JP2004530427A

JP2004530427A - アカゲザルアンドロゲン受容体をコードするｄｎａ分子

Info

Publication number: JP2004530427A
Application number: JP2002587591A
Authority: JP
Inventors: タウラー，ドワイト・エイ; チエン，フアン
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2001-05-08
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2004-10-07
Also published as: US20040254105A1; WO2002090529A1; CA2446819A1; EP1392821A4; US7060463B2; EP1392821A1

Abstract

本発明はアカゲザル由来新規アンドロゲン受容体（ＡＲ）タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の単離と特性決定を開示する。組換えベクター、組換え宿主細胞、アカゲザルＡＲ（ｒｈＡＲ）活性モジュレーターのスクリーニング方法、ｒｈＡＲタンパク質の全部又は一部を含む精製タンパク質及び融合タンパク質、ｒｈＡＲタンパク質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニックマウス、並びにＡＲに対する抗体又はそのエピトープの生産も開示に含む。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は一面ではＭａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）アンドロゲン受容体（ｒｈＡＲ）タンパク質をコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明はｒｈＡＲをコードするＤＮＡフラグメントを含む組換えベクターと組換え宿主、ｒｈＡＲの実質的に精製された生物学的に活性な形態（前記タンパク質の前駆体形と成熟形を含む）、目的生物活性を維持する突然変異タンパク質、ｒｈＡＲ活性を調節する化合物の同定に関連する方法、並びにｒｈＡＲ活性を発現するように組換えた非ヒト動物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモン受容体を含む核内受容体スーパーファミリーは発生、分化及び生理機能を制御する役割をもつことが示されている。核内受容体をコードするｃＤＮＡクローンの単離により、数種の特性が明らかになっている。まず、ＮＨ_２末端領域又はＡ／Ｂドメインは受容体によって長さが異なり、ファミリーメンバー間の相同度が低い超可変部である。内部保存領域はドメインＣ、Ｄ及びＥ／Ｆと呼ぶ３種である。領域ＣはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と呼ぶシステインリッチな領域をコードする。領域Ｄ及びＥ／Ｆはタンパク質のＣＯＯＨ末端部内にある。領域Ｄはリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とも呼ぶヒンジ部をコードする。Ｐｏｗｅｒら（１９９２，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１３：３１８−３２３）参照。
【０００３】
ステロイド受容体を活性化する親油性ホルモンはヒト疾病に関係があることが知られている。従って、夫々の核内受容体が治療介入の潜在的ターゲットとして同定されている。各種ステロイドホルモン受容体の作用メカニズムについては、ＴｓａｉとＯ’Ｍａｌｌｅｙ（１９９４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：４５１−４８６）を参照されたい。
【０００４】
非ステロイド核内受容体に関する最近の研究によると、治療介入の薬剤ターゲットとしての可能性も示されている。この研究は保存ＤＢＤ領域により認識されたペルオキシソーム増殖因子応答性受容体ｇ（ＰＰＡＲｇ）が活性化されると脂肪細胞分化を促進することや、抗糖尿病薬の１種であるチアゾリジンジオンがＰＰＡＲｇを介して作用することを報告している（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら，１９９４，Ｃｅｌｌ７９：１１４７−１１５６；Ｌｅｈｍａｎｎら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２２）：１２９５３−１２９５６；Ｔｅｂｏｕｌら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４７）：２８１８３−２８１８７）。これはＰＰＡＲｇがグルコース恒常性と脂質代謝に関与することを示すものである。
【０００５】
Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら（１９９５，Ｃｅｌｌ８３：８３５−８３９）は核内受容体スーパーファミリーの公知メンバーについて記載している。
【０００６】
１９９７年３月２５日付けで発行されたＬｉａｏとＣｈａｎｇの米国特許第５，６１４，６２０号はヒト及びラットアンドロゲン受容体をコードするヌクレオチド配列と、夫々のアンドロゲン受容体のオープンリーディングフレーム内の完全アミノ酸配列を開示している。
【０００７】
１９９９年８月４日付けで発行されたＦｒｅｎｃｈらのヨーロッパ特許第０３６５６５７Ｂ１号はヒトアンドロゲン受容体をコードする組換えＤＮＡ分子と、ヒトアンドロゲン受容体タンパク質のアミノ酸配列を開示している。
【０００８】
Ｃｈｏｏｎｇら（１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４７：３３４−３４２）はチンパンジー、ヒヒ、キツネザル及びカニクイザル等の非ヒト霊長類のアミノ酸配列を開示している（カニクイザルアンドロゲン受容体のヌクレオチド配列については配列番号６参照、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ９４１７９参照）。
【０００９】
Ａｂｄｅｌｇａｄｉｒら（１９９９，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ６０：１２５１−１２５６）はアカゲザルコーディング領域の５’部分に相当するＰＣＲフラグメントを開示している（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０９２９３０も参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
薬理研究に使用される非ヒト霊長類のようにヒトアンドロゲン受容体遺伝子と近縁関係にあり、アンドロゲン受容体タンパク質をコードする他の遺伝子を同定できるならば有利であろう。アンドロゲン受容体は骨と筋肉の発生、再生及び維持の調節に重要な役割を果たすので、このような遺伝子と発現されたその機能タンパク質は特にこの調節が骨形成に関係する場合にアンドロゲン受容体の生物活性を調節する化合物を選択するためのアッセイで有用であろう。本発明は全長アカゲザルアンドロゲン受容体をコードする単離核酸分子を開示することによりこれらの必要に対処し、満足するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は一面では全長アカゲザルアンドロゲン受容体（ｒｈＡＲ）をコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）と、骨形成に活性なアンドロゲン選択性化合物の同定における発現ｒｈＡＲ又はその部分の使用に関する。本発明の単離ポリヌクレオチドはこの核内受容体スーパーファミリーの非ヒト霊長類メンバーをコードする。本明細書に開示するＤＮＡ分子は選択宿主細胞にトランスフェクトすることができ、組換え宿主細胞は実質的レベルの発現された機能的ｒｈＡＲの供給源をとなる。このような機能的核内受容体は骨と筋肉の発生、再生及び維持の調節に有効であり得るアンドロゲン受容体のモジュレーターを同定するためのスクリーニング法で使用するのに有効なターゲットとなろう。
【００１２】
本発明の１好適態様は図１Ａ〜Ｃと配列番号１に開示するｒｈＡＲをコードする単離ＤＮＡ分子である。ヌクレオチド１０５１は多形であり、「Ａ」ヌクレオチド又は「Ｇ」ヌクレオチドとして存在する（配列番号３参照）。
【００１３】
この点で、本発明の別の好適態様はヌクレオチド１０５１が「Ａ」ヌクレオチドでなく「Ｇ」ヌクレオチドである以外は図１Ａ〜Ｃと配列番号１に示す単離ＤＮＡ分子であり、この単離ＤＮＡ分子を更に配列番号３として開示する。
【００１４】
本発明は核内受容体スーパーファミリーに属する生物学的に活性なアカゲザルアンドロゲン受容体を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸フラグメントにも関する。１好適態様はｒｈＡＲの生物学的に機能的な誘導体を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１及び３の単離核酸フラグメント、特にｒｈＡＲオープンリーディングフレームのＬＢＤ及び／又はＤＢＤ領域の全部又は一部をコードする前記核酸フラグメントに関する。
【００１５】
本発明は本明細書の各所に開示する実質的に精製された核酸分子を含むようにトランスフェクト又は形質転換した原核及び真核両者の組換えベクター及び組換え宿主にも関する。
【００１６】
本発明の１好適側面は新規トランス作用性核内受容体タンパク質、図２（配列番号２）に開示するアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質及び配列番号２に開示するタンパク質の対立遺伝子変異体の実質的に精製された形態に関する。本明細書では対立遺伝子変異体の１例を配列番号４として開示する。配列番号２のｒｈＡＲのＧｌｕ−２１０残基は親対立遺伝子である。ヌクレオチド１０５１を（配列番号１の）「Ａ」から（配列番号３の）「Ｇ」に単一ヌクレオチド置換すると、ｒｈＡＲの残基２１０が配列番号２のＧｌｕ残基から対立遺伝子変異体として配列番号４に開示するようにＧｌｙ−２１０残基にアミノ酸置換する。
【００１７】
本発明の別の好適側面は配列番号１及び３に示すヌクレオチド配列又は上記のようなその核酸フラグメントを含むＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞から得られる実質的に精製され、完全にプロセシング（任意タンパク分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化を含む）された成熟ｒｈＡＲタンパク質に関し、前記ＤＮＡ発現ベクターは各ｒｈＡＲタンパク質又はｒｈＡＲ前駆体タンパク質を発現する。組換え宿主細胞は真核宿主細胞が特に好ましく、哺乳動物細胞系、昆虫細胞系又は酵母が挙げられるが、これらに限定しない。
【００１８】
本発明は配列番号２及び４に示すｒｈＡＲの生物学的に機能的な誘導体にも関し、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシル末端短縮等のｒｈＡＲ突然変異体及び生物学的に活性なフラグメントが挙げられるが、これらに限定するものではなく、これらのフラグメントは診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを提供し、ｒｈＡＲ機能のアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングに有用である。
【００１９】
本発明は各種化合物がｒｈＡＲのモジュレーターとして作用する能力又はｉｎｖｉｔｒｏ培養用細胞を提供することにより任意ｉｎｖｉｖｏ代替機能的ｒｈＡＲとして作用する能力を試験するために有用な非ヒトトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物とはトランスジーンと遺伝子を意味する。本明細書において、トランスジーンは遺伝子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物の細胞の１個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンはトランスジェニック動物の染色体の少なくとも１カ所に担持される。当然のことながら、遺伝子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、例えば本明細書に記載するｃＤＮＡクローンの１種又は組合せである。遺伝子及び／又はトランスジーンは当分野で公知の遺伝調節エレメント及び／又は構造エレメントも含むことができる。トランスジーンを導入するターゲット細胞の１例は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はｉｎｖｉｔｒｏ培養した着床前胚から取得し、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２２：４４５−４４８）。トランスジーンはＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション又はレトロウイルスによる導入等の各種標準技術によりＥＳ細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞をその後、非ヒト動物からの胚盤胞と結合することができる。導入したＥＳ細胞はその後、胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１４６８−１４７４）。野生型バックグラウンドとｒｈＡＲサブユニットの一方又は両方を欠損させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ突然変異体でｒｈＡＲトランスジーンを発現するトランスジェニック又はノックアウト無脊椎動物（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）を作製することも当業者に予想されよう。これらの生物は更にｒｈＡＲのドミナントネガティブ効果を検討し、この効果を調節する化合物を選択するのにも利用できよう。
【００２０】
