ１０のアミノ酸は下記の通りである。本発明の別の好適態様は配列番号１１に開示され、野生型形態（配列番号２）のヌクレオチド５８８が“Ｇ”から“Ａ”に突然変異している。本発明の別の好適態様は突然変異タンパク質（ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ）であり、配列番号１１のヌクレオチド５８８は野生型形態（配列番号２）に比較して “Ｇ”から“Ａ”に突然変異しており、その結果、配列番号１２に開示するように野生型アミノ酸配列（配列番号３）に比較してＡｓｐ１２７がＡｓｎ１２７に変化している。本発明は本明細書に開示するサイクリン依存性キナーゼの発現方法、これらのサイクリン依存性キナーゼを使用するアッセイ、これらのサイクリン依存性キナーゼを発現する細胞、及びこれらのサイクリン依存性キナーゼを使用することにより同定される化合物（例えばサイクリン依存性キナーゼとの直接接触、関連サイクリン又はＣＫＤ／サイクリン複合体を介するサイクリン依存性キナーゼのモジュレーター）にも関する。本方法で同定される前記モジュレーターはヒト癌に結び付けられる細胞増殖又は免疫細胞増殖を抑制するための治療薬として有用である。更に、ＣＤＫ−１０又はその活性突然変異体をコードする単離精製ＣＤＫ１０ｃＤＮＡは大量の各タンパク質の組換え生産に有用であろう。大量のタンパク質を生産できるならば、ＣＤＫ１０タンパク質又は本明細書に開示する具体的突然変異体等の突然変異体を含む治療薬の製造に有用であろう。ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬は細胞周期及び／又はＣＤＫ１０関連疾患又はＣＤＫ１０応答性症状の治療に有用であり、場合により非限定的な例としてＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ等の突然変異体を含む治療薬は細胞周期疾患又は突然変異キナーゼの調節作用に応答性の症状の治療に有用であると思われる。本発明の単離核酸分子としては、１本鎖（コーディング又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）や、合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡが挙げられる。本発明の単離核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。特定アミノ酸をコードする種々のコドンには実質的量の重複が存在することが知られている。従って、本発明は同一アミノ酸の最終翻訳物をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書の目的では、１個以上の置換コドンをもつ配列を縮重変異体と定義する。発現されるタンパク質の最終物性を実質的に変えない限り、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質の突然変異も本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリン、リジンをアルギニン、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能は変化しない。従って、本発明は下記に示すような同一アミノ酸の最終翻訳物をコードする代替コドンを含むＲＮＡを発現するＤＮＡ配列にも関する。Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵＣ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵＧ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵＫ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧＬ＝Ｌｄｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧＮ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵＰ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧＲ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵＳ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵＴ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵＶ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵＷ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。従って、本発明は同一タンパク質を発現する種々のＤＮＡ分子を形成し得るコドン重複を開示する。本明細書の目的では、１個以上の置換コドンをもつ配列を縮重変異体と定義する。発現されるタンパク質の最終物性を実質的に変えない限り、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質の突然変異も本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリン、リジンをアルギニン、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能は変化しない。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は天然ペプチドと異なる性質をもつペプチドをコードするように改変できることが知られている。ＤＮＡ配列の改変方法の非限定的な例としては部位特異的突然変異誘発が挙げられる。性質改変の非限定的な例としては酵素の基質親和性又はレセプターのリガンド親和性の改変が挙げられる。本明細書で使用する野生型ＣＤＫの「生物学的に活性な等価物」又は「機能的誘導体」は野生型ＣＤＫ１０タンパク質の生物活性と実質的に類似する生物活性をもつ。「機能的誘導体」なる用語は、野生型ＣＤＫ１０タンパク質の「フラグメント」、「突然変異体」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「相同体」又は「化学的誘導体」を含むものとする。「フラグメント」なる用語は野生型ＣＤＫ１０の任意ポリペプチドサブセットを意味する。「突然変異体」なる用語は野生型形態と実質的に類似し得るが、異なる生物特性をもつ分子を意味する。このような特性改変の非限定的な例としては、酵素活性の改変、サイクリン結合の改変、基質結合の改変、基質親和性の改変及び生物活性に作用する化合物に対する感受性の改変が挙げられる。突然変異体の１例はＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎであり、配列番号２のヌクレオチド５８８の単塩基突然変異により残基１２７がアスパラギン酸からアスパラギンに単一アミノ酸置換している。この突然変異により、ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎのキナーゼ活性は野生型ＣＤＫ１０タンパク質に対して改変される。「変異体」なる用語は完全野生型タンパク質又はそのフラグメントと構造及び機能が実質的に類似する分子を意味する。ある分子と野生型ＣＤＫ１０様タンパク質が実質的に類似の構造をもつか又は両者が類似の生物活性をもつならば、この分子は野生型ＣＤＫ１０様タンパク質に「実質的に類似」している。従って、２種の分子が実質的に類似の生物活性をもつならば、一方の分子の構造が他方に存在しないか又は２種のアミノ酸配列が同一でないとしても、両者は変異体であるとみなされる。「類似体」なる用語は機能が完全野生型ＣＤＫ１０様タンパク質又はそのフラグメントに実質的に類似する分子を意味する。核酸に関して「実質的相同」又は「実質的類似」という場合には、セグメント又はその相補鎖が最適に整列及び比較した場合にヌクレオチドの少なくとも７５％で適当なヌクレオチド挿入又は欠失に同一であることを意味する。あるいは、セグメントが鎖又はその相補体にハイブリダイズする場合にも実質的相同が存在する。ポリペプチドに関して「実質的相同」という場合には、該当ポリペプチド又はタンパク質が該当天然タンパク質と少なくとも約３０％、通常は少なくとも約６５％の相同を示すことを意味する。本発明の核酸は全細胞又は細胞溶解液又は部分精製もしくは実質的精製形態で存在することができる。核酸から環境汚染物質を除去した場合に実質的精製形態とみなす。例えば、細胞から単離した核酸配列から常法により細胞成分を除去した場合に実質的精製形態とみなし、化学的に合成した核酸配列からその化学前駆物質を除去した場合に実質的精製形態とみなす。ＣＤＫ１０をクローニングするには種々の手順の任意のものを使用することができる。以下の方法が挙げられるが、これらに限定するものではない。（１）ＲＡＣＥＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８９９８−９００２）。５’及び／又は３’ＲＡＣＥを実施すると、完全長ｃＤＮＡ配列を生成することができる。このストラテジーはＣＤＫ１０ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用する。これらの遺伝子特異的プライマーは任意数の公表核酸及びタンパク質データベースを検索して発現核酸タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列を同定することにより設計される。（２）適当な発現ベクター系でＣＤＫ１０を含むｃＤＮＡライブラリーを構築後、ＣＤＫ１０ｃＤＮＡの直接機能発現。（３）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＣＤＫ１０を含むｃＤＮＡライブラリーをＣＤＫ１０タンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニング。（４）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＣＤＫ１０を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＣＤＫ１０タンパク質をコードする部分ｃＤＮＡによりスクリーニング。この部分ｃＤＮＡはＣＤＫ１０タンパク質に関連する他のＣＤＫキナーゼに公知のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計してＣＤＫ１０ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。（５）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＣＤＫ１０を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＣＤＫ１０タンパク質をコードする部分ｃＤＮＡによりスクリーニング。このストラテジーは上述のようにＥＳＴとして同定されたＣＤＫ１０ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用してもよい。（６）公知ＲＡＣＥ法により完全長ｃＤＮＡを生成するか又はこれらの同一の公知ＲＡＣＥ法によりコーディング領域の一部を生成してコーディング領域の一部を生成及び単離するように配列番号２を鋳型として使用して５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計し、多種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーの１種をスクリーニングするためのプローブとして使用し、ＣＤＫ１０をコードする完全長ヌクレオチド配列を単離する。当業者に自明の通り、他の型のライブラリーや、他の細胞型又は種型から構築したライブラリーもＣＤＫ１０をコードするＤＮＡ又はＣＤＫ１０相同体を単離するために有用であり得る。他の型のライブラリーとしては、ヒト細胞又は組織以外の細胞又は細胞系（例えばマウス細胞、齧歯類細胞又はＣＤＫ１０をコードするＤＮＡを含むことができる任意の他の脊椎動物宿主）から誘導されるｃＤＮＡライブラリーが挙げられるが、これらに限定するものではない。更に、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにより脊椎動物ゲノムライブラリーをハイブリダイゼーションスクリーニングしてＣＤＫ１０遺伝子を単離することもでき、このようなライブラリーとしてはヒトゲノムライブラリー、マウスゲノムライブラリー及び齧歯類ゲノムライブラリーと、付随ヒトゲノムＤＮＡライブラリーが挙げられるが、これらに限定するものではない。当業者に自明の通り、ＣＤＫ１０活性をもつ細胞又は細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ＣＤＫ１０ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーを作製するのに使用する細胞又は細胞系の選択は、まず任意の公知ＣＤＫ活性アッセイを使用して細胞関連ＣＤＫ１０活性を測定することにより実施することができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製は当該技術分野で周知の標準技術により実施することができる。周知ｃＤＮＡライブラリー構築法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。相補的ＤＮＡライブラリーはこれらに限定するものではないが、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．やＳｔｒａｔａｇｅｎｅ等の多数の製造業者から入手することもできる。同様に当業者に自明の通り、ＣＤＫ１０をコードするＤＮＡは適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離することもできる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で周知の標準技術により実施することができる。周知ゲノムＤＮＡライブラリー構築法はＳａｍｂｒｏｏｋらの上記文献に記載されている。好適方法の１種によりＣＤＫ１０遺伝子をクローニングするためには、ＣＤＫ１０又は相同タンパク質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列が必要であると思われる。このためには、ＣＤＫ１０又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定装置により部分アミノ酸配列を決定することができる。部分ＣＤＫ１０ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅には完全アミノ酸配列を決定する必要はなく、６〜８個のアミノ酸の２領域の直鎖状配列を決定すればよい。適当なアミノ酸配列の同定後、これらの配列をコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードは縮重性であるため、特定アミノ酸をコードするために２種以上のコドンを使用できるので、アミノ酸配列は１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドの任意のものによりコードされ得る。この１組のうちの１個のメンバーのみがＣＤＫ１０配列と同一であり、他のメンバーはミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもＣＤＫ１０ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。ミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌクレオチドはＣＤＫ１０をコードするＤＮＡの同定と単離を可能にするために十分にＣＤＫ１０ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。あるいは、１種以上の利用可能なゲノムデータベースを検索することにより発現配列の領域のヌクレオチド配列を同定することもできる。ｃＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡ集団から該当ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施するには、遺伝子特異的プライマーを使用することができる。上述のように、ＰＣＲ法で使用するのに適したヌクレオチド配列は配列番号２から得られ、ＣＤＫ１０をコードする完全長配列を生成するためにオーバーラップする５’及び３’ＲＡＣＥ産物を単離する目的で使用したり、１種以上のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用するようにＣＤＫ１０をコードするヌクレオチド配列の一部を単離し、ＣＤＫ１０又はＣＤＫ１０様タンパク質をコードする完全長配列を単離するために使用できる。方法の１例では、ＲＡＣＥＰＣＲ法（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ８５：８９９８−９００２）を使用してＣＤＫ１０をコードするＤＮＡの５’コーディング領域をクローニングする。第１回ＰＣＲではアダプター連結ヒト胎盤ＤＮＡ鋳型（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、遺伝子特異的プライマーＰＫ２２Ｌ２３４（５’−ＴＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧ−３’；配列番号４）及びアダプタープライマーＡＰ１（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’：配列番号５）を使用した。ＰＣＲ増幅はＥｌｏｎｇａｓｅ（登録商標）を使用して実施した。サーマルサイクリングを完了し、この第１のＰＣＲ反応産物の一部を第２のＰＣＲ反応にＤＮＡ鋳型として加えた。このＰＣＲ反応は更に第１のＰＣＲ反応と異なり、入れ子遺伝子特異的プライマーＰＫ２２Ｌ１６１（５’−ＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡ−３’；配列番号６）と入れ子アダプタープライマーＡＰ２（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；配列番号７）を使用した。１％アガロース電気泳動ゲルから約６００ｂｐＤＮＡ産物を同定し、切り出し、ＱｉａｇｅｎＰＣＲスパンカラム（Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標））を使用して精製した。このフラグメントを直接使用し、ＰＫ２２Ｌ１６１及びＡＰ２プライマーを使用してＤＮＡシーケンシングし、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲ２．１にクローニングした。公表核酸及びタンパク質データベースを検索することにより６００ｂｐ５’フラグメントにオーバーラップする３’ＤＮＡフラグメントを同定した。この３’ フラグメントは典型的ファージミドベクターでＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして入手可能な約１．８ＫｂｃＤＮＡインサートである。このｃＤＮＡクローンはＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｈ１７７２７、ＩｍａｇｅＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．５０４８４、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．ｙｍ４０ａ０６及びＧＢＤＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．４２３２９４により容易に同定される。このｃＤＮＡはヒト幼児脳ｍＲＮＡから構築したライブラリーから単離した。