本発明は該当動物に内在する機能的ｒｈＡＲ遺伝子にヘテロ接合の非ヒトトランスジェニック動物にも関する。本明細書において機能的とは細胞又はｉｎｖｉｔｒｏ系に存在する場合に一般に天然又は非改変条件又は環境にあるかのように機能する遺伝子又はタンパク質を表すために使用する。本発明のこの側面の動物は遺伝子のただ１個の機能的コピーをもつ動物でｒｈＡＲの特異的発現又は活性を試験するために有用である。前記動物は各種化合物がｒｈＡＲ活性もしくは発現のｉｎｖｉｖｏモジュレーターとして作用する能力又はｉｎｖｉｔｒｏ培養用細胞を提供することにより作用する能力を試験するためにも有用である。繰返すと、本明細書においてモジュレーターとはｒｈＡＲの発現もしくは活性を変化させるか又はｒｈＡＲとそのリガンドもしくは他のタンパク質の相互作用の効果を変化させる化合物である。本側面の１態様では、機能的天然ＡＲ遺伝子を欠失する別の動物の作製方法で前記動物を使用する。別の態様では、天然ＡＲ遺伝子の発現の不在下に非天然ｒｈＡＲ遺伝子を発現する動物を作製するための方法で本側面の動物を使用する。特定態様では、非ヒト動物はマウスである。
【００２１】
本発明のトランスジェニック動物とはトランスジーンと遺伝子を意味する。本明細書において、トランスジーンは遺伝子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物の細胞の１個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンはトランスジェニック動物の染色体の少なくとも１カ所に担持される。当然のことながら、遺伝子はｒｈＡＲ等のタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び／又はトランスジーンは当分野で公知の遺伝調節エレメント及び／又は構造エレメントも含むことができる。
【００２２】
本発明の１側面は天然ＡＲヌルバックグラウンドに非天然ｒｈＡＲ遺伝子を含むトランスジーンをもつトランスジェニック動物の作製方法である。本方法によると、細胞が機能的ｒｈＡＲタンパク質をコードする天然遺伝子と改変天然ＡＲ遺伝子にヘテロ接合の本発明のトランスジェニック動物を準備する。非天然ｒｈＡＲ遺伝子を含むトランスジーンにヘミ接合である本発明のトランスジェニック動物と先の動物を交配すると、改変天然ＡＲ遺伝子にヘテロ接合であると同時に非天然ｒｈＡＲ遺伝子にヘミ接合の動物が得られる。この動物を同系交配すると、非天然ｒｈＡＲにホモ接合又はヘミ接合であると共に改変天然ＡＲ遺伝子にホモ接合の動物が得られる。特定態様では、方法の段階で作製した任意動物から細胞系を作製する。
【００２３】
本発明のトランスジェニック動物はこれらの動物における非天然ｒｈＡＲの組織及び時間特異的発現パターンを試験するためにも有用である。前記動物は非天然ｒｈＡＲの野生型及び突然変異対立遺伝子の各種形態が天然ＡＲヌル欠損を修復する能力を試験するためにも有用である。前記動物は各種化合物が非天然ｒｈＡＲの発現もしくは活性のｉｎｖｉｖｏモジュレーターとして作用する能力又はｉｎｖｉｔｒｏ試験用の培養用細胞を提供することにより作用する能力を試験するためにも有用である。
【００２４】
ｒｈＡＲをもつトランスジェニックマウスとして、ｒｈＡＲ発現がマウス内在ＡＲよりも優勢であり、ｒｈＡＲ発現を組織特異的に誘導できるものが特に有用である。
【００２５】
本明細書において「標的遺伝子」又は「ノックアウト」（ＫＯ）とは人的介入（例えば本明細書に記載する方法が挙げられるが、これに限定するものではない）により非ヒト動物の生殖細胞系列に導入されるＤＮＡ配列である。本発明の標的遺伝子としては、コグネイト内在対立遺伝子を特異的に改変するように設計した核酸配列が挙げられる。改変ＡＲ遺伝子は宿主動物に内在すると同一のＡＲを完全にコードするのではなく、その発現産物を多少改変してもよいし、全く発現させなくしてもよい。天然ＡＲ遺伝子の不在下にトランスジェニック動物で非天然ｒｈＡＲを発現させることが有用な場合には、改変ＡＲ遺伝子は動物でヌル致死性ノックアウト表現型を誘導することが好ましい。しかし、改変度の少ないＡＲ遺伝子も有用な場合があり、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
トランスジーンを導入するターゲット細胞の１例は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はｉｎｖｉｔｒｏ培養した着床前胚から取得し、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２２：４４５−４４８）。トランスジーンはＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション又はレトロウイルスによる導入等の各種標準技術によりＥＳ細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞をその後、非ヒト動物からの胚盤胞と結合することができる。導入したＥＳ細胞はその後、胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１４６８−１４７４）。
【００２７】
標的組換えイベントと得られるノックアウトマウスの評価方法は容易に入手可能であり、当分野で公知である。このような方法としてはＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーションによる標的対立遺伝子の検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットによるＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の検出が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明はｒｈＡＲに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体、又は生物学的に機能的なその誘導体にも関する。特に、Ａ／Ｂドメインとヒンジドメイン、（Ｄドメイン）に対する抗体が好ましい。この点で、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体はｒｈＡＲレベルをスクリーニング及び測定するために使用することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体はｒｈＡＲの検出とタイピングに適したキットを処方するのに利用できる。
【００２９】
本発明はｒｈＡＲ活性を調節する化合物を同定するために使用されるアッセイにも関する。本発明のこの部分の１側面はＧＳＴ−ｒｈＡＲＬＢＤ融合タンパク質を使用するｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイであり、実施例２に示す。他のアッセイも考えられ、化合物の生体活性を測定するためのコトランスフェクションアッセイや、アカゲザルＡＲのＮＨ_２及びＣＯＯＨ末端相互作用に及ぼす化合物の効果を試験するための哺乳動物２ハイブリッドアッセイでｒｈＡＲｃＤＮＡクローン及び／又は発現タンパク質を使用することが挙げけられるが、これらに限定するものではない。このようなアッセイについては後述する。
【００３０】
本発明の１目的はヒトｒｈＡＲ等の核内受容体タンパク質の新規形態をコードする単離核酸分子、ｒｈＡＲ等の全長タンパク質のヒト核内受容体タンパク質フラグメント、並びに配列番号２及び４の誘導体である突然変異体を提供することである。このような任意ポリヌクレオチドとしてはヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシル末端短縮が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではなく、これらの突然変異体は診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ｒｈＡＲ機能のアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングに有用である。
【００３１】
本発明の別の目的は本発明のプローブ又は抗体を使用する組織タイピングである。１特定態様では、ポリヌクレオチドプローブを使用してｒｈＡＲｍＲＮＡを発現する組織を同定する。別の態様では、プローブ又は抗体を使用してｒｈＡＲ発現又はｒｈＡＲ受容体の提示に基づいて組織型を同定することができる。
【００３２】
本発明の別の目的は、上記核酸分子によりコードされるｒｈＡＲタンパク質又はタンパク質フラグメントを提供することであり、例えば本明細書に開示するようなｒｈＡＲヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞内で発現される前記ｒｈＡＲタンパク質が挙げられる。
【００３３】
本発明の別の目的はｒｈＡＲをコードする核酸配列又はその生物学的等価物を含む組換えベクター及び組換え宿主細胞を提供することである。
【００３４】
本発明の１目的は配列番号２及び４に示す実質的精製形態のｒｈＡＲを提供することである。
【００３５】
本発明の１目的はｒｈＡＲの生物学的に機能的な誘導体を提供することであり、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシル末端短縮が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではなく、これらのフラグメント及び／又は突然変異体は診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを提供する。
【００３６】
本発明の別の目的はｒｈＡＲをベースとするインフレーム融合構築物、これらの融合構築物と本明細書に開示する生物学的等価物を発現させる方法、関連アッセイ、これらの構築物を発現する組換え細胞、発現された融合タンパク質、及びこれらのｒｈＡＲをベースとする融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子の使用により同定されたアゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物を提供することである。好適融合構築物の１例はｒｈＡＲオープンリーディングフレームのＬＢＤ及び／又はＤＢＤ領域の全部又は一部をコードするものである。好適融合タンパク質の１例はこのような構築物から発現されるものである。
【００３７】
本発明の別の目的はｒｈＡＲ活性を調節する化合物を同定するためのアッセイを提供することである。
【００３８】
本明細書において「ＡＲ」とはアンドロゲン受容体を意味する。
【００３９】
本明細書において「ｒｈＡＲ」とはアカゲザルアンドロゲン受容体を意味する。
【００４０】
本明細書において「ＤＢＤ」とはＤＮＡ結合ドメインを意味する。
【００４１】
本明細書において「ＬＢＤ」とはリガンド結合ドメインを意味する。
【００４２】
本明細書において「ＳＡＲＭ」とは選択性アンドロゲン受容体モジュレーターを意味する。
【００４３】
本明細書において「哺乳動物宿主」なる用語はヒトを含む任意哺乳動物を意味する。
【００４４】
本明細書において「Ｒ１８８１」とはメチルトリエノールオン（１７ｂ−ヒドロキシ−１７−メチルエストラ−４，９，１１−トリエン−３−オンとしても知られる）を意味し、その製造はＶｅｌｌｕｘら，１９６３，Ｃｏｍｐｔ．Ｒｅｎｄ．２５７：５６９以下に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は全長アカゲザルアンドロゲン受容体（ｒｈＡＲ）をコードする遺伝子の同定及びクローニングと、組織選択的アンドロゲン化合物の同定におけるその使用に関し、このような化合物としては骨形成、筋同化、筋肉減少症の治療、閉経後症候群の緩和、良性前立腺肥大の治療、にきびの治療、多毛症の治療、男性性機能不全の治療、前立腺癌の予防と治療、脂質管理、アテローム硬化症の治療、乳癌の予防と治療に活性な化合物が挙げられる。アンドロゲン受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーである。同スーパーファミリーは構造的に同類の受容体群から構成されるが、化学的に異なるリガンドにより調節される。その共通構造はペプチドの中心に位置する保存ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＣ末端の保存リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）である。９種の非変異体システインのうちの８種が他のＤＮＡ結合タンパク質からこれらを区別する２個のＩＩ型亜鉛フィンガーを形成する。
【００４６】
本発明は新規Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）アンドロゲン受容体（ｒｈＡＲ）をコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の単離ポリヌクレオチドはこの核内受容体スーパーファミリーの非霊長類メンバーをコードする。本明細書に開示するＤＮＡ分子は選択宿主細胞にトランスフェクトすることができ、組換え宿主細胞は同様に本発明の一部を形成する実質的レベルの発現され、実質的に精製された機能的ｒｈＡＲの供給源となる。本明細書に記載するように、このような機能的核内受容体は骨と筋肉の発生、再生及び維持の調節、前立腺疾患の治療、脂質代謝と海馬機能の調節に有効であり得るアンドロゲン受容体のモジュレーターを同定するためのスクリーニング法で使用するのに有効なターゲットとなろう。ＡＲの機能異常が前立腺癌の原因となることも知られている。蓄積情報によると、アンドロゲン欠損の結果として骨量増加等の各種骨代謝異常を招くことも示されている。アンドロゲン療法は男女各種疾患を治療するために広く使用されている。しかし、所望効果（即ち骨増進）をもつと同時に副作用（即ち攻撃的行動、にきび）の少ないアンドロゲンモジュレーターの開発には至っていない。ホルモン補充療法の最近の進歩により選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ）の開発の可能性が立証されている。Ｊ．ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８４（１０）：３４５９（１９９９）。従って、安全なアンドロゲン薬剤開発には本明細書に開示するｒｈＡＲ等のＡＲを使用する化合物スクリーニングシステムが必要である。
【００４７】
本発明の１好適態様は図１Ａ〜Ｃと配列番号１に開示するｒｈＡＲをコードする単離ＤＮＡ分子である。ヌクレオチド１０５１は多形であり、「Ａ」ヌクレオチド又は「Ｇ」ヌクレオチドとして存在する（配列番号３参照）。この態様を以下に示し、１０５１−Ａを太字下線で示す。
【００４８】
【化１】

【００４９】
上述のように、ヌクレオチド１０５１は単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）に相当する。この点で、本発明の別の好適態様はヌクレオチド１０５１が「Ａ」ヌクレオチドでなく「Ｇ」ヌクレオチドである以外は図１Ａ〜Ｃと配列番号１に示す単離ＤＮＡ分子であり、この単離ＤＮＡ分子を更に下記配列番号３として開示し、１０５１−Ａを太字下線で示す。
【００５０】
【化２】

【００５１】
上記に例示した単離ＤＮＡ分子は以下の特性をもつ。配列番号１はＭｅｔ（ヌクレオチド４２３〜４２５）から開始し、「ＴＣＡ」終結コドン（ヌクレオチド３１０６〜３１０８）をもち、ヌクレオチド１０５１（「Ａ」）を多形部位とする３１７５ヌクレオチドであり、オープンリーディングフレームにより配列番号２に示すアミノ酸残基２１０がＧｌｕ（Ｅ）残基である８９５アミノ酸のタンパク質を発現する。配列番号３はＭｅｔ（ヌクレオチド４２３〜４２５）から開始し、「ＴＣＡ」終結コドン（ヌクレオチド３１０６〜３１０８）をもち、ヌクレオチド１０５１（「Ｇ」）を多形部位とする３１７５ヌクレオチドであり、オープンリーディングフレームにより配列番号４に示すアミノ酸残基２１０がアミノ酸残基２１０がＧｌｙ（Ｇ）残基である８９５アミノ酸のタンパク質を発現する。
【００５２】
本発明は核内受容体スーパーファミリーに属する生物学的に活性なアカゲザルアンドロゲン受容体を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸フラグメントにも関する。１好適態様はｒｈＡＲの生物学的に機能的な誘導体を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１及び３の単離核酸フラグメントに関する。このような任意核酸フラグメントはｒｈＡＲ（配列番号２及び４）に存在するｒｈＡＲ核内受容体ファミリードメインで保存されているドメインである細胞内ＤＮＡ結合ドメイン及び／又はリガンド結合ドメインを少なくとも含むタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする。このような任意ポリヌクレオチドとしてはヌクレオチド置換（例えば本明細書に開示する単一ヌクレオチド置換等のＳＮＰや、ＳＮＰの公知仮定義に該当する欠失及び／又は挿入が挙げられるが、これらに限定されない）、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシル末端短縮が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、これらの突然変異体は診断、治療又は予防用タンパク質又はタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ｒｈＡＲのアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングに有用である。
【００５３】
本発明の単離核酸分子としてはデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）が挙げられ、例えば１本鎖（コーディング鎖又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）や、合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡが挙げられる。本発明の単離核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。好適鋳型はＤＮＡである。
【００５４】
特定アミノ酸をコードする各種コドンには実質的量の冗長があることが知られている。従って、本発明は以下のように最終的に同一アミノ酸の翻訳をコードする代替コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列にも関する。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＧ，ＧＣＧ，ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ，ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ。
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００５５】
従って、本発明は同一タンパク質を発現する異なるＤＮＡ分子を生じ得るコドン冗長を開示する。本明細書の趣旨では、１個以上の置換コドンをもつ配列を縮重変異と定義する。発現タンパク質の最終物性を実質的に変えない限り、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質の突然変異も本発明の範囲に含む。例えば、ロイシンをバリン、リジンをアルギニン、又はグルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能は変わらない。
【００５６】
天然に存在するペプチドとは異なる性質をもつペプチドをコードするようにペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変できることは知られている。ＤＮＡ配列の改変方法としては部位特異的突然変異誘発が挙げられるが、これに限定されない。改変性質の例としては基質に対する酵素の親和性又はリガンドに対する受容体の親和性の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書において「精製」と「単離」は同義に使用することができ、該当核酸、タンパク質及び又はその各フラグメントを当業者が操作できるようにそのｉｎｖｉｖｏ環境から実質的に取出した割合を表し、このような操作としてはヌクレオチドシーケンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発、核酸フラグメントの発現ベクターへのサブクローニング、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作製する機会を得られるように純量のタンパク質又はタンパク質フラグメントの取得、アミノ酸シーケンシング及びペプチド消化が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明で請求する核酸は全細胞又は細胞溶解液又は部分精製もしくは実質精製形態とすることができる。核酸は環境汚染を除去した場合に実質的に精製されているとみなす。即ち、細胞から単離した核酸配列は常法により細胞成分を除去した場合に実質的に精製されているとみなし、化学合成核酸配列はその化学前駆体を除去した場合に実質的に精製されているとみなす。
【００５８】
ｒｈＡＲをクローニングするには各種方法の任意のものを使用することができる。これらの方法としては以下のものが挙げられるが、これらに限定するものではない。（１）ＲＡＣＥＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２）。５’及び／又は３’ＲＡＣＥを実施して全長ｃＤＮＡ配列を作製することができる。このストラテジーはｒｈＡＲｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。これらの遺伝子特異的プライマーは任意数の公開核酸及びタンパク質データベースを検索して同定した発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定により設計する。（２）適当な発現ベクターシステムでｒｈＡＲを含むｃＤＮＡライブラリーの構築後にｒｈＡＲを直接機能的に発現させる。（３）ｒｈＡＲタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＡＲを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。（４）ｒｈＡＲタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＡＲを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。この部分ｃＤＮＡはｒｈＡＲタンパク質に類似する他の核内受容体について分かっているアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによりｒｈＡＲＤＮＡフラグメントを特異的にＰＣＲ増幅することにより得られる。（５）ｒｈＡＲタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＡＲを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。このストラテジーも上記のようにＥＳＴとして同定したｒｈＡＲｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合もある。（６）配列番号１又は３を鋳型として５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計し、公知ＰＣＲ技術により全長ｃＤＮＡを作製できるようにするか、又はこれらの同一公知ＰＣＲ技術によりコーディング領域の一部を作製し、ｒｈＡＲをコードするヌクレオチド分子の全長形を単離するために多種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーの１つをスクリーニングするためのプローブとして使用するようにコーディング領域の一部を作製及び単離できるようにする。
【００５９】
当業者に自明の通り、他の型のライブラリーや、他の細胞型もしくは種型から構築したライブラリーもｒｈＡＲをコードするＤＮＡ又はｒｈＡＲ相同体を単離するのに有用であり得る。他の型のライブラリーとしては、ｒｈＡＲ細胞又は組織以外の他の細胞又は細胞系（例えばｒｈＡＲをコードするＤＮＡを含み得るマウス細胞、齧歯類細胞又は他の任意脊椎動物宿主）に由来するｃＤＮＡライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。更に、脊椎動物ゲノムライブラリーのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドによるハイブリダイゼーションによりｒｈＡＲ遺伝子及び相同体を単離することもでき、このようなライブラリーとしてはマウスゲノムライブラリー、齧歯類ゲノムライブラリー及び併用ｒｈＡＲゲノムライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
当業者に自明の通り、ｒｈＡＲ活性をもつ細胞又は細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ｒｈＡＲをコードするｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーの作製に使用する細胞又は細胞系の選択はこのような目的に利用可能な任意公知アッセイを使用してまず細胞関連ｒｈＡＲ活性を測定することにより実施することができる。
【００６１】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は当分野で周知の標準技術により実施することができる。周知ｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。ｃＤＮＡライブラリーは多数の製造業者から入手することもでき、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．やＳｔｒａｔａｇｅｎｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
同様に当業者に自明に通り、ｒｈＡＲをコードするＤＮＡは適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離することもできる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当分野で周知の標準技術により実施することができる。周知ゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されている。
【００６３】
好適方法の１種によりｒｈＡＲ遺伝子をクローニングするためには、ｒｈＡＲ又は相同タンパク質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列が必要であると思われる。これを実施するためには、ｒｈＡＲタンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動シーケンサー又は質量分析により部分アミノ酸配列を決定することができる。完全アミノ酸配列を決定する必要はなく、６〜８アミノ酸の２領域の直鎖配列を決定して部分ｒｈＡＲＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅すればよい。適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらの配列をコードすることが可能なＤＮＡ分子を合成する。遺伝コードの縮重により特定アミノ酸をコードするのに２種以上のコドンを使用することができるので、１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドの任意のものによりアミノ酸をコードすることができる。１組の１メンバーのみがｒｈＡＲ配列に一致し、同じ組の他のメンバーはミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもｒｈＡＲＤＮＡとハイブリダイズすることができる。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドもｒｈＡＲをコードするＤＮＡを精製及び単離するために十分にｒｈＡＲＤＮＡとハイブリダイズすることができる。あるいは、１種以上の市販ゲノムデータベースを検索することにより発現配列のある領域のヌクレオチド配列を同定することもできる。遺伝子特異的プライマーを使用してｃＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡ集団から目的ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施してもよい。上述のように、ｒｈＡＲをコードする全長配列を作製するためにオーバーラップする５’及び３’ＲＡＣＥ産物を単離する目的、あるいはｒｈＡＲ又はｒｈＡＲ様タンパク質をコードする全長分子を単離するために１種以上のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用するためにｒｈＡＲをコードするヌクレオチド分子の一部を単離する目的でＰＣＲ法で使用するのに適したヌクレオチド配列は配列番号１又は１８〜２０から得られる。