この構築物はＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，２１３０ＭｅｍｏｒｉａｌＰａｒｋｗａｙＳＷ，ＨｕｎＳｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ３５８０１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）から入手可能である。ＡＴＧ翻訳開始コドンのちょうど５’にＢａｍＨＩ部位を付けた発現カセットとしてｐＬＩＴＭＵＳ２８（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で完全長ＣＤＫ１０コーディング領域を組み立てた。ＣＤＫ１０をもつＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再クローニングし、ＣＤＫ１０をもつＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメントをｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２バキュロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再クローニングした。ＣＤＫ１０の優性ネガティブ単塩基突然変異を含む類似構築物を作製した。この突然変異体はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ“ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ”キットとプライマー２２Ｕ−Ｄ１２７Ｎ（５’−ＣＡＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣ−３’；配列番号８）及び２２Ｌ−Ｄ１２７Ｎ（５’−ＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣ−ＧＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＴＴＧ−３’；配列番号９）を使用してｐＬＩＴＭＵＳ２８：：ＣＤＫ１０から作製した。２種の突然変異構築物を夫々（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとして）ｐｃＤＮＡ３．１及び（ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメントとして）ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２にサブクローニングした。５’上流配列と、コーディング領域と、３’未翻訳配列からなり、ＣＤＫ１０をコードするヒト完全長ｃＤＮＡの配列を配列番号２に示す。クローニングしたｃＤＮＡからのＣＤＫ１０の予想アミノ酸配列を配列番号３に示す。決定したｃＤＮＡ配列を点検すると、３２５アミノ酸タンパク質をコードする単一オープンリーディングフレームの存在が判明する。ＣＤＫ１０コーディング領域のオープンリーディングフレームは配列番号２のヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド１１８２に位置する。好適突然変異形態（Ａｓｐ１２７→Ａｓｎ１２７）をコードするヌクレオチド配列を配列番号１１に示す。この好適突然変異形態ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。種々の哺乳動物ベクターを使用して哺乳動物細胞で組換えＣＤＫ１０を発現させることができる。本明細書では、クローニングしたＤＮＡの転写と適当な宿主におけるそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として発現ベクターを定義する。このようなベクターを使用すると、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細菌及び動物細菌等の種々の宿主で真核ＤＮＡを発現させることができる。特別に設計したベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間でＤＮＡのシャトリングが可能である。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞における自律複製のための複製起点と、選択マーカーと、制限数の有用制限酵素部位と、高コピー数力価と、活性プロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力プロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクターとしてはクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられるが、これらに限定するものではない。組換えＣＤＫ１０発現に利用可能な市販哺乳動物発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８及びｐＬＩＴＭＵＳ３９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ −ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳｖｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられるが、これらに限定するものではない。種々の細菌発現ベクターを使用して組換えＣＤＫ１０を細菌細胞で発現させることができる。組換えＣＤＫ１０発現に利用可能な市販細菌発現ベクターとしてはｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、 λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定するものではない。種々の真菌細胞発現ベクターを使用して組換えＣＤＫ１０を真菌で発現させることができる。組換えＣＤＫ１０発現に利用可能な市販真菌細胞発現ベクターとしてはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定するものではない。種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して組換えレセプターを昆虫細胞で発現させることができる。ＣＤＫ１０の組換え発現に利用可能な市販昆虫細胞発現ベクターとしてはｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定するものではない。発現ベクターはこれらに限定するものてばないが、例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーション等の多数の技術の任意の１種により宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む細胞をクローン増殖して個々に分析し、ＣＤＫ１０タを産生するか否かを試験する。ＣＤＫ１０発現宿主細胞クローンの同定はこれに限定するものではないが、例えば抗ＣＤＫ１０抗体に対する免疫反応性等の数種の手段により実施することができる。ｉｎｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡ又は天然ｍＲＮＡを使用してＣＤＫ１０ＤＮＡを発現させることもできる。合成ｍＲＮＡ又はＣＤＫ１０産生細胞から単離したｍＲＮＡは、非限定的な例としてコムギ胚芽エキス及び網状赤血球抽出液等の種々の無細胞系で効率的に翻訳することができ、更に、非限定的な例としてカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等の細胞系でも効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。ＣＤＫ１０様タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して組換え宿主細胞でＣＤＫ１０を発現させることができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、非限定的な例としては細菌類（例えば大腸菌）、真菌細胞（例えば酵母）、哺乳動物細胞（非限定的な例として例えばヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来細胞系）及び昆虫細胞（非限定的な例としてショウジョウバエ及びカイコ由来細胞系）が挙げられる。哺乳動物種に由来する細胞系として利用可能な市販品を挙げると、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓー２（ＡＴＣＣＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ −Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）があるが、これらに限定するものではない。発現ベクターはこれらに限定するものではないが、例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーション等の多数の技術の任意の１種により宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む細胞を個々に分析し、ＣＤＫ１０タンパク質を産生するか否かを試験する。ＣＤＫ１０発現細胞の同定はこれらに限定するものではないが、例えば抗ＣＤＫ１０抗体に対する免疫反応性や、宿主細胞関連ＣＤＫ１０活性の存在等の数種の手段により実施することができる。上記方法により得られたクローン化ＣＤＫ１０ｃＤＮＡは、適当なプロモーターと他の適切な転写調節エレメントを含む発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２及びｐＬＩＴＭＵＳ２８）に分子クローニングすることにより組換え発現させ、原核又は真核宿主細胞に導入して組換えＣＤＫ１０を生産することができる。このような操作技術はＳａｍｂｒｏｏｋの上記文献に記載されており、実施例の項に詳細に説明し、当業者に周知且つ容易に利用可能である。