【００６４】
方法の１例では、アカゲザル前立腺ｍＲＮＡから合成した鋳型ｃＤＮＡをスクリーニングすることにより本発明のｒｈＡＲ全長ｃＤＮＡを単離した。アカゲザルＡＲに基づくオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。アカゲザル前立腺ｍＲＮＡから鋳型ｃＤＮＡを合成した。ＮＨ_２部分とＣＯＯＨ部分からなるプライマー対を使用して２つのＰＣＲフラグメントを作製し、サブクローニングし、特性決定し、全長ＤＮＡ配列（配列番号１及び３）を構築した。クローニングしたアカゲザルＡＲｃＤＮＡはコーディング領域にカニクイザルＡＲと７ヌクレオチド変異があり、その結果、２個のアミノ酸残基が変異している（図４）。２つのアカゲザルｐｏｌｙＱ及びｐｏｌｙＧ配列は相互に一致しており、対応するヒト配列よりも短い。ＤＢＤ−ヒンジ−ＬＢＤ領域にアカゲザルとヒトのＡＲ間の単一アミノ酸変異［Ａｌａ−６３２］が存在する。
【００６５】
本発明は本明細書に開示する核酸分子でトランスフェクト及び／又は形質転換した原核及び真核両者の組換えベクターと組換え宿主にも関する。
【００６６】
本発明は本明細書に開示するｒｈＡＲ及び生物学的等価物の発現方法、前記タンパク質の発現され、プロセシングされた形態、これらの組換え発現遺伝子産物を使用するアッセイ、これらの遺伝子産物を発現する細胞、並びにこれらの組換え形を利用するアッセイを使用して同定されたアゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物（例えばＬＢＤとの直接接触又はＤＢＤもしくはアンドロゲン受容体とトランス相互作用する野生型転写複合体と相互作用するリガンドとの直接もしくは間接接触により同定され、骨生態を調節する１種以上のｒｈＡＲモジュレーターが挙げられるが、これに限定するものではない）にも関する。
【００６７】
本発明は組換え系でｒｈＡＲを発現させ、ｒｈＡＲのアゴニストとアンタゴニストを同定する方法にも関する。本発明の新規ｒｈＡＲタンパク質は哺乳動物ｒｈＡＲのトランス活性化活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ法で使用するのに適している。本明細書に記載するｒｈＡＲ活性の調節としては、この可溶性トランス作用因子の阻害又は活性化が挙げられ、従って、ｒｈＡＲ活性の正常調節への直接又は間接作用が挙げられる。ｒｈＡＲを調節する化合物としてはアゴニスト、アンタゴニスト及びｒｈＡＲの調節に直接又は間接的に作用する化合物が挙げられる。ターゲットタンパク質と特異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために化合物をスクリーニングする場合には、同定される化合物がターゲットタンパク質にできるだけ特異的になるようにする必要がある。このためには、ターゲット受容体に類似するできるだけ広範なタンパク質（例えばアカゲザル受容体に相同の種）に対して化合物をスクリーニングすることが必要であると思われる。即ち、ｒｈＡＲと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、化合物がｒｈＡＲ（「プラスターゲット」）と相互作用してｒｈＡＲを介して所望薬理効果を生じるようにするだけでなく、化合物がタンパク質Ｂ、Ｃ、Ｄ等（「マイナスターゲット」）と相互作用しないことを確かめることも必要である。一般に、スクリーニングプログラムの一面として、マイナスターゲットをできるだけ多くすることが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：９７３−９８０，ｐ．９８０参照）。ｒｈＡＲタンパク質とこのタンパク質をコードするＤＮＡ分子は例えば核内受容体スーパーファミリーの他のメンバーを利用するアッセイでこの目的に利用できる。
【００６８】
本明細書において野生型ｒｈＡＲの「生物学的に機能的な誘導体」は野生型ｒｈＡＲの生物活性に類似する生物活性をもつ。「機能的誘導体」なる用語は野生型ｒｈＡＲタンパク質の「フラグメント」、「突然変異体」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「相同体」を意味する。「フラグメント」なる用語は野生型ｒｈＡＲの任意ポリペプチドサブセットを意味し、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシル末端短縮を含むｒｈＡＲタンパク質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定しない。「突然変異体」なる用語は野生型と実質的に類似していてもよいが、異なる生物特性をもつ生体活性フラグメントのサブセットを意味する。このような特性改変としては基質結合の改変、基質親和性の改変及びｒｈＡＲ又はｒｈＡＲ機能的誘導体の生物活性に作用する化合物に対する感受性の改変が挙げられるが、これらに限定されない。「変異体」なる用語は野生型タンパク質又はそのフラグメントに構造と機能が実質的に類似する分子を意味する。
【００６９】
各種哺乳動物発現ベクターを使用して組換えｒｈＡＲを哺乳動物細胞で発現させることができる。本明細書では、クローニングしたＤＮＡを転写してそのｍＲＮＡを適当な宿主で翻訳するために必要なＤＮＡ配列として発現ベクターを定義する。このようなベクターを使用すると細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞等の各種宿主で真核ＤＮＡを発現させることができる。特別に設計したベクターは細菌−酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間でＤＮＡを交換することができる。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞で自律複製するための複製起点と、選択マーカーと、制限数の有用制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、活性プロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力プロモーターは高頻度でｍＲＮＡに開始させるプロモーターである。発現ベクターとしてはクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
組換えｒｈＡＲ発現に利用可能な市販哺乳動物発現ベクターとしてはｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８及びｐＬＩＴＭＵＳ３９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
各種細菌発現ベクターを使用して細菌細胞で組換えｒｈＡＲを発現させることができる。組換えｒｈＡＲ発現に利用可能な市販細菌発現ベクターとしてはｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）並びにｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
各種真菌細胞発現ベクターを使用して真菌細胞で組換えｒｈＡＲを発現させることができる。組換えｒｈＡＲ発現に利用可能な市販真菌細胞発現ベクターとしてはＳ．ｐｏｍｂｅを発現宿主として利用するＥＳＰ（登録商標）酵母発現系、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
各種昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫細胞で組換え受容体を発現させることができる。組換えｒｈＡＲ発現に利用可能な市販昆虫細胞発現ベクターとしてはｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）やｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
ｒｈＡＲ又はｒｈＡＲ様タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して組換え宿主細胞でｒｈＡＲを発現させることができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば細菌（例えば大腸菌）、真菌細胞（例えば酵母）、哺乳動物細胞（例えばウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来ｒｈＡＲ細胞系が挙げられるが、これらに限定されない）、及び昆虫細胞（例えばショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物種に由来する利用可能な市販細胞系としてはＬ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）及びＣＰＡＥ（ＡＴＣＣＣＣＬ２０９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
発現ベクターは多数の技術の任意の１種により宿主細胞に導入することができ、例えばトランスフェクション、形質転換、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターを導入した細胞を個々に分析し、ｒｈＡＲタンパク質を産生するか否かを判定する。ｒｈＡＲを発現する細胞の同定は数種の手段により実施することができ、例えば抗ｒｈＡＲ抗体との免役反応性、標識リガンド結合及び宿主細胞関連ｒｈＡＲ活性の存在が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
上記方法により得られたクローン化ｒｈＡＲｃＤＮＡを適当なプロモーターと他の適切な転写調節エレメントを含む発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＱＥ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ及びｐＬＩＴＭＵＳ２８）への分子クローニングにより組換え発現させ、原核又は真核宿主細胞に導入して組換えｒｈＡＲを生産することができる。このような操作技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されており、実施例に詳述するが、当業者には周知であり、容易に実施できる。
【００７７】
ｉｎｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用してｒｈＡＲＤＮＡの発現を実施してもよい。合成ｍＲＮＡは種々の無細胞系（例えば麦芽エキスや網状赤血球エキスが挙げられるが、これらに限定されない）に効率的に翻訳することができ、更に例えばカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションにより細胞系に効率的に翻訳することもでき、これに限定するものではないが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００７８】
最適レベルのｒｈＡＲが得られるｒｈＡＲｃＤＮＡ配列を決定するためには、ｃＤＮＡ分子を構築することができ、例えばｒｈＡＲの全長オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡフラグメントや、タンパク質の特定ドメインのみ又はタンパク質の再配置ドメインをコードするｃＤＮＡの部分を含む各種構築物が挙げられるが、これらに限定されない。全構築物はｒｈＡＲｃＤＮＡの５’及び／又は３’非翻訳領域を全く含まないように設計してもよいし、その全部又は一部を含むように設計してもよい。ｒｈＡＲの発現レベルと活性はこれらの構築物を適当な宿主細胞に単独及び併用導入後に決定することができる。トランジェントアッセイで最適発現を生じるｒｈＡＲｃＤＮＡカセットを決定した後に、このｒｈＡＲｃＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞等の種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入するが、これらに限定するものではない。
【００７９】
本発明の１好適側面は新規トランス作用性核内受容体タンパク質、図２（配列番号２）に開示するアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質及び配列番号２に開示するタンパク質の多形体（本明細書に配列番号４として開示）の実質的に精製された形態に関する。
【００８０】
配列番号２に開示するｒｈＡＲタンパク質を以下に示す。
【００８１】
【化３】

【００８２】
上述のように、配列番号２のｒｈＡＲのＧｌｕ−２１０残基（下線太字部分）は配列番号１のヌクレオチド１０５１の立遺伝子変異体に相当する。ヌクレオチド１０５１を「Ａ」から「Ｇ」に単一ヌクレオチド置換すると、ｒｈＡＲの残基２１０が配列番号２のＧｌｕ残基から配列番号４として以下に示すＧｌｙ残基（下線太字部分）にアミノ酸置換する。
【００８３】
【化４】

【００８４】
配列番号２及び４の下線部（アミノ酸残基５３５〜残基６００）はｒｈＡＲ受容体タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に相当する。ＤＢＤはＡＲトランス抑制経路におけるタンパク質−タンパク質相互作用の調節に関与している。Ａａｒｎｉｓａｌｏら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４０（７）：３０９７（１９９９）。アンドロゲン受容体の転写活性化及び抑制機能はＤＮＡ結合ドメインの突然変異により示差的影響を受ける。トランス活性化では、ＡＲはＤＢＤを介してホモダイマーを形成し、ＤＮＡ応答エレメントと結合する。
【００８５】
本発明は配列番号１及び３に示すヌクレオチド配列又は上記のようなその核酸フラグメントを含むＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞から得られる実質的に精製され、完全にプロセシング（天然、ハイブリッドもしくは合成配列のプロセシング等のタンパク分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化を含む）された成熟ｒｈＡＲタンパク質にも関し、前記ＤＮＡ発現ベクターは各ｒｈＡＲタンパク質又はｒｈＡＲ前駆体タンパク質を発現する。組換え宿主細胞は真核宿主細胞が特に好ましく、哺乳細胞系又は昆虫細胞系酵母が挙げられるが、これらに限定しない。別の態様では、組換え宿主細胞は酵母宿主細胞が特に好ましい。
【００８６】
本発明は哺乳動物ＡＲを調節する化合物を同定するためのアッセイで有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離核酸分子にも関する。本発明のこの部分の１好適側面としてはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＧＳＴ−ｒｈＡＲ融合構築物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの融合構築物としては、ｒｈＡＲのリガンド結合ドメインの全部又は一部と夫々ＧＳＴ遺伝子のカルボキシ末端のインフレーム融合体が挙げられるが、これらに限定されない。配列番号１及び３の開示は、ＧＳＴ−核内受容体融合タンパク質をコードするこのような任意核酸分子を構築するために必要な情報を当業者に提供する。各種発現系で可溶性組換えＧＳＴ−核内受容体融合タンパク質を発現させることができ、このような発現系としては酵母発現系（実施例２参照）や、バキュロウイルス発現ベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＤＮＡ又はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品ｐＡｃＧ２Ｔ）を使用する昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のＳｐｏｄｅｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）が挙げられるが、これらに限定されない。実施例２は酵母で発現されるＧＳＴ−Ｆｌａｇ−ｒｈＡＲＬＢＤ（Ｍｒ＝６０ｋＤａ）の構築を開示している。この融合タンパク質を常法により精製し、標識Ｒ１８８１と未標識試験化合物の存在下にヒドロキシアパタイト結合アッセイで使用する。濃度を上げながら未標識試験化合物を^３Ｈ−Ｒ１８８１と共にインキュベートする平行結合反応後にヒドロキシアパタイトスラリーを調製して処理する。未結合リガンドを除去した後にヒドロキシアパタイトペレットを洗浄し、リガンドに結合したＧＳＴ−ｒｈＡＲを試験し、組換えｒｈＡＲ融合タンパク質に結合した放射性リガンド（^３Ｈ−Ｒ１８８１）を定量する。約１ｎＭのＩＣ５０を示す公知高親和性リガンド（例えば５−αジヒドロテストステロンや未標識Ｒ１８８１）と結果を比較する。ＡｓｓｅｌｉｎとＭｅｌａｎｃｏｎ，１９７７，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ３０：５９１−６０４；Ｇｈａｎａｄｉａｎら，１９７７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．５（４）：１６９−１７３参照。
【００８７】
本発明のｒｈＡＲｃＤＮＡクローンには他のアッセイも考えられ、例えばこれらのクローンを使用して化合物の生物活性を測定するためのコトランスフェクションアッセイを計画したり、アカゲザルＡＲのＮ及びＣ末端相互作用に及ぼす化合物の効果を試験するための哺乳動物２ハイブリッドアッセイを計画することもできるが、これらに限定されない。
【００８８】
例えば、本発明は受容体構築物（例えばｒｈＡＲＬＢＤを含む構築物、例えばＧａｌ４−ｒｈＡＲ−ＬＢＤ）と受容体構築物の発現の増減に応答する調節部位をもつレポーター構築物（例えばＳＥＡＰ又はＬａｃＺ）を含む構築物に関する。従って、本発明はｒｈＡＲのモジュレーターを同定するアッセイを含む。他の受容体のアゴニストとアンタゴニストの同定方法は当分野で周知であり、ｒｈＡＲのｉｎｖｉｖｏレベルに作用する化合物を同定するように改変することができる。従って、本発明はある物質がＡＲレベルの潜在的モジュレーターであるか否かを判定する方法を含み、本方法は、
（ａ）受容体ベクターとしても公知のｒｈＡＲ（例えばｒｈＡＲのＬＢＤ）をコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は形質転換する段階と、
（ｂ）タンパク質−タンパク質相互作用によりｒｈＡＲに応答するが、レポーター遺伝子の上流に融合した非ｒｈＡＲタンパク質又はプロモーターフラグメントと結合することが分かっているエレメントを含むレポーターベクターとしても公知の第２の発現ベクターを段階（ａ）の細胞にトランスフェクト又は形質転換する段階と、
（ｃ）ｒｈＡＲを発現させるために十分な時間トランスフェクトした細胞を増殖させる段階と、
（ｄ）トランスフェクトした細胞のうちでｒｈＡＲを発現する細胞の一部（「試験細胞」）を試験物質に暴露すると共に、対照細胞を試験物質に暴露せずにおく段階と、
（ｅ）試験細胞と対照細胞でレポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む。
【００８９】
当然のことながら、このようなアッセイの「対照」は多数の形態をとることができ、例えば上記段階（ｄ）に記載したものでもよいし、場合によってはｒｈＡＲを発現する核酸分子をトランスフェクトしない細胞（即ち非トランスフェクト細胞）を使用してもよいし、ｒｈＡＲのコーディング領域を除いたベクター単独をトランスフェクトした細胞を使用してもよいが、これらに限定するものではない。また、方法の段階（ｄ）を実施する条件はタンパク質−リガンド相互作用の試験に当分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的ｐＨ、ＰＢＳ等の通常使用される緩衝液や組織培地中の塩条件、約４℃〜約５５℃の温度である。本アッセイは粗細胞溶解液で実施してもよいし、精製材料で実施してもよい。あるいは、トランス抑制アッセイは、
（ａ）ｒｈＡＲ又はその一部（例えばｒｈＡＲのＬＢＤ）を細胞で発現させる受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより試験細胞を提供する段階と、
（ｂ）タンパク質−タンパク質相互作用を介してｒｈＡＲに応答する調節エレメント又はｒｈＡＲ構築物の一部の制御下にレポーター遺伝子を発現させる第２のレポーター発現ベクターを段階（ａ）の細胞にトランスフェクトすることにより試験細胞を提供する段階と、
（ｃ）試験細胞を物質に暴露する段階と、
（ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定する段階と、
（ｅ）段階（ｂ）のレポーターベクターをトランスフェクトし、段階（ａ）の受容体ベクターをトランスフェクトしていない対照細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を比較する段階により実施することもできる。
【００９０】
本アッセイは細胞浸透性試験化合物を使用して導入哺乳動物細胞系で実施することができる。
【００９１】
代替アッセイとして、トランス作用因子の一般性質を測定できるように多重受容体／レポーター構築物を細胞にトランスフェクトしてもよい。当然のことながら、本発明の核内受容体タンパク質が異種ＤＮＡ結合タンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用により目的プロモーターの転写に作用する能力に及ぼす物質の影響を測定するためのアッセイを提供するために、当業者に公知の任意数の変異体を使用してもよい。
【００９２】
本発明は更に物質がｒｈＡＲに結合することができるか否か、即ち物質がｒｈＡＲの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストであるかを判定する方法も含み、本方法は、
（ａ）ｒｈＡＲを細胞で発現させる発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより試験細胞を提供する段階と、
（ｂ）試験細胞と対照細胞を物質に暴露する段階と、
（ｃ）物質のｒｈＡＲ結合量を測定する段階と、
（ｄ）試験細胞における物質のｒｈＡＲ結合量を、ｒｈＡＲ又はその一部をトランスフェクトしていない対照細胞と物質の結合量と比較し、物質の結合量が対照細胞よりも試験細胞のほうが多い場合には物質がｒｈＡＲと結合できると判定する段階を含む。その後、例えば上記トランス抑制アッセイ等の機能的アッセイの使用により、物質が実際にアゴニスト又はアンタゴニストであるかを判定することができる。
【００９３】
遺伝子発現によりｒｈＡＲ機能を調節する試験化合物は上記方法を使用して評価することができる。
【００９４】
方法の段階（ｂ）を実施する条件はタンパク質−リガンド相互作用の試験に当分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的ｐＨ、ＰＢＳ等の通常使用される緩衝液や組織培地中の塩条件、約４℃〜約５５℃の温度である。
【００９５】
上記アッセイはｒｈＡＲを一過的又は安定的にトランスフェクトした細胞で実施することができる。トランスフェクションとはｒｈＡＲを試験細胞に導入するために当分野で公知の任意方法を意味する。例えば、トランスフェクションとしてはリン酸カルシウム又は塩化カルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、ｒｈＡＲを含むレトロウイルス構築物の感染、及びエレクトロポレーションが挙げられる。物質又はアゴニストとｒｈＡＲの結合を測定する場合には、標識物質又はアゴニストを使用することによりこのような結合を測定することができる。前記物質又はアゴニストは当分野で公知の簡便な任意方法（例えば放射性、蛍光、酵素）により標識することができる。
【００９６】
本発明のｒｈＡＲはリガンドに結合したｒｈＡＲ転写因子のタンパク質−タンパク質相互作用により進行する転写調節を評価することによりｒｈＡＲリガンドをスクリーニングするために使用することができる。あるいは、本発明のｒｈＡＲはｒｈＡＲＤＢＤに結合する古典的核内受容体応答エレメントとのコトランスフェクションを使用してｒｈＡＲリガンドをスクリーニングするために使用することもできる。
【００９７】
本発明はｒｈＡＲに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体にも関する。全長ｒｈＡＲタンパク質又はｒｈＡＲタンパク質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体から作製した免疫アティニティーカラムを使用することにより他の細胞タンパク質から組換えｒｈＡＲタンパク質を分離することもできる。更に、配列番号２及び／又は配列番号４に開示するようなタンパク質の一部から合成ペプチド（通常は約９〜約２５アミノ酸長）に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を生産することもできる。ｒｈＡＲに対する単一特異抗体はｒｈＡＲに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか又はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）を使用してｒｈＡＲに反応性のモノクローナル抗体として調製する。本明細書において単一特異抗体とは単一抗体種又はｒｈＡＲに対して均一結合特性をもつ多重抗体種として定義される。本明細書において均一結合とは抗体種が特定抗原又はエピトープ（例えば上記のようにｒｈＡＲに関連するもの）と結合できることを意味する。ｒｈＡＲ特異抗体は適切な濃度のｒｈＡＲタンパク質又はｒｈＡＲの一部から作製した合成ペプチドを免疫アジュバントの存在下又は不在下にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物に免疫することにより産生される。