ＣＤＫ１０ＤＮＡの発現はｉｎｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用して実施することもできる。合成ｍＲＮＡは、非限定的な例としてコムギ胚芽エキス及び網状赤血球抽出液等の種々の無細胞系で効率的に翻訳することができ、更に、非限定的な例としてカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等の細胞系でも効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。最適レベルのＣＤＫ１０タンパク質を生産するＣＤＫ１０ｃＤＮＡ配列を決定するためには、これらに限定するものではないが、例えばＣＤＫ１０ｃＤＮＡの完全長オープンリーディングフレームや、タンパク質の特定ドメイン又はタンパク質の転位ドメインのみをコードするｃＤＮＡの部分を含む種々の構築物等のＣＤＫ１０ｃＤＮＡ分子を構築することができる。全構築物はＣＤＫ１０の５ ’及び／又は３’未翻訳領域の全部又は一部を含むかあるいは全く含まないように設計することができる。ＣＤＫ１０活性とタンパク質発現レベルはこれらの構築物を適当な宿主細胞に単独又は組み合わせて導入後に決定することができる。一過性アッセイで最適発現を生じるＣＤＫ１０ｃＤＮＡカセットを決定後、このＣＤＫ１０ｃＤＮＡ構築物を非限定的な例として例えば哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞等の種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入することができる。宿主細胞におけるＣＤＫ１０タンパク質のレベルは非限定的な例として例えば免疫親和性及び／又はリガンド親和性法等の種々の技術により定量される。ＣＤＫ１０特異的アフィニティビーズ又はＣＤＫ１０特異的抗体を使用して³⁵Ｓメチオニン標識又は末標識ＣＤＫ１０タンパク質を単離する。標識ＣＤＫ１０タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。未標識ＣＤＫ１０タンパク質はＣＤＫ１０特異的抗体を使用してウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイにより検出する。宿主細胞でＣＤＫ１０の発現後、ＣＤＫ１０タンパク質を回収し、ＣＤＫ１０を活性形態で提供することができる。数種のＣＤＫ１０精製手順が知られており、利用できる。組換えＣＤＫ１０は塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを種々に組み合わせるか又は個々に適用することにより、細胞溶解液及び抽出液又は条件付け培地から精製することができる。更に、完全長ＣＤＫ１０又はＣＤＫ１０のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製した免疫アフィニティカラムを使用することにより、他の細胞タンパク質から組換えＣＤＫ１０を分離することもできる。また、配列番号３に開示するようなタンパク質の一部から（通常は約９〜約２５アミノ酸長の）合成ペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することもできる。ＣＤＫ１０に対する単一特異的抗体はＣＤＫ１０に対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、又はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）の技術を使用してＣＤＫ１０に反応性のモノクローナル抗体として作製される。本明細書で使用する単一特異的抗体は、ＣＤＫ１０に特徴的なホモ結合をもつ単一抗体種又は複数抗体種として定義される。本明細書で使用するホモ結合とは、抗体種が上述のようにＣＤＫ１０に関連するもの等の特定抗原又はエピトープに結合できることを意味する。ＣＤＫ１０特異抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を免疫アジュバントの存在下又は不在下に適当な濃度のＣＤＫ１０又はＣＤＫ１０合成ペプチドで免疫することにより作製される。最初の免疫前に、免疫前血清を採取する。許容可能な免疫アジュバントと共に約０．１μｇ〜約１０００μｇのＣＤＫ１０を各動物に投与する。前記許容可能なアジュバントの非限定的な例としては、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈降物、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍとｔＲＮＡを含む油中水エマルションが挙げられる。初期免疫はＣＤＫ１０タンパク質又はＣＤＫ１０合成ペプチドを好ましくはフロイント完全アジュバントに懸濁し、皮下（ＳＣ）、腹膜組織内（ＩＰ）又はその両経路で複数部位に投与する。各動物から一定間隔、好ましくは毎週採血し、抗体力価を測定する。初期免疫後に動物にブースター注射してもよいし、しなくてもよい。ブースター注射する場合には、一般に等量のＣＤＫ１０をフロイント不完全アジュバントに懸濁し、同一経路で動物に投与する。ブースター注射は最大力価が得られるまで約３週間隔で行う。各ブースター免疫から約７日後又は単一免疫から約１週間後に動物から採血して血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。ＣＤＫ１０に対して反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃにＣＤＫ１０を免疫することにより作製する。ＣＤＫ１０約１μｇ〜約１００μｇ、好ましくは約１０μｇを緩衝液又は食塩水約０．５ｍｌに懸濁し、上述のように等量の許容可能なアジュバントに加えてＩＰ又はＳＣ経路でマウスに免疫する。フロイント完全アジュバントが好ましい。マウスに０日目に初期免疫を行い、約３〜約３０週間そのままにしておく。ＣＤＫ１０約１〜約１００μｇをリン酸緩衝食塩水等の緩衝液に懸濁し、免疫後のマウスに静脈内（ＩＶ）経路で１回以上ブースター免疫する。当該技術分野で公知の標準手順により免疫マウスから脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは牌リンパ球を得る。安定なハイブリドーマを形成できるような条件下で脾リンパ球を適当な融合パートナー、好ましくはミエローマ細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を生成する。融合パートナーの非限定的な例としては、マウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が挙げられ、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体生産細胞とミエローマ細胞を濃度約３０％〜約５０％で約１０００重量ｍｏｌのポリエチレングリコール中で融合する。ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン中を加えたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で当該技術分野で公知の手順により増殖させて融合ハイブリドーマ細胞を選択する。約１４、１８及び２１日に増殖陽性ウェルから上清液を採取し、ＣＤＫ１０を抗原として使用して固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイにより抗体生産をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのアイソタイプを調べる。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９７３，ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓの軟寒天法等の技術により抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞をクローニングする。プリスチンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスにプライミングから約４日後に１匹当たり約０．５ｍｌの割合でハイブリドーマ細胞約２×１０⁶〜約６×１０⁶個を注射することによりモノクローナル抗体をｉｎｖｉｖｏ生産する。細胞導入から約８〜１２日後に腹水を採取し、当該技術分野で公知の技術によりモノクローナル抗体を精製する。約２％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることにより、抗ＣＤＫ１０ｍＡｂのｉｎｖｉｔｒｏ生産を実施し、十分な量の特異ｍＡｂを得る。当該技術分野で公知の技術によりｍＡｂを精製する。非限定的な例として沈降、受動凝集、酵素によるイムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の種々の血清学的又は免疫学的アッセイにより腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を測定する。同様のアッセイを使用して体液又は組織及び細胞抽出液中のＣＤＫ１０の存在を検出する。当業者に自明の通り、上記単一特異的抗体の生産方法を使用してＣＤＫ１０ポリペプチドフラグメント又は完全長ＣＤＫ１０ポリペプチドに特異的な抗体を生産することができる。抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることにより、ＣＤＫ１０抗体アフィニティカラムを作製する。次いでスペーサーアームとのアミド結合により抗体をゲルに結合する。その後、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水洗後、０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＣＤＫ１０又はＣＤＫ１０フラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽出液をゆっくりとカラムに通す。