【００９８】
最初の免疫前に免疫前血清を採取する。許容可能な免疫アジュバントと共にｒｈＡＲタンパク質約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇを各動物に投与する。このような許容可能なアジュバントとしてはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍとｔＲＮＡを加えたフロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、油中水エマルションが挙げられるが、これらに限定されない。初期免疫はｒｈＡＲタンパク質又はそのペプチドフラグメントを好ましくはフロイント完全アジュバントに加え、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又は両者で多重部位に行う。各動物から定間隔、好ましくは毎週採血し、抗体力価を測定する。初期免疫後に動物にブースター注射してもよいし、しなくてもよい。ブースター注射する動物には一般にフロイント不完全アジュバントに等量のｒｈＡＲを加えて同一経路で投与する。ブースター注射は最大力価が得られるまで約３週間置きに行う。各ブースター免疫から約７日後又は単一免疫後約１週間毎に動物から採血し、血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。
【００９９】
近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃにｒｈＡＲタンパク質を免疫することによりｒｈＡＲに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製する。上述のように等容量の許容可能なアジュバントに加えた緩衝液又は食塩水約０．５ｍｌ中ｒｈＡＲタンパク質約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇをＩＰ又はＳＣ経路でマウスに免疫する。フロイント完全アジュバントが好ましい。動物に０日目に初期免疫し、約３〜約３０週間安静にする。免疫したマウスにリン酸緩衝食塩水等の緩衝液中ｒｈＡＲ約１〜約１００ｍｇを静脈内（ＩＶ）経路で１回以上ブースター免疫する。抗体陽性マウスからのリンパ球を得るが、免疫したマウスから当分野で公知の標準手順により脾臓を抽出して脾リンパ球を得ることが好ましい。安定なハイブリドーマを形成することが可能な条件下で脾リンパ球を適当な融合パートナー、好ましくはミエローマ細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を産生させる。融合パートナーとしてはマウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が挙げられるがこれらに限定されず、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞とミエローマ細胞を濃度約３０％〜約５０％のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合する。ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させることにより融合したハイブリドーマ細胞を当分野で公知の手順により選択する。約１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウェルから上清を採取し、抗原としてｒｈＡＲを使用して固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈殿アッセイで試験し、ｍＡｂのアイソタイプを調べる。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９７３，ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓの軟寒天法等の技術により抗体陽性ウェルからのハイブリドーマをクローニングする。
【０１００】
プリスタン約０．５ｍｌ／匹でプライミングしておいたＢａｌｂ／ｃマウスにプライミングから約４日後にハイブリドーマ細胞約２×１０^６〜約６×１０^６個を注入することによりモノクローナル抗体をｉｎｖｉｖｏ産生させる。細胞導入から約８〜１２日後に腹水を採取し、当分野で公知の技術によりモノクローナル抗体を精製する。
【０１０１】
約２％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることにより抗ｒｈＡＲｍＡｂをｉｎｖｉｔｒｏ産生させ、十分な量の特異的ｍＡｂを得る。ｍＡｂを当分野で公知の技術により精製する。
【０１０２】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を各種血清学的又は免疫学的アッセイにより測定し、例えば沈降、受身凝集反応、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法が挙げられるが、これらに限定されない。同様のアッセイを使用して体液又は組織及び細胞抽出液中のヒトｒｈＡＲの存在を検出する。
【０１０３】
当業者に自明の通り、上記単一特異的抗体の生産方法を使用してｒｈＡＲペプチドフラグメント又は全長ｒｈＡＲに特異的な抗体を生産することもできる。
【０１０４】
例えば抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化したゲル担体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることによりｒｈＡＲ抗体アフィニティーカラムを作製する。次にスペーサーアームを介するアミド結合により抗体をゲルに結合する。次に、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．０）でクエンチする。カラムを水洗後、０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次にカラムをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３）で平衡化し、全長ｒｈＡＲ又はｒｈＡＲタンパク質フラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽出液をカラムにゆっくりと通す。次に光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドまで低下するまでカラムをリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、タンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。次に精製ｒｈＡＲタンパク質をリン酸緩衝食塩水で透析する。
【０１０５】
イムノアフィニティー及び／又はリガンドアフィニティー法等の各種技術により宿主細胞中のｒｈＡＲ濃度を定量するが、これらに限定するものではない。ｒｈＡＲ特異的アフィニティービーズ又はｒｈＡＲ特異抗体を使用して^３５Ｓ−メチオニン標識又は未標識ｒｈＡＲを単離する。標識ｒｈＡＲタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。ｒｈＡＲタンパク質特異抗体及び／又は抗ホスホチロシン抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイにより未標識ｒｈＡＲタンパク質を検出する。
【０１０６】
宿主細胞でｒｈＡＲを発現させた後にｒｈＡＲタンパク質を回収すると、活性形のｒｈＡＲタンパク質が得られる。数種のｒｈＡＲタンパク質精製法が利用可能であり、使用に適している。塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを種々に組合せるか又は個々に適用することにより細胞溶解液及び抽出液又は条件付け培地から組換えｒｈＡＲタンパク質を精製することができる。
【０１０７】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体はｒｈＡＲレベルをスクリーニング及び測定するために使用することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体はｒｈＡＲの検出とタイピングに適したキットを処方するのに利用できる。このようなキットは少なくとも１個の容器を緊密に保持するのに適した区画キャリヤーを含む。キャリヤーは更にｒｈＡＲを検出するのに適した組換えｒｈＡＲ又は抗ｒｈＡＲ抗体等の試薬を含む。更に標識抗原や酵素基質等の検出手段をキャリヤーに加えてもよい。
【０１０８】
医薬的に許容可能なキャリヤーの混合等の公知方法により、ｒｈＡＲのモジュレーターを含む医薬的に有用な組成物を処方することができる。このようなキャリヤーと処方方法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を形成するために、このような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変ｒｈＡＲ、又はｒｈＡＲアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。
【０１０９】
ｒｈＡＲのモジュレーターを含む治療用又は診断用組成物は疾患を治療又は診断するために十分な量を個体に投与する。有効量は個体の状態、体重、性別及び年齢等の種々の因子により異なる。他の因子としては投与方法も挙げられる。
【０１１０】
医薬組成物は皮下、局所、経口及び筋肉内等の種々の経路で個体に投与することができる。
【０１１１】
「化学的誘導体」なる用語は通常は基本分子の一部でない付加化学部分を含む分子を意味する。このような部分は基本分子の溶解度、半減期、吸収等を改善することができる。あるいは、前記部分は基本分子の望ましくない副作用を緩和するか、又は基本分子の毒性を低下させることができる。このような部分の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓを始めとする種々の教科書に記載されている。
【０１１２】
本明細書に開示する方法に従って同定した化合物は適当な用量で単独使用することができる。あるいは、他の薬剤を同時又は逐次投与することが望ましい場合もある。
【０１１３】
本発明は本発明の新規治療方法で使用するのに適した局所、経口、全身及び非経口医薬製剤を提供することも目的とする。本発明により活性成分として同定された化合物を含む組成物は慣用投与用賦形剤に加えた広範な治療剤形で投与することができる。例えば、タブレット、カプセル（各々定時放出製剤及び持続放出製剤を含む）、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ及び乳剤等の経口剤形又は注射により投与することができる。同様に、静脈内（ボーラス注射と輸液の両者）、腹膜組織内、皮下、閉鎖式又は非閉鎖式局所、又は筋肉内形態で投与することもでき、いずれも薬剤分野の当業者に周知の形態を使用する。
【０１１４】
本発明の化合物は１日１回投与してもよいし、合計１日用量を１日に２、３又は４回に分けて投与しても有利である。更に、本発明の化合物は適当な鼻孔内賦形剤の局所使用により鼻孔内形態で投与してもよいし、当業者に周知の経皮パッチ形態を使用する経皮経路により投与してもよい。経皮送達系の形態で投与するためには、製剤投与は当然のことながら投与期間を通して間欠投与するよりも連続投与したほうがよい。
【０１１５】
２種以上の活性剤を別個の製剤で使用して併用治療する場合には、活性剤を同時に投与してもよいし、各々時間をずらせて投与してもよい。
【０１１６】
本発明の化合物を使用する投与計画は患者の型、種、年齢、体重、性別及び病態；治療する症状の重篤度；投与経路；患者の腎、肝及び心臓血管機能；並びに使用するその特定化合物等の種々の因子に応じて選択する。通常の知識をもつ医師又は獣医であれば、症状の進行を防止、抑制又は阻止するために必要な薬剤の有効量を容易に決定及び処方することができる。毒性を生じずに効力を発揮する範囲内の薬剤濃度に達するように最適に調整するには、薬剤の標的部位利用率の動態に基づく投与計画が必要である。これには、薬剤の分配、平衡及び排出を考慮する必要がある。
【０１１７】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１８】
ｒｈＡＲをコードするＤＮＡ分子の単離と特性決定
プライマー設計にはカニクイザルＡＲのＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．＃Ｕ９４１７９、添付配列表に配列番号６として開示）とアカゲザルＡＲのＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０９２９３０）を使用することができる。アカゲザルＡＲＥＳＴのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１１９】
【化５】

【０１２０】
アカゲザル前立腺由来メッセンジャーＲＮＡを調製し、常法によりｃＤＮＡを合成した。標準ＰＣＲ法により全長アカゲザルＡＲをクローニングした。カニクイザルＡＲに基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。アカゲザル前立腺ｍＡｂから鋳型ｃＤＮＡを合成した。プライマー対ｍｋＡＲＦ２（５’−ＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＴＧ−３’；配列番号８）及びｍｋＡＲＲ５（５’−ＧＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＡ−３’；配列番号９）を使用してＰＣＲにより遺伝子のＮＨ_２末端部分を得、ＣＯＯＨ末端部分はｍｋＡＲＦ５（５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＣ−３’；配列番号１０）及びｍｋＡＲＲ２（５’−ＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡ−３’；配列番号１１）を使用して得た。各フラグメントをｐＣＲＩＩベクターにサブクローニングし、各サブクローンからのＤＮＡでシーケンシング確認を行った。ＮＨ_２及びＣＯＯＨ両末端ＤＮＡ配列アセンブリからのコンセンサス配列に比較して野生型ｃＤＮＡ配列を含むクローンを使用して全長ｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡの５’及び３’末端をＫｐｎＩ部位にライゲートし、ｐＣＲＩＩベクターにクローニングすることにより最終全長ｃＤＮＡを得た。ヌクレオチド配列を再びシーケンシングにより確認した。同様にｍｋＡＲＲ７プライマー（５’−ＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＴＡＧＡＣＣＣＴＣ−３’；配列番号１２）を使用して細分化アカゲザルｃＤＮＡライブラリーでｃＤＮＡ伸長によりアカゲザルＡＲの開始Ｍｅｔ及び５’−ＵＴＲ情報を得た。クローニングしたアカゲザルＡＲｃＤＮＡはコーディング領域にアカゲザルＡＲと７ヌクレオチド変異を示し、その結果、２アミノ酸残基変異を示す。両者のオープンリーディングフレームはヒト形よりも短い同一ｐｏｌｙＱ及びｐｏｌｙＧ配列を示し、ＤＢＤ及びＬＢＤ領域はヒト形に一致する。
【実施例２】
【０１２１】
ｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ用ＧＳＴ−ｒｈＡＲ融合タンパク質の作製
発現ベクター構築：完全ＬＢＤを含む残基６０１〜８９５を含むＰＣＲフラグメントをｐＥＳＰ−１発現ベクター（＃２５１６００，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬｏＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＳｍａＩ部位に挿入し、ＧＳＴ−Ｆｌａｇタグの下流にｒｈＡＲＬＢＤを形成した。最終結合配列はベクター５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣ．．．．．．ＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＧＧＴＡＡ−３’ベクターである。
【０１２２】
ＡＲ発現−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコールに従ってｐＥＳＰ−１ベクターを使用してＧＳＴ−Ｆｌａｇ−ｒｈＡＲＬＢＤ（Ｍｒ＝６０ｋＤａ）を酵母で発現させ、ＴＥＧＭ／ＤＴＴ／ＰＩ緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４，１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１０ｍＭモリブデン酸、２ｍＭＤＴＴ，酵母前立腺インヒビターカクテル（ＰＩ：Ｓｉｇｍａ）５０μｌ／ｇ酵母及びＰＩ完全（ＰＩ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１／１０容量／ｇ酵母］に溶解させる。
【０１２３】
融合タンパク質精製−ＴＥＧＭ／ＤＴＴ緩衝液を使用するバッチ精製法により抗フラグＭ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）を使用して上記融合タンパク質を精製する。フラグペプチド１００μｇ／ｍｌを含有するＴＥＧＭ／ＤＴＴを使用してタンパク質を溶離する。
【０１２４】
ヒドロキシアパタイト結合アッセイ−典型例では、１８時間４℃でインキュベートすることにより（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０％グリセロール，０．８ＭＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び２ｍＭジチオスレイトールを含む）結合反応液１００μｌ中で組換え精製ＧＳＴ−Ｆｌａｇ−ｒｈＡＲＬＢＤ０．２５μｇ／ｍｌと２ｎＭ ^３Ｈ−Ｒ１８８１を結合させる。各種濃度の未標識試験化合物の存在下に平行結合反応アリコート中で^３Ｈ−Ｒ１８８１結合置換を調べる。初期１８時間結合反応後に５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）スラリー１００μｌを各試料に加え、ボルテックスし、氷上で〜１０分間インキュベートする。次に、試料を遠心分離し、上清を吸引して未結合リガンドを除去する。ＨＡＰペレットを洗浄用緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１００ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭＥＧＴＡ）で３回洗浄する。リガンド結合ＧＳＴ−ＲｈＡＲを含む３回洗浄ＨＡＰペレットを９５％ＥｔＯＨに加え、シンチレーション液５ｍｌを加えたシンチレーションバイアルに移し、混合し、計数し、組換えＲｈＡＲ融合タンパク質に結合した放射性リガンド（^３Ｈ−Ｒ１８８１）を定量する。約１ｎＭのＩＣ５０を示す公知高親和性リガンド（例えば５−αジヒドロテストステロンや未標識Ｒ１８８１）に結果を比較する。
【０１２５】
以上、例証を目的とする実施例により本発明の原理を教示したが、当然のことながら、本発明の実施は特許請求の範囲とその等価物に該当する通常の全変形、応用又は改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】図１Ａ〜ＣはｒｈＡＲをコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。下線で示したヌクレオチド１０５１（「Ａ」）は対立遺伝子変異体の部位であり、（配列番号３に開示するように）「Ｇ」残基でもよい。
【図１Ｂ】図１Ａ〜ＣはｒｈＡＲをコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。下線で示したヌクレオチド１０５１（「Ａ」）は対立遺伝子変異体の部位であり、（配列番号３に開示するように）「Ｇ」残基でもよい。
【図１Ｃ】図１Ａ〜ＣはｒｈＡＲをコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。下線で示したヌクレオチド１０５１（「Ａ」）は対立遺伝子変異体の部位であり、（配列番号３に開示するように）「Ｇ」残基でもよい。
【図２】ｒｈＡＲのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。太字下線領域（配列番号２の残基５３５〜残基６００）はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）である。残基２１０（同じく太字下線で示すＧｌｕ残基）は対立遺伝子変異体の部位であり、（配列番号３によりコードされ、本明細書に配列番号４として開示するように）Ｇｌｙ残基でもよい。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜Ｆはアカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質（配列番号２）のオープンリーディングフレームを含むコーディング鎖（配列番号１）と非コーディング鎖（配列番号５）を示す。下線部（即ち配列番号２のアミノ酸残基５３５〜アミノ酸残基６００）は発現ｒｈＡＲタンパク質のＤＢＤ領域を示す。