その後、光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンドまで低下するまでカラムをリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、タンパク質を０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。その後、精製ＣＤＫ１０タンパク質をリン酸緩衝食塩水で透析する。本発明の新規ＣＤＫ１０はＣＤＫ１０活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ手順で使用するのに利用できる。本明細書に記載するＣＤＫ１０活性の調節とは、タンパク質の阻害又は活性化に加え、ＣＤＫ１０活性に関連する細胞周期調節性質に直接又は間接的に作用することも含む。ＣＤＫ１０活性を調節する化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター、アクチベーター及びＣＤＫ１０活性及び／又はＣＤＫ１０／サイクリン会合の調節に直接又は間接的に作用する化合物が挙げられる。本発明のＣＤＫ１０プロテインキナーゼはＣＤＫ１０モジュレーターを同定するためのアッセイ手順で使用するために天然及び組換え起源から得られる。一般に、ＣＤＫ１０モジュレーターを同定するためのアッセイ手順は本発明のＣＤＫ１０タンパク質と、ＣＤＫ１０／サイクリン複合体を形成する天然サイクリンタンパク質と、推定ＣＤＫ１０モジュレーターを含む試験化合物又は試料を含む。試験化合物又は試料は例えば、天然又は組換えを問わず精製ＣＤＫ１０タンパク質、天然又は組換えを問わずＣＤＫ１０産生細胞の細胞以下のフラクション、及び／又は天然又は組換えを問わずＣＤＫ１０を発現する全細胞で直接試験することができる。試験化合物又は試料は公知ＣＤＫ１０モジュレーターの存在下でＣＤＫ１０に加えてもよいし、不在下で加えてもよい。試験化合物又は試料の調節活性は、例えば試験化合物又は試料がＣＤＫ１０タンパク質に結合、タンパク質を活性化、ＣＤＫ１０活性を阻害、他の化合物とＣＤＫ１０タンパク質の結合を阻害もしくは増進、レセプター調節を変更、又は細胞内活性を変更する能力を分析することにより測定することができる。ＣＤＫ１０活性のモジュレーターの同定は細胞周期に関連する疾病状態の治療に有用であり、癌に関連する細胞増殖又は免疫細胞増殖を抑制するのに有用である。酵素の活性を刺激又は阻害するために他の化合物も有用であると思われる。これらの化合物は、ＣＤＫ１０タンパク質の活性化又は不活化の結果として細胞増殖、細胞死、非増殖、細胞悪性トランスフォーメーションの誘導又は転移性腫瘍増殖を生じる疾病の治療に有用であり、従って、種々の癌の予防及び／又は治療に使用できる。本発明は本発明のＣＤＫタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現を調節するか又はこのようなＣＤＫタンパク質の機能を調節する化合物をスクリーニングするための方法にも関する。これらの活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子のいずれでもよい。化合物はＣＤＫタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＣＤＫタンパク質の機能を増減することにより調節することができる。ＣＤＫタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はその生物学的機能を調節する化合物は種々のアッセイにより検出することができる。アッセイは単純な「イエス／ノー」アッセイで発現又は機能の変化の有無を調べることができる。アッセイは試料の発現又は機能を標準試料における発現又は機能のレベルと比較することにより定量的に実施することもできる。改変ＣＤＫ１０、抗ＣＤＫ１０抗体又は改変ＣＤＫ１０タンパク質を含むキットをこれらの用途に公知の方法により作製することができる。本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体を使用してＣＤＫ１０ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルをスクリーニング及び測定することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体を使用してＣＤＫ１０の検出及び型別に適したキットを作製することができる。このようなキットは少なくとも１個の容器を拘束保持するのに適した区画キャリヤーを含む。キャリヤーは更に、ＣＤＫ１０を検出するのに適した組換えＣＤＫ１０タンパク質又は抗ＣＤＫ１０抗体等の試薬を含む。キャリヤーは更に、標識抗原又は酵素基質等の検出手段を含むことができる。医薬的に許容可能なキャリヤーの混合等の公知方法により、ＣＤＫ１０のモジュレーターを含む医薬的に有用な組成物を調製することができる。このようなキャリヤー及び調製方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を形成するために、前記組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は改変ＣＤＫ１０を含む。本発明の治療又は診断用組成物は、疾病を治療又は診断するために十分な量を個体に投与する。有効量は個体の症状、体重、性別及び年齢等の種々の因子によって異なる。他の因子として投与方法も挙げられる。医薬組成物は皮下、局所、経口及び筋肉内等の種々の経路により個体に投与することができる。「化学的誘導体」なる用語は、通常は塩基分子を構成しない付加的化学的部分を含む分子を意味する。このような部分は、塩基分子の溶解度、半減期、吸収等を改善することができる。あるいは、これらの分子は塩基部分の望ましくない副作用を緩和したり、塩基分子の毒性を軽減することができる。このような分子の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓをはじめとする種々の文献に記載されている。本発明の方法により同定される化合物は適切な用量で単独使用することができる。あるいは、他の物質と同時投与又は順次投与することが望ましい場合もある。本発明は、本発明の新規治療方法で使用するのに適した局所、経口、全身及び非経口医薬製剤を提供することも目的とする。本発明により活性成分として同定された化合物を含む組成物は、慣用投与ビヒクルに加えて多種多様の治療剤形で投与することができる。例えば、化合物はタブレット、カプセル（各々徐放及び持続製剤を含む）、ピル、散剤、粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及びエマルション等の経口剤形又は注射により投与することができる。同様に、いずれも医薬分野の当業者に周知の形態を使用して静脈内（ボーラス注射と点滴の両方）、腹膜組織内、皮下、閉塞の有無を問わずに局所、又は筋肉内形態で投与することもできる。本発明の化合物は１日１回投与してもよいし、１日合計用量を１日２回、３回又は４回に分けて投与してもよいという利点がある。更に、本発明の化合物は適当な鼻孔内ビヒクルの局所使用により鼻孔内形態で投与してもよいし、当業者に周知の経皮スキンパッチの形態を使用して経皮経路で投与してもよい。経皮送達システムの形態で投与するには、当然のことながら、全投与期間を通して不連続でなく連続投与する。別々の用量製剤である２種以上の活性物質で併用治療するには、活性物質を同時に投与してもよいし、時間をずらして投与してもよい。本発明の化合物を使用する投与計画は患者の型、人種、年齢、体重、性別及び医療症状；治療しようとする症状の重篤度；投与経路；患者の腎及び肝機能；並びに使用する特定化合物等の種々の因子に従って選択される。通常の知識をもつ医師又は獣医は症状の進行を予防、抑制又は阻止するために必要な薬剤の有効量を容易に決定及び処方することができる。無毒性で効力を生じる範囲内の薬剤の濃度を最適精度で達成するには、標的部位の薬剤利用性の動態変化に基づく計画が必要である。このためには、薬剤の分布、平衡及び排泄を考慮する必要がある。単離精製ＣＤＫ１０は大量のＣＤＫ１０タンパク質の組換え生産にも有用である。大量のタンパク質を生産できるならば、ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬の製造に有用であろう。ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬が入手できるならば、細胞周期及び／又はＣＤＫ１０関連疾患又はＣＤＫ１０応答性症状の治療に有用であろう。ゲノムデータベースのコンピューター分析、分子クローニング及びＤＮＡシーケンシングにより、ヒトＣＤＫ遺伝子ファミリーの新規メンバーが同定された。この新規ｃＤＮＡフラグメントは新規サイクリン結合ドメインシグネチャー配列を含み、公知ＣＤＫの保存ＡＴＰ結合モチーフ内のＴｈｒ１４及び／又はＴｙｒ１５を欠失し、保存Ｔｈｒ１６０／１６１残基を含むＴループドメインも欠失する新規サイクリン依存性キナーゼをコードする。種々の細胞及び組織からのＲＮＡによるノーザンハイブリダイゼーション実験の結果、ＣＤＫ１０は脳、精巣、下垂体及び副腎由来細胞又は組織等の種々のヒト組織で発現されることが判明した。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例に発明を限定するものではない。実施例１ＣＤＫをコードするＤＮＡフラグメントの単離及び特性決定ＣＤＫ１０コーディング領域の３’部分をＭｅｒｃｋ−ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＥＳＴから５’ＥＳＴＨ１７７２７として検出した。ＥＳＴ“Ｈ１７７２７” は数種のＣＤＫ及びＭＡＰＫ遺伝子に似ていた。ＣＤＫ１０の３’コーディング領域と３’未翻訳領域を含むｐＨ１７７２７プラスミド構築物は、典型的ファージミドベクターで約１．８ＫｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに含まれる。このフラグメントの５’部分は６００ｂｐの３’末端にオーバーラップする。このｃＤＮＡクローンはＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｈ１７７２７、ＩｍａｇｅＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．