Claims

配列番号２に３文字略記で示す下記アミノ酸配列：

を含むアカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項２に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項２に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記ＤＮＡ発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、
組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
配列番号２に３文字略記で示す下記アミノ酸配列：

から成るアカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
請求項５に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項６に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、
組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
配列番号１に示す下記ヌクレオチド配列：

を含むアカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
配列番号１のヌクレオチド１５４〜約ヌクレオチド１２５７から構成される請求項９に記載のＤＮＡ分子。
請求項９に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるための発現ベクター。
請求項１０に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるための発現ベクター。
請求項１１に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
請求項１２に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項１１に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項１５に記載の方法。
配列番号１に示す下記ヌクレオチド配列：

から構成されるアカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
配列番号１のヌクレオチド４２３〜約ヌクレオチド３１０８から構成される請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
請求項１７に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項１９に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
請求項２０に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項１９に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項２３に記載の方法。
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む精製アカゲザルＡＲタンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列から構成される精製アカゲザルＡＲタンパク質。
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞から誘導される精製アカゲザルＡＲタンパク質。
前記ＤＮＡ発現ベクターが配列番号１の約ヌクレオチド４２３〜約ヌクレオチド３１０８を含む請求項２７に記載の精製アカゲザルＡＲタンパク質。
配列番号４に３文字略記で示す下記アミノ酸配列：

を含む、アカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
請求項２９に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項３０に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項３０に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記ＤＮＡ発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項３２に記載の方法。
配列番号４に３文字略記で示す下記アミノ酸配列：

から構成される、アカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
請求項３４に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項３５に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項３５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項３７に記載の方法。
配列番号３に示す下記ヌクレオチド配列：

を含む、アカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
配列番号３のヌクレオチド１５４〜約ヌクレオチド１２５７から構成される請求項３９に記載のＤＮＡ分子。
請求項３９に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるための発現ベクター。
請求項４０に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるための発現ベクター。
請求項４１に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
請求項４２に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項４１に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項４５に記載の方法。
配列番号３に示す下記ヌクレオチド配列：

から構成されるアカゲザルＡＲタンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子。
配列番号３のヌクレオチド４２３〜約ヌクレオチド３１０８から構成される請求項４７に記載のＤＮＡ分子。
請求項４７に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項４８に記載のＤＮＡ分子を含む、アカゲザルＡＲタンパク質を発現させるためのＤＮＡ発現ベクター。
請求項４９に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
請求項５０に記載の発現ベクターを含む、組換えアカゲザルＡＲタンパク質を発現する宿主細胞。
（ａ）請求項４９に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする段階と、
（ｂ）前記発現ベクターから前記アカゲザルＡＲタンパク質を発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む、組換え宿主細胞でアカゲザルＡＲタンパク質を発現させる方法。
宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項５３に記載の方法。
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む精製アカゲザルＡＲタンパク質。
配列番号４に記載のアミノ酸配列から構成される精製アカゲザルＡＲタンパク質。
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞から誘導される精製アカゲザルＡＲタンパク質。
前記ＤＮＡ発現ベクターが配列番号３の約ヌクレオチド４２３〜約ヌクレオチド３１０８を含む請求項５７に記載の精製アカゲザルＡＲタンパク質。