５０４８４、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．ｙｍ４０ａ０６及びＧＢＤＣｌｏｎｅＩＤＮｏ．４２３２９４により公に入手可能である。このｃＤＮＡをヒト幼児脳ｍＲＮＡから構築したラィブラリーから単離した。この構築物はＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，２１３０ＭｅｍｏｒｉａｌＰａｒｋｗａｙＳＷ，Ｈｕｎｓｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ３５８０１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）から入手可能である。遺伝子の５’部分はＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃ＰＴ１１５６−１，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｋ１８０２−１）から市販されているＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）既製ヒト胎盤ｃＤＮＡを使用して５’ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８９９８−９００２）を実施することにより単離した。ヒト胎盤ｍＲＮＡから作製したアダプター連結２本鎖ｃＤＮＡを鋳型として使用し、遺伝子特異的プライマーＰＫ２２Ｌ２３４（５’−ＴＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧ−３’；配列番号４）とアダプタープライマーＡＰ１（５’ −ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；配列番号５）を使用してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅はＥｌｏｎｇａｓｅ（登録商標）ｌｏｎｇ−ＰＣＲ酵素ミックス（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、安定剤及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに保存）とＧｉｂｃｏ−ＢＲＬから入手したＰＣＲ反応用緩衝液を使用して実施した。緩衝液は３００ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄（２５℃でｐＨ９．１）、９０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄及び１．５ｍＭＭｇＳＯ₄から構成した。Ｍａｒａｔｈｏｎ胎盤ｃＤＮＡ鋳型２μｌとＰＫ２２Ｌ２３４及びＡＰ１各１０ｐｍｏｌを反応混合物に加え、滅菌水を加えて合計容量２０ｍｌとした。サーマルサイクリングは（１）９４℃／３０秒、６８℃／６分を５サイクル、（２）９４℃／３０秒、６４℃／３０秒、６８℃／４分を５サイクル、（３）９４℃／３０秒、６２℃／３０秒、６８℃／４分を３０サイクルとした。この第１のＰＣＲ反応の１／２０希釈液１μｌを第２のＰＣＲ反応にＤＮＡ鋳型として加えた。第２のＰＣＲ反応は第１のＰＣＲ反応と異なり、入れ子プライマーＰＫ２２Ｌ１６１（５’−ＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡ−３’；配列番号６）とＡＰ２（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３ ’；配列番号７）を使用した。１％アガロース電気泳動ゲルから約６００ｂｐのＰＣＲ産物を同定し、切り出し、ＱｉａｇｅｎＰＣＲスパンカラムを使用して精製した。このフラグメントを直接使用し、ＰＫ２２Ｌ１６１及びＡＰ２オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＤＮＡシーケンシングを行った。２本鎖５’オーバーハングアダプターを２本鎖ｃＤＮＡ鋳型に連結することにより、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製品Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）既製ヒト胎盤ｃＤＮＡを強化する。アダプターの３’末端はアミノ基によりブロックし、ＰＣＲ増幅中に延長しないようにする。ＡＰ１オリゴは非延長３’領域内でハイブリダイズする。従って、ＡＰ１は元のｃＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズせず、これを延長せず、第２回目のＰＣＲで延長と増幅を開始する。実施例２ＣＤＫ１０をコードする完全長ＤＮＡフラグメントの構築ＣＤＫ１０をコードするＤＮＡフラグメントの３’部分はＤＮＡプラスミドベクターｐＨ１７７２７に含まれる。このインサートはインサートに固有の５’ＸｈｏＩ部位と、インサートに固有の３’未翻訳領域におけるＮｃｏＩ部位を含む。このＸｈｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントを単離し、ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩで消化したｐＬＩＴＭＵＳ２８プラスミドＤＮＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングし、ｐＬＩＴＭＵＳ２８：Ｈ１７７２７を得た。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡクローニングキットを製造業者に記載されているように使用し、５’ＲＡＣＥから得た６００ｂｐＰＣＲフラグメントをｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＰｍｌＩ制限部位は６００ｂｐＰＣＲ産物のほぼ中央に位置する。ＰｍｌＩ部位を使用して２種の独立した５’ＲＡＣＥＰＣＲクローンｐＰＫ２２ｂｏ４及びｐＰＫ２２ｄｏ４から６００ｂｐ５’フラグメントの野生型形態を構築した。（ＰｍｌＩ部位の３’に突然変異を含む）ｐＰＫ２２ｂｏ４のＰｍｌＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを（ＰｍｌＩ部位の５’に突然変異を含む）クローンｐＰＫ２２ｄｏ４のＰｍｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントで置換した。得られたクローンｐＰＫ２２ｂｏ４／ｄｏ４は固有ＸｈｏＩ制限部位を通ってｐＨ１７７２７の５’部分にオーバーラップする。プライマーＰＫ２２Ｌ６６１（５’−ＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡ−３’；配列番号６）及びＰＫ２２Ｕ２１０（５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴ−３’；配列番号１０）を使用してクローンｐＰＫ２２ｂｏ４／ｄｏ４からのインサートをＰＣＲ増幅することにより、ＡＴＧ翻訳開始コドンのちようど５’にＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ制限部位クラスターを付けた。得られたＰＣＲフラグメントをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩ −ＸｈｏＩで消化したｐＬＩＴＭＵＳ２８：Ｈ１７７２７に連結し、ｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０を得た（図３）。実施例３ＣＤＫ１０哺乳動物発現ベクターの構築ＣＤＫ１０コーディング領域を含むｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０からのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで予め消化しておいた哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られた構築物ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０はＣＭＶプロモーターの一部と、ＣＤＫ１０ＡＴＧ翻訳開始コドンの上流のＴ７プライマー部位と、翻訳終結コドンの下流のＢＧＨポリＡ領域を含む。当然のことながら、大腸菌及び哺乳動物細胞での増殖を可能にする他の成分もこのベクターに存在する。実施例４ＣＤＫ１０バキュロウイルス導入ベクターの構築ＣＤＫ１０コーディング領域を含むｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０からのＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで予め消化しておいたバキュロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。得られた構築物ｐＢＢＨ：ＣＤＫ１０は、製造業者の指示（例えばｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ、Ｂ及びＣについてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔ．Ｎｏ．３７５−２０参照）に従って昆虫細胞からの組換えＣＤＫ１０を発現させるために使用することができる。実施例５ＣＤＫ１０優性ネガティブ突然変異体をコードするＤＮＡフラグメントの構築ｐＬＩＴＭＵＳ：ＣＤＫ１０構築物（実施例２参照）を突然変させ、「優性ネガティブ」単塩基対突然変異を生成した。この突然変異はＳｔｒａｔａｇｅｎ“ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ”キットとプライマー２２Ｕ−Ｄ１２７Ｎ：（５’−ＣＡＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣ−３’；配列番号８）及び２２Ｌ−Ｄ１２７Ｎ：（５’−ＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＴＴＧ−３’；配列番号９）を製造業者の指示に従って使用してｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０から生成した。優性ネガティブ突然変異はコドンＧＡＣ（配列番号２のヌクレオチド５８８〜５９０）をＡＣＣ（配列番号１１のヌクレオチド５８８〜５９０）に変異させ、こうして必須アミノ酸Ａｓｐ１２７を欠失させてＡｓｎ１２７とし（配列番号１２参照）、キナーゼ活性を不活化する（実施例７及びｖａｎｄｅｎＨｅｕｖｅｌ＆Ｈａｒｌｏｗ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：２０５０ −２０５４参照）。ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ構築物を（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとして）ｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０−ｄ１２７Ｎを得た。ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ構築物を更に（ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメントとして）ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２にサブクローニングし、ｐＢＢＨ：ＣＤＫ１０−ｄ１２７Ｎを得た。実施例６ＣＤＫ１０発現の組織分布ヒト多重組織ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ＃７７６０−１、ヒト脳ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔＩＩ＃７７５５−１、ヒト脳ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔＩＩＩ＃７７５０−１、及びヒト多重組織ＮｏｒｔｈｅｒｎＤｏｔＢｌｏｔはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。プローブはＧｉｂｃｏＢＲＬからの“Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ”（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ− ３’；配列番号１３）と“Ｒｅｖｅｒｓｅ”（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’；配列番号１４）プライマーを使用してｐＨ１７７２７からのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートをＰＣＲ増幅することにより作製した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ“Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ” ランダムプライミングキットを使用してプローブ２５ｎｇを³²Ｐで標識し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って高ストリンジェンシーで４個のノーザンブロットにハイブリダイズした。図４及び図５はノーザンデータを示し、ＣＤＫ１０転写物が種々の成人ヒト組織（図４）と成人及び胎児ヒト脳の特定領域（図５）に存在することを示している。このデータは精巣、下垂体及び副腎に高い発現レベルを示している。脳の種々の領域における発現は比較的一定しており、前頭葉、側頭葉及び大脳皮質に高い発現が認められる。実施例７細胞増殖に及ぼすＣＤＫ：Ｄ１２７Ｎの効果ＤＭＥＭ高グルコース培地＋グルタミン＋１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ− ＢＲＬに推奨されているような濃度）でヒト骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ２（ＡＴＣＣＨＢＴ−８５）を増殖させた。実験は続けて２回実施した。トランスフェクションから２日前に細胞を１０ｃｍ培養皿に１：６に分割した。トランスフェクションはＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ（１９８７，Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２）によるＣａＰＯ₄法を使用して実施した。各プラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３：ＣＤＫ１０、ｐｃＤＮＡ３：ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ）１０μｇを各１０ｃｍ皿で〜６０％コンフルエント細胞にトランスフェクトした。細胞をダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で２回濯ぎ、新鮮な培地１０ｍＬを加えた。２日後に細胞をトリプシン処理し、１２ウェル皿に新鮮な培地＋５００μｇ／ｍＬゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）にプレーティングした。プレーティングから１１及び１６日後にコロニーを計数し、トランスフェクトした細胞のうちで増殖及びコロニー形成可能な細胞の数を測定した（表１）。このデータとｖａｎｄｅｎＨｅｕｖｅｌとＨａｒｌｏｗ（１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：２０５０−２０５４）に記載されているデータとの類推によると、キナーゼ不活性「優性ネガティブ」形態のＣＤＫ１０（即ちＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ）の発現はコロニー形成を悪化させると考えられる。実施例８細胞周期遺伝子の発現に及ぼす優性突然変異体ＣＤＫ：Ｄ１２７Ｎの特異的効果Ｅ１及びＥ３遺伝子を欠失する対照アデノウイルス又はＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎをコードする構築物を含む同一アデノウイルスでＨｅＬａ頚管癌細胞を４８時間処理した。ＣＤＫ１０タンパク質のＣ末端２５アミノ酸（配列番号３のアミノ酸３０１〜アミノ酸３２５）に対するウサギ抗体でウェスタンブロットを実施した。Ａｄ／ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎをトランスフェクトした細胞系は内因性野生型ＣＤＫ１０の５０倍のレベルでＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎを発現した。２種の感染細胞集団からｍＲＮＡを単離し、ほぼＬｏｃｋｈａｒｔら（１９９６，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１６７５−１６８０）に記載されているように遺伝子発現ＤＮＡチップ試験用プローブを作製した。ＣＤＫ１０− Ｄ１２７ＮによりｍＲＮＡレベルで抑制された遺伝子を表２に要約する。 ¹ オリゴヌクレオチドアレーの蛍光画像から測定した定量任意発現単位。これらのデータから明らかなように、細胞周期は優性ネガティブ突然変異遺伝子ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎにより妨害され、ＣＤＫ１０タンパク質が細胞周期に重要であることを示している。２種のウイルスで４８時間処理した細胞を（蛍光活性化細胞ソーター即ちＦＡＣＳを使用して）細胞周期分析した処、細胞は細胞周期の特定期間では妨害されないことが判明した。上記実施例の項に報告したデータは、細胞周期におけるＣＤＫ１０の重要性を示している。従って、ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬は細胞周期及び／又はＣＤＫ１０関連疾患又はＣＤＫ１０応答性症状の治療に有用であると思われ、ＣＤＫ１０− Ｄ１２７Ｎ等の優性ネガティブ突然変異体も、細胞周期疾患又は突然変異タンパク質の細胞周期調節能に応答性の症状の治療に有用であると思われる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月３日（１９９８．９．３）【補正内容】本発明の別の好適態様は配列番号１１に開示され、野生型形態（配列番号２）のヌクレオチド５８８が“Ｇ”から“Ａ”に突然変異している。本発明の別の好適態様は突然変異タンパク質（ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ）であり、配列番号１１のヌクレオチド５８８は野生型形態（配列番号２）に比較して “Ｇ”から“Ａ”に突然変異しており、その結果、配列番号１２に開示するように野生型アミノ酸配列（配列番号３）に比較してＡｓｐ１２７がＡｓｎ１２７に変化している。本発明は本明細書に開示するサイクリン依存性キナーゼの発現方法、これらのサイクリン依存性キナーゼを使用するアッセイ、これらのサイクリン依存性キナーゼを発現する細胞、及びこれらのサイクリン依存性キナーゼを使用することにより同定される化合物（例えばサイクリン依存性キナーゼとの直接接触、関連サイクリン又はＣＫＤ／サイクリン複合体を介するサイクリン依存性キナーゼのモジュレーター）にも関する。本方法で同定される前記モジュレーターはヒト癌に結び付けられる細胞増殖又は免疫細胞増殖を抑制するための治療薬として有用である。更に、ＣＤＫ−１０又はその活性突然変異体をコードする単離精製ＣＤＫ１０ｃＤＮＡは大量の各タンパク質の組換え生産に有用であろう。大量のタンパク質を生産できるならば、ＣＤＫ１０タンパク質又は本明細書に開示する具体的突然変異体等の突然変異体を含む治療薬の製造に有用であろう。ＣＤＫ１０タンパク質を含む治療薬は細胞周期及び／又はＣＤＫ１０関連疾患又はＣＤＫ１０応答性症状の治療に有用であり、場合により非限定的な例としてＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ等の突然変異体を含む治療薬は細胞周期疾患又は突然変異キナーゼの調節作用に応答性の症状の治療に有用であると思われる。本発明の単離核酸分子としては、１本鎖（コーディング又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）や、合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡが挙げられる。請求の範囲１．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記タンパク質がタンパク質のアミノ末端領域にサイクリン結合のためのペプチドモチーフＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕを含む前記精製ＤＮＡ分子。２．前記タンパク質が前記タンパク質のアミノ末端領域に保存ＡＴＰ結合モチーフ内の保存スレオニン残基と保存チロシン残基を欠失している請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子。３．前記タンパク質が前記タンパク質のカルボキシ末端領域に保存Ｔループドメインを欠失している請求項２に記載の精製ＤＮＡ分子。４．配列番号２に示す下記ヌクレオチド配列：を含む請求項３に記載の精製ＤＮＡ分子。５．配列番号２の約ヌクレオチド２１０〜約ヌクレオチド１１８５を含む請求項４に記載の精製ＤＮＡ分子。６．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子が配列番号３に示す下記アミノ酸配列：を含むタンパク質をコードする前記精製ＤＮＡ分子。７．組換え宿主細胞でヒトサイクリン依存性キナーゼを発現するための発現ベクターであって、請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む前記発現ベクター。８．ｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０、ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０及びｐＢＢＨ：ＣＫＤ１０から構成される群から選択される請求項７に記載の発現ベクター。９．組換えヒトサイクリン依存性キナーゼを発現する宿主細胞であって、請求項７に記載の発現ベクターを含む前記宿主細胞。１０．組換えヒトサイクリン依存性キナーゼを発現する宿主細胞であって、請求項８に記載の発現ベクターを含む前記宿主細胞。１１．配列番号１１に示す下記ヌクレオチド配列：を含む精製ＤＮＡ分子。１２．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子が配列番号１２に示す下記アミノ酸配列：を含むタンパク質をコードする前記精製ＤＮＡ分子。１３．組換え宿主細胞におけるヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質の発現方法であって、（ａ）請求項５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、（ｂ）発現ベクターからヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。１４．組換え宿主細胞でヒトサイクリン依存性キナーゼを発現させるための発現ベクターであって、請求項１１に記載のＤＮＡ分子を含む前記発現ベクター。１５．ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ及びｐＢＢＨ：ＣＫＤ１０− Ｄ１２７Ｎから構成される群から選択される請求項１４に記載の発現ベクター。１６．配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質に対する精製抗体。１７．配列番号３に示すアミノ酸配列から構成されるタンパク質に対する請求項１６に記載の精製抗体。１８．配列番号１２から構成されるアミノ酸配列から構成されるタンパク質に対する請求項１６に記載の精製抗体。１９．配列番号３の約アミノ酸３０１〜アミノ酸３２５を含むペプチドフラグメントに対する請求項１６に記載の精製抗体。２０．配列番号３のアミノ酸３０１〜アミノ酸３２５から構成されるペプチドフラグメントに対する請求項１９に記載の精製抗体。２１．配列番号３に示すアミノ酸配列を含む精製ヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質。２２．配列番号３に示すアミノ酸配列から構成される精製ヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質。２３．請求項１３に記載の方法により製造された精製ヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質。２４．配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む精製ヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質。２５．配列番号１２に示すアミノ酸配列から構成される精製ヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質。２６．物質がサイクリン依存性キナーゼ１０タンパク質に結合できるか否かを判定するための方法であって、（ａ）細胞でサイクリン依存性キナーゼ１０を発現させる発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより試験細胞を提供する段階と、（ｂ）試験細胞を物質に暴露する段階と、（ｃ）物質がサイクリン依存性キナーゼ１０に結合する量を測定する段階と、（ｄ）試験細胞で物質がサイクリン依存性キナーゼ１０に結合する量を、物質がサイクリン依存性キナーゼ１０をトランスフェクトしていない対照細胞に結合する量と比較する段階を含む前記方法。２７．ヒトサイクリン依存性キナーゼ１０が配列番号３に示すアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の方法。２８．ヒトサイクリン依存性キナーゼ１０が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＮＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記タンパク質がタンパク質のアミノ末端領域にサイクリン結合のためのペプチドモチーフＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕを含む前記精製ＤＮＡ分子。２．前記タンパク質が前記タンパク質のアミノ末端領域に保存ＡＴＰ結合モチーフ内の保存スレオニン残基と保存チロシン残基を欠失している請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子。３．前記タンパク質が前記タンパク質のカルボキシ末端領域に保存Ｔループドメインを欠失している請求項２に記載の精製ＤＮＡ分子。４．配列番号２に示す下記ヌクレオチド配列：を含む請求項３に記載の精製ＤＮＡ分子。５．配列番号２の約ヌクレオチド２１０〜約ヌクレオチド１１８５を含む請求項４に記載の精製ＤＮＡ分子。６．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子が配列番号３に示す下記アミノ酸配列：を含むタンパク質をコードする前記精製ＤＮＡ分子。７．組換え宿主細胞でヒトサイクリン依存性キナーゼを発現するための発現ベクターであって、請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む前記発現ベクター。８．ｐＬＩＴＭＵＳ２８：ＣＤＫ１０、ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０及びｐＢＢＨ：ＣＫＤ１０から構成される群から選択される請求項７に記載の発現ベクター。９．組換えヒトサイクリン依存性キナーゼを発現する宿主細胞であって、請求項７に記載の発現ベクターを含む前記宿主細胞。１０．組換えヒトサイクリン依存性キナーゼを発現する宿主細胞であって、請求項８に記載の発現ベクターを含む前記宿主細胞。１１．配列番号１１に示す下記ヌクレオチド配列：を含む精製ＤＮＡ分子。１２．ヒトサイクリン依存性キナーゼをコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子が配列番号１２に示す下記アミノ酸配列：を含むタンパク質をコードする前記精製ＤＮＡ分子。１３．組換え宿主細胞におけるヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質の発現方法であって、（ａ）請求項５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、（ｂ）発現ベクターからヒトサイクリン依存性キナーゼタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。１４．組換え宿主細胞でヒトサイクリン依存性キナーゼを発現させるための発現ベクターであって、請求項１１に記載のＤＮＡ分子を含む前記発現ベクター。１５．ｐｃＤＮＡ３．１：ＣＤＫ１０−Ｄ１２７Ｎ及びｐＢＢＨ：ＣＫＤ１０− Ｄ１２７Ｎから構成される群から選択される請求項１４に記載の発現ベクター。１６．配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質に対する精製抗体。１７．配列番号３に示すアミノ酸配列から構成されるタンパク質に対する請求項１６に記載の精製抗体。１８．配列番号１２から構成されるアミノ酸配列から構成されるタンパク質に対する請求項１６に記載の精製抗体。１９．配列番号３の約アミノ酸３０１〜アミノ酸３２５を含むペプチドフラグメントに対する請求項１６に記載の精製抗体。２０．配列番号３のアミノ酸３０１〜アミノ酸３２５から構成されるペプチドフラグメントに対する請求項１９に記載の精